CN101068563B

CN101068563B - 新型抗微生物肽

Info

Publication number: CN101068563B
Application number: CN2005800416016A
Authority: CN
Inventors: A·施密特兴; M·马尔姆斯滕; B·沃尔泽
Original assignee: Dermagen AB
Current assignee: Dermagen AB
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2025-11-17
Also published as: CA2588145A1; US20080069849A1; SE0402807D0; AU2005307160B2; JP4898698B2; HK1114777A1; JP2008520660A; EP1817046A4; WO2006054947A1; AU2005307160A1; EP1817046A1; CN101068563A; KR20070108142A

Abstract

本发明涉及肽在制备用于抗微生物的组合物中的用途，所述的肽至少有一个氨基酸残基被取代以提高该抗微生物肽的效力。该组合物可用作抗微生物，例如细菌、病毒、真菌、寄生虫以及酵母的药物组合物。

Description

新型抗微生物肽

技术领域

本发明涉及含有SEQ ID NO：1所示序列的肽在用于制备抗微生物组合物中的用途，所述肽的序列中至少有一个氨基酸残基被取代，以提高该肽的效力。上述组合物可用作抗微生物，例如细菌、病毒、真菌、包括酵母或寄生虫的药物组合物。

背景技术

哺乳动物，例如人类的免疫系统能够成功地抵御几种感染。然而某些情况下并不总能清除细菌、真菌或病毒，这会导致发生局部或全身性的急性感染。这对于处于围产期、烧伤或需要特别护理的病患以及免疫缺陷的个体来说，都是需要严重关注的情况。在另外的情况下，细菌连续的存在于上皮表面将导致发生或恶化慢性疾病。在人类中，这样的情况可例举出慢性皮肤溃疡、特应性皮炎或其它类型的湿疹、痤疮或泌尿生殖器感染等。

有多种药物可治疗有症状的感染。一些病症还可采用现有的疫苗进行治疗。然而疫苗并不总是最佳的治疗方案，而且对于有些微生物并无相应的可用的疫苗。当没有可行的保护措施时，就必须对疾病进行治疗。通常的治疗都采用杀死微生物的抗生素药物。然而近几年来很多微生物已经对抗生素变得具有抗药性。抗药性问题极有可能在近期内愈发变得严重。另外，一些人群逐渐发展为对抗生素药物的敏感体质，因此减少了有效使用某些抗生素药物的可能性。

多种器官的上皮表面是持续地暴露于细菌环境下的。近年来认为基于抗微生物肽(antimicrobialpe ptide)的先天的免疫系统在启动对处于易被感染的生物界的细菌的清除中发挥重要作用(Lehrer，R.I.，and Ganz，T.(1999)Curr Opin Immunol11：23-27，Boman，H.G.(2000)Immuno l.Rev.173，5-16)。抗微生物肽通过透过细菌的细胞膜杀死细菌，因此其缺少特异性的分子微生物靶，这最大限度地降低了对其的抗药性的发展。

已知现有技术中有几种与上面所述的肽类相关的抗微生物肽和蛋白质。

在US6503881中公开了一种被用作抗微生物肽的indolicidin(来源于牛中性粒细胞的多肽抗生素)的类似物的阳离子肽。该阳离子肽来源于包括动物和植物的不同的物种。

在US5912230中公开了抗真菌和抗细菌的基于histatin(一种富组氨酸多肽)的肽。该肽基于天然存在的人histatin的确定的氨基酸序列部分，以及在治疗真菌和细菌中使用的方法。

在US5717064中公开了甲基化的富赖氨酸的溶菌肽。该肽是具有胰蛋白酶消化抗性，并且是非天然肽。该细胞溶菌酶适合用于体内给药。

在US5646014中公开了一种抗微生物肽。该肽是从一种来自蚕的血淋巴的抗微生物级分中分离而来的。该肽显示出对几种细菌株优良的抗菌活性，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽胞杆菌。

在McCabe et al.，J.Biol.Chem.Vol277：27477-27488，2002中描述了一种37kDa的抗微生物性的和趋化性蛋白：天青杀素(azurocidin)，其包含结合相同基序XBBXBX和XBBBXXBX的肝素。

在WO2004016653中公开了基于天青杀素的20-44序列的肽。该肽包含由二硫键连接的环状结构。

在US6495516及相关专利中公开了基于杀菌的55kDa蛋白质的提高杀菌/渗透性的蛋白质(BPI)。该肽发挥抗微生物效果并且具有肝素和LPS的能力。

WO01/81578公开了编码与G蛋白偶联蛋白质受体相关的多肽的多种序列，这些多肽可被用于多种疾病。

目前，已知大约有700种不同的抗微生物肽类序列(www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/search.htm)，包括天蚕素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainin)以及组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)。

虽然目前已经可得到相对多的抗微生物肽，然而对于新型改进的抗微生物肽的需求仍在增加。需要能够被用于抵御微生物的抗微生物肽，所述微生物是具有对抗生素药物和/或其他抗微生物类药物的抗药性或耐药性的微生物。更加重要的是，需要一种当导入哺乳动物或人类时不产生过敏的新型的抗微生物肽。细菌在进化过程中遇到过内源性产生的抗微生物肽，不产生明显的抗性。

发明内容

本发明涉及新型改进的肽在制备用于抗微生物的抗微生物组合物中的用途，该肽包含SEQ ID NO：1及其类似物，其中该肽与SEQ ID NO：1的不同在于：其选自C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18以及A20之中的至少一个氨基酸残基被取代。

另外，本发明还涉及一种药物组合物，该组合物包含上述肽及药学上允许的缓冲液、稀释液、载体、佐剂、赋形剂。

本发明还涉及利用一种与SEQ ID NO：2所示序列具有至少70％的同源性的多肽，该多肽被用于制备一种用于防御、抑制、降低或破坏选自细菌、病毒、寄生虫、真菌和酵母中的微生物的抗微生物组合物。

最后，本发明涉及治疗患有微生物感染的哺乳动物的方法，该方法包含对哺乳动物施用治疗有效剂量的含有本发明的肽或肽类的药物组合物。

通过提供该抗微生物的肽类，对于抗微生物的肽类产生过敏反应的风险可以被减小，这是因为上述肽类是由内源性蛋白和/或肽类的多肽序列衍生而来的。与更长的肽和蛋白质相比，通过使用短肽可提高该肽的稳定性并降低其生产成本，因此本发明在经济方面更有优势。

本发明的肽类提供一种能够方便地有效预防、减少或杀灭微生物的组合物。因此抵御对抗生素药物具有抗药性或耐药性的微生物的可能性提高。而且对市售的抗生素药物过敏的哺乳动物也可得到治疗。通过提供抗由改良的内源性蛋白质衍生的抗微生物/药物组合物，哺乳动物对特定肽的过敏的可能性将被减小甚至消除。因此该抗微生物/药物组合物可作为治疗药物或预防感染的添加剂用于与哺乳动物相接触的几种用途中。

另外，短肽的使用可提高生物利用度。另外，使用对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、或真菌具有特异性或者优先作用的结构上独特的肽，能够特异性地靶向多种微生物，因此最大限度的减少了抗药性和生态学问题的发展。通过使用与已经存在于哺乳动物中的肽类等同的肽作为补充肽，新型抗生素带来的附加的生态压力风险被进一步减小。最后，上述药物还可提高内源性抗微生物肽的效果。

上述有创造性的抗微生物肽的出现增加了抗微生物药物的种类，增加了在包括但不仅限于例如侵入或感染哺乳动物(例如人类)等所有应用中的用于预防、减少或杀灭微生物抗微生物药物的选择。

附图说明

图1A描述了CNY21对于粪肠球菌(E.faecalis)2374(—●—)、以及假单胞绿脓杆菌(P.aeruginosa)27.1(—□—)的杀菌效果。

图1B描述了CNY21在不同缓冲液中的存活计数分析。

图2示出CNY21肽的螺旋环(Helical Wheel)的投影图。

图3示出CNYIEELRRQLLRALLRGLAR肽的螺旋环投影图。

图4a-c为大肠杆菌37.4、金黄色葡萄球菌分离株BD14312、金黄色葡萄球菌ATCC29213、白色假丝酵母等不同微生物作为RDA值的函数的净电荷以及溶血活性的示意图。

图5a-b为肽39、42、43和47的螺旋环投影图。

图6为理想的两亲性α-螺旋的示意图。用数字表示CNY20的氨基酸在螺旋环图中的位置。黑色代表疏水性残基，白色代表亲水性残基，灰色代表N-和C-末端。

图7a-b为在N-末端、C-末端、或中间区域带有两亲性断点(breakof amphipathicity)的肽的螺旋环投影图。

图8显示CNY变体的放射状扩散测验分析。

图9显示CNY-变异体的抗真菌效果。

图10显示抗微生物肽的溶血效果。

图11说明CNY-变异体对真核细胞膜的效果。

具体实施方式

定义

下述定义适用于本申请和发明的内容中：

术语“核苷序列”指的是两个以上的核苷的序列。核苷可以来自基因组DNA、cDNA、RNA、半合成或全合成来源的核苷、或它们的混合物。该术语包括单或双链形式的DNA或RNA。

术语“取代”指的是氨基酸残基被另一氨基酸残基所取代。例如，S15V指SEQ ID NO：1中的第15位的丝氨酸残基被例如缬氨酸所取代。

术语“其类似物”指的是SEQ ID NO1的多肽的全部或一部多肽分是基于非蛋白质氨基酸残基的，例如氨基异丁酸(Aib)、正缬氨酸γ-氨基丁酸(Abu)或鸟氨酸。其它非蛋白质氨基酸残基可在下述网址中找到：http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polyam/ po00008.htm。

术语“删除”指的是至少一个氨基酸残基被删除，例如从多肽中放出而不是用另外的氨基酸代替。

术语“同源性”指的是与多肽SEQ ID NO：2的整体同源性，而不应与指特定的氨基酸残基属于同一组(例如疏水的、亲水的)的术语“相似性”(similarity)混淆，也不应与指氨基酸残基为相同的术语“同一性”(identity)混淆。

术语“抗微生物肽”指的是能够预防、抑制、减少或杀灭微生物的肽。其抗微生物活性可以被任一种方法所测定，例如实施例3-5中的方法。

术语“两亲性分子的”指亲水和疏水的氨基酸残基分布于α-螺旋结构、β-片层、线形、环形、或其它二级结构的相对的表面上，以及分布于肽一级结构的相对的两端，因此使得分子的一个表面或一端显著地带有电荷而显示亲水性，而另一表面或一端主要显示疏水性。一个肽的两亲性程度可以通过多种基于网络的算法来划分氨基酸序列的方法检测出，例如可在下述网址中找到这些算法：http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl或http://www.mbio. ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html。疏水性残基的分布可以被螺旋环图可视化。二级结构预测算法例如GORIV和AGADIR可在下述网址找到：www.expasy.com。

术语“阳离子”指在pH大约4～大约12，例如pH大约4～大约10的范围内具有净正电荷的分子。

术语“微生物”指任何一种活的微生物。微生物的例子为细菌、真菌、病毒、寄生虫和酵母。

术语“抗微生物药物”指任何一种可以预防、降低或杀灭微生物生命的药剂。抗微生物药物的例子可在《斯坦福抗微生物治疗指南》(第32版，抗微生物治疗，Inc，US)(The Sanford Guide toAntimicrobial Therapy(32^ndedition，Antimicrobial Therapy，Inc，US))找到。

在本发明的内容中，氨基酸名称以及原子名称根据ProteinDataBank(PDB)(www.pdb.org)的定义使用，该定义基于IUPAC命名法(IUPAC氨基酸和肽类的命名法以及符号使用(残基名称，原子名称等))，Eur J Biochem.，138，9-37(1984)，以及它们在Eur J Biochem.，152，1(1985)中的校正本。术语“氨基酸”指选自下面的任何一种氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)以及它们的衍生物。

描述

抗微生物肽

本发明涉及具有SEQ ID NO：1的肽及其类似物在制备用于降低或杀灭微生物的抗微生物的组合物中的用途，所述肽与SEQ ID NO：1的不同在于，其中至少有一个选自C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18和A20中的氨基酸被取代。上述取代使得多肽具有比SEQ ID NO：1肽更好的活性。已确定通过使用基于螺旋-卷曲变换理论的算法AGADIR来预测适合被取代的螺旋性方法(参考实施例1)。由于目前认为抗微生物的效力与α-螺旋构象在模拟细胞膜的环境下的可诱导性相关，而不是与其内在稳定性相关(TossiA，Sandri L，Giangaspero A.(2000)，Amphipathic，alpha-helicalantimicrobial peptides，Biopolymers，55，4-30)，因此上述取代增加多肽在抵御微生物方面的活性。

上述取代可以由另一个氨基酸残基进行取代，或者由一个非蛋白质氨基酸残基取代，前提是相比上述SEQ ID NO：1的抗微生物活性，取代的多肽的抗微生物功能仍然被保留和/或被提高。

上述取代基团可选自：C1G、N2S、N2T、N2K、T5E、T5D、T5N、E6A、E6V、E6L、E6I、E6M、E6F、E6Y、E6W、R8A、R8V、R8L、R8I、R8M、R8W、R8K、R9K、H11A、H11V、H11L、H11I、H11M、H11K、H11R、H11W、A12L、R13K、A14V、A14L、A14I、A14M、S15A、S15V、S15L、S15I、S15M、S15T、S15N、S15Q、S15K、S15R、S15W、H16K、H16R、H16A、H16V、H16L、H16I、H16M、L17K、L17R、L17A、L17V、L17I、L17M、G18W和A20R，例如选自：N2S、N2K、T5E、T5D、T5N、E6A、E6V、E6L、E6I、E6M、E6F、E6Y、E6W、R8A、R8V、R8L、R8I、R8M、R8K、E8W、H11A、H11V、H11L、H11I、H11M、H11K、H11R、H11W、A12L、A14L、S15A、S15V、S15L、S15I、S15M、S15T、S15N、S15Q、S15K、S15R、S15W、H16K、H16R、H16A、H16V、H16L、H16I、H16M、L17K、L17R、L17A、L17V、L17I、L17M、G18W和A20R。

另外，本发明的抗微生物肽可以与SEQ ID NO：1中所示的氨基选序列有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基的不同。

另外，可有一个或多个氨基酸残基从SEQ ID NO：1的C或N两个末端中被删除，也可从其中一个部分中被删除，前提是其抗微生物活性仍然保留。可以从SEQ ID NO：1中被删除的氨基酸残基的例子为C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18和A20。不过，原则上，上述所有提到的可能被取代的氨基酸残基都可被删除。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基可从SEQ IDNO：1中被删除。

该多肽可以含有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸大小的残基。

上面提到的SEQ ID NO：1可最初基于部分辅因子C3分子(见SEQID NO：2)。然而它也可是合成甚至半合成的。

上述抗微生物肽类可被一个或多个氨基酸残基延伸，例如1～100个氨基酸残基、5～50个氨基酸残基或6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。上述附加的氨基酸残基可以复制与由非抗微生物蛋白衍生的抗微生物肽的序列邻近的序列。被添加的数目取决于需要抵御何种微生物，包括肽的稳定性、毒性、被治疗的哺乳动物、或该肽应存在于什么产品中以及该抗微生物肽应基于哪种肽结构。应该被添加至多肽上的氨基酸的数目还取决于产品的选择，例如表达载体和表达宿主、以及制备抗微生物/药物组合物的选择。可以在该抗微生物肽的N-或C-末端部分或这两部分进行延长，前提是这样并不破坏该肽的抗微生物活性。该抗微生物肽还可以是融合蛋白，此情况下该肽与另一种肽融合。

另外，该抗微生物肽可以可操作地与另一已知的抗微生物肽连接，或与其它物质，例如其它的肽、蛋白质、寡糖、多糖、其它有机化合物或无机物质相连接。例如，该抗微生物肽可与保护该抗微生物肽在哺乳动物体内进行抑制、预防或杀灭微生物之前不被降解的物质相缀合。

进而，上述抗微生物肽类还可在C-末端被酰胺化或酯化修饰，或在N-末端被酰化、乙酰化、PEG化、烷基化等修饰。

被上述抗微生物肽抑制、预防或杀灭的微生物的例子为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌这两种，例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、大肠杆菌(Eschericia coli)、假单胞绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、病毒、寄生虫、真菌和酵母，例如白色假丝酵母(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)

上述抗微生物肽类可由天然存在的来源，例如人细胞、c-DNA、基因组克隆、化学合成中获得，或通过重组DNA技术以表达产物的形式从细胞源中获得。

上述抗微生物肽类可通过标准的化学合成法方法，包括由自动化工艺进行合成。总之，肽类似物可以通过基于采用HATU(N-[二甲基氨基-1H-1.2.3-三氮唑[4，5-B]嘧啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲烷铵六氟硫酸盐氮氧化物)作为缀合剂或其它例如HOAt-1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑作为缀合剂的标准的固相Fmoc保护方法进行合成。上述肽被含有适当的可以使侧链功能基团脱保护的脱氧剂的三氟乙酸切断从固相树脂上脱离下来。粗制肽可采用制备用反相色谱层析进一步纯化。还可以采用其它的纯化方法例如分配色谱层析法、凝胶过滤、凝胶电泳法或离子色谱层析。还可使用其它本领域已知的合成技术，例如tBoc保护方法或不同的缀合剂等来制备等同的肽。

或者，肽也可由重组制备方方式合成(例如参见U.S.Pat.No.5,593,866)。有多种宿主系统适合生产上述肽类似物，所述系统包括细菌，例如大肠杆菌；酵母、酿酒酵母或毕赤酵母；昆虫，例如Sf9以及哺乳动物细胞，例如CHO或COS-7。有很多可被每种宿主利用的表达载体，只要上述载体和宿主能够生产抗微生物肽，本发明并不局限于它们中的任何一种。大肠杆菌中的克隆和表达的载体和步骤可在例如下述文献中找到：Sambrook等(《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1987)和Ausubel等(《当代分子生物学方法》，Greene出版公司，1995)。

最后，可从血浆、血液、各种组织等中纯化肽。上述肽可以是内源性的，或由酶或化学性消化纯化蛋白质后得到。例如，肝素结合蛋白可被胰酶消化，所得到的抗微生物肽可以进一步大规模地分离纯化。

编码抗微生物肽的DNA序列被导入至对于宿主适宜的合适的表达载体中。在优选的实施方案中，该基因被克隆至一个载体中以构建一个融合蛋白。为了便于肽序列的分离，将对化学断裂(例如CNBr)或酶断裂(例如V8蛋白酶、胰蛋白素)敏感的氨基酸用于交联肽与融合伴侣。例如在大肠杆菌中表达时，融合伴侣优选为指导形成包涵体的常规的细胞内蛋白质。在这种情况下，下述断裂被用于释放最终的产物，且并不需要肽复性。在本发明中，含有融合蛋白伴侣与肽基因的DNA盒可被插入至表达载体中。优选的情况是，表达载体为包含诱导型或结构型启动子的质粒，以便于插入的DNA序列能有效地转录。

可采用传统的转染技术，例如钙介导技术、电穿孔技术或其它被本领域内的专业人员熟知的技术将表达载体导入至宿主中。

编码抗微生物肽的序列可由某种天然来源例如哺乳动物细胞、现有的cDNA、基因组克隆或合成的序列衍生而来。可以采用下述方法：通过使用扩增引物的PCR辅助扩增抗微生物肽，该扩增引物衍生于抗微生物DNA模板的5’和3’端，并且根据载体的克隆位点选择典型地插入限制性内切酶位点。如果需要，翻译的启始和终止密码子可以被工程化至引物序列中。编码抗微生物肽的序列可以被优化密码子，以促进在特定宿主中的表达，前提是选择密码子时考虑最终被治疗的哺乳动物。因此，举例来说，如果该抗微生物肽在细菌中被表达，该密码子为细菌而优化。

表达载体可以含有启动子序列，以促进所导入的抗微生物肽的表达。如果需要，还可引入调节序列，例如一个或多个增强子、核糖体结合位点、转录终止信号序列、分泌信号序列、复制起点、选择性标记等序列。调节序列可操作性地相互连接以允许转录和后续的翻译。如果需要在细菌内表达抗微生物肽，调节序列应被设计成可在细菌中使用，并被本领域的专业人员所熟知。可广泛性地获得适合的启动子，例如结构性和可诱导性的启动子，包括来自T5、T7、T3、SP6噬菌体、以及trp、lpp、和lac操纵子的启动子。

如果含有抗微生物肽的载体需要在细菌中表达，复制起点的可为下述例子中的任一种：产生高拷贝数的起点、或产生低拷贝数的起点，例如f1-Ori和col E1Ori。

优选地，质粒中包含至少一种在宿主中有功能的可选择性标记，该选择性标记允许转化的细胞被鉴定和/或者选择性地生长。适合细菌宿主的选择性标记基因包括青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因以及本领域内熟知的其它基因。

在细菌中表达的质粒的例子包括pET表达载体pET3a、pET11a、pET12a-c和pET15b(可从Novagen，Madison，Wis.获得)。低拷贝数载体(例如pPD100)在对大肠杆菌宿主有毒性的肽的有效的过表达中使用(Dersch等，FEMS Microbiol.Lett.123：19，1994)。

合适的宿主的例子为细菌、酵母、昆虫及哺乳动物细胞。不过，通常情况下使用例如大肠杆菌这样的细菌。

可通过常规的分离手段分离表达的抗微生物肽，例如亲合、分子排阻或离子交换层析色谱、HPLC等。其它的纯化技术可以在下述文献中找到：《生化学家指南：应用生物化学的原理和技术》(ABiologist’s Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry)(eds.Wilson和Golding、Edward Arnold、London)、或《当代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)(JohnWiley&Sons，Inc)。

相应地，人皮肤肥大细胞在受到纯化的人C3a因子(300nM～600uM范围，Kubota Y.J Dermatol.199219：19-26)的刺激后分泌组氨酸。由聚集的IgG和C3a介导的人肥大细胞的刺激性活化导致添加性脱颗粒。这些数据支持下述机制：肥大细胞(MC)在多种炎性皮肤疾病中作为引发炎症的成分起作用。因此，此处公开的抗微生物肽可以作为肥大细胞活化抑制剂，并可起到与它们的抗微生物的效果相对应的新型的抗炎分子的作用。

另外，本发明涉及包含如上所述的抗微生物肽以及药学上允许的缓冲液、稀释液、载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。添加的化合物可以被包含于组合物中。它们包含例如EDTA、EGTA或谷胱甘肽等螯合剂。上述抗微生物/药物组合物可通过本领域内已知的方式进行制备，前提是可以获得足够的储存稳定性以及适合于对人类和动物进行给药。该药物组合物可以通过例如冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾冷却等方法制成冻干粉。

“药学上可接受”指一种非毒性的材料，它不降低活性成分例如上述抗微生物肽的生物学活性的效力。这样的药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂在本领域内是被熟知的(参见Remington’sPharmaceutical Sciences)，18^th版，A.R.Genna ro，Ed.，Ma ck出版社(1990)、以及handbook of Pharmaceutical Excipients，3^rd版，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。

术语“缓冲液”指含有酸碱混合物以建立pH稳定为目的的水溶液。缓冲液的例子可例举Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、甲次砷酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

术语“稀释剂”指用于在药物组合物的制备中用于稀释上述肽的水性或非水性溶液。稀释液可以为下述物质的一种到多种：盐溶液、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉花籽油或芝麻油)。

术语“佐剂”指任何添加到剂型中用于增加肽的生物学活性的化合物。佐剂可以为下述物质的一种或多种：具有不同阴离子的锌、铜或银盐，例如但不局限于具有不同酰基化合物的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和乙酸盐。

赋形剂可以为下述物质的一个到多个：碳水化合物、多聚物、脂类或矿物质。碳水化合物的例子包括添加至组合物中用于例如改善冷冻干燥特性的乳糖、蔗糖、甘露糖和环糊精。多聚物可例举淀粉、纤维素酯、纤维素羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉藻胶、透明质酸以及它们的衍生物、不同水解程度的聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚乙烯氧化物、氧化聚乙烯/氧化聚丙烯共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乳酸酯以及聚乙烯吡咯烷酮以及它们的所有的不同的分子量的状态，上述物质被添加至组合物中用于实现例如粘度控制、生物粘合性或保护脂类不受化学或分解蛋白的降解。脂类可例举出出于和多聚物相似的理由而添加至组合物中的脂肪酸、磷脂类、单-、双-、或三甘油酯、神经酰胺、神经鞘脂类、糖酯类、它们的所有的具有不同长度和饱和度的酰基链、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂和氢化大豆卵磷脂。矿物质可例举出为了获得减少脂类积蓄或期望的染色特性等效果而添加至化合物中的滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛。

载体的特性取决于给药途径。一种给药途径为局部给药。例如，对于局部给药，优选的载体为含有活性肽的乳化的膏状物质，但还可以使用其它的普通载体例如某种基于矿脂/矿物和基于蔬菜的油膏、以及聚合物凝胶、液晶相或微乳液。

发明的一个特定的具体实施方案涉及抗微生物或药物组合物，其包含例如下述的盐部分：单价的钠、钾、二价的锌、镁、铜和钙。上述特定组合物的pH的范围可以从大约4.5到大约7.0，例如5.0、5.5、6.0或6.5。

组合物可以含有一个或多个肽，例如在抗微生物/药物组合物中有1、2、3或4种不同的肽。通过采用不同的肽的组合，其抗微生物效果可以被提高，并且/或该微生物对该抗微生物药物发生抵抗和/或耐受的可能性将被降低。

如果肽处在含有一种如上所述的盐和/或pH的范围为大约4.5到大约7.0内的组合物中，通过盐的加入和/或特定的pH范围的选择，该肽将变得有活性，例如获得一种增强的效果。

该肽的盐可以是一种与无机酸形成的酸加成物，例如盐酸、硫酸、硝酸、溴氢酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸等等，或者下述有机酸：甲酸、乙酸、卤代乙酸、丙酸、乙醇酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、葡萄糖酸、乳酸、丙二酸、延胡索酸、氨基苯甲酸、苯甲酸、苯乙烯酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等等。可以添加所有具有相应的阴离子的无机盐，例如单价的钠、钾、或二价的锌、镁、铜或钙，用于提高抗微生物组合物的生物学活性。

本发明的抗微生物/药物组合物还可以在脂质体形式中，在其中除了添加其它的药学上可接受的载体以外，该肽还与例如脂类等两亲性分子型药剂相组合，该两性分子型药剂以聚集为微囊、不溶性的单层结构以及液晶状态的形式存在。适用于脂质体剂型的脂类包括，但不局限于单甘油酯、双甘油酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、胆汁酸等。这样的脂质体剂型的制备方法可以在例如US4,235,871中找到。

本发明的抗微生物/药物组合物还可以为生物可降解微球的形式。脂肪族聚酯，例如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)、以及聚酐类目前已被作为生物可降解聚合物广泛的应用于微球的生产中。上述微球的制备方法可以在US5,851,451和EP0213303中找到。

本发明的抗微生物/药物组合物还可以为聚合物凝胶的形式，此处的聚合物可以为淀粉、纤维素酯、纤维素羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉藻胶、透明质酸以及它们的衍生物、不同水解程度的聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙烯醇/聚乙烯氧化物、氧化聚乙烯/氧化聚丙烯共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乳酸酯、以及聚乙烯吡咯烷酮，它们被用于使含有上述肽的溶液增稠。

或者，该抗微生物肽还可以被溶解于盐溶液、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如红花油、玉米油、花生油、棉花籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或不同的缓冲液中。上述药物组合物也可包含离子以及确定的pH以增强抗微生物肽类的作用。

本发明的抗微生物/药物组合物可以采用例如灭菌等通常的制药学操作，和/或包含通常的佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液、填充剂等如本说明书中其它地方所公开的物质。

本发明的抗微生物/药物组合物可以局部给药或整体给药。给药途径包括局部、眼部、鼻腔、背部、口腔、非肠道的(静脉注射、皮下注射而肌肉注射)、口服、非肠道、阴道和直肠。另外还可以采用植入式的给药方式。适合的抗微生物制剂形式为例如颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、微乳化剂、被定义为光学各向同性的热力学稳定的系统包括水、油和表面活性剂、液晶相；被定义为特征是在长范围有规则但短范围内无规则的系统(例如片层、六边形及立方体相，连续的水或油中的一种)；或它们的分散的形式、凝胶、油膏、分散物、混悬物、膏、气雾剂、滴丸剂或安培瓶中的可注射溶液、以及活性成分缓释的制剂，上述剂型中赋形剂、稀释剂、佐剂或载体按照上面所述的通常的方法使用。该药物组合物还可以被提供到绷带、膏药或缝合线等中。

该药物组合物应以治疗有效量施用给患者。“治疗有效量”指对于被给药的疾病足够产生期望的效果的剂量。精确的剂量根据化合物的活性、给药的方式、病症的本质和严重程度、患者的年龄和体重的不同而不同。药物的给药可以通过个体化剂量单位或几个较小剂量单位的单次给药形式进行，也可以通过在特定的间隔期给予分配好的剂量的多次给药的形式进行。

本发明的药物组合物还可以单独给药，或与其他治疗药物例如抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗寄生虫剂等抗生素类或防腐剂组合给药。具体可例举出青霉素、头孢菌素、碳头孢烯类、头霉素、碳青霉烯类、单环内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮类。防腐剂包括碘酒、银、铜、洗必泰、聚己缩胍及其他的双胍类、脱乙酰壳多糖、醋酸及过氧化氢。这些药物可以被加入至药物组合物中作为其一部分，或者分开给药。

本发明的对象涉及人类及其他的哺乳动物二者，例如马、狗、猫、牛、猪、骆驼及其它。因此上述方法既适用于人类的治疗也适用于兽医治疗。适合上述治疗的目标可通过早已建立的感染的特点进行鉴定，例如发烧、puls、微生物的培养等。可以被抗微生物肽治疗的感染包括由微生物所引起或导致的感染。微生物的例子包括细菌(例如革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌)、真菌(例如酵母或霉菌)、寄生虫(例如原生动物、线虫、绦虫和吸虫)、病毒、朊病毒。上述这些分类中的特定的微生物是众所周知的(参考Davis等，《微生物学》，第3期增刊版，Harper&Row，1980)。感染包括但不局限于慢性皮肤溃疡、伤口和烧伤伤口的急性感染、感染性皮肤湿疹、脓疱病、特应性皮炎、痤疮、外耳炎、阴道感染、脂溢性皮炎、口腔感染和牙周炎、假丝酵母性擦烂、结膜炎和其它眼部感染以及肺炎。

相应地，抗微生物/药物组合物还可以用于烧伤、术后或皮肤外伤后的预防性治疗。该药物组合物还可被含有在用于储存或与人身体接触的治疗用外用材料，例如隐形眼镜、整形外科移植物、导尿管中。

另外抗微生物/药物组合物还可以用于下述病症的治疗：特应性皮炎、脓疱病、慢性皮肤溃疡、伤口和烧伤伤口的急性感染、痤疮、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂溢性皮炎、假丝酵母性擦烂、咽喉假丝酵母感染、眼部感染(细菌性结膜炎)、鼻腔感染(包括MRSA支架)。

抗微生物/药物组合物还可以用于清洁剂溶液中，例如镜头消毒液以及储存液，或被用于预防与泌尿道尿管的使用和中央静脉导管接触导致的细菌感染。

另外，抗微生物组合物还可以用于膏药、粘合剂、缝合线、或在伤口敷料中使用，以预防外科手术后的感染。

抗微生物肽类还可以用于聚合物、纺织品等中以建立抗菌表面，或者该抗微生物/药物组合物还可补充于化妆品、个人护理品(肥皂、香波、牙膏、抗痤疮用品、防晒霜、棉球、尿布等)中。

本发明还涉及多肽的用途，该多肽显示与SEQ ID NO：2相比至少70％、80％、90％或95％甚至更高的同源性，且如上所定义的C3a多肽或抗微生物肽，或如上所定义的抗微生物/药物组合物被用于制备用于预防、抑制、减少或杀灭选自细菌、病毒、寄生虫、真菌和酵母的微生物的抗微生物组合物，本发明还涉及该多肽在治疗和诊断中的用途。

最后，本发明还涉及治疗患有微生物感染或有过敏症状的哺乳动物的方法，该方法包含如上所述的对患者给予治疗有效量的药物组合物。

实施例

实施例1

潜在取代位置的预测

AGADIR是基于螺旋-卷曲变换理论的算法，其被用于预测形成螺旋的倾向(LacroixE，Viguera AR and SerranoL.(1998)，Elucidating the folding problem of α-helices：local motifs，long-rangeel ectrostatics，ionic-strength dependenceandprediction of NMR parameters，J Mol Biol，284，173-191)。通过将肽的序列输入至EMBL WWW门户链接到AGADIR服务(http://www.embl-heidelberg.de/Services/serrano/agadir/aga dir-s tart.html)进行计算。

输入的参数如下：自由C末端，自由N末端，pH7.4，温度278K，离子强度0.15M。两亲性通过螺旋环图表进行测算。

一个建模以适应α-螺旋构象的关于CNY21的结构研究显示该分子的N末端部分具有明显的两亲性(图2和6)。另外，Arg9和Gln10上的侧链可以与Glu6的侧链形成氢键，并且Arg13的侧链可与Gln10上的侧链形成氢键，使螺旋稳定。

众所周知，在α-螺旋的末端的特定位置存在氨基酸偏好(Richardson JS and Richardson DC.(1988)Amino acid preferencesfor specific locations at the ends of α-helices，Science，240，1648-1652)。AGADIR研究了CNY21上不同N-帽残基(N-capresidue)的影响(由AGADIR预测的螺旋内容显示于肽序列之后)。

CNYITELRRQHARASHLGLAR4.83

-NYITELRRQHARASHLGLAR13.58

-SYITELRRQHARASHLGLAR14.57

-GYITELRRQHARASHLGLAR4.85

-TYITELRRQHARASHLGLAR4.47

-VYITELRRQHARASHLGLAR3.16

GNYITELRRQHARASHLGLAR4.97

可以看出仅有C末端的Cys的删除以及有Asn或Ser中任一个作为N帽残基对螺旋倾向有深刻的影响。进而，还有报道抗微生物肽类对N末端的Gly具有位置保守性(TossiA，Sandri L，GiangasperoA.(2000)，Amphipathic，alpha-helical antimicrobial peptides，Biopolymers，55，4-30)。此处用Gly代替N末端的Cys几乎没有影响。

通过假设2位置的Asn作为N帽残基起作用，对在N帽+3的位置上的不同的残基的研究显示有对Glu或Asp的偏好倾向。

CNYITELRRQHARASHLGLAR4.83

CNYISELRRQHARASHLGLAR3.84

CNYINELRRQHARASHLGLAR3.29

CNYIQELRRQHARASHLGLAR2.03

CNYIMELRRQHARASHLGLAR2.81

CNYIDELRRQHARASHLGLAR11.64

CNYIEELRRQHARASHLGLAR14.68

CNYIGELRRQHARASHLGLAR2.42

CNYIKELRRQHARASHLGLAR1.76

CNYIRELRRQHARASHLGLAR2.08

CNYIHELRRQHARASHLGLAR1.44

CNYIYELRRQHARASHLGLAR2.87

CNYIFELRRQHARASHLGLAR2.29

CNYIWELRRQHARASHLGLAR3.15

CNYIPELRRQHARASHLGLAR1.27

该偏好是由于形成了一个称为“帽盒”(capping box)相互相反(reciprocal)的骨架-侧链氢键的相互作用(Harper ET and RoseGD，(1993)，Helix stop signals in proteins and peptides：Thecapping box，Biochemistry，32，7605-7609)。该基序的进一步分析显示在CNY21中，在位置2对Asn、Ser或Thr的其中一个的偏好，以及在位置5对G lu和Asp的偏好。

CNYITELRRQHARASHLGLAR4.83

CNYIEELRRQHARASHLGLAR14.68

CNYIDELRRQHARASHLGLAR11.64

CSYITELRRQHARASHLGLAR4.94

CSYIEELRRQHARASHLGLAR18.89

CSYIDELRRQHARASHLGLAR13.90

CTYITELRRQHARASHLGLAR3.19

CTYIEELRRQHARASHLGLAR14.81

CTYIDELRRQHARASHLGLAR11.57

同样此处的N末端Cys的删除增加了尤其是具有NXXE和SXXE帽基序的肽的螺旋性。

-NYITELRRQHARASHLGLAR13.58

-NYIEELRRQHARASHLGLAR27.33

-NYIDELRRQHARASHLGLAR20.18

-NYINELRRQHARASHLGLAR6.37

-NYIHELRRQHARASHLGLAR3.26

-NYIQELRRQHARASHLGLAR4.39

-SYITELRRQHARASHLGLAR14.57

-SYIEELRRQHARASHLGLAR32.01

-SYIDELRRQHARASHLGLAR24.58

-SYINELRRQHARASHLGLAR6.76

-SYIQELRRQHARASHLGLAR4.95

-TYITELRRQHARASHLGLAR4.47

-TYIEELRRQHARASHLGLAR22.89

-TYIDELRRQHARASHLGLAR16.54

-TYINELRRQHARASHLGLAR4.61

-TYIHELRRQHARASHLGLAR2.21

-TYIQELRRQHARASHLGLAR3.46

有时螺旋被N帽的+4位置的疏水性残基稳定化。研究此的目的还在于观察负电荷是否可被清除。

CNYITELRRQHARASHLGLAR4.83

CNYITALRRQHARASHLGLAR4.51

CNYIEELRRQHARASHLGLAR14.68

CNYIEALRRQHARASHLGLAR15.57

CNYIELLRRQHARASHLGLAR16.61

-NYITELRRQHARASHLGLAR13.58

-NYIEELRRQHARASHLGLAR27.33

-NYIEALRRQHARASHLGLAR9.57

-NYIELLRRQHARASHLGLAR7.31

螺旋通常被作为C帽残基的Gly或在C帽+1位置上的Pro所终止(Richardson JS and Richardson DC.(1988)Amino acidpreferences for specific location at the ends of α-helices，Science，240，1648-1652)。CNY21在自身的C末端具有一个Schellman结构域(Prieto J and Serrano L，(1997)，C-capping andhelix stability：The Pro C-capping motif，J Mol Biol，274，276-288)，该结构域被i位置的Gly、i-4和i+1的位置上的一个疏水性残基或i-2位置上的Ala的指纹图谱所鉴定。

CNYITELRRQHARASHLGLAR4.83

CNYITELRRQHARLSHLGLAR5.02

CNYITELRRQHARASALGLAR5.86

CNYITELRRQHARLSALGLAR6.53

进一步，可以通过优化肽中的疏水性残基之间的间隔有效地增加螺旋含量(helix cont ent)。尤其是已知亮氨酸之间的i、i+3或i、i+4间隔可以使螺旋稳定化，最后一个间隔期提供了最强的相互作用(Luo P，Baldwin RL.(2002)Origin of the different strengthsof the(i，i+4)and(i，i+3)leucine pair interactions in helices，Biophys Chem.96，103-108)。在CNY21的N末端，Tyr3与Leu7最易于发生i，i+4相互作用。如下面可以看到的，通过插入亮氨酸到位置8、11、12和16，在CNY21中该螺旋含量从5％增加至50％。

CNYITELRRQHARASHLGLAR4.83

CNYITELLRQHARASHLGLAR10.59

CNYITELRRQLARASHLGLAR15.15

CNYITELRRQHLRASHLGLAR5.09

CNYITELRRQHARASLLGLAR5.91

CNYITELLRQLARASHLGLAR31.64

CNYITELLRQLLRASHLGLAR39.43

CNYITELRRQLARASLLGLAR17.90

CNYITELRRQLLRASLLGLAR22.22

CNYITELLRQLARASLLGLAR35.71

CNYITELLRQLLRASLLGLAR47.49

CNY21的两性分子结构并不是最优选的(图2和6)。通过用一个疏水性残基取代Arg8、His11和Ser15，以及用一个亲水性带电残基取代His16和Leu17，此类带有正电荷的氨基酸增加了肽的净正电荷，将会优化CNY21的两性分子特征。

CNYITELLRQHARASHLGLAR10.59

CNYITELLRQLARASHLGLAR31.64

CNYITELLRQLARALHLGLAR47.29

CNYITELRRQHARASHKGLAR5.07

CNYITELLRQLARALHKGLAR48.70

CNYITELRRQHARASKLGLAR6.01

CNYITELLRQHARASKLGLAR12.70

CNYITELLRQLARASKLGLAR36.26

CNYITELLRQLARASKKGLAR37.53

CNYITELLRQLARASQKGLAR36.48

CNYITELLRQLARASEKGLAR32.67

CNYITELLRQLARALKKGLAR57.55

CNYITELLRQLLRALKKGLAR64.98

最后，通过组合如上所述的不同的取代，将有可能设计这样一种CNY21的变异体，其具有增加的螺旋性和理想的两亲性。如具有T5E、H11L、A12L、S15L、H16L和L17R的取代的肽所例证的情况所示，仅通过六个取代，就有可能使螺旋性从5％增加超过70％。图3中示出该CNY21变异体的螺旋环投影图。

CNYIEELLRQLARALHKGLAR58.71

CSYIEELLRQLARALHKGLAR61.84

CSYIEELLRQLLRALLKGLAR76.45

CNYIEELRRQLARALHKGLAR51.32

CNYIEELRRQLLRALHKGLAR57.97

CSYIEELRRQLARALHKGLAR55.59

CSYIEELRRQLLRALLKGLAR73.55

CSYIEELRRQLLRALLRGLAR74.12

CNYIEELRRQLLRALLKGLAR71.47

CNYIEELRRQLLRALLRGLAR72.04

CNYIEELLRQLLRALKKGLAR70.57

CSYIEELLRQLLRALKKGLAR72.02

CSYIEELLRQLLRALKRGLAR72.40

所有在CNY21肽的不同位置上的可选的取代总结于表1中。

表1：增加CNY21螺旋性的氨基酸取代

作为阴性对照的肽CNY21R-S和CNY21H-P应该比CNY21具有更少的螺旋性。这些肽也被确切地预测到具有很低的螺旋含量。显示出更强的抗菌活性的CNY21H-K和CNY21H-L肽具有更高的预测到的螺旋性，这与更大的形成α-螺旋构象的倾向将提高效力的假说是一致的。

CNY21 CNYITELRRQHARASHLGLAR4.83

CNY21R-S CNYITELSSQHASASHLGLAR0.60

CNY21H-P CNYITELRRQPARASPLGLAR1.91

CNY21H-K CNYITELRRQKARASKLGLAR9.72

CNY21H-L CNYITELRRQLARASLLGLAR17.90

实施例2

抗微生物肽类

由Innovagen AB，Ideon，SE-22370，Lund，Sweden合成下述肽：CNY21；CNY ITELRRQHARASHLGLAR，CNY20；CNYITELRRQHARASHLGLA，CNY21R-S；CNYITELSSQHASASHLGLAR，CNY20R-S；CNYITELSSQHASASHLGLA，CNY21H-L：CNYITELRRQLARASLLGLAR，CNY21H-K；CNYITELRRQKARASKLGLAR，CNY21H-P；CNYITELRRQPARASPLGLAR。通过质谱分析确定(MALDI.TOF Voyager)这些肽的纯度(>95％)以及分子量。

微生物

将最初从慢性静脉溃疡中获得的粪肠球菌2374、大肠杆菌37.4、假单胞绿脓杆菌27.4、以及从患有特应性湿疹的患者身上获得的白色假丝酵母BM4435用于试验中。

实施例3

由C3a衍生的CNY21肽的抗菌效果

图1A显示CNY21对粪肠球菌2374(—●—)，以及对假单胞绿脓杆菌27.1(—□—)的杀菌效果。细菌在Todd-Hewitt(TH)培养基中被培养至对数生长期中期。细菌在10mM Tris，pH7.4，含有5mM葡萄糖的溶液中被洗涤和稀释。细菌(50μl；2×10⁶cfu/ml)在37℃下温育2小时，得到浓度在0.03～60μM范围内的合成肽。为了定量细菌的活性，温育混合物的系列稀释物被涂板至TH琼脂板上，然后在37℃下温育过夜，之后测定菌落形成单位。

图1B显示CNY21在不同缓冲液中的存活计数分析；10mM TrispH7.4(—●—)和10mM MES pH5.5(—□—)，二者都含有0.15M NaC l。假单胞绿脓杆菌27.1(2×10⁶cfu/ml)与浓度处于0.03～6μM范围内的肽一起温育，体积为50μl。

实施例4

CNY变异体的放射扩散检测分析

大致按照前人所述的方法(Andersson et al.，Eur J Biochem，2004，271：1219-1226)进行放射扩散检测(RDA)。简而言之，将细菌(假单胞绿脓杆菌27.1)在10ml的全浓度(3％w/v)的胰化酪蛋白大豆培养液(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中培养至对数生长中期。用pH7.4的10mM Tris洗涤一次该微生物。4×10⁶细菌cfu或1×10⁵真菌cfu被加入至5ml底层琼脂糖凝胶中，该凝胶含有0.03％(w/v)TSB、1％(w/v)低电渗型(Low-EEO)琼脂糖(Sigma，St LouiseMO)以及终浓度为0.02％(v/v)的吐温20(Sigma)。该底层凝胶被倒入一个直径85mm的有盖培养皿中。琼脂糖固化后，打出4mm直径的孔，每孔中加入6μl待测样品。培养板在37℃下温育3小时以使肽扩散。底层凝胶被5ml熔化的上层覆盖(在dH₂O中的6％TSB和1％Low-EEO琼脂糖)。37℃下18～24小时的温育后，肽的抗微生物活性可通过每个孔周围的干净区域来观察。以100μM的浓度测试了合成肽以确定其抗菌效果(图8)。CNY21；CNYITELRRQHARASHLGLAR，CNY20；CNYITELRRQHARASHLGLA，CNY21R-S；CNYITELSSQHASASHLGLAR，CNY20R-S；CNY-ITELSSQHASASHLGLA，CNY21H-L：CNYITELRRQLARASLLGLAR，CNY21H-K：CNYITELRRQKARASKLGLAR，CNY21H-P：CNYITELRRQPARASPLGLAR。CNY21H-P变异体(此处未示出)未显示任何抗微生物活性。

实施例5

CNY-变异体的抗真菌效果

将真菌(C.albicans，白色假丝酵母)在10ml的全浓度(3％w/v)的胰化酪蛋白大豆培养液(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中培养至对数生长中期。用pH7.4的10mM Tris洗涤一次该微生物。1×10⁵真菌cfu被加入至5ml底层琼脂糖凝胶中，该凝胶含有0.03％(w/v)TSB、1％(w/v)低电渗型(Low-EEO)琼脂糖(Sigma，StLouiseMO)以及终浓度为0.02％(v/v)的吐温20(Sigma)。该底层凝胶被倒入一个直径85mm的有盖培养皿中。琼脂糖固化后，打出4mm直径的孔，每孔中加入6μl待测样品。培养板在37℃下温育3小时以使肽扩散。底层凝胶被5ml熔化的上层覆盖(在dH₂O中的6％TSB和1％Low-EEO琼脂糖)。28℃下18～24小时的温育后，肽对于白色假丝酵母的抗微生物活性可通过每个孔周围的干净区域来观察(图9)。结果以三个重复样品的平均值表示。CNY21；CNYITELRRQHARASHLGLAR，CNY21H-K；CNYITELRRQKARASKLGLAR，CNY21H-L；CNYITELRRQLARASLLGLAR，CNY20R-S；CNYITELSSQHASASHLGLA，CNY21R-S；CNYITELSSQHASASHLGLAR，CNY21H-P；CNYITELRRQPARASPLGLAR。

实施例6

抗微生物肽的溶血效果

通过在540nm处检测血红蛋白的释放以测定溶血活性。简而言之，血红细胞的混悬液(在10％的PBS中)与同体积的肽(在PBS中)温育。混合物在37℃下温育1小时后离心。测定上清液的光吸收。通过加入占血红细胞混悬液等同体积的2％的Triton X100实现100％的溶血。对CNY变异体的研究显示很小或没有溶血性效果(图10)。作为对比的抗微生物肽LL-37在60μM下引起大约6％的溶血。

实施例7

CNY-变异体对真核细胞膜的影响

研究了对人类HaCaT角化细胞细胞株的细胞膜穿透效果。在96孔板中的汇合细胞培养与肽一同温育6小时，测定了乳酸脱氢酶的释放。与抗微生物肽LL-37相比，所研究的CNY变异体未释放任何LDH(图11)。

实施例8

CNY21的肝素结合

测试了肽的肝素结合活性。肽被应用于硝酸纤维素膜上(Hybond，Amersham Bioscience)。膜被封闭1小时(PBS，pH7.4，0.25％吐温20，3％牛血清白蛋白)，并在相同的缓冲液中与放射标记的肝素温育1个小时。加入未标记的多糖(肝素，2mg/ml)用于结合竞争。洗涤膜(3×10min，在PBS中，pH7.4，0.25％的吐温20)。使用Bas2000放射显影系统(富士)使放射活性可视化。未标记肝素(6mg/ml)抑制了与¹²⁵I-肝素CNY21的结合。

实施例9

CNY21变异体与脂双层结构的结合

测试了肽与脂双层结构的结合，结果导致孔洞的形成和肽在脂质膜中形成二级结构。研究的脂质膜包括两性离子的膜(含有磷脂酰胆碱)和阴离子的膜(含有磷脂酰胆碱和磷脂酸的混合物)。脂类膜在无水硅酸中沉淀，使用椭圆光度法直接监测10mM Tris，pH7.4的肽的结合。脂类膜还以脂质体的形式进行了制备，由同样的脂类在同样的缓冲液中通过挤压和重复的冷冻-溶化，结果形成了直径为150nm的单室脂质体。在上述脂质体中的孔洞形成通过下述方法测定：在脂质体中含有羧基荧光素，然后在脂质体中添加肽以后出现了荧光强度的增加。进一步，肽类在脂质体脂膜中形成的二级结构通过圆二色谱进行测定。结果显示CNY21两性离子和阴离子的脂类膜上，并且CNY21显示比CNY21R-S更高的结合倾向。另外，CNY21变异体导致了孔洞的形成以及脂质体的泄漏，其效力的顺序为：CNY21H-L≈CNY21H-K>CNY21>CNY21H-P≥CNY21R-S。另外，圆二色谱(CD)显示肽在脂质体的脂类膜中形成了螺旋结构，其程度为同样的按顺序降低。

实施例10

肽

肽来自Sigma-Genosys，由肽合成平台制备(PEPscreen

CustomPeptide Libraries，SigmaGenosys)。产量为约大约1～6mg，肽链长度为20个氨基酸。对上述肽进行了MALDI-ToF质谱分析。20聚物的粗产物平均纯度大约为61％。肽被制成冻干粉并储存于96孔管架中。在进行生物学测定之前，将PEP筛选肽用dH₂O(5mM母液)稀释，并储藏于-20℃。该储藏溶液被用于后续的实验。

微生物

大肠杆菌37.4分离株最初获自患有慢性静脉溃疡的患者，金黄色葡萄球菌分离株BD14312获自患有特应性皮炎的患者。金黄色葡萄球菌ATCC29213和白色假丝酵母ATCC90028均获自Lund医学院的临床细菌学部。

放射扩散检测

基本如前人所述(Lehrer et al.，J Immunol Methods137，167-173，1991，Andersson et al.，Eur J Biochem271，1219-1226，2004)，细菌在10ml的全浓度(3％w/v)的胰化酪蛋白大豆培养液(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中被培养至对数生长中期。该微生物被pH7.4的10mM Tris洗涤一次。4×10⁶细菌菌落形成单元被加入至15ml底层琼脂糖凝胶中，该凝胶含有0.03％(w/v)TSB、1％(w/v)低电渗(EEO)琼脂糖(Sigma，St Louis MO)以及终浓度为0.02％(v/v)的吐温20(Sigma)。该底层凝胶被倒入一个直径144mm的有盖培养皿中。琼脂糖固化后，打出4mm直径的孔，每孔中加入6μl待测样品。培养板在37℃下温育3小时以使肽类扩散。底层凝胶被15ml熔化的上层覆盖(在dH₂O中的6％TSB和1％Low-EEO琼脂糖)。37℃下18～24小时的温育后，肽的抗微生物活性可通过每个孔周围的干净区域来观察。

实施例11

溶血检测

EDTA-血以800g离心10分钟，然后去除血浆和淡黄色的表层。真核细胞被洗涤三次并重悬于pH为7.4的5％的PBS中。然后细胞在肽的存在下(60μM)在连续的转动下在37℃温育1小时。将2％的Trit onX-100(SigmaAldrich)作为阳性对照。然后样品以800g离心10分钟。在λ540nm处测定血红蛋白的释放的吸光度，在图表中被表示为Trit on X-100诱导的溶血的百分数(％)。

实施例12

螺旋形成的预测

AGADIR是基于螺旋-卷曲变换理论的算法，其被用于预测形成螺旋的倾向(Lacroix et al.，J Mo lBiol，284，173-191，1998)。通过将肽的序列输入至EMBL WWW门户链接的AGADIR服务进行计算：(http://www.emb l-heide l berg.de/s ervices/serrano/agadir/ agadir-s tart.html)。输入的参数如下：自由C末端，自由N末端，pH7.4，温度278K，离子强度0.15M。

由实施例10～12获得的结果

基于实施例1中定义的标准，设计和合成了几种带有净的正电荷、具有更高的螺旋性和提高的两亲性的变异体。为了定量地测试尽可能多的不同的变异体，采用了如前所述的PEP筛选文库。由于PEP筛选文库只适用于20个残基的肽，CNY21的C末端精氨酸残基被省略。使用两种临床分离株假单胞绿脓杆菌15159和大肠杆菌37.4，在RDA检测中比较CNY20变异体“CNYINYITELRRQHARASHLGLA”与CNY21。得到了使用100μM的肽(n＝9)的假单胞绿脓杆菌的下述数据；平均值；CNY21：5，00，SD；0，81，SEM0，27.CNY20：平均值；6，02，SD；0，59，SEM；0，20.大肠杆菌；CNY21：平均值6，02，SD0，93，SEM；0，31，CNY20：平均值；8，03，SD；1，22，SEM，0，41。因此，CNY20与CNY21比较未发现有活性的降低。通过改变N-帽、N-帽+3和N-帽+4位置(表1，实施例1)，设计了序号为2～17的肽类以提高螺旋性。对于21～30的肽，则通过改变亮氨酸之间的间隔以提高螺旋性(表1，实施例1)。通过取代肽31～43的在位置8、11、15、16和17的氨基酸，两亲性分子性结构被进一步增加(表1，实施例1)。对于44-56的肽，通过组合如前所述的取代获得了优化的两亲性和增加的螺旋。最后，为了在获得稳定的螺旋性和改善的两亲性的同时提高正电荷，设计了肽57～74。

生物学测试的结果表示在表1中。在被设计为通过N-帽和C-帽基序的稳定化而提高螺旋性的前面的20个肽中，相对来说，较少的肽显示出了任何关于抗微生物效果的提高。只有净正电荷+3的肽显示出明显提高的RDA值(例如肽编号14)。这些肽均无溶血作用。更为疏水性的肽编号21～30显示出了相似的效果。肽编号27～30未包含在试验对象中。具有优化的两亲性结构的肽类显示出更高的RDA值(肽39、40、42和43)。然而被预测具有高螺旋含量的肽编号42和43也同时表现出较高的溶血活性。具有组合取代以使螺旋性最大化的肽44～56中的大多数均显示出较高的溶血性。由于稳定性问题研究中排除了肽编号51和53。肽编号47显示了较高的抗微生物效果，同时具有低的溶血活性。肽57～74中，除了肽编号73以外均有溶血性，其原因可能是由于它们较高的净电荷和螺旋性。值得一提的是，具有该系列中最高的净电荷的肽编号73，却显示出非常显著的抗金黄色葡萄球菌和假丝酵母的效果，并且显示出低的溶血活性。

未观察到净电荷或螺旋性与大肠杆菌RDA之间的明显的相关性。观察到净电荷和较高预测的螺旋性与溶血活性之间有较低的相关性。另一方面，金黄色葡萄球菌和假丝酵母的RDA则与净电荷有着很强的相关性。具有高正的净电荷的肽表现出很高的抗微生物活性(图4)。

需要说明的是，具有高预测螺旋性和高抗微生物活性的肽表现出非常不同的溶血活性。例如，肽编号39和47表现出低溶血活性，而肽编号42和43则具有很强的溶血性。特别是，肽39和42只有一个氨基酸的差别：肽42在位置15有一个由亮氨酸取代丝氨酸的附加的取代。在溶血活性方面的巨大差别可能反映出肽42形成了一个更优化的两亲性螺旋的事实(图5)。同样的理由也适用于肽43和47。肽43的精氨酸8被亮氨酸所取代(图5)。

第二代CNY20肽以及它们的活性

首次PEP筛选中的变异体中有四种在RDA值中显示出对于大肠杆菌很高的抗微生物活性，同时显示了较低的溶血性，而且含有不完美的两亲性螺旋。因此，设计了另外的具有使两亲性肽的结构性组织出现断点(break)的氨基酸取代的变异体。所述肽的净电荷保持在+2和+3附近，且还被设计为具有相对较高的(但并非过度高)的螺旋含量(20～60％)。

设计了新的在N末端区域(140～146)、C末端区域(147～160)、或中间区域(161～168)处具有两亲性裂的变异体。附加的肽含有较高的正的净电荷(169～171)，较高的疏水性(172～177)，具有乙酰化或酰胺化的N-和C-末端(179～181)，或包含所有的D-氨基酸(182～184)(表2)。

为了提高肽的C末端的两亲性，在位置11和15处实施用亮氨酸取代极性氨基酸(图6和4)。进一步，在位置16和17实施用赖氨酸取代疏水性氨基酸(图6和7)。为了提高肽的N末端的两亲性，在位置8和11实施用用亮氨酸进行取代(图6和7)。在中间区域具有两亲性断点的肽均在位置11处具有带正电荷的精氨酸和赖氨酸，并在位置8和15具有疏水性的亮氨酸，以及在位置17具有一个赖氨酸。上述所有的变异体均在位置5处有一个由苏氨酸到谷氨酸盐的取代，该取代通过如实施例1中所述的使帽基序稳定化而用于提高螺旋性。

几乎所有测试的肽都显示了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的显著的抗微生物效果。未观察到在N-末端和C-末端或中间区域具有两亲性断点的不同的肽组之间有明显的差异。不过，结果提示在中间区域具有断点的肽对于金黄色葡萄球菌具有稍强一点的抗微生物效果。具有更高净电荷的肽也显示出更好的抗微生物活性。在N-末端和C-末端的乙酰化和酰胺化的影响很微小，D-氨基酸肽类显示出与由L-氨基酸构成的肽类相似的抗微生物活性。在位置5处具有谷氨酸盐的肽类与在此位置没有进行取代的肽类相比，并不具有更强的抗微生物活性。有可能净电荷降低超过了螺旋性的稳定带来的影响。

具有很好的抗微生物活性的肽在位置5处含有苏氨酸或谷氨酸，在位置8处含有精氨酸，赖氨酸或亮氨酸，在位置11处具有亮氨酸，精氨酸或赖氨酸，在位置12处具有丙氨酸或亮氨酸，在位置14处具有丙氨酸或亮氨酸，在位置15处具有丝氨酸、亮氨酸、精氨酸或赖氨酸，在位置16处具有组氨酸或赖氨酸，在位置17处具有亮氨酸或赖氨酸。特别是肽编号140、146和160显示出对于大肠杆菌很高的抗微生物活性，肽编号160、161和165显示出对于金黄色葡萄球菌很高的抗微生物活性，肽编号158、160和171对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示出很高的抗微生物活性。而且，上述结果显示具不完美的两性结构、以及较高的净电荷的肽类对于金黄色葡萄球菌和假丝酵母属的微生物具有较强活性。

综上所述，上述研究显示在CNY20肽的精确限定的位置上的少量氨基酸的取代可以提高抗微生物活性并同时保持较低的溶血活性，这使得上述肽类具有比原来的肽更高的治疗指数。较高的净电荷、形成α-螺旋构象的倾向性以及并不完美的两亲性的组合，是实现上述目的的关键因素。对于CNY20肽，在位置8、11、15及17上的取代被证明是非常必要的。

序列表

<110>Dermagen AB公司

<120>新型抗微生物肽

<130>P5856003

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>PRT

<213>人

<400>1

Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His

1 5 10 15

Leu Gly Leu Ala Arg

20

<210>2

<211>77

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ser Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro

1 5 10 15

Lys Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met

20 25 30

Arg Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Cys Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg

50 55 60

Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg

65 70 75

Claims

1.由SEQ ID NO：1构成的肽，其中所述的肽具有取代T5K。

2.权利要求1的肽在制备具有抗大肠杆菌(Eschericiacoli)和金黄色葡萄球菌(Seaphylococcus aureus)的活性的药物中的用途。