WO1998016555A1

WO1998016555A1 - Sels de metaux de transition d'un polypeptide et procede d'accroissement de l'activite anti-vih de ce polypeptide

Info

Publication number: WO1998016555A1
Application number: PCT/JP1997/003711
Authority: WO
Inventors: Akiyoshi Matsumoto; Michinori Waki
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 1998-04-23
Also published as: NO991772L; HUP9904615A3; HUP9904615A2; EP1016672A4; AU4572197A; NO991772D0; US6329498B1; RU2179981C2; AU713591B2; CN1233257A; CA2268011A1; KR20000049105A; EP1016672A1

Description

明細書

ポリべプチド遷移金属塩、およびポリべプチドの抗 H I V活性増強法技術分野

本発明はリポ多糖類、特にェンドトキシンに強い親和性を示すポリぺプチドの遷移金属塩に関し、更に本発明は、該ポリペプチドを遷移金属塩とすることにより、ポリペプチドの有する抗ウィルス効果（例えば抗 H I V効果）を安定的に高度に発現する、活性増強法、並びに該ポリべプチドの遷移金属塩を活性成分として成るウイルス、特に H I Vの活動を阻害するための製薬学的組成物及び製剤学的組成物に関する。

背景技術

下記文献に示すように、従来、カブトガ二からエンドトキシンに親和性を示し、抗菌性を示すポリべプチド 2族が単離報告されている。

例えば、 Shigenagaら、 J. Biol. Chem. , 265 ： 21350〜 21 354 ( 1990) ； Kawanoら、 J. Biol. Chem.， 265 : 15365 -15367 (1990) ； Mutaら、 J. Biochem.， 108 ： 261〜 266 ( 1990) ；特開平 2— 167230号公報；特開平 2— 1 52987号公報；特開平 2— 53799号公報； US P 5068 314 (公表特許公報平 2— 500194) ； Miyataら、 J. Bioch em. , 106 ： 663〜 668 ( 1989) ； Aka j iら、 Chem. Pharm. B ull. 37 : 2661〜 2664 (1989) ; Tokunaga および Iwan aga、代謝、 26 ： 429〜 439 ( 1989) ； Shiehら、 FEBS Lett. ， 252 : 121〜 124 (1989) ； Nakamura ら、 J. Biol. Che m. , 263 : 16709〜 16713 (1988) を参照。

一つの族（夕キプレシン族）は、日本産カブトガニ Tachypleus属から単離され、タキプレシン I、 II 及び III が同定されている。他の一族（ポリフエムシン族）は、米国産カブトガニ Limulus polyphemus から単離され、ポリフエムシン I 及び Π が同定されている。

また夕キプレシン、ポリフエムシンの両族とも、グラム陰性およびグラム陽性細菌の何れをも、またキャンディダアルビカンスのごとき真菌に対し低濃度でその発育を阻害し、細菌リポ多糖と複合体を形成することが見出されている

[Shigenagaら、 J. Biol. Chem.， 265 : 2 1 350〜 2 1354 ( 1 990) ； Mutaら、 J. Biochem. , 108 : 26 1〜 266 ( 1 990) ] 。

また、夕キプレシン族のポリペプチドは、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウィルス [ Murakamiら、 Chemotherapy ， 37 ： 327〜 334 ( 1 99 1 ) ] またはヒ卜免疫不全ウィルス [Morimotoら、 Chem otherapy ， 37 : 206〜 2 1 1 ( 199 1 ) ]

のごときウィルスにある種の阻害作用を示すことが知られている。

一方、高度に分化したヒ卜の生存維持に関し、ヒト免疫不全ウィルス (H I V) の感染により引き起こされる後天性免疫不全症候群（A I D S) の発症に対し予防または治療効果の期待される薬剤の開発が望まれている。

本発明者らは既に、これらエンドトキシン親和性ポリペプチドの構造変換と抗ヒ卜免疫不全ウィルス（抗 H I V) 活性の相関についての研究により、カブトガ二のポリぺプチドの共通構造とは基本的に異なる一連の高い抗 H I V活性を有するポリぺプチド群を見出し以下の文献等にて公表した。 [Nakashimaら、 Antimicrob. Agents Chemother. , 36 ： 1249 ~ 1 255 (1 992) ; Masudaら、 Biochem. Biophys. Res. Commun.， 18 9 ： 845〜 850(1 992) ; Tamamuraら、 Chem. Pharm. Bull.， 4 1 ： 978〜 980 (1 993) ; Tamamuraら、 Biochim. Biophys. Acta, 1 163 : 209〜 2 16 (1 993) ; Masudaら、 J. Pharmacobio. D yn. , 1 5 : s— 90 ( 1992) ; U S P 557 1 892 (P CT国際公開公報 W092/04374号）； U S P 5449752 (曰本国特許公開公報特開平 5— 1 63298号公報） ]

当初のカブトガニ由来ポリべプチドの基本構造に摸して、アミノ酸 1 6〜 18残基からなるポリベプチドの抗 H I V活性発現の為の構造要件を検討した結果から、本発明者らは更に、最小必須構造概念を中心とする改良発明を提出した [P CT国際公開公報 W095 1 0534号] 。これら、上記発明に基づきカブトガ二のポリぺプチドを基準物質として得られた抗 H I V活性を発現するリ一ド化合物 · ポリベプチドの構造概念は、下記式 [I ]にて集約することが出来る。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ai— A₂— Cys— A₂— A₃— A₃— X— Y— Z— Λ₂— A₃— A₃— Cys— A₃— A₄

[ I ] (配列番号： 1)

[式中は、独立して Lys、 Argおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基；前記塩基性ァミノ酸を少なくとも 2個有するぺプチド残基；前記塩基性ァミノ酸残基または前記べプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基の N— α位の水素原子がァシル基もしくは置換チォカルバモイル基で置換されている Ν— α置換ァミノ酸残基もしくは Ν— α置換べプチド残基を示し、 A ₂ は、独立して Phe、 Trpおよび Tyrから選ばれるアミノ酸残基を示し、

A ₃ は、独立して Arg、 Lysおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基を示し、

A ₄ は、一〇H (カルボキシル基由来）または一 N H ₂ (酸アミド基由来）を示し、

Xは、 Ala, Val， Leu, He, Ser, Metおよび Cys から選ばれる 1個のアミノ酸残基の次位に、 A ₂ の 1個のアミノ酸がペプチド結合により連結したアミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

Yは、 Gly と、 A ₃ の 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基、又は Pro と、 D- Arg、 D- Lysおよび!)- Orn から選ばれる 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2 残基のぺプチド残基を示し、

Zは、 Ala, Val, Leu, lie, Ser, Met および A ₂ から選ばれる 1個のァミノ酸残基の次位に、 Cys がべプチド結合により連結して成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

ぺプチド結合により連結した X - Y - Z残基は、 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とぺプチド結合を介して連結しているか、または

X Zが同時に欠落することにより Y残基が 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とペプチド結合を介して直接結合しても良く、その際、 Yの構成アミノ酸である D- Lys、 L-Lys、 D-Orn もしくは L- Orn の側鎖 ω _ ァミノ基の水素原子は、 ω—ァミノァシル基で置換されていてもよい]。上記の式 [ I ]の構造を有するとき、高い抗 H I V活性の発現に加えて、特定部位を修飾することによっても活性の低下がみられず、むしろその修飾によって基本構造の有する物理 ·化学的性質や治療用法の巾広い選択例えば、親水性、親油性を增減したり、特定の組織、臓器、細胞に選択的に集積すること又は体内での滞留時間を増減したりする方法や剤形の展開が可能となるポリべプチドであることは既に開示した通りである。式 [ I ] に包含されるポリペプチドの内、それ自体高い抗 H I V活性を示す化合物を表 1に例示する。

[I] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 15

Ai 一 A₂— Cys— A₂— A₃— A₃ — X Y Z - A₂— A₃— A₃ - Cys— A₃— A₄ (配列番号: 1)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

(1) Ar —Arg— Trp— Cys- Tyr— Arg—し ys— Cys—Tyr— Lys— Gly— Tyr— Cys— Tyr— Arg— Lys— Cys— Arg— NH₂ (配歹 ij番号： 2 )

1 2 3 4 5 6 (7) 8 (9) 10 11 12 13 14 15

(2) Arg― Arg— Trp— Cys— Tyr― Arg— Lys DLys— Pro -Tyr一 Arg― Lys― Cys― Arg― NH ₂

(3) Arg - Trp一 Cys— Tyr— Arg— Lys— Cys— Tyr— Arg— Gl y— I le— Cys— Tyr— Arg— Lys— Cys— Arg - NH ₂ (配列番号: 3)

(4) Arg-Arg— Trp— Cys-Tyr— Arg— Lys— Cys— Tyr— Arg— Gly— Ile-Cys— Tyr— Arg— Lys— Cys— Arg-NH₂ (配列番号： 4)

(5) Ac— Arg— Arg— Trp— Cys— Tyr— Arg— Lys— Cys— Tyr— Arg— Gly— lie— Cys— Tyr— Arg-Lys— Cys— Arg— NH₂ (配歹リ番号： 4)

(6) Parni-Arg-Arg-Trp— Cys-Tyr— Arg— Lys— Cys— Tyr— Lys— Gly- He— Cys-Tyr- Arg— Lys— Cys— Arg-NH₂ (配列番号： 5)

(7) FTC_Arg— Arg— Trp— Cys— Tyr— Arg_Lys— Cys— Tyr— Lys— Gly— Tyr— Cys— Tyr— Arg— Lys— Cys— Arg— NH₂ (配列番号: 2)

表 1 (続き）

1 2 3 4 5 6 (7) 8 (9) 10 11 12 13 14 15

(8) Myr― Arg - Arg一 Trp— Cys― Tyr一 Arg― Lys - Cys― Tyr— Lys— Gly— Tyr― Cys一 Tyr― Arg一 Lys― Cys一 Arg一 NH ₂ (配列番号： 2)

(9) Arg— Arg— Trp—Cys— Tyr— Arg— Lys—Cys— Tyr― Dし y s - Pro― fyr—Cys— Tyr— Ar —Lys— Cys一 Arg— H₂

(10) Arg— Arg—Trp— Cys― Tyr—Arg— Lys— Cys— Tyr― Pro― DLys-Ile—Cys— Tyr—Arg— Arg― Cys― Arg— H₂

£— N - Ac - '

(11) Arg一 Arg― Trp― Cys—Tyr— Arg一 Lys- -- DLys-Pro Tyr— Arg— Lys— Cys— Arg— H₂

(12) FTC - Arg - Arg - Trp - Cys - Tyr - Arg - Lys- -DLys-Pro- Tyr— Arg― Lys― Cys― Arg― NH ₂

£-N-But-

(13) FTC― Arg― Arg― Trp― Cys—Tyr— Arg— Lys DLys—Pro Tyr—Arg— Lys— Cys— Arg— H₂

£ - N - Ac j

(14) FTC—Arg— Arg— Trp― Cys—Tyr— Arg— Lys Pro― DLys Tyr—Arg— Lys— Cys— Arg― NH ₂

本発明者は、式 [ I ]に示すポリペプチドが、抗 H I V活性を特異的に示すその理由付けを究明する過程で、本ポリぺプチドと遷移金属との塩形成が、ポリぺプチドの安定的に高い抗 H I V活性を発現保持するという事実を得て、本発明に到達した。

本発明の第 1の目的は、抗ウィルス活性を示す特定の構造式を有するポリべプチドの新規な遷移金属塩を提供することであり、第 2の目的は該ポリぺプチドを遷移金属塩とすることにより生理活性、特に抗 H I V 活性等の抗ゥィルス活性を増強し、且つ治療剤としての製剤学的に安定な活性を発現する方法並びに製剤学的組成物を提供することである。発明の開示

本発明はリポ多糖類、特にエンドトキシンに強い親和性を示す、式 [ I ] で表されるポリペプチドの遷移金属塩に関し、更に本発明は、該ポリぺプチドを遷移金属塩とすることにより、ポリぺプチドの有する抗ウイルス効果（例えば抗 H I V効果）を安定的に高度に発現する、活性増強法に関する。

すなわち、本発明は、

( 1 ) 下記式

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Ai— A ₂—し ys— Λ ₂— A₃— A₃— X— Y— Z— A ₂— Λ ₃— A₃— Cys— A₃— A₄

[ I ] (配列番号： 1 )

[式中は、独立して Lys、 Argおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基；前記塩基性ァミノ酸を少なくとも 2個有するぺプチド残基；前記塩基性ァミノ酸残基または前記べプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基の N— α位の水素原子がァシル基もしくは置換チォカルバモイル基で置換されている N— α置換ァミノ酸残基もしくは Ν— α置換べプチド残基を示し、

Α ₂ は、独立して Phe、 Trpおよび Tyr から選ばれるアミノ酸残基を示し、

A ₄ は、 — O H (カルボキシル基由来）または— N H ₂ (酸アミド基由来）を示し、

は、 Ala, Val, Leu, He, Ser, Metおよび Cys から選ばれる 1個のァミノ酸残基の次位に、 A ₂ の 1個のアミノ酸がぺプチド結合により連結したァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

Yは、 Gly と、 A ₃ の 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2残基のペプチド残基、又は Pro と、 D- Arg、 D_Lysおよび！)- Orn から選ばれる 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2 残基のペプチド残基を示し、

ぺプチド結合により連結した X - Y - Z残基は、 6位と 1 0位のそれぞれのアミノ酸残基とペプチド結合を介して連結しているか、または

X Zが同時に欠落することにより Y残基が 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とペプチド結合を介して直接結合しても良く、その際、 Yの構成アミノ酸である D- Lys、 L- Lys、 D-Orn もしくは L-Orn の側鎖 ω _ ァミノ基の水素原子は、 ω—アミノアシル基で置換されていてもよい] で示されるポリぺプチド化合物と、遷移金属との塩であるポリぺプチド遷移金属塩化合物あるいは該ポリぺプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩、

( 2) ( 1 ) の遷移金属との塩が錯塩であるポリペプチド遷移金属塩化合物あるいは該ポリぺプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩、

( 3) 遷移金属が、鉄族（Fe， Co, Ni) 、銅族（Cu， Ag, Au) 、亜鉛族（Zn， Cd， Hg) およびマンガン族（Mn， Tc, Re) からなる群から選ばれる遷移金属である（ 1 ) または（2) のポリペプチド遷移金属塩化合物あるいは該ポリぺプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩、

(4) 下記式

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 A]一 A₂—し ys— A₂— A₃— A₃— X— Y— Z— A₂— A₃— A₃— Cys— A₃— A₄

[ I ] (配列番号： 1 )

[式中 A! は、独立して Lys、 Argおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基；前記塩基性ァミノ酸を少なくとも 2個有するぺプチド残基；前記塩基性ァミノ酸残基または前記べプチド残基のァミノ末端アミノ酸残基の N— α位の水素原子がァシル基もしくは置換チォカルバモイル基で置換されている Ν— α置換ァミノ酸残基もしくは Ν— α置換べプチド残基を示し、

A ₂ は、独立して Phe、 Trpおよび Tyr から選ばれるアミノ酸残基を示し、

A₄ は、一〇H (カルボキシル基由来）または一 NH₂ (酸アミド基由来）を示し、

Xは、 Ala, Val, Leu, lie, Ser, Metおよび Cys から選ばれる 1個のアミノ酸残基の次位に、 A ₂ の 1個のアミノ酸がペプチド結合により連結したアミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

Yは、 Gly と、 A ₃ の 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基、又は Pro と、 D- Arg、 D- Lysおよび D- Orn から選ばれる 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2 残基のぺプチド残基を示し、

Zは、 Ala， Val, Leu, lie, Ser, Met および A ₂ から選ばれる 1個のアミノ酸残基の次位に、 Cys がべプチド結合により連結して成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

X Zが同時に欠落することにより Y残基が 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とペプチド結合を介して直接結合しても良く、その際、 Yの構成アミノ酸である D - Lys、 L- Lys、 D-Orn もしくは L- Orn の側鎖 ω— ァミノ基の水素原子は、 ω—アミノアシル基で置換されていてもよい] で示されるポリべプチド化合物の抗 H I V作用活性発現法において、遷移金属との塩とすることにより、抗 H I V作用の高く且つ安定な活性を発現する方法、

( 5 ) ( 1 ) に示すポリペプチド遷移金属塩化合物、あるいは該ポリぺプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩の有効量及び製薬学的担体を含む製薬学的あるいは製剤学的組成物、

( 6 ) ウィルスの活動を阻害するための（ 5 ) の組成物、 ( 7 ) 患者体内の H I Vの活動を阻害するための（5 ) の組成物、を提供する。

前記 N—ひ位の水素原子と置換されるァシル基としては、炭素数 2 ~ 1 8のァシル基があげられ、具体的にはァセチル基、プロピル基、プチリル基、へキサノィル基、ォクタノィル基、デカノィル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、ニコチノィル基等が例示される。前記 N— α位の水素原子と置換される置換チォカルバモイル基の置換基としては、フルォレツセイン基、フヱニル基、置換フエニル基（例えばジメチルアミノフヱニルァゾフヱニル基等）等があげられる。

前記 Υの構成アミノ酸である D— L y s、 L— L y s、 D— O r nまたは L 一 O r nの側鎖 ω—ァミノ基の水素原子と置換される ω—ァミノァシル基としては、炭素数 2〜6の ω—ァミノァシル基があげられ、具体的には ω—アミノアセチル基、 ω—アミノブチリル基、 ω—ァミノへキサノィル基等が例示される。

発明を実施するための最良の形態ここに規定のポリぺプチド配列において、各記号は国際的に認められた三文字表示によるァミノ酸残基または置換ァミノ酸残基を示し、特に表示しない限り、 L—体を表す。すなわち各記号は下記アミノ酸または置換ァミノ酸の残基を示す。

Ala (ァラニン）； Arg (アルギニン）； Cys (システィン）； l ie (ィソロイシン）； Gly (グリシン）； Leu (ロイシン）； Ser (セリン）； M et (メチォニン）； Lys (リジン）； Orn (オル二チン）； Phe (フエ二ルァラニン）； Pro (プロリン）； Trp ( トリプトファン）； Tyr (チロシン）； Val (パリン）； DArg (D-アルギニン）； DLys (D-リジン）； D Orn (D-オル二チン）； Ac- Arg (N- α—ァセチルアルギニン）； FTC- Arg (N - α-フルォレツセィンチォ力ルバモイル化アルギニン）； Laur- Arg (Ν-α-ラウロイルアルギニン）； Myr- Arg (Ν- α-ミリストイルアルギニン）； N i c o t— A r g (Ν—ひ一ニコチノィルアルギニン）； 0 c t一 A r g (N— α—ォクタノィルアルギニン）； P a r m— A r g (N—ひ一パルミトイルアルギニン）； P a rm— O r n (Ν— α—パルミトイルオル二チン）； PTC— A r g (N— α—フエ二ルチオカルバモイル化アルギニン）； ε— N_A c— D L y s ( ε— N— ω—アミノアセチルー D—リジン）及び ε— N— B u t— DL y s ( ε -N - ω—アミノブチリル一 D—リジン）。

本発明は、上記の観点に基づき完成され、下記式 [ I ]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ai— A₂—し ys— /\₂— A₃— A₃— X— Y— Z— A₂— ft₃— A₃— Cys— A₃— A₄

[ I ] (配列番号： 1)

[式中は、独立して Lys、 Argおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基；前記塩基性ァミノ酸を少なくとも 2個有するぺプチド残基；前記塩基性ァミノ酸残基または前記べプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基の N—ひ位の水素原子がァシル基もしくは置換チォカルバモイル基で置換されている N— α置換ァミノ酸残基もしくは Ν— α置換べプチド残基を示し、

A 2 は、独立して Phe、 Trpおよび Tyr から選ばれるアミノ酸残基を示し、 A ₃ は、独立して Arg、 Lysおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基を示し、

A ₄ は、一 O H (カルボキシル基由来）または一 N H ₂ (酸アミド基由来）を示し、

Xは、 Ala, Val, Leu, He, Ser, Metおよび Cys から選ばれる 1個のアミノ酸残基の次位に、 A ₂ の 1個のアミノ酸がペプチド結合により連結したアミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

Yは、 Gly と、 A ₃ の 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2残基のペプチド残基、又は Pro と、 D- Arg、 D- Lysおよび!)- Orn から選ばれる 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2 残基のぺプチド残基を示し、

Zは、 Ala, Val, Leu, He, Ser, Met および A ₂ から選ばれる 1個のァミノ酸残基の次位に、 Cys がべプチド結合により連結して成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

ペプチド結合により連結した X - Y - Z残基は、 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とぺプチド結合を介して連結しているか、または X Zが同時に欠落することにより Y残基が 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とペプチド結合を介して直接結合しても良く、その際、 Yの構成アミノ酸である D- Lys、 L- Lys、 D-0rn もしくは L_0rn の側鎖 ω— ァミノ基の水素原子は、 ω—アミノアシル基で置換されていてもよい] で示されるポリべプチド化合物と、鉄族、銅族、亜鉛族及びマンガン族から選ばれる遷移金属との塩を包含するポリぺプチドの塩であり、遷移金属塩の形態が錯塩であるポリぺプチド化合物の塩を提供し、その目的は、高い抗 H I V効果を示す式 [ I ] のポリぺプチド化合物の活性を安定的に更に高度に発現せしめる、塩形成物と、活性増強法の提供に関する。

以下さらに詳しく本発明の新規ポリぺプチド遷移金属塩化合物について説明する。

ポリペプチドの調製

本発明の式 [ I ] で示されるポリペプチドは、それ自体公知の方法、例えば Stewart&Young著ピアス化学会社発行、ロックフォード、ィリノィ州（1984)" 固相ペプチド合成法" に記載されている固相合成技法によつて製造することができる。式 [ I ] 中 A ,においてアミノ末端ァミノ酸残基の N— α位の水素原子がァシル基で置換されている Ν— α —ァシルァミノ酸残基または Ν— α —ァシルぺプチド残基である場合、直鎖状の式 [ I ] のポリペプチドを不溶性樹脂に結合したポリペプチド樹脂として調製し、該ポリべプチド樹脂とァシル基に該当する酸無水物または力ルボン酸とを縮合剤を用いて反応させ、 Ν末端ァミノ基をァシル化し、 Ν—ァシル化ポリペプチド樹脂とし、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱離させて、直鎖状の式 [ I ] のポリペプチドを調製する。式 [ I ] 中においてァミノ末端 Ν— α位の水素原子が置換チォカルバモイル基で置換されている Ν— α—置換チォカルバモイル化ァミノ酸残基または Ν— α —置換チォカルバモイル化ぺプチド残基である場合は、前記ポリぺプチドを置換ィソチオシァネート化合物と微ァルカリ条件下に反応することにより本発明の Ν末端 Ν— α —置換チォカルバモイル化ポリぺプチドを得ることができる。

得られたポリぺプチドは、 1 4位のァミノ酸残基のカルボキシル末端はフリー（Α ₄ が一〇Ηに相当）である力あるいは酸アミド（Α ₄ — NH₂に相当）に変換することもできる。

前記固相合成法に使用される各ァミノ酸は特に表示しないかぎりは L 体を示し、 8位 Yを構成するプロリンと対をなす塩基性ァミノ酸は D体に限定される。

別法として、本発明のポリぺプチドはリコンビナント DN A技法により調製することもできる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列のポリヌクレオチドをクローン化し、よく知られた既存の技術を用いて該ポリぺプチドを発現させることが出来る。

例ば、 Mniatisら、 Molecular Cloning, Λ Laboratory Mannual, Col d Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1991を参照 ₀ かくして得られたポリべプチドは、ポリべプチドのそれ自体知られた単離精製手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気泳動、向流分配等により単離精製することができるが、逆相高速液体クロマトグラフィ一による方法が最も効果的である。

これらの製法による具体的実例は、既に開示された U S P 557 1 892 (国際公開公報 W092Z04374号）； U S P 544975 2 (特開平 5— 163298号公報）及び国際公開公報 W095/1 0 534号の明細書を参照することができる。

式 [ I ] で示されるポリぺプチドは、分子内に C y s残基、 A r g残基、 L y s残基を包含し、立体構造的知見により、最低 1対の C y s残基又は A r g残基が立体構造の同一側面に一 S II側鎖又はグァニジン側鎖を配座する形をとり、該側鎖は遷移金属と安定的に錯塩を形成し易い。しかしながら、通常該ポリぺプチドは、酸化して一 S— S—体となっているので、更に容易に遷移金属との錯塩を形成しやすくするために、錯塩形成に際しては、あらかじめ、一 S H (還元）体として遷移金属との塩を形成するのが好ましい。

例えば、該還元体の酢酸塩の中性水溶液に遷移金属の塩、好ましくは遷移金属と有機酸または無機酸との水溶性の塩（例えば、酢酸亜鉛）を少なくとも 2当量以上添加することにより遷移金属との塩を形成することができる。

本発明の式 [ I ] で示されるポリペプチド遷移金属塩化合物は極めて強い塩基性を示す。

この強い塩基性故に酸付加により付加塩を形成する。たとえば無機酸 (塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）、有機カルボン酸（酢酸、トリフルォロ酢酸のごときハロゲン化酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クェン酸、酒石酸、サリチル酸など）、グルクロン酸、ガラクッロン酸、グルコン酸、ァスコルビン酸等の酸性糖類、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸類、アルギン酸等の多糖硫酸ェステルを含むこともある酸性多糖、または有機スルホン酸（メタンスルホン酸、 P— トルエンスルホン酸など）等の薬学的に許容される酸との塩を形成する。本発明の前記式（ I ) で示されるポリペプチドとの遷移金属塩は、これらの薬学的に許容しうる酸との付加塩として製剤学的組成物に用いることができる。

本ポリぺプチド遷移金属塩化合物の用途

式 [ I ] にて示すポリペプチドの遷移金属塩化合物は、エンドトキシン結合能力、抗菌活性及びエンドトキシン感作血球溶血性を有する。加えるに、本発明のポリぺプチド遷移金属塩化合物は極めて高い抗ゥィルス活性を有する。実施の態様として、本発明のポリペプチド遷移金属塩化合物は、抗 H I V活性を有する。

本発明による薬剤、特に抗 H I V剤は、有効成分として、前記式 [ I ] で示されるポリぺプチド遷移金属塩化合物または該ポリぺプチド遷移金属塩化合物の薬学的に許容しうる酸との付加塩と、薬剤の投与方法および投与形態に応じて選択されうる薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として調製される。薬学的に許容される担体としては、 Hank' s もしくは Ringer' s 溶液、生理食塩液、グルコース生理塩溶液、またはそれらの混合液、及びへパリン化クェン酸 Zクェン酸ソ一ダ塩 Zブドウ糖溶液として知られる生理的緩衝液を例示できる。また、本発明の抗 H I V剤は、生体内部ウィルス疾患、あるいは生体表面等の生体外部ウイルス感染部の治療又は消毒対象に応じて、経口的にあるいは非経口的に投与され、その投与方法に応じて適宜な薬物担体により、粉末、顆粒、注射用もしくは内服用液剤、錠剤、座剤、ペッサリー、軟膏、クリーム、エアゾールなどの製剤として調製することができる。

本発明の抗 H I V剤を、注射剤として直接、生体に投与する場合には、本発明のポリぺプチドまたはその塩を、ヒト体重 kg, 1日あたり 1 O mg ないし 5 0 0 O mgあて生理食塩液に溶解し点滴静注により連続的又は間欠的に投与することができる。

実施例

以下実施例を掲げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定を受けるものではない。

ここに示す実施例にて、ポリべプチド（ 1 ) およびポリべプチド（2 ) の遷移金属塩の製造例、及び該ポリべプチド遷移金属塩の抗 H I V活性検定結果を既知ェンドトキシン親和性ポリべプチドのそれとともに示す。実施例 1 ：ポリぺプチド（ 1 ) 亜鉛錯体塩の調製

下記式に示すポリべプチド（1) は、 US P 5571892 (P CT 国際公開公報 W092Z04374号）、 US P 5449752 (日本国特許公開公報特開平 5— 163298号）に記載した方法にて合成調達した。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ai— A₂— Cys— A₂— A₃— A₃— X— Y— Z— A₂— A₃— A₃— Cys— A₃— A₄

[ I ] (配列番号： 1)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Arg-Arg-Trp -Cys -Tyr -Arg -Lys -Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-

11 12 13 14 15

Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂

(1) (配列番号： 2 )

1. 1 ポリペプチド（ 1 ) の還元体の調製；

上記 P C T国際公報等に従い調製したポリペプチド（1) 酢酸塩（ 1 0. 2mg, 3. 37〃mo 1 ) を精製水（0. 5m l ) に溶かした。この溶液に、ポリべプチド（1) に対して 50倍当量のジチオスレィトール（生化学工業（株）製）（26. Omg, 169 //mo 1 ) を加え、窒素ガスをフラッシュし、窒素気流下、室温 2時間攪拌した。該還元反応の進行状況は H P L Cで追跡し、完全に還元が進行したことを確認した。

還元反応が完了した該反応溶液を、予め 25% 酢酸水溶液で平衡化したセフアデックス G— 25 (ファイン）（フアルマシアバイオテク（株 ) ) カラム（2. 5 x 70 cm) にアプライし、同じ 25% 酢酸水溶液で溶出し、分画（1 分画 == 224滴）を行った。エールマン反応 [G. L. E l l ma n、 A r c h. B i o c h em. B i o p h y s .. _8_2. 70 ( 1959) ；チオール基の検出法] およびフルォレスカミン反応 [A.M. F e 1 i xら， J . C h r oma t o g r.、 8 、 361 ( 1974) ；ァミノ基の蛍光検出法] に陽性の分画番号 2 6および 27の分画部分を集め、該分画溶液を減圧濃縮し、 10%酢酸水溶液で希釈後、その溶液を凍結乾燥し、目的とするポリペプチド（1) の還元体酢酸塩を得た。

収量： 6. 8mg (収率 67%)

1.2 ポリペプチド（1) の還元体の分析：

1. 1で得られたポリべプチド（1) の還元体酢酸塩を、 L i uらの方法 [T.— Y. L i uら， J . B i o l . C h em.、 251、 1936 ( 1976) ] に従い、 0. 2%トリプ夕ミン含有 4M メタンスルホン酸中、 1 15°C、 24時間の酸加水分解を行った。そのアミノ酸組成値は、ポリぺプチド（ 1 ) の還元体のァミノ酸組成値とよく一致した。得られたポリペプチド（1) の還元体酢酸塩の比旋光度 [a] ²⁰D は — 26. 0° (c = 0. 09、 1 M 酢酸水溶液）であった。

更に、得られたポリペプチド（1) の還元体酢酸塩は、下記条件下での H P L C分析で単一ピークを示した。

く H P L C分析条件および結果〉

カラム： TSK g e l ODS- 120 T (0.46 x 15 cm) (東ソ一（株）） +TSK g u r d g e l ODS- 120T (0. 32 χ 1.5 c m) (東ソ一（株））グラジェント溶離：

溶離液： 10% ァセトニトリル /0. 1 % トリフルォロ酢酸（ A液）

80% ァセトニトリル /0. 1 % トリフルォロ酢酸（B液）グラジェント条件：

グラジェント時間 B液濃度 A液濃度

1.0分 0% 10%

29.4分 42% 39.4%

35.0分 100 % 80 %

温度： 40°C

流速： 0.8m lノ分

検出： 220 nmおよび 280 nm

アプライ量： 5 1 (ペプチド濃度： 1 mgZm 1 ) 溶出時間：ポリペプチド（1)の還元体酢酸塩 19. 27分ポリペプチド（1)の酢酸塩 18. 24分 1.3 ポリぺプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩の調製：

1. 1で得られたポリペプチド（1) の還元体酢酸塩を，精製水あるいは 1 M酢酸アンモニゥム緩衝液（pH 7.2) に溶解した。

この水溶液あるいは緩衝液溶液に、ポリぺプチド（ 1 ) 還元体に対して 2当量の亜鉛（ I I ) イオンに相当する 0. 005 M 酢酸亜鉛水溶液を加えた。最終のぺプチド濃度は 5mg/m 1になるように調節し、ポリべプチド（ 1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液を得た。

1.4 ポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩のイオンスプレー質量分析法による構造確認： 1.3で得られたポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液の一部を取り、その溶液を構造解析の検体溶液とし、下記条件下イオンスプレー質量分析法により構造分析した。

〈イオンスプレー質量分析条件〉

装置：トリプルステージ四重極型質量分析装置 AP I I I E 型

(P e r k i n-E l me r S c i e x社製品；宝酒造（株

) 扱い）

サンプノレ注入： H a r v a r d A p p a r a t u s s y r i n g e i n f u s i o n p um 22 (S o u t h N a t i c k、 MA S S) を使用し、流速 5 1 Z分で注入

オリィフィス電圧： 130 V

マススペクトル範囲等：質量対電荷比（mZ z ) 600 - 18

00

(ステップワイズ 0.5 a m u.での陽イオンモードにより、平均 30スキャン）

得られたデータの分析： Ma c s p e c 3.22 (S c i e x) で分析

〈イオンスプレー質量分析の結果〉

2 +および 3 +の電荷物状態のマス値（mZz ： 1277.00および 851.67) がそれぞれ観察された、その再構成マス値（mZ z ： 2552.48) は還元ポリペプチド（ 1 ) + Z n 一 4Hの計算マス値（mZ z ： 2552.40) によく一致した

すなわち、還元ポリぺプチド（ 1 ) と亜鉛（ I I ) イオンがぺプチド： Z n = 1 ： 1の錯体を形成していることが示された。

〈考察〉

ぺプチドあるいは蛋白と金属錯体の構造をイオンスプレー質量分析あるいはエレクトロスプレー質量分析により同定出来ることが既に報告されている。例えば H. E.W i t k ows k aらのグルココルチコィドレセプターの DN A結合ドメィンの亜鉛フィンガー構造の分析 [ J . Am e r. C h em. S o c.、 1 17、 3319 ( 1995) ] 、 T. W. H u ' t c h e n sらの亜鉛フィンガー蛋白ドメィンへの銅配位構造の分析 [F E B S L e t t., 309、 170 ( 1992) ] およびイオンスプレー質量分析法に関する梅田の総説 [蛋白質核酸酵素、 ϋ、 1655 (1991) ] 等を参照。

今回の実験に於いても、ポリペプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) ィオンとの錯体の構造が、ィオンスプレー質量分析法により同定可能なことが明らかになった。

1.5 ポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩の紫外吸収スペクトル測定分析による構造確認；

1. 1で得られたポリぺプチド（ 1 ) 還元体の水溶液および 1.3 で得られたポリペプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液の一部をとり、その各溶液を構造解析の検体溶液とし、下記条件下、紫外吸収スぺクトル及びその差スぺクトルを測定し、その分析より構造分析した。

〈紫外吸収スぺクトル測定〉

機器：紫外可視分光光度計 Ub e s t— 30(日本分光（株））測定波長： 200— 340 nm サンプル：フレツシュに調製した各検体を測定チューブに取った後、窒素ガスをフラッシュし、直ちに測定した通常の紫外吸収スぺクトル：

対照側：蒸留水

検体側：ポリぺプチド（ 1 ) 還元体溶液及びポリぺプチド

(1) 還元体と亜鉛（ I 〖）イオンとの錯体溶液紫外吸収差スぺクトル：

対照側：ポリぺプチド（ 1 ) 還元体溶液

検体側：ポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液

〈紫外吸収スぺクトル測定結果〉

通常の紫外吸収スぺクトル：

ポリぺプチド（ 1 ) 還元体溶液：ポリぺプチド（ 1 ) 構成ァミノ酸の T r pに特徴的吸収である 250— 300 nmに大きな吸収の山を示した。 278 n mの吸収極大と 280 n mのショウルダ一を示したが、これは T r pに起因する特有の吸収である。

ポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液： 25 0 nm近辺から 200 nmにかけて、上記ポリべプチド（1) 還元体溶液の吸収曲線に、ブロードに上乗せした吸収曲線が得られた。吸収波長をさらに明確にするため、下記の差スぺクトルを測定した。

紫外吸収差スぺクトル：

215— 235 n mの範囲を差吸収の山とする差スぺクトルが得られた

〈得られた紫外吸収スぺクトルの分析〉上記の様に、ポリぺプチド（ 1 ) 還元体溶液に亜鉛（ I I ) ィオンを添加すると、 215— 235 nmの範囲を中心としてプロ一ドに紫外吸収が増大することが観測された。

この観察結果は、下記で考察する様に、ポリペプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの溶液に於いては、ポリペプチド（1) の還元体の C y sの S H基が亜鉛（ I I ) イオンとメルカプチド結合で錯体を形成していることを明示している。

〈考察〉

重金属解毒に関与する蛋白、メタ口チォネインは、その構成 C y s残基の S H基が、カドミウム（ I I ) 、亜鉛（ I I ) 、銅（ I， 1 1 ) 、水銀（ I I ) イオン等とメルカプチド結合で錯体を形成して、構成され、アポメタロチォネン（SH体）に金属がメルカプチド結合すると、各金属メルカプチド結合に特有の波長範囲で紫外吸収が増大することが知られている。例えば、亜鉛（ I I ) イオンとのメルカプチド結合体の場合、 220 - 230 nmの範囲を中心としてブロードに紫外吸収が増大することが知られている [J. H. R. K a g i と B. L. V a l l e e、 J . B i o 1. C h e m, 236、 2435 ( 1961 ) ； M. V a s a kら、 B i o c h e m i s t r y、 20, 2852 ( 1981 ) ； A. R. T h r owe rら、 J. B i o l . C h em, 263、 7037 ( 198 8) ； J . H. R. K a g i ら、 E n v i r o nme n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s、 54, 93 ( 1984) 等を参照] 。この亜鉛（ I I ) イオンのメルカプチド結合によるブロードな紫外吸収増大範囲（220— 230 nm) は、上記のポリべプチド（1) 還元体と亜鉛 ( I I ) イオンとの溶液に於いて観察された差スぺクトルの增大波長範囲と一致している。

すなわち、ポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの溶液に於いては、ポリぺプチド（ 1 ) の還元体の C y sの S H基は、亜鉛（ I I ) イオンとメルカプチド結合を形成していることが明示された。

1.6 ポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩の抗 H I V活性；

1.3で得られたポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液の一部を取り、その溶液を抗 H I V活性測定の検体溶液とし、抗 H I V活性を測定した。

実施例 2 ：ポリぺプチド（ 2 ) 亜鉛錯体塩の調製

下記式に示すポリべプチド（2) は、 P CT国際公開公報 W095/ 10534号に記載した方法にて台成調達した。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 A,— A₂— Cys— A₂— A₃— A₃—（X)— Y— (Z)— A₂— A₃— A₃_Cys— A₃— A₄

[ I ] (配列番号： 1)

1 2 3 4 5 6 (7) 8 (9) 10 11

Arg-Arg-Trp - Cys -Tyr -Arg -Lys DLys-Pro Tyr-Arg

12 13 14 15

- Lys - Cys - Arg - NH₂

(2)

2. 1 ポリペプチド（2) の還元体の調製；

上記 P CT国際公報に従い調製したポリペプチド（2) 酢酸塩（1 0. 0 m g, 3. 94 mo 1 ) を精製水（0. 5m l ) に溶かした。この溶液に、ポリぺプチド（ 2 ) に対して 53倍当量のジチオスレィ卜 —ル（生化学工業（株）製）（32. Omg, 207.5 ^mo l ) を加え、窒素ガスをフラッシュし、窒素気流下、室温 2時間攪拌した。該還元反応の進行状況は H P L Cで追跡し、完全に還元が進行したことを確認した。

還元反応が完了した該反応溶液を、予め 25% 酢酸水溶液で平衡化した、セフアデックス G— 25 (ファイン）（フアルマシアバイオテク（株））カラム（2. 5 X 70 cm) にアプライし、同じ 25% 酢酸水溶液で溶出し、分画（1分画 = 224滴）を行った。エールマン反応およびフルォレスカミン反応に陽性の分画番号 25— 27の分画部分を集め、該分画溶液を減圧濃縮し、 10%酢酸水溶液で希釈後、その溶液を凍結乾燥し、目的とするポリペプチド（2) の還元体酢酸塩を得た。

収量： 9. 8m g (収率 98%)

2.2 ポリぺプチド（2) の還元体の分析；

2. 1で得られたポリペプチド（2) の還元体酢酸塩を， 1.2のポリぺプチド（ 1 ) の場合と同様に、 L i uらの方法に従い、 0. 2 % トリプ夕ミン含有 4 Mメタンスルホン酸中、 1 15°C、 24時間の酸加水分解を行った。そのアミノ酸組成値は、ポリペプチド（2) の還元体のアミノ酸組成値とよく一致した。

得られたポリペプチド（2) の還元体酢酸塩の比旋光度 [a] ²⁰D は — 23. 3° ( c = 0. 04、 1M 酢酸水溶液）であった。更に、得られたポリペプチド（2) の還元体酢酸塩は、 1.2のポリペプチド（1) の HP L C分析条件と同様な条件下で HP L C分析し、単一ピークを示した。 <H P L C分析結果〉

溶出時間：ポリペプチド（2) の還元体酢酸塩 16. 14分ポリペプチド（2) の酢酸塩 15. 87分

2.3 ポリべプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩の調製；

2. 1で得られたポリペプチド（2) の還元体酢酸塩を、精製水あるいは 1 M酢酸アンモニゥム緩衝液（p H 7.2) に溶解した。

この水溶液あるいは緩衝液溶液に、ポリペプチド（2) 還元体に対して 1当量の亜鉛（ I I ) イオンに相当する 0. 005 M酢酸亜鉛水溶液を加えた. 最終のペプチド濃度は 5mg/m 1 になるように調節し、ポリべプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液を得た。 2.4 ポリべプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩のィオンスプレー質量分析法による構造確認：

2.3で得られたポリぺプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液の一部を取り、その溶液を構造解析の検体溶液とし、 1. 4のポリべプチド（1) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液のィオンスプレー質量分析の場合と同一条件下、イオンスプレー質量分析法により構造分析した。

〈イオンスプレー質量分析の結果〉

2 +および 3 +の電荷物状態のマス値（mZ z ： 1030.50 と 68 7.34) がそれぞれ観察された、その再構成マス値（m/ z ： 205 9.98) は還元ポリペプチド（2) + Z n— 4 Hの計算マス値（m/ z ： 2059.83) によく一致した。

すなわち、還元ポリベプチド（2) と亜鉛（ I I ) イオンがぺプチド： Z n = 1 ： 1の錯体を形成していることが示された。

2.5ポリぺプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩の紫外吸収スぺクトル測定分析による構造確認

2. 1で得られたポリぺプチド（2) 還元体の水溶液および 2.3 で得られたポリべプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液の一部をとり、その各溶液を構造解析の検体溶液とし、 1.5のポリペプチド（ 1) の場合と同様な条件下、紫外吸収スぺクトル及びその差スぺクトルを測定した。

〈紫外吸収スぺクトル測定〉

通常の紫外吸収スペクトル：

対照側：蒸留水

検体側：ポリぺプチド（ 2 ) 還元体溶液及び

ポリべプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液

紫外吸収差スぺクトル：

対照側：ポリペプチド（ 2 ) 還元体溶液

検体側：ポリぺプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液

〈紫外吸収スぺクトル測定結果〉

通常の紫外吸収スペクトル：

ポリぺプチド（2) 還元体溶液：ポリぺプチド（2) 構成ァミノ酸の T r pに特徴的吸収である 250— 300 n mに大きな吸収の山を示した。 278 nmの吸収極大と 280 nmのショルダーを示したが、これは T r pに起因する特有の吸収である。ポリべプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液： 25

0 nm近辺から 200 nmにかけて、上記ポリぺプチド（2) 還元体溶液の吸収曲線に、わずかにプロ一ドに上乗せした吸収曲線が得られた。

紫外吸収差スぺクトル：

215 - 235 nmの範囲を差吸収の山とする差スぺクトルが得られた。

〈得られた紫外吸収スぺクトルの分析〉

上記の様に、ポリペプチド（2) 還元体溶液に亜鉛（ I I ) イオンを添加すると、 215— 235 nmの範囲を中心としてブロードに紫外吸収が増大することが観測された。

すなわち、ポリペプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの溶液に於いては、ポリぺプチド（ 1 ) の還元体の C y sの S H基は、亜鉛（ I

1 ) イオンとメルカプチド結合を形成していることが示された。

2.6 ポリベプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体塩の抗 H I V活性；

上記で得られたポリペプチド（2) 還元体と亜鉛（ I I ) イオンとの錯体溶液の一部を取り、その溶液を抗 H I V活性測定の検体溶液とし、抗 H I V活性を測定した。

実施例 3 ：ヒ卜免疫不全ウィルス（H I V) に対する抗ウィルス活性実施例 1により調製したポリべプチド（1) 亜鉛錯体、並びに実施例 2により調製したポリぺプチド（2) 亜鉛錯体の H I Vに対する抗ウイルス活性を以下の方法に従い試験し評価した。

96穴マイクロタイタープレー卜に、種々の濃度の試験物質と共に H I V感染 MT— 4細胞（2. 5 104 細胞 Z穴（well)、感染多重度（M 0 1 ) : 0. 00 1 ) を感染直後に加える。 C 0₂ ィンキュベータ一中、 37 °Cで 5日間培養した後、生存細胞数を MTT法 [ Pauwelsら； J . Virol. Methods 20， 309〜 32 1 ( 1 988 ) ] で測定した。抗ウィルス活性は、 H I V感染による細胞死を 50%抑制する濃度（E C so： 50% effective concentration)で表わす。一方、試験物質の MT— 4細胞に対する細胞毒性を知るために、ウィルス非感染細胞を上と同様に、種々の濃度の試験物質と共に培養を行った。細胞毒性は試験物質による 50%細胞障害濃度（C C ₅₀ : 50 % cytotoxic concentr ation)で表わす。また、 C C ₅₀と E C soの概略比（ C C ₅₀ E C ₅₀) を有効比（S I ) として表わした。

抗 H I V活性測定結果を、他の化合物の結果と併せて下表 2に示す c 表 2. 各種化合物の抗 H I V活性

化合物 C C₅o(Aig/ml) E C₅o(/ g/ml) S I (CC₅₀/EC₅o) ポリペプチド（1) 41.53 0.0047 8928 ポリぺプチド（1 )

+ Z n ^{+ +} (2 e q) 38.66 0.008 4808 ポリぺプチド（1 )

の還元体 41. 27 0.0052 80 1 1 [ポリべプチド（ 1)

/2eq Z n^{+ +} ] 錯塩 40.63 0.00 1 3 30683 ポリペプチド（2) 44.60 0.029 1 565 ポリぺプチド（ 2 )

+ Z n^{+ +} (l e q) 38.93 0.033 1 72 ポリベプチド（ 2 )

の還元体 4 1. 1 7 0. 0 4 0 1 0 3 4

[ポリべプチド（2)

/leq Z n ⁺⁺] 錯塩 5 4. 6 3 0. 0 1 4 4 0 5 2

Z η⁺⁺ ( β Μ 0. 4 8 0. 1 5 3 デキストラン硫酸〉 1 0 0 0 0. 6 8 > 1 4 8 0

Α Ζ Τ ( Μ) 1. 9 3 0. 0 0 1 1 7 1 6

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 1 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列の特徴

存在位置： 1

他の情報：

Xaaは、独立して Lys、 Argおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基；前記塩基性ァミノ酸を少なくとも 2個有するぺプチド残基；前記塩基性ァミノ酸残基または前記べプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基の N— 位の水素原子がァシル基もしくは置換チォカルバモイル基で置換されている N— α置換ァミノ酸残基もしくは Ν— α置換べプチド残基を示す。

存在位置： 2

他の情報：

Xaaは、独立して Phe、 Trpおよび Tyrから選ばれるアミノ酸残基を示す。

存在位置： 4

他の情報：

Xaaは、独立して Phe、 Trpおよび Tyrから選ばれるアミノ酸残基を示す。存在位置： 5， 6

他の情報：

Xaaは、独立して Arg、 Lysおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基を示す。

存在位置： Ί

他の情報：

Xaaは、 Ala, Val， Leu, lie, Ser, Metおよび Cys から選ばれる 1 個のァミノ酸残基の次位に、 Phe， Trp または Tyr の 1個のァミノ酸がぺプチド結合により連結したァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示す。存在位置： 8

他の情報：

Xaaは、 Gly と、 Arg， Lysまたは Orn の 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基、又は Pro と、 D_Arg、 D - Lysおよび D-Orn から選ばれる 1個のァミノ酸残基との組み合わせから成るアミノ酸 2残基のぺプチド残基を示す。

存在位置： 9

他の情報：

Xaaは、 Ala, Val, Leu, lie, Ser, Met, Phe, Tr および Tyr から選ばれる 1個のァミノ酸残基の次位に、 Cys がべプチド結合により連結して成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示す。

存在位置： 7， 8 , 9

他の情報：

ぺプチド結合により連結した Xaa— Xaa— Xaa残基は、 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とぺプチド結合を介して連結しているか、又は 7位の Xaaと 9位の Xaaが同時に欠落することにより 8位の Xaa残基が 6 位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とぺプチド結合を介して直接結合しても良く、その際、 8位の Xaaの構成アミノ酸である D- Lys、 L- Lys、 D - Orn もしくは L - Orn の側鎖 ω—ァミノ基の水素原子は、 ω—ァミノァシル基で置換されていてもよい。

存在位置： 1 0

他の情報：

存在位置： 1 1 , 1 2

他の情報：

Xaaは、独立して Arg、 Lysおよび Ornから選ばれる塩基性アミノ酸残基を示す。

存在位置： 1 4

他の情報：

配列：

Aaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Aaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 配列番号： 2

配列の長さ： 1 8

配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg

1 5 10 15

Lys Cys Arg 配列番号： 3

配列の長さ： 1 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Arg Gly l ie Cys Tyr Arg Lys 1 5 10 15

Cys Arg 配列番号 4

配列の長さ 1 8

配列の型アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド配列

Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Arg Gly lie Cys Tyr Arg

1 5 10 15

Lys Cys Arg

配列番号： 5

配列の長さ： 1 8

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly lie Cys Tyr Arg

1 5 10 15

Lys Cys Arg

Claims

請求の範囲

1. 下記式

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ai - A₂-Cys- A₂- A₃- A₃-X- Y-Z- A₂- A₃- A₃-Cys- A₃- A₄

[ I ] (配列番号： 1 )

[式中 A, は、独立して Lys、 Argおよび Orn から選ばれる塩基性ァミノ酸残基；前記塩基性ァミノ酸を少なくとも 2個有するぺプチド残基；前記塩基性ァミノ酸残基または前記べプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基の N—ひ位の水素原子がァシル基もしくは置換チォカルバモイル基で置換されている N— α置換ァミノ酸残基もしくは Ν— α置換べプチド残基を示し、

A₄ は、一 OH (カルボキシル基由来）または一 NH₂ (酸アミド基由来）を示し、

Xは、 Ala， Val, Leu, lie, Ser， Metおよび Cys から選ばれる 1個のアミノ酸残基の次位に、 A₂ の 1個のアミノ酸がペプチド結合により連結したァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

Yは、 Gly と、 A₃ の 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2残基のペプチド残基、又は Pro と、 D- Arg、 D- Lysおよび D- Orn から選ばれる 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2 残基のぺプチド残基を示し、 Zは、 Ala, Val, Leu, He, Ser. Met および A ₂から選ばれる 1個のァミノ酸残基の次位に、 Cys がべプチド結合により連結して成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

ぺプチド結合により連結した X- Y-Z残基は、 6位と 10位のそれぞれのアミノ酸残基とペプチド結合を介して連結しているか、または

X Zが同時に欠落することにより Y残基が 6位と 10位のそれぞれのァミノ酸残基とペプチド結合を介して直接結合しても良く、その際、 Yの構成アミノ酸である D- Lys、 L-Lys、 D-Orn もしくは L- Orn の側鎖 ω— ァミノ基の水素原子は、 ω—アミノアシル基で置換されていてもよい] で示されるポリぺプチド化合物と、遷移金属との塩であるポリぺプチド遷移金属塩化合物、あるいは該ポリべプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩。

2. 請求の範囲 1の遷移金属との塩が、錯塩である請求の範囲 1のポリべプチド遷移金属塩化合物、あるいは該ポリべプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩。

3. 遷移金属が、鉄族（ Fe， Co, Ni) 、銅族（ Cu， Ag, Au) 、亜鉛族（ Zn, Cd， Hg) およびマンガン族（ Mn， Tc, Re) からなる群から選ばれる遷移金属である請求の範囲 1または 2のポリぺプチド遷移金属塩化合物、あるいは該ポリぺプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩。

4. 下記式

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ai— A₂— tys— Λ₂— Α₃-Α₃— X— Y— Z— A₂— A₃— A₃— Cys— Α₃— Α₄

[ I ] (配列番号： 1)

[式中は、独立して Lys、 Argおよび Orn から選ばれる塩基性アミノ酸残基；前記塩基性ァミノ酸を少なくとも 2個有するぺプチド残基；前記塩基性ァミノ酸残基または前記べプチド残基のァミノ末端ァミノ酸残基の N— α位の水素原子がァシル基もしくは置換チォカルバモイル基で置換されている Ν— α置換ァミノ酸残基もしくは Ν— α置換べプチド残基を示し、

A ₄ は、 _ O H (カルボキシル基由来）または一 N H ₂ (酸アミド基由来）を示し、

Xは、 Ala, Val, Leu, He, Ser, Metおよび Cys から選ばれる 1個のァミノ酸残基の次位に、 A ₂ の 1個のァミノ酸がぺプチド結合により連結したアミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

Yは、 Gly と、 A ₃ の 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2残基のペプチド残基、又は Pro と、 D- Arg、 D- Lysおよび D- Orn から選ばれる 1個のアミノ酸残基との組み合わせから成るァミノ酸 2 残基のぺプチド残基を示し、

Zは、 Ala, Val, Leu, lie, Ser, Met および A ₂ から選ばれる 1個のアミノ酸残基の次位に、 Cys がべプチド結合により連結して成るァミノ酸 2残基のぺプチド残基を示し、

X Zが同時に欠落することにより Y残基が 6位と 1 0位のそれぞれのァミノ酸残基とペプチド結合を介して直接結合しても良く、その際、 Yの構成アミノ酸である D- Lys、 L- Lys、 D-Orn もしくは L-Orn の側鎖 ω— ァミノ基の水素原子は、 ω—アミノアシル基で置換されていてもよい] で示されるポリべプチド化合物の抗 H I V作用活性発現法において、遷移金属との塩とすることにより、抗 H I V作用の高く且つ安定な活性を発現する方法。

5 . 請求の範囲 1に示すポリペプチド遷移金属塩化合物、あるいは該ポリぺプチド遷移金属塩化合物と酸との付加塩の有効量及び製薬学的担体を含む製薬学的あるいは製剤学的組成物。

6 . ウイルスの活動を阻害するための請求の範囲 5の組成物。

7 . 患者体内の H I Vの活動を阻害するための請求の範囲 5の組成物。