WO1998022823A1 - Plaque pour analyse immunologique comportant des cupules - Google Patents

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WO1998022823A1
WO1998022823A1 PCT/JP1997/004117 JP9704117W WO9822823A1 WO 1998022823 A1 WO1998022823 A1 WO 1998022823A1 JP 9704117 W JP9704117 W JP 9704117W WO 9822823 A1 WO9822823 A1 WO 9822823A1
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plate
desiccant
antibody
antigen
well
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PCT/JP1997/004117
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Inventor
Eiji Kobayashi
Katsumichi Takeda
Original Assignee
Dainabot Co., Ltd.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
    • G01N33/5304—Reaction vessels, e.g. agglutination plates
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira

Definitions

  • the present invention relates to an elution plate for immunoassay.
  • 96 A plate such as a well is used as an agglutination reaction using red blood cells or colored particles, or as a sample tank for immunochromatography using strips. Have been.
  • the reagent is added to each well of the aliquot plate at the time of measurement, and the analyte is measured. Therefore, if a certain amount of reagent is added to each well in advance, a measurement operation is simplified.
  • eluate may be used as a solid phase for enzyme immunoassay (hereinafter, EIA), fluorescence immunoassay (hereinafter, FIA) or chemiluminescence immunoassay (hereinafter, CLIA).
  • EIA enzyme immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • CLIA chemiluminescence immunoassay
  • the antigen or antibody is immobilized.
  • the eluate is sealed in a bag containing a dehumidifier to prevent reagents such as antigen and antibody from deteriorating
  • an object of the present invention is to provide an elliptic plate in which a reagent has been added in advance and which can be stored and transported.
  • a dried reagent is put in each well of the eluate, and each well is put on the upper surface of the eluate, and a desiccant-containing finolem is provided. ⁇ elplate for immunoassay sealed with
  • any of the elliptical plates conventionally used can be the elliptic plate of the present invention.
  • a 96-hole plate is used. 9 6 holes ⁇ 8 plates, 8 rows,
  • U-shaped, V-shaped and flat bottom There are various shapes depending on the application, such as U-shaped, V-shaped and flat bottom.
  • the U-shaped shell and the V-shaped shell are suitable for visually observing the degree of agglutination of sensitized red blood cells, colored particles, and the like generated as a result of the immune reaction.
  • the flat-bottom type is suitable for measuring transmitted light, and various types of ellipses for immunoassays, such as those used for measurements such as EIA and colloid agglutination, are used. It is known that the diameter and depth of the well, the number of wells and the units that can be separated are various, but in the present invention, the shape of these wells and the like Any type of plate can be used without limitation
  • the reagent added to the well in advance and dried is the reagent used for the immune reaction. If the immune reaction is an agglutination reaction, the reagent added in advance and dried is red blood cells or colored particles sensitized with the antigen or antibody. Passive hemagglutination using erythrocytes as a carrier (hereinafter
  • PHA uses antigen-sensitized erythrocytes, and if erythrocytes undergo an agglutination reaction, it indicates that a specific antibody against the sensitized antigen exists.
  • Reverse passive hemagglutination (RPHA) sensitizes antibodies quality
  • An agglutination reaction using some colored particles instead of erythrocytes is also generally performed.
  • Polystyrene, gelatin, liposomes, metal or non-metal particles are used as the colored particles.
  • these colored particles or erythrocytes that have bound or sensitized the antigen or antibody are dispensed into wells and dried.
  • the reagent added and dried in advance is an antigen or antibody labeled with an enzyme or colored fine particles. It is. Polystyrene, gelatin, ribosome, metal or non-metal particles are used as the coloring fine particles.
  • a sample solution is added to a well, added to a well in advance, dried, and the labeled antibody (or antigen) present in the sample solution and dried. After reacting with the antigen or antibody to form a complex, the reaction solution is moved in the strip carrier by capillary action, and is pre-located at the detection site in the strip carrier.
  • the immobilized solid-phased antibody reacts with the complex, and the labeled substance accumulated at the detection site
  • the reagent added and dried in advance is an antigen or antibody previously immobilized on a well. Immobilization is usually by adsorption or covalent bonding.
  • the number of dispensing of reagents in immunoassays such as EIA is performed. And can be performed more easily.
  • the antigen or antibody is immobilized on the gel, but the immobilization method is often polystyrene. (PS), Polyethylene (PE), Polypropylene (PP), etc., aliquot an aliquot of the antigen or antibody solution into each of the plastic plates. Note, after leaving for a certain period of time, discard the solution of each module, wash each module with a washing solution, dehydrate the plate, and dry it with a desiccator. In addition, a functional group can be introduced into the material of the e-plate, and reacted with the functional group of the reagent to form a covalent bond.
  • PS polystyrene.
  • PE Polyethylene
  • PP Polypropylene
  • a functional group can be introduced into the material of the e-plate, and reacted with the functional group of the reagent to form a covalent bond.
  • a method of bonding via a linker is also generally used as necessary.
  • the immobilized antigen or antibody is dried. Dried reagents are bound or added ⁇ Eluate is sealed with desiccant-containing finale ⁇ Sealed on top of eluate
  • the film containing the desiccant is (1) a desiccant sheet in which the desiccant is kneaded into a thermoplastic resin and formed into a finolem, and (2) moisture is substantially transmitted. (3) If the desiccant sheet cannot be in close contact with the upper surface of the pellet, it can adhere to the upper surface of the phenolic plate, allowing moisture to permeate. It is a multi-layer laminated film that works with the inner finolem.
  • the outer film may be further laminated with a film on the outside to protect the outer film.
  • a finolem with desiccant may also have a film with oxygen absorbent. If the film contains an oxygen absorbent, the outer finolem is substantially impermeable to moisture and oxygen, and the inner film is permeable to water and oxygen.
  • the desiccant sheets that have the properties include calcium chloride, silica gel, molecular sieves, silicon dioxide, anoremina, and zeolite, which are used as desiccants.
  • the oleat etc. can be kneaded into a thermoplastic, water-permeable polymer resin such as PE, PP, PS, etc., and prepared by the usual film production method.
  • the film containing the oxygen absorbent is made of an oxygen absorbent such as activated iron oxide or pyrogallol which is made of a thermoplastic material such as PE, PP, PS, etc., and which is permeable to oxygen. It can be prepared by kneading it into a molecular resin by the usual film production method.
  • an oxygen absorbent such as activated iron oxide or pyrogallol
  • thermoplastic material such as PE, PP, PS, etc.
  • external fins examples include PE with a minimum of 300 ⁇ , PP with a minimum of 300 ⁇ m, polyvinylidene chloride (PVDC) with a minimum of 10 / zm, 7 / im Aluminum foil.
  • PVDC polyvinylidene chloride
  • a film or a film that does not substantially transmit moisture and oxygen examples include PE with a minimum of 300 ⁇ , PP with a minimum of 300 ⁇ m, polyvinylidene chloride (PVDC) with a minimum of 10 / zm, 7 / im Aluminum foil.
  • PVDC polyvinylidene chloride
  • PVD C 15 ⁇ m or more of polyvinyl alcohol specimen, aluminum foil of 7 tm or more, etc.
  • inner finolems are PE / PP / PS finolem of 30 / zm or less and finolem mainly composed of PE, PP and PS, with the appropriate amount of auxiliary materials. There is something.
  • the material of the inner fin is determined in consideration of the suitability of the heat seal with the el plate and the ease of peeling after the heat seal.
  • finolems to further protect external films examples include: 1 2 // There is m polyester (PET), 12 / im nylon etc.
  • the desiccant-containing finolem must be in close contact with the upper surface of the elplate to seal the gel.
  • the seal must be peelable when using the elplate; it must be able to
  • the gluing method may be gluing or heat sealing.
  • the inner film is not required if the desiccant sheet can be heat-sealed.
  • the glue is applied directly to the desiccant sheet, so no internal film is required in that case.
  • the inner surface of the finolem containing the desiccant and the upper surface of the phenolic plate are made of different thermoplastic resins.
  • a paste of a rubber type, an acrylic type, or a butyl polymer ether type is used.
  • the material of the enoprelate of the present invention may be low permeability such as ⁇ , ⁇ PET, PET, polyvinyl chloride, etc. in order to prevent the transmission of moisture. Even if a wet material is used, a metal such as aluminum is deposited on the lower surface of the plate to prevent moisture from permeating,
  • paint may be applied with PVDC and / or the thickness of the ellipse may be increased. Deposition of aluminum does not require any special method
  • the purpose is to prevent the penetration of moisture from the bottom or side of the cuplet, and a finolem with aluminum foil, for example 70 m of PE or PP / 7 ⁇ aluminum foil 2 ⁇ m
  • PET may be heat-sealed on the side of the bottom of the ellipse. It is desirable that this heat seal can be easily peeled off during use.
  • one or more of the ellipticals of the present invention may be put in a bag such as an aluminum foil-containing film.
  • the film containing the desiccant is peeled off, and a sample solution containing a test sample and a control solution are added to each gel. Let's do an immune response.
  • Anti-HBsAg mouse monoclonal antibody Z Cellenium Colloid Conjugate was added to each column of “Fastec UP late” (manufactured by Fuji Rebio Co., Ltd.). (“Dynascreen HBsAg” manufactured by Dynabot Co., Ltd.)
  • One bottle was dissolved in 1.5 mL of purified water, and the solution was pipetted in 25 ⁇ L aliquots. Noted. This was designated as reagent-dispensed eluate. Dispensed this reagent ⁇ ⁇ Pre-freeze the eluate at minus 500 ° C for 30 minutes, then take minus 120 ° C at minus 500 ° C for 120 minutes.
  • both plate A and plate B were anti-HBsAg mouse monoclonal antibodies, and were not anti-HBsAg antibodies against Z-selenium colloid-conjugate. HBsAg antibody activity was retained.
  • Normal serum containing HBaAg was dispensed every 25 // L.
  • the above plate was allowed to stand for 2 minutes after dispensing, and the well was stirred well, and the anti-HBsAg mouse monoclonal antibody was fixed to the well.
  • the modified sheet was put in and judged 15 minutes and 40 minutes after that.
  • Treponema noridam (TP) solubilized antigen was diluted with 0.4% sodium carbonate buffer (pH 9.8) to 0.2 / zg / mL. . This is called "Imnoplate 'Polysonoreb F-
  • a base color developing solution (2,2'-Azino benzoate (3-ethylbenzene azothiol) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • ABTS 6-sulfonic acid
  • citric acid buffer solution 3 7.
  • Stop solution solution containing 1% sodium fluoride and 2% citric acid
  • Table 3 shows the results of a similar measurement using a plate before heat sealing in a finolem containing a desiccant and used as a control. T after heat sealing with finolem containing desiccant
  • Plate C after heat transfer is 2 Plate D, which was stored at ⁇ 8 ° C and 30 ° C and not heat-sealed, was placed in an aluminum foil bag with 5 g of silica gel and sealed tightly. Stored at 2-8 ° C. One, three, and six months after storage, the activity of the immobilized TP antigen was examined. Cover each plate with 100 ⁇ L of negative control (normal serum) and TP antibody-positive serum diluted with normal serum, and cover at 37 ° C for 1 hour. Incubated.
  • a reagent plate is provided in which reagents are added in advance and can be stored and transported. This simplifies the immunoassay procedure

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Description

明 細
免疫分析用 ゥ エルプ レー ト
[発明の詳細な説明 ]
[発明の属する技術分野 ]
こ の発明は、 免疫分析用 ゥエルプレー ト に関する。
[従来の技術]
9 6 穴ゥ エ ル等の ゥュルプ レー ト は、 赤血球や着色粒子を用 いた凝集反応や、 ス ト リ ップを用いるィ ム ノ ク ロマ ト グラ フ ィ 一のサ ンプル槽等と して用い られている。 これ らの測定方法に おいては、 試薬は測定時に ゥ エルプレー ト の各ゥ エルに添加 さ れ、 被検体が測定される。 従って、 一定の試薬が一定量ずつ各 ゥ エルに予め添加 されていれば測定作業が簡便にな る。 また、 ゥ エ ルプ レー ト は酵素免疫測定法 （以下、 E I A ) 、 蛍光免疫 測定法 （以下、 F I A ) や化学発光免疫測定法 （以下、 C L I A ) 等の固相 と して も使用する こ と ができ るが、 抗原又は抗体 等を固定化 した ゥ エルプ レー ト は、 抗原や抗体等の試薬が酸素 や湿気等によ り 劣化する のを防ぐために脱湿剤を入れた袋に密 封されてレ、る こ と が必要である。 し力 し、 こ の包装には多 く の 費用 がかかる
[発明が解決 し よ う と す る課題 ]
こ の発明 の 目 的は、 し たが っ て、 予め ゥ エルに試薬が添加 さ れていて、 保存、 運搬等が可能な ゥ エ ルプ レー ト を提供す る と に あ る
[課題を解決す る ため の手段 ]
ゥ エ ルプ レー ト の各 ゥ エルに乾燥 し た試薬を入れ、 次いで各 ゥ エ ルを ゥ ェルプ レ ー ト 上面において乾燥剤入 り フ イ ノレ ム で密 封す る こ と に よ り 、 保存、 運搬等が可能な ゥ エルプ レー ト を提 供す る こ と ができ た。
[発明の実施の形態 ]
すな わち こ の発明 は、 ゥ エルプ レー ト の各 ゥ エルに乾燥 し た 試薬が入れ られていて、 各 ゥ エルが ゥ エルプ レー ト 上面にぉレ' て乾燥剤入 り フ イ ノレ ム で密封 さ れてい る免疫分析用 ゥ エルプ レ ト であ る
従来 よ り 用 レヽ られてい る ゥ エルプ レー ト のいずれ も が本発明 の ゥ エルプ レー ト と する こ と ができ る 。 多 く の場合 9 6 穴 ゥ ルプ レー ト が用 レヽ られてレ、 る。 9 6 穴 ゥ エルプ レー ト は、 8 行、
2 列の ウ エノレカ ら な っ てい る。 さ ら に 8 穴単位又 は 1 2 穴単 位毎等に分離 して使用でき る ゥエルも本発明の ゥ エルプ レー ト とする こ と 力 Sでき る
ゥ エ ルの形状は.、 U字型、 V字型、 平底型等、 用途に よ っ て 種々 の形状がある。 U字型ゥ エル及ぴ V字型ゥ エルは、 免疫反 応の結果生 じた感作赤血球や着色粒子等の凝集程度を 目 視で観 察する のに適 している。 平底型は、 透過光を測定するのに適 し てお り 、 E I Aゃコ ロイ ド凝集法な どの測定に使用 されている こ の よ う に免疫分析用 ゥ エルプレー ト と して種々 の ものが知 ら れてお り 、 その ゥ エルの径ゃ深さ、 あ るいはゥエルの数や分離 でき る単位も種々 の ものが存在するが、 こ の発明では、 これ ら ゥ エルプレー ト の形状等に限定される こ と な く 何れの ゥ エルプ レー ト も使用する こ と ができ る
ゥ エルに予め添加 され乾燥される試薬は免疫反応に用い られ る試薬であ る。 免疫反応が凝集反応であれば、 予め添加 され乾 燥される試薬は抗原又は抗体を感作 した赤血球や着色粒子であ る。 赤血球を担体 と して用 いる受身赤血球凝集反応 （以下、
P H A ) は、 抗原を感作 した赤血球を用い、 赤血球が凝集反応 を起こせば感作 した抗原に対する特異抗体が存在する こ と を示 す。 逆受身赤血球凝集反応 （以下、 R P H A ) は抗体を感作し 質
た赤血球を用いて、 感作赤血球の凝集を観察する こ と に よ っ て 検体中の抗原を検出ある いは定量する ため の方法である。 赤血 球の代わ り に何らかの着色粒子を用いた凝集反応も一般に行わ れてレ、 る。 着色粒子 と し て は、 ポ リ ス チ レ ン、 ゼ ラ チ ン、 リ ポ ソーム、 金属あるいは非金属う の粒子な どが用い られている。 凝 集反応においては、 抗原あるいは抗体を結合又は感作した これ らの着色粒子や赤血球を ゥ エルに分注し乾燥させる
ウ エノレがィ ム ノ ク ロ マ ト グラ フ ィ 一等の反応槽又 はサ ンプル 槽であ る場合には、 予め添加 され乾燥される試薬は酵素や着色 微粒子等で標識された抗原又は抗体である。 着色微粒子 と して は、 ポ リ ス チ レ ン、 ゼ ラ チ ン、 リ ボ ソ ーム 、 金属 あ る い は非金 属 の粒子な どが用 い られてい る。 ィ ム ノ ク ロ マ ト グラ フ ィ ー よ る測定は、 ゥ エルに検体液を添カ卩 し、 ゥ ュルに予め添加、 乾 燥されて存在する標識抗体 （あるいは抗原） と検体液中の抗原 ある いは抗体） と を反応 させ複合体を形成させた後に、 反応 液を毛管現象によ り ス ト リ ップ担体中 を移動させ、 ス ト リ ップ 担体中の検出部位に予め不動化されている固相化抗体 （あるい は抗原） と 該複合体を反応させ、 検出部位に蓄積された標識物 E I A， F I A及び C L I A等において は、 予め添加 さ れ乾 燥 さ れ る試薬は、 予 め ゥ エルに固定化 された抗原あ る い は抗体 であ る。 固定化は、 通常、 吸着や共有結合に よ り 行 う 。 さ ら に、 予め添加 さ れ乾燥 さ れる 試薬 と し て標識化抗原ま た は標識化抗 体を使用す る こ と に よ っ て、 E I A等 の免疫測定にお け る試薬 の分注回数を減 ら し 、 よ り 簡便に行 う こ と ができ る。
乾燥は、 ゥ エルプ レー ト の各 ゥ エルに予 め一定量の試薬溶液 を添加 し、 凍結乾燥又は真空乾燥す る こ と に よ り 行 う 。
前述の よ う に、 E I A、 F I A及ぴ C L I A等におレヽては、 抗原又 は抗体を ゥ エ ルに固定化す る が 、 固 定化の方法は、 多 く の場合ポ リ ス チ レ ン （ P S ) 、 ポ リ エ チ レ ン （ P E ) 、 ポ リ プ ロ ピ レ ン （ P P ) 等の プラ ス チ ッ ク 製プ レー ト の各 ゥ エルに抗 原又は抗体溶液の一定量を分注 し、 一定時間放置後 、 各 ゥ ュル の溶液 を捨て、 各 ゥ ュルを洗浄液にて洗浄後、 ゥ ルプ レー ト を脱水 し、 デシケー タ ー等にて乾燥 さ せる 。 ま た、 ゥ エ ルプ レ 一 ト の材料に官能基 を導入 し、 試薬の官能基 と 反応 させ共有結 合に よ り 結合 さ せる こ と も でき る。 共有結合に よ る 場合に は必 要に よ り リ ンカ ー を介 し て結合 さ せる 方法 も 一般に用 い られて い る。 次いで固定化 された抗原又は抗体を乾燥す る。 乾燥試薬が結合又 は添加 されてい る ゥ エ ルプ レー ト は、 乾燥 剤入 り フ イ ノレムで ゥ エルプ レー ト 上面において密封 され る
乾燥剤入 り フ ィ ル ム は、 （ 1 ) 乾燥剤が熱可塑性樹脂 に練 り 込まれて フ イ ノレ ム状に さ れた乾燥剤シー ト と 、 （ 2 ) 水分を実 質的に透過 しない外面 フ ィ ル ム と 、 （ 3 ) 乾燥剤 シー ト が ゥ ルプ レー ト 上面 と 密着で き ない も ので あ る と き は ウ エノレプ レ ト 上面 と 密着す る こ と が でき 水分を透過す る 内面 フ イ ノレ ム と 力 ら な る 、 多層 ラ ミ ネ ー ト フ ィ ル ム であ る。 外面 フ ィ ル ム は更 その外側に外面 フ ィ ルム を保護する た めの フ ィ ルム が ラ ミ ネ ト さ れ る こ と があ る
乾燥剤入 り フ イ ノレ ム は、 更に酸素吸収剤入 り フ ィ ル ム を有す る場合 も あ る。 酸素吸収剤入 り フ ィ ルム を有す る場合に は、 外 面 フ ィ ノレム は水分及び酸素 を実質的に透過 しな い も ので あ り 、 内面 フ ィ ルム は水分透過性及び酸素透過性の あ る も のであ る 乾燥剤シー ト は、 乾燥剤 と して用 レヽ られ る塩化カ ルシ ウ ム、 シ リ カ ゲル、 モ レキ ュ ラ ー シ一ブ、 二酸化珪素、 ァノレ ミ ナ、 ゼ オラ イ ト 等 を P E 、 P P 、 P S 等の熱可塑性であ っ て水分を透 過す る 高分子樹脂 に練 り 込んで通常の フ ィ ル ム製造法に よ り 調 製でき る。 乾燥剤 シー ト の例 と して、 「モ イ ス チ ャ ーガー ド」 (東洋製缶 （株） 製） 、 「ハイ シー ト ' ド ラ イ フ ィ ル ム 」 （丸 谷化工機 （株） 製） があ る
ま た、 酸素吸収剤入 り フ ィ ル ム は、 活性酸化鉄、 ピ ロ ガ ロ ー ル等の酸素吸収剤 を P E 、 P P 、 P S 等の熱可塑性であ っ て酸 素 を透過す る 高分子樹脂 に練 り 込んで通常の フ ィ ル ム製造法 よ り 、 調製で き る。 酸素吸収剤入 り フ イ ノレ ム の例 と して 、 「ォ キ シガー ド」 （東洋製缶 （株） 製） が あ る
外面 フ イ ノレ ム の例 と して、 3 0 0 μ πι以上の P E 、 3 0 0 μ m 以上の P P 、 1 0 /z m以上のポ リ 塩化 ビニ リ デ ン （ P V D C ) 、 7 /i m以上の ア ル ミ ニ ウ ム箔な どが あ る 。 ま た、 水分及び酸素 を 実質的 に透過 し な レ、 フ ィ ルム の例 と し て 、 1 5 /z m以上 の
P V D C 、 1 5 μ m以上の ポ リ ビニルァ ノレコ ールの験化物、 7 t m以上のアル ミ 二 ゥ ム箔な どがあ る
内面 フ イ ノレ ム の例 と し て、 3 0 /z m以下の P E 、 P P 、 P S フ イ ノレ ム及び P E 、 P P 、 P S を主 と し適 当 量の副材料をカロ え て フ イ ノレ ム と し た も のが あ る。 内面 フ イ ノレ ム の材質は ゥ エ ル プ レ 一 ト と の熱シー ル適性、 熱シー ル後 の剥 が し易 さ な ど を考慮 し て決め られ る。
外面 フ ィ ルム を更に保護するた めの フ イ ノレムの例 と して、 1 2 // m の ポ リ エ ス テ ル （ P E T ) 、 1 2 /i mの ナイ ロ ン な ど が あ る
乾燥剤入 り フ イ ノレ ム は、 ゥ エ ルプ レ ー ト 上面 と 密着 し て ゥ ルを密封す る 。 密着 は、 ゥ エ ルプ レー ト 使用時に剥 がす こ と 力; でき る よ う に しな ければな ら ない
密着方法は糊付け で も 良い し熱シー ルで も 良い。 前述 し た よ う に、 内面 フ ィ ル ム は乾燥剤 シー ト が熱シールで き る も の であ れば不要で あ る。 ま た、 糊付けす る場合に は、 多 く の場合乾燥 剤 シー ト に直接糊 を塗布す る ので、 そ の場合に は内面フ ィ ルム は不要であ る
剥 がすこ と が可能な よ う に熱シールする ため には、 乾燥剤入 り フ イ ノレム の 内面 と ウ エ ノレプ レー ト 上面 と が異な る材料の熱可 塑性樹脂であればよ く 、 あ る いは、 乾燥剤入 り フ ィ ルム 内面 ホ ッ ト メ ノレ ト 剤を コ ーテ ィ ングすればよ い
乾燥剤入 り フ ィ ル ム が糊付け さ れ る場合には、 ゴ ム系、 ァ ク リ ノレ系 、 あ る いは ビュルポ リ マーエーテル系等の糊 が使用 さ れ る。
本発明の ウ エノレプ レー ト の材料 と し て、 P S の他、 水分の透 過 を防 ぐた め に Ρ Ε 、 Ρ Ρ 、 P E T , ポ リ 塩化 ビ ニ ル等の低透 湿性材料を用 いて も ょ レ ま た、 ゥ エ ルプ レー ト の 下面 に水分 の透過 を 防 ぐた め に ア ル ミ ニ ゥ ム な ど の金属 を蒸着 し た り 、
P V D C入 り 塗料を塗布 し た り 、 あ る いは ゥ エルプ レー ト の厚 さ を大 に し た り す る こ と も あ る。 アル ミ ニ ウ ム の蒸着は特別の 方法を要 しない
ク ルプ レ ト の下面あ る い は側面か ら の水分の透過 を防 ぐ 目 的で、 アル ミ ニ ウ ム箔入 り フ イ ノレ ム 、 例 え ば 7 0 m の P E あ る い は P P / 7 μ πι の ア ル ミ ニ ウ ム箔 2 μ m の
P E T を ゥ エルプ レー ト の下面あ る レ、 は側面に熱シーノレす る と も あ る。 こ の熱シールは使用時に容易 に剥がす こ と が でき る よ う にする こ と が望ま しい
ゥ エ ルプ レー ト の材質、 厚 さ の変更 、 ウ エノレプ レー ト 下面あ る いは側面の修飾等は酸素透過 を防 ぐため に も有用 であ る ま た 、 水分及び酸素か ら ゥ エ ルプ レ ー ト を完全に遮断す る た め に、 本発明 の ゥ エルプ レー ト の 1 個又は複数個 を アル ミ ニ ゥ ム箔入 り フ ィ ルム等の袋に入れ る こ と も あ る
本発明の ゥ ヱルプ レー ト の免疫分析への使用 は、 乾燥剤入 り フ ィ ル ム を剥が し、 被検体を含むサ ンプル液や対照溶液 を各 ゥ ェルに添加 し、 通常の方法で免疫反応 を行わせればよ レ、 [実施例]
[実施例 1 ]
「 F a s t e c U P l a t e 」 （富士 レ ビォ （株） 製） の各 ゥ エルに、 抗 H B s A g マ ウ スモ ノ ク ロ ーナノレ抗体 Zセ レ ニ ゥム コ ロ イ ド一 コ ンジュ ゲー ト （ダイ ナボ ッ ト （株） 製 「ダ イ ナス ク リ ー ン H B s A g 」 ） 1 瓶を精製水 1 . 5 m L で溶解 した も のを、 2 5 μ Lずつ ピペ ッ ト で分注した。 これを試薬分 注済み ゥエルプ レー ト と した。 こ の試薬分注済み ゥ エルプ レー ト を マ イ ナ ス 5 0 °Cで 3 0 分間 予備凍結 し た後 、 マ イ ナ ス 5 0 °Cからマイ ナス 5 でま で 1 2 0 分間かけて昇温 し、 マイ ナ ス 5 °Cで 1 0 時間保持、 マイ ナス 5 °Cカゝ ら 4 0 °Cま で 1 2 0 分 間かけ て昇温、 4 0 °Cで 1 2 0 分間保持、 4 0 DCか ら 2 5 °Cま で 3 0 分間で降温、 2 5 Όで 3 0 分間保持する こ と によ り 凍結 乾燥した （プ レー ト A ) 。
別の試薬分注済み ゥ エ ルプ レー ト を真空デシケーター内に置 き 、 真空ポンプで徐々 に脱気 した。 完全に脱気後、 そのまま室 温 （ 2 3〜 2 8 °C ) に 1 5 時間放置 し真空乾燥 した。 完全に試 薬が乾燥したのを 目 視で確認後、 ゥ エルプ レー ト を真空デシケ 一タ ーか ら 取 り 出 し た （プ レー ト B ) 。 プ レー ト A及びプ レー ト B を 2 μ m の P E T 5 μ の A 1 0 /i mの乾燥剤入 り P E / P S シー ト で構成 され る乾燥剤入 り フ ィ ルムで 6 5 °Cの熱板によ っ て 0 . 7 秒熱 シ ル し た。 こ の乾燥剤入 り P E Z P S シー ト は m た り 8 g のゼォライ ト が練 り 込まれている
プ レー ト A及びプ レー ト B の乾燥剤入 り シールを剥が し各ゥ ノレ 2 5 n g m L の H B s A g を添力 Π した正常人血清の各 5 0 Lずつ （ n =
2 ) を分注した。 分注後 2 分間放置 し よ く 撹拌 した。 こ れ ら の 各ゥ ノレ 前記抗 H B s A g マ ウ スモ ノ ク ロ ーナル抗体固定 化シー ト （ダイナボッ ト （株） 製 「ダイナスク リ ーン H B s A g」 を入れ、 1 5 分後及び 4 0 分後に判定を行った
コ ン ト ロ ーノレ と して、 上記試薬を入れていない 「 F a s t e
U P 1 a t e 」 の 各 ゥ エ ル に 、 前記抗 H B s A g マ ウ ス モ ノ ク ロ ーナノレ抗体 /セ レ ニ ゥ ム コ ロ イ ド ー コ ン ジ ユ ゲー ト 1 瓶 を精製水 1 . 5 m L で溶解 し た も の を 2 5 /z L 分注 し 、 1 . 6 , 3 . 1 ， 6 . 3 , 1 2 . 5 , 2 5 n g / m の H B s A g を含む正常人血清の 各 2 5 / L を 分注 し た こ れ ら の対照 ウ エ ノレ に 、 前記抗 H B s A g マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 固 定化 シ一 ト を 入れ 、 同 様 に 1 5 分後 及 ぴ 4 0 分後 に 判 定 し た。
表 1 に示すよ う に、 プレー ト A及びプレー ト Bは共に抗 H B s A g マ ウ ス モ ノ ク ロ ーナノレ抗体 Zセ レニ ウ ム コ ロ イ ド ー コ ン ジ ュ ゲ 一 ト の抗 H B s A g 抗体活性を保持 し ていた。
表 1
Figure imgf000014_0001
判定時の シ グナルの強 さ ： 2+ > 2/+ > + > +W> +/- > +;
( こ こ ま で陽性） > - 陰性 乾燥剤入 り フ ィ ルムでの熱シール後の プ レー ト を、 2 〜 8 。C 及 び 3 0 °Cに保存 し 、 1 力 月 後 ， 3 力 月 後及 び 6 力 月 後 に 抗
H B s A g 抗体活性を調べた 保存後のプ レー ト A 6， 3 1 ， 6 . 3 , 5 ,
2 5 n g / m L の H B s A g を 添力 [1 し た 正常 人 血清 を 5 0
L ずつ （ n 2 ) を 分注 し た
コ ン ト ロ ー ル と し て上記試薬 を入れて いない 「 F a s t Θ c
U P t e 」 の 各 ゥ エ ル に 、 前記抗 H B s A g マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ノレ 抗体 Zセ レ ニ ウ ム コ ロ イ ド ー コ ン ジ ゲ ト 1 瓶 を 精 製水 5 m L で溶解 し た も の を 2 5 L
6 ， 3 6 1 2 2 5 η g m 1 の
H B a A g を 含 む 正 常人 血 清 を 2 5 // L ず つ 分 注 し た 。 以 上 の プ レ ー ト は 、 分注後 2 分 間 放置 し 、 良 く 撹拌 し た れ ら の ゥ エ ル に 、 前記 抗 H B s A g マ ウ ス モ ノ ク ロ 一 ナ ノレ 抗体 固 定化 シ ー ト を 入れ 、 そ の 1 5 分後 及 び 4 0 分後 に 判 定 し た 。
結果は表 2 に示す と お り で、 保存後 のプ レー ト A は保存前の 抗 H B s A g マ ウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体 /セ レ ニ ウ ム コ ロ イ ド 一 コ ンジユ ゲー ト の抗 H B s A g 抗体活性を保持 し ていた 表 2
Figure imgf000016_0001
判 定時の シ グナルの強 さ ： 2+ > 2/+ > + > +W > +/- > +/ =
( こ こ ま で陽性） > - 陰性
[実施例 2 ]
ト レポネーマ . ノ リ ダム （以下 T P ) 可溶化抗原 を 0 . 4 % 炭酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 9 . 8 ) で 0 . 2 /z g / m L にな る よ う に希釈 した。 これ を 「ィ ム ノ プ レー ト ' ポ リ ソ ノレブ F —
9 6 」 （ 9 6 穴平底 プ レ ー ト ： ヌ ン ク 社製） の各 ウ エ ノレ に 、
9 0 // L ずつ分注 し 、 蓋 を して 2 〜 8 °Cに 1 6 時間放置 し た。 ゥ エルの溶液を捨て 、 各 ウ エノレに T w e e n 2 0 を 0 . 1 %含 む 0 . 9 %塩化ナ ト リ ウ ム溶液 （洗浄液） を 2 0 0 i L ずつ入 れて洗浄 し、 洗浄液を捨て た。 こ の洗浄操作を 2 回繰 り 返 した。 吸い取 り 紙上で水 を切っ た後、 真空デ シケー タ ー内 で真空状態 に し て室温で 2 時間乾燥 し た。 こ の よ う に し て得 ら れた T P 抗 原固定化プ レー ト を実施例 1 と 同様の方法に よ り 乾燥剤入 り フ ィ ノレム で熱 シーノレ し た c
乾燥前入 り フ イ ノレ ム熱 シ ー ル前後 の プ レ ー ト を 用 い て試料 ( T P 抗原） の活性が保持 さ れてい る か否かを調べた。 熱シー ル し た プ レー ト の乾燥剤入 り フ イ ノレム を剥 が した各 ゥ エ ルに、 陰性 コ ン ト ロ ー ル （正常人血清） 及び正常人血清 で希釈 し た T P 抗体陽性血清 を 1 0 0 /i L ずつ分注 し、 3 7 °Cで 1 時間ィ ン キ ュ ベー ト し た。 洗浄液 2 0 0 /z L を各 ゥ エルに入れて洗浄 し た。 こ の洗浄を 3 回行な っ た後、 ペルォキ シダーゼ標識抗 ヒ ト I g G ャ ギ抗体液 を 1 0 0 μ L 力 [] えて 3 7 °Cで 1 時間イ ン キ ュペー ト し た。 洗浄液 2 0 0 L で各 ゥ ュルを 3 回洗浄後、 基 質発色液 （和光純薬 （株） 製 2 , 2 ' 一 ア ジ ノ ビ ス ー （ 3 —ェ チルベ ン ゾ チ オア ゾ リ ン 一 6 — スルホ ン酸） （ A B T S ) ) を 0 . 1 %、 過酸ィヒ水素を 0 · 0 5 %含む 0 . 0 5 % ク ェ ン酸緩 衝液） 1 0 0 μ L を加 え て 3 7 。C、 3 0 分間イ ンキ ュ ベー ト し た。 反応停止液 （ 1 % フ ッ化ナ ト リ ウ ム、 2 % ク ェ ン酸を含む 溶液） 0 0 // L加 えて発色 を停止 し、 発色停止後 1 0 分以内
4 0 5 n mにお け る吸光度を測定 した。 乾燥剤入 り フ イ ノレ ム で の熱シール前のプ レー ト を用 いて 同様 の測定を行い対照 と した 結果 を表 3 に示す。 乾燥剤入 り フ イ ノレム で の熱シール後 も T
P 抗原の活性の低下はみ られな かっ た 陰 性
コ ン ト 希釈抗 T P 抗体陽性血？ ϊ n
ロ ール 6400倍 3200倍 1600倍 800倍 400 プ レ 卜 C 0.085 0.290 0.459 0.690 0.969 1.804
0.076 0.252 0.429 0.624 1.083 1.780 平均 0. 081 0. 271 0. 444 0. 657 1. 026 1. 792 プ レー ト D 0. 078 0. 253 0. 386 0. 616 1. 004 1. 783
0. 085 0. 263 0. 392 0. 655 1. 087 1. 883 平均 0. 082 0. 258 0. 389 0. 636 1. 046 1. 833 熱シ一ノレ後 のプ レー ト C を、 2 〜 8 °C及び 3 0 °Cに保存 し 、 熱シールを し な 力 つ たプ レー ト D は、 シ リ カ ゲノレ 5 g と と も に アル ミ ニ ウ ム箔袋に入れて密封 し、 2 〜 8 °Cに保存 した。 保存 後 1 力 月 後、 3 力 月 後及び 6 力 月 後 に固相化 T P 抗原の活性を 調べた。 各プ レー ト に 、 陰性コ ン ト ロ ール （正常人血清） 及び正常人 血清で希釈 し た T P 抗体陽性血清を 1 0 0 ^ L カ卩 えて蓋 を し、 3 7 °Cで 1 時間イ ンキ ュ ベー ト した。
洗浄液 2 0 0 I L を各 ゥ エルに入れて洗浄 を 3 回行い、 更に ペルォキ シダーゼ標識抗 ヒ ト I g G ャ ギ抗体液を 1 0 0 μ L 力!] えて蓋を し、 3 7 °Cで 1 時間イ ンキ ュベー ト した。
洗浄液 2 0 0 を各 ゥ エルに入れて 3 回洗浄 し 、 更 に基質 発色液 （和光純薬 A B T S 0 . 1 %及び過酸化水素 0 . 0 5 % を含む 0 . 5 % ク ェ ン酸緩衝液） を 1 0 0 // Lカ卩 えて蓋 を し、
3 7 °Cで 3 0 分イ ンキ ュベー ト した。
反応停止液 （ 1 % フ ッ化ナ ト リ ウ ム 、 2 % ク ェ ン酸を含む溶 液） を 1 0 0 // し カ卩 えて発色 を停止 し、 それか ら 1 0 分以内 に
4 0 5 n mの吸光度 を測定 した。 結果は表 4 に示す と お り で、 保存後 のプ レー ト C 及びプ レー ト D について固定化 T P 抗原の 活性低下は見 られな かっ た。 陰性
希釈抗 T P 抗体陽性血清
6400 3200 1600 800 400
― ノレ
泣 i
In 1 1n In 保 仔俊 ノ レ 1 ~~ 卜 し 0. u y u U . oo Ό . 4 U . 0 1. 023 1. 790
1 月 2 - 8 C 1^： 0. 092 0. I I I U . ^ 11 685 1. 131 1. 852 半均 0. 091 0. 253 0. 378 0. 606 1. 077 1. 821 プ レ ー 卜 C 0. 098 0. 273 o . 423 0. 675 1. 089 1. 931
3 0 C保仔 0. 099 0. 306 o . 459 0. 661 1. 159 1. 686 平均 0. 099 0 - 290 0. 441 0. 668 1. 124 1 - 809 フ レー ト D 0. 095 0 - 256 0. 402 0. 601 1. 011 1. 855
2 - 8 C保ィ手 0. 099 0. 299 0. 410 0. 622 1. 112 1. 665 平均 0. 097 0. 278 0. 406 0. 612 1. 062 1 760 保存後 プ レー ト C 0. 132 0. 254 0. 382 0. 579 1. 039 1. 726
3 力 月 2 - 8。C保存 0. 124 0. 257 0. 442 0. 615 1. 065 1. 787 平均 0. 128 0. 256 0. 412 0. 597 1. 052 1. 757 プ レ C 0. 138 0. 271 0. 424 0. 629 1. 097 1. 821
3 0 C保 0. 143 0. 2 / 6 0. 444 0. 611 1. 118 1. 819
0. 141 0. 274 0. 434 0. 620 1 108 1. 820 プ レー ト D 0. 135 0. 266 0. 401 0. 601 1 001 1. 779
2-8°C保存 0. 122 0. 250 0. 435 0. 622 1 121 1. 801 平均 0. 129 0. 258 0. 418 0. 612 1 061 1. 790 保存後 プ レー ト C 0' 092 0. 252 0. 423 0. 675 1 - 022 1. 850
6 力 月 2- 8°C保存 0. 085 0. 273 0. 386 0. 616 1. 005 1. 781 平均 0. 089 0. 263 0. 405 0. 646 1. 014 1. 816 プ レー ト C 0. 077 0. 271 0. 429 0. 690 1. 099 1 921
3 0 °C保存 0. 098 0. 252 0. 422 0. 553 1. 113 1 699 平均 0. 088 0. 262 0. 426 0. 622 1. 106 1 810 プ レー ト D 0. 088 0. 250 0. 399 0. 611 0. 999 1 859
2-8。C保存 0. 085 0. 287 0. 435 0. 599 1 152 1. 911 平均 0. 087 0. 269 0. 417 0. 605 1 - 076 1. 885
[発明の効果
予め ゥエルに試薬が添加 されて いて 、 保存、 運搬等が可能な ゥエルプ レー ト を提供 し た。 こ れに よ り 免疫分析操作が簡略化 でき る

Claims

1 »Β_ 求 の 範 囲
1 . ゥ エルプ レー ト の各ゥ エルに乾燥した試薬が入れ られて いて、 各ゥ エルが ゥ エルプレー ト 上面において乾燥剤入 り フ ィ ルム で密封されている免疫分析用 ゥエルプレー ト
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