JP3418772B2 - Ｄｎａ断片の標識法 - Google Patents
Ｄｎａ断片の標識法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応
−一本鎖高次構造多型解析法（polymerase chain react
ion-single strand conformation polymorphism,ＰＣＲ
−ＳＳＣＰ）に適用されるＤＮＡ断片の標識法に関す
る。
−一本鎖高次構造多型解析法（polymerase chain react
ion-single strand conformation polymorphism,ＰＣＲ
−ＳＳＣＰ）に適用されるＤＮＡ断片の標識法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、多くの癌や遺伝子病は、ＤＮＡの
極一部の突然変異（大部分一塩基置換）が原因となって
いることが明らかにされ、該原因ＤＮＡの変異を調べる
ことにより、疾患の診断を行なう、所謂遺伝子診断法が
確立され、更にＤＮＡの微細な変異をより簡便且つ正確
に検出する方法が種々研究されつつある。
極一部の突然変異（大部分一塩基置換）が原因となって
いることが明らかにされ、該原因ＤＮＡの変異を調べる
ことにより、疾患の診断を行なう、所謂遺伝子診断法が
確立され、更にＤＮＡの微細な変異をより簡便且つ正確
に検出する方法が種々研究されつつある。
【０００３】上記確立された遺伝子診断法の一つの画期
的なものは、折田らによる一本鎖高次構造多型解析（Ｓ
ＳＣＰ）を利用するものである（Proc.Natl.Acad.Sci.,
USA, 86, 2766 (1989) ）。即ち、このＳＳＣＰは、Ｄ
ＮＡを変性して一本鎖にすれば、その一次構造の変異が
微細であっても高次構造が大きく異なることを利用し
て、電気泳動における移動度の差により変異ＤＮＡを検
出しようとするものである。
的なものは、折田らによる一本鎖高次構造多型解析（Ｓ
ＳＣＰ）を利用するものである（Proc.Natl.Acad.Sci.,
USA, 86, 2766 (1989) ）。即ち、このＳＳＣＰは、Ｄ
ＮＡを変性して一本鎖にすれば、その一次構造の変異が
微細であっても高次構造が大きく異なることを利用し
て、電気泳動における移動度の差により変異ＤＮＡを検
出しようとするものである。
【０００４】更に上記ＳＳＣＰとポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を組合わせることにより、微量のＤＮＡをも
解析可能とするＰＣＲ−ＳＳＣＰ法が開発されるに至り
（Genomics, 5, 874 (1989) ）、これが遺伝子診断に広
く試みられてきている。
（ＰＣＲ）を組合わせることにより、微量のＤＮＡをも
解析可能とするＰＣＲ−ＳＳＣＰ法が開発されるに至り
（Genomics, 5, 874 (1989) ）、これが遺伝子診断に広
く試みられてきている。
【０００５】上記ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、当初、放射性
同位体で標識されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅産物
の放射活性を検出するものであったが、放射性同位体の
取扱い及びその検出操作の繁雑さ等の面より臨床検査へ
の応用は困難であった。
同位体で標識されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅産物
の放射活性を検出するものであったが、放射性同位体の
取扱い及びその検出操作の繁雑さ等の面より臨床検査へ
の応用は困難であった。
【０００６】最近、之等欠点を伴わない非放射性標識Ｐ
ＣＲ−ＳＳＣＰ法が、種々研究、提案されている。例え
ば、上記放射性同位体標識プライマーに代わって、蛍光
標識されたプライマーを用いる方法が開発され（特開平
５−３１７０４８号公報）、またセンス鎖プライマーと
アンチセンス鎖プライマーとを異なる色に蛍光標識して
ＳＳＣＰの検出精度を向上させる技術も提案され（治療
学、27 (12), 1477 (1993)）、之等の技術の進歩より、
検出機器の機能アップと合わせて、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法
による遺伝子診断等が一層急速に普及しつつある現状に
ある。
ＣＲ−ＳＳＣＰ法が、種々研究、提案されている。例え
ば、上記放射性同位体標識プライマーに代わって、蛍光
標識されたプライマーを用いる方法が開発され（特開平
５−３１７０４８号公報）、またセンス鎖プライマーと
アンチセンス鎖プライマーとを異なる色に蛍光標識して
ＳＳＣＰの検出精度を向上させる技術も提案され（治療
学、27 (12), 1477 (1993)）、之等の技術の進歩より、
検出機器の機能アップと合わせて、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法
による遺伝子診断等が一層急速に普及しつつある現状に
ある。
【０００７】しかるに、公知のＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、
いずれも標識されたプライマー、即ち化学修飾されたプ
ライマーの利用を必須としており、これがＰＣＲにおけ
る所望ＤＮＡ断片の増幅不良の要因となる重大な欠点が
あり、他に、かなりの時間と経費とを要して標識プライ
マーを合成せねばならない不利もある。
いずれも標識されたプライマー、即ち化学修飾されたプ
ライマーの利用を必須としており、これがＰＣＲにおけ
る所望ＤＮＡ断片の増幅不良の要因となる重大な欠点が
あり、他に、かなりの時間と経費とを要して標識プライ
マーを合成せねばならない不利もある。
【０００８】また従来、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片
を検出するために、ＤＮＡ断片そのものを、例えば臭化
エチジウム等の蛍光物質と結合させて着色する方法も試
みられている（特開平４−２６７８９５号公報、特開平
５−６８５９６号公報等参照）。
を検出するために、ＤＮＡ断片そのものを、例えば臭化
エチジウム等の蛍光物質と結合させて着色する方法も試
みられている（特開平４−２６７８９５号公報、特開平
５−６８５９６号公報等参照）。
【０００９】しかしながら、之等の方法によると、臭化
エチジウム等の色素がＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の二本鎖の
間に架橋状態で入り込むので、一本鎖にすることが殆ど
不可能であり、仮に一本鎖にできたとしても、検出感度
が極めて低くなり、とてもＳＳＣＰには適用できない。
エチジウム等の色素がＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の二本鎖の
間に架橋状態で入り込むので、一本鎖にすることが殆ど
不可能であり、仮に一本鎖にできたとしても、検出感度
が極めて低くなり、とてもＳＳＣＰには適用できない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、従来のＰＣＲ−ＳＳＣＰに見られる上記欠点をすべ
て解消する改良されたＰＣＲ−ＳＳＣＰ法のための新し
いＤＮＡ断片の標識法を提供することにある。
は、従来のＰＣＲ−ＳＳＣＰに見られる上記欠点をすべ
て解消する改良されたＰＣＲ−ＳＳＣＰ法のための新し
いＤＮＡ断片の標識法を提供することにある。
【００１１】即ち、本発明はＳＳＣＰでの電気泳動によ
るバンドの分離がシャープで、従って正確な検出による
高精度な解析が可能なＰＣＲ−ＳＳＣＰのための、改善
されたＤＮＡ断片の標識法を提供することを目的として
いる。
るバンドの分離がシャープで、従って正確な検出による
高精度な解析が可能なＰＣＲ−ＳＳＣＰのための、改善
されたＤＮＡ断片の標識法を提供することを目的として
いる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を
重ねた結果、通常の非標識プライマーを用いてＰＣＲを
行なった後、得られるＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチ
センス鎖の３′末端ヌクレオチドを蛍光標識することに
よって、上記目的に合致する標識法が提供され、かくし
て所望の正確な検出及び高精度な解析の可能なＰＣＲ−
ＳＳＣＰ法が確立できるという新しい事実を見出だし、
ここに本発明を完成するに至った。
重ねた結果、通常の非標識プライマーを用いてＰＣＲを
行なった後、得られるＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチ
センス鎖の３′末端ヌクレオチドを蛍光標識することに
よって、上記目的に合致する標識法が提供され、かくし
て所望の正確な検出及び高精度な解析の可能なＰＣＲ−
ＳＳＣＰ法が確立できるという新しい事実を見出だし、
ここに本発明を完成するに至った。
【００１３】即ち、本発明によれば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ
におけるＤＮＡ断片の標識に当り、増幅されたＤＮＡ断
片のセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の
３′末端ヌクレオチドを蛍光標識することを特徴とする
ＤＮＡ断片の標識法が提供される。
におけるＤＮＡ断片の標識に当り、増幅されたＤＮＡ断
片のセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の
３′末端ヌクレオチドを蛍光標識することを特徴とする
ＤＮＡ断片の標識法が提供される。
【００１４】また本発明によれば、特に、蛍光標識が、
センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の３′末
端ヌクレオチドと、蛍光標識されたヌクレオシド誘導体
とを置換することにより行なわれる上記標識法、蛍光標
識されたヌクレオシド誘導体との置換反応が、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片を用いて行なわれる上記標
識法、蛍光標識が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両者
の３′末端ヌクレオチドについて、之等をそれぞれ異な
る色の蛍光標識されたヌクレオシド誘導体と置換するこ
とにより行なわれる上記標識法、センス鎖及びアンチセ
ンス鎖の両者の３′末端ヌクレオチドの置換反応が同時
に行なわれる上記標識法、及び蛍光標識されたヌクレオ
シド誘導体が、塩基部分に結合手を介してローダミン類
を結合させたヌクレオシド３リン酸である上記標識法
が、それぞれ提供される。
センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の３′末
端ヌクレオチドと、蛍光標識されたヌクレオシド誘導体
とを置換することにより行なわれる上記標識法、蛍光標
識されたヌクレオシド誘導体との置換反応が、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片を用いて行なわれる上記標
識法、蛍光標識が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両者
の３′末端ヌクレオチドについて、之等をそれぞれ異な
る色の蛍光標識されたヌクレオシド誘導体と置換するこ
とにより行なわれる上記標識法、センス鎖及びアンチセ
ンス鎖の両者の３′末端ヌクレオチドの置換反応が同時
に行なわれる上記標識法、及び蛍光標識されたヌクレオ
シド誘導体が、塩基部分に結合手を介してローダミン類
を結合させたヌクレオシド３リン酸である上記標識法
が、それぞれ提供される。
【００１５】本発明標識法においては、ＰＣＲにより増
幅されたＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖の少
なくとも一方の３′末端ヌクレオチドを蛍光標識するこ
とが重要であり、かくして得られる蛍光標識されたＤＮ
Ａ断片は、ＳＳＣＰ法によって、正確に検出でき、また
高精度にて解析できるのである。
幅されたＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖の少
なくとも一方の３′末端ヌクレオチドを蛍光標識するこ
とが重要であり、かくして得られる蛍光標識されたＤＮ
Ａ断片は、ＳＳＣＰ法によって、正確に検出でき、また
高精度にて解析できるのである。
【００１６】上記ＰＣＲによるＤＮＡ断片の調製は、常
法に従うことができ、得られるセンス鎖及び／又はアン
チセンス鎖の蛍光標識は、代表的には之等各鎖の３′末
端ヌクレオチドを、予め蛍光標識されたヌクレオシド誘
導体と置換させることにより行ない得る。該置換反応
は、各鎖と、その末端ヌクレオチドの塩基に対応する塩
基を有するヌクレオシド誘導体の蛍光標識物とを、適当
な酵素の存在下に反応させることにより実施できる。
法に従うことができ、得られるセンス鎖及び／又はアン
チセンス鎖の蛍光標識は、代表的には之等各鎖の３′末
端ヌクレオチドを、予め蛍光標識されたヌクレオシド誘
導体と置換させることにより行ない得る。該置換反応
は、各鎖と、その末端ヌクレオチドの塩基に対応する塩
基を有するヌクレオシド誘導体の蛍光標識物とを、適当
な酵素の存在下に反応させることにより実施できる。
【００１７】上記で用いられる酵素は、種々ＤＮＡポリ
メラーゼのいずれでもよく、特にＤＮＡ合成酵素活性
と、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性とを合せ持つも
のが好ましい。その具体例としては、例えばＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片を例示できる。該酵素の使用
量は、利用する酵素の種類に応じて当業者にとり適宜決
定でき、限定されるものではないが、例えば上記ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノー断片の場合は、少なくとも２
単位程度を使用すれば充分である。
メラーゼのいずれでもよく、特にＤＮＡ合成酵素活性
と、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性とを合せ持つも
のが好ましい。その具体例としては、例えばＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片を例示できる。該酵素の使用
量は、利用する酵素の種類に応じて当業者にとり適宜決
定でき、限定されるものではないが、例えば上記ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノー断片の場合は、少なくとも２
単位程度を使用すれば充分である。
【００１８】また上記で利用される予め蛍光標識された
ヌクレオシド誘導体（ヌクレオシド誘導体の蛍光標識
物）としては、塩基部分に蛍光物質を結合手を介して結
合させた化合物（ヌクレオシド）を使用でき、之等は公
知であるか、公知の方法に従って別途に製造することが
でき、一部市販されている。その例としては、例えばヌ
クレオシド３リン酸の塩基部分にローダミン類が結合手
３−アミノ−１−プロピン−１−イルを介して結合した
化合物を挙げることができる（Nucleic Acids Researc
h, 20 (10), 2471 (1992)）。本発明に有利に利用でき
る上記化合物の具体例としては、例えばデオキシウリジ
ン３リン酸（ｄＵＴＰ）、ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシン３リン酸（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシ−７−デア
ザグアノシン３リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジデオキシシチ
ジン３リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシチミジン３リ
ン酸（ｄｄＴＴＰ）等のヌクレオシド３リン酸の５位
（ピリミジン骨格の場合）又は７位（７−デアザプリン
骨格の場合）に、上記結合手を介して各種のローダミン
類、例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ；緑
色）、６−カルボキシローダミンＸ（６−ＲＯＸ；赤
色）、５−カルボキシローダミン１１０（Ｒ１１０；青
色）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭ
ＲＡ；黄色）等を結合させた化合物を例示できる。以
下、本明細書においては、之等の化合物を、ローダミン
類とヌクレオシド誘導体との各略号を用いて、例えばＲ
６Ｇ−ｄＵＴＰ、Ｒ１１０−ｄＵＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄ
ＵＴＰ、Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰのように表記するものとす
る。
ヌクレオシド誘導体（ヌクレオシド誘導体の蛍光標識
物）としては、塩基部分に蛍光物質を結合手を介して結
合させた化合物（ヌクレオシド）を使用でき、之等は公
知であるか、公知の方法に従って別途に製造することが
でき、一部市販されている。その例としては、例えばヌ
クレオシド３リン酸の塩基部分にローダミン類が結合手
３−アミノ−１−プロピン−１−イルを介して結合した
化合物を挙げることができる（Nucleic Acids Researc
h, 20 (10), 2471 (1992)）。本発明に有利に利用でき
る上記化合物の具体例としては、例えばデオキシウリジ
ン３リン酸（ｄＵＴＰ）、ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシン３リン酸（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシ−７−デア
ザグアノシン３リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジデオキシシチ
ジン３リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシチミジン３リ
ン酸（ｄｄＴＴＰ）等のヌクレオシド３リン酸の５位
（ピリミジン骨格の場合）又は７位（７−デアザプリン
骨格の場合）に、上記結合手を介して各種のローダミン
類、例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ；緑
色）、６−カルボキシローダミンＸ（６−ＲＯＸ；赤
色）、５−カルボキシローダミン１１０（Ｒ１１０；青
色）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭ
ＲＡ；黄色）等を結合させた化合物を例示できる。以
下、本明細書においては、之等の化合物を、ローダミン
類とヌクレオシド誘導体との各略号を用いて、例えばＲ
６Ｇ−ｄＵＴＰ、Ｒ１１０−ｄＵＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄ
ＵＴＰ、Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰのように表記するものとす
る。
【００１９】上記蛍光標識されたヌクレオシド誘導体の
使用量は、特に限定されず至適量とされるのがよく、通
常０．０５〜２０μＭ、好ましくは０．０５〜２μＭの
範囲の濃度で用いることができる。
使用量は、特に限定されず至適量とされるのがよく、通
常０．０５〜２０μＭ、好ましくは０．０５〜２μＭの
範囲の濃度で用いることができる。
【００２０】本発明に従う上記置換反応の条件は、用い
る蛍光標識されたヌクレオシド誘導体や酵素の種類等に
応じて最適条件（温度、時間等）を適宜決定でき、特に
限定されるものではなく、反応温度は、用いる酵素の酵
素活性が最もよく発揮される条件、通常３７℃及びその
付近とするのがよく、反応時間は一般には５分〜１時間
程度、より好ましくは５分〜３０分程度の範囲とするの
がよい。
る蛍光標識されたヌクレオシド誘導体や酵素の種類等に
応じて最適条件（温度、時間等）を適宜決定でき、特に
限定されるものではなく、反応温度は、用いる酵素の酵
素活性が最もよく発揮される条件、通常３７℃及びその
付近とするのがよく、反応時間は一般には５分〜１時間
程度、より好ましくは５分〜３０分程度の範囲とするの
がよい。
【００２１】尚、本発明標識法においては、上記センス
鎖及びアンチセンス鎖の双方の３′末端ヌクレオチド
を、それぞれ異なる色の蛍光標識されたヌクレオシド誘
導体と、同時に置換反応させることができる。即ち、Ｐ
ＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を構成する各鎖の３′末端
の塩基に対応するそれぞれのヌクレオシド誘導体、例え
ば上記３′末端の塩基がＴの場合はこれに対応するｄＵ
ＴＰ、ｄｄＴＴＰ等、Ａの場合は対応するｄｄＡＴＰ等
を、それぞれ異なる色の蛍光物質にて標識し、之等異な
る色を有する複数の蛍光標識されたヌクレオシド誘導体
を、前述した方法に従い、酵素の存在下に、上記ＤＮＡ
断片と反応させることにより、該ＤＮＡ断片のセンス鎖
及びアンチセンス鎖のそれぞれを同時に異なる色に標識
することができる。但し、この場合、センス鎖とアンチ
センス鎖のそれぞれの３′末端塩基（置換すべき塩基）
は、異なっている必要があり、このためには、ＰＣＲに
おけるセンスプライマーとアンチセンスプライマーとの
各５′末端塩基として異なるものを選べばよい。
鎖及びアンチセンス鎖の双方の３′末端ヌクレオチド
を、それぞれ異なる色の蛍光標識されたヌクレオシド誘
導体と、同時に置換反応させることができる。即ち、Ｐ
ＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を構成する各鎖の３′末端
の塩基に対応するそれぞれのヌクレオシド誘導体、例え
ば上記３′末端の塩基がＴの場合はこれに対応するｄＵ
ＴＰ、ｄｄＴＴＰ等、Ａの場合は対応するｄｄＡＴＰ等
を、それぞれ異なる色の蛍光物質にて標識し、之等異な
る色を有する複数の蛍光標識されたヌクレオシド誘導体
を、前述した方法に従い、酵素の存在下に、上記ＤＮＡ
断片と反応させることにより、該ＤＮＡ断片のセンス鎖
及びアンチセンス鎖のそれぞれを同時に異なる色に標識
することができる。但し、この場合、センス鎖とアンチ
センス鎖のそれぞれの３′末端塩基（置換すべき塩基）
は、異なっている必要があり、このためには、ＰＣＲに
おけるセンスプライマーとアンチセンスプライマーとの
各５′末端塩基として異なるものを選べばよい。
【００２２】上記センス鎖とアンチセンス鎖との標識色
を相違させる本発明方法によれば、ＳＳＣＰによって、
同一レーンにて、センス鎖とアンチセンス鎖とのそれぞ
れの一本鎖ＤＮＡを別々に検出することができ、変異Ｄ
ＮＡの識別を一層明確なものとすることができ、ひいて
は遺伝子診断の精度を向上させ得る利点がある。
を相違させる本発明方法によれば、ＳＳＣＰによって、
同一レーンにて、センス鎖とアンチセンス鎖とのそれぞ
れの一本鎖ＤＮＡを別々に検出することができ、変異Ｄ
ＮＡの識別を一層明確なものとすることができ、ひいて
は遺伝子診断の精度を向上させ得る利点がある。
【００２３】また、本発明方法に従い標識されるＤＮＡ
断片は、そのＰＣＲ増幅の際に利用するプライマーの
５′末端から２番目の塩基として、前記置換反応停止の
ための塩基、例えば好ましくはグアニン（Ｇ）又はシト
シン（Ｃ）を配されたものを選択、採用するのが望まし
い。
断片は、そのＰＣＲ増幅の際に利用するプライマーの
５′末端から２番目の塩基として、前記置換反応停止の
ための塩基、例えば好ましくはグアニン（Ｇ）又はシト
シン（Ｃ）を配されたものを選択、採用するのが望まし
い。
【００２４】かくして本発明所期の蛍光標識されたＤＮ
Ａ断片を調製できる。
Ａ断片を調製できる。
【００２５】該蛍光標識されたＤＮＡ断片は、ＳＳＣＰ
における通常のゲル電気泳動によって解析できる。該解
析の条件は公知のＳＳＣＰの条件と特に異なる訳ではな
く、より鮮明且つ正確な解析結果が得られるように、当
業者にとり任意に決定することができる。一般に、用い
るポリアクリルアミドゲルの濃度は１２％程度が、ゲル
板の温度は２０℃前後がよく用いられており、本発明で
も之等に準じた条件を採用すればよい。また、ＳＳＣＰ
に用いられる機器としても、従来公知の各種の機器でよ
く、特に電気泳動によりゲル板を通過するＤＮＡ断片を
検出し、そのまま自動的に画像化できるものが知られて
おり、その利用が簡便であり好ましい。更に、多蛍光検
出機能、温度調節機能等の付加された機器も開発されて
おり（Biotechniques,16, 296 (1994)）、之等は操作の
簡便化、データーの正確さ等の面より有利に利用でき
る。
における通常のゲル電気泳動によって解析できる。該解
析の条件は公知のＳＳＣＰの条件と特に異なる訳ではな
く、より鮮明且つ正確な解析結果が得られるように、当
業者にとり任意に決定することができる。一般に、用い
るポリアクリルアミドゲルの濃度は１２％程度が、ゲル
板の温度は２０℃前後がよく用いられており、本発明で
も之等に準じた条件を採用すればよい。また、ＳＳＣＰ
に用いられる機器としても、従来公知の各種の機器でよ
く、特に電気泳動によりゲル板を通過するＤＮＡ断片を
検出し、そのまま自動的に画像化できるものが知られて
おり、その利用が簡便であり好ましい。更に、多蛍光検
出機能、温度調節機能等の付加された機器も開発されて
おり（Biotechniques,16, 296 (1994)）、之等は操作の
簡便化、データーの正確さ等の面より有利に利用でき
る。
【００２６】
【発明の効果】本発明の標識法は、従来の放射性同位体
を用いる標識法に比して、繁雑且つ特殊な操作を要しな
い利点がある。
を用いる標識法に比して、繁雑且つ特殊な操作を要しな
い利点がある。
【００２７】また本標識法では、通常のプライマー（非
標識）を用いてＰＣＲを行ない得るため、該プライマー
の標識化に要する手間、コスト等を省略できることは勿
論のこと、標識されたプライマーの如き化学修飾された
プライマーの利用に見られる、目的ＤＮＡ断片の増幅が
不良となり、正確な検出ができなくなるおそれもなく、
得られる標識されたＤＮＡ断片は優れた検出感度にて正
確に検出できる。
標識）を用いてＰＣＲを行ない得るため、該プライマー
の標識化に要する手間、コスト等を省略できることは勿
論のこと、標識されたプライマーの如き化学修飾された
プライマーの利用に見られる、目的ＤＮＡ断片の増幅が
不良となり、正確な検出ができなくなるおそれもなく、
得られる標識されたＤＮＡ断片は優れた検出感度にて正
確に検出できる。
【００２８】更に本発明方法により標識されたＤＮＡ断
片は、これをＳＳＣＰに適用することによって、電気泳
動によるバンドの分離がシャープであると共に、本発明
方法によれば、センス鎖とアンチセンス鎖とを別々の色
に標識できるため、両鎖のうちの一方の電気泳動による
バンドが近接する場合でも、より高精度な解析結果を与
え、それ故、正確な遺伝子診断を行ない得る。
片は、これをＳＳＣＰに適用することによって、電気泳
動によるバンドの分離がシャープであると共に、本発明
方法によれば、センス鎖とアンチセンス鎖とを別々の色
に標識できるため、両鎖のうちの一方の電気泳動による
バンドが近接する場合でも、より高精度な解析結果を与
え、それ故、正確な遺伝子診断を行ない得る。
【００２９】加えて、本発明方法に従う標識法は、対象
ＤＮＡ断片及びＳＳＣＰ条件を同一とする限り、標識す
べき色を変化させても泳動結果は変化しない特徴を有し
ており、従って得られた結果は普遍的データーとして取
扱うことができる。
ＤＮＡ断片及びＳＳＣＰ条件を同一とする限り、標識す
べき色を変化させても泳動結果は変化しない特徴を有し
ており、従って得られた結果は普遍的データーとして取
扱うことができる。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。尚、以下に示す例は本発明の一実施態様を
示すものであって、本発明はこれに限定されず、その要
旨を逸脱しない範囲において種々の態様を包含すること
は勿論である。
例を挙げる。尚、以下に示す例は本発明の一実施態様を
示すものであって、本発明はこれに限定されず、その要
旨を逸脱しない範囲において種々の態様を包含すること
は勿論である。
【００３１】
【実施例１】
１．染色体ＤＮＡの単離とＰＣＲによる増幅
表１に示す７種のヒト腫瘍細胞由来細胞株より、同表に
示す通り、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２又は１３部分
に変異を有する各染色体ＤＮＡを調製した。また対照と
して、健常人の末梢血白血球より、健常な染色体ＤＮＡ
を調製した。
示す通り、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２又は１３部分
に変異を有する各染色体ＤＮＡを調製した。また対照と
して、健常人の末梢血白血球より、健常な染色体ＤＮＡ
を調製した。
【００３２】
【表１】
次に、得られた各染色体ＤＮＡより、Ｋ−ｒａｓ遺伝子
のコドン１２又は１３を含む１７５塩基対のＤＮＡ断片
を、表２に示す各プライマーを用いて、二段階ＰＣＲ
（一段階３０回）により増幅させた。尚、各プライマー
は、ＰＥ／ＡＢＩ部門製ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（型番：
３９２）により合成した。
のコドン１２又は１３を含む１７５塩基対のＤＮＡ断片
を、表２に示す各プライマーを用いて、二段階ＰＣＲ
（一段階３０回）により増幅させた。尚、各プライマー
は、ＰＥ／ＡＢＩ部門製ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（型番：
３９２）により合成した。
【００３３】
【表２】
即ち、アステック社製サーモサイクラー（ＰＣ−７０
０）を用いて表３に示す反応液中で、一段階目は１００
ｎｇの染色体ＤＮＡを鋳型として用いて全容量１０μｌ
で反応を行ない、二段階目は一段階目の反応液を５００
倍希釈したものを鋳型として全容量５０μｌにて反応を
行なった。尚、１サイクルのＰＣＲ（変性、ハイブリダ
イズ及び伸展）は、それぞれ、９４℃、５５℃及び７２
℃で１分、１分及び２分間とした。但し、最初の変性反
応は９４℃で３分間行ない、最後の伸展反応は７２℃で
１０分間行なった。
０）を用いて表３に示す反応液中で、一段階目は１００
ｎｇの染色体ＤＮＡを鋳型として用いて全容量１０μｌ
で反応を行ない、二段階目は一段階目の反応液を５００
倍希釈したものを鋳型として全容量５０μｌにて反応を
行なった。尚、１サイクルのＰＣＲ（変性、ハイブリダ
イズ及び伸展）は、それぞれ、９４℃、５５℃及び７２
℃で１分、１分及び２分間とした。但し、最初の変性反
応は９４℃で３分間行ない、最後の伸展反応は７２℃で
１０分間行なった。
【００３４】
【表３】
上記二段階目のＰＣＲの後、１０μｌの反応液を１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、１７５塩基対のＤＮＡ断
片の増幅を確認した。残りの４０μｌの反応液について
は、酢酸アンモニウムを塩としてエタノール沈殿を行な
い、３０μｌの脱イオン加熱滅菌水に溶解させた。尚、
増幅させたＤＮＡ断片の量は、吸光度計（ベックマン社
製、ＤＵ−６４）により測定した。
ガロースゲル電気泳動にかけ、１７５塩基対のＤＮＡ断
片の増幅を確認した。残りの４０μｌの反応液について
は、酢酸アンモニウムを塩としてエタノール沈殿を行な
い、３０μｌの脱イオン加熱滅菌水に溶解させた。尚、
増幅させたＤＮＡ断片の量は、吸光度計（ベックマン社
製、ＤＵ−６４）により測定した。
【００３５】２．ＤＮＡ断片の標識
上記１．で増幅させたＤＮＡ断片（１７５塩基対）０．
１μｇを用い、これを標識ヌクレオシド誘導体として、
Ｒ１１０−ｄＵＴＰ（青色）０．５μＭ及びＲ６Ｇ−ｄ
ｄＡＴＰ（緑色）０．０７５μＭを含むｄＵＴＰ１２５
μＭ、ｄＡＴＰ１２５μＭ、トリス緩衝液（室温、ｐＨ
７．５）５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、ジチオ
スレイトール１ｍＭ及び塩化ナトリウム１００ｍＭから
なる溶液と混合し、混合物に更にＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片（宝酒造社製）４単位を加えて、３７℃
で２０分間保温反応させた。
１μｇを用い、これを標識ヌクレオシド誘導体として、
Ｒ１１０−ｄＵＴＰ（青色）０．５μＭ及びＲ６Ｇ−ｄ
ｄＡＴＰ（緑色）０．０７５μＭを含むｄＵＴＰ１２５
μＭ、ｄＡＴＰ１２５μＭ、トリス緩衝液（室温、ｐＨ
７．５）５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、ジチオ
スレイトール１ｍＭ及び塩化ナトリウム１００ｍＭから
なる溶液と混合し、混合物に更にＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片（宝酒造社製）４単位を加えて、３７℃
で２０分間保温反応させた。
【００３６】反応終了後、過剰の標識ヌクレオシド誘導
体を除去するために、５％臭化セチルトリメチルアンモ
ニウム液２．５μｌを加え、室温、１６０００×ｇで３
分間遠心し、上清をすてた。残渣に１．２Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液と９９．５％エタノール１２５μｌとを加
え、室温、１６０００×ｇで３分間遠心し、沈殿を７０
％エタノール５００μｌで洗浄後、再度同様の条件で遠
心した。
体を除去するために、５％臭化セチルトリメチルアンモ
ニウム液２．５μｌを加え、室温、１６０００×ｇで３
分間遠心し、上清をすてた。残渣に１．２Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液と９９．５％エタノール１２５μｌとを加
え、室温、１６０００×ｇで３分間遠心し、沈殿を７０
％エタノール５００μｌで洗浄後、再度同様の条件で遠
心した。
【００３７】得られた沈殿物は、ホルムアミド：ＥＤＴ
Ａ（５０ｍＭ）＝５０：１の混合液約１０μｌに溶解し
た。
Ａ（５０ｍＭ）＝５０：１の混合液約１０μｌに溶解し
た。
【００３８】３．ＳＳＣＰによる解析
解析機器として、ＰＥ／ＡＢＩ部門製ＤＮＡシーケンサ
ー（型番：３７３Ａ）に循環水型温度調節装置を付加し
たもの（Biotechniques,16, 296 (1994)）を利用し、温
度調節を循環水の代わりにペルチェ素子で行なうように
改良したものを用いて、以下の通りＳＳＣＰを行なっ
た。
ー（型番：３７３Ａ）に循環水型温度調節装置を付加し
たもの（Biotechniques,16, 296 (1994)）を利用し、温
度調節を循環水の代わりにペルチェ素子で行なうように
改良したものを用いて、以下の通りＳＳＣＰを行なっ
た。
【００３９】即ち、上記２．で得られた沈殿物の溶液を
９０℃で３分間加熱し、直ちに氷冷した後、内部標準と
して、Genescan-2500 ROX （ＡＢＩ社製）を微量添加し
た。この液の適量を採取してゲルにチャージし、これを
上記機器にセットした。
９０℃で３分間加熱し、直ちに氷冷した後、内部標準と
して、Genescan-2500 ROX （ＡＢＩ社製）を微量添加し
た。この液の適量を採取してゲルにチャージし、これを
上記機器にセットした。
【００４０】尚、電気泳動は、１２ｃｍの長さのゲル板
を用いて、表４の組成のゲルで２０℃にて行なった。ま
た、電気泳動後の画像データーは、ＰＥ／ＡＢＩ部門製
ソフトウェア（genescan 672）を用いて解析した。
を用いて、表４の組成のゲルで２０℃にて行なった。ま
た、電気泳動後の画像データーは、ＰＥ／ＡＢＩ部門製
ソフトウェア（genescan 672）を用いて解析した。
【００４１】
【表４】
４．結果
得られた結果を図１に示す。
【００４２】図１は、上記電気泳動後の画像データーを
解析したカラー写真に対応する図面代用写真であり、図
中、レーン（番号）はそれぞれ１＝健常人、２＝Ａ５４
９、３＝Ｌｕ６５、４＝ＭＤＡ−ＭＢ２３１、５＝ＰＡ
ＮＣ１、６＝ＰＳＮ１、７＝ＳＷ４８０、８＝ＳＷ１１
１６に対応するＤＮＡ断片を示す。また、赤色のバンド
（図１中最上バンド及び下から３つのバンド、計４本）
は、いずれも内部標準物質を示す。
解析したカラー写真に対応する図面代用写真であり、図
中、レーン（番号）はそれぞれ１＝健常人、２＝Ａ５４
９、３＝Ｌｕ６５、４＝ＭＤＡ−ＭＢ２３１、５＝ＰＡ
ＮＣ１、６＝ＰＳＮ１、７＝ＳＷ４８０、８＝ＳＷ１１
１６に対応するＤＮＡ断片を示す。また、赤色のバンド
（図１中最上バンド及び下から３つのバンド、計４本）
は、いずれも内部標準物質を示す。
【００４３】該図より、各ＤＮＡ断片とも、１本のシャ
ープなアンチセンス鎖のバンド（緑色）と、若干２〜３
本に分かれてはいるが、明確なセンス鎖のバンド（青
色）が検出され、全ての腫瘍細胞株から増幅したＤＮＡ
断片（レーン２〜８）は、どれも健常人から増幅したそ
れ（レーン１）とは異なる移動度を示すことが極めて明
瞭に確認でき、このことから、本発明方法に従う標識さ
れたＤＮＡ断片の利用によれば、ＳＳＣＰによって、Ｄ
ＮＡの変異等の検出が可能であり、かくして遺伝子診断
を行ない得ることが明らかとなった。
ープなアンチセンス鎖のバンド（緑色）と、若干２〜３
本に分かれてはいるが、明確なセンス鎖のバンド（青
色）が検出され、全ての腫瘍細胞株から増幅したＤＮＡ
断片（レーン２〜８）は、どれも健常人から増幅したそ
れ（レーン１）とは異なる移動度を示すことが極めて明
瞭に確認でき、このことから、本発明方法に従う標識さ
れたＤＮＡ断片の利用によれば、ＳＳＣＰによって、Ｄ
ＮＡの変異等の検出が可能であり、かくして遺伝子診断
を行ない得ることが明らかとなった。
【図１】本発明実施例１−３．に従い解析された各ＤＮ
Ａ断片の電気泳動結果を示す図面代用写真である。
Ａ断片の電気泳動結果を示す図面代用写真である。
Claims (5)
- 【請求項１】 ポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖高次構造
多型解析法におけるDNA断片の標識に当たり、増幅され
たDNA断片と蛍光標識されたヌクレオシド誘導体とを、D
NA合成酵素活性と3'→5'エキソヌクレアーゼ活性とを併
せ持つDNAポリメラーゼを用いて置換反応させることに
よって、該DNA断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖の少
なくとも一方の3'末端ヌクレオチドを蛍光標識すること
を特徴とするDNA断片の標識法。 - 【請求項２】 置換反応が、DNAポリメラーゼIのクレノ
ー断片を用いて行われる、請求項１に記載の標識法。 - 【請求項３】蛍光標識が、センス鎖及びアンチセンス鎖
の両者の3'末端ヌクレオチドについて、これらをそれぞ
れ異なる色の蛍光標識されたヌクレオシド誘導体と置換
することにより行われる、請求項１に記載の標識法。 - 【請求項４】センス鎖及びアンチセンス鎖の両者の3'末
端ヌクレオチドの置換反応が同時に行われる、請求項３
に記載の標識法。 - 【請求項５】蛍光標識されたヌクレオシド誘導体が、塩
基部分に結合手を介してローダミン類を結合させたヌク
レオシド３リン酸である、請求項１−４のいずれかに記
載の標識法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31563694A JP3418772B2 (ja) | 1994-11-24 | 1994-11-24 | Ｄｎａ断片の標識法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31563694A JP3418772B2 (ja) | 1994-11-24 | 1994-11-24 | Ｄｎａ断片の標識法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08140700A JPH08140700A (ja) | 1996-06-04 |
| JP3418772B2 true JP3418772B2 (ja) | 2003-06-23 |
Family
ID=18067753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31563694A Expired - Lifetime JP3418772B2 (ja) | 1994-11-24 | 1994-11-24 | Ｄｎａ断片の標識法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3418772B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3489991B2 (ja) * | 1997-07-07 | 2004-01-26 | 理化学研究所 | ３’−デオキシリボヌクレオチド誘導体 |
-
1994
- 1994-11-24 JP JP31563694A patent/JP3418772B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08140700A (ja) | 1996-06-04 |
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