WO1995021393A2 - Vorrichtung und verfahren zum optischen messen eines probenpunktes einer probe mit hoher ortsauflösung - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zum optischen messen eines probenpunktes einer probe mit hoher ortsauflösung Download PDF

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WO1995021393A2
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Jan Wichmann
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Stefan Hell
Jan Wichmann
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Definitions

  • the invention relates to a device for optically measuring a sample point of a sample with a high spatial resolution, with a light source for emitting an excitation light beam suitable for exciting an energy state of the sample, a lens for focusing the excitation light beam onto the sample point, the sample that can be arranged in the focal area of the lens Separation device for separating out the emission light spontaneously emitted by the sample due to the excitation of the energy state and a detector for detecting the emission light. Furthermore, the invention relates to a method for optically measuring a sample point of a sample with a high spatial resolution, in which an excitation light beam is focused on the sample point to be measured using a lens and excites the energy state there, and in which the above. spontaneously emitted emission light is separated out and detected from the sample point due to the excitation of the energy state.
  • Such a device and such a method are known from practice. They find their application e.g. B. in microscopes and in particular in scanning microscopes. Individual sample points are scanned and measured with a scanning microscope. In this way, the sample can be measured three-dimensionally.
  • Luminescent, in particular fire-resisting or phosphorescent, samples or samples provided with appropriate dyes are used.
  • the spatial resolution is given by the spatial expansion of the so-called effective point imaging function.
  • This is a location-based function, which is the probability quantify with which a photon is spontaneously emitted from a specific point in the focal region. It is more spatial with. Distribution of the probability that the energy state is excited at a certain point in the focal region is identical.
  • the effective point imaging function is identical to the point mapping function of the objective at the wavelength of the excitation light, which indicates the intensity distribution of the excitation light in the focal range of the objective and quantifies from a quantum mechanical point of view the probability with which a lighting photon can be found in a particular point of the focal range.
  • the subdivision of the screening is limited by the spatial resolution. With a better spatial resolution, a finer subdivision can therefore be selected, with which a better resolution of the reconstructed image can be achieved.
  • the resolution can be improved by imaging the light emitted by the sample onto the point detector, which is arranged in a plane conjugate to the focal plane of the objective.
  • Such an arrangement is called a confocal arrangement.
  • the better resolution comes about because two point mapping functions determine the image in the convocal scanning microscope: the effective point mapping function and the detection imaging function, which describes the mapping of the light emitted by the sample to be detected into the point detector and quantifies the probability from a quantum mechanical point of view with which a photon emitted from the focal area reaches the point detector. Since both illumination and detection have to take place, the point mapping function of a confocal scanning microscope is the product of both probability distributions, ie of the effective point mapping function and the detection point mapping function.
  • the invention has for its object to improve the generic device and the generic method such that a greater spatial resolution is achieved.
  • this object is achieved according to the invention by a stimulation light beam coming from the light source for generating stimulated emission of the sample excited by the excitation light beam in the sample point, the excitation light beam and the stimulation light beam being arranged in such a way that their intensity distributions in the focal region partially overlap.
  • the object is achieved according to the invention in that the sample excited by the excitation light beam is caused to stimulate emission in the sample point by a stimulation light beam, the intensity distributions of the excitation light beam and the stimulation light beam partially overlapping in the focal area of the objective.
  • the stimulated emission, induced by the stimulation light beam, of the sample excited by the excitation light beam in the coverage area of the intensity distributions of the excitation light and of the stimulation light in the focal area of the objective has the effect that the excited energy states in the coverage area are de-energized and no longer contribute to the spontaneously emitted radiation to be detected can.
  • the effective point imaging function which is identical to the radio image in the normal fluorescence microscope function of the lens at the wavelength of the excitation light is thereby smeared. This corresponds to an increased spatial resolution.
  • the improvement of the spatial resolution depends on the type of coverage of the intensity distributions. Both a lateral and an axial improvement in the spatial resolution can be achieved.
  • the sample is arranged on a positioning table with which a mechanical grid movement can be carried out at least in the direction of the optical axis.
  • the device corresponds to a scanning microscope in which the sample can be scanned at least along the optical axis.
  • an improvement in the spatial resolution in the axial direction is particularly advantageous, since then a better resolution can be achieved in this direction by finer screening.
  • a further advantage can be achieved if a beam raster device for controlled scanning of the sample with the excitation light beam and the stimulation light beam is provided between the light source and the objective.
  • the device is used as a scanning microscope in which the sample can be scanned laterally or three-dimensionally. With such a scanning microscope, a better spatial resolution can also be achieved in the lateral direction by reducing the screening.
  • the stimulation light beam is laterally offset in the focal plane with respect to the excitation light beam.
  • the effective point mapping function of the device is narrowed in the lateral direction.
  • the stimulation light beam is offset along the optical axis with respect to the excitation light beam. Then an improvement in the spatial resolution of the device in the axial direction is brought about.
  • at least one further stimulation light beam coming from the light source can be provided, the intensity distribution of which in the focal region of the objective is different from the intensity distribution of the other stimulation beams.
  • the intensity distributions of the additional stimulation beams are also superimposed on the intensity distribution of the excitation light beam in the focal region of the objective, whereby a further narrowing of the effective point mapping function of the device is achieved.
  • the type of narrowing of the effective point imaging function can be selected accordingly by the spatial arrangement of the stimulation light beams.
  • the stimulation light beams are advantageously arranged spatially symmetrically with respect to the excitation light beam. Then a spatially symmetrical narrowing of the main maxiroum of the effective point imaging function in the focal area is achieved.
  • the stimulation light beams can be arranged in such a way that they run through a circular ring which is concentric with the excitation light beam.
  • the stimulation beams can each have the same distance from one another. In this way, the main maximum of the intensity distribution of the excitation light beam is narrowed, so to speak, from several sides. Further arrangements of the stimulation light beams are also possible and the exact choice of the arrangement is left to the person skilled in the art.
  • the light source can comprise a laser which emits light components of different wavelengths.
  • the light of one wavelength is used as excitation light.
  • the wavelength of the light should be chosen so that the energy state of the sample can be excited with it.
  • the light component with the other wavelength is selected for the stimulation light.
  • the wavelength must be selected so that the sample is excited in the excited state via stimulated emission can be.
  • the wavelengths required for the excitation light and the stimulation light are different from one another. In the event that these wavelengths are the same, it is of course sufficient to use a laser which emits only one wavelength.
  • the light source comprises at least two lasers that emit light of different wavelengths. Then one laser is used to generate the excitation light and the other laser (s) is used to generate the stimulation light. Either several stimulation light beams can be generated with one laser, which is possible, for example, by means of a suitable aperture or by suitably arranging mirrors, or several lasers can be used to generate one or more stimulation beams.
  • the use of lasers as a light source also has the advantage that spatially highly localizable light beams with high intensity are available.
  • a continuous wave emitting the excitation light can advantageously be provided.
  • the arrangement is inexpensive by using continuous wave lasers. There may be little ⁇ least one laser may be provided which emits light pulses chronological order.
  • a stimulation light is favorably generated by a laser which emits light pulses in a chronological sequence.
  • An advantageous arrangement is that a continuous wave laser is used to generate the excitation light and at least one laser that emits light pulses in chronological order is used to generate the stimulation light.
  • the time within which the luminescence is not to be detected by the detector is determined by the pulse duration of the stimulation light. It is advantageous if the pulse duration of the laser that emits the stimulation light is 10 -10 to 10 -5 s.
  • both the excitation light and the stimulation light are generated by lasers which emit light pulses in chronological order. In this case, the pulse duration of the excitation light and the stimulation light should be shorter than the characteristic times for the spontaneous emission of the sample in the excited energy state.
  • the pulse duration of the stimulation light should be longer than the characteristic time for a decay process of the final state, in which the sample is located after the energy state has been de-stimulated by stimulated emission, into an even lower ground state. From the latter, the sample is typically excited into the energy state.
  • the pulse duration of the excitation light is advantageously 10 -15 to 10 -9 s; the pulse duration of the stimulation light is advantageously 10 -12 to 10 -9 s.
  • the laser can advantageously emit a light beam with a Gaussian intensity distribution to generate the stimulation light. This also results in a Gaussian spatial intensity distribution in the focal plane.
  • Such an intensity distribution has the advantage that it has no secondary maxima by which the resolution could be deteriorated.
  • This is particularly advantageous in the case of the stimulation beams, since these can then be superimposed on the excitation light beam such that they laterally overlap the main maximum of the intensity distribution of the excitation beam. In this case, any side maxima present in the intensity distribution of the excitation light beam are eliminated due to the effect of the stimulation light beams in the effective point mapping function.
  • the stimulation light rays of the intensity distribution of the excitation light beam can be superimposed from the outside without new secondary maxima appearing in the effective point imaging function.
  • the main maximum of the effective point imaging function is significantly narrowed without secondary maxima occurring. It is also advantageous if the light source for generating the stimulated emission is of high intensity, so that there is a non-linear relationship between this intensity and the occupation of the energy state of the sample. As a result, the stimulated light state in the coverage area of the intensity distribution of the excitation and stimulation light can be spatially very sharply delimited by stimulated emission, so that the effective point imaging function is spatially very sharply delimited and at the same time the reduction in the overall luminescence intensity is minimized.
  • the separation device comprises a time control device with which the detector can be switched on immediately after a pulse of the stimulation light has decayed.
  • the timing control device can also control the lasers in such a way that a stimulation light pulse is emitted as soon as an excitation light pulse has subsided.
  • the detector can then be actuated after the pulse of the stimulation light has decayed using the same time control device.
  • the preferred pulse durations of the lasers have already been mentioned above. It is possible to easily and cleanly separate the emission light of the sample, even if the excitation light has the same wavelength as the emission light.
  • the construction of the device is mechanically simple since no further filter elements have to be used.
  • the separation device can have a poiarization element upstream of the objective for polarizing the stimulation light and a poiarization element downstream of the objective for polarizing the one going to the detector Include light with an orthogonal transmission direction to that of the clarification element upstream of the lens.
  • a polarization element for polarizing the excitation light can also be arranged upstream of the lens and a further polarization element can be connected downstream of the lens, which has an orthogonal transmission direction to the polarization element for polarizing the light going to the detector.
  • the separation device has at least one wavelength filter.
  • the wavelength filters the light emitted by the sample can be separated from the excitation light if there are different wavelengths.
  • a wavelength filter is installed downstream of the lens. Color filters, dichroic filters, monochromators, prisms etc. can be used as wavelength filters.
  • the separation device can have a dichroic mirror. The mirror is then arranged between the light source and the lens, so that the light emitted by the sample is directed by the dichroic mirror, if it has a certain wavelength, into the detector.
  • the detector can be a point detector.
  • a focusing element and a diaphragm can be connected upstream of the detector, the diaphragm being arranged in a plane optically conjugate to the focal plane of the objective.
  • the aperture is, for example, a perforated aperture, and its diameter is preferably so large that its image in the sample area is of the order of magnitude of the extension of the effective point imaging function that is at the wavelength of the light to be detected.
  • the point mapping function of the The device results from the product of the effective point imaging function and the detection point imaging function. Because of the point detector, an additional narrowing of the main maximum of the point mapping function of the device and thus a further improvement in the resolution is achieved.
  • a further improvement in the spatial resolution of the device can be achieved in that a filter element which is transparent to the wavelength of the stimulation light and which has an opaque central region and a transparent outer region for the wavelength of the excitation light is arranged between the light source and the objective.
  • a filter element shifts light in the intensity distribution of the excitation light in the focal region from the main maximum to the secondary diffraction maxima, the main maximum being significantly narrowed. This leads to a further narrowing of the effective point mapping function.
  • the increase in intensity in the secondary maxima of the intensity distribution of the excitation light is not disturbing in this case, since these are suppressed in the effective point imaging function due to the intensity distribution of the stimulation light, since the intensity distributions partially overlap.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of an exemplary embodiment of the device according to the invention
  • FIG. 2 shows an example for the intensity distribution of the excitation light and for the intensity distributions of the stimulation light in the focal plane of the objective of the inventive device and
  • FIG. 1 shows the arrangement of a scanning microscope as an exemplary embodiment of the device according to the invention.
  • the scanning microscope comprises a light source 1 with a laser 2 for emitting excitation light and a laser 3 for emitting stimulation light.
  • dichroic mirrors 4 and 5 and a lens 6 are provided, with which the excitation light and stimulation light coming from the lasers 2 and 3 are directed or focused onto a sample point 7 of the sample 8.
  • the sample point 7 has a spatial extent, which is an area here.
  • a detector 9 is arranged to detect the emission light emitted by the sample 8, which is separated out of the excitation light 18 with the dichroic mirror 5.
  • the sample is arranged on a positioning table 10.
  • a beam raster device 11 is provided for the controlled scanning of the sample 8 with the excitation light and the stimulation light.
  • the light source 1 comprises lenses 12 and 13 and an aperture 14.
  • the lens 12 is used to focus the laser beam coming from the laser 2 onto the aperture 14.
  • the lens 13 serves to adjust the divergence of the excitation light beam and the stimulation light beams so that they can be focused in the same plane with the aid of the lens 6. Pinholes are usually used as apertures.
  • a beam splitter 23 and a mirror 24 for splitting the beam coming from the laser 3 into two stimulation light beams 17 are arranged behind the laser 3. The arrangement is chosen so that the excitation light beam and the stimulation light beams strike the mirror 4 in such a way that the intensity distributions of the beams partially overlap after deflecting the mirror 5 and passing through the lens 6 in the focal region of the lens 6.
  • two stimulation light beams are shown. But it can also only be one or more further stimulation light beams can be used.
  • further lasers can be used which are more analogous to the beam structure of laser 3.
  • criminal; are used, the beams being directed in a suitable manner onto the mirror 4 and from there via the mirror 5 and the objective 6 onto the sample point 7.
  • a laser 3 can also be used as shown, and the stimulation light beam coming from the laser 3 can be broken down into individual stimulation light beams via further beam splitters. It is important that the stimulation light beams are all arranged in such a way that their intensity distributions in the focal region of the objective 6 partially coincide with the intensity distribution of the excitation light beam.
  • the lasers 3 or the associated beam elements must be arranged in such a way that a desired predetermined arrangement of the intensity distributions in the focal area of the objective 6 is obtained.
  • different stimulation light beams can be arranged on a circular ring, through the center of which the excitation light beam 16 coming from the laser 2 runs.
  • the energy state of the sample 8 is excited with the excitation light beam 16 impinging there.
  • the wavelength of the excitation light is selected to excite this energy state.
  • the stimulation light beam 17 coming from the laser 3 strikes, the energy state of the sample 8 excited with the excitation light is excited in a lower state by stimulated emission.
  • the laser 3 can emit the stimulation light as light pulses in a chronological sequence.
  • the emission light emitted spontaneously by the sample 8 is directed through the lens 6 and the mirror 5 into the detector 9 and is detected there.
  • the emission light for detection in the detector 9 is separated from the excitation light 16 by the dichroic mirror 5. This is possible since the excitation light 16 generally has a different wavelength than the emission light 18.
  • To further improve the Selection of the emission light 13 based on its wavelength has a color filter 19 arranged in front of the detector 9.
  • polarizer 20 connected upstream of the objective 6 for polarizing the stimulation light 17 and a polarizer 21 connected downstream of the objective 6. Polarization of the light going to the detector is provided.
  • the polarizers 20 and 21 have an orthogonal transmission direction. With the help of the polarizers 20 and 21, the emission light coming from the sample 8 can be separated from the stimulation light.
  • the polarizers 20, 21 are required because the stimulation light and the emission light do not have the same wavelengths and are therefore not separable from one another by color filters.
  • the color filter 19 and the polarizer 21 are preceded by a pinhole 15, which is located in a plane optically conjugate to the focal plane of the objective.
  • the emission light coming from the sample can be separated from the stimulation light or the excitation light by a timing control device, not shown.
  • a timing control device not shown.
  • the timing device must turn on the detector immediately after a pulse of the stimulation light has subsided. In this way, the emission light can be easily and reliably separated from the stimulation light.
  • the filter 19 and polarizers 20, 21 can also be arranged as shown in FIG. 1 as required.
  • a lens 22, with which the excitation light beam 16 and the stimulation light beams 17 are focused into the beam grid device 11, is connected upstream of the beam grid device 11.
  • the excitation light beam 16 and the stimulation light beam 17 are controlled with the beam raster device 11 in such a way that they scan the points 7, 7 ',... Of the sample 8 in a desired sequence.
  • the measurement described above is carried out in each of the points 7, 7 '.
  • FIG. 2 shows the intensity distribution 25 of the excitation light beam and the intensity distribution 26 of two stimulation light beams 17.
  • the intensity distribution 25 of the excitation light beam 16 has a main maximum and, in addition, symmetrical secondary maxima in the lateral direction.
  • the intensity distribution 26 of the stimulation beams 17 are in each case Gaussian.
  • the maxima of the Gaussian distributions of the stimulation light are laterally offset with respect to the maximum of the intensity distribution 25 of the excitation light.
  • a symmetrical arrangement is selected in which the two stimulation light beams are shifted in the opposite direction with the same distance with respect to the central axis through the intensity distribution 25 of the excitation light.
  • the intensity of the stimulation light is significantly greater than the intensity of the excitation light.
  • the intensity of the stimulation light beam is selected so that there is a non-linear relationship between this intensity and the occupation of the energy state of the sample.
  • FIG. 3 shows the effective point imaging function in the focal plane of the objective, into which the intensity distributions of FIG. 2 are incorporated.
  • the effective point imaging function determines the spatial resolution of a scanning microscope.
  • the resulting effective point imaging function has a maximum whose half-value width is significantly narrower than the half-value width of the intensity distribution of the excitation light, compare FIG. 2.
  • the secondary maxima contained in the excitation light are eliminated by the overall effect of the intensity distributions shown in FIG .
  • the positioning table 10 is used to bring the sample 8 into a specific position on the optical axis A.
  • the lasers 2, 3 as well as the lenses 12, 13, the diaphragm 14, the beam splitter 23 and the mirror 24 are arranged in such a way that the stimulating light beams 17 and the excitation light beam 16 are directed by the mirror 5 and the objective 6 onto a selected sample point 7 .
  • the stimulation light beams 17 are aligned in such a way that their intensity distributions coincide in the focal region of the objective 6 with the intensity distribution of the excitation light beam 16 in a desired manner.
  • the filter 19 and the polarizers 20, 21 are arranged such that the emission light emitted by the sample in the sample point 7 is separated from the excitation light and the separation light and directed into the detector 9 and detected there.
  • a new sample point 7 ' is selected.
  • the excitation light beam 16 and the stimulation light beam 17 are directed onto the sample point 7 '.
  • the measurement takes place there in the same way as in the sample point 7.
  • the excitation light beam 16 and the stimulation light beams 17 are directed by the beam scanning device II to a further sample point until the sample 8 is scanned and measured in the desired area in the lateral direction.
  • the positioning table 10 in the direction of the optical Axis A shifted. In this position of sample 8, the entire measurement process begins again. In this way, the sample 8 can be scanned three-dimensionally and measured.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum optischen Messen eines Probenpunktes (7) einer Probe (8) mit hoher Ortsauflösung, mit einer Lichtquelle (1) zum Aussenden eines zum Anregen eines Energiezustandes der Probe (8) geeigneten Anregungslichtstrahls (16), einem Objektiv (6) zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls (16) auf den Probenpunkt (7) der im Fokalbereich des Objektivs (6) anordenbare Probe (8), einer Separationseinrichtung (5) zum Herausseparieren des von der Probe (8) aufgrund der Anregung des Energiezustandes spontan abgestrahlten Emissionslichts und einem Detektor (9) zum Nachweis des Emissionslichts sowie ein entsprechendes Verfahren. Die laterale Auflösung der Vorrichtung und des Verfahrens werden dadurch verbessert, daß ein von der Lichtquelle (1) kommende Stimulationslichtstrahl (17) zum Erzeugen stimulierter Emission der von dem Anregungslichtstrahl (16) angeregten Probe (8) in dem Probenpunkt (7) vorgesehen ist, wobei der Anregungslichtstrahl (16) und der Stimulationslichtstrahl (17) derart angeordnet sind, daß sich ihre Intensitätsverteilungen im Fokalbereich teilweise decken.

Description

Vorrichtung und Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunktes einer Probe mit hoher Ortsauflösung
Die Erfindung betrifft eine Verrichtung zum optischen Messen eines Probenpunktes einer Probe mit hoher Ortsauflösung, mit einer Lichtquelle zum Aussenden eines zum Anregen eines Energiezustandes der Probe geeigneten Anregungslichtstrahls, einem Objektiv zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls auf den Probenpunkt, der im Fokalbereich des Objektivs anordenbaren Probe, einer Separationseinrichtung zum Herausseparieren des von der Probe aufgrund der Anregung des Energiezustandes spontan abgestrahlten Emissionsiichts und einem Detektor zum Nachweis des Emissionslichts. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunktes einer Probe mit hoher Ortsauflösung, bei dem ein Anregungsiichtstrahl auf den zu messenden Probenpunkt mitrels eines Objektivs fokussiert wird und dort den Energiezustand anregt, und bei dem das vor. dem Probenpunkt aufgrund der Anregung des Energiezustands spontan emittierte Emissionslicht heraussepariert und nachgewiesen wird.
Eine solche Vorrichtung und ein solches Verfahren sind aus der Praxis bekannt. Sie finden ihre Anwendung z. B. bei Mikroskopen und insbesondere bei Rastermikroskopen. Mit einem Rastermikroskop werden einzelne Probenpunkte abgetastet und gemessen. Auf diese Weise kann die Probe dreidimensional vermessen werden. Es werden lumineszierende, insbesondere fiuereszierende oder phosphoreszierende Proben oder mit entsprechenden Farbstoffen versehene Proben verwendet.
Bei einer solchen Vorrichtung und einem solchen Verfahren ist es wünschenswert, eine gute Ortsauflösung zu erreichen. Die Ortsauflösung ist durch die räumliche Ausdehnung der sogenannten effektiven Punktabbiidungsfuktion gegeben. Diese ist eine ortssbhängige Funktion, die die Wahrscheinlichkeit quantifiziere, mit der aus einem bestimmten Punkt des Fokalbereichs ein Photon spontan emittiert wird. Sie ist mit der räumlicher. Verteilung der Wahrscheinlichkeit, daß an einem bestimmten Punkt des Fokalbereichs der Energiezustand angeregt ist, identisch. Bei herkömmlichen Fioureszenzmikroskopen ist die effektive Punktabbiidungsfuktion identisch mit der Punktabbildungsfunktion des Objektivs bei der Wellenlänge des Anregungslichts, welche die Intensitätsverteilung des Anregungslichts im Fokalbereich des Objektivs angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein Beleuchtungsphoton in einem bestimmten Punkt des Fokalbereichs anzutreffen ist. Bei einem Rastermikroskop ist die Unterteilung der Rasterung durch die Ortsauflösung begrenzt. Bei einer besseren Ortsauflösung kann daher eine feinere Unterteilung gewählt werden, mit der eine bessere Auflösung des rekonstruierten Bildes erzielt werden kann.
Es ist bekannt, daß bei einem Rastermikroskop die Auflösung dadurch verbessert werden kann, daß das von der Probe emittierte Licht auf den Punktdetektor abgebildet wird, der in einer zu der Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet ist. Eine solche Anordnung wird als konfokale Anordnung bezeichnet. Die bessere Auflösung kommt dadurch zustande, daß zwei Punktabbildungsfunktionen die Abbildung im konvokalen Rastermikroskop bestimmen: Die effektive Punktabbildungsfunktion und die Detektionsabbildungsfunktion, welche die Abbildung des von der Probe emittierten, zu detektierenden Lichts in den Punktdetektor beschreibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein aus dem Fokalbereich emittiertes Photon in den Punktdetektor gelangt. Da sowohl Beleuchtung und Detektion stattfinden müssen, ist die Punktabbildungsfunktion eines konfokalen Rastermikroskops das Produkt aus beiden Wahrscheinlichkeitsverteilungen, d. h. aus der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion und der Detektionspunkt-Abbildungsfunktion. Dies führt zu einep deutlich schmaleren Haupt maximum der kcnfokalen Punktabbiidungsfunktion im Vergleich zu einem nicht konfokal angeordneten Mikroskop. Dies entspricht einer höheren Auflösung des kcnfokalen Mikroskops und bewirkt eine Diskriminierung aller Punkte, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung des Fokus befinden. Letzteres ist Voraussetzung für die Erstellung dreidimensionaler Bilder im Rasterverfahren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die gattungsgemäße Vorrichtung und das gattungsgemäße Verfahren derart zu verbessern, daß eine größere Ortsauflösung erzielt wird.
Hinsichtlich der Vorrichtung wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch einen von der Lichtquelle kommenden Stimulationslichtstrahl zur Erzeugung stimulierter Emission der von dem Anregungslichtstrahl angeregten Probe in dem Probenpunkt gelöst, wobei der Anregungsiichtstrahl und der Stimulationslichtstrahi derart angeordnet sind, daß sich ihre Intensitätsverteilungen im Fokalbereich teilweise decken.
Hinsichtlich des Verfahrens wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die von dem Anregungsiichtstrahl angeregte Probe in dem Probenpunkt durch einen Stimulationslichtstrahl zu stimulierte Emission veranlaßt wird, wobei sich die Intensitätsverteilungen des Anregungslichtstrahls und des Stimulationsiichtstrahis im Fokalbereich des Objektivs teilweise decken.
Durch die durch den Stimulationslichtstrahl induzierte stimulierte Emission der von dem Anregungsiichtstrahl angeregten Probe in dem Deckungsbereich der Intensitätsverteilungen des Anregungslichts und des Stimulationslichts im Fokalbereich des Objektivs wird bewirkt, daß die angeregten Energiezustände im Deckungsbereich abgeregt werden und nicht mehr zu der zu detektierenden spontan emittierten Strahlung beitragen können. Die effektive Punktabbildungsfunktion, die im normalen Fluoreszenzmikroskop identisch mit der Funktabbi ldungs funktion des Objektivs bei der Wellenlänge des Anregungslichts ist, wird dadurch verschmäiert. Dies entspricht einer erhöhten räumlichen Auflösung. Die Verbesserung der Ortsauflösung ist von der Art der Deckung der Intensitätsverteiiungen abhängig. Es kann sowohl eine laterale als auch eine axiale Verbesserung in der Ortsauflösung erzielt werden.
Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn die Probe auf einem Positioniertisch angeordnet ist, mit dem eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse durchführbar ist. Die Vorrichtung entspricht dann einem Rastermikroskop, bei dem die Probe zumindest entlang der optischen Achse abgerastert werden kann. In diesem Fall ist eine Verbesserung der Ortsauflösung in axialer Richtung besonders vorteilhaft, da dann in dieser Richtung durch feineres Rastern eine bessere Auflösung erzielt werden kann. Ein weiterer Vorteil kann erreicht werden, wenn zwischen der Lichtquelle und dem Objektiv eine Strahlrastereinrichtung zum gesteuerten Abrastern der Probe mit dem Anregungsiichtstrahl und dem Stimulationslichtstrahl vorgesehen ist. Die Vorrichtung wird als Rastermikroskop verwendet, bei dem die Probe lateral oder dreidimensional abgerastert werden kann. Bei einem solchen Rastermikroskop kann dann durch Verkleinern der Rasterung auch in der lateralen Richtung eine bessere Ortsauflösung erzielt werden.
Ferner ist es vorteilhaft, wenn der Stimulationslichtstrahl hinsichtlich des Anregungslichtstrahls in der Fokalebene lateral versetzt ist. Durch diese Anordnung wird eine Verschmälerung der effektiven Punktabbildungsfunktion der Vorrichtung in lateraler Richtung bewirkt. Auch kann es günstig sein, wenn der Stimulationslichtstrahl hinsichtlich des Anregungslichtstrahls entlang der optischen Achse versetzt ist. Dann wird eine Verbesserung der Ortsauflösung der Vorrichtung in axialer Richtung bewirkt. Vorteilhafterweise kann wenigstens ein weiterer von der Lichtquelle kommender Stimulationslichtstrahl vorgesehen sein, dessen Intensitätsverteilung im Fokalbereich des Objektivs von der Intensitätsverteilung der übrigen Stimulationsstrahlen verschieden ist. Bei dieser Anordnung werden die Intensitätsverteilungen der zusätzlichen Stimulationsstrahien ebenfalls der Intensitätsverteiiung des Anregungslichtstrahis im Fokalbereich des Objektivs überlagert, wodurch eine weitere Verschmälerung der effektiven Punktabbildungsfunktion der Vorrichtung erzielt wird. Die Art der Verschmälerung der effektiven Punktabbiidungsfunktion kann durch die räumliche Anordnung der Stimulationslichtstrahlen entsprechend gewählt werden. Günstigerweise kennen die Stimuiationsiichtstrahlen hinsichtlich des Anregungslichtstrahls räumlich symmetrisch angeordnet werden. Dann wird eine räumlich symmetrische Verschmälerung des Hauptmaxiroums der effektiven Punktabbiidungsfunktion im Fokalbereich erzielt. Z. B. können die Stimulationslichtstrahlen derart angeordnet werden, daß sie durch einen zu dem Anregungsiichtstrahl konzentrischen Kreisring verlaufen. Dabei können die Stimulationsstrahlen zueinander jeweils einen gleichen Abstand aufweisen. Auf diese Weise wird das Hauptmaximum der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls sozusagen von mehreren Seiten gleichmäßig verschmälert. Auch weitere Anordnungen der Stimuiationslichtstrahlen sind möglich und die genaue Aμswahl der Anordnung ist dem Fachmann überlassen.
Gemäß einer günstigen Weiterbildung der Erfindung kann die Lichtquelle einen Laser umfassen, der Lichtanteile unterschiedlicher Wellenlängen emittiert. Das Licht der einen Wellenlänge wird dsnn als Anregungsiicht verwendet. Die Wellenlänge des Lichtes ist dabei so zu wählen, daß der Energiezustand der Probe damit angeregt werden kann. Der Lichtanteil mit der anderen Wellenlänge wird für das Stimuiationslicht gewählt. Die Wellenlange muß so gewählt sein, daß die Probe in dem angeregten Zustand über stimulierte Emission abgeregt werden kann. Im Normaifall sind die für das Anregungslicht und das Stimuiationslicht erforderlichen Wellenlängen voneinander verschieden. Für den Fall, daß diese Wellenlängen gleich sind, genügt es selbstverständlich, einen Laser zu verwenden, der nur eine Wellenlänge emittiert.
Auch kann es vorteilhaft sein, wenn die Lichtquelle wenigstens zwei Laser umfaßt, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren. Dann dient der eine Laser zum Erzeugen des Anregungslichtes und der/die andere/n Laser zum Erzeugen des Stimulationslichtes. Es können entweder mit einem Laser mehrere Stimulationslichtstrahien erzeugt werden, was etwa durch eine geeignete Blende oder durch geeignetes Anordnen von Spiegeln möglich ist oder es können mehrere Laser zum Erzeugen je eines oder mehrerer Stimulationsstrahlen verwendet werden. Die Verwendung von Lasern als Lichtquelle hat ferner den Vorteil, daß räumlich stark lokaiisierbare Lichtstrahlen mit hoher Intensität zur Verfügung stehen.
Günstigerweise kann ein Dauerstrichiaser vorgesehen sein, der das Anregungslicht aussendet. Durch das Verwenden von Dauerstrichlasern wird die Anordnung kostengünstig. Es kann wenig¬ stens ein Laser vorgesehen sein, der Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet. Günstigerweise erzeugt ein Laser, der Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet, das Stimuiationslicht.
Eine vorteilhafte Anordnung besteht darin, daß ein Dauerstrichlaser zum Erzeugen des Anregungslichtes und wenigstens ein Laser, der Lichtpulse in zeitlicher Abfolge ausstrahlt, zur Erzeugung des Stimuiationslicht verwendet wird. Dabei wird die Zeit, .innerhalb der das Lumineszenziicht vom Detektor erfaßt werden soll, durch die Pulsdauer des Stimulationslichtes bestimmt. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Pulsdauer des Lasers, der das Stimuiationslicht ausstrahlt, 10-10 bis 10-5 s beträgt. Gemäß einer weiteren vorteilhaften Anordnung wird sowohl das Anregungslicht als auch das Stimuiationslicht von Lasern erzeugt, die Lichtpulse in zeitlicher Abfolge aussenden. Die Pulsdauer des Anregungslichtes und des Stimulationslichtes sollen in diesem Fall kleiner sein als die charakteristischen Zeiten für die spontane Emission der Probe in dem angeregten Energiezustand. Die Puisdauer des Stimuiationslichts soll größer sein als die charakteristische Zeit für einen Zerfallsprozeß des Endzustandes, in dem sich die Probe nach Abregen des Energiezustandes durch stimulierte Emission befindet, in einen noch tiefer liegenden Grundzustand. Von letzterem aus wird die Probe typischerweise in den Energiezustand angeregt. Die Pulsdauer des Anregungslichtes beträgt vorteilhafterweise 10-15 bis 10-9s; die Pulsdauer des Stimulationslichtes beträgt günstigerweise 10-12 bis 10-9s.
Vorteilhafterweise kann der Laser zur Erzeugung des Stimulationslichts einen Lichtstrahl mit gaußförmiger Intensitätsverteilung aussenden. Dadurch wird in der Fokaiebene ebenfalls eine gaußförmige räumliche Intensitätsverteiiung erzielt. Eine solche Intensitätsverteilung hat den Vorteil, daß sie keine Nebenmaxima aufweist, durch welche die Auflösung verschlechtert v/erden könnte. Dies ist insbesondere bei den Stimulationsstrahlen vorteilhaft, da diese dem Anregungslichtstrahl dann so überlagert werden können, daß sie sich dem Hauptmaximum der Intensitätsverteiiung des Anregungsstrahles lateral überlappen. In diesem Fall werden eventuell in der Intensitätsverteiiung des Anregungslichtstrahls vorhandene Seitenmaxima aufgrund der Wirkung der Stimulatiσnslichtstrahlen in der effektiven Punktabbildungfunktion eliminiert. Dabei können die Stimulationsiichtstrahien der Intensitätsverteiiung des Anregungslichtstrahls von außen her überlagert werden, ohne daß in der effektiven Punktabbiidungsfunktion neue Nebenmaxima entstehen. In diesem Fall wird eine deutliche Verschmälerung des Hauptmaximums der effektiven Punktabbiidungsfunktion erzielt, ohne daß Nebenmaxima auftreten. Auch ist es günstig, wenn die Lichtquelle zur Erzeugung der stimulierten Emission von hoher Intensität ist, so daß zwischen dieser Intensität und der Besetzung des Energiezustandes der Probe ein nichtlinearer Zusammenhang besteht. Dadurch kann mit dem Stimulationslichtstrahl der angeregte Energiezustand im Deckungsbereich der Intensitätsverteilung des Anregungs- und des Stimulationslichtes durch stimulierte Emission räumlich sehr scharf begrenzt - abgeregt werden, so daß auch die effektive Punktabbiidungsfunktion räumlich sehr scharf begrenzt wird und zugleich die Verminderung der gesamten Lumineszenzintensität minimiert wird.
Gemäß einem vorteilhaften Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt die Separationseinrichtung eine Zeitsteuerungseinrichtung, mit der der Detektor unmittelbar nach Abklingen eines Pulses des Stimulationslichts eingeschaltet werden kann. Wenn bei dieser Anordnung sowohl zum Erzeugen des Anregungslichtes als auch zum Erzeugen des Separationslichtes Laser verwendet werden, die Lichtpuise zeitlicher Abfolge aussenden, kann die Zeitsteuereinrichtung auch die Laser derart steuern, daß ein Stimulationslichtpuls ausgesendet wird, sobald ein Anregungslichtpuls abgeklungen ist. Das Betätigen des Detektors nach Abklingen des Pulses des Stimulationslichtes kann dann mit der gleichen Zeitsteuerungseinrichtung erfolgen. Die bevorzugten Pulsdauern der Laser wurden oben bereits genannt. Es ist ein einfaches und sauberes Heraustrennen des Emissionlichts der Probe möglich, auch dann, wenn das Anregungslicht gleiche Wellenlänge wie das Emissionsiicht hat. Der Aufbau der Vorrichtung wird mechanisch einfach, da keine weiteren Filterelemente verwendet werden müssen.
Gemäß einem anderen vorteilhaften Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die Separationseinrichtung ein dem objektiv vorgeschaltetes Poiarisationseiement zum Polarisieren des Stimulationslichts und ein dem Objektivs nachgeschaltetes Poiarisationseiement zum Polarisieren des zum Detektor gehenden Lichts mit einer orthogonalen Durchlaßrichtung zu der des dem Objektiv vorgeschalteten Pclarisationselements umfassen. Vorbzw. nachgeschaitet bedeutet hier sowohl räumlich als auch in Laufrichtung des Lichtes vor bzw. nach dem Objektiv. Dadurch ist es möglich, das Emissionlicht von dem Stimuiationslicht bei gleichen Wellenlängen zuverlässig voneinander zu trennen. Es kann auch ein Polarisationselement zum Polarisieren des Anregungslichts dem Objektiv vorgeschaltet angeordnet sein und ein weiteres Polarisationselement dem Objektiv nachgeschaltet sein, welches zu dem Poiarisationselement zum Polarisieren des zum Detektor gehenden Lichts eine orthogonale Durchlaßrichtung aufweist. So kann das von der Probe emittierte Licht auch von dem Anregungslicht getrennt werden. Auch ist es vorteilhaft, wenn die Separationseinrichtung wenigstens ein Wellenlängenfilter aufweist. Mit den Wellenlängenfiltern kann das von der Probe emittierte Licht von dem Anregungslicht heraussepariert werden, wenn unterschiedliche Wellenlängen vorliegen. Ein Welienlängenfilter ist dem Objektiv nachgeschaltet. Als Welienlängenfilter können Farbfilter, dichroitische Filter, Monochromatoren, Prismen etc. verwendet werden. Ferner kann die Separationseinrichtung einen dichroitischen Spiegel aufweisen. Der Spiegel ist dann zwischen der Lichtquelle und dem Objektiv angeordnet, so daß das von der Probe emittierte Licht von dem dichroitischen Spiegel, wenn es eine bestimmte Wellenlänge aufweist, in den Detektor gelenkt wird.
Gemäß einer günstigen Weiterbildung der Erfindung kann der Detektor ein Punktdetektor sein. Dem Detektor kann ein Fokussierungselement und eine Blende vorgeschaltet sein, wobei die Blende in einer zur Fokalebene des Objektivs optisch konjugierten Ebene angeordnet ist. Die Blende ist beispielsweise eine Lochbiende, wobei ihr Durchmesser vorzugsweise so groß ist, daß ihr Bild im Probenbereich in der Größenordnung der Ausdehnung der effektiven Punktabbildungsfunktion ist, das man bei der Wellenlänge des zu detektierenden Lichtes hat. Die Punktabbiidungsfunktion der Vorrichtung ergibt sich aus dem Produkt der effektiven Punktabbiidungsfunktion und der Detektionspunkt-Abbildungsfunktion. Aufgrund des Punktdetektors wird also eine zusätzliche Verschmälerung des Hauptmaximums der Punktabbildungsfunktion der Vorrichtung und damit eine weitere Verbesserung der Auflösung erzielt.
Eine weitere Verbesserung der Ortsauflösung der Vorrichtung kann dadurch erzielt werden, daß zwischen der Lichtquelle und dem Objektiv ein für die Wellenlänge des Stimulationslichts durchlässiges Filterelement angeordnet ist, weiches für die Wellenlänge des Anregungslichts einen undurchlässigen Mittenbereich und einen durchlässigen Außenbereich aufweist. Ein solches Filterelement verlagert in der IntensitätsVerteilung des Anregungslichtes im Fokalbereich Licht aus dem Hauptmaximum in die Beugungsnebenmaxima, wobei das Hauptmaximum deutlich verschmälert wird. Dies führt zu einer weiteren Verschmälerung der effektiven Punktabbildungsfuktion. Die Intensitätszunahme in den Nebenmaxima der Intensitätsverteilung des Anregungslichts ist in diesem Fall nicht störend, da diese aufgrund der Intensitätsverteiiung des Stimulationslichts in der effektiven Punktabbiidungsfunktion unterdrückt werden, da sich die Intensitätsverteilungen teilweise überlappen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher beschrieben. Es zeigen:
Figur 1 ein schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Figur 2 ein Beispiel für die Intensitätsverteiiung des Anregungslichts und für die Intensitätsverteilungen des Stimulationslichts in der Fokalebene des Objektivs der erfindungsgemäßen Verrichtung und
Figur 3 die effektive Punktabbiidungsfunktion in der Fckalebene des Objektivs der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Figur 1 zeigt als Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Anordnung eines Rastermikroskops. Das Rastermikroskop umfaßt eine Lichtquelle 1 mit einem Laser 2 zum Aussenden von Anregungslicht und einem Laser 3 zum Aussenden von Stimuiationslicht. Ferner sind dichroitische Spiegel 4 und 5 und ein Objektiv 6 vorgesehen, mit denen das von den Lasern 2 und 3 kommende Anregungslicht und Stimuiationslicht auf einen Probenpunkt 7 der Probe 8 gelenkt bzw. fokussiert wird. Der Probenpunkt 7 hat dabei eine Ortsausdehnung, welche hier eine Flächenausdehnung ist. Ein Detektor 9 ist zum Nachweis des von der Probe 8 emittierten Emissionslichts angeordnet, welches mit dem dichroitischen Spiegel 5 aus dem Anregungslicht 18 heraussepariert wird. Die Probe ist auf einem Positioniertisch 10 angeordnet. Zwischen der Lichtquelle 1 und dem Objektiv 6 ist eine Strahlrastereinrichtung 11 zum gesteuerten Abrastern der Probe 8 mit dem Anregungslicht und dem Stimuiationslicht vorgesehen. Die Lichtquelle 1 umfaßt zusätzlich zu den Lasern 2 und 3 Linsen 12 und 13 sowie eine Blende 14. Mit der Linse 12 wird der von dem Laser 2 kommende Laserstrahl auf die Blende 14 fokussiert. Die Linse 13 dient zur Anpassung der Divergenz des Anregungslichtstrahls und der Stimulationslichtstrahlen, damit sie in der gleichen Ebene mit Hilfe des Objektivs 6 fokussiert werden können. Ais Blenden werden üblicherweise Lochblendeh verwendet. Hinter dem Laser 3 sind ein Strahiteiler 23 und ein Spiegel 24 zum Aufteilen des von dem Laser 3 kommenden Strahls in zwei Stimulationslichtstrahlen 17 angeordnet. Die Anordnung ist so gewählt, daß der Anregungslichtstrahl und die Stimulationslichtstrahlen derart auf den Spiegel 4 auftreffen, daß sich die Intensitätsverteilungen der Strahlen nach Umlenken an dem Spiegel 5 und Durchlaufen des Objektivs 6 im Fokalbereich des Objektivs- 6 teilweise decken.
In dem gezeigten Ausführungsbeispiel sind zwei Stimulationsiichtstrahl gezeigt. Es können aber auch nur ein oder noch weitere Stimulationslichtstrahlen verwendet werden. Hierzu können entweder weitere Laser mit zu dem Strahlenganσ des Lasers 3 analoger. Strahiengänger; verwendet werden, wobei die Strahlen in geeigneter Weise auf den Spiegel 4 und von dort über den Spiegel 5 und das Objektiv 6 auf den Probenpunkt 7 gelenkt werden. Es kann aber auch wie gezeigt ein Laser 3 verwendet werden, und der von dem Laser 3 kommende Stimulationslichtstrahl über weitere Strahlteiler in einzelne Stimulationslichtstrahlen zerlegt werden. Wichtig ist, daß die Stimulationslichtstrahlen alle derart angeordnet sind, daß sich ihre Intensitätsverteilungen im Fokalbereich des Objektivs 6 teilweise mit der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls decken. Die Laser 3 bzw. die dazugehörigen nicht dargestellten Strahielemente, wie Strahlteiler, Linsen, etc. müssen derart angeordnet sein, daß sich eine gewünschte vorherbestimmte Anordnung der Intensitätsverteilungen im Fokalbereich des Objektivs 6 ergibt. Z. B. können verschieden Stimulationslichtstrahlen auf einem Kreisring angeordnet sein, durch dessen Mittelpunkt der von dem Laser 2 kommende Anregungsiichtstrahl 16 verläuft.
In dem Punkt 7 wird der Energiezustand der Probe 8 mit dem dort auftreffenden Anregungsiichtstrahl 16 angeregt. Die Wellenlänge des Anregungslichts ist geeignet zum Anregen dieses Energiezustandes gewählt. Durch Auftreffen des von dem Laser 3 kommenden Stimuiationslichtstrahl 17 wird der mit dem Anregungslicht angeregte Energiezustand der Probe 8 über stimulierte Emission in einem tieferliegenden Zustand abgeregt. Hierzu kann der Laser 3 das Stimuiationslicht als Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussenden. Das von der Probe 8 spontan emittierte Emissionsiicht wird durch das Objektiv 6 und den Spiegel 5 in den Detektor 9 gelenkt und dort nachgewiesen. In der gezeigten Darstellung wird das Emissionslicht zum Nachweis in dem Detektor 9 von dem Anregungslicht 16 durch den dichroitischen Spiegel 5 getrennt. Dies ist möglich, da in der Regel das Anregungsiicht 16 eine andere Wellenlänge hat als das Emissionsiicht 18. Zur weiteren Verbesserung der Selektion des Emissionsiichts 13 aufgrund seiner Wellenlänge ist vor dem Detektor 9 ein Farbfilter 19 angeordnet.
Ferner ist ein dem Objektiv 6 vorgeschalteter Polarisator 20 zum Polarisieren des Stimulationsiichts 17 und ein dem Objektiv 6 nachgeschalteter Polarisator 21 zum. Polarisieren des zum Detektor gehenden Lichts vorgesehen. Die Polarisatoren 20 und 21 haben eine zueinander orthogonale Durchlaßrichtung. Mit Hilfe der Polarisatoren 20 und 21 läßt sich das von der Probe 8 kommende Emissionslicht von dem Stimuiationslicht trennen. Die Polarisatoren 20, 21 sind erforderlich, da das Stimuiationslicht und das Emissionsiicht gleiche Wellenlängen aufweisen und somit nicht durch Farbfilter voneinander trennbar sind. Ferner ist dem Farbfilter 19 und dem Polarisator 21 eine Lochblende 15 vorgeschaltet, die sich in einer zur Fokalebene des Objektivs optisch konjugierten Ebene befindet. Alternativ kann das von der Probe kommende Emissionslicht von dem Stimuiationslicht bzw. dem Anregungslicht durch eine nicht dargestellte Zeitsteuerungseinrichtung getrennt werden. Dies ist dann möglich, wenn der Laser 3 Stimulationslichtpulse in zeitlicher Abfolge und der Laser 2 Anregungsiichtpulse in zeitlicher Abfolge aussenden. Die Zeitsteuerungseinrichtung muß den Detektor unmittelbar nach Abklingen eines Pulses des Stimulationsiichts einschalten. Auf diese Weise kann das Emissionslicht einfach und zuverlässig von dem Stimulationsiichts getrennt werden. Das Filter 19. und Polarisatoren 20, 21 können je nach Bedarf zusätzlich wie m Figur I gezeigt, angeordnet werden. Der Strahirastereinrichtung 11 ist eine Linse 22 vorgeschaltet, mit der der Anregungsiichtstrahl 16 und die Stimulationslichtstrahlen 17 in die Strahirastereinrichtung 11 fokussiert werden. Mit der Strahirastereinrichtung 11 werden der Anregungsiichtstrahl 16 und der Stimulationslichtstrahl 17 so gesteuert, daß sie die Punkte 7, 7 ',... der Probe 8 in einer gewünschten Reihenfolge abrastern. In jedem der Punkte 7, 7' wird die oben beschriebene Messung durchgeführt. In Figur 2 sind die Intensitätsverteiiung 25 des Anregungslichtstrahis und die Ir.ten≤itätsverteilungen 26 zweier Stimulationslichtstrahlen 17 dargestellt. Die Intensitätsverteilung 25 des Anregungslichtstrahls 16 hat ein Hauptmaximum und dazu symmetrische Nebenmaxima in lateraler Richtung. Die Intensitätsverteilung 26 der Stimulationsstrahlen 17 sind jeweils gaußförmig. Die Maxima der Gaußverteilungen des Stimulationsiichts sind hinsichtlich des Maximums der intensitätsverteilung 25 des Anregungslichtes lateral versetzt. Es ist eine symmetrische Anordnung gewählt, bei der die beiden Stimulationslichtstrahlen in entgegengesetzte Richtung mit gleichem Abstand hinsichtlich der Mittelachse durch die Intensitätsverteilung 25 des Anregungslichts verschoben sind. Die Intensität des Stimulationsiichts ist deutlich größer als die Intensität des AnregungsIichts. Die Intensität des Stimulationslichtstrahis ist so gewählt, daß zwischen dieser Intensität und der Besetzung des Energiezustandes der Probe ein nichtlinearer Zusammenhang besteht.
In Figur 3 ist die effektive Punktabbiidungsfunktion in der Fokalebene des Objektivs dargestellt, in weiche die Intensitätsverteiiungen der Figur 2 eingehen. Die effektive Punktabbiidungsfunktion bestimmt die Ortsauflösung eines Rastermikroskops. Wie man der Figur entnimmt, weist die resultierende effektive Punktabbiidungsfunktion ein Maximum auf, dessen Halbwertsbreite deutlich schmaler ist als die Halbwertsbreite der Intensitätsverteilung des Anregungslichts, vergleiche Figur 2. Zudem sind durch die Gesamtwirkung der in Figur 2 dargestellten Intensitätsverteilungen die in dem Anregungslicht enthaltenen Nebenmaxima eliminiert. Aufgrund des Zusammenwirkens des Anregungslichtstrahls und der Stimulationslichtstrahlen erhält man also eine effektive Punktabbiidungsfunktion mit einer erhebliehen Verbesserung in der lateralen Auflösung, da sowohl die Halbwertsbreite der effektiven Punktabbiidungsfunktion erheblich reduziert wird, als auch die in der Intensitäts Verteilung des Anregungs!ichts enthaltenen Nebenmaxima eliminiert werden, verglichen mit der effektiven Punktabbiidungsfunktion eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops, die identisch mit der Intensitätsverteilung des Anregungslichtes im Fokalbereich des Objektives ist. Aufgrund von Rechenergebnissen kann durch das erfindungsgemäße Verfahren die laterale Auflösung eines Rastermikroskops um etwa einen Faktor 5 verbessert werden. Die in den Fig. 2 und 3 dargestellten Kurven sind eine prinzipielle, nicht maßstabsgetreue Darstellung.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der Figur 1 beschrieben. In dem dort gezeigten Rastermikroskop wird mit dem Positioniertisch 10 die Probe 8 in eine bestimmte Position der optischen Achse A gebracht. Die Laser 2, 3 sowie die Linsen 12, 13, die Blende 14, der Strahlteiler 23 und der Spiegel 24 werden so angeordnet, daß die Stimulationslichtstrahlen 17 und der Anregungsiichtstrahl 16 von dem Spiegel 5 und dem Objektiv 6 auf einen gewählten Probenpunkt 7 gelenkt werden. Die Stimulationslichtstrahlen 17 werden so ausgerichtet, daß ihre Intensitätsverteiiungen sich im Fokalbereich des Objektivs 6 mit der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls 16 auf eine gewünschte Weise decken. Das Filter 19 und die Polarisatoren 20, 21 werden so angeordnet, daß das von der Probe in dem Probenpunkt 7 emittierte Emissionsiicht von dem Anregungslicht und dem Separationslicht heraussepariert und in den Detektor 9 gelenkt und dort nachgewiesen wird. Nach dieser Messung wird ein neuer Probenpunkt 7' ausgewählt. Hierzu werden der Anregungslichtstrahl 16 und der Stimulationslichtstrahl 17 auf den Probenpunkt 7' gelenkt. Dort erfolgt die Messung auf die gleiche Weise wie in dem Probenpunkt 7. Danach werden der Anregungsiichtstrahl 16 und die Stimulationslichtstrahlen 17 von der Strahirastereinrichtung II auf einen weiteren Probenpunkt gelenkt, bis die Probe 8 in dem gewünschten Bereich in lateraler Richtung abgerastert und gemessen ist. Dann wird der Positioniertisch 10 in Richtung der optischen Achse A verschoben. In dieser Stellung der Probe 8 beginnt wiederum der gesamte Meßabiauf. Auf diese Weise kann die Probe 8 dreidimensional abgerastert und σemessen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zum optischen Messen eines Probenpunktes einer Probe mit hoher Ortsauflösung,
mit einer Lichtquelle zum Aussenden eines zum Anregen eines Energiezustandes der Probe geeigneten Anregunslichtstrahis, einem Objektiv zum Fokussieren des Anregungslichtstrahls auf den Probenpunkt der im Fokaibereich des Objektivs anordenbaren Probe,
einer Separationseinrichtung zum Herausseparieren des von der Probe aufgrund der Anregung des Energiezustandes spontan abgestrahlten Emissionslichts und
einem Detektor zum Nachweis des Emissionslichts,
gekennzeichnet durch
einen von der Lichtquelle (1) kommenden Stimulationslichtstrahl (17) zum Erzeugen stimulierter Emission der von dem Anregungsiichtstrahl (16) angeregten Probe (8) in dem Probenpunkt (7),
wobei der Anregungsiichtstrahl (16) und der Stimulationslichtstrahl (17) derart angeorgnet sind, 'daß sich ihre Intensitätsverteilungen (25, 26) im Fokalbereich teilweise decken.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe (8) auf einem Positioniertisch (10) angeordnet ist, mit dem eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse (A) durchführbar ist.
3. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß zwischen der Lichtquelle (1) und dem Objektiv (6) eine Strahirastereinrichtung (11) zum gesteuerten Abrastern der Probe (8) mit dem Anregungslichtstrahl (16) und dem Stimulationsiichtstrahl (17) vergesehen ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß der Stimuiationslichtstrahl (17) hinsichtlich des Anregungslichtstrahls (16) in der Fokalebene lateral versetzt ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Stimuiationslichtstrahl (17) hinsichtlich des Anregungslichtstrahls (16) entlang der optischen Achse versetzt ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß wenigstens ein weiterer von der Lichtquelle (1) kommender Stimuiationslichtsrahi (17) vorgesehen ist, dessen Intensitätsverteilung (26) im Fokalbereich des Objektivs (6) von der Intensitätsverteilung (26) der übrigen Stimulationsiichtstrahlen verschieden ist.
7. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Stimulationslichtstrahlen (17) hinsichtlich des Anregungsiichtstrahls (16) räumlich symmetrisch angeordnet sind.
8. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Lichtquelle (1) einen Laser umfaßt, der Lichtanteile unterschiedlicher Wellenlängen emittiert.
9. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Lichtquelle (1) wenigstens zwei Laser (2, 3) umfaßt, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen
emittieren.
10. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß wenigstens ein Dauerstrichiaser (2) vorgesehen ist, der das Anregungslicht aussendet.
11. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß wenigstens ein Laser (2, 3) vorgesehen ist, der
Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Laser (3), der Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet, das Stimuiationslicht erzeugt.
13. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Laser (3) zur Erzeugung des Stimulationsiichts einen Lichtstrahl mit einem Gauß-förmigen Profil aussendet.
14. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Lichtquelle (1) zur Erzeugung der stimulierten Emission von hoher Intensität ist, so daß zwischen dieser Intensität und der Besetzung des Energiezustandes der Probe ein nichtlinearer Zusammenhang besteht.
15. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Separationseinrichtung eine Zeitsteuerungseinrichtung umfaßt, mit der der Detektor (9) unmittelbar nach Abklingen eines Pulses des Stimulationsiichts eingeschaltet werden kann.
16. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Separationseinrichtung ein dem Objektiv (6) vorgeschaltetes Polarisationselement (20) zum Polarisieren des Stimulationsiichts und ein dem Objektiv nachgescheltetes Polarisationselement (21) zum Polarisieren des zum Detektor (9) gehenden Lichts mit einer orthogonalen Durchlaßrichtung zu der des dem Objektiv (9) vorgeschalteten Poiarisationselement(20) umfaßt.
17. Vorrichtung nach einem der vorangehenden. Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Separationseinrichtung wenigstens ein Wellenlängenfilter (19) aufweist.
18. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Separationseinrichtung einen dichroitischen Spiegel (5) aufweist.
19. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Detektor (9) ein Punktdetektor ist, der in einer zur Fokalebene des Objektivs (6) optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß dem Detektor (9) ein Fokussierungselement und eine
Blende (15) vorgeschaltet sind, wobei die Blende (15) in einer zur Fokalebene des Objektivs (6) optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.
21. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß zwischen der Lichtquelle (1) und dem Objektiv (6) ein für die Weilenlänge des Stimulationsiichts durchlässiges Filterelement angeordnet ist, weiches für die Wellenlänge des Anregungslichts einen undurchlässigen Mittenbereich und einen durchlässigen Außenbereich aufweist.
22. Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunktes einer Probe mit hoher Ortsauflösung,
bei dem ein Anregungsiichtstrahl auf den zu messenden Probenpunkt mittels eines Objektivs fokussiert wird und dort den Energiezustand anregt, und bei dem das von dem Probenpunkt aufgrund der Anregung des Energiezustands spontan emittierte Emissionsiicht heraussepariert und nachgewiesen wird,
dadurch gekennzeichnet,
daß die von dem Anregungsiichtstrahl (16) angeregte Probe (8) in dem Probenpunkt (7) durch einen Stimuiationslichtstrahl (17) zu stimulierter Emission veranlaßt wird, wobei sich die Intensitätsverteilungen (25, 26) des Anregungslichtstrahls (16) und des Stimulationslichtstrahls (17) im Fokalbereich des Objektivs (6) teilweise decken.
23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe (8) mit dem Anregungsiichtstrahl (16) und dem Stimuiationslichtstrahl (17) abgerastert wird.
PCT/DE1995/000124 1994-02-01 1995-02-01 Vorrichtung und verfahren zum optischen messen eines probenpunktes einer probe mit hoher ortsauflösung WO1995021393A2 (de)

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