RU2108345C1 - Водорастворимый, жесткоцепной олигоэфир, способ его получения и композиция на его основе - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к олигоэфирам, способу их получения и композиции на их основе, которые обладают значительном активностью против вируса человеческого иммунодефицита и используется для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа). Водно-растворимый жесткоцепной олигоэфир получают взаимодействием дифенола с бифункциональным электрофилом, содержащим группу -SO₃R₂, в присутствии растворителя при 0 - 40^oС, рН среды 7 - 8. Композиция содержит эффективное количество активного агента на основе указанного олигоэфира и фармацевтически приемлемый носитель. 3 с. и 14 з.п. ф-лы, 11 табл.

Description

Изобретение относится к олигоэфирам, их использованию, а также к способу их получения. Олигомеры по изобретению являются анионными соединениями и обладают значительной активностью против вируса человеческого иммунодефицита, а поэтому указанные олигоэфиры могут быть использованы для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа).

В настоящее время множество научных исследований направлено на разработку лекарственных средств для лечения вирусных заболеваний человека и животных. Особый интерес для ученых представляет СПИД и СПИД-ассоциированный комплекс (САК) человека, распространенность которых возрастает с угрожающей скоростью. Продолжительность жизни больных СПИДом составляет примерно 5 лет, и пациенты с этим заболеванием, чья иммунная система подвержена серьезным нарушениям, страдают от различных заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, например, саркомы Капоши, пневмоцитоза.

Эффективного средства от СПИДа пока не существует, а имеющиеся средства являются далеко не адекватными при их практическом использовании и вызывают множество неблагоприятных побочных эффектов. Страх перед заболеванием СПИДом у людей приводит к социальному остракизму и дискриминации против людей с заболеванием СПИДом или подозреваемых в этом заболеваний.

Ретровирусы принадлежат к классу вирусов, содержащих рибонуклеиновую кислоту (РНК), которая реплицируется с помощью обратной транскриптазы, образуя нить комплементарной ДНК (кДНК), из которой продуцируется двухнитевая провирусная ДНК. Эту провирусную ДНК затем методом рандомизации вводят в хромосомную ДНК хозяйской клетки, делая возможной репликацию генома вируса путем поздней трансляции вирусной РНК из интегрированного вирусного генома.

Многие из известных ретровирусов являются онкогенными или вызывают образование опухолей. В самом деле, первые два ретровируса, обнаруженные у человека, так называемые вирусы I и II лимфолейкоза или HTLV-I и II вызывают редкую форму лейкоза у человека после инфицирования Т-лимфоцитов. Третий вирус, обнаруженный у человека, HTLV-III, называемый в настоящее ВИЧ, вызывает гибель клеток после инфицирования Т-лимфоцитов и идентифицируется как возбудитель СПИДа и САК.

Белок оболочки вируса ВИЧ представляет собой гликопротеин 160 кД. Этот белок расщепляется протеазой с образованием внешнего белка 120 кД, др. 120, и трансмембранного гликопротеина, др. 41. Белок др. 120 содержит аминокислотную последовательность, распознающую антиген CD4 на Т-хелперных (Т4) клетках человека.

Некоторые исследования были направлены на попытку помешать связыванию ВИЧ с его мишенью, Т-клетками человека. Эти Т4-клетки имеют специфичную область, CD4-антиген, которая взаимодействует с др. 120. Если помешать этому взаимодействию, то инфицирование хозяйской клетки может быть ингибировано.

Интерференция путем образования вирусного оболочечного гликопротеина должна помешать начальному взаимодействию вируса и хозяйской клетки или последующему слиянию или должна помешать дупликации вируса путем предупреждения формирования собственного гликопротеина, требуемого для завершения вирусной мембраны. В работе H.A. Beough и др. /Biochem. Biophs. Res. comm. 141(1), 33 - 38 (1986)/ указывается, что неспецифичные ингибиторы гликосилирования 2-дезокси-D-глюкоза м β - гидроксинорвалин ингибируют экспрессию ВИЧ-гликопротеинов и блокируют образование синцитиев. Вирусное размножение ВИЧ-инфицированных клеток, обработанных указанными агентами прекращается вероятно из-за отсутствия гликопротеина, необходимого для формирования вирусной мембраны. В другой работе /W. Mc. Dowell и др. Biochemistry 24 (27), 8145-52 (1985)/ ингибитор гликосилирования 2-дезокси-2-фторо-D-манноза показывает ингибирование противовирусной активности против вируса гриппа и инфицированных клеток путем предотвращения гликосилирования белка вирусной мембраны. В этой работе также исследовалась противовирусная активность 2-дезоксиглюкозы и 2-дезокси-2-фторглюкозы, в результате этих исследований было обнаружено, что каждое из этих соединений ингибирует гликосилирование вирусного белка различными механизмами. Однако другие известные ингибиторы гликосилирования не обнаруживали противовирусной активности. Поэтому противовирусная активность вообще и активность против конкретного вируса ингибиторов гликосилирования является абсолютно непредсказуемой.

В Южно-африканском патенте 90/0094, выданном 31 октября 1990 года, указывается, что очищенная форма гепарина, сульфатированного полисахарида, связывается посредством взаимодействия с вирусным белком, который является ответственным за распознавание клетки, и способствует ограниченному ингибированию инфицирования хозяйской клетки. Однако гепарин оказывает некоторые побочные действия, например, вызывает геморрагию и ускоряет образование тромбов, а также вызывает тромбоцитопенид. Использование гепарина противопоказано пациентам, со склонностью к кровотечениям или пациентам с гемофилией, пурпурой, тромбоцитопенией, внутричерепным кровотечением, септическим эндокардитом, активным туберкулезом, повышенной проницаемостью капилляров, язвами желудочно-кишечного тракта, осложненной гипертензией, угрожающим абортом или раком внутренних органов. Эти противопоказания особенно касаются больных гемофилией, поскольку они особенно предрасположены к заболеванию, вызываемому ВИЧ.

Уже давно известно, что синтетические водорастворимые полимеры показывают широкий спектр биологической активности (R.M.Ottenbrite "Biological Activities of Polymers" Amer. Chem. Soc. Symp. Ser. N 182, стр. 205 - 220, изд. C.E.Carraher и C.G. Gebeleni (1982)). Сополимер поливинилового эфира и ангидрида малеиновой кислоты обладает активностью против ряда вирусов и возможность его использования в противораковой химиотерапии многие годы исследовалась Breslow D-s [Pure and Apphied. chem 46, 103 (1976)/. Полиакриловые, полиметакриловые и ряд других алифатических водорастворимых полимеров также показывают широкий спектр биологической активности /W. Regelson и др., Nature 186, 778 (1960)/. К сожалению слишком высокая токсичность этих полимеров не позволяет использовать их в клинических условиях. Кроме того, эти полимеры имеют большую молекулярную массу и неспособны проходить через почечные мембраны.

Для решения проблем, связанных с токсичностью полимеров, были предприняты попытки синтезировать низкомолекулярные алифатические полимеры (1000 - 10000) /R. M. Ottenbrite "Biological Activities Polymers". Amer Chem. Soc. Symp Ser N 182, стр. 205 - 220, изд. C.E.Carraher и C.G.Gebeleni, 1982)/. Было обнаружено, что указанные полимеры являются менее токсичными, но при этом имеют более низкую противовирусную активность. Эти низкомолекулярные алифатические полимеры могут быть классифицированы как "статистические клубки". Такие полимеры имеют непредсказуемую конфигурацию вследствие гибкости групп связи основной цепи. Конфигурация статистического клубка в растворе может быть в основном охарактеризована как глобулярная. Хотя механизм действия таких водорастворимых полимеров пока неизвестен, однако в качестве предположения, можно сказать, что полимер связывается с вирусной мембраной, например, вируса энцефаломиокардита посредством межионного притяжения, сообщая тем самым вирусу неспособность к инфицированию хозяйской клетки.

Еще один способ с использованием синтетического полимера направлен на то, чтобы поставлять ионные группы в основную цепь полимера, имеющего более определенную геометрию.

Известны низкомолекулярные водорастворимые сложные олигоэфиры молекулярной массы < 6200 на основе дикарбоновых кислот и двухатомных спиртов, которые применяются в качестве термоплавких клеев (JP, заявка, 56-147822, кл. C 08 G 63/68, 1981).

Известны олигоэфиры, содержащие сульфогруппы, которые придают водорастворимость олигоэфиру, применяемому в качестве средства для укладки волос (US, патент 4150216, кл. C 08 G 63/68, 1976).

Технической задачей изобретения является разработка фармацевтического препарата на основе олигоэфира для лечения СПИДа, который не оказывал бы побочного действия и был бы значительно более эффективным, чем те полимеры, которые использовались до настоящего времени в фармацевтике.

Было обнаружено, что анионные олигомеры ингибируют репликацию вируса, не оказывая при этом побочного действия, свойственного гепарину и известным полимерам. Указанные олигомеры имеют упорядоченное межанионное расстояние и жесткую цепь и являются водорастворимыми.

Новые олигомеры по изобретению являются анионными, карбонилсодержащими соединениями. Примерами указанных олигомеров являются сложные полиэфиры, имеющие среднечисленную мол. м. M_n < 10000 и упорядоченное межанионное расстояние и являющиеся жесткоцепными и водорастворимыми. Олигомеры, а также их соли являются фармацевтически приемлемыми и могут быть использованы в качестве лекарственных средств.

Другим применением указанных анионных олигомеров является их использование в качестве эффективных загустителей в водных растворах, или в качестве мягких ионных детергентов. В основном водорастворимые полимеры, включая олигомеры по изобретению, имеют широкое применение в качестве загустителей, диспергаторов и флокулянта. Олигомеры по изобретению могут быть использованы в нефтяной промышленности, горном деле, бумажной промышленности, текстильной промышленности, в косметике и технологии приготовления пищевых продуктов. Кроме того, низкомолекулярные полимеры по изобретению, т.е. олигомеры, могут быть использованы в качестве исходных материалов для получения высокомолекулярных полимеров и сополимеров.

Таким образом, изобретение относится к водорастворимому, жесткоцепному олигоэфиру мол. м. менее 10000, содержащему повторяющиеся звенья, связанные посредством карбонильных связывающих групп, причем указанный олигомер имеет анионные группы и в основном линейную геометрию, такую, что расстояние между анионными группами этого олигомера в водной среде, являются регулярными. Предпочтительно, если каждое повторяющееся звено имеет по крайней мере две анионных группы.

В изобретении может быть использован любой олигомер, удовлетворяющий указанным критериям. В частности, предпочтительными олигомерами являются сложные полиэфиры. Указанные олигоэфиры предпочтительно имеют линейную геометрию.

Новые олигоэфиры по изобретению, которые представлены сложными полиэфирами, имеют среднечисленную мол. м. M_n < 10000, структуру с упорядоченным механионным расстоянием в основном, линейную геометрию в водной среде и являются жесткоцепным и водорастворимым. Указанные олигомеры являются предпочтительно линейными в своей основной цепи, а также могут быть в виде соли; особенно предпочтительными солями является фармацевтически приемлемые соли.

Поставленная техническая задача изобретения решается олигоэфиром общей формулы:

где
X - означает:

n - целое число от 3 до 15;
R₄ - атом водорода или HO-X, где X определен выше, фенил или фенил, замещенный от 1 до 2 - SO₃R₂ группами,
R₂ - атом водорода или фармацевтически приемлемый катион,
R₅ является:

где
R₄ определен выше,
X₃ - является:

Термин "фармацевтически приемлемый катион" означает катион, который является допустимым для использования в фармацевтических целях. Те катионы, которые являются в основном нетоксичными при введении их в дозах, необходимых для достижения желаемого эффекта, и сами по себе не обладают значительной фармакологической активностью, также подпадают под определение "фармацевтически приемлемый катион". В качестве примера можно указать соли щелочных металлов, таких, как натрий или калий; щелочно-земельных металлов, таких, как калий и магний; соли аммония; соли металлов группы IIIA, например, алюминия; и органических первичных, вторичных и третичных аминов, таких, как триалкиламин, например, триэтиламин, прокаин, дибензиламин, N,N'-дибензилэтилендиамин, дигидроабиэтиламин, N - (C₁-C₄)-алкилпиперидин и других подходящих аминов. Предпочтительными являются соли натрия и калия. Термин "фармацевтически приемлемый" означает приемлемый для введения теплокровным животным и человеку, и поскольку фармацевтически приемлемое средство является нетоксичным, оно не причиняет вреда теплокровным животным, а также может быть использовано в фармацевтических целях. Фармацевтически приемлемые катионы олигомеров по изобретению могут быть получены путем стандартной ионообменной обработки R₁-кислоты соответствующим основанием.

Если лекарственные средства, полученные с использованием олигомеров по изобретению, предназначены для иных применений, то могут быть использованы и неприемлемые в фармацевтическом отношении соли. Например, могут быть использованы аддитивные соли бария, цинка и титана.

Олигомеры по изобретению являются низкомолекулярными, жесткоцепными и водорастворимыми полимерами. Кроме того, указанные олигомеры имеют структуру с упорядоченными межанионным расстоянием. Термин "упорядоченное межанионное расстояние" или "регулярное расстояние между анионными группами" означает, что указанные анионные группы (R₁) присутствуют в основной цепи полимера на расстоянии, определенном используемым материалом исходного реагента, и местоположение указанных анионных групп контролируется предсказуемым образом. Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, можно лишь указать, что анионные группы олигомеров по изобретению, по всей вероятности, являются той частью, которая связывается с ВИЧ и/или клеточной мембраной, предотвращая тем самым способность вируса к репликации.

Термин "преимущественно линейная геометрия" в водной среде относится к конфигурации раствора олигомера. Для оценки конфигурации полимерных молекул в растворе существует известный способ, основанный на следующей формуле, называемой уравнением Марка-Хоувинка:
[η] = K•M^α
где η - характеристическая вязкость; M - среднемассовая молекулярная масса; K - постоянная, зависящая от размера связей в цепи, α - постоянная, определяемая конфигурацией полимера. Характеристическая вязкость для полимера типа статистического клубка соответствует 0,5 < α < 0,9 , а для линейного полимера она соответствует 0,9 ≤ α < 1,8 . Эта формула выражает соотношение между вязкостью " η " и молекулярной массой "М". В изобретении линейные полимеры определяются, как полимеры со значением " α ", превышающим или равным 0,9. Для стержнеобразных жестких полимеров теоретическое значение (верхний предел) составляет 1,8. Для данной молекулярной массы более высокая вязкость раствора может быть получена с использованием полимеров с линейной конфигурацией по сравнению с вязкостью, полученной с использованием статистического клубка. Кроме того, следует отметить, что значение " α " зависит от используемого растворителя. Например, " α " для данного водорастворимого полимера могут отличаться при различных солевых концентрациях.

Термин "олигомер", используемый в описании изобретения, включает в себя олигомеры со всеми возможными значениями n, например n = 3-15. Главное, чтобы указанные олигомеры имели достаточно низкую молекулярную массу, такую, чтобы с одной стороны они проходили через почечную выделительную мембрану, а с другой стороны, чтобы они обладали способностью к ингибированию вируса ВИЧ. Среднечисловая молекулярная масса регулируется стехиометрией реагентов. Среднечисловая молекулярная масса (M_n) составляет менее 10000, предпочтительно 500-10000, а наиболее предпочтительно 1000-6000.

Предпочтительным является олигоэфир, который представляет собой поли { окси/2,2'-дисульфо(1,1'-дифенил)-4,4'-диил/окси-карбонил-1,4- фениленкарбонил} общей формулы (I), где R₄ и R₅ являются водородом, X₃-фениленом, а X является

где
n = 3-15, предпочтительно n = 4 (обозначение олигоэфира : H B P DS/TPC. Другим предпочтительным олигоэфиром является поли{-окси(-2,5- дисульфо-1,4-фенилен)оксикарбонил-1,4-фениленкарбонил} общей формулы (I), где R₄ и R₅ являются водородом, X₃ - фениленом, X является:

где
n = 3-15, предпочтительно, n = 3, олигоэфир обозначается как HBPDS/TPC.

Поставленная техническая задача решается также способом получения олигоэфира общей формулы (I), который заключается в том, что проводят взаимодействие дифенола формулы HO-X-OH, где X - обозначен выше, с бифункциональным электрофилом формулы:

где
Hal - атом хлора или брома, а X₃ обозначен выше. Процесс проводят в присутствии полярного апротонного растворителя при молярном отношении дифенола к бифункциональному электрофилу (0,9-1,2), при 0-40^oC и pH среды 7-8. После добавления электрофила смесь выдерживают 15-120 мин.

Предварительно можно проводить обработку дифенола основанием с образованием соответствующего моно- или дифеноксида перед взаимодействием с бифункциональным электрофилом.

Поставленная техническая задача решается также композицией, обладающей анти- HIV активностью, которая включает фармацевтически приемлемый носитель и активный агент, в качестве которого она содержит эффективное количество соединения формулы:

где
X - означает:

n - равно от 3 до 15, R₂ означает атом водорода или фармацевтически приемлемый катион; X₃ означает:

предпочтительно около 500 до около 10000, а наиболее предпочтительно от около 1000 до около 6000.

Композиции по изобретению могут быть изготовлены как в твердой, так и в жидкой форме. Эти композиции могут быть изготовлены в виде набора лекарственных форм таким образом, что два компонента смешивают за определенное время до начала приема. Либо к этому препарату или набору подмешивают требуемый фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.

Олигоэфиры по изобретению являются растворимыми в воде и в солевых растворах, особенно в растворе с физиологическим значением pH. Таким образом, олигоэфиры по изобретению могут быть легко приготовлены в подходящей стандартной дозе в виде водного раствора. После введения в организм олигоэфир по изобретению сохраняет свою растворимость in vivo.

АНТИ-ВИЧ анионные олигоэфиры могут быть использованы для предупреждения образования синцитиев в клетках, инфицированных ВИЧ-1 или другими родственными вирусами, имеющими поверхностный белок gp 120. Анти-ВИЧ анионные олигоэфиры могут быть использованы для лечения СПИДа и САК и других заболеваний, вызванных ретровирусом ВИЧ-1 или другими родственными вирусами, имеющими поверхностный белок gp.120. Анионные олигоэфиры по изобретению могут быть использованы в виде чистых соединений или в виде смеси, такой, в которой значение n соответствует конкретному определению формул I-IV, или смесей соединений, принадлежащих к разным указанным формулам, например соединений формулы I и формулы II, или в виде смесей с другими известными агентами, использующимися в тех же целях, что и изобретение. Однако для всех полученных олигоэфиров n представляет собой среднечисловую длину повторов распределения в олигоэфирах всех формул.

Количество анти-ВИЧ анионных олигоэфиров, необходимое для предупреждения образования синцитиев в ВИЧ-инфицированных клетках, может быть любым эффективным количеством. Экспериментально было определено, что анти-ВИЧ анионные олигоэфиры при использовании их в виде водных препаратов в концентрации 100 мгк/мл показывали полное ингибирование образования синцитиев, а также способствовали снижению количества присутствующего антигена p24, который является индикатором репликации вируса, до менее, чем 300 мг/мл. Количество анти-ВИЧ анионного олигоэфира, вводимое для лечения СПИДа и САКа, вызванных инфицированием ВИЧ, может широко варьироваться в зависимости от конкретно используемой разовой формы, периода лечения, возраста и пола пациента, природы и степени нарушений и других факторов, хорошо известных практикующим врачам. Кроме того, анти-ВИЧ анионные олигоэфиры могут быть использованы в сочетании с другими известными средствами, используемыми при лечении ретровирусных заболеваний, а также с известными средствами, используемыми для симптоматического лечения осложнений и состояний, вызванных ретровирусами.

Согласно изобретению анти-ВИЧ - эффективное количество анти-ВИЧ анионного олигоэфира, вводимого в организм, в основном, составляет около 0,1 мг/кг до 500 мг/кг на вес тела пациента и может быть введено один раз или несколько раз в день. Анти-ВИЧ анионные олигоэфиры могут быть введены в сочетании с фармацевтическими носителями, которые обычно используются при составлении стандартных разовых форм для перорального или парентерального введения.

Для перорального введения анти-ВИЧ анионные олигоэфиры могут быть использованы в виде твердых или жидких препаратов, например в виде капсул, драже, таблеток, пастилок, расплавов, порошков, растворов, суспензий или эмульсий. Твердые разовые формы могут быть изготовлены в виде капсул жесткого типа и с мягкой желатиновой оболочкой, содержащих, например, поверхностно-активные вещества, замасливатели и инертные наполнители, такие, как лактоза, сахароза, сорбит, фосфат кальция, и кукурузный крахмал. В другом варианте осуществления изобретения, анионные олигоэфиры могут быть изготовлены в виде таблеток с использованием лактозы, сахарозы, кукурузного крахмала в сочетании со связующими, такими, как аравийская камедь, кукурузный крахмал, или желатин; дизинтегрирующими агентами для облегчения разложения и растворения таблетки после введения, таких, как картофельный крахмал, альгиновая кислота, кукурузный крахмал, и хьюаровая камедь; замасливателями для улучшения текучести при гранулировании таблеток и предупреждения адгезии таблеточного материала с поверхностями экструзионных головок и пресс-форм, например, таких, как тальк, стеариновая кислота или стеарат магния, кальция или цинка; красителями и проматизирующими агентами для улучшения вкусовых качеств и внешнего вида используемых препаратов. Подходящими наполнителями для пероральных жидких лекарственных форм являются разбавители, такие, как вода, спирты, например, этанол, бензиловый спирт, и полиэтиленгликоль, которые могут быть использованы как сами по себе, так и в сочетании с фармацевтически приемлемыми поверхностно-активными веществами, суспендирующими агентами, или эмульгирующими агентами.

Анти-ВИЧ анионные олигоэфиры по изобретению могут быть также введены парентерально, то есть, подкожно, внутривенно, внутримышечно или внутрибрюшинно, в виде инъецируемых разовых форм, содержащих анионные олигомеры в физиологически приемлемых разбавителях в сочетании с фармацевтическими носителями, которыми могут быть стерильные жидкости или смеси жидкостей, такие, как вода, солевой раствор, водные растворы декстрозы и родственных сахаров; спирты такие, как этанол, изопропанол, или гексадениловый спирт; гликоли, такие, как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, глицериновые кетали, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол; простые эфиры, такие, как поли(этиленгликоль)400; масла; жирные кислоты; сложные эфиры жирных кислот или глицериды, или ацетилированные глицериды жирных кислот, которые могут быть использованы отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемыми поверхностно-активными веществами (ПАВ), такими, как мыло; детергентами; суспендирующими агентами, такими, как пектин, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, или карбоксиметилцеллюлоза; или эмульгирующими агентами и другими фармацевтическими адъювантами.

Примерами масел, которые могут быть использованы в парентеральных препаратах данного изобретения, являются нефтяное, животное, растительное или синтетическое масло, например арахисовое масло, соевое масло, кунжутное масло, масло из семян хлопка, кукурузное масло, оливковое масло, вазелиновое масло и минеральное масло. Подходящими для использования в изобретении жирными кислотами являются олеиновая кислота, стеариновая кислота и изостеариновая кислота. Подходящими сложными эфирами жирных кислот являются, например, этилолеат и изопропилмиристат. Подходящими мылами являются соли жирных кислот, образованные от щелочных металлов, аммония и триэтиламина, а подходящими детергентами являются катионные детергенты, например, галиды диметилдиалкиламмония, галиды алкилпиридиния, ацетаты алкиламинов; анионные детергенты, например, алкил-, арил- и олефиновые сульфонаты, алкилсульфаты, олефиновые сульфаты, эфирные сульфаты и сульфаты моноглицерида и сульфосукцинаты; неионные детергенты, например, оксиды жирных кислот, алканоламиды жирных кислот, и сополимеры полиоксиэтилена и полипропилена; и амфотерные детергенты, например, алкил-бета-аминопропионаты, и соли 2-алкилимидазолин-четвертичного аммония, а также их соли. Парентеральные композиции по изобретению в основном содержат от около 0,5 до около 25 мас.% анти-ВИЧ анионного олигоэфира в растворе. Кроме того, могут быть использованы консерванты и буферы. В целях минимизации или устранения раздражений в месте введения инъекции указанные композиции могут содержать неионогенные ПАВ с гидрофильным-диофильным балансом (HLB) от около 12 до около 17. Количество ПАВ в указанных композициях составляет от около 5 до около 15 мас.%. ПАВ может быть единственным компонентом, имеющим указанный HLB или может быть смесью двух или более компонентов, имеющих нужный HLB. Примерами ПАВ, которые могут быть использованы в парентеральных композициях по изобретению, являются соединения, относящиеся к классу сложных эфиров жирных кислот полиэтиленсорбитана, например сорбитанмоноолеат.

Олигоэфиры по изобретению могут быть также использованы с профилактической целью, то есть, в целях предупреждения трансмиссии вируса от инфицированного организма к неинфицированной цели. Распространение вируса пропорционально обмену крови, но его трансмиссия может быть осуществлена также путем обмена других физиологических жидкостей. Таким образом, олигомеры по изобретению могут быть составлены с использованием детергентов для использования при очистке, в частности при анализах в клинических лабораториях и больницах, где вручную обрабатываются пробы крови инфицированных пациентов. Композиции, содержащие олигоэфиры по изобретению, могут быть использованы для очистки медицинских /хирургических инструментов и посуды/, а также обработки рук и других участков кожи лаборантов в целях профилактики. Олигоэфиры по изобретению также могут быть использованы в виде жидких и порошковых композиций для наружного применения путем нанесения на поверхность противозачаточных средств, таких, как презервативы, осуществляемого либо пользователем, либо производителем указанных противозачаточных средств до их продажи. Олигоэфиры по изобретению могут быть составлены в композиции в виде влагалищных душей для использования женщинами перед половым актом с инфицированным партнером. Олигоэфиры по изобретению могут быть также изготовлены в сочетании с замасливателями в виде сперметоцидных желе и лосьонов. И наконец, олигоэфиры по изобретению могут быть также добавлены в виде композиций в горячие ванны, вибрационные ванны и плавательные бассейны в целях инактивации потенциальной вирусной активности.

Термины, используемые в описании изобретения, имеют следующие значения:
n - среднечисловая длина повторов в распределении олигомера всех формул.

RPMI - клеточные культуральные среды.

TCIDSD - единица тканевой инфекционной культуры, т.е. количество культуральной жидкости, эффективное для инфицирования 50% клеток.

MTT - бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолил.

MT4 - клеточная линия.

P24-тест-Аббот-анализ вирусного ядерного антигена с использованием набора для анализа, доставляемого Abbott.

Анализ на ВИЧ Coulter^TM - радиоиммунный анализ на определение вирусного антигена p24
ГSCD₄ - рекомбинантный растворимый CD₄, содержащий 4 экстрацитоплазматических иммуноглобулина аналогичных вариабельным (V) областям V₁ - V₄.

T - 4-метиланилин или толуидин за исключением тех случаев, когда используются термин "T4-клетки" или "T-хелперные клетки".

P - фосген.

C - п-крезол.

MBC - 4-метилбензоилхлорид.

TPC - 1,4-бензолдикарбонилхлорид или терефталоилхлорид.

TPCS - 2,5-бис хлорокарбонил бензолсульфонат натрия, имеющий формулу:

HBDS - дикалий 2,5-дигидрокси-1,4-бензолдисульфонат, имеющий формулу:

HBPDS - дикалий 4,4'-дигидрокси(1,1'-бифенил)-2,2'-дисульфонат, имеющий формулу:

PDS - 2,5-диамино-1,4-бензолдисульфоновая кислота, имеющая формулу:

BPDS - 4,4'-диамино-(1,1'-бифенил)2,2'-дисульфоновая кислота, имеющая формулу:

HBDS/TPC - поли{ окси(2,5-дисульфо-1,4-фенилен)оксикарбонил-1,4- фениленкарбонил} и представлен формулой III, где R₄ и R₅ являются водородом, X³ является п-фениленом, X является:

где
R₂ определен в формуле I.

HBPDS/TPC - поли {-окси/2,2'-дисульфо (1,1'-бифенил)-4,4'-диил/ оксикарбонил-1,4-фениленкарбонил} - и представлен формулой I, R₄ и R₅ являются водородом, X³ является п-фениленом, а X является:

и R₂ определен выше в формуле I.

Олигоэфиры получали путем модификации процедуры Кершнера (US, патент, 4895660, кл. 210/640, 1990) путем замещения части одного из бифункциональных мономеров монофункциональным регулятором молекулярной массы и проведения реакции в отсутствие ПАВ. Среднечисловая молекулярная масса (V_n) регулировалась посредством стехиометрии реагентов.

Пример A. Получение HBPDS формулы:

В 2-литровой колбе, снабженной воронкой для добавления и стержнем магнитной мешалки, добавляли 49,99 г (0,145 М) 4,4'-диамино (1,1'-бифенил)-2,2'-дисульфоновой кислоты и 600 мл воды. Диамин солюбилизировали путем добавления 30 мл (0,15 М) 5 М NaOH. К полученному раствору добавляли 20,56 г (0,298 М) нитрата натрия. Затем реакционную смесь охлаждали до 0^oC и в течение 30 мин добавляли концентрированную H₂SO₄, растворенную в 360 мл воды. В результате образовывалось желтое твердое вещество. Затем к смеси добавляли 300 мл воды и смесь поддерживали при 0^oC в течение 1 ч. Затем реакционную смесь фильтровали. Желтое твердое вещество, растворенное в 800 мл воды, помещали в 1-литровую колбу и нагревали до тех пор, пока не останется 50 мл воды. Азот выделялся в течение нагревания. К концентрированному раствору добавляли 20,14 г (0,146 М) K₂CO₃ после чего раствор кипятили. Затем добавляли абсолютный этанол (1,5 л) и полученное коричневое твердое вещество осаждали. Осадок отфильтровывали и осушали в течение ночи в печи при 50^oC. Продукт, HBPDS, получали с выходом 32,33 г (53%), а затем анализировали с помощью Н¹ЯМР.

¹Н ЯМР δ 6,70 (дд, 1H), 7,05 (д, 1H), 7,14 (д, 1H).

Пример B. Получение TPCS формулы:

В 500-мл колбу, снабженную механической мешалкой, термометром и дефлегматором, загружали 40,49 г (0,143 М) мононатриевой соли 2-сульфотерефталевой кислоты, 160 мл хлорбензола, 2,4 мл (0,031 М) диметилформамида, и 23 мл (0,315 М) тионилхлорида. Раствор нагревали до 105^oC и размешивали в течение 2 ч в атмосфере азота. В течение этого периода отмечалось выделение газа. Раствор охлаждали до комнатной температуры и твердое вещество осаждали. Осадок фильтровали и осушали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре. В результате чего получали твердый бледно-желтый продукт с выходом 20,56 г (47%).

Для подтверждения структуры продукта некоторое количество продукта превращали в его сложный метиловый эфир.

В 25-мл колбу, снабженную стержнем магнитной мешалки и барботером для азота, добавляли 0,9509 г (3,12 мМ) полученного продукта 0,6874 г (6,47 мМ) Na₂CO₃ и 10 мл метанола. Реакционную смесь размешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере азота, после чего твердое вещество отфильтровывали, осушали в вакуумной печи в течение 6 ч при комнатной температуре и затем определили, что образовавшийся сложный диметиловый эфир продукта имеет следующие данные:
¹H ЯМР ( δ ) 3,34 (с, 6H), 7,39 (д, 1H), 7,97 (д, 1H), 8,26 (с, 1H).

¹³C ЯМР ( δ ): 58,0; 136,0, 139,8, 140,9, 145,2, 146,8, 150,1, 183,5, 186,4.

Получение олигоэфира.

Пример 1. Получение HBP/TPC формулы:

Олигомер A(n=4)
В 500-мл колбу, снабженную дефлегматором, воронкой для добавления и механической мешалкой, загружали 7,92 г (18,7 мМ) HBPDS, 3,16 г (37,6 мМ) бикарбоната натрия, 125 мл воды, и 25 мл метиленхлорида. К размешанной реакционной смеси добавляли 3,8 г (18,7 мМ) TPC в 100 мл метиленхлорида в течение 1 ч. Полученный раствор размешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Затем раствор переносили в 2-литровую колбу и добавляли 100 мл воды, использованной для промывки реакционного сосуда. Для расслоения эмульсии добавляли ацетон в избытке 250 мл. После добавления 1000 мл ацетона, на дне колбы образовывалось твердое вещество, которое на вид было похоже на шарики, наполненные водой. Раствор фильтровали, осаждали 750 мл ацетона, снова фильтровали и осушали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре. В результате получали 4,89 г коричневого твердого продукта, характеристическая вязкость которого составляла 0,16 дг/г в воде, а M_n = 2100. Затем продукт анализировали:
¹H ЯМР δ : 2,2 (с); 7,0 (шир.с); 7,25 (шир.с); 7,5 (шир.с); 8,0 (шир.с).

Пример 2. Получение HBDS/TPC формулы:

Олигомер A(n=3)
Повторяли процедуру примера 6 с использованием следующих количество реагентов, приведенных в табл.1.

Полученный раствор размешивают в течение 1,5 ч при комнатной температуре в присутствии азота. Затем раствор переносили в 1-литровую колбу и добавляли 100 мл воды, использованной для промывки реакционного сосуда. В колбу добавляли 450 мл ацетона для расслоения эмульсии. В нижнем слое воды образовался осадок. Затем раствор переносили в делительную воронку и низший слой отделяли. Затем водный раствор обрабатывали 500 мл ацетона. Образовавшееся твердое вещество фильтровали и осушали 2 дня в вакуумной печи при комнатной температуре. В результате получали продукт весом 4,38 г и с характеристической вязкостью 0,05 дл/г. Анализ с помощью ¹H ЯМР и ЖХВД показали значительное количество исходного дифенола.

Для удаления непрореагировашего исходного материала, 2,0 г указанного твердого продукта растворяли в 200 мл воды. Продукт осаждали путем добавления 700 мл ацетона, фильтровали и осушали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре. В результате получали 0,41 г твердого продукта, который имел характеристическую вязкость 0,11 дл/г в воде и M_n=1300.

Биологические данные
Пример 1. Способность анти-ВИЧ-олигомера для предупреждения образования синцитиев и экспрессия антигена P24-вирусного ядра с использованием JM-клеток и вирусного штамма GB8.

Для того, чтобы показать, что олигомер по изобретению блокирует ВИЧ-инфекцию, T-клетки CD4⁺(JM) подвергали воздействию клинического изолята ВИЧ-1, GB8. Сначала вирус инкубировали с олигомером в течение 15 мин, а затем добавляли клетки. После 2-часовой адсорбции, вирусный инокулят удаляли, а клетки промывали три раза для удаления следов введенного вируса. Противовирусную активность определяли после 3-дневной инкубации путем построения графической зависимости среднего числа синцитиев, обнаруженных в четвертичных культурах от log₁₀ - концентрации анионного полимера или других испытуемых соединений. Способность олигомера также измеряли путем анализа на антиген вирусного ядра (P24 тест-Абботт) в надосадочной жидкости. В качестве положительного контроля использовали гепарин, декстрансульфат, SCD4 ATZ или ddC-данные, которые приведены в табл. 2-11.

Пример 11. Инфицирование вирусом JM-клеток осуществляли в присутствии различных концентраций испытуемых соединений. JM-клетки (1 • 10⁵) и 50-100 синцитийобразующих единиц вируса (GB3) добавляли в дублированные лунки планшеты для тканевых культур, содержащих 1 мл объемов среды для выращивания без лекарственного средства и с содержанием лекарственного средства. Планшету инкубировали в течение 2 дней при 37^oC, а затем анализировали на присутствие синцитиев. В то же время клетки промывали и культуральную среду заменяли. Затем инкубировали еще два дня, бесклеточные супернатанты собирали и анализировали на концентрацию антигена P24-вирусного ядра с использованием анализа Coulter^Т.М на ВИЧ-антиген. Результаты анализа приводятся в табл. 3-5. В табл. 3-5. N.D = не обнаружено и N.A = не анализировали.

Пример III. Способность различных анти-ВИЧ-олигомеров к предупреждению гибели вирус-индуцированных клеток с использованием MT4-клеток и штамма RF.

Различные олигомеры растворяли в RPMI-среде, а затем анализировали на анти-ВИЧ-активность путем удвоенных разведений растворов на 96-луночной планшете для микротитрования. Затем к каждой лунке добавляли 5•10⁴ клеток и 100 TCID 50 вируса и планшеты инкубировали в течение 7 дней при 37^oC. Затем к каждой лунке добавляли MTT и планшеты инкубировали еще 2 ч. Голубые кристаллы формазана растворяли, используя кислый изопропанол и измеряли поглощение при 540 нм. Результаты предоставлены в табл. 5.

Пример IV. Исследование способности к предварительной обработке клеток различными олигомерами и к блокированию инфицирования ВИЧ-1 с использованием JM-клеток и GB8-штамма ВИЧ-1.

JM-клетки предварительно обрабатывали в течение ночи при 37^oC различными соединениями при 20 мкг/мл или оставляли необработанными. Клети промывали 3 раза в RPMI-среде, а затем инфицировали ВИЧ-1 (GB8) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем клетки опять промывали 3 раза в RPMI-среде, ресуспендировали в свежей среде для их распределения в дублированных лунках, и инкубировали при 37^oC. Через 2 дня подсчитывали синцитии, а бесклеточные супернатанты собирали и анализировали на присутствие антигена вирусного ядра P24, используя анализ на ВИЧ-антиген

. Результаты представлены в табл. 6.

Пример V. Исследование способности анти-ВИЧ-1-олигомеров к предупреждению образования синцитиев и экспрессия антигена P24-вирусного ядра с использованием различных вирусных штаммов (GB8 и RF) и клеток (JM и C8 166).

Клетки инфицировали штаммом RF или GB8 в течение 24 ч при 37^oC при множественности инфекции 0,001. Клетки промывали три раза для удаления остаточного вируса, а затем снова помещали на свежую культуральную среду. После чего клетки обрабатывали указанными концентрациями испытуемых соединений через 24 и 48 ч после инфекцирования (p.i). Через указанное количество дней p.i, определяли уровни синцитиев и P24 описанными способами. Результаты представлены в таблицах 7 - 9.

Результаты табл. 7 показывают, что вирус-индуцированные цитопатологические изменения, такие, как образование синцитиев, могут быть ингибированы даже, если соединения вводятся в уже инфицированные клетки. Эти результаты также показывают, что анионные олигомеры действуют по механизму блокирования связывания вируса с поверхностным белком клеток CD₄.

Результаты табл. 8 показывают, что олигомеры по изобретению являются эффективными против различных вирусных штаммов и различных типов клеток, даже если эти олигомеры добавляют через 24 ч после инфицирования вирусом.

Через 48 ч p.i. в контрольных лунках наблюдали приблизительно 50 синцитий/лунка. В то же время, лунки загружали 5 мкг/мл олигомера примера 1А и затем инкубировали. Синцитии подсчитывали на 3-й день p.i. На 4-й день p.i. клетки промывали в среде, содержащей 5 мкг/мл олигомера примера 1А, и затем инкубировали в 5 мкг/мл олигомера примера 1А. Вирус-контрольные клетки промывали в среде, не содержащей испытуемые соединения, и снова инкубировали параллельно. На 6-1 день p.i. бесклеточную среду всех образцов собирали и определяли уровни антигена вируса P24.

Результаты этих исследований показали, что олигомеры примера 1А очищают культуры от синцитиев, стабилизируют от инфекции и снижают уровни антигена вируса в клетках, зараженных вирусом.

Пример VI. Протокол: C8166-клетки инфицировали ВИЧ (штаммом RF) в течение 1 ч при комнатной температуре до получения множественности инфекции приблизительно 0,01 инф.ед. на клетку. Затем клетки промывали три раза, ресуспендировали в свежей среде и распределяли по дублированным лункам, содержащим различные концентрации испытуемого соединения. После выдерживания в течение 2 дней при 37^oC, клетки исследовали на присутствие синцитиев, а супернатант анализировали на антиген P24-вирусного ядра, используя метод анализа на ВИЧ-антиген Coulter.

Пример VII. JM-клетки инфицировали ВИЧ (штаммом GB8) и получали приблизительно 200 синцитий/1•10⁵ клеток через 3 дня после заражения; инфицирование вирусом проводили в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки промывали и ресуспендировали в свежей среде, распределяли по дублированным лункам планшеты для тканевой культуры, содержащим различные концентрации испытуемых соединений. Через 3 дня клетки исследовали, синцитии подсчитывали, а супернатант анализировали на антиген P24-вирусного ядра с использованием метода ВИЧ-Ag - анализа Coulter.

Claims (15)

1. Водорастворимый, жесткоцепной олигоэфир с мол.м. менее 10000, содержащий повторяющиеся звенья, соединенные карбонильными группами, с анионными группами и линейной геометрией общей формулы I

где X -

n - целое число 3 - 15;
R₄ - атом водорода или HO-X, где X имеет указанные значения, фенил или фенил, замещенный 1 - 2 - SO₃R₂-группами;
R₂ - атом водорода, или фармацевтически приемлемый катион;
R₅ -

где R₄ имеет указанные значения;
X₃ -

2. Олигоэфир по п.1, в котором повторяющееся звено имеет две или более анионные группы.

3. Олигоэфир по п.1, который существует в виде фармацевтически приемлемой соли.

4. Олигоэфир по п.1, среднечисловая мол.м. которого равна 500 - 10000.

5. Олигоэфир по п.4, среднечисловая мол.м. которого равна 1000 - 6000.

6. Олигоэфир по п.1, где R₄ и R₅ - водород, X₃ -

X -

где R₂ имеет значения, приведенные в п.1.

7. Олигоэфир по п.6, который представляет собой поли-{окси[2,2'-дисульфо (1,1'-дифенил)-4,4'-диил] оксикарбонил-1,4-фениленкарбонил} общей формулы I, где R₄ и R₅ - водород, X₃ - п-фенилен, X -

R₂ и n имеют значения, указанные в п.1.

8. Олигоэфир по п.7, где n = 4.

9. Олигоэфир по п. 6, который представляет собой поли-[-окси(2,5-дисульфо-1,4-фенилен) оксикарбонил-1,4-фени ленкарбонил] формулы I, где R₄ и R₅ - водород, X₃ - фенилен, X -

где R₂ и n имеют указанные значения.

10. Олигоэфир по п.9, где n = 3.

11. Способ получения олигоэфира по п.1, заключающийся в том, что проводят взаимодействие дифенола формулы
HO - H - OH,
где X

с бифункциональным электрофилом формулы

где Hal - атом хлора или брома;
X₃ -

причем процесс проводят в присутствии полярного апротонного растворителя или в смеси воды и водорастворимого растворителя, при мольном отношении дифенола к бифункциональному электрофилу (0,9 - 1,2) при 0 - 40^oС и pH среды 7 - 8.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что после добавления бифункционального электрофила смесь выдерживают в течение 15 - 120 мин.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что проводят предварительную обработку дифенола основанием с образованием соответствующего моно- или дифеноксида перед взаимодействием с бифункциональным электрофилом.

14. Композиция, обладающая анти- HIV активностью, включающая активный агент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного агента она содержит эффективное количество соединения формулы II

где X -

n = 3 - 15;
R₂ - атом водорода или фармацевтически приемлемый катион;
X₃ -

15. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что в качестве активного агента содержит соединение формулы II, где n = 4 и X имеет формулу

где R₂ имеет значения, определенные в п.14.

16. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что в качестве активного агента она содержит соединение формулы II, где n = 3, X -

где R₂ имеет значения, определенные в п.14.

17. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что дополнительно содержит детергент.

Images