JPH1132759A - グルコースを認識する新規なレクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】グルコースに特異的な結合能を有する新規なマ
ボヤ体液由来蛋白質（レクチン）、それをコードするＤ
ＮＡ、マボヤ体液をマンナンに接触させ、マンノース、
またはグルコース溶液で溶出することを特徴とする当該
蛋白質の製造方法、および当該蛋白質の一部、または全
部を含有する感染症予防治療剤。 【効果】本発明の蛋白質（レクチン）は、病原微生物表
面の糖鎖末端のグルコースに特異的に結合することを特
徴とし、結合の結果病原微生物を不活化し、感染症の予
防治療剤として有用である。本発明の蛋白質は、アミノ
酸配列および塩基配列の解明により、遺伝子工学的手法
による製造が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、病原微生物表面の
糖鎖末端のグルコースに特異的な結合能を有する新規な
マボヤ体液由来蛋白質、それをコードするＤＮＡ、当該
蛋白質の製造方法、および当該蛋白質を含有する感染症
予防治療剤に関する。

【０００２】

【従来技術】動物レクチンは、病原微生物表面の糖鎖を
認識するマンノース結合蛋白質（ＭＢＰ）［別称、マン
ノース結合レクチン（ＭＢＬ）］やコングルチニンなど
のＣ型レクチンがあり、生体防御機構として働いてい
る。ＭＢＰは、病原微生物表面の糖鎖末端のマンノース
やＮ−アセチルグルコサミンに特異的に結合し、これら
に富んだ病原微生物（細菌、真菌、酵母、ウイルス、寄
生体を含む）を不活化することができる。また、これら
のレクチンはオプソニン活性を有し、好中球、マクロフ
ァージによる貪食を高めている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、感染
症の予防または治療に有用な、表面上でグルコースを発
現している病原体に特異的に結合する新規なグルコース
結合蛋白質、ならびにその製造方法を提供することにあ
る。また、本発明の目的は、この新規蛋白質を遺伝子工
学手法により製造するために、当該蛋白質のアミノ酸配
列を明らかにし、当該蛋白質をコードするＤＮＡを提供
することにある。さらに、本発明の目的は新規な感染症
予防治療剤を提供することにある。たとえば、上記グル
コース結合蛋白、または全組換え蛋白質は、表面上でグ
ルコースを発現する病原体（細菌、真菌、酵母、ウイル
ス、寄生体を含む）、特に真菌を標的とするのに有用で
ある。それゆえ、グルコース結合蛋白を、病原体を死
滅、もしくは増殖を抑制することのできる分子と結合
し、ハイブリット蛋白を構築することで、優れた感染症
治療剤を提供することができる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、マボヤ体
液からマンナンに結合し、マンノース、またはグルコー
スで溶出される新規な蛋白質を見出し、この蛋白質が、
グルコースで構成されるオリゴ糖（グルカン）に特異的
に結合することを見出した。さらに、本発明者らは、当
該蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングを行い、
そのｃＤＮＡの塩基配列から当該新規蛋白質のアミノ酸
配列を明らかにした。

【０００５】本発明は、実質的に式（Ｉ）に示されるア
ミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。

【０００６】

【化４】 P G W Y L A D N G Y E Y W M S S S H I G Y Y S T G K E I C E D K R A R L A T I G V R D P E I R S E I V Q N V V G D S H L W V W I G L D R L D T I A G W T W L D G V A S T S E N T A W G P N E P N D S G N E R C G Q L N R D S N Y L I N D K S C L A S C A A L C E R K H C F I （Ｉ）

【０００７】当該蛋白質は、少なくとも式（Ｉ）に示さ
れるアミノ酸配列を含んでいればよい。式（Ｉ）は糖鎖
認識ドメイン（または炭水化物認識ドメイン）を示す。
直接グルコースと結合するグルコース結合ドメインは、
この領域内にある。

【０００８】本発明は、実質的に式（II）に示されるア
ミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。

【０００９】

【化５】 E D E Q Y L A C R R V T K A E N T T E H D G S F Y Q D A I R I L Q G R V E H L E I Q V A G F E E E L N E E F Q E M K R R V D V L W Q R A S N A T E P G W Y L A D N G Y E Y W M S S S H I G Y Y S T G K E I C E D K R A R L A T I G V R D P E I R S E I V Q N V V G D S H L W V W I G L D R L D T I A G W T W L D G V A S T S E N T A W G P N E P N D S G N E R C G Q L N R D S N Y L I N D K S C L A S C A A L C E R K H C F I （II）

【００１０】ここで「実質的に」とは、式（Ｉ）、また
は（II）の各式に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質
に限定されず、当該アミノ酸配列を有する蛋白質と同様
な生物学的性質（グルコースに特異的な糖（鎖）結合
能）を有する限り、当該アミノ酸配列中のアミノ酸の幾
つかについて欠質、置換、もしくは付加があってもよい
ことを意味する。

【００１１】本発明の蛋白質は、上記アミノ酸配列を有
してなるポリペプチドに、さらに糖が結合したものであ
ってもよい。上記式中で用いた略号は、次の意味を有す
る。 Ａ Ala アラニン Ｌ Leu ロイシン Ｒ Arg アルギニン Ｍ Met メチオニン Ｎ Asn アスパラギン Ｋ Lys リジン Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｆ Phe フェニルアラニン Ｃ Cys システイン Ｐ Pro プロリン Ｑ Gln グルタミン Ｓ Ser セリン Ｅ Glu グルタミン酸 Ｔ Thr スレオニン Ｇ Gly グリシン Ｗ Trp トリプトファン Ｈ His ヒスチジン Ｙ Tyr チロシン Ｉ Ile イソロイシン Ｖ Val バリン

【００１２】本発明の蛋白質の好適な例として、次の性
質を有するマボヤ体液由来の蛋白質ＧＢＬ（グルコース
結合レクチン）が挙げられる。 マボヤ体液をマンナンに接触させ、マンノース、また
はグルコース溶液で溶出することにより得ることができ
る。 還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により測定した分子量が約３６ｋＤａである。 Ｎ末端に式（III）に示されるアミノ酸配列を有す
る。

【００１３】

【化６】 Glu Asp Glu Gln Tyr Leu Ala Cys Arg Arg Val Thr Lys Ala Glu Asn Thr Thr Glu His （III）

【００１４】等電点：４.５７ 蛋白質ＧＢＬは、グルコースと特異的に結合する。ＧＢ
Ｌは、グルコースを介して糖鎖と結合すると考えられ
る。また、ＧＢＬはマンノース、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン、およびガラクトースに結合せず、Ｎ−グリコシド
型糖鎖の高マンノース型、複合型、および混合型にも結
合しない。

【００１５】本発明の新規蛋白質は、マボヤ体液から精
製することにより、あるいは、組換えＤＮＡ技術、ポリ
ペプチド合成法などの常法によって調整することができ
る。

【００１６】本発明の蛋白質をマボヤ体液から調整する
場合は、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、ゲ
ル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、吸着剤処
理、塩析、等電点沈殿法、ポリエチレングリコール分画
法などの公知の蛋白質の精製法を適宜組合わせることに
より得ることができる。好ましくは、マボヤ体液をマン
ナンに接触させ、グルコース溶液で溶出することにより
調整することができる。

【００１７】以下に、本発明の蛋白質の好適な調整方法
を示す。マンナンに接触させるマボヤ体液画分は、マボ
ヤ体液をポリエチレングリコール分画処理した沈殿画分
が好ましい。詳細には、遠心分離にて血球を除いたマボ
ヤ体液に、分子量４０００のポリエチレングリコールを
終濃度７％になるように添加し、沈殿画分を回収する。
このポリエチレングリコール分画処理は２〜８℃好まし
くは４℃付近で行う。

【００１８】得られた沈殿画分を緩衝液に溶解して、マ
ンナンに接触させる。緩衝液は、塩濃度０.１〜２Ｍ、
ｐＨ６〜８が好ましく、具体的には１〜１.５Ｍ塩化ナ
トリウム含有２０ｍＭ〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩
衝液（ｐＨ７〜８）が例示される。マンナンは、不溶性
担体にマンナンを結合したものが好適に使用され、例え
ばマンナン−セファロースなどのカラムが用いられる。
次いで、マンノース、またはグルコース溶液で溶出する
ことにより、本発明蛋白質を含有する分画が得られる。
マンノース、またはグルコース溶液は、好ましくは０.
１〜０.５Ｍ、より好ましくは０.３Ｍのマンノース、ま
たはグルコースを含有する緩衝液であり、緩衝液として
は、前記のものが好適に使用される。

【００１９】組換えＤＮＡ技術により本発明の蛋白質を
調整する場合には、常法に従って、本発明蛋白質をコー
ドするＤＮＡ（後述）を含む発現ベクターで形質転換さ
れた宿主細胞を培地中で培養し、該培養物から本発明蛋
白質を採取することによって調整することができる。

【００２０】宿主細胞としては、微生物［細菌（例え
ば、大腸菌、枯草菌）、酵母（例えば、サッカロミセス
属）］、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、昆虫細胞（例えば、
Ｓｆ細胞）などが使用できる。

【００２１】ベクターとしては、pBR322、pBR325、pUC1
2、pUC13などの大腸菌由来のプラスミド、pUB110、pTP
5、pC194などの枯草菌由来のプラスミド、pSH19、pSH15
などの酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテ
リオファージ、バキュロウイルス（核多角体ウイルス）
などの昆虫ウイルスなど、公知の入手可能なベクターを
使用することができる。

【００２２】本発明はまた、式（Ｉ）に示されるアミノ
酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含むＤＮＡに関する。当該ＤＮＡは、上記塩基配
列を含んでいれば、いかなるＤＮＡであってもよいが、
少なくとも式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を有するＤＮＡである。式（Ｉ）に示される
アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式（Ｉ）
に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれ
ば特に限定されないが、具体的には、図２に示される塩
基配列中、５’末端から数えて塩基番号３２２〜７２３
で示される塩基配列が例示される。

【００２３】また、本発明は、式（II）に示されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含むＤＮＡに関する。当該ＤＮＡは、上記塩基
配列を含んでいれば、いかなるＤＮＡであってもよい
が、少なくとも式（II）に示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡである。式（II）に示さ
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式
（II）に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列
であれば特に限定されないが、具体的には、図２に示さ
れる塩基配列中、５’末端から数えて塩基番号１０３〜
７２３で示される塩基配列が例示される。また、当該Ｄ
ＮＡは、その５’末端に、シグナルペプチドをコードす
る塩基配列を含有していてもよい。シグナルペプチドの
由来は特に限定されないが、好ましくは、図２中の下線
で示されるアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜１７で示さ
れる配列）をコードするＤＮＡであり、より好ましく
は、図２に示される塩基配列中、５’末端から数えて塩
基番号５２〜１０２で示される塩基配列が例示される。

【００２４】一般に、遺伝子組換えの技術分野では、遺
伝子暗号の縮重に従い、遺伝子から産生される蛋白質の
アミノ酸配列を変えることなく、その遺伝子のＤＮＡ配
列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することが
できる。従って、本発明のＤＮＡは、図２で示される塩
基配列を遺伝暗号に基ずく置換によって変化させた塩基
配列を有するものをも包含する。

【００２５】また、本発明のＤＮＡは、いかなる方法で
得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調整
される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調整
されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させてえら
れるＤＮＡ、およびこれらの方法を適当に組み合わせて
構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。

【００２６】従って、本発明のＤＮＡは、常法に従って
本発明の蛋白質のｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化す
る方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理す
る方法、科学合成する方法等により取得することができ
る。

【００２７】（１）例えば、本発明蛋白質のｍＲＮＡか
らのｃＤＮＡクローニングは、常法（Sambrook, Fritsc
h and Maniatis, Molecular Cloning, 2nd Ed. Cold S
pring Harbor Lab. Press, 1989）に従って行うことが
できる。具体的には、以下の方法が例示される。まず、
マボヤ hepato-pancreasからｍＲＮＡを調整する。ｍ
ＲＮＡの調整は、例えば、グアニジンチオシアネート法
［Chirgwin, J. M. etal., Biochem., 18, 5294 (197
9)］、熱フェノール法、もしくは、ＡＧＰＣ法等の公知
の方法を用いて調製した全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）セ
ルロースや、ポリＵ−セファロース等によるアフィニテ
ィクロマトグラフィーにかけることによって行うことが
できる。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、例え
ば、逆転写酵素を用いる等の公知の方法［例えば、Okay
ama, H. らの方法［Okayama, H.et al., Mol. Cell. Bi
ol., 2, 161 (1982) 及び、同誌 3, 280 (1983)］や、G
ubler, H. とHoffman, B. J. の方法［Gubler, H. and
Hoffman, B. J., Gene, 25, 263 (1983)］が例示され
る。］でｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮ
Ａへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクタ
ー、もしくは、ファージベクターに組み込み、大腸菌を
形質転換して、あるいは、インビトロパッケージング
後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することに
よりｃＤＮＡライブラリーを作製する。ここで用いられ
るプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持され
るものであれば特に制限されず、また、用いられるファ
ージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば
良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとし
て、ｐＵＣ１１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ
等が例示される。ただし、後述免疫学的スクリーニング
に供する場合は、宿主内で本発明蛋白質の遺伝子を発現
させうるプロモーターを有したベクターであることが好
ましい。

【００２８】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば、Maniatis, T.ら、モレキュラークローニ
ング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual）Cold Spring Harbor Labora
tory, p.239 (1982) に記載の方法などが挙げられる。
また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、Hyunh, T. V. らの方法［Hyunh, T. V., DNA Clo
ning, a practical approach, 1, 49 (1985)］などが挙
げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例
えば、宝酒造等）を用いることもできる。このようにし
て得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原
核細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、ＤＨ５、
またはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入す
る。

【００２９】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、Maniatis, T.らのモレキュラークローニング、ア・
ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual）Cold Spring Harbor Laboratory, p.2
39 (1982) に記載の塩化カルシウム法、塩化カルシウム
法／塩化ルビジウム法、またはエレクトロポレーション
法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導
入する方法としては、ファージＤＮＡをインビトロパッ
ケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が
例示される。インビトロパッケージングは、市販のイン
ビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン
社製、アマシャム社製等）を用いることによって簡便に
行うことができる。

【００３０】上記の方法によって作製されたｃＤＮＡラ
イブラリーから、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法
を組み合わせることによって行うことができる。例え
ば、別個に本発明蛋白質のアミノ酸配列に対応すると考
えられるオリゴヌクレオチドを化学合成した後、これを
³²Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイ
ブリダイゼーション法［Crunstein, M. and Hogness,
D. S., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 72, 3961 (197
5)］、またはプラークハイブリダイゼーション法［Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, p.239 (1982)］により、目的のｃＤ
ＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方法、Ｐ
ＣＲプライマーを作製し、本発明の蛋白質の特定領域を
ＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮＡ断片
を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。ま
た、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λｇｔ１
１ファージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡライブ
ラリーを用いる場合には、本発明蛋白質に対する抗体を
用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択
することができる。大量にクローンを処理する場合に
は、ＰＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いること
が好ましい。

【００３１】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列は
マキサム・ギルバート法［Maxam, A. M. and Gilbert,
W., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 74, 560 (197
7)］、あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌク
レオチド合成鎖停止の方法［Sanger, F.ら、Proc. Nat
l. Acid. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)］によって
決定することができる。本発明のＤＮＡは、その全部ま
たは一部を上記のようにして得られるクローンから制限
酵素により切り出すことにより取得できる。

【００３２】（２）また、マボヤhepatopancreasのゲノ
ムＤＮＡから本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを単離
することによる調整方法としては、例えば以下の方法が
例示される。マボヤhepatopancreasを好ましくはＳＤ
Ｓ、またはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノー
ルによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮ
Ａを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得ら
れるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られ
るＤＮＡ断片を適当なファージ、またはコスミドで増幅
し、ライブラリーを作製する。次に、目的の配列を有す
るクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブ
を用いる方法等により検出し、該クローンから本発明の
蛋白質のＤＮＡの全部、または一部を制限酵素等により
切り出し取得する。

【００３３】（３）また、化学的合成による本発明のＤ
ＮＡの製造は、図１に示される塩基配列をもとにして、
常法に従って行うことができる。

【００３４】本発明の蛋白質は、表面上でグルコースを
発現している病原微生物に特異的に結合し、不活化する
作用を有するので、細菌、ウイルス、真菌などの病原微
生物による感染症の予防、または治療に有効である。細
菌としては、サルモネラ、大腸菌、緑膿菌などのグラム
陰性菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌などのグラ
ム陽性菌、ウイルスとしては、ヘルペスウイルス、ＨＩ
Ｖなど、真菌としては、カンジダ、アスペルギルス、ク
リプトコッカス、ムコール、トリコスポロンなどが挙げ
られる。これらの病原微生物による感染症としては、脳
髄膜炎、肺炎、尿路感染症、急性胃腸炎、食中毒、敗血
症、帯状疱疹などのヘルペスウイルス感染症、カンジダ
症などの真菌症などが挙げられる。

【００３５】本発明の蛋白質は、薬理的に許容される添
加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤など）などの製薬
上必要な成分と適宜混合し、ゲル、軟膏、粉末、顆粒、
錠剤、カプセル剤、注射剤などの形態で医薬組成物とし
て、経口的、または非経口的（静脈内、筋肉内、または
局所的）に投与することができる。好ましくは、生理食
塩水、注射用蒸留水、滅菌精製水などの希釈剤に溶解し
た、またはそれを凍結乾燥した注射剤の形態である。

【００３６】当該製剤には、安定化剤を配合してもよ
い。安定化剤は、グルコースを除く血漿蛋白製剤などの
安定化剤として通常使用されるものであれば特に限定さ
れない。例えば、ショ糖、マルトース等の糖類、マンニ
トール、ソルビトール等の糖アルコール、グリシン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、塩化ナトリ
ウム、クエン酸ナトリウム、リン酸塩等の塩、リン脂
質、アルブミン、ゼラチン、クエン酸、リンゴ酸などを
用いることができる。

【００３７】上記製剤中には、本発明の蛋白質の有効量
が配合される。投与量は、投与経路、患者の症状、体
重、あるいは年齢などによって異なる。また、本発明の
蛋白質はヒト血漿由来の成分ではないため、投与に際し
ては、慎重を要することがある。

【００３８】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

【００３９】実施例１：ＧＢＬ（グルコース結合レクチ
ン）の精製 マボヤ体液を３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心操作を
し、この上清にポリエチレングリコール４０００を終濃
度７％となるように加え、４℃で１時間、反応させた。
９０００ｒｐｍ、２０分間の遠心操作で沈殿画分を得
た。これを２０ｍＭＴｒｉｓ、１Ｍ塩化ナトリウム、５
０ｍＭ塩化カルシウム含有緩衝液（ｐＨ７.８）に溶解
後、酵母マンナンセファロースカラムにアプライした。
前記緩衝液でカラムを洗浄後、０.３Ｍマンノース、ま
たはグルコースを含有する前記緩衝液で本発明の蛋白質
ＧＢＬ（グルコース結合レクチン）を溶出させた。溶出
されたＧＢＬを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ塩化ナ
トリウム、５ｍＭ塩化カルシウム含有緩衝液（ｐＨ７.
８）で透析し、ＭｏｎｏＱカラム（陰イオン交換樹脂）
を用いて精製した。得られたＧＢＬは、還元下のＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）で３６ｋＤａのバンドとして認められた。ＧＢＬ
は、Ｎ末端に次式（III）で示されるアミノ酸配列を有
していた。

【００４０】

【化７】 Glu Asp Glu Gln Tyr Leu Ala Cys Arg Arg Val Thr Lys Ala Glu Asn Thr Thr Glu His （III）

【００４１】実施例２：ＧＢＬのｃＤＮＡクローニング ＧＢＬのｃＤＮＡクローニングは、標準的な方法（Samb
rook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning, 2nd
Ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に従って
行った。λＺＡＰをベクターとして、マボヤhepatopanc
reas cDNAライブラリーを構築した。実施例１で精製し
たＧＢＬ蛋白質を、クリーブランドの方法［Cleveland,
D. W. Methods in Enzymology, 96, 222-229 (1983)］
に基づいてstaphylo-coccus aureus V8プロテアーゼで
消化し、２つの断片化されたＧＢＬ蛋白質を得た。この
アミノ酸配列を決定し、図１の下線、および二重下線で
示される結果を得た。実施例１で示されたＧＢＬのＮ末
端アミノ酸配列、および図１の二重下線で示されるアミ
ノ酸配列に基づいてＰＣＲプライマーを作製し、ＧＢＬ
のＮ末端領域の蛋白質をコードするＤＮＡ（５０６ｂ
ｐ）を増幅した。このＤＮＡをプローブとして、λＺＡ
Ｐをベクターとしたマボヤhepatopancreas cDNAライブ
ラリーをスクリーニングした。プラークを転写したナイ
ロンメンブレンとプローブとのハイブイダイゼーション
は、５×デンハルツ（Denhardts）、４×ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１００μｇ／ｍｌサケＤＮＡ、
および³²Ｐ標識プローブを含む溶液中で６０〜６５℃、
一昼夜行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、１
×ＳＳＣ中室温で３０分間、さらに６５〜７０℃で１〜
２時間行った。この結果、約２０万クローンのλＺＡＰ
から、１２クローンのＧＢＬｃＤＮＡが得られた。これ
らをpBluescript II KS⁺にサブクローニングし、Sanger
らの方法（Proc.Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 197
7）に従って塩基配列を決定した。

【００４２】得られた１２クローンの塩基配列の共通部
分を重複させた結果、図１に示すようなＧＢＬｃＤＮＡ
配列が得られた。このｃＤＮＡは、６７２ｂｐの長さの
オープンリーディングフレーム（転写解読枠）を持ち、
１７アミノ酸からなるシグナルペプチド（図１中の点線
部分）と、これに続く２０７アミノ酸の成熟ＧＢＬ蛋白
質をコードしていた。

【００４３】図２にＧＢＬのドメイン構造を示す。成熟
ＧＢＬのＮ末端領域（図２、Ｉ）にはＧＢＬのダイマー
形成に関与する一つのシステイン残基が存在する。これ
に続き、α−ヘリカル構造を形成しうるグルタミン酸残
基に富んだ領域（図２、II）が存在する。この構造はＭ
ＢＬのコラーゲン様構造に相当するものと考えられ、こ
の部分でホモポリマーを形成していると推定される。さ
らに、ＧＢＬのＣ端側には約１３５アミノ酸からなる糖
鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）が存在し、 データバンクと
のホモロジィー検索の結果、哺乳類（ヒト、赤毛ザル、
ラット、およびマウス）のＭＢＰのＣＲＤとホモロジィ
ーを持つことが判明した。また、ＧＢＬのＣＲＤには、
Ｃ型レクチンのＣＲＤに保存されている１８のアミノ酸
のうち、１３のアミノ酸が保存されており、ＧＢＬはＣ
型レクチンファミリーに属するものと考えられた。

【００４４】実施例３：ＧＢＬの糖鎖結合試験 本発明蛋白（ＧＢＬ）のグルコースに特異的な糖鎖結合
能を示すために、様々な合成オリゴ糖への結合試験を行
った（参考文献： Matsushita, M.ら、J. Biol. Chem.
271, 2448-2454 (1996)）。糖鎖結合試験に用いた合成
オリゴ糖を以下に示す。 Mal5 ：マルトペンタオース (Glcα1-4Glcα1-4Glcα1-4Glcα1-4Glc) Isomal5 ：イソマルトペンタオース (Glcα1-6Glcα1-6Glcα1-6Glcα1-6Glc) Cello5 ：セロペンタオース (Glcβ1-4Glcβ1-4Glcβ1-4Glcβ1-4Glc) Lami5 ：ラミナリペンタオース (Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1-3Glc) Man5 ：Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Manで構成されるマンノペ ンタオース GN5 ：ペンタ-Ｎ-アセチルチトペンタオース （GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc) G2M3 ：GlcNacβ1-2Manα1-6(GlcNacβ1-2Manα1-3)Manで構成されるオリ ゴ糖 3′SL ：3′-シアリラクトース (Sialic acidα2-3Galβ1-4Glc) 6′SL ：6′-シアリラクトース (Sialic acidα2-6Galβ1-4Glc) Lac ：ラクトース (Galβ1-4Glc) （Glc：グルコース、Man：マンノース、GlcNAc：Ｎ-アセチルグルコサミン、Gal ：ガラクトース） これらのオリゴ糖をdipalmitoylphosphatidylethanolam
ineと結合させ、ＴＬＣシステムを用いて展開し、これ
に実施例１で精製した¹²⁵Ｉ標識ＧＢＬを反応させ、オ
ートラジオグラフィーにより解析した。その結果、図３
に示すように、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、およびガラクトースには結合せず、グルコースのみ
で構成されるオリゴ糖（Maltopentaose、Isomaltopenta
ose、Cellopentaose、およびLaminaripentaose）に特異
的に結合することが判明した。以上の結果から、ＧＢＬ
は糖鎖末端のグルコースを特異的に認識することが明ら
かとなった。

【００４５】

【発明の効果】本発明の新規蛋白質は、糖鎖末端のグル
コースへの特異的な結合能を有し、表面上でグルコース
を発現する病原体（細菌、真菌、酵母、ウイルス、寄生
体を含む）による感染症の予防、または治療剤として有
用である。特に、カンジダ症、アスペルギルス症、クリ
プトコッカス症、ムコール症、およびトリコスポロン症
などの真菌症に有用である。さらに、ＧＢＬの一部、ま
たは全部を、遺伝子工学的手法などにより病原体を死
滅、もしくは増殖を抑制することのできる分子と結合さ
せたハイブリット蛋白は、優れた感染症治療剤として有
用である。

【００４６】また本発明によれば、当該新規蛋白質をマ
ボヤ体液から簡便に、効率よく調整する方法が提供され
る。

【００４７】さらに本発明は、当該新規蛋白質のアミノ
酸配列、および当該蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配
列を初めて明らかにするものである。かかるアミノ酸配
列、および塩基配列の解明により、遺伝子工学的手法に
よる本発明蛋白質の製造、それに基づく構造活性相関の
研究が可能となる。すなわち、本発明のアミノ酸配列、
および塩基配列は、当該蛋白質の分子、あるいは遺伝子
レベルでの物理化学的性状、および生物学的性状の解析
に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 蛋白質ＧＢＬをコードするｃＤＮＡの塩基配
列、およびＧＢＬのアミノ酸配列を示す図である。

【図２】 蛋白質ＧＢＬの簡単なドメイン構造を示す図
である。

【図３】 蛋白質ＧＢＬのグルコースに特異的な結合能
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 遠藤 雄一 福島県福島市大森字北島35−６ (72)発明者 水落 次男 東京都世田谷区岡本２−24−19−107

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に式（Ｉ）に示されるアミノ酸配
   列を有してなる蛋白質。 【化１】 P G W Y L A D N G Y E Y W M S S S H I G Y Y S T G K E I C E D K R A R L A T I G V R D P E I R S E I V Q N V V G D S H L W V W I G L D R L D T I A G W T W L D G V A S T S E N T A W G P N E P N D S G N E R C G Q L N R D S N Y L I N D K S C L A S C A A L C E R K H C F I （Ｉ）
2. 【請求項２】 実質的に式（II）に示されるアミノ酸配
   列を有してなる蛋白質。 【化２】 E D E Q Y L A C R R V T K A E N T T E H D G S F Y Q D A I R I L Q G R V E H L E I Q V A G F E E E L N E E F Q E M K R R V D V L W Q R A S N A T E P G W Y L A D N G Y E Y W M S S S H I G Y Y S T G K E I C E D K R A R L A T I G V R D P E I R S E I V Q N V V G D S H L W V W I G L D R L D T I A G W T W L D G V A S T S E N T A W G P N E P N D S G N E R C G Q L N R D S N Y L I N D K S C L A S C A A L C E R K H C F I （II）
3. 【請求項３】 請求項１記載の蛋白質のアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含むＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２記載の蛋白質のアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含むＤＮＡ。
5. 【請求項５】 マボヤ体液をマンナンに接触させ、マン
   ノースまたはグルコース溶液で溶出することを特徴とす
   る請求項１又は２記載の蛋白質の製造方法。
6. 【請求項６】 （１）マボヤ体液をマンナンに接触さ
   せ、マンノースまたはグルコース溶液で溶出することに
   より得ることができる物質であり、（２）還元下のＳＤ
   Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した
   分子量が約３６ｋＤａであり、（３）Ｎ末端に式（II
   I）に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。 【化３】 Glu Asp Glu Gln Tyr Leu Ala Cys Arg Arg Val Thr Lys Ala Glu Asn Thr Thr Glu His（III）
7. 【請求項７】 請求項１〜２および６のいずれか１項に
   記載の蛋白質を有効成分とする感染症予防治療剤。