WO1995027787A1 - Fragment peptidique de la proteine g du virus respiratoire syncytial, agent immunogene, composition pharmaceutique le contenant et procede de preparation - Google Patents

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Ngoc Thien N'guyen
Thierry Baussant
Michel Trudel
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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
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    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to polypeptides which can be used in particular in the preparation of immunogens and the obtaining of a vaccine against respiratory syncytial virus (RSV) and to nucleotide sequences making it possible to obtain them.
  • the invention also relates to an adjuvanting immunity protein extracted from Klebsiella pneumoniae, to compositions containing the immunogenic polypeptides, optionally associated with such an adjuvanting protein, as well as to their process of preparation.
  • the respiratory syncytial virus (RSV) is the most common cause of respiratory diseases in newborns: bronchopneumopathies
  • RSV is classified in the family of Paramyxoviridae, genus pneumovirus comprising a non-segmented RNA genome, of negative polarity, coding for 10 specific proteins.
  • RSV structural proteins for a vaccine such as the envelope proteins called protein F (fusion protein) or protein G, a 22 Kd glycoprotein, a protein of 9.5 Kd, or the major capsid protein (protein N).
  • RSV infections of the upper airways treatment is essentially based on symptomatic medications identical to those of other viral infections.
  • RSV infections of the lower airways treatment in infants is based on maintaining proper hydration, aspirating secretions and administering oxygen if necessary.
  • a positive effect has been observed with ribavirin, a nucleotide active in vitro against RSV.
  • the subject of the present invention is a polypeptide useful in particular in the production of immunogen, characterized in that it is carried by the peptide sequence comprised between the amino acid residues 130 and 230 of the protein sequence G of the respiratory syncytial virus, or by a sequence having at least 80% homology with said peptide sequence.
  • This sequence differs slightly for subgroups A and B of human RSV, or for bovine RSV.
  • the invention includes sequences from human RSV subgroup A and B, or bovine
  • Protein G is an RSV envelope glycoprotein, with a molecular weight between 84 and 90 Kd, poor in methionine.
  • the Applicant has demonstrated that the sequence between amino acids 130 and 230 of the natural protein G is particularly suitable for inducing effective protection against infection by RSV.
  • the invention includes sequences from human RSV subgroup A or B, or bovine.
  • the present invention relates to polypeptides, useful in particular as an immunogenic element included in the preceding one and which comprise the peptide sequence comprised between the amino acid residues numbered 174 and 187 of the protein G of RSV (human, subgroups A and B , or bovine) or a sequence having at least 80% homology with the corresponding sequence.
  • Other peptide sequences suitable for the preparation of an immunogen included in said sequence of the RSV G protein consist of the sequence between the amino acid residues numbered 171 and 187 of the G protein of the human or bovine RSV, or a sequence having at least 80% homology with the corresponding sequence.
  • Other peptides of interest according to the present invention are carried by the sequence between the nucleotides numbered 158 and 190 of the GRS protein of RSV or a sequence having at least 80% homology with the corresponding sequence.
  • the subject of the invention is peptides useful for the preparation of an immunogen and which have a sequence corresponding to the sequence between the amino acid residues numbered 140 and 200 of the protein G of human RSV or bovine, or a sequence with at least 80% homology with the corresponding sequence. Sequences starting at amino acid 140 of said protein G of RSV and whose C-terminal end corresponds respectively to amino acid 198, 196, 194, 192, or 190, as well as sequences having at least 80% of homology with the sequences carried by these fragments are particularly advantageous.
  • polypeptides which comprise a sequence in which:
  • amino acids at positions 176 and 182 are capable of forming a covalent bridge other than a disulfide bridge, in particular aspartic acid and ornithine.
  • polypeptide sequence 130-230 of the RSV subgroup A can be used complete, in its native form. This sequence corresponds to the sequence noted Seq id n ° 1 (or G2A).
  • the complete polypeptide sequence 130-230 of the RSV in group B can be used, in its native form. This sequence corresponds to the sequence noted Seq id No. 2 (G2B). The sequence id n ° 1 will be noted G2A in the rest of the request.
  • sequence id no 2 will be noted G2B in the rest of the request.
  • Sequences with at least 80% homology with G2A or G2B are also suitable.
  • amino acids 130 and 230 can be modified by replacing the cysteine residues at positions 173 and 186 with serine residues to obtain a peptide retaining good immunogenic properties, by maintaining the loop formed by the Cys residues in positions 176 and 182.
  • the amino acid and nucleotide sequences of this polypeptide for the subgroup A are shown in seq id No. 3 (G2A ⁇ Cys).
  • subgroup B the amino acid and nucleotide sequences are shown in seq id No. 4 (G2B ⁇ Cys).
  • the peptide sequences will be noted G2A ⁇ Cys and G2B ⁇ Cys.
  • the subject of the invention is a polypeptide useful for the preparation of immunogen, characterized in that it consists of the peptide sequence comprised between the amino acid residues numbered 174 and 187 of the protein G of the RSV or a sequence having at least 80% homology with said peptide sequence.
  • the peptide 174-187 subgroup A can have the sequence:
  • amino acid residues at positions 176 and 182 are respectively replaced by an aspartic acid and an ornithine, so as to obtain the one of the following sequences:
  • Maintaining the immunogenic properties is obtained by replacing the disulfide bridge (between natural Cys) with an amide bridge between positions 176 and 182.
  • the subject of the invention is also a polypeptide which can be used as an immunogenic agent having one of the preceding sequences and which also comprises at least one cysteine residue in the N-terminal or C-terminal position.
  • the invention also includes a polypeptide which consists of the peptide sequence between amino acid residues numbered 130 and 230 of the RSV protein G sequence subgroup A and subgroup B, or a sequence having 80% homology with said peptide sequence and which is in the form of a fusion protein with the human serum albumin receptor, named BBG2A ⁇ C or BBG2B ⁇ C, or another binding protein.
  • BBG2A ⁇ C or BBG2B ⁇ C a fusion protein with the human serum albumin receptor
  • the complete BB protein sequence is given in the appendix (Seq ID No. 74).
  • the invention also includes, for example glycosylated or sulfated variants of the different peptides, whether these functions are natural or not.
  • polypeptides can be prepared by peptide synthesis or by recombinant DNA techniques, which are known to those skilled in the art.
  • sequences of the gene coding for the epitope of approximately 100 amino acids can be prepared by assembly of genes in solid phase, and the corresponding protein expressed for example in E. coli by the intracellular route.
  • RNA or DNA The nucleotide sequences (RNA or DNA) coding for the proteins or polypeptides defined above form part of the invention.
  • Another object of the invention is an immunogenic agent which comprises a polypeptide as defined above coupled to a carrier protein, in particular to an adjuvanting protein of immunity.
  • the polypeptide according to the invention is coupled to a carrier protein of the OmpA type of the external membrane of a bacterium of the genus Klebsiella, preferably in the form of a soluble conjugate.
  • the Applicant has been able to show that while the variants of the 174-187 sequence of the RSV protein G are weakly immunogenic, their coupling with such a protein induces a specific immune response.
  • the intensity of the immune response was compared with that obtained with conventional adjuvants, such as coupling to the carrier KLH (keyhole limpet hemocyanin) coadministered with the adjuvant of Freund, or coupling to the carrier protein TT (tetanus toxoid) .
  • conventional adjuvants such as coupling to the carrier KLH (keyhole limpet hemocyanin) coadministered with the adjuvant of Freund, or coupling to the carrier protein TT (tetanus toxoid) .
  • compositions containing an immunogenic polypeptide according to the invention coupled to the p40 protein of Klebsiella pneumoniae or a protein having 80% homology with the p40 protein are particularly advantageous results.
  • polypeptide is coupled to a protein comprising the peptide sequence noted Seq id No. 13.
  • the nucleotide sequence (DNA or RNA) coding for the protein comprising the sequence id No. 13 is included in the invention.
  • the immunogenic polypeptide can be coupled to the adjuvanted immunity protein by methods known to those skilled in the art such as:
  • the polypeptide can be conjugated to the carrier protein by a binding protein, for example the human serum albumin (BB) receptor.
  • a binding protein for example the human serum albumin (BB) receptor.
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of a conjugated peptide entering into a composition useful for the prevention or treatment of RSV conditions, characterized in that:
  • the proteins are subjected to anion exchange chromatography to separate the fraction containing the adjuvanted immunity protein
  • the adjuvanted immunity protein is conjugated with an immunogenic polypeptide as defined above to form a soluble conjugate.
  • the divalent cation salt used in step a) is preferably a calcium or magnesium salt. After centrifugation, the proteins of the supernatant can be recovered with good yield by two precipitations with ethanol.
  • the membrane proteins after resuspension, are separated on an anion exchange column, usable under industrial conditions.
  • This chromatographic support is very stable and compatible with drastic depyrogenation treatments, which was not the case with the chromatographic supports already described.
  • the elution of the protein can be carried out under isocratic conditions and not by application of an NaCl gradient (as described above), which is particularly advantageous under industrial conditions.
  • a second chromatography step is carried out, on a cation exchanger, and the fractions containing the adjuvant protein are recovered, which are concentrated. This additional step allows better elimination of lipopolysaccharides.
  • the adjuvant protein is then conjugated with an immunogenic polypeptide according to the invention.
  • the subject of the invention is a composition useful for the prevention and / or treatment of conditions caused by RSV, characterized in that it contains a polypeptide characterized above.
  • compositions also contain pharmaceutically acceptable excipients suitable for administration by the injectable route.
  • compositions results in protection, not by a neutralizing effect, but by a systemic immune response of the organism.
  • the humoral and cellular responses are caused by the product which also induces long-term protection and an immunological memory against RSVs in groups a and b.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a conjugate between an immunogenic peptide and a Klebsiella membrane protein, in particular the p40 protein of K. pneumoniae, in which the coupling is carried out in the presence of glutaraldehyde with concentrations less than or equal to 0.05%.
  • the conjugated peptide can be frozen and used as it is or freeze-dried.
  • sequence polypeptide noted G 1 A is prepared by solid phase synthesis using chemistry
  • the assembly of the peptide is carried out by peptide synthesis in solid phase on polystyrene (divinylbenzene 1%), starting with a Boc-Lys (2-cl-Z) -phenylacetamidomethyl binding agent.
  • the coupling is carried out in DMF with a preformed hydroxybenzotriazole ester for 30 min. It is checked at each step of the coupling, if residual free amino functions are present, by the ninhydrin test. If necessary, a double coupling is carried out.
  • the following side chain protection groups were used:
  • the formyl group is removed by treatment for 30 min with a 25% piperidine solution in DMF.
  • the peptide resin is washed with DCM and ether, and dried under reduced pressure.
  • the peptide is cleaved from the resin and completely deprotected by a treatment with liquid hydrogen fluoride. 10 ml of Hydrogen Fluoride per gram of peptide-resin are conventionally used at 0 ° C for 45 min in the presence of p-cresol and ethanedithiol as a trap. After evaporation of the hydrogen fluoride, the crude reaction mixture is washed with ether, dissolved in TFA, precipitated with ether and dried.
  • the crude peptide obtained after cleavage is purified under the conditions described above (gradient from 20 to 50% B).
  • the fractions having a purity greater than 70-80% (HPLC) are combined and lyophilized.
  • the peptide is then purified in a mixture of acetonitrile water and DMSO (1 mg / ml) and left under stirring until the cyclization is complete (4 to 6 days).
  • the progress of the reaction is monitored by HPLC.
  • the reaction mixture is finally concentrated on the preparative HPLC column and a gradient of 15 to 40% of B is applied over 30 min in order to purify the peptide.
  • the hybridization mixture is incubated at 70 ° C for 5 min and allowed to return to 37 ° C before adding 3 units of T4 DNA ligase (BRL) followed by 15 min of incubation at 37 ° C.
  • the reaction mixture is rinsed before adding 0.2 pmole of the following oligo.
  • the hybridization / ligation procedure is repeated as many times as a new 5 'phosphorylated complementary oligo is added.
  • the DNA duplex fixed on magnetic beads can be separated from the support by cutting with the appropriate restriction enzymes.
  • the DNA corresponding to the sequence G2A ⁇ Cys and to the sequence G2A ⁇ Cys linked to the human serum albumin (BB) binding protein denoted BB-G2A ⁇ Cys is prepared.
  • the nucleotide sequence is expressed in E. coli to recover the corresponding proteins.
  • pVABBG2A ⁇ C is an intracellular type expression vector, it contains a promoter of E. coli origin, the tryptophan (Trp) operation, followed by the gene coding for the human serum albumin receptor BB (P- ⁇ Nygrén and col , J. Mol. Recognit., 1988, 1, 60) and finally the gene coding for G2A ⁇ C of the RSV. Expression of the heterologous gene can be induced in the presence of IAA (3- ⁇ -indolacrylic acid).
  • the BBG2A ⁇ C fusion product can be purified by affinity on an HSA-sepharose column, after having released the cytoplasmic proteins of E. coli.
  • the E. coli RV 308 strain (Maurer et al., J. Mol. Biol., 1980, 139, 147) transfected with the plasmid pVABBG2A ⁇ C, was selected on agar containing ampicillin (100 ⁇ g / ml) and tetracycline (8 ⁇ g / ml).
  • the strain is inoculated into an Erlenmeyer flask containing 100 ml of TSB culture medium (Tryptic Soy broth, Difco) (30 g / l), supplemented with yeast (Yeast Extract, Difco) (5 g / l), Ampicillin (100 ⁇ g / ml), tetracycline (8 ⁇ g / ml) and Tryptophan (100 ⁇ g / ml). Incubate at 32 ° C for 12 hours with shaking (190 rpm). Transfer the culture to another Erlenmeyer flask (5 liters) containing four times the initial volume (400 ml TSB + yeast + the same antibiotics at the same concentration).
  • the production of the proteins is induced by adding to the medium IAA at the final concentration of 25 ⁇ g / ml.
  • the culture is stopped after 5 hours of incubation, with shaking (190 rpm) at 32 ° C. After centrifugation, the bacterial pellet is resuspended in a container containing approximately 60 ml of TST solution (50 mM TrisHCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.5 mM EDTA) in the cold.
  • TST solution 50 mM TrisHCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.5 mM EDTA
  • a standard sonicator probe (VIBRA-CELL, Somics Mat, USA) is introduced into the container. Sonication is made at power 5 for approximately two minutes. The solution supernatant after centrifugation is filtered at 0.45 ⁇ m, and passed through a column containing approximately 3 ml of HSA-sepharose gel (STAHL et al, J. Immunol. Meth., 1989, 124, 43).
  • the purified proteins are analyzed by SDS-PAGE on the Phast System device (PHARMACIA) or on Mini Protean BIORAD.
  • the gels are revealed by Coomassie blue.
  • the BBG2A ⁇ C protein, representing more than 90% purity, corresponds well to the expected size (39.3 Kda) compared to the known molecular weight standards.
  • the immunoblot of this protein on a Problott membrane makes it possible to identify it with specific antibodies, anti-BB and / or anti-G protein of RSV (ss-group A).
  • the yield of soluble proteins purified from the cytoplasm of E. coli is approximately 50 mg / liter of culture.
  • Example 3 Isolation and purification of the natural p40 protein
  • the biomass of Klebsiella pneumoniae (strain 1-145, 40 g of dry cells) is adjusted to pH 2.5 using pure acetic acid.
  • the pellets obtained after the second precipitation are resuspended in a solution of zwittergent 3-14, 1%.
  • the proteins of the MP fraction are dialyzed against a buffer
  • the fractions containing P40 are combined and dialyzed against a 20 mM citrate buffer, pH 3.0; zwittergent 3-14, 0.1%.
  • the P40 protein is eluted for a 0.7 M NaCl concentration.
  • the fractions containing P40 are combined and concentrated by ultrafiltration using a Minitan Millipore tangential flow filtration system used with membrane plates having a cutoff threshold of 10 kDa.
  • the fractions obtained after each chromatographic step are analyzed by SDS-PAGE in order to gather those containing the P40 protein.
  • the amounts of protein are measured by the Lowry method (Table I).
  • the purity and homogeneity of the P40 protein are estimated by SDS-PAGE, in the presence of molecular weight standards.
  • the P40 protein is devoid of the major contaminant present in the MP fraction (the protein having an apparent molecular mass of 18 kDa) and has a degree of purity greater than 95%.
  • the electrophoretic profile of the P40 reveals several bands. These bands are recognized after immunoblotting by P40 monoclonal antibodies obtained in mice.
  • the upper major band corresponds to the denatured protein (by treatment at 100 ° C, 15 min. In the presence of SDS), and the lower minor band to the protein in its native form.
  • P40 is indeed a so-called "heat-modifiable” protein, and we were able to verify this property using heating kinetics at 100 ° C. in the presence of SDS. Without heating, the protein in native form has an ⁇ -helical structure which fixes more SDS and therefore migrates further towards the anode than the denatured form (complete denaturation after 5 min. At 100 ° C) which has a ⁇ -sheet structure (KB KELLER (1978) J. Bacteriol. 134, 1181-1183).
  • LPS lipopolysaccharides
  • This method is used to approximate the LPS content of the samples from the different purification steps.
  • the amount of ß-hydroxymyristic acid present in the P40 fraction after cation exchange chromatography being less than the quantification threshold of the assay, it can be estimated that the amount of residual LPS is less than 1%.
  • RV 308 strain ATCC 31608 (MAURER R., MEYER B.J., PTASCHNE M., J. MOL. BIOL, 1980, 139,147-161).
  • K. pneumoniae IP 145: strain C.I.B.P.F - VECTORS
  • pRIT 28 Hultman et Col, 1988,7: 629-638: cloning and sequencing vector possessing the ampicillin resistance gene, the origins of replication of E. coli and of phage F1 as well as a portion of the E. coli lac-z gene (ß-galactosidosis).
  • pVABB gene fusion expression vector.
  • the nucleotide primers were determined from the part of the published sequence of the OMPA of Klebsiella pneumoniae (LAWRENCE, GJ, et al, Journal of gênerai microbiology, 1991, 137, 1911-1921) of the conscientious sequence resulting from l alignment of 5 OMPA sequences of enterobacteria (E.coli, S.tryphimurium, S.marcescens, S.dysenteriae, E.aeroginosae), as well as peptide sequences obtained by manual sequencing.
  • the oligonucleotides were synthesized according to the chemical method of phosphoramidites on the "Gene Assemble Plus" apparatus from Pharmacia.
  • the OPA DNA of Klebsiella pneumoniae was amplified as follows.
  • a colony of Klebsiella pneumoniae is lysed in 10 ⁇ l of lysis buffer by heating at 95 ° C for 5 minutes.
  • amplification buffer see annex
  • a unit of Taq polymerase enzyme Perkin Elmer Cetus
  • Each cycle comprises a denaturation step of 30 seconds at 95 ° C followed by hybridization of the primer to DNA and an extension of one minute at 72 ° C. 30 cycles are thus carried out using a 9000 Perkin Elmer Cetus "Gen Amp PCR" thermal cycler.
  • amplified DNA fragments are then digested, purified and linked to the pRIT 28 vector.
  • the fragments thus cloned are sequenced on an automatic sequencer 373 DNA Sequencer of Applied Biosystem.
  • the sequencing reactions are carried out using the “dye Terminator” kit according to the supplier's recommendations (Applied Biosystem) either on double strand DNA obtained after gene amplification or from maxiprep or on single strand DNA from denatured PCR fragments (Hultman et Col, Nucleid acids res.; 1989, 17: 4937-4946).
  • the entire P40 gene is cloned into the expression vector pVABB.
  • This vector makes it possible to add an affinity tail "BB" to P40; B being the part of the G protein of the streptococcus which binds the serum albumin (Nygren P.A et Col; Journal mol. Recognit. 1988; 1, 69-74).
  • the E. coli RV308 strains transformed by the vector pVABBP40 are cultivated overnight at 37 ° C. with stirring, in 100 ml of TSB supplemented with yeast extract, in ampicillin (200 ⁇ g / ml) in tetracycline (8 ⁇ g / ml) and tryptophan (100 ⁇ g / ml).
  • the expression of the protein is induced by adding IAA to (25 ⁇ g / ml) in the medium.
  • the culture is centrifuged at 4 ° C at 2460 g for 10 minutes.
  • the pellet is taken up in 20 ml of TST 1 x pH 7.4, and the test solution then centrifuged at 4 ° C at 23,000 g for 30 minutes.
  • the supernatant is passed over Sepharose which allows the isolation of so-called soluble proteins.
  • the pellet is washed with washing buffer and then centrifuged at 23,000 g at 4 ° C for 30 minutes.
  • the pellet containing the inclusion bodies is then taken up in 900 ⁇ l of a denaturing solution +
  • the solution is then incubated overnight at room temperature, with shaking, in 100 ml of renaturation buffer at 2300 g for 1 hour.
  • the supernatant is passed over HSA Sepharose.
  • the fixed proteins are eluted with 0.5 M acetic acid pH 2.8 and collected in 1 ml fraction.
  • the cloning of the gene was carried out in three stages according to the strategy presented in FIG. 4.
  • the entire gene was obtained by fusion of the two parts 8/4 and 3/14 and then cloned into the vector pRIT 28.
  • the sequence corresponds to SEQ ID No. 13.
  • the protein is expressed in the form BBP40.
  • the electrophoretic profile shows that BBP40, obtained after denaturation, is of high purity.
  • the apparent molecular weight corresponds to the calculated theoretical weight which is 63 kDa.
  • Example 5 coupling of the protein p40 to the peptide G 1 A p40 (5 mg / ml, 40 mg) is dialyzed against 300 volumes of 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7, zwittergent 3-14, 0.1%.
  • the dialysate is adjusted to a concentration of 2 mg / ml using a 0.1 M carbonate buffer, pH 9; zwittergent 3-14, 0.1%.
  • Sodium dodecyl sulfate (SDS) is added to reach a final concentration of 4%.
  • the peptide G 1 (10 mg / 10 ml of 0.1 M carbonate buffer pH 9; zwittergent 3-14 0.1%) is added to the solution of p40.
  • the pH value is controlled (between pH 9 and pH 10).
  • the reaction is stopped by adding 100 ⁇ l of lysine 1 M.
  • the solution is dialyzed for 24 hours at 4 ° C.
  • the SDS is eliminated by double precipitation with KCl.
  • the solution containing the p40 conjugate is frozen and used as it is or freeze-dried.
  • the serum is collected and tested by ELISA.
  • the anti-Gl or anti-carrier Ig are isolated on a BSA-G1 support and on a "carrier" support (KLH or TT or P40).
  • the Ig are revealed using an anti-rabbit peroxidase conjugate.
  • the optical density is read at 450 nm and the anti-Gl antibody titer is given by the inverse of the last dilution giving twice the background noise.
  • the results represent the mean + standard deviation of the titles of the 5 mice.
  • mice are immunized with G1A in different forms according to an identical immunization scheme.
  • the antibody responses induced by the different forms of G1A are compared 28 days after the start of the experiment.
  • the synthetic peptide G1A administered pure does not induce an immune response even if it is co-administered with the adjuvant of Freund.
  • G1A Presented by the KLH carrier, G1A induces a weak response which is significantly increased by the coadministration of Freund's adjuvant (AF).
  • AF Freund's adjuvant
  • G1A induces a response superior to that obtained in the classic KLH / G1 + AF immunization scheme, p40 to properties of "self-adjuvant carrier".
  • mice are immunized with G1A in different forms according to an identical immunization scheme.
  • the antibody responses induced by the different forms of G1A are compared over time: 7, 17, 28, 35, 42 days after the start of the experiment.
  • the anti-G1A response is significantly higher and faster when mice are immunized with p40 / G1A than the more conventional TT / G1A and KLH / G1A + AF immunizations.
  • a single injection of p40 / G1A makes it possible to obtain, in 7 days, an anti-G1A antibody titer of 1000. This titer is obtained with TT / G1A or KLH / G1A + AF in 28 days.
  • the anti-G1A antibody titer is maintained without weakening until day 42.
  • mice are immunized with G1A coupled to a carrier according to an identical immunization scheme.
  • the antibody responses induced by the various carriers are compared over time, 7, 17, 28, 35, 42 days after the start of the experiment.
  • the anti-p40 response (titer close to 10,000) is greater than the anti-KLH response but not significantly different from the anti-TT response.
  • Example 7 Evaluation of the protective potential of the peptides and of the recombinant proteins of the glycoprotein G of the respiratory syncytial virus (RSV) subgroup A coupled to the carrier protein p40
  • the BALB / c mice were immunized with the following different preparations:
  • mice received 3 intramuscular doses (200 ⁇ g / mouse) with aluminum hydroxide as an adjuvant (commonly used in humans). The results of the protection tests as well as the immunological profile of the sera are shown in Table 2.
  • mice were immunized with the following different preparations:
  • mice received 3 intramuscular doses (200 ⁇ g / mouse) with the Freund's adjuvant.
  • the results of the protection tests as well as of the immunological profile of the sera are shown in Table 3.
  • the KLH-G1A preparation provides complete protection against RSV subgroup A but not against the RSV subgroup B.
  • the KLH-G1B preparation provides complete protection against vis-à-vis RSV subgroup B but not vis-à-vis RSV subgroup A.
  • the ELISA test reflects the same situation.
  • the peptide prepared by solid phase synthesis using Boc chemistry is coupled to KLH using glutaraldehyde (Schaaper et al. Mol. Immunol. (1989) 26: 81-85).
  • the animals are challenged with the Snook strain, 21 days after the last inoculation, intranasally and intratracheally with each ml of virus titrating at 2 ⁇ 105 / ml.
  • the virus titrated on calf kidney cells according to the plaque method is determined in the nasopharyngeal washes respectively 3 and 2 days after the challenge and 7 days in the lungs of the animals sacrificed.

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Abstract

La présente invention concerne un polypeptide utilisable comme élément d'immunogène, caractérisé en ce qu'il est porté par la séquence peptidique comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la séquence de la protéine G du virus respiratoire syncytial humain du sous-groupe A et du sous-groupe B, ou du virus respiratoire syncytial bovin, ou par une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec ladite séquence peptidique. L'invention concerne également un agent immunogène ou une composition pharmaceutique contenant le polypeptide et leur procédé de préparation.

Description

FRAGMENT PEPTIDIQUE DE LA PROTEINE G DU VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIAL, AGENT IMMUNOGENE, COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE
CONTENANT ET PROCEDE DE PREPARATION
La présente invention se rapporte à des polypeptides utilisables notamment dans la préparation d'immunogènes et l'obtention de vaccin contre le virus respiratoire syncytial (VRS) et à des séquences nucléotidiques permettant de les obtenir. L'invention se rapporte également à une protéine adjuvante d'immunité extraite de Klebsiella pneumoniae, à des compositions contenant les polypeptides immunogènes, éventuellement associés à une telle protéine adjuvante, ainsi qu'à leur procédé de préparation.
Le virus respiratoire syncytial (VRS) est la cause la plus fréquente de maladies respiratoires chez le nouveau-né : bronchopneumopathies
(bronchiolites). L'OMS estime chaque année 50 millions de cas atteints du VRS, dont 160 000 décès dans le monde entier. Il existe deux sous groupes du virus (sous groupes A et B).
Le VRS est classé dans la famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité négative, codant pour 10 protéines spécifiques.
II n'existe pas actuellement de vaccin disponible, contre le VRS. Les vaccins à virus inactivé se sont montrés inefficaces et ont même parfois aggravé les infections des nourrissons. Dans les années 60, les tentatives de vaccination avec le VRS inactivé à la formaline ont conduit à l'échec : au lieu de conférer une protection lors de la réinfection due au VRS, le vaccin a eu pour effet d'aggraver la maladie chez l'enfant.
La demande WO 87/04185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N).
La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiées sous forme monomériques ou désacétylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes. Toutefois les vaccins immunitaires testés à ce jour se sont montrés inefficaces ou ont induit une pathologie pulmonaire (bronchiolite ou péribronchite).
A l'heure actuelle il n'existe pas de traitement de fond des infections dues au VRS.
Les infections au VRS des voies aériennes supérieures : le traitement repose essentiellement sur les médications symptomatiques identiques à celles des autres infections virales.
Les infections au VRS des voies aériennes inférieures : le traitement chez les nourrissons repose sur le maintien d'une hydratation correcte, l'aspiration des sécrétions et l'administration d'oxygène si besoin. Un effet positif a été observé avec la ribavirine, nucléotide actif in vitro contre le VRS.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un polypeptide utile notamment dans la production d'immunogène, caractérisé en ce qu'il est porté par la séquence peptidique comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la séquence de la protéine G du virus respiratoire syncytial, ou par une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique. Cette séquence diffère légèrement pour les sous-groupes A et B du VRS humain, ou pour le VRS bovin. L'invention comprend les séquences provenant des VRS humain sous-groupe A et B, ou bovin
La protéine G est une glycoprotéine d'enveloppe du VRS, de poids moléculaire compris entre 84 et 90 Kd, pauvre en méthionine.
La Demanderesse a mis en évidence que la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G naturelle est particulièrement appropriée pour induire une protection efficace contre l'infection par le VRS. L' invention comprend les séquences provenant des VRS humain sous-groupe A ou B, ou bovin.
Plus particulièrement la présente invention concerne des polypeptides, utiles notamment comme élément d'immunogène compris dans le précédent et qui comportent la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 174 et 187 de la protéine G du VRS (humain, sous-groupes A et B, ou bovin) ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence correspondante. D'autres séquences peptidiques adaptées à la préparation d'un immunogéne comprises dans ladite séquence de la protéine G du VRS sont constituées par la séquence comprise entre les résidus aminoacides numérotés 171 et 187 de la protéine G du VRS humain ou bovin, ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence correspondante. D'autres peptides d'intérêt selon la présente invention sont portées par la séquence comprise entreles nucléotides numérotés 158 et 190 de la protéine G du VRS ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence correspondante.
Selon un autre de ses modes de réalisation l'invention a pour objet des peptides utiles pour la préparation d'un immunogéne et qui présentent une séquence correspondant à la séquence comprise entre les résidus aminoacides numérotés 140 et 200 de la protéine G du VRS humain ou bovin, ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence correspondante. Des séquences débutant à l'aminoacidè 140 de ladite protéine G du VRS et dont l'extrémité C-terminale correspond respectivement à l'aminoacidè 198, 196, 194, 192, ou 190 ,ainsi, que des séquences présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences portées par ces fragments sont particulièrement avantageuses.
Parmi les variants des séquences précédentes, il faut citer les polypeptides qui comportent une séquence dans laquelle :
a) l'acide aminé Cys en positions 173 et/ou 186 a été remplacé par un aminoacide ne formant pas de pont disulfure en particulier la serine, et/ou
b) les acides aminés en positions 176 et 182 sont susceptibles de former un pont covalent autre qu'un pont disulfure notamment l'acide aspartique et l'ornithine.
Ainsi, la séquence polypeptidique 130-230 du VRS sous-groupe A peut être utilisée complète, sous sa forme native. Cette séquence correspond à la séquence notée Seq id n° 1 (ou G2A).
De même, on peut utiliser la séquence polypeptidique complète 130-230 du VRS sous groupe B, sous sa forme native. Cette séquence correspond à la séquence notée Seq id n° 2 (G2B). La séquence id n° 1 sera notée G2A dans la suite de la demande.
La séquence id nº 2 sera notée G2B dans la suite de la demande.
Des séquences présentant au moins 80% d'homologie avec G2A ou G2B sont également appropriées.
La séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230, peut être modifiée par le remplacement des résidus cystéine en positions 173 et 186 par des résidus serine pour obtenir un peptide conservant de bonnes propriétés immunogènes, grâce au maintien de la boucle formée par les résidus Cys en positions 176 et 182. Les séquences en acides aminés et nucléotides de ce polypeptide pour le sous-groupe A sont représentées sur la seq id n° 3 (G2AδCys).
Pour le sous-groupe B, les séquences en acides aminés et en nucléotides sont représentées sur la seq id n° 4 (G2BδCys).
Les séquences peptidiques seront notées G2AδCys et G2BδCys.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un polypeptide utile pour la préparation d'immunogène, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 174 et 187 de la protéine G du VRS ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique.
Dans cette dernière séquence le peptide 174-187 sous-groupe A peut présenter la séquence :
Figure imgf000006_0001
Dans la séquence comprise entre les résidus 174 et 187 du peptide immunogéne, selon l'une des variantes de l'invention, les résidus aminoacides en positions 176 et 182 sont respectivement remplacés par un acide aspartique et une ornithine, de manière à obtenir l'une des séquences suivantes :
Figure imgf000007_0001
Le maintien des propriétés immunogènes est obtenu grâce au remplacement du pont disulfure (entre les Cys naturelles) par un pont amide entre les positions 176 et 182.
D'autres séquences selon l'invention telles que définies précédemment figurent en annexe de la présente demande sous les désignations SEQ ID N°14 à SEQ.ID N°73.
L'invention a également pour objet un polypeptide utilisable comme agent immunogéne présentant l'une des séquences précédentes et qui comporte en outre au moins un résidu cystéine en position N- terminale ou C- terminale.
L'invention comprend également un polypeptide qui consiste en la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 130 et 230 de la séquence de la protéine G du VRS sous-groupe A et sousgroupe B, ou en une séquence présentant 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique et qui est sous forme d'une protéine de fusion avec le récepteur de la serumalbumine humaine, nommée BBG2AδC ou BBG2BδC, ou une autre protéine de liaison. La séquence de la protéine BB complète figure en annexe (Seq ID n° 74). L'invention comprend également les variants par exemple glycosylés ou sulfatés des différents peptides, que ces fonctions soient naturelles ou non.
Les polypeptides peuvent être préparés par synthèse peptidique ou par les techniques d'ADN recombinant, qui sont connues de l'homme du métier.
En particulier, les séquences du gène codant pour l'épitope d'environ 100 acides aminés peuvent être préparées par assemblage de gènes en phase solide, et la protéine correspondante exprimée par exemple dans E. coli par voie intracellulaire.
Les séquences nucléotidiques (ARN ou ADN) codant pour les protéines ou les polypeptides définis ci-dessus font partie de l'invention.
Un autre objet de l'invention est un agent immunogéne qui comporte un polypeptide tel que défini précédemment couplé à une protéine porteuse, en particulier à une protéine adjuvante d'immunité.
De préférence, le polypeptide selon l'invention est couplé à une protéine porteuse de type OmpA de la membrane externe d'une bactérie du genre Klebsiella, de préférence sous forme d'un conjugué soluble.
La Demanderesse a pu montrer qu'alors que les variants de la séquence 174-187 de la protéine G du VRS sont faiblement immunogènes, leur couplage avec une telle protéine induit une réponse immunitaire spécifique.
L'intensité de la réponse immunitaire a été comparée avec celle obtenue avec des adjuvants classiques, tel que le couplage au porteur KLH (keyhole limpet hemocyanin) coadministré avec l'adjuvant de Freund, ou le couplage à la protéine porteuse TT (tetanus toxoid).
Des résultats particulièrement avantageux sont obtenus pour des compositions contenant un polypeptide immunogéne selon l'invention couplé à la protéine p40 de Klebsiella pneumoniae ou une protéine présentant 80% d'homologie avec la protéine p40.
Plus particulièrement, ledit polypeptide est couplé à une protéine comportant la séquence peptidique notée Seq id n° 13. La séquence nucléotidique (ADN ou ARN) codant pour la protéine comportant la séquence id n° 13 est comprise dans l'invention.
Le polypeptide immunogéne peut être couplé à la protéine adjuvante d'immunité par des méthodes connues de l'homme du métier telles que :
- Glutaraldéhyde
- Carbodiimide (ex : EDC. : 1-(3diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide).
- Bis imido esters (ex : diméthyladipimidate).
- N-hydroxysuccinimidyl esters (ex : disuccinimidyl subérate).
- Pour les peptides comportant une cystéine supplémentaire en position N terminale ou C terminale :
* Maléimido-N-hydroxysuccinimide esters (ex : MBS : maléimido benzoyl-N-hydroxy-succinimide ester).
* N- succinimidyl Bromoacétate.
Le polypeptide peut être conjugué à la protéine porteuse par une protéine de liaison, par exemple le récepteur de la serumalbumine humaine (BB).
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un peptide conjugué entrant dans une composition utile pour prévention ou traitement des affections à VRS, caractérisé en ce que :
a) on précipite les lipopolysaccharides de membranes de bactéries du genre Klebsiella, en présence d'un sel de cation divalent et de détergents, pour récupérer les protéines membranaires totales dans le surnageant,
b) on soumet les protéines à une chromatographie par échange d'anions pour séparer la fraction contenant la protéine adjuvante d'immunité,
c) on concentre la fraction contenant la protéine adjuvante d'immunité,
d) on conjugue la protéine adjuvante d'immunité avec un polypeptide immunogéne tel que définis ci-dessus pour former un conjugué soluble. Le sel de cation divalent utilisé dans l'étape a) est de préférence un sel de calcium ou de magnésium. Après centrifugation, les protéines du surnageant peuvent être récupérées avec un bon rendement par deux précipitations à l'éthanol.
Les protéines membranaires, après remise en suspension, sont séparées sur une colonne échangeuse d'anions, utilisable en conditions industrielles. Ce support chromatographique est très stable et compatible avec les traitements de dépyrogénation drastiques, ce qui n'était pas le cas des supports chromatographiques déjà décrits. D'autre part, l'élution de la protéine peut être réalisée en conditions isocratiques et non par application d'un gradient de NaCl (comme décrit précédemment), ce qui est particulièrement avantageux en conditions industrielles.
Selon un mode de réalisation préféré, après l'étape c), on procède à une seconde étape de chromatographie, sur échangeur de cations, et on récupère les fractions contenant la protéine adjuvante, qui sont concentrées. Cette étape supplémentaire permet une meilleure élimination des lipopolysaccharides. La protéine adjuvante est ensuite conjuguée avec un polypeptide immunogéne selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition utile pour la prévention et/ou le traitement des affections provoquées par le VRS, caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide caractérisé ciavant.
Plus particulièrement les compositions contiennent en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables adaptés à l'administration par voie injectable.
En effet, la Demanderesse a mis en évidence que l'injection de telles compositions entraîne une protection, non par un effet neutralisant, mais par une réponse immunitaire systémique de l'organisme.
Les réponses humorales et cellulaire (IgM, IgG, IgA et cellules T) sont provoquées par le produit qui induit également une protection à long terme et une mémoire immunologique contre les VRS sous groupes a et b.
En vue de l'administration des compositions vaccinales par voie sous-cutanée, il est souhaitable de disposer de conjugué soluble, ce qui est difficile par les méthodes conventionnelles. C'est pourquoi l'invention concerne également un procédé de préparation d'un conjugué entre un peptide immunogéne et une protéine de membrane de Klebsiella, en particulier la protéine p40 de K. pneumoniae, dans lequel le couplage est effectué en présence de glutaraldéhyde à des concentrations inférieures ou égales à 0,05%.
Ce procédé de couplage diminue considérablement les concentrations en glutaraldéhyde en comparaison de celles habituellement utilisées (2 fois 0,01% au lieu de 1% environ) ; le glutaraldéhyde est ajouté en 2 fois sur une période de cinq jours alors que les protocoles décrits mentionnent des temps de 24 heures.
Ces modifications ont permis l'obtention d'un conjugué soluble. sous une forme adaptée à l'administration sous cutanée.
Les protocoles usuels (concentrations en glutaraldéhyde plus élevées et temps courts) se traduisent par la formation d'un gel dense (dû à des réactions de conjugaison P40-P40, très probablement), forme Impropre à l'administration et à la manipulation en général.
Le peptide conjugué peut être congelé et utilisé tel quel ou lyophilisé.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes :
- Figure 1 : intensité de la réponse immunitaire induite contre G1A sous différentes formes,
- Figure 2 : Cinétique de la réponse immunitaire induite contre G1A présentée sous différentes formes,
- Figure 3 : Cinétique de la réponse immunitaire induite contre le porteur seul,
- Figure 4 : Stratégie de clonage par amplification génique de p40. Exemple 1 : Synthèse et Purification du GiA
Le polypeptide de séquence
Figure imgf000012_0001
noté G1A, est préparé par synthèse en phase solide en utilisant la chimie
Boc.
Assemblage
L'assemblage du peptide est effectué par synthèse peptidique en phase solide sur polystyrène (divinylbenzène 1%), en commençant avec un agent de liaison Boc-Lys(2-cl-Z)-phénylacétamidométhyl.
On a utilisé la stratégie chimique Boc-Benzyle avec la procédure de déprotection-couplage suivante :
Figure imgf000012_0002
A chaque étape on utilise 20 ml de solvant par gramme de peptide- résine.
Le couplage est effectué dans du DMF avec un ester hydroxybenzotriazole préformé pendant 30 min. On vérifie à chaque étape du couplage, si des fonctions aminé libres résiduelles sont présentes, par le test à la ninhydrine. Si nécessaire, un double couplage est effectué. Pour la synthèse du peptide GiA, on a utilisé les groupes de protection de la chaîne latérale suivants :
- 2-chlorobenzyloxycarbonyl pour la Lysine,
- Benzyl pour la Serine et la Thréonine,
- 4-méthylbenzyl pour la Cystéine,
- Formyl pour le Tryptophane.
Avant l'étape finale de déprotection/cleavage, le groupe formyl est éliminé par traitement 30 min par une solution de piperidine à 25 % dans du DMF. La résine peptidique est lavée par du DCM et de l'éther, et séchée sous pression réduite.
Clivage
Le peptide est clivé de la résine et complètement déprotégé par un traitement au Fluorure d'Hydrogène liquide. 10 ml de Fluorure d'Hydrogène par gramme de peptide-résine sont utilisés classiquement à 0°C pendant 45 min en présence de p-cresol et d'éthanedithiol comme piège. Après évaporation du Fluorure d'Hydrogène, le mélange de réaction brut est lavé à l'éther, dissout dans du TFA, précipité à l'éther et séché.
Figure imgf000013_0001
Le peptide brut obtenu après clivage est purifié dans les conditions décrites ci-dessus (gradient de 20 à 50 % B). Les fractions ayant une pureté supérieure à 70-80 % (HPLC) sont réunies et lyophilisées. Le peptide est ensuite purifié dans un mélange acétonitrile eau et DMSO ( 1mg/ml) et laissé sous agitation jusqu'à ce que la cyclisation soit complète (4 à 6 jours). L'évolution de la réaction est contrôlée par HPLC. Le mélange de réaction est finalement concentré sur la colonne d'HPLC préparative et un gradient de 15 à 40 % de B est appliqué en 30 min afin de purifier le peptide.
Généralement, après lyophilisation, une seconde purification dans les mêmes conditions, est effectuée pour atteindre le degré de pureté requis.
La pureté et l'identité du produit final sont contrôlées par HPLC analytique, analyse des amino acides et analyse de masse FAB.
Dans le peptide ainsi obtenu, le résidu serine en treizième position remplace le résidu Cys du peptide naturel, évitant ainsi une hétérogénéité dans la formation des ponts disulfures, pouvant être nuisible à l'immunogénicité. Exemple 2 : Préparation de l'épitope G2AδCys Construction de gène : matériels et méthodes
Dans un microtube Eppendorf, on rince 300 μg de billes avec du tampon washing/binding ( 1M NaCl, 10mM Tris-HCl pH7,5, 1 mM EDTA) avant d'ajouter 0,2 pmole de l'oligo biotinylé, 15 minutes d'incubation à température ambiante pour le binding. Les billes avec l'oligo fixé sont rincées et sédimentées. 0,2 pmole de l'oligo phosphorylé en 5' suivant est ajouté dans 60 μl de tampon hybridation/ligation (50mM Tris-HCl pH7,6, 10 mM MgCl2l 1 mM ATP, 1mM 1,4-dithiothreitol [DTT], 5% polyéthylène glycol
[PEG] 8000). Le mélange d'hybridation est incubé à 70° C pendant 5 mn et laissé revenir à 37° C avant d'ajouter 3 unités de T4 DNA ligase (BRL) suivi de 15 mn d'incubation à 37° C. Le mélange réactionnel est rincé avant d'ajouter 0,2 pmole d'oligo suivant. La procédure d'hybridation/ligation est répétée autant de fois qu'on ajoute un nouveau oligo complémentaire phosphorylé en 5'. A la fin, le duplex d'ADN fixé sur billes magnétiques peut être séparé du support en coupant avec les enzymes de restriction appropriées.
On prépare l'ADN correspondant à la séquence G2AδCys et à la séquence G2AδCys liée à la protéine de liaison à la serumalbumine humaine(BB) notée BB-G2AδCys.
La séquence nucléotidique est exprimée chez E. coli pour récupérer les protéines correspondantes.
Vecteur d'expression :
pVABBG2AδC est un vecteur d'expression de type intracellulaire, il contient un promoteur d'origine E. coli , l'opération tryptophane (Trp), suvi du gène codant pour le récepteur de la sérum albumine humaine BB (P-Å Nygrén et col, J. Mol. Recognit., 1988, 1, 60) et enfin le gène codant pour G2AδC du VRS. L'expression du gène hétérologue peut être induite en présence de l'IAA (acide-3-ß-indolacrylique). Le produit de fusion BBG2AδC peut être purifié par affinité sur colonne HSA-sépharose, après avoir libéré les protéines cytoplasmiques de E. coli.
Exemples de purification de protéines à partir de culture de 500 ml :
La souche E. coli RV 308 (Maurer et col., J. Mol. Biol., 1980, 139, 147) transfectée par le plasmide pVABBG2AδC, a été sélectionnée sur gélose renfermant de l'ampicilline ( 100 μg/ml) et de la tétracycline (8 μg/ml). On inocule la souche dans un Erlenmeyer contenant 100 ml de milieu de culture TSB (Tryptic Soy broth, Difco) (30g/l), supplémenté avec de la levure (Yeast Extract, Difco) (5 g/l), de l'Ampicilline (100 μg/ml), de la tétracycline (8 μg/ml) et du Tryptophane ( 100 μg/ml). Incuber à 32°C pendant 12 heures sous agitation (190 rpm). Transvaser la culture dans un autre erlenmeyer (5 litres) contenant quatre fois le volume initial (400 ml TSB + levure + les mêmes antibiotiques à la même concentration). Lorsque la densité optique du milieu (à 550 nm) atteint environ une D.O. de 1,5, on induit la production des protéines en ajoutant dans le milieu de l'IAA à la concentration finale de 25 μg/ml. On arrête la culture après 5 heures d'incubation, sous agitation ( 190 rpm) à 32°C. Après centrifugation, le culot bactérien est resuspendu dans un récipient contenant environ 60 ml de solution de TST (50 mM TrisHCl, pH 8,0, 200mM NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,5 mM EDTA) à froid.
On introduit dans le récipient une sonde standard de sonicateur (VIBRA-CELL, Somics Mat, USA). On fait la sonication à la puissance 5 pendant deux minutes environ. Le surnageant de solution après centrifugation est filtré à 0,45 μm, et passé dans une colonne contenant environ 3 ml de gel de HSA-sépharose (STAHL et col, J. Immunol. Meth., 1989, 124, 43).
Les protéines purifiées sont analysées par SDS-PAGE sur l'appareil Phast System (PHARMACIA) ou sur Mini Protean BIORAD. Les gels sont révélés par le bleu de Coomassie. La protéine BBG2AδC, représentant plus de 90 % de pureté, correspond bien à la taille attendue (39,3 Kda) par rapport aux standards de poids moléculaires connus.
L'immunotransfert de cette protéine sur membrane Problott (ABI) permet de l'identifier avec des anticorps spécifiques, anti-BB et/ou anti-protéine G du VRS (ss-groupe A). Le rendement de protéines solubles purifiées à partir du cytoplasme de E. coli est environ 50 mg/litre de culture.
En fermenteur de 2 litres, on peut obtenir de 500 à 800 mg de protéines BBG2AδC par litre de culture, dans les conditions optimales de culture.
Exemple 3 : isolement et purification de la protéine p40 naturelle
Le procédé de purification de la protéine P40 à partir de la biomasse de Klebsiella pneumoniae, souche 1-145, a été mis au point avec un objectif principal : mettre au point un procédé permettant la transposition àgrande échelle et l'extrapolation industrielle. Ce procédé met en jeu successivement la préparation d'une fraction enrichie en protéines membranaires et la purification de la protéine P40 par chromatographie. MATERIEL ET METHODES
La biomasse de Klebsiella pneumoniae (souche 1-145, 40 g de cellules sèches) est ajustée à pH 2,5 à l'aide d'acide acétique pur.
Après addition de 1/2 volume d'une solution contenant 6 % cétrimide, 60 % éthanol, 1,5 M CaCl2 dont le pH est ajusté à 2,5 avec de l'acide acétique, le mélange est placé sous agitation pendant 16 heures à température ambiante.
Après centrifugation 20 mn à 15000 g à 4°C, les protéines du surnageant sont précipitées à l'éthanol. Deux précipitations successives avec centrifugation intermédiaire (10 mn, 10000 g, 4 °C) sont réalisées : de 20 à 50 % puis de 50 à 80 %.
Les culots obtenus après la seconde précipitation sont remis en suspension dans une solution de zwittergent 3-14, 1 %.
Après agitation 4 heures à température ambiante, le pH est ajusté à
6,5 à l'aide de NaOH1 N.
Une centrifugation du mélange pendant 20 mn à 10000 g à 4 °C permet d'obtenir une fraction enrichie en protéines membranaires (fraction MP).
Les protéines de la fraction MP sont dialysées contre un tampon
Tris/HCl 20 mM pH 8,0 ; zwittergent 3-14, 0,1 %. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (colonne de diamètre = 50 mm x H = 250 mm, gel Biorad Macroprep High Q) équilibrée dans le tampon décrit ci-dessus. La protéine P40 est éluée pour une concentration de 50 mM en NaCl dans le tampon d'équilibration.
Les fractions contenant la P40 sont rassemblées et dialysées contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0 ; zwittergent 3-14, 0,1 %. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (dimensions de la colonne : diamètre = 25 mm x H = 160 mm, gel Biorad Macroprep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20 mM pH 3,0, zwittergent 3-14, 0, 1 %. La protéine P40 est éluée pour une concentration 0,7 M en NaCl. Les fractions contenant la P40 sont rassemblées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa. RESULTATS
Les fractions obtenues après chaque étape chromatographique sont analysées par SDS-PAGE afin de rassembler celles contenant la protéine P40.
Les quantités de protéines sont mesurées par la méthode de Lowry (tableau I). La pureté et l'homogénéité de la protéine P40 sont estimées par SDS-PAGE, en présence de standards de masse moléculaire.
Après l'étape de chromatographie d'échange de cations, la protéine P40 est dépourvue du contaminant majeur présent dans la fraction MP (la protéine présentant une masse moléculaire apparente de 18 kDa) et présente un degré de pureté supérieur à 95 %.
Le profil électrophorétique de la P40 révèle plusieurs bandes. Ces bandes sont reconnues après immunoblot par des anticorps monoclonaux P40 obtenus chez la souris. La bande majeure supérieure correspond à la protéine dénaturée (par le traitement à 100°C, 15 min. en présence ide SDS), et la bande mineure inférieure à la protéine sous sa forme native.
La P40 est en effet une protéine dite "heat-modifiable", et nous avons pu vérifier cette propriété à l'aide d'une cinétique de chauffage à 100°C en présence de SDS. Sans chauffage la protéine sous forme native présente une structure en hélices α qui fixe plus de SDS et migre donc plus loin vers l'anode que la forme dénaturée (dénaturation complète après 5 min. à 100°C) qui présente une structure en feuillets β (K.B KELLER ( 1978) J. Bacteriol. 134, 1181-1183).
La contamination par les lipopolysaccharides (LPS) est estimée par dosage par chromatographie en phase gazeuse de l'acide β-hydroxymyristique, acide gras marqueur des LPS de Klebsiella pneumoniae (tableau I).
Figure imgf000019_0001
Cette méthode est utilisée pour approcher la teneur en LPS des échantillons issus des différentes étapes de purification.
La quantité d'acide ß-hydroxymyristique présente dans la fraction P40 après chromatographie d'échange de cations étant inférieure au seuil de quantification du dosage, on peut estimer que la quantité de LPS résiduel est inférieure à 1 %.
Exemple 4 : clonage de la protéine p40 et expression de BBp40 SOUCHES BACTERIENNES
* E. coli : RV 308 : souche ATCC 31608 (MAURER R., MEYER B.J., PTASCHNE M., J. MOL. BIOL, 1980, 139,147-161). * K. pneumoniae : IP 145 : souche C.I.B.P.F - VECTEURS
* pRIT 28 (Hultman et Col, 1988,7 : 629-638) : vecteur de clonage et de séquençage possédant le gène de résistance à l'ampicilline, les origines de replication d'E.coli et du phage F1 ainsi qu'une portion du gène lac-z d'E.coli ( ß-galactosidose). pVABB : vecteur d'expression de fusion de gène.
SOLUTIONS
Figure imgf000020_0001
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MATERIEL ET METHODE
- Synthèse des oligonucléotides
Les amorces nucléotidiques ont été déterminées à partir de la partie de la séquence publiée de l'OMPA de Klebsiella pneumoniae (LAWRENCE, G.J., et al, Journal of gênerai microbiology, 1991, 137, 1911-1921 ) de la séquence conscensus issue de l'alignement des séquences de 5 OMPA d'entérobactéries (E.coli, S.tryphimurium, S.marcescens, S.dysenteriae, E.aeroginosae), ainsi que des séquences de peptides obtenus par séquençage manuel. Les oligonucléotides ont été synthétisés selon la méthode chimique des phosphoramidites sur l'appareil "Gène Assembler Plus" de Pharmacia.
- Amplification génique par PCR du gène de P40
L'ADN de l'OMPA de Klebsiella pneumoniae a été amplifié de la manière suivante.
Une colonie de Klebsiella pneumoniae est lysée dans 10 μl de tampon de lyse par chauffage à 95 °C pendant 5 minutes.
1 μl de cette solution sert de source d'ADN pouf les réactions d'amplification.
Celles-ci sont réalisées dans 100 μl de tampon d'amplification (cf.annexe), avec 5 pmoles de chaque amorce et une unité d'enzyme Taq polymérase (Perkin Elmer Cetus). Chaque cycle comprend une étape de dénaturation de 30 secondes à 95°C suivie d'une hybridation de l'amorce à l'ADN et d'une extension d'une minute à 72 °C. 30 cycles sont ainsi effectués à l'aide d'un thermocycleur "Gen Amp PCR" 9000 Perkin Elmer Cetus .
Les PCR suivantes sont réalisées à partir des fragments d'ADN amplifiés précédemment.
Les fragments d'ADN amplifiés sont ensuite digérés, purifiés et liés au vecteur pRIT 28.
SEQUENCAGE
Les fragments ainsi clones sont séquences sur un séquenceur automatique 373 DNA Séquenceur d' Applied Biosystem. Les réactions de séquençage sont réalisées à l'aide du kit "dye Terminator" selon les recommandations du fournisseur (Applied Biosystem) soit sur de l'ADN double brin obtenu après amplification génique ou issu de maxiprep soit sur de l'ADN simple brin issu de fragments PCR dénaturés (Hultman et Col, Nucleid acids res. ; 1989, 17 : 4937-4946). EXPRESSION DE LA PROTEINE
Le gène entier de P40 est clone dans le vecteur d'expression pVABB. Ce vecteur permet d'adjoindre une queue d'affinité "BB" à P40 ; B étant la partie de la protéine G du streptocoque qui lie la sérum albumine (Nygren P.A et Col ; Journal mol. Recognit. 1988 ; 1, 69-74).
Les souches d'E.coli RV308 transformées par le vecteur pVABBP40 sont mises à cultiver une nuit à 37°C sous agitation, dans 100 ml de TSB complémenté en extrait de levure, en ampicilline (200 μg/ml) en tétracycline (8 μg/ml) et en tryptophane ( 100 μg/ml). Le lendemain, une culture à DO= 1 pour une longueur d'onde de 580 nm est préparée dans du TSB + extraits de levure + ampi + tetra.
Après 10 minutes de culture, l'expression de la protéine est induite par addition d'IAA à (25 μg/ml) dans le milieu . La culture est centrifugée à 4°C à 2460 g pendant 10 minutes.
Le culot est repris par 20ml de TST 1 x pH 7,4, et la solution test alors centrifugée à 4°C à 23000 g pendant 30 minutes.
Le surnageant est passé sur Sépharose ce qui permet d'isoler les protéines dites solubles. Le culot est lavé avec du tampon de lavage puis centrifugé à 23000 g à 4°C pendant 30 minutes. Le culot renfermant les corps d'inclusion est alors repris par 900 μl d'une solution dénaturante +
100 μl de Diothiothreitol 10mM et incubé 2 heures à 37 °C.
La solution est ensuite incubée 1 nuit à température ambiante, sous agitation,dans 100 ml de tampon de renaturation à 2300 g pendant 1 heure.
Le surnageant est passé sur HSA Sépharose.
Dans les deux cas les protéines fixées sont éluées avec de l'acide acétique 0,5 M pH 2,8 et collectées par fraction de 1 ml.
Les fractions collectées sont ensuite annalysées sur gel d'électrophorèse en SDS-PAGE et par Immuno blot. RESULTATS
Le clonage du gène a été effectué en trois temps selon la stratégie présentée sur la figure 4.
Dans un premier temps, nous avons confirmé la partie de la séquence publiée à l'exception d'un T à la place d'un A en position 103.
Puis nous avons déterminé la séquence en 3 ' du gène et enfin celle en 5 '.
Le gène entier a été obtenu par fusion des deux parties 8/4 et 3/14 puis clone dans le vecteur pRIT 28. La séquence correspond à SEQ ID N° 13.
La protéine est exprimée sous la forme BBP40.
Elle est essentiellement obtenue à partir des corps d'inclusion. Pour une culture de 200 ml, on purifie une quinzaine de milligrammes de protéine.
Le profil électrophorétique montre que BBP40, obtenue après dénaturation, est d'une grande pureté. Le poids moléculaire apparent, correspond au poids théorique calculé qui est de 63 kDa.
La caractérisation en Immuno blot montre que la protéine purifiée est bien reconnue par un sérum de lapin anti-P40.
Exemple 5 : couplage de la protéine p40 au peptide G1A p40 (5 mg/ml, 40 mg) est dialysée contre 300 volumes de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7, zwittergent 3-14, 0,1%.
Le dialysat est ajusté à une concentration de 2 mg/ml à l'aide d'un tampon carbonate 0,1 M pH 9 ; zwittergent 3-14, 0,1%. Du sodium dodécyl sulfate (SDS) est ajouté pour atteindre une concentration finale de 4%.
Le peptide G1 ( 10 mg/10 ml de tampon carbonate 0,1 M pH 9 ; zwittergent 3-14 0,1 %) est ajouté à la solution de p40. La valeur du pH est contrôlée (comprise entre pH 9 et pH 10).
Ajouter 220 μl de glutaraldéhyde (2,5% dans l'eau), agiter 24 heures à 4° C. Ajouter 5 ml de tampon carbonate 0,1 M pH 9 ; zwittergent 3-14 0,1%; vérifier le pH (compris entre pH 9 et pH 10) ; agiter 72 heures à 4° C.
Ajouter 220 μl de glutaraldéhyde (2,5% dans l'eau), vérifier le pH, agiter 24 heures à + 4° C.
La réaction est stoppée par addition de 100 μl de lysine 1 M. La solution est dialysée 24 heures à 4° C.
Le SDS est éliminé, par double précipitation au KCl.
La solution contenant le conjugué p40 est congelée et utilisée telle quelle ou lyophylisée.
Exemple 6 : activité
Matériel et méthodes Les souris C57BL/6 (N=5) sont immunisées à JO, J10, J20 par Voie sous cutanée avec 10 μg de Gl, couplé ou non à un porteur, en présence ou non d'un adjuvant. Le sérum est collecté et testé par ELISA. Les Ig anti-Gl ou anti-porteur sont isolées sur support BSA-G1 et sur support "porteur" (KLH ou TT ou P40). Les Ig sont révélées à l'aide d'un conjugué anti-Ig lapin peroxydase. La densité optique est lue à 450 nm et le titre en anticorps anti-Gl est donné par l'inverse de la dernière dilution donnant deux fois le bruit de fond. Les résultats représentent la moyenne + écart-type des titres des 5 souris. RESULTATS
Induction d'une réponse immunitaire contre G1A
Les souris sont immunisées avec G1A sous différentes formes selon un schéma d'immunisation identique. Les réponses anticorps induites par les différentes formes de G1A sont comparées 28 jours après le début de l'expérience. Le peptide synthétique G1A administré pur n'induit pas de réponse immunitaire même s'il est coadministré avec l'adjuvant de Freund. Présenté par le porteur KLH, G1A induit une réponse faible qui est significativement augmentée par la coadministration de l'adjuvant de Freund (AF). Présenté par p40, G1A induit une réponse supérieure à celle obtenue dans le schéma d'immunisation classique KLH/G1+AF, p40 à des propriétés de "self-adjuyant carrier''.
Les résultats sont présentés sur la figure 1. Cinétique de la réponse immunitaire contre G1A
Les souris sont immunisées avec G1A sous différentes formes selon un schéma d'immunisation identique. Les réponses anticorps induites par les différentes formes de G1A sont comparées dans le temps : 7, 17, 28, 35, 42 jours après le début de l'expérience.
La réponse anti-G1A est significativement plus élevée et plus rapide lorsque les souris sont immunisées avec p40/G1A que les immunisations plus classiques TT/G1A et KLH/G1A+AF. Une seule injection de p40/G1A permet d'obtenir, en 7 jours, un titre d'anticorps anti-G1A de 1000. Ce titre est obtenu avec TT/G1A ou KLH/G1A+AF en 28 jours. La réponse maximum (titre = 1/380 000), obtenue après trois injections, en 28 jours, est environ 30 fois supérieure à celle obtenue avec KLH/G1A+AF et 70 fois supérieure à celle obtenue avec TT/G1A. Le titre en anticorps anti-G1A se maintient sans faiblir jusqu'au jour 42.
Les résultats sont présentés sur la figure 2.
Cinétique de la réponse immunitaire contre le porteur
Les souris sont immunisées avec G1A couplé à un porteur selon un schéma d'immunisation identique. Les réponses anticorps induites par lesdifférents porteurs sont comparées dans le temps, 7, 17, 28, 35, 42 jours après le début de l'expérience. La réponse anti-p40 (titre voisin du 10 000) est supérieure à la réponse anti-KLH mais non significativement différente de la réponse anti-TT.
Les résultats sont présentés sur la figure 3.
CONCLUSION
Le couplage chimique du peptide G1A sur la protéine p40 a permis d'induire une réponse anti-G1A significativement plus importante et plus rapide que celles provoquées par les modèles de référence KLH/G1A+AF ou
TT/G1A. Le couplage du peptide G1B devrait induire des réponses similaires.
Exemple 7 : Evaluation du potentiel protecteur des peptides et des protéines recombinantek de la glycoprotéine G du virus respiratoire syncytial (VRS) sous- groupe A couplés à la protéine porteuse p40 Les souris BALB/c ont été immunisées avec les différentes préparations suivantes :
1) peptide de synthèse G1A couplé à KLH (keyhole limpet hemocyanin) = KLH.G1A.
2) peptide de synthèse G1A couplé à la protéine porteuse p40 = p40.G1A.
3) témoin p40 seul.
4) protéine recombinante produite dans E. coli : BBG2AδC couplée à la protéine porteuse p40 = p40.BBG2AδC.
5) peptide de synthèse G1A couplé à la protéine porteuse toxine tétanique (TT) = TT.G1A.
6) témoin TT seul,
7) témoin BB seul,
8) témoin VRS long (sous-groupe A). Les souris ont reçu 3 doses intramusculaires (200 μg/souris) avec l'hydroxyde d'aluminium comme adjuvant (utilisé couramment chez l'homme). Les résultats des tests de protection ainsi que du profil immunologique des sérums se trouvent dans le tableau 2.
Les préparations suivantes confèrent une protection complète suite au challenge avec le VRS Long (Souche A) : p40.G1A, p40.BBG2AδC, par rapport à TT.G1A qui confère aussi une très bonne protection comparable au peptide KLH.G1A. En test ELISA, tous reconnaissent l'antigène VRS avec un titre le plus fort pour p40.G1A=1/12800.
Quant au test de neutralisation, aucune des préparations ne possède d'activité neutralisante in vitro.
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Exemple 8
Evaluation du potentiel protecteur des peptides de la glycoprotéine G du virus respiratoire syncytial (VRS) sous-groupe A et sous-groupe B couplés à la KLH. Protection vis-à-vis d'un challenge réalisé avec les deux sous-groupes du VRS.
Les souris BALB/c ont été immunisées avec les différentes préparations suivantes :
1. peptide de synthèse C1A couplé à la KLH (keyhole limpet hemocyanin) = KLH-G1A
2. peptide de synthèse G1B couplé à la KLH (keyhole limpet hemocyanin) = KLH-G1B. Le peptide G1B correspond à la séquence G (174-187)δCys du sous-groupe B dont la séquence est :
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3. Témoin KLH
4. Témoin VRS long (sous-groupe A)
5. Témoin VRS 8/60 (sous-groupe B)
Les souris ont reçu 3 doses intramusculaires (200 μg/souris) avec l'adjuvant de Freund. Les résultats des tests de protection ainsi que du profil immunologique des sérums se trouvent dans le tableau 3.
La préparation KLH-G1A permet une protection complète vis-à-vis du VRS sous-groupe A mais pas vis-à-vis du VRS sous-groupe B. Par contre, la préparation KLH-G1B permet une protection complète vis-à-vis du VRS sous-groupe B mais pas vis-à-vis du VRS sous-groupe A. Le test ELISA reflète la même situation.
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Exemple 9: Application vétérinaire
Evaluation du potentiel protecteur de peptide G1vΔC dérivé de la protéine G de la souche bovine du Virus Respiratoire Syncytial (VRS) Lerch et al. 1990, J. Virol. 64:5559 couplé à la protéine porteuse KLH.
174 187
Ser Thr Cys Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Ser His
présentant un pont disulfure en position 176-182.
Le peptide préparé par synthèse en phase solide en utilisant la chimie Boc est couplé au KLH en utilisant la glutaraldéhyde (Schaaper et al. Mol. Immunol. (1989) 26: 81-85).
Deux veaux ont été immunisés par voie intramusculaire avec 500 μg de G1vΔC-KLH avec de l'adjuvant incomplet de Freund 3 fois à intervalle de 3 semaines. Un veau a été immunisé avec KLH sans peptide G1VΔC, avec un adjuvant incomplet de Freund.
Les animaux sont challenges avec la souche Snook, 21 jours après la dernière inoculation, par voie intranasale et intratrachéale avec chacune lml de virus titrant à 2×105 /ml.
Le virus titré sur cellules de reins de veau selon la méthode des plaques est déterminé dans les lavages nasopharyngeaux respectivement 3 et 2 jours après le challenge et 7 jours dans les poumons des animaux sacrifiés.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide utilisable comme élément d'immunogène, caractérisé en ce qu'il est porté par la séquence peptidique comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la séquence de la protéine G du virus respiratoire syncytial humain du sous-groupe A et du sous-groupe B, ou du virus respiratoire syncytial bovin, ou par une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 174 et 187 de la protéine G du VRS ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence correspondante.
3. Polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence dans laquelle :
a) l'acide aminé Cys en positions 173 et/ou 186 à été remplacé par un aminoacide ne formant pas de pont disulfure en partiαulier la serine, et/ou
b) les acides aminés en positions 176 et 182 sont susceptibles de former un pont covalent autre qu'un pont disulfure notamment l'acide aspartique et l'ornithine.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 140 et 200 de la séquence de la protéine G du VRS ou en une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 158 et 190 de la séquence de la protéine G du virus VRS ou en une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique.
6. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides numérotés 130 et 230 de la séquence de la protéine G du VRS humain, sous-groupe A et sous-groupe B ou du VRS bovin, ou en une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec ladite séquence peptidique.
7. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente l'une des séquences suivantes :
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8. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente l'une des séquences ID n° 14 à 73.
9. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins un résidu cystéine en position N- terminale ou C- terminale.
10. Agent immunogéne, caractérisé en ce qu'il comporte un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 couplé à une protéine porteuse.
11. Agent immunogéne selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine porteuse est une protéine adjuvante d'immunité.
12. Agent immunogéne selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que la protéine porteuse est une protéine OmpA.
13. Agent selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le polypeptide est sous forme d'un conjugué soluble avec une protéine de la membrane externe d'une bactérie du genre Klebsiella.
14. Agent selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que la protéine adjuvante d'immunité est la protéine p40 de Klebsiella pneumoniae ou une protéine présentant 80% d'homologie avec la protéine p40.
15. Agent selon l'une des revendications 10 à 14, caractérisé en ce que le polypeptide est conjugué à la protéine porteuse par une protéine de liaison.
16. Agent selon la revendication 15, caractérisé en ce que la protéine de liaison est le récepteur de la serumalbumine humaine.
17. Agent selon l'une des revendications 10 à 16, caractérisée en ce que ledit polypeptide est couplé à une protéine comportant la séquence id n° 13.
18. Agent selon l'une des revendications 10 à 17, caractérisé en ce que le couplage est un couplage covalent.
19. Agent selon l'une des revendications 10 à 18, caractérisé en ce qu'il est obtenu par voie biologique.
20. Composition utile pour la prévention et/ou le traitement des affections provoquées par le VRS humain, sous-groupe A et/ou sous-groupe B, ou le VRS bovin caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 ou un agent selon l'une des revendications 10 à 19.
21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle contient en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables adaptés à l'administration par voie injectable.
22. Composition selon l'une des revendications 20 ou 21 , caractérisée en ce qu'elle comporte un adjuvant d'immunité non spécifique.
23. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9.
24. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine comportant la séquence id n° 13.
25. Procédé de préparation d'un peptide conjugué entrant dans une composition selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que :
a) on précipite les lipopolysaccharides de membranes de bactéries du genre Klebsiella, en présence d'un sel de cation divalent et de détergents, pour récupérer les protéines membranaires totales dans le surnageant,
b) on soumet les protéines à une chromatographie par échange d'anions pour séparer la fraction contenant la protéine adjuvante d'immunité,
c) on concentre la fraction contenant la protéine adjuvante d'immunité,
d) on conjugue la protéine adjuvante d'immunité avec un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 pour former un conjugué soluble.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'étape d) est effectuée en présence de glutaraldéhyde à des concentrations inférieures ou égales à 0,05% et durant une période supérieure ou égale à 5 jours.
27. Utilisation d'une protéine présentant la séquence id n° 13 ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie, pour améliorer l'immunogénicité d'un antigène.
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