WO1997024449A1

WO1997024449A1 - Cold-inducible promoter sequences

Info

Publication number: WO1997024449A1
Application number: PCT/JP1996/003822
Authority: WO
Inventors: Toshiki Mine; Akio Ohyama; Tooru Hiyoshi; Keisuke Kasaoka
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 1997-07-10
Also published as: EP0812917A4; KR100452853B1; JP3469902B2; CA2213991C; AU725727B2; ES2243954T3; AU1208597A; US6084089A; DE69634875T2; CA2213991A1; DE69634875D1; DK0812917T3; ATE298368T1; KR19980702463A; CN1137997C; EP0812917A1; CN1176661A; EP0812917B1

Description

明細書

低温誘導性プロモーター配列

技術分野

本発明は、低温において遺伝子発現を誘導する性莨を有するプロモーター配列に関する。本発明の低温誘導性プロモーター配列は、低温貯蔵中のバレイショ塊茎中の還元糖量の抑制、バレイショ塊茎の発芽抑制及び植物への低温耐性の付与に有用 Cめ" ©。

背景技術

多くの作物は、収穫後、低温等の処理により品質を長期間維持させることが必須である。しかし、バレイショ塊茎では低温貯蔵中に Low temperature sweeteningといわれる還元糖蓄稜が起こリ、その際生成された還元糖が、フレンチフライ、ポテトチップス等の加工製品作成時に呈色反応（メイラード反応）を引き起こし、商品価値を著しく低下させることが広く知られている。また、果実などではエチレン生成による軟化等が知られており、これらの問題点を解決するための研究、すなわち収穫後生理（Post-harvest physiology) は現在世界中で広く行われている研究分野の一つである。

バレイショ塊茎で外来遺伝子を特異的に発現させる際には、貯葳タンパク筲パタチン遺伝子のプロモーターが世界的に広く使用されてきた（EMBO J. 8(1) : 23 -29. 1989. Plant Moに Biol. 12: 41-50, 1989, Bio/Technology 12: 1101- 11 05, 1994等）。バタチン遺伝子の発現は塊茎の生育、肥大に伴い増大するが、塊茎の肥大時は同時に遠元糖からデンプンへの転換をはじめとする種々の代謝系が活性化している時期でもある。そのためバタチンプロモーターに連結する遺伝子の種類によっては代謝系の撹乱、さらには収量減等につながる恐れがある。このような問題を回避し、貯蔵時の品質維持を効率的に行うためには、通常条件下の植物体中では発現量が少なく、低温貯蔵中の瑰茎でのみ効率的な発現を可能にするプロモータ一を単離、利用することが必要と思われる。

低温锈導性遺伝子は、原核、真核生物を問わず、数多くの種類が単離、報告されている（総説として、組織培養 19(10) : 357-361, 1993等がある）。また、バレイショ塊薹からも単離例がある (Plant Physiol. 104: 445-452， 1994 )。同じ Solanum厲植物からはォスモチン類似遺伝子が単離され、これが低温で誘導されることが報告されている (Plant Mol. Biol. 21 : 729-735， 1993) ₀ バレイショ塊茎からの単離例は、上記 1報のみである。

バレイショ塊茎から低温誘導性遺伝子（c D N A ) は 5種類単離されており（ Plant Physiol . 104 : 445-452, 1994 ) 、そのうち 2種は他種植物の smal l hea t- shock proteinあるいは他種植物低温誘導タンパク質、 A B A誘導タンパク質等の遺伝子と類似性が見いだされている。他の 3種については未解析である。これら c D N Aの核遗伝子（プロモーターを含む）は報告されていない。これらはいずれも低温に対する反応が早い（1週間以内に反応する）遺伝子と思われる。上記既知遺伝子のプロモーターを低温貯蔵する必要がある作物（バレイショ等 ) に応用することはもちろん可能である。しかし、これらプロモーター（Plant Physiol . 104 : 445-452, 1994 等）が目的とする器官にのみ高発現を誘導するかは明かではない（低温時に他の器官でも誘導される可能性がある）。また、 «温下においてもある程度発現する可能性がある。すなわち、これら既知遗伝子プロモーターが低温条件下のバレイショ塊茎等、貯蔵を目的とする器官でのみ効率的な遗伝子発現を行えるかは明かではない。また、バレイショ塊茎の貯蔵期間は数力月間の長期に及ぶため、その間上記プロモーターが機能するかどうかは不明である（Plant Physiol. 104 : 445-452, 1994 、この文献では 1力月程度しか調査していない。 ) 。

発明の開示

本発明の目的は、バレイショ塊茎中で、低温下において遺伝子発現が锈導されるが、塊荃以外の他の器官及び常温下においてはほとんど锈導されず、かつ、発現が 5力月以上の長期にわたつて持続する、新規な低温誘導性プロモーターを提供することである。

さらに本発明は、バレイショもしくは他の植物中に存在する新たな低温誘導性プロモータを見いだすためのプローブとして有用な D N A断片を提供することも目的とするものである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、バレイショ塊茎中で、低温下において遺伝子発現が誘導されるが、塊茎以外の他の器官及び常温下においてはほとんど誘導されず、かつ、発現が 5力月以上の長期にわたって持続する、新規な低温誘導性プロモーター配列を見出し、かつ、その塩基配列を決定することに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号 1で表される塩基配列のうち、第 1番目〜第 3 5 4 6番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又はこれらの配列のうち 1又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に 1又は複数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された，低温誘導性プロモータ一活性を有する D N A配列を提供する。

また、本発明は、配列表の配列番号 2で表される配列のうち、第 1番目〜第 4 1 2 0番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又はこれらの配列のうち 1又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に 1又は複数のヌクレオチドが揷入若しくは付加された、低温誘導性プロモーター活性を有する D N A配列を提供する。

本発明により、バレイショ塊荃中で、低温下において遺伝子発現が誘導されるが、塊茎以外の他の器官及び常温下においてはほとんど誘導されず、かつ、発現が 5力月以上の長期にわたつて持続する、新規な低温誘導性プロモータ一配列が提供された。本発明のプロモーター配列を利用することにより、低温貯蔵中のバレイショ塊茎中の還元糖量の抑制、バレイショ塊茎の発芽抑制及び植物への低温耐性の付与等が可能になる。

図面の簡単な説明

図 1は、 L C I P 2— 1 0プロモータ導入のためのコンストラクト作製手順を示した説明図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の低温誘導性プロモーター配列は、配列表の配列番号 1で示される塩基配列のうち、第 1番目〜第 3 5 4 6番目の塩基から成る配列、又は配列番号 2で示される塩基配列のうち第 1番目〜第 4 1 2 0番目の塩基から成る配列中に含まれる。これらの配列は、その全体でも低温誘導性プロモーター活性を発揮するが、これらの配列中の一部であっても低温 SI導性プロモーター活性を発揮するもの、例えば、配列表の配列番号 1に示される塩基配列のうち、第 2 4 1 8番目〜第 3 5 4 1番目の塩基から成る配列等は本発明の範囲に含まれる。また、この配列番号 1の配列中の第 2 4 1 8番目〜第 3 5 4 1番目の塩基からなる配列を含む配列であって低温誘導性プロモータ活性を有するものも本発明の範囲に含まれるものである。

なお、配列表の配列番号 1の第 3 5 4 7番目〜第 3 5 4 9番目、又は配列番号 2の第 4 1 2 1番目〜 4 1 2 3番目の「A T G J は翻訳開始コドンである。また、配列番号 1で示される配列の第 3 5 0 3番目以降の m R N A ( c D N A ) 配列が、これがコードする推定ァミノ酸配列と共に配列番号 3に示されている。

本明細書において、「低温誘導性」とは、プロモーターによる遺伝子の発現が 6 °C以下の温度において誘導され、かつ、温度を 6 °C以下に維持すれば、その発現が 5力月以上持続することを意味する。

一般に、生理活性を有する D N Aの塩基配列が小さく変更された場合、すなわち、該塩基配列の中の 1又は複数のヌクレオチドが置換され若しくは欠失し又は 1又は複数のヌクレオチドが付加若しくは挿入された場合でも、該 D N Aの生理活性が維持される場合があることは周知の事実である。従って、上記した本発明の低温誘導性プロモーター配列にこのような修飾が加えられ、かつ、低温誘導性プロモーター活性を有する D N A配列も本発明の範囲内に含まれる。すなわち、配列表の配列番号 1で表される塩基配列のうち、第 1番目〜第 3 5 4 6番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部に加え、これらの配列のうち少数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に少数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、低温锈導性プロモーター活性を有する D N A配列も本発明の範囲に含まれる。また、この配列の一部である第 2 4 1 7番目〜第 3 5 4 1番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部に加え、これらの配列のうち少数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に少数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、低温誘導性プロモーター活性を有する D N A配列も本発明の範囲に含まれる。

同様に、配列表の配列番号 2で表される塩基列のうち、第 1番目〜第 4 1 2 0番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部に加え、これらの配列のうち少数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に少数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、低温铳導性プロモータ一活性を有する D N A配列も本発明の範囲に含まれる。

ヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換は、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20， p6487-6500, 1982) により実施することができ、本明細書において「1又は複数のヌクレオチド」とは、部位特異的変異誘発法により付加、挿入、欠失又は S換できる程度の数のヌクレオチドを意味する。

部位特異的変異誘発は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は変異を受けるべき一本鎖ファージ D N Aに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて次のように行うことができる。すなわち、プライマーとして上記合成ォリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖 D N Aでファージ担持性宿主細菌を形質耘換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には、 5 0 0/0の新コロニーが単鎖として変異を有するファージを含有し、残りの 5 0 %が元の配列を有する。得られたプラークを、上記所望の変異を有する D N Aと完全に一致するものとはハイブリッド形成するが、もとの鎖を有する不一致のものとはハイブリツド形成しない温度において、キナーゼ処理された合成プローブとハイブリッド形成せしめる。次に該プローブとハイブリド形成するプラークを拾い、培養し、 D N Aを回収する。

なお、プロモーター配列に、低温誘導性プロモーター活性を喪失せしめない 1 又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、付加又は挿入の方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遗伝子を変異原で処理する方法及び遺伝子を選択的に闋裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、又は置換し、次いで連結する方法もある。

下 K実施例において詳述するように、配列番号 1及び 2に示される塩基配列は、次のような過程を踏んで決定されたものである。

(1) 長期間 4 °Cで保存した塊茎由来の c D N Aライブラリーを作製し、生育中の種々のバレイショ組織（葉、茎、根、カルス、生育中の塊茎）の m R N Aとハイブリせず（厳密ではない）、低温貯蔵中の塊茎 m R N Aとハイプリする c D N Aクローンを単離し、埴基配列を決定および解析した。

(2) 上記（1) で使用した RN Aを用いてノーザン分析を行い、通常条件下で生育中のバレイショ植物体では殆ど発現が認められないことを再度確 |gした。

(3) 収穫後の塊茎を様々な温度（3、 6、 9, 1 2. 1 5、 20°C) で長期（ 5〜6力月程度）貯蔵し、これらの塊茎から抽出した RN Αを用いて、低温で锈導されるか、どの温度以下にすれば誘導されるか、どれくらいの期間発現しているか、低温から常温に戻すことにより発現が解除されるか等をノーザン法によりチェックした。その結果、 6°C以下の低温で誘導され、発現は長期（少なくとも 5— 6力月）持続し、低温から常温に戻すことにより発現が解除されること等を確認した。

(4) 低温下で塊茎以外の組織にも発現が誘導されるかどうかをバレイショ in vitro 植物体を用いてチ Iックした。その結果、誘導は塊茎以外でも起こる可能性があるが、殆ど問趣にならないレベルと思われた（低温処理塊茎に比べ著しく変化が少ない）。

(5) サザン分析により、シングルコピー遺伝子であることを確認した。また、イネ、トウモロコシ、タバコ等ではバンドが検出されず、他植物としてはトマトに検出された。

(6) ゲノムクローンを 2種単離した。 1つは開始 A TG前後の配列が c D N A 配列と完全に一致する。もう一つは完全には一致しないが、高い相同性を有し、同じ機能を有する別の座位（locus ) の遺伝子をコードするものと考えられた。逆転写 P C Rにより解析した結果、 2種の遗伝子の発現パターンは殆ど同じと考えられた。

(7) ゲノムクローンの AT G上流域の塩基配列解析の結果、低温誘導性蛋白質でよく見受けられる ABA耪導（反応）モチーフは発見されず、 GA反応モチーフが何れのクローンにも見受けられた。単離した 2種のゲノムクローンは、 AT G上流約 500 b pまではお互いに高い相同性（80.3% ) を有していたが、その上流では裹ぃ相同性を示す領域は見い出せなかった。

(8) 単離したゲノムクローン 2種のうち 1種のプロモーター配列の一部をルシフェラーゼ遗伝子（Science 234: 856-859, 1986) をレポーターとしてバレイショに導入した。得られた形質転換体よリ作出したマイクロチューバ一の低温貯截試験を行い、プロモーターの低温誘導性を確認した。また、形質転換体の葉においてもわずかながら低温誘導性が見いだされた。

本発明のプロモーター配列は、（1) ~ (8) の過程からなる、下記実施例において詳述する方法により得ることができる。また、本発明により、該プロモーター配列の塩基配列が明らかになつたので、該プロモーター配列を含む D N Αは、バレイショのゲノムを錶型とする P C R法等により容易に得ることができる。

配列番号 1ないし 2に記載されている配列は、公知のバレイショ塊荃由来の低温誘導性遺伝子とは相同性がない。従って、本発明のプロモーター配列は、公知のものとは異なるタイプの新規なプロモーター配列であると考えられる。

また、本発明の低温誘導性プロモーター配列は、常温（2 0 °C) で生育中の葉、根、茎、塊茎では遺伝子発現が非紫に弱い。収穫した塊茎を低温（6 °C以下）におくことにより発現が誘導される。低温処理により塊茎以外の器官（葉、茎、根 ) でも誘導されるが、わずかである。ただし、低温貯蔵した塊荃からの萌芽にはかなり誘導される。一方、既報（Plant Physiol. 104 : 445-452, 1994 ) では塊茎以外の器官についての発現までは言及していない。本発明の遺伝子は厳密な意味での低温貯蔵塊荃特異的遺伝子とはいえないが、それに近いものと考えられ、収穫後の品質維持等に効果的な遺伝子（プロモータ一）といえる。

本発明の低温誘導性プロモーター配列は、低温で遺伝子発現が誘導され、常温に戻すと発現が解除される。文献（Plant Physiol . 104 : 445-452, 1994) の分類によれば本遺伝子は、低温に対する反応が遅いグループに属するものと考えられる（低温処理 1週間程度では発現がブラ I -ーに達することはない。 van Berkel ら（Plant Physiol. 104 : 445-452, 1994) は、このグループに属する遗伝子の単離には成功していない）。従って、温度による発現制御が可能である。

本発明の低温锈導性プロモーター配列は、低温貯蔵時に長期間発現を誘導（少なくとも 5力月）する。一方、既報（Plant Physiol . 104 : 445 - 452, 1994 ) の遺伝子では確認されていない。本発明のプロモーター配列を用いることによリ長期の遺伝子制御が可能となる。

他の植物であるイネ、トウモロコシ、タバコには、本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子は見受けられなかった。トマトには存在する。従って、イネ、トウモ口コシ、タバコ等への遺伝子導入に本発明のプロモーターを使用することにより、ジーンサイレンシング（Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 88 : 1770-1774, 1991 ) の少ない遗伝子発現を行える可能性がある。

以上のことから、本発明の低温誘導性プロモーター配列は、下記の用途に用いることが可能である。

(i ) バレイショ低温貯蕨塊荃中の還元糖量の制御（還元糖量の抑制）

本発明のプロモーター配列の下流に、例えば酸性インベルターゼインヒビター (Oval le et al . , Plant Science 108 (1995) 133-141)遗伝子、液胞型酸性インベルターゼ（EMBL Data Library accession number X76946)アンチセンス遗伝子、 P F K (EC 2. 7. 1. 1 1 、国際公開番号： W095/05457) 遺伝子、スターチフォスフオリラーゼ (Brisson et al. , Plant Cell 1 ( 1989) 559-566 ; Mori et al. , J. Bioc em 266 ( 1991 ) 18446-18453, Sonnwald et al. Plant Mol. Biol. 27 (19 95) 567-576)アンチセンス遺伝子、 /S—あるいは α—アミラーゼ（Kreiberg and Gaushi ng, 12th Triennial Conerence of the European Assoc i at ion for Potato Research, Abstracts (1993) 334- 335)アンチセンス遗伝子、 A D Pグルコースピロフォスフオリラーゼ（Stark et al. , Science 258 (1992) 287-292) 遗伝子等を連結することにより、バレイショ塊茎を低温貯蔵した場合の塊茎中の還元糖量を抑制することができる。これにより、フレンチフライやポテトフライに加工した時の着色が防止できる。

(i i〉バレイショ塊茎の発芽抑制

本発明のプロモーターは、低温で発現を誘導し、常温に戻すと発現をストップする性質を有する。従って、例えば酵母インベルターゼ遗伝子（Sonnewald et al. Plant J. 1 (1991) 95 - 100) 、大 8¾菌 inorganic pyrophosphatase is伝子 (Sonne ald, Plant J. 2 (1992) 571-581 ; Jel i tto et al. Planta 188 (1992) 238-244) 、 ent-kaurene synthetase (ジベレリン生合成系遗伝子、 Sun et al. Plant Cel l 4 ( 1992) 119-128) アンチセンス '遣伝子等を速結し、ノくレイショ、タマネギ等の植物に導入することにより、低温下で遺伝子発現（発芽しない）、常温下で発現解除（発芽する）といった生育制御を行うことが可能である。 (i i i ) 植物への低温耐性の付与

低温下で、例えばグリセロール一 3—リン酸ァシルトランスフ：∑：ラーゼ

(Murata et al. Nature 356 (1992) 710- 718)遺伝子、 Flaveria browni i由来の Pyruvate, orthophosphate dikinase (PPDK, Usami et al. Plant Mol. Biol. 27 ( 1995) 969-980) 遺伝子等の発現により植物に低温耐性を付加することが可能である。

次に、本発明の他の側面である低温誘導性プロモーター検索用プローブについて説明する。

本発明のプローブは、配列表の配列番号 3記戴の配列のうち、第 4 5番目〜第 8 3 9番目の塩基配列中、もしくはそれらに相補的な塩基配列中の少なくとも連続する 1 5塩基の配列を有する D N A断片よりなるものである。上述した配列番号 3中の第 4 5番目〜第 8 3 9番目までの配列もしくはこの配列と相同性の高い配列は、低温誘導性プロモータ配列の下流に存在する可能性が高い。したがって、この配列もしくはその一部の配列をプローブとして用いて植物ゲノム D N Aを検索することにより、バレイショもしくは他の植物中に存在する新たな低温誘導性プロモータを見いだすことが可能となる。

プローブは、上記配列に基づいて設計されるものであり、その長さは少なくとも連続する 1 5塩基以上であることが好ましいが、 1 5塩基以上であれば上記配列の全長までのいずれの長さであってもよい。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよいが少な〈とも使用時には一本鎖となる。さらに、上述した配列から選定された D N A断片プローブを、上記配列もしくはこれと相同性の高い配列に対し特異的にハイブリダィズする性質を失わないように塩基の付加、欠失、挿入もしくは鴛換した配列も本発明に含まれる。なお、この塩基配列の付加、欠失、挿入もしくは置換の方法は、上述した本発明の低温誘導性プロモーターで用いる方法と同様な方法で行なうことが可能である。

本発明のプローブは、後述する実施例で詳述する方法により得られる配列表の配列番号 3に記載の D N A断片を、適当な制限酵素によって切断することにより調製できる。また、この配列を含む試料を用いて P C R反応を行なうことによつて、調製することも可能である。あるいは、市販の D N A合成機（例えば、パーキンエルマ一社製）によリ惯用された方法により、プローブとなる一本鎖 DN A を合成することも可能である。

本発明のプローブは慣用された方法により、例えば、放射線同位元素、検出可能な酵素等によリ檷識できる。例えば³² Pを用いる場合、一般に配列表 3記載の DN A断片を用いる場合は、ランダムプライミングラベルによリ棵 ¾し、また、合成プライマーを使用する場合はリン酸化酵素によリ 5 ' 末端檁識すると都合がよい。

本発明のプローブを用いる際のハイブリダィゼーシヨンは、憤用された方法により行なうことができる。一般には、中程度のハイブリダィゼーシヨン強度（4 2°C〜50°Cでハイブリダィゼーシヨンを行い、 0.1 x S SCで洗浄）によって行なう。

本発明のプローブを対象植物のゲノムライブラリ一に対して用い、ハイブリダィゼーションが検出された場合は、この遺伝子の上流域を特定することによリ新たな低温锈導性プロモーターを得ることができる。

実施例

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1 ディファレンシャルスクリーニング（上記（1)の過程）

7ヶ月 4°Cで貯蔵したバレイショ塊茎（品種卜ヨシ口）より全 RNA を SD S Zフエノール法により抽出し、 Dynabeads (Dynal 社）により polyA⁺RNA を精製した。これを材料として cDNAを合成し、 A gUOベクターに連結、ライブラリ一 ¾:作製した (Amersham λ gtlO cloning kit, Amersham Japan) 。ラづブラリ一の作製に使用した polyA⁺RNAおよび肥大中の塊茎よリ抽出した polyA+RNAを ³² Pによリ摞識し、ディファレンシャルスクリーニングを行った。

ハイブリダィゼーシヨン、洗浄等は文献（Proc. Natl. Acad. Scに USA 81 :19 91-1995, 1984) の方法により行い、上記 2種のプローブにより得られたオートラジオグラフを比較した。貯蔵中にシグナルが增大すると思われる c DNAクローンは、つまようじでプレーティングし直した後、再度ハイブリダィゼーシヨンを行った。得られた才ートラジオグラフのシグナルをデンシトメ一ターにより測定し、シグナルの増大の著しいものをまず選抜し、さらに、塊茎以外の器官（葉，茎、根、カルス）の mRNAと強くハイブリダィズしないクローン（CIP353) を単離した。

実施例 2 ノーザンブロット分析（上記 (2)および (3)の過程）

種々のバレイショ組織（品種トヨシ口の塊茎、葉、茎、根および品種ケネベックの培養細胞）より総 RNA を SDS -フ 1ノール法にて抽出し、グリオキサールゲノレ電 ;水動 (Molecular cloning: A Laboratory Manual /Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) により分離後 (3 μ g/lane) 、 Gene-screen Plus膜（Du Pont 社）に転写した。プローブとしては、マルチプライム摞識 (Molecular cloning: A Laboratory Manual /Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 ) した cDNA (CIP353) の EcoRI 断片（完全長）を用いた。膜への転写、ハイブリダィゼーシヨン、洗浄等は Gene-screen 膜に添付のマニュアル（Du Pont 社）通りに行った。結果を表 1から表 3にまとめる。表 1 バレイショ諸器官あるいは懸濁細胞における mR N Aの発現状況

器官 mRNAレベル葉 *1

蓥 *1 土

根 *1

懸濁細胞 *2

肥大中の塊荃

7力月低温 + + + + +

貯蔵した塊茎

*1培養苗に由来するもの

*2品種ケネベック。他は品種トヨシロを使用表 2 貯蔵（短期）塊茎における mRN Aの発現状況貯蔵期間 2週閲 4週間 2力月 3力月

20°C 土

1 5°C 土 ±

1 2。C 土 ± ±

9°C ± ± +

6°C + + + + + (+) + ( + )

3°C + (+) + + + + + + ( + )

6°C2力月貯蔵後 20°C1週間貯蔵

6°C2力月貯蔵後 20°C2週間貯蔵

6°C2力月貯蔵後 20°C4週間貯蔵

表 3 貯蕨（長期）塊茎における mRN Aの発現状況

貯蕨期間 3力月 5力月 6力月

20。C

6。C + (+) + (+)

3°C + + + + + + + + + + + + +

3°C5力月貯蔵後 20°C1力月貯蔵

6°C5力月貯蔵後 20°C1力月貯蔵

20°C5力月貯蔵後 3°C1力月貯蔵

20°C5力月貯蔵後 6°C1力月貯蔵 + ( + )

20°C 5力月貯蔵した塊茎より生じた萌芽

6 5力月貯蔵した塊荃ょリ生じた萌芽 + (+) 表より明らかなように、通常育成中のバレイショの塊茎、葉、茎、根および培養細胞では上記プローブはほとんどハイブリダィズしなかった。また、種々の温度で 5〜 6力月間貯蔵したバレイショ塊茎では、 6 °C以下で貯截したものについて明らかなハイブリダィゼーシヨンが認められたが、 9 °C以上で貯蔵したものについてはほとんど認められなかった。

実施例 3 組織特異性の確認（上記 (4) の過程）

Linsmaier and Skoog (Physiol. Plant, 18:100-127， 1965)の寒天培地上で、 20。C、 3000 I u x. 1 6時間日長の下、 3— 4週間培養した無菌シュートを材料に用いた。これらを 3°Cあるいは 20°C下におき、 1 6時間日長、 300 0 I u xで 4週間培養し、培養後 0、 2、 4週間後にサンプリング（葉、茎、根に分ける）、 RN Aを抽出した。ノーザン分析は上記と同様に行った。結果を表 4および表 5にまとめる。

表 4 貯蔵処理（20°C) した諸器官における mRN Aの発現状況

貯蔵期間未貯蔵 2週間 4週間葉 *1 一一（土）

茎 *1 一一（土）

根 *1 (土） ± ±

*1培養苗に由来するもの表 5 貯蔵処理（3°C) した諸器官における mRN Aの発現状況

貯蔵期間未貯蔵 2週閣 4週間葉 *1 一土 ±

茎 *1 一土 +

根 *1 (土）土土

*1培養苗に由来するもの

表から明らかなように、 3°Cで保存した、葉、茎及び根では、ハイブリダィゼーシヨンは僅かに認められるものの、同温度で保存した塊茎に比べればはるかに少なかった„ 実施例 4 サザンブロット分析（上記 (5) の過程）

DNAは、バレイショ品種卜ヨシ口、卜マト品種ハウスおどりこ、タバコ品種 F 1 04、トウモロコシ品種 A 1 88、イネ品種朝の光等の若い葉からホットフェノール法により調製した。各品種より抽出した DNA (l Oju g) は、制限酵素 EcoRI あるいは Hindlll で消化（バレイショゲノム中のコピー数検定においては、他に、 BamHI、 Bgl II、 EcoR V、 Xba I を使用した。制限酵素は全て Taka ra社のものを使用。）、ァガロースゲル電気泳動を行い、 Hybond N⁺ 膜（Amers ham Japan; に $κ¾·した (Molecular cloning: A Laboratory Manual /Second Edi tion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 。マルチプライム標識 (Molecul ar cloning: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor

Laboratory, 1989) した cDNA (CIP353) の EcoRI 断片（完全長）をプローブとし、実施例 1 と同様にハイブリダィゼーシヨンを行った。

その結果、該遗伝子はシングルコピー遗伝子であることが確認された。また、イネ、トウモロコシ、タバコではバンドが検出されず、トマトでは検出された。実施例 5 ゲノミッククローンの単離（上記 (6)の過程）

バレイショ品種卜ヨシ口の若葉よリ D N Aをホットフエノール法によリ抽出し、 100 μ gの D N Aを 0.0078あるいは 0.0156unitの制限酵素 Sau3AI(Takara社 ) で 1時間部分消化した（反応 bufferは Takara社添付のものを使用）。反応は終濃度 40mMの EDTAで停止させ、フ ιノール/クロ口ホルム抽出、エタノール沈澱後、 150 μ 1 の ΤΕに消化した DNAを溶解させた。 DNAは、 65°Cで"！ 0分間処理後、 1 0〜40%ショ糖密度勾配（20mM Tris, pH8.0， ImM EDTA, 200mM NaClからなる bufferに終濃度 40, 32.5, 25， 17.5, 10% のショ糖を溶かしたものを順次積んで作製）に重 ISした。 Hitachi SRP28SA ローターを使用し、 20,000 rpm、 20°Cで 1 7時間以上逸心分離後、 0.5ml ずつ分画し、 0.5%ァガロースゲルで分析した。 15kb以上の断片を含む分画は一つにまとめた後、エタノール沈澱により濃縮し、そのうち 0.4 ； u g を λ DASHIl/BamHKStratagene 社） 1 i g とライゲーシヨンさせ、 Gigapackll Gold (Stratagene 社）を用いてパッケージングした。ライゲージヨン、パッケージング反応は Stratagene社添付のプロトコ一ル通リに行った。約 80万クローンをマルチプライム棵識 (Molecular clonin g: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 19 89 ) した cDNA(CIP353)EcoR I断片をプローブとして実施例 1 と同様にスクリーニングし、 2個の (¾性クローンを得た（LCIP2- 10および LCIP1-2 ) 。ファージからの DN A抽出、プラスミドベクターへのサブクローニングは、文献（Molecu lar cloning: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) に記載の通りに行った。

実施例 6 逆耘写 PCR分析（上記 (6)の過程）

2種類のゲノムクローンの DN A配列解析の結果、 ATG上流、非翻訳領域中に数塩基の違いが見いだされた。そこで、この領域の配列を含む合成オリゴヌクレオチド 12S (5' -GAAAAAGGAAATAAAAA-3' , LCIP卜 2由来の niRNAに特異的， Tm=4 3 °C) および 210S (5' -G AAAAAATTAAGAGTAAC-3 ' , LCIP2-10由来の mRNAに特異的， Tm=45 °C) を作製、 cDNAの内部配列に由来する 3'側のアンチセンス鎖プライマ一， 325aR (2種の mRNAに共通に使用、 5' - ATCACTAGCAACGGGCAT- 3' , Tm=54 °C ) と共に逆転写 PCRを行った。

逆転写 PCRの材料としては、バレイショ品種トヨシ口の各組織由来の総 RN A 10 g を用い、 oligo-dT 500ngと混合後（水を加え、全量 55 1 とする）、 70°Cで 10分間処理した。これに反応液（5xlst. strand buffer (BRL 社） 20 1, 10mM dNTPs ο μ I, lOOmM DTT 10 μ 1, R ase inhibitor (Pharmacia社） 5 μ 1， Superscript RTase (BRL 社） 5 1 ) を混ぜ（総量 100 1 ) 、 37°C で 1時間反応後、 95°C、 5分間熱処理し、逆耘写 PCRの錶型 1本鎖 cDNAとした（この溶液中の cDNA濃度は lOOng/ 】と仮定）。

合成された cDNA 1- lOOngを錶型として PC R反応（cDNA 1-lOOng, Primer 10 pmolx2, 2.5tnM dNTPs 1.6 μ 1, lOxPCR buffer (Takara社) 2 ^ 1, rTaq (Taka ra 社） 0.2 1,総量 20 1 ) を行った。上記 12S および 325aR プライマー使用時の反応条件は、 94°C 30秒、 45°C 30秒、 72°C 60秒、 30サィクルとし、 210Sおよび 325aR プライマー使用時には、 94。C 30秒、 47 °C 30秒、 72°C60秒、 30サイクルとした。 P C R産物はァガロースゲル髦気泳動により分析した。結果を表 6にまとめる。（表 6) 表中のし C I P 2 - 1 0は後述する配列表の配列番号 1に記載の配列に対応し、 LC I P 1— 2は配列番号 2に対応する。表から明らかなように、いずれのゲノムクローン由来の mRNAにおいても、低温長期間貯蔵した塊茎のみ顕著な発現がみとめられた。これより、配列番号 1および 2の両配列共、低温锈導性プロモータ活性を有することがわかる。

表 6 RT— PC Rによる 2種のゲノムクローン由来の mRNAの発現状況

L C I P 2 - 1 0 L C I P 1 -2 mRNA mRNA

20°C4週貯蔵した葉 *1 (土）

20°C4週間貯蔵した茎 *1 (土）

20°〇4週間貯蔵した根*1 (土） (±) 3 4週間貯蔵した葉 *1 (土） 3 4週間貯蔵した茎*1 + (土） 3°〇4週間貯蔵した根*1 (土）

20°C5力月貯蔵した

塊茎より生じた萌芽 + +

6°C5力月貯蔵した

塊茎より生じた萌芽 + ( + ) + 肥大中の塊茎 (土）

収穫直後の成熟塊茎一

20°C5力月貯蔵した（成熟）塊荃 ―

3°C 5力月貯蔵した塊茎 ++( + ) *1培養苗に由来するもの

実施例 7 DN A塩基配列の決定、解析（上記（1) 、 (7) の過程）

シークェンス反応、配列の決定は、プラスミド DNA を錶型としたジデォキシ法 (ABI 社， Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) および DNA シ一ケンサ一（ABI 社， 373A) により行った。配列の解析は、 GENETYX (ソフトゥ Iァ開発株式会社）ソフトを介して行った。

その結果、上記 2つのゲノムクローンのうちの 1つから、配列番号 1に示す配列が、また他方のクローンから配列番号 2に示す配列が得られた。また、上記の c DNAクローン（CIP353) から配列番号 3に示す配列が得られた。

実施例 8 形質耘換用べクタ一の作製および形質転換法によるプロモーターの低温誘導性の確認（上記 (8) の過程）

ゲノムクローン LCIP2- 10を制限酵素 Asp718 (ベーリンガー社）で消化し、開始 ATG上流域約 200bpを含む Asp718断片を pUC19 プラスミドに導入し、組み換えプラスミド P210A8を得た。次にこのプラスミド（p210A8) を錶型とし、 M13 プライマー RV (Takara社）および 210Aプライマー（5' - GTTACTCTTAATTTTTTC-3' ) を用いて PCR (94°C20秒、 55°C30秒、 72°C60秒、 25サイクル ) を行った。増幅産物を ΤΛクローニングベクター（Invitrogen社）にサブクロ一二ングし、開始 ATG 上流約 200bp 領域のみ含むベクター、 p210Pro(200)を作製した。このプラスミドより制限酵素 Hindlll, Xhol (Takara社）消化により開始 ATG 上流域約 200bp を含む断片を単離し、 pHSG399 (Takara社）の Hindll I， Sail サイトに揷入、プラスミド pHSG210 (200) を得た。このプラスミドを H indlll, BamHI (Takara社）消化し、単離された ATG 上流域 200bp 断片を、 pBI 101ベクター（Clontecti社）のベータグルクロニダ一ゼ遗伝子を BamHI, Sad サイトを利用してルシフ Iラーゼ遗伝子（Science 234: 856-859， 1986) に置換したベクター（pLUClOl) の 5 ' 上流域へ Hindlll, BamHIサイトを利用して挿入、 PLUC210 (200)を得た。他方、ゲノムクローン LCIP2- 10由来の開始 ATG 上流域約 lOOObpを含む Xbal (Takara社）消化断片を導入した pUC18 ベクター（p210X 1) を作製し、このベクターから制限酵素 Asp718消化により単離した 800bp 断片（ATG 上流約- 200〜- lOOObpの領域）を pLUC210(200)の Asp718サイトに揷入し、約 lkb のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子を連結した形質転換用べクター、 pLUC210(1000) を作製した。形 K転換用ベクター（pLUClOl および pLUC2 10(1000) ) は三系交雑法（植物遗伝子操作マニュアル、講談社、 1990) により、細菌 Agrobacterium tumefaciens LBA440 に導入し、植物の形質換に使用しバレイショの形質転換は、文献（特開平 6— "！ 33783) に準じて行った。材料として Linsmaier t Skoog (Physiol. Plant. 18: 100-127, 1965) の寒天培地で無菌増殖した品種卜ヨシ口の葉および茎を供試した。これらの組織は、適当な大きさに切断し、 Agrobacterium 菌液中で 2日間共存培養後、インドール舴酸 0. lmg/1 、ゼァチンリボシド 1.0mg/l 、カナマイシン 100mg/l 、セフオタキシム 250mg/l を含む Linsmaier と Skoog (Physiol. Plant. 18: 100-127, 19 65) の寒天培地上に S床した。 20°C、 16時間日長下で培養後、細分化した植物体はカナマイシン 100mg/l を含む Linsmaier と Skoog (Physiol. Plant. 18: 1 00-127, 1965) の寒天培地上で継代増殖した。

増殖した形 K転換体は、単節ごとに切り出し、 Linsmaier と Skoog (Physiol. Plant. 18: 100-127, 1965) の液体培地上で 3〜 4週間培養し（20°C、 16時間日長）、その後培地をショ糖 80g/l を含む Linsmaier と Skoog (Physiol. Plan t. 18: 100-127, 1965) の液体培地に交換し、 20°C、暗黒下で 4一 5週間以上培養した。形成したマイクロチューバ一は、水洗、水切り後、シャーレに入れて、暗黒下、 20°Cあるいは 4 。(：で貯載した。 Linsmaier と Skoog (Physiol. Plant. 18: 100-127, 1965) の寒天培地で育成中の植物体も、暗黒下、 20°Cあるいは 4 °Cの貯蔵轼験に供試した。

ルシフ Xラーゼ活性測定は、文献（Science 234: 856-859. 1986) に準じて行つた。生重あたり 3— 1 0倍量の抽出緩衝液（lOOmM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5)、 1mM ジチオスレィ卜ール）を加え、磨砕後、遠心（15000rpm， 5min) し、上清を粗抽出液とした。粗抽出液 50 I と活性測定用緩衝液（36mMグリシルグリシン緩衝液（pH7.8). 1mg/ml牛血淸アルブミン， 20mM塩化マグネシウム. 12m ATP) 100 μ I を混合後、 0.4mM ルシフェリンを 100 μ I 添加し、ルミノメ一ター（モデル 6100、パッカード社）でルシフヱラーゼ活性を測定した。結果を表 7および表 8にまとめる。ベレイショ形質耘換体の葉におけるルシフ 1ラーゼ活性系統形質転換に用い貯蔵条件ルシフ Xラーゼ活性

コンス卜ラク卜 (cps/mg protein)

LUC1000-1-1 PLUC210 (1000) 未貯蔵 25900 LUC1000-1-1 PLUC210 (1000) 4 °C、 4 週間 36000

表 8 バレイショ形質転換体のマイクロチューバ一におけるルシフェラーゼ活性系統形質転換に用い貯蔵条件ルシフ: Lラーゼ活性

コンス卜ラク卜 cps/tng protein)

LUC101-2-1 PLUC101* 未貯蔵 217

LUC101-2-1 PLUC101* 20°C、 4 週間 166

LUC101-2-1 PLUC101* 4 °C、 4 週間 245

LUC1000-1-1 PLUC210 (1000) 未貯蔵 78200

LUC1000-1-1 PLUC210 (1000) 20°C、 4 週間 23800

LUC1000-1-1 PLUC210 (1000) 4 。C、 4 週間 149000

*:プロモーター欠損コンストラクト。対照。

表より明らかなように、低温 (4°C) で 4週間貯蔵したマイクロチューバにおいて、顕著な活性上昇が観察された。また、活性はマイクロチューバに劣るものの、葉においても低温下での活性上昇がわずかに認められた。従って、配列番号 1記載の配列の内、第 241 8番目〜第 3541番目の塩基から成る D N A配列（プ口モーター断片）は、低温下で遺伝子発現を誘導する作用を有することが明らかとなった。配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 3 6 0 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ゲノム D N A

起源：

生物名：バレイショ (So l anum tuberosum L. )

品種：トヨシロ

直接の起源：

ライブラリ一名：緑葉ゲノム D N A由来 λ D A S H I I ゲノム D N Aライブラリー

配列の特徴：

配列

GATCTATGAT ATTCCTTTAT CAAATTTTAG ACTAAGGAA6 GATTAATGAT AAGTTTTGAA 60 TATTTGTTTC CAAGATAAAT TAAAGTTAAC AA6TCTTATC ATTGGATTCT TAAAGAAGAT 120 TTTTATAATG TTGCATCACT TGTTACGATT GACCTAAAAA TTGTTGTGTA CTATTTTGAT 180 TTATTGAGAA AACGAATCAT TGTTGTATAG GGTAAAAATG GGTT6GACAT CACTACTAAA 240 AATAAT6GAA AAATCGACGA ATAAGGTGAG TCTAAAAATT GACAATGTTC ATCGATTTTT 300 TTTCATGCAA AAATTATAAT TTCTTAATTT TTTTTTTTTT AAATGATACA GTTCCTTGGT 360 TTCAATTAAT TCCATACAAA ATT6ACGAAC ATGATCAGTT CCCGGAGTGT AAACCTACAG 420 TT6AATATTA TAAATAAAAA CGAT6AAATA TTTTATGAGA ACATGTATGG ATCGAGTGGT 480 AGAATTTTCC AAATTCCTAA AAAATACTTG GATTCACTTC CAAATAGGTA CATTCTATAG 540 6TATATTTTT T6AAAAAACG ATGACACTAT CAATAGCTAA GTGAATATTA ATGTTGTTTT 600 AACAAAGCAC 6ATATTGCTA TAACAATTTT TTTTTTTTGG TCAAAATAAA TTCAAATGTA 660 CCATTTTCAT GGTAAACACA ATATTGCCAT AACAATTTGT TTTTAATAAA C6AGATTGTT 720 ATCAAGAAAT TTTAGTTA6C GATATAAACG TGACCATGCT ACATTTTTTT TTTAACCTTT 780 GAACTTTAAT TTATCAACTT CAAGTTAAAA GTGAGTGAAT TCTTTTGAGT TCTAGAGTTT 840 0893 V11VVV1VV1 IDOIIVVOIV IVVVIDIVVV OlOlllVOOI VV09100V1V V1V1VVV19V

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配列の長さ： 4 1 4 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ゲノム D N A

起源：

玍物：ノくレインョ (So l anum tuberosum L.リ

品種：トヨシロ

直接の起源：

ライブラリ一名：綠葉ゲノム D N A由来 λ D A S H I Iゲノム D N Aラ 5ζλ OAV

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配列の長さ： 1 1 3 2

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源：

玍物名：バレインョ (So l anum tuberosum L.；

品種：トヨシロ

直接の起源：

ライブラリ一名：低温貯蔵塊茎 m R N A由来 λ g t l O c D N Aライブラリー

配列の特徴：

特徴を表す記号： C D S 存在位置： 45— 836

特徴を決定した方法：

配列

CTTTCACTCA AAAAAAAAAA GGAAAAAATT AAGAGTAACA AAAG ATG TGT GGA GGT 56

Met Cys Gly Gly

1

GCC ATA ATC TCC GAT TAT GAG CCC GCC GGA AAC TTC TAC CGG AAA CTC 104 Ala l ie Me Ser Asp Tyr Glu Pro Ala Gly Asn Phe Tyr Arg Lys Leu

5 10 15 20

TCT GCT CGT GAC CTG TGG GCT GAG CTG GAC CCT ATC TCC GAC TAC TGG 152 Ser Ala Arg Asp Leu Trp Ala Glu Leu Asp Pro l ie Ser Asp Tyr Trp

25 30 35

TCC TCT TCC TCC TCA TCC TCA ACT GTC GAA AAC CCT TAT TCC GCT CAG 200 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Val Glu Asn Pro Tyr Ser Ala Gin

40 45 50

TCG CCG GTG ACT CAC TCC GTC GAT AAG CCT AAG AAA TCA GAT TCC GGC 248 Ser Pro Val Thr His Ser Val Asp Lys Pro Lys Lys Ser Asp Ser Gly

55 60 65

AAA TCT AAT CAA CTC AAA AAA GGT AAT AAG ACT GTG AAG GTT GAG AAG 296 Lys Ser Asn Gin Leu Lys Lys Gly Asn Lys Thr Val Lys Val Glu Lys

70 75 80

GAG AAQ AGT ACT GGA CCA AGG CAG AGA AAG AAC AAG TAC AGA GGA ATA 344 Glu Lys Ser Thr Gly Pro Arg Gin Arg Lys Asn Lys Tyr Arg Gly l ie

85 90 95 100

AGG CAG AGA CCA TGG GGA AAA TGG GCT GCT GAG ATT CGC GAT CCT CAG 392 Arg Gin Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu I le Arg Asp Pro Gin

105 110 115

AAG GGT GTC CGT GTT TGG CTT GGT ACA TTC AAC ACA GCA GAG GAT GCT 440 Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Thr Ala Glu Asp Ala 120 125 130

GCC AGA GCC TAT GAT GAG GCT GCT AAG CGC ATT CGT GGT AAC AAG GCC 488 Ala Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Arg l ie Arg Gly Asn Lys Ala

135 140 145

AAA CTC AAC TTC CCT GCC CCA TCA CCA CCT GCT AAG CGA CAG TGC ACT 536 Lys Leu Asn Phe Pro Ala Pro Ser Pro Pro Ala Lys Arg Gin Cys Thr

150 155 160

AGC ACT GTC GCT GCT GAT CCT CCA CCA GCA CTA CTC CTT GAG AGT TCT 584 Ser Thr Val Ala Ala Asp Pro Pro Pro Ala Leu Leu Leu Glu Ser Ser 165 170 175 180

AAC ATA ATA TCT TAT AAC AAT TCT CCT TTA ATG AAC TTC GGA TAT GAT 632 Asn l ie l ie Ser Tyr Asn Asn Ser Pro Leu Met Asn Phe Gly Tyr Asp

185 190 195

GTT CAG AGC CAA ACT CCC TAC TAC CCA ATG GAA ATG CCC GTT GCT AGT 680 Val Gin Ser Gin Thr Pro Tyr Tyr Pro Met Glu Met Pro Val Ala Ser

200 205 210

GAT GAT TAT GAA CTC AAG GAA CAG ATT TCC AAC TTG GAA TCG TTC CTG 728 Asp Asp Tyr Glu Leu Lys Glu Gin I I e Ser Asn Leu Glu Ser Phe Leu

215 220 225

GAA TTG GAG CCA GCA GAT TCA TCT GAT CAG TTT TCA GGG ATC GTC GAT 776 Glu Leu Glu Pro Ala Asp Ser Ser Asp Gin Phe Ser Gly I le Val Asp

230 235 240

CCT GAT CCT CTT AAT GTT ITT CTG ATG GAG GAT TTT GCT TCA ACT CAG 824 Pro Asp Pro Leu Asn Val Phe Leu Met Glu Asp Phe Ala Ser Thr Gin

245 250 255 260

CAT CAG TTC TAT TGATCCTGAG TTGTTTGGTG AGTGATGAGT GACTAGTTTA 876 His Gin Phe Tyr

TTAGCTTTTG GCTGTAGTAG TAGTAATAGA GAAAAAAGTA CATATGATAT GATAATAATA 936 AGTTGCGK3C CTTAGCCTGC AATTGTAATA GTATCAATGT TTGTTGTCTT GTGTTGTTTA 996

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9 l VVVVVVVV1V VVVVVVVVVV VVVVVVVVVV VVVVVVVIOV IiViiiOViO VDDiViVlVi

9901 0VV1011V19 1V1D1D9111 V019D111D1 VVIVIIOOVI 11V091101V VlOlllODi

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Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 1で表される塩基配列のうち、第 1番目〜第 3 5 4 6番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又はこれらの配列のうち 1又は複数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に 1又は複数のヌクレオチドが揷入若しくは付加された、低温誘導性プロモーター活性を有する D N A配列。

2 . 配列表の配列番号 1で表される塩基配列のうち、第 1番目〜第 3 5 4 6番目の塩基から成る配列又は低温誘導性プロモーター活性を有するその一部から成る、請求項 1記載の D N A配列。

3 . 配列表の配列番号 1で表される塩基配列のうち、第 2 4 1 8番目〜第 3 5 4 1番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又はこれらの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に 1又は複数のヌクレオチドが挿入もしくは付加された、低温誘導性プロモーター活性を有する D N A配列。

4 . 配列表の配列番号 1で表される塩基配列のうち、第 2 4 1 8番目〜第 3 5 4 1番目の塩基から成る配列、またはこの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失し、置換しもしくはこの配列に 1又は複数のヌクレオチドが揷入もしくは付加された配列を含む低温誘導性プロモーター配列。

5 . 配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目〜第 4 1 2 0番目の塩基から成る配列若しくは低温誘導性プロモーター活性を有するその一部、又はこれらの配列のうち 1又は複数のヌクレオチドが欠失し、 a換し又はこれらの配列に 1又は複数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、低温誘導性プロモーター活性を有する D N A配列。

6 . 配列表の配列番号 2で表される塩基 E列のうち、第 1番目〜第 4 1 2 0番目の塩基から成る配列又は低温誘導性プロモーター活性を有するその一部から成る、請求項 5記載の D N A配列。

7 . 配列表の配列番号 3記載の配列のうち、第 4 5番目〜第 8 3 9番目の塩基配列中、もしくはそれらに相補的な塩基配列中の少なくとも連続する 1 5塩基の配列を有する D N A断片よりなる低温誘導性プロモータ検索用プローブ。