WO1995035106A1 - Composition inhibitrice de la croissance du virus vih - Google Patents

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WO1995035106A1
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benzylidene
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Mutsuyuki Kochi
Yoshio Ueno
Seiichi Tanuma
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Mutsuyuki Kochi
Yoshio Ueno
Seiichi Tanuma
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • composition for inhibiting HIV proliferation Composition for inhibiting HIV proliferation
  • the present invention relates to a human-derived compound comprising 5,6-0-benzylidene-lasconolevinic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Immunodeficiency syndrome virus hereinafter sometimes abbreviated as HIV
  • HIV Immunodeficiency syndrome virus
  • ie a composition for inhibiting the growth of AIDS virus, and HIV virus in HIV-infected human T cells
  • the present invention also relates to a method for inhibiting the replication of a virus particle.
  • AIDS Human acquired immunodeficiency syndrome or HIV
  • AIDS virus or HIV
  • Various anti-HIV active agents have been reported.
  • anti-HIV agents for example, AZT (azidothymidine), DDI (2 ', 3'-didoxinosine), IFN (interferon), and the anticancer drug alkylation Drugs or antimetabolites (see JP-A-1-38031) are known as anti-HIV agents.
  • the present inventors have conducted intensive studies in consideration of the above circumstances, and as a result, have found that 5, 6, 0—benzylidene L—asconolevinic acid (hereinafter simply referred to as benzylidene) (Sometimes referred to as denascorbic acid) or the fact that these pharmaceutically acceptable metal salts have low toxicity and high anti-HIV activity. Issued. The present invention has been completed based on this finding.
  • 5, 6, 0-benzylidene L-ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable product thereof contains an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt as an active ingredient, and is characterized by comprising a pharmaceutically acceptable carrier in the active ingredient.
  • a composition for inhibiting the growth of HIV is provided.
  • composition according to the present invention is useful for the medical treatment of AIDS, and is used as an active ingredient in the present composition.
  • Ascorbic acid or a salt thereof is a known compound.
  • 5, 6 — 0 — benzylidene L Ascorbic acid production method is described in “Steroids J Vol. 12, p. 309 (1968)”, and another production method is described. It is disclosed in Japanese Patent Publication No. 3-33127 and U.S. Patent No. 5,036,103.
  • 5, 6- ⁇ benzylidene-L-ascorbin is also disclosed.
  • the anticancer activity of an acid or a sodium salt, a potassium salt and a potassium salt thereof and a method for producing these salts are disclosed in Japanese Patent Publication No. 33127/1991. And US Patent No. 5.036,103. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • benzylidene-as-conolevic acid salts useful as an active ingredient in the composition for inhibiting HIV growth of the present invention include monosodium salts, There are sodium, mono-, di- and calcium salts.
  • 5, 6-0-benzylidene-L-ascoronolebinate sodium salt (abbreviation: SBA) is preferred.
  • S B A is given by the following equation (I)
  • the SBA synthesized by a conventional method is a racemic form of two stereoisomers, ($)-388 and (R) -SBA, and In the analysis by liquid high-speed chromatography, the (S) -form and the (R) -form are contained in a mixing ratio of 2: 1.
  • the benzylidene-ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof used as an active ingredient in the present invention has low toxicity as shown in the test examples described below. It also has anti-HIV activity.
  • the composition for inhibiting HIV proliferation of the present invention comprises a human immune cell. It is useful for the prophylactic treatment of HIV infection and the preventive or medical treatment of human acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • AIDS human acquired immunodeficiency syndrome
  • the anti-HIV composition of the present invention is used as the drug for the above purpose, the above-mentioned active ingredient compound is added to a pharmaceutically acceptable additive such as a carrier, an activator, a diluent and the like. It can be appropriately mixed with pharmaceutically necessary additives to prepare a pharmaceutical composition in the form of powder, granules, tablets, capsules, syrups, injections, external suppositories and the like.
  • the composition can be administered orally or parenterally to animals or humans.
  • the active ingredient compound used in the present invention is mixed in an effective amount to achieve the purpose of administration.
  • the dosage of the active ingredient varies depending on the administration route, symptoms, patient weight, gender, age, etc.For example, for an adult patient, about 100 to 3000 mg per day is presented. . However, in consideration of various situations such as the results of animal tests, the dose should be administered continuously or intermittently within a range where the drug blood concentration does not exceed a certain level due to drug administration. it can. Appropriate dosages and frequency of administration under certain conditions should be decided by the specialist based on the above guidelines.
  • the content of the active ingredient compound in the preparation of the anti-HIV composition of the present invention varies depending on the preparation type, but is usually 0.1 to 99% by weight, preferably 1 to 99% by weight. 90% by weight.
  • the above solid carrier It is used in the form of tablets, capsules, powders, granules, dry syrups, liquids, syrups, etc. together with the liquid carrier.
  • the content of the active ingredient compound is generally 3 to 99% by weight, preferably 5 to 90% by weight, and the balance is a carrier.
  • the anti-HIV composition according to the present invention comprises 5, 6-0-benzylidene-L-ascorbic acid monosodium salt as an active ingredient. It is preferred to contain 0.1 to 99% by weight based on the weight.
  • compositions and carriers are selected as excipients and carriers to be incorporated into the anti-HIV composition according to the present invention, and the type and composition are determined by the administration route and administration. It depends on the method. For example, water, alcohol, animal or vegetable oils such as soybean oil, sesame oil, mineral oil, or synthetic oil, or synthetic oil is used as the liquid carrier. Cellulose such as sugars such as maltose, cellulose, amino acids such as lysine, and hydroxypropyl propyl cellulose as solid carriers Derivatives, polysaccharides such as cyclodextrin, and organic acid salts such as magnesium stearate are used.
  • the liquid carrier is generally a physiological saline, various buffers, glucose, inositol, mannitol. Glycols such as saccharide solutions, ethylene glycol, polyethylene glycol, etc. are desirable. In addition, innocitol, manifold, glucose, mannose, maltose, blackcloth Lyophilized formulation together with excipients such as sugars such as sugars, amino acids such as phenylalanine, etc. It can be dissolved and used in intravenous fluids such as water, glucose solution, electrolyte solution, and amino acid.
  • an effective amount of 5, 6-0 to inhibit HIV virus particle replication in human T cells infected with HIV Propagation of HIV in HIV-infected human T cells, comprising treating HIV-infected human T cells with sodium L-ascorbinate sodium salt A method is provided for inhibiting
  • the method for inhibiting the proliferation of HIV according to the second aspect of the present invention is applicable to the case where the blood extracted from the human body and stored may contain HIV-infected T cells.
  • HIV virus particles replicate in HIV-infected T cells in the stored blood, in other words, inhibit the growth of HIV. Available.
  • an effective amount for HIV-infected animals or humans When the method for inhibiting HIV growth according to the second aspect of the present invention is applied to a method for administering SBA by intravenous injection or another administration route, it is necessary to use an in vivo method comprising T cells infected with HIV.
  • An effective amount of SBA administered or transferred into the bloodstream is expected to be able to contact HIV-infected T cells and inhibit replication of HIV virus particles or HIV growth in the T cells Is done.
  • the present invention provides a method for producing a composition for inhibiting the growth of HIV, comprising 5,10-benzylidene-1L-asconolevic acid or a derivative thereof.
  • Pharmaceutically acceptable metal salts include the use of alkaline metal salts.
  • CMC Carbide salt 18 g After mixing the above ingredients uniformly, stearate magnesium Then, 2 g of rubber was added, and the mixture was further mixed, and the mixed powder was tabletted to give a tablet of 200 mg per tablet.
  • This tablet may be used, if necessary, in a commonly used gastric-soluble phylloresin-coating agent (e.g., polyvinylacetate, etc.). Or coloring with an edible colorant.
  • a solution prepared by dissolving SBA and glucose in physiological saline was filtered through a membrane filter, and then sterilized and filtered again.
  • the filtrate was aseptically separated into vials. After injection and filling with nitrogen gas, the solution was sealed and used as an intravenous injection solution.
  • U933 cells human monocyte blastoid cells, a kind of human T cells
  • U1 cells which are persistently infected cells of HIV, in which the HIV-1 gene is present in the cells as a virus, were used as cells for HIV expression tests.
  • a cell stimulant such as TPA (horbor-lester) or TNF (tumor necrosis factor)
  • TPA horbor-lester
  • TNF tumor necrosis factor
  • the U1 cells described above were cultured in each well of a 48-well coaster plate under the following various conditions. That is, sodium sulfate (hereinafter, abbreviated as SBA) is added to the culture medium at various concentrations at various concentrations of 5,6-dibenzylidene-L-ascozolebinate monosodium salt.
  • SBA sodium sulfate
  • U1 cells were cultured in the presence or absence of SBA, and the cells were stimulated by the addition of various concentrations of TPA.
  • TPA concentration of various concentrations of TPA.
  • One cell and the unstimulated U1 cell were also cultured.
  • U1 cells stimulated by the addition of TPA results in replication of HIV virus particles in a significant number of U1 cells, producing HIV antigens within the cells, HIV-positive cells where HIV virus particles germinate and are released from cells It becomes. HIV virus particle replication can be detected by the indirect immunofluorescence assay described below.
  • U1 cells were cultured under different conditions when both were added.
  • the replication of HIV virus particles and the release of HIV virus particles from U1 cells cultured under different conditions as primary antibodies are used as anti-HIV- 1 Detected by indirect fluorescence assay using mouse monoclonal antibody with activity and using human IgG antibody derived from FITC rabbits as secondary antibody .
  • the number of detected HIV-positive cells was calculated as a percentage (%) of the total number of U1 cells used in the test, and expressed as the appearance rate (%) of HIV-1 positive cells.
  • Table 1 shows the obtained test results.
  • SBA and therefore generally 561-benzylidene-L-asconolevic acid or its salts, can be used in host cells with persistent HIV infection. It was confirmed that the virus particles had an activity of inhibiting the replication of virus particles, that is, they had an anti-HIV activity.
  • TPA tumor necrosis factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • Stimulation with TPA and tumor necrosis factor (TNF) activates the HIV gene latent as an HIV promoter in HIV-infected cells, leading to the germination and release of virus particles Power ; known to be strongly guided. It is thought that the activation of HIV virus expression is caused by oxidative stress in host cells caused by the extracellular stimulus. Also, NF k B Ah Ru in nuclear factor within the cell critically involved in the proliferation of HIV ⁇ I Angeles, and important in the redox state activation of the factor NF k B of the NF k B And other findings have been reported. Therefore, the following test method was used to determine whether SBA has inhibitory activity against HIV proliferation at the level of cultured cells.
  • PBMC cells which have been activated and blasted with the mitogen, PHA (polyester), are cultured, and then inoculated with HIV or inoculated with SBAT-pretreated HIV. Infected. These HIV-infected cells continue to be cultured in media containing various concentrations of SBA, the supernatant of the culture is further separated, and the amount of HIV virus particles released into the supernatant Was measured. However, the measurement of the amount of HIV virus particles released is based on the amount of HIV-p24 antigen, which is a structural protein of HIV, present in the supernatant. This was done by measuring as an indicator. The results are shown in Table 3 below. Table 3
  • the anti-HIV activity of SBA is determined by using the amount of HIV-p24 antigen that is expressed when PHA-activated PBMC cells are infected with HIV as an index.
  • SBA was found to exhibit an inhibitory effect on HIV antigen production. Therefore, the results in Table 3 show that SBA was effective in suppressing the replication of HIV virus particles ⁇ f.
  • a study in which HIV-infected cells infected with HIV after pretreatment with SBA were cultured in the presence of SBA showed a significant inhibitory effect on the replication of HIV virus particles. Power.
  • the medium used for the above cell culture was RPM 1 containing 10% heat-treated fetal calf serum penicillin, stripe mycin, guasole, and ethanol. — 1640 medium.
  • Table 4 shows the results of a comparative test in which 2 g / ml AZT (a known anti-HIV drug practically used in the treatment of AIDS) was added instead of SBA when culturing HIV-infected cells. It is also shown. Comparison of HBA infection with SBA and AZT, and comparison of HIV virus particle replication inhibitory effect showed that SBA had the same effect as AZT (2 g / ml) at a concentration of g / ml. Thus, an effective amount of SBA is as effective as AZT in inhibiting the replication of HIV virus particles in cells, and is therefore as useful as AZT in medical treatment of AIDS. It is expected that there is.
  • 2 g / ml AZT a known anti-HIV drug practically used in the treatment of AIDS
  • test results of the above tests (Mouth) to (2) show that the tested SBA has the effect of inhibiting the replication of HIV virus particles in the cells of HIV infected with T cells. Which indicates that.
  • SBA suppresses giant cell formation in Mo 11-4 cells and a small amount of 1 / g / ml SBA suppresses TNF-induced HIV proliferation. It indicates that it suppresses the initial process of transcription of HIV-1 gene in cells and does not express HIV virus envelope protein. In the transfer initial excessive degree of HIV- 1 gene, transcription regulatory factor NF k B the host cells are fruits other an important role. Therefore the SBA it is strongly indicate possible to have an effect you inhibit the activation of NF k B.
  • NF k B is Ri composite evening lymph click Shitsudea the molecules of the motor damper click protein is associated with a molecular weight of about 50,000 (P 50) of the motor lymph click protein and molecular weight 65,000 (P 65), the composite of this the I k B (molecular weight 37,000) cytoplasm while inactivating a nucleic acid binding ability of NF k B data damper click proteins is by binding of the motor damper click protein as the nucleic acid binding capacity inhibitor It is known to exist.
  • Various acids from extracellular When stimulated by inflammatory cytokines such as oxidized stress factors and TNF, the cells generate reactive oxygen species. It induces the expression of an enzyme that captures active oxygen as an in vivo defense reaction against the generated active oxygen.
  • NF k B The Chi sales of its Yo I Do enzymes also to have the effect you activate nucleic acid binding ability of NF k B.
  • Activated NF k B binds to transcription regulatory site main Tsu cell down di catcher over RNA of HIV gene present in the pro c I Angeles, transfer to m RNA of the HIV Strengthen. As a result, it promotes the growth of HIV. That it has a strong I antioxidant capacity SBA, the active oxygen trapped in the cell, therefore not induced expression of the enzyme to capture active oxygen derived from the host cell, resulting in the nucleic acid binding ability of NF k B It is postulated that SBA may eventually inhibit the replication of HIV-1 virus particles because they do not induce activation.
  • 5, 6-0-benzylidene-L-ascorbic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, particularly, sodium nitrate is used. Salt has been shown to inhibit the replication of HIV virus particles in HIV-infected human T cells and, more broadly, to inhibit HIV proliferation.
  • 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid or a salt thereof is effective for the treatment of inhibiting HIV virus infecting human T cells. It has low toxicity and is expected to be useful for the medical treatment of AIDS.

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Description

明 細 書
H I V増殖阻害用組成物
技 術 分 野
本発明 は 5 , 6 — 0 — べ ン ジ リ デ ン ー L ー ァ ス コ ノレ ビ ン酸又は こ れの製薬学的に許容でき る塩を有効成分 と し て含有する、 ヒ ト 後天性免疫不全症候群ウ ィ ルス （以下、 H I V と略すこ と も あ る） 、 すなわちエイ ズウ イ ルスの 増殖阻害用組成物に関 し、 ま た H I V感染 した ヒ ト T細 胞中の H I Vのウ ィ ルス粒子の複製を阻害す る方法に も 関する。
背 景 技 術
ヒ ト 後天性免疫不全症候群すなわちエイ ズ （ A I D S ) は ヒ ト T細胞にエイ ズウ イ ルスすなわち H I Vが感染 し た こ と に よ る病気であ り 、 エイ ズの予防乃至治療剤 と し て は各種の抗 H I V活性剤 （以下、 単に抗 H I V剤 と い う ） が報告さ れてい る。 例えば、 A Z T (ア ジ ドチ ミ ジ ン ） 、 D D I ( 2 ' , 3 ' — ジ デォ キ シ イ ノ シ ン ） 、 I F N (イ ン タ ー フ ェ ロ ン） 、 制癌剤であ る ア ルキル化 剤ま たは代謝拮抗剤 （特開平 1 - 38031号参照） 等が抗 H I V剤 と して知 られる。
しか し、 従来知 られてい る抗 H I V剤はエイ ズ治療薬 と して満足でき る も のがないので、 毒性が低 く 且つ強い 抗 H I V活性を もつ新規な抗 H I V剤を提供する こ とが 要望さ れている。 発 明 の 開 示
本発明者 ら は上記の事情を考慮 して鋭意検討を重ねた 結果、 5 , 6 — 0 — ベ ン ジ リ デ ン ー L — ァ ス コ ノレ ビ ン酸 (以下では、 単にべ ン ジ リ デ ン ー ァ ス コ ル ビ ン酸 と記載 す る こ と も あ る ） 又は こ れの製薬学的に許容で き る 金属 塩が低い毒性 と高い抗 H I V活性を有す る こ と を見出 し た。 こ の知見に基づいて本発明 を完成 した。
従 っ て、 本発明の第 1 の要旨 に よ る と 、 5 , 6 — 0 — ベ ン ジ リ デ ン ー L — ァ ス コ ル ビ ン酸又は こ れの製薬学的 に許容で き る ア ル カ リ 金属塩あ る いは ア ル カ リ 土類金属 塩を有効成分 と して含有 し、 有効成分に製剤学上許容で き る 担体を配合 して成る こ と を特徴 と す る H I Vの増殖 阻害用組成物が提供さ れ る。
本発明 に よ る 組成物 はエイ ズの医療的処理に有用 であ り 、 本組成物にお いて有効成分 と して用 い ら れ る 5 , 6 — 〇 一 ベ ン ジ リ デ ン 一 L ー ァ ス コ ル ビ ン酸 ま た は そ の塩 は公知の化合物であ る。 5 , 6 — 0 — べ ン ジ リ デ ン ー L — ァ ス コ ル ビ ン酸の製造法は 「 SteroidsJ 12巻， 309頁 ( 1968)等 に記載 さ れ、 ま た 別 の 製造法 は、 特公平 3 - 33127 号公報及 び米国特許第 5, 036, 103号明細書に示 さ れ る 。 更 に 、 5 , 6 — 〇 一 べ ン ジ リ デ ン ー L ー ァ ス コ ル ビ ン酸又は こ れのナ ト リ ウ ム塩、 カ リ ウ ム塩及びカ ノレ シ ゥ ム塩が有す る 抗癌活性及び こ れ ら の塩を製造す る 方法 は特公平 3 — 33127号公報及び米国特許第 5.036, 103号 明細書に記載さ れ る。 発明を実施す る ための最良の形態
本発明の H I V増殖阻害用組成物で有効成分 と して有 用であ るべン ジ リ デ ン ー ァ ス コ ノレ ビ ン酸の塩の具体例に は、 一ナ ト リ ウ ム塩、 ニナ ト リ ウ ム塩、 一カ リ ウ ム塩、 二カ リ ウ ム塩及びカ ル シ ウ ム塩があ る。 特に、 5 , 6 — 0 — べ ン ジ リ デ ン 一 L 一ァ ス コ ノレ ビ ン酸ーナ ト リ ウ 厶塩 (略号 ： S B A ) が好ま しい。 S B Aは次式 （ I )
N
Figure imgf000005_0001
で示さ れる 化合物であ り 、 通常の方法で合成さ れた S B Aは 2 つの立体異性体、 すなわち （$)— 3 8 八 と （R)— S B Aの ラ セ ミ 体であ り 、 そ して液体高速 ク ロ マ ト ダラ フ ィ 一 に よ る分析では、 （S)— 体 と （R)—体 とを 2 ： 1 の混合比で含有する。
本発明で有効成分 と して用 い られる ベ ン ジ リ デ ン — ァ ス コ ル ビ ン酸又はそ の製薬学的に許容でき る塩は後記の 試験例に示すよ う に低毒性であ り 、 しか も抗 H I V活性 を有する。
本発明の H I V増殖阻害用組成物は、 ヒ ト の免疫細胞 の H I V ウ ィ ルスに よ る感染の予防的処置 と ヒ ト 後天性 免疫不全症候群 （ A I D S ) の予防的又は医療的処理に 有用であ る。 本発明の抗 H I V組成物を上記の 目 的の医 薬品と して用いる場合、 前記の有効成分化合物を、 製薬 学的に許容 さ れる添加剤、 例えば、 担体、 賦活剤、 希釈 剤等の如 き製薬上必要な添加剤成分 と適宜混合 し、 粉末 顆粒、 錠剤、 カ プセル剤、 シ ロ ッ プ剤、 注射剤、 外用剤 坐剤等の態様で医薬組成物に製剤でき る。 そ して、 本組 成物は経口 的 ま たは非経口 的に動物又は ヒ ト に投与する こ とができ る。
上記の抗 H I V組成物の製剤中には、 本発明で用 いる 有効成分化合物はそ の投与の 目 的を達する有効量が配合 さ れる。 有効成分の投与量は、 投与経路、 症状、 患者の 体重、 性別、 年齢等に よ っ て異な るが、 例え ば、 成人患 者では 1 日 当た り 1 00〜 3000 mg程度が提示さ れる。 しか し、 そ の投与量は動物試験の結果な ど種々 の情況を勘案 して薬剤投与に よ る薬剤血中濃度が一定量を越えない範 囲で、 連続的ま たは間けつ的に投与でき る。 一定の条件 下におけ る適量 と投与回数は、 上記の指針を基に して専 門医の決定に よ らな ければな らない。 ま た、 本発明の抗 H I V組成物の製剤物中 にお け る有効成分化合物の含量 は製剤型に よ り 種々 異な る が、 通常は 0. 1〜 99重量％、 好ま し く は 1 〜 90重量％であ る。 例えば注射液の場合に は、 通常 0. 1 ~ 5 重量％ の有効成分化合物を含むよ う に する こ とが よ い。 経口投与の場合には、 前記の固体担体 も し く は液状担体 と共に錠剤、 カ ブセ ル剤、 粉剤、 顆粒 剤、 ド ラ イ シ ロ ッ プ剤、 液剤、 シ ロ ッ プ剤等の形態で用 い られ る。 カ プセ ル、 錠剤、 顆粒、 粉剤の場合、 一般に 有効成分化合物の含量は 3 〜 99重量％、 好 ま し く は 5 〜 90重量 で あ り 、 残部 は担体で あ る 。 本発 明 に よ る 抗 H I V組成物は、 有効成分 と して 5 , 6 — 0 — べ ン ジ リ デ ン — L ー ァ ス コ ル ビ ン酸一ナ ト リ ゥ 厶塩を組成物の重 量に基づいて 0. 1〜 99重量％ の割合で含有す る のが好 ま しい。
本発明 に よ る抗 H I V組成物 に配合 さ れ る 賦形剤お よ び担体 と して は製薬学上許容 さ れ る も のが選ばれ、 そ の 種類お よ び組成は投与経路や投与方法に よ つ て決 ま る 。 例え ば、 液状担体 と して水、 ア ル コ ー ル も し く は大豆油 ゴマ油、 ミ ネ ラ ル油 な どの動植物油、 ま た は合成油 な ど が用 い ら れ る 。 固体担体 と してマ ル ト 一 ス、 シ ユ ー ク ロ — スな どの糖類、 リ ジ ン な どの ア ミ ノ 酸類、 ヒ ド ロ キ シ プロ ピルセ ル ロ ー ス な どのセ ル ロ ー ス誘導体、 シ ク ロ デ キス ト リ ン な どの多糖類、 ス テア リ ン酸マ グ ネ シ ウ ム な どの有機酸塩な どが使用 さ れ る 。
注射剤 と して本発明の抗 H I V組成物を製剤す る 場合 に は、 液状担体は一般に生理食塩水、 各種緩衝液、 グル コ ー ス、 イ ノ シ ト ー ル、 マ ン ニ ト ー ルな どの糖類溶液、 エチ レ ン グ リ コ ー ル、 ポ リ エチ レ ン グ リ コ ー ル等の グ リ コ ー ル類が望 ま し い。 ま た、 イ ノ シ ト ー ル、 マ ン ニ ト ー ル、 グル コ ー ス、 マ ン ノ ー ス、 マ ル ト ース、 シ ュ 一 ク ロ ー ス な どの糖類、 フ エ 二ル ァ ラ ニ ン な どの ア ミ ノ 酸類な どの賦形剤 と共に凍結乾燥製剤 と し、 それを投与時に注 射用の適当な溶剤、 例えば滅菌水、 生理食塩水、 ブ ドウ 糖液、 電解質溶液、 ア ミ ノ 酸な どの静脈投与用液体に溶 解 して用レ、る こ と もでき る。
更に、 本発明の第 2 の要旨に よ る と、 H I V に感染 し た ヒ 卜 T細胞における H I Vの ウ ィ ルス粒子の複製を阻 害する のに有効な量の 5 , 6 — 0 —べ ン ジ リ デ ン ー L 一 ァ ス コ ル ビ ン酸ーナ ト リ ウ ム塩で H I V感染 した ヒ ト T 細胞を処理する こ とか ら成る、 H I V感染 した ヒ ト T細 胞におけ る H I Vの増殖を阻害す る方法が提供さ れる。
本発明の第 2 の要旨に よ る H I V増殖阻害方法は、 人 体か ら取出 さ れて貯蔵さ れた血液が H I V感染 した T紬 胞を含む可能性があ る場合に、 本法を該血液貯蔵品に適 用する と、 貯蔵血液中に在 り う る H I V感染 した T細胞 内で H I V の ウ ィ ルス粒子が複製する、 換言すれば H I Vが増殖する のを阻害する よ う に して利用でき る。
5 , 6 — 0 —ベ ン ジ リ デ ン ー L —ァ ス コ ゾレ ビ ン酸一ナ ト リ ウ ム塩 （すなわち S B A ) は米国特許第 5. 036. 1 03 号明細書に記載さ れる と お り に担癌患者に静脈又は腹腔 内注射に よ り 反復投与する 時に各種癌の治療に有効に作 用でき る。 こ の こ と力、 ら判 る よ う に、 血管内に S B A を 入れる と、 血液流中で S B A は安定にその作用を維持 し う る。
ま た、 H I V感染 した動物又は ヒ ト に対 して有効量の S B Aを静脈注射で、 又は他の投与ルー 卜 で投与する仕 方で本発明の第 2の要旨に よ る H I V増殖阻害方法を実 施する場合には、 H I V感染 した T細胞を含む生体内の 血液流中に投与又は移行さ れた有効量の S B Aは、 H I V感染 した T細胞に接触 して該 T細胞にお ける H I Vの ウ ィ ルス粒子の複製又は H I Vの増殖を阻害でき る と期 待さ れる。
ま た、 本発明は 、 その別の要旨においては、 H I Vの 増殖阻害用組成物の製造での 5 , 6 一 0— べ ン ジ リ デン 一 L ー ァ ス コ ノレ ビ ン酸又は こ れの製薬学的に許容でき る ア ル力 リ 金属塩あ る レヽはァ ノレ力 リ 土類金属塩の使用を包 含する。
本発明を よ り 詳細に説明す る ために製剤例及び試験例 等を挙げる が、 本発明は こ れ ら に よ り 何 ら限定さ れる も のではない。
製剤例 1 錠剤の調製
(1) S B A (すなわ ち 5 , 6 一 0— べ ン ジ リ デ ン
一 L 一 ァ ス コ ル ビ ン酸一ナ ト リ ウ ム塩） 50 g
(2) メ タ ケイ酸ァ ノレ ミ ン酸マ グネ シ ゥ ム 14 g (3) ト ウ モ ロ コ シデ ン プ ン 21 g
(4) 乳 糖 35g
(5) 結晶セ ル 口一ス 60 g
(6) カ ルボキ シル メ チルセル ロ ー ズ
( C M C ) 力 ル ン ゥ ム塩 18 g 上記成分を均一に混合 した後にス テア リ ン酸マ グネ シ ゥ ムの 2 g を添加 して さ ら に混合 し、 そ の混合粉末を打 錠 して、 1 錠 200mgの錠剤 と し た。 こ の錠剤は、 必要に 応 じて、 通常用 い ら れ る 胃溶性 フ ィ ゾレ厶 コ 一 テ ィ ン グ剤 (例えば、 ポ リ ビニルァ セ 夕一ル ジェチ ルァ ミ ノ ア セ テ ー ト ） あ る い は食用性着色剤で着色 して も よ い。
製剤例 2 カ プセ ル剤の調製
(1) S B A 1000 g
(2) 乳 糖 960 g
(3) ス テア リ ン酸マ グ ネ シ ゥ ム 40 g 上記成分を均一に混合 し、 そ の混合粉末をハ ー ドゼ ラ チ ン カ プセ ル に 200mgずつ充填 し た。
製剤例 3 注射液の調製
(1) S B A lOOmg
(2) ブ ド ウ 糖 lOOmg
(3) 生理食塩水 全量で 10ml
S B A と ブ ド ウ 糖を生理食塩水に溶解 した液を メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー で濾過後 に再び除菌濾過を行い、 そ の濾 過液を無菌的 にバイ ア ル に分注 し、 窒素ガス を充填 した 後、 密封 して静脈内注射液 と し た。
試験例 1 毒性の評価
生理食塩水に と 力、 し た S B A溶液 （ S B A 100 g/ml 含有） の形で 1000mg/kg体重の投与量で S B Aを、 I C R系マ イ ス （ 5 週令， 雄， 各群 5 匹） に静脈内投与 し た 何れのマ イ ス も 、 死亡す る に は到 ら なか っ た。 こ れに よ り 、 5 , 6 — 0—べ ン ジ リ デ ン ー L ー ァ ス コ ル ビ ン酸又 はそのナ ト リ ゥ ム塩が極めて低い毒性を示す こ とが認め られる。
試験例 2
U 9 3 7細胞 （ ヒ ト 単球芽球様細胞、 すなわち ヒ ト T 細胞の一種） に H I V— 1 ( H T L V— DT B株） の遺伝 子 D N Aを 2 コ ピー導入 して作 られて、 かつ H I V— 1 遺伝子がプロ ウ ィ ル ス と して細胞内に存在 している H I V持続感染細胞であ る U 1 細胞を H I V発現試験用の紬 胞 と して用 いた。 こ の U 1 細胞は T P A (ホルボー ルェ ステル） あ る いは T N F (腫瘍壊死因子） 等の細胞刺激 剤に よ り 感染細胞を刺激 しない と、 H I Vの ウ ィ ル ス粒 子の複製、 すなわち H I Vの発現が起 こ らない型の細胞 であ る。
上記の U 1 細胞を 4 8 穴の コ ス タ 一 プ レ ー ト の各穴で 下記の種々 の条件下で培養 した。 すなわち、 種々 の濃度 で 5 ， 6 — 〇 一 ベ ン ジ リ デ ン ー L ー ァ ス コ ゾレ ビ ン酸一ナ ト リ ウ ム塩 （以下、 S B A と略す） を培養培地液中に添 加 して S B Aの存在下に又は S B Aの非存在下に U 1 細 胞を培養 し、 ま た さ ら に、 こ れ ら細胞に種 々 の濃度の T P Aの添加に よ る刺激を行っ た U 1 細胞 と、 刺激を行 わなか っ た U 1 細胞 と を も培養 した。
T P Aの添加に よ る刺激を受けた U 1 細胞を培養する と、 相当数の U 1 細胞の中で H I Vの ウ ィ ルス粒子の複 製が起 り 、 細胞内で H I V抗原が生成 して、 H I Vの ゥ ィ ル ス粒子が細胞よ り 発芽、 放出 さ れる H I V陽性細胞 と な る。 H I Vのウ ィ ルス粒子の複製は下記の間接蛍光 抗体法で検出でき る。
上記の よ う に して、 S B A及び T P Aの両者 と も添加 しない場合、 S B Aを添加 したが T P Aを添加 しない場 合、 S B Aを添加 し な いが T P Aを添加 し た場合及 び S B A と T P Aの両者を添加 した場合の夫々 別 々 の条件 の下に U 1 細胞を培養 した。 こ の よ う に別 々 の条件下で 培養さ れた U 1 細胞の う ちの H I Vの ウ ィ ルス粒子の複 製 と H I Vの ウ ィ ルス粒子の放出を、 一次抗体 と して、 抗 H I V - 1 活性を有する マ ウ ス モ ノ ク ロ 一 ナ ル抗体を 用 い、 ま た二次抗体 と して F I T C 一家兎由来 ヒ ト I g G抗体を用 い る 間接蛍光測定法に よ り 検出 した。 検出 し た H I V陽性細胞の細胞数を、 試験に供 した U 1 細胞の 全数に対する百分率 （％ ) と して算出 し、 H I V— 1 陽 性細胞の出現率 （％ ) と して表わす。
得 られた試験結果を表 1 に示す。
表 1
培地中の H I V- 1陽性細胞の出現率 （％)
SB A濃度 TP Aを添加 TP A 1 ng/mlを
Figure imgf000012_0001
しない場合 添加する場合
0 3 27
25 3 26
50 2 21
100 2 16
200 3 1
400 3 12
800 4 8 表 1 の結果か ら明 らかな よ う に、 添加 さ れた S B Aは その濃度 50〜 800 g/mlの範囲で S B Aの濃度に依存 し て、 T P A添加培養の細胞系で H I V - 1 陽性細胞の出 現率が低下 してお り 、 H I Vの ウ ィ ルス粒子の複製が抑 制さ れた こ とが認め られ、 その 50%阻害に要する S B A の濃度はほぼ 400〃 g/mlであ る。
上記の結果か ら、 S B Aは、 ま た従っ て一般的には 5 6 一 0—べ ン ジ リ デ ン ー L —ァ ス コ ノレ ビン酸又はその塩 は H I V持続感染 した宿主細胞内において H I Vの ウ イ ルス粒子の複製を阻害す る 活性を有する こ と、 すなわち 抗 H I V作用を有する こ とが確認さ れた。
試験例 3
T P A及び腫瘍壊死因子 ( T N F ) での刺激に よ り 、 H I V感染細胞内で H I Vプロ ウ イ ノレス と して潜伏する H I V遺伝子が活性化さ れ、 ゥ ィ ル ス粒子の発芽、 放出 への進行力、 ;強 く 誘導 さ れる こ と が知 られる。 の H I V ウ ィ ルス発現の活性化は、 前記の細胞外か らの刺激で生 じ る宿主钿胞内の酸化ス ト レ スが原因であ る と考え られ ている。 ま た、 細胞内の核内因子であ る NFkBが H I Vゥ ィ ルスの増殖に重大に関与 し、 かつその NFkBの酸化還元 状態が本因子 NFkBの活性化に重要であ る こ と、 な どの知 見 も報告さ れてい る。 そ こ で S B Aに H I Vの増殖に対 する 阻害活性があ るか否かを、 下記の試験法で培養細胞 レベルで検 ρίしァこ。
(ィ ） 各種の T細胞に対す る S B Aの細胞毒性試験 A 3.01細胞 （ H A T感受性 C E M細胞株） と、 H I V を感染さ せた A 3.01細胞 と、 前記の U 1 細胞 とを夫々 に 種 々 の濃度の S B A を含む改良 R P M 1 — 1640培地中で 培養 し、 培養後に生存 した細胞の細胞数を偏光顕微鏡下 で ト リ パ ンブルー色素排除法に よ り 測定 した。 細胞の生 存率 （ ％ ) を算出 して、 次の表 2 に示す。 表 2
Figure imgf000014_0001
A 3.01細胞、 H I V感染 A 3.01細胞、 U 1 細胞に対す る S B A の上記の細胞毒性試験では、 U 1 細胞に対 して S B A は細胞毒性をほ とん ど示さ ない。 A 3.01細胞に対 して も S B Aが 1000 g/mlの高濃度で細胞の生存率がほ ぼ 70%であ っ た。 こ れ らの細胞毒性の試験結果はこ れ ら 細胞に対する S B A の細胞毒性がかな り 低いこ とを示 し てい る。 一方、 H I Vに感染 した A 3.01細胞に対 して、 S B A は 500〜 800 g/mlの濃度で存在する時に細胞の 生存率が 3 〜 24% と低 く いか ら、 該細胞の生存に阻害作 用を示 した。
( 口 ） H I V感染さ れたマ イ ト ジ ェ ン誘導幼若化 ヒ ト 末 稍血単核球細胞 （ P M B C ) にお け る H I Vの感染 及び増殖な ら びにゥ イ ノレ ス粒子の複製に対す る S B Aの阻害試
マ イ ト ジ ェ ンであ る P H A (ホ -ルボー ルエステル） で 活性化さ れて幼若化 した P B M C細胞を培養 し、 次いで H I Vを接種 して又は S B A T前処理さ れた H I Vを接 種 して感染さ せた。 こ れ ら の H I V感染細胞を種 々 の濃 度の S B Aを含む培地中で培養 し続け、 更に培養物の上 清を分離 し、 上清中に放出 さ れた H I Vの ウ イ ルス粒子 の量を測定 した。 但 し、 H I Vの ウ イ ルス粒子の放出量 の測定は、 H I Vの構造夕 ン パ ク 質であ る H I V - p 24 抗原が上清中に存在する量を ゥ イ ノレ ス粒子の量の代行指 標 と して測定する こ と に よ り 行つ た。 そ の結果を次の表 3 に示す。 表 3
培地中の P 24抗原量 (pg/nil)
S B A濃度 H I V感染 S 前処理 H I Vで
(^g/ml) 細胞の培養 感染後に細胞を培養
0 1100 1200
10 1500 1240
50 1 00 1520
100 380 1430 上記の試験におけ る よ う に、 P H Aで活性化 した P B M C細胞に H I Vを感染さ せた際に発現す る H I V - p 24抗原の生成量を指標 と して、 S B Aの抗 H I V作用 を 見る と、 S B Aは 100 g/mlの濃度では H I V抗原の生 成に対す る 抑制効果を示す こ と が認め ら れた。 従 っ て H I Vの ウ ィ ルス粒子の複製抑制に ^ f して S B Aが有効 に作用する こ とが認め られた こ とが表 3 の結果か ら示さ れる。 しか し、 H I Vを S B Aで前処理 してか ら感染さ せた H I V感染細胞を S B Aの存在下に培養 した試験で は、 H I Vの ウ ィ ルス粒子の複製に対する抑制効果があ ま り 認め ら れな 力、 つ た。 こ れ ら の結果か ら 、 S B Aの H I V - 1 複製抑制効果は S B Aが直接に H I Vに作用 して H I Vの感染性 （感染力） を失わせた こ と に よ る も のでない とみ られる。
(ハ） H I V感染 した A 3.01細胞に腫瘍壊死因子 （ T N F - ) を導入 した時に誘導 さ れる H I Vのウ ィ ル ス粒子の複製に対する S B Aの阻害作用試験
エイ ズウ イ ルス H I V B R U (逆転写酵素活性、 0. 03CPII1 Z細胞） と 6 x lOe 個の A 3.01細胞 （ H A T感受性 C E M細胞株） を 37°Cで 1 時間反応 さ せた。 1 時間反応後に . 細胞を P B Sで洗い、 余分な ウ ィ ルス粒子を除去 した。 5 X 105 個の H I V感染 した A 3.01細胞を種々 の濃度の T N F — α と S B Aを含む培地中で培養 し、 培養 0 日 目 〜 5 日 目 の間でその培養細胞の上清中に放出 さ れた Η I V構造 タ ンパ ク 質であ る H I V— ρ 24抗原の量を測定 し た。
上記の細胞培養に用 いた培地は 10 %熱処理胎児牛血清 ペニ シ リ ン 、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン 、 グ ゾレ 夕 ミ ン 、 メ ノレ 力 ブ ト エタ ノ ールを含む R P M 1 — 1640培地であ る。
経時的に測定 した H I V — p 24抗原の生成量 と S B A の濃度 との関連性を次の表 4 に要約 して示す。
&_ 4一——
Figure imgf000017_0001
上記の試験では培養細胞上清に出現する p 24抗原タ ン パ ク質を指標 と して H I Vの ウ ィ ルス粒子の複製の検討 を行っ た。 すなわち、 H I V感染後、 6 日 間、 経時的に p 24抗原量を測定 した と こ ろ、 S B Aの非存在下では、 A 3.01細胞で 10 uni t/ml0 T N F — ひ の刺激に よ り H I V の ウ ィ ルス粒子の複製が誘導 さ れた c , しか し、 そ の H I Vのウ ィ ルス粒子の複製は 1 g/mlとい う 低濃度の S B Aの添加で H I V感染後 5 日 目 には著 し く 抑制 さ れ てお り 、 10 g/mlの S B Aの添加は、 S B Aの無添加に 比べて 50%の阻害を示 した。 100〃 g/mlの S B A の添加 では H I Vのウ ィ ルス粒子の複製が完全に阻止さ れた こ とが表 4 の結果よ り 認め られた。
なお、 表 4 では、 H I V感染細胞の培養時に S B Aに 代えて 2 g/mlの A Z T (エイ ズの治療に実用 さ れる既 知の抗 H I V剤） を添加 して培養 した場合の比較試験の 結果 も 示 して あ る 。 S B A と A Z T と の H I V感染、 H I Vのウ ィ ルス粒子の複製阻害効果の比較は、 S B A は濃度 g/mlで A Z T ( 2 g/ml) と 同 じ効果を示 した。 こ の よ う に、 有効量の S B Aは A Z T と 同等に、 細胞内の H I Vウ ィ ル ス粒子の複製を阻害でき る効果を 有する か ら、 A Z T と 同様にエイ ズの医療的処理に有用 であ る と期待さ れる。
(二） H I V感染 Molt— 4 細胞の 巨細胞形成に対する S B Aの抑制作用試験
上記の試験 （ハ） と 同様に してエイ ズウ イ ルス H I V BR U を Molt— 4 細胞 （ C D 4 陽性 ヒ ト 由来の T紬胞株） に感染さ せた。 その後、 H I V感染 した Molt— 4細胞 と H I V感染 してない Molt - 4細胞 とを混合 して、 種 々 の 濃度の S B Aを含む上記の改良 R P M 1 一 1640培地中で 高密度で混合培養 した。 H I V感染細胞 と H I V感染細 胞に よ り 、 ま た H I V感染細胞 と非感染細胞に よ り 形成 さ れる細胞融合細胞 （ 巨細胞） の存在を検討 した。 巨細 胞出現は顕微鏡下で確認を行っ た。 その 巨細胞の大き さ は他の細胞の大き さ と は明 らかに異な る。 上記の混合培 養の実験系で S B Aを添加下に培養す る と、 培養 20時間 において 10〃 g/ml以上の S B A濃度で S B Aは巨細胞形 成を抑制する こ とが認め られた。
上記の試験 （ 口 ） 〜 （ 二） の試験結果 は、 試験 し た S B Aが T細胞に感染 した H I Vの細胞内の H I Vの ゥ ィ ルス粒子の複製を抑制す る作用 を有す る物質であ る こ とを示 している。 上記の夫 々 の試験において、 M011— 4 細胞 に お け る 巨細胞形成 と 、 マ イ ト ジ ェ ン誘導に よ る P B M C幼若下での H I V感染 と、 A 3.01細胞にお ける H I V p 24... タ ンパ ク 質生産等が、 S B Aで抑制さ れ る こ とが証明 さ れた。 即ち、 S B Aは抗 H I V作用を有 す る こ とを示す。
特に S B Aが Mo 11— 4 細胞での 巨細胞形成を抑制 し、 かつ 1 / g/mlとい う 微量の S B Aが T N F — で誘導さ れる H I Vの増殖を抑制する前記の知見は、 S B Aが H I V感染細胞内にお ける H I V - 1 遺伝子の転写の初期 過程を抑制 して H I Vの ウ ィ ル スエ ンベロ ープ蛋白を発 現さ せないこ と を示す。 H I V— 1 遺伝子の転写初期過 程においては、 宿主細胞の転写調節因子 NFkBが重要な役 割を果た している。 従っ て S B Aは NF k Bの活性化を阻害 す る作用を有する可能性を強 く 示 してい る。
NFkBは分子量約 5 万 （ P 50) の タ ンパ ク質と分子量 6 万 5 千 （ P 65) のタ ンパ ク 質 と の分子が会合 した複合 夕 ンパ ク 質であ り 、 こ の複合 タ ンパ ク 質に核酸結合能阻害 因子 と しての IkB (分子量 3万 7千） の タ ンパ ク質が結 合 して NFkBの核酸結合能を不活性化 した状態で細胞質に 存在 している こ とが知 られている。 細胞外よ り 諸種の酸 化ス ト レ ス因子や T N F — ひ な どの炎症性サ イ ト カ イ ン に よ り 刺激を受け る と、 細胞内に活性酸素が生 じ る。 こ の生 じた活性酸素に対す る生体内防御反応 と して活性酸 素を捕捉する酵素の発現を誘導さ せる。 そのよ う な酵素 の う ち には NFkBの核酸結合能を活性化す る作用を有する も のがある。 活性化さ れた NFkBは、 プロ ウ ィ ルス と して 存在 している H I V遺伝子の メ ッ セ ン ジ ャ ー R N Aの転 写調節部位に結合 して、 H I Vの m R N Aへの転写を増 強さ せる。 そ の結果、 H I Vの増殖促進を誘導する。 強 ぃ抗酸化能を有す る S B Aは、 細胞内で活性酸素を捕捉 し、 そのため宿主細胞由来の活性酸素を捕捉する酵素の 発現が誘導さ れず、 結果的に NFkBの核酸結合能の活性化 の誘導を行わせないため、 結局は S B Aに よ っ て H I V ― 1 の ウ ィ ルス粒子の複製が阻害さ れる と考察さ れる。
産業上の利用可能性
以上の よ う に、 本発明において、 5 , 6 — 0— ベ ン ジ リ デ ン 一 Lー ァス コ ル ビン酸又は こ れの製薬学的に許容 でき る塩、 特に一ナ ト リ ウ ム塩は H I V感染 した ヒ ト T 細胞における H I Vのウ ィ ルス粒子の複製を阻害する活 性を示す こ とが認め られ、 広 く 言えば、 H I Vの増殖阻 害活性を有する こ とが認め られた。 5 , 6 — 0—べ ン ジ リ デ ン 一 Lー ァス コ ル ビ ン酸又はその塩は ヒ ト T細胞内 に感染 しているエイ ズウ イ ルスを阻害する処理用 に有効 であ り 、 低毒性であ り 、 それ らはエイ ズの医療的処理に 有用であ る と期待 さ れる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 5 , 6 — 0—べ ン ジ リ デ ン 一 L ー ァ ス コ ル ビ ン酸 又は こ れの製薬学的に許容で き る 了 ルカ リ 金属塩あ る い はアルカ リ 土類金属塩を有効成分 と して含有 し、 有効成 分に製剤学上許容でき る担体を配合 して成る こ と を特徴 とす る H I Vの増殖阻害用組成物。
2. 有効成分 と して 5 , 6 — 0—べ ン ジ リ デン ー L 一 ァス コ ル ビ ン酸一ナ ト リ ゥ ム塩を組成物の重量に基づい て 0.1〜 99重量％の割合で含有する請求項 1 に記載の組 成物。
3 . H I Vに感染 した ヒ ト T細胞におけ る H I Vのゥ ィ ル ス粒子の複製を阻害す る のに有効な量の 5 , 6 — 0 一 べ ン ジ リ デン ー L ー ァ ス コ ゾレ ビ ン酸一ナ ト リ ウ 厶塩で H I V感染 した ヒ ト T細胞 を処理す る こ と か ら成 る 、 H I V感染 した ヒ ト T細胞にお け る H I Vの増殖を阻害 する方法。
4 . H I Vの増殖阻害用組成物の製造での 5， 6 - 0 — ベ ン ジ リ デ ン ー L ー ァ ス コ ル ビ ン酸又 は こ れの製薬学 的に許容でき るアル力 リ 金属塩あ る いはア ル力 リ 土類金 属塩の使用。
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