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Die
vorliegende Erfindung einer Anordnung zur Abbildungsstabilisierung
betrifft optische Mikroskope, bei denen das Objekt besonders stabil
gegenüber Schwingungen und Drifteffekten gelagert werden
muss. Insbesondere bei optischen Mikroskopen, die eine höhere
Auflösung erreichen, ist es für eine gute Bildqualität
wichtig, eine hohe mechanische Stabilität des Mikroskopaufbaus
zu gewährleisten.
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Aufgabenstellung:
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Die
Mechanik gewöhnlicher optischer Mikroskope ist für
eine beugungsbegrenzte Auflösung im Bereich von 200–500
nm ausgelegt. Daher ist eine Positionsstabilität der Probe
bezüglich des Objektivfokus lateral und axial im Bereich
von einigen 10 nm unter gewöhnlichen Laborbedingungen (Temperaturstabilität,
Erschütterungen etc.) für eine reproduzierbare
Abbildung eines Objektes völlig ausreichend. Bei optischen
Mikroskopen, die eine höhere Auflösung erreichen,
steigen die Anforderungen an die mechanische Stabilität
des Mikroskopaufbaus jedoch massiv an.
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In
der STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskopie [
WO 001995021393 A2 ]
wurden bereits Auflösungen im Bereich im einstelligen Nanometerbereich
erreicht [
Rittweger, E., K. Y. Han, S. E. Irvine, C. Eggeling,
S. W. Hell (2009): "STED microscopy reveals crystal colour
centres with nanometric resolution". Nature Photonics 3,
144–147]. Folglich muss das Objekt während
der Datenaufnahme auf wenige Nanometer stabil im Objektivfokus gehalten bzw.
geführt werden.
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Bei
anderen Verfahren, die auf der Lokalisierung einzelner Fluoreszenzmoleküle
basieren (wie z. B. PALM:
US2008/0111086A1 ) und noch längere Bildaufnahmezeiten
erfordern, sind Maßnahmen zur Driftreduktion erforderlich.
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Bauartlich
bedingt sind bei derzeitigen optischen Mikroskopen Objekttischaufhängungen,
Objektivrevolveraufhängungen und Objektführungen ”welch” und
führen bei äußerer Anregung typischerweise
Schwingungsamplituden bis in den Bereich einiger 10–100
nm aus. Das Objekt ist typischer Weise über viele cm mittels
unterschiedlicher Materialien an das Mikroskop und damit an den
Focus des Mikroskops gekoppelt.
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In
der Praxis werden allein auf thermischen Effekten basierende Driften
in der Größenordnung 1 nm/sec beobachtet, wobei
auch nach Temperierung des Gesamtsystems nach dem Einschaltvorgang
etwa, unter gewöhnlichen Laborbedingungen zufällige Driftamplituden
im Minutenbereich ohne weiteres bis zu 100 nm beobachtet werden
können.
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Bei
Aufnahmen, bei denen ein Objekt über mehrere Minuten beobachtet
werden muss, wird folglich der Objektbewegung die Drift überlagert.
Bei hoch aufgelösten Abbildungen führt die Drift
notwendiger Weise zur Verschmierungen und damit zu Auflösungsverlusten,
wenn keine weiteren Maßnahmen ergriffen werden.
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Zusätzlich
können äußere Einwirkungen, wie beispielsweise
Gebäudeschwingungen oder Mikrophonie die Abbildungsqualität
beeinträchtigen. Bei Schwingungseintrag in das Mikroskopsystem
können unter gewöhnlichen Laborbedingungen ohne
Weiteres Relativbewegungen zwischen Objekt und eines Fokuspunktes
des Objektivs von einigen 10 nm beobachtet werden. Diese können
auch besonders groß werden, wenn die Störfrequenz
nahe einer mechanischen Resonanz von Tisch und/oder Objektiv liegt.
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Stand der Technik/Lösung alt:
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Um
die Einflüsse von Gebäudeschwingungen zu reduzieren
kommen oft schwingungsgedämpfte Tische zum Einsatz. Diese
sind zum Teil aufwändig aktiv stabilisiert, weswegen die
Anschaffungskosten sehr hoch sind.
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Temperaturschwankungen
der Umgebung führten zu thermischen Driften, die nur mit
aufwändiger Temperaturstabilisierung (insbesondere Kühlung)
der Umgebung reduzierbar sind und ebenfalls mit hohen Kosten verbunden
sind.
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Durch
eine geeignete Materialauswahl und Berücksichtigung der
thermischen Ausdehnungskoeffizienten der Materialien können
thermische Drifteffekte teilweise kompensiert werden [siehe z. B.
EP1418456 ]. Der Einfluss
von Temperaturgradienten und Schwingungen wird dadurch jedoch nicht
wesentlich reduziert.
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In
den Patentschriften
DE10361327 und
DE10100246 wird vorgeschlagen,
die auftretenden Drifteffekte nachträglich durch geeignete
Bildverarbeitung wieder auszubessern. Diese kann dann besonders
gelingen, wenn die lange Aufnahmezeit zeitlich in viele Teilaufnahmen
unterteilt wird, deren einzelne Aufnahmezeit so kurz ist, dass die
Drift für die Einzelaufnahme keine Rolle mehr spielt. Dazu
werden mit unter in das Objekt geeignete Referenzstrukturen eingebracht,
die dann zur späteren numerischen Bildkorrektur herangezogen
werden. In der Praxis kann die Aufnahme aber nicht immer ohne andere
Nachteile in kleinere Zeitabschnitte aufgeteilt werden, insbesondere
bei zellbiologischen Messungen. Auch das Einbringen von Referenzstrukturen
in das Objekt selbst ist in der Biologie nicht immer ohne größere
Störungen möglich. Hinzu kommt, dass zu schnelle
Schwingungen prinzipiell so nicht kompensiert werden können.
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In
der Patentschrift
EP1486810 wird
eine besonders massive und symmetrische Bauweise vorgeschlagen,
um den Instabilitäten zu begegnen. Ebenso beschreibt die
Patentschrift
EP1418455 eine Symmetrie
des Aufbaus um Driften zu minimieren. Aber auch diese vorgeschlagenen
Lösungen aus dem Stand der Technik können wiederum
aufgrund von Temperaturgradienten zu Driften führen und Schwingungen
nicht ausgeschlossen werden, die das Abbildungsergebnis signifikant
verschlechtern.
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Der
mechanische Weg von einem Fokuspunkt des Objektivs bis zum Objekt
ist bei all diesen Mikroskopen 10–20 cm lang und selbst
bei Materialien mit einem geringen Ausdehnungskoeffizienten um 10 μm/K/m,
muss mit Driften im Bereich von 1.000 nm pro Grad Kelvin gerechnet
werden. Für eine Stabilisierung bis in den Nanometerbereich müssen
Temperaturschwankungen und Temperaturgradienten über den
Aufbau hinweg im Bereich von wenigen tausendstel Kelvin gehalten
werden.
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Um
diese Nachteile der Temperaturschwankungen und Temperaturgradienten
wenigstens teilweise zu kompensieren, versuchte man günstigere Materialien
einzusetzen. Das Ausweichen auf Materialien wie z. B. Invar mit
noch geringeren Ausdehnungskoeffizienten ist meist unpraktikabel
wegen der typischerweise schwierigeren Bearbeitbarkeit dieser Materialien.
Zudem sind Objektive und deren Linsenfassungen fast immer aus Messing
gefertigt und nicht einfach austauschbar. Des Weiteren verfügen
die meisten Mikroskopobjektive über einen mechanischen
Kollisionsschutz bei Fehlfokussierung, was eine weitere Positionsunsicherheit
in das Mikroskopsystem einführt.
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Erfindung/Lösung neu:
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Erfindungsgemäß wird
zur maximalen Verkürzung der mechanischen Wege vorgeschlagen, das
Objekt möglichst direkt am Objektivkopf selbst zu fixieren.
Die erfindungsgemäßen Anordnungen erlauben dennoch
die Verwendung der optischen Anordnungen des gewöhnlichen
Mikroskops, wie Beleuchtungen und Kontrastierverfahren etc. ohne, dass
die mechanischen Instabilitäten des Mikroskopaufbaus direkt
Auswirkungen auf die Abbildung haben.
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In
einer einfachen Ausführungsform wird der Objektführer
mit Objekt direkt mechanisch am Kopf des Mikroskopobjektives montiert
anstatt am Mikroskopkörper. Dies ist in der Hochauflösung
möglich, da die zu untersuchenden Objekte typischerweise
sehr klein und leicht sind und zudem in der Praxis fast nie Objektive
gewechselt werden. Die Objektführung in allen drei Raumrichtungen
xyz wird dabei vorzugsweise über kleine, kurzhubige besonders
steife Piezoaktuatoren bewerkstelligt.
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Nutzen:
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Durch
die erfindungsgemäße Montage des Objektführers
direkt am Objektivkopf selbst werden insbesondere die drei folgenden
Nachteile und Hauptschwachpunkte universeller Mikroskopkonstruktionen
eliminiert.
- 1. Die Fokussiereinrichtung: Diese
stellt bei invertierten Mikroskopen in typischer Weise die Objektrevolveraufhängung
und bei aufrechten Mikroskopen in typischer Weise die Tischaufhängung dar.
Objektrevolveraufhängung und Tischaufhängung sind
zumeist sehr massiv ausgeführt und daher empfänglich
für die Einwirkung äußerer Schwingungen.
- 2. Der Kollisionsschutz im Objektiv. Dieser verfügt notwendiger
Weise über ein Spiel von einigen Mikrometern.
- 3. Die mechanischen Wege der Kopplung des Objektes an Fokus
und optische Achse werden optimal minimiert und dadurch thermische
Einflüsse wesentlich reduziert. Durch eine geeignete Materialauswahl
kann dies noch weiter verbessert werden. Die Anordnung kann ohne
Aufwand und Mikroskopmodifikationen an praktisch allen kommerziell
erhältlichen Standardmikroskopen angebracht werden. Durch
diese neue und einfache Objekthalterung werden insbesondere bei
hochauflösenden Mikroskopen quasi drift- und schwingungsfreie
Abbildungen auch unter regulären Laborbedingungen möglich.
Aber auch bei Langzeitbeobachtungen etwa lebender Zellen kann die Anordnung
vorteilhaft genutzt werden, ohne dass Driften oder Schwingungen
die Abbildungen beeinträchtigen. Auf Referenzstrukturen
in den Proben oder korrigierende Nachbearbeitungen der Daten kann
verzichtet werden. Ein rascher Objektivwechsel kann auch mit der
Objektfixierung am Objektiv ermöglicht werden, indem zum
Beispiel mechanische Schnellverschlüsse verwendet werden
und mechanische Anschläge für eine reproduzierbare
Positionierung des Halters sorgen. Der Objektivkopf könnte
dazu zum Beispiel mit einer Schwalbenschwanzführung oder
einer Ringschwalbe ausgestattet werden oder mit geeigneten Strukturen,
die den Halter mit einer druckknopfartigen Mechanik einrasten lassen.
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Die
Anordnung zur Abbildungsstabilisierung in der optischen Mikroskopie
wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert,
ohne lediglich darauf beschränkt zu sein:
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Beschreibung der Zeichnungen:
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In
der Zeichnung 1 ist ein Schema eines Mikroskops mit einem regulären
am Mikroskopkörper fixierten Objekthalter dargestellt,
wie es dem derzeitigen Stand der Technik entspricht.
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Die
Zeichnung 2 zeigt den Aufbau und das Prinzip einer erfindungsgemäßen
Anordnung. Eine Grundplatte (4) ist am Kopf des Mikroskopobjektivs (5)
fixiert. Auf dieser ist der Objekthalter (2) zur Positionierung
des Objekts (1) verstellbar montiert. Zur Fokussierung
des Objektes sind vorzugsweise Schrauben und/oder Piezoaktoren (3)
angebracht, die den Objektführer axial relativ zur Grundplatte
positionieren.
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Die
Zeichnungen 3–5 stellen je ein besonders bevorzugtes, erfindungsgemäßes
Ausführungsbeispiel dar, ohne prinzipiell auf diese Ausführungsbeispiele
beschränkt zu sein.
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Der
Objekthalter besteht hier aus einer Grundplatte (siehe Zeichnung
4), die an den Objektivkopf geklemmt wird und einem Objektführer
(siehe Zeichnung 5). Der Objektführer kann über
Feingewindeschrauben in der Höhe über dem Objektiv
zur Grobfokussierung verstellt werden. Mit diesen Schrauben kann
gleichzeitig das Objekt relative zur Brennebene verkippt werden.
Zur lateralen Verstellung ist der Objektführer mit den
Stützschrauben gleitfähig auf der Grundplatte
gelagert. Zur Vorspannung der Schrauben dienen Federn und Magnete (hier
nicht gezeigt). Auch das Objekt selbst kann mittels Magneten auf
dem Objekthalter fixiert werden.
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Zur
Feinverstellbarkeit der Brennebene sind in den Objektführer
von oben und unten Schlitze eingefräst (siehe Zeichnung
5). Dadurch entstehen jeweils zwei biegbare Lamellen, sodass sich
der mittlere Plattenteil, auf dem das Objekt fixiert wird, senkrecht
zur Platte verstellbar wird. Der Versatz wird durch einen Piezo
eingestellt.
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Legenden der Zeichnungen:
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Zeichnung
1: Mikroskop (Stand der Technik) mit regulärem am Mikroskopkörper
fixierten Objekthalter
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Zeichnung
2: erfindungsgemäßes Objekthalteprinzip
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Zeichnung
3: erfindungsgemäßer Gesamtaufbau
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Zeichnung
4: erfindungsgemäße Anordnung mit Grundplatte
am Mikroskopobjektiv
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Zeichnung
5: erfindungsgemäßer Obiektführer
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- 1
- Objekt
- 2
- Objektführer
- 3
- Aktuator
- 4
- Grundplatte
- 5
- Objektiv
- 6
- Mikroskop
- 7
- Klemmschraube
- 8
- Biegelamelle
- 9
- Schlitz
- 10
- Piezohalter
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 001995021393
A2 [0003]
- - US 2008/0111086 A1 [0004]
- - EP 1418456 [0011]
- - DE 10361327 [0012]
- - DE 10100246 [0012]
- - EP 1486810 [0013]
- - EP 1418455 [0013]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Rittweger,
E., K. Y. Han, S. E. Irvine, C. Eggeling, S. W. Hell (2009): ”STED
microscopy reveals crystal colour centres with nanometric resolution”. Nature
Photonics 3, 144–147 [0003]