WO1995015980A1 - Nouveau peptide synthetique, tensioactif pulmonaire contenant ledit peptide et remede contre le syndrome de souffrance respiratoire - Google Patents

Nouveau peptide synthetique, tensioactif pulmonaire contenant ledit peptide et remede contre le syndrome de souffrance respiratoire Download PDF

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Tsunetomo Takei
Eiji Ohtsubo
Hirosi Ohkawa
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Tokyo Tanabe Company Limited
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Definitions

  • Examples of the chemical production method of the synthetic peptide of the present invention include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a stepwise elution method and a fragment condensation method by a fragment condensation method.
  • Liquid phase synthesis such as the activated ester method (p-nitrophenyl ester method, p-hydroxysuccinic acid imido ester method, carboimigusole method), oxidation-reduction method or DCC-activation method Method or solid phase synthesis method.
  • the present invention also provides a method for producing the synthetic peptide of the present invention by a fragment condensation method using a hydrophilic peptide moiety having a protected N-terminal and a functional side chain as a production intermediate.
  • Suitable fatty alcohols are alcohols having 14 to 18 carbon atoms, preferably hexadecyl alcohol.
  • an amine having 14 to 18 carbon atoms is suitable, but hexadecylamine is preferred.
  • Solvents used for preparing the lipid mixture solution include, for example, chlorophoronem, chloroform-form methanol [1: 2 to 5: 1 (VZV)].
  • the surfactant dry powder formulation of the present invention can be prepared by using a shake hand, a variable speed mixer or an ultrasonic generator to prepare a monovalent or divalent metal salt having an appropriate physiological concentration, for example, 0.9% chloride. It can be used by uniformly suspending and dispersing it using sodium or 1.5 mM calcium chloride or a physiological buffer containing them.
  • a suspension test of the lung surfactant was performed according to the method described in Japanese Patent Publication No. 4-766965.
  • the surfactant of the present invention was administered intraperitoneally to mature Wistar rats at 300-600 mg / kg / day for 1 month, but no change in body weight and abnormalities in macroscopic and histological observation of major organs were observed. .
  • lung volume the alveolar cavity volume (hereinafter referred to as lung volume) was measured at 37 ° C under increasing and decreasing airway pressure.
  • the surfactant of the present invention (60 mg / kg) was administered at a concentration of 1.
  • physiological saline was administered instead of the surfactant suspension of the present invention.
  • the lung volume (5 cm water pressure) of rabbit immature fetuses at gestational age 27 was 1-5 m1 Zkg, and the alveoli were hardly dilated.
  • the lung volume (5 cm water pressure) of the immature fetus was 15 to 25 ml / k and the alveoli were insufficiently expanded.
  • the synthetic peptide of the present invention has an action of strongly activating the surface activity of a lipid mixture. Therefore, from the surfactant of the present invention comprising the synthetic peptide of the present invention and a lipid mixture, an effective therapeutic agent for respiratory distress syndrome can be prepared in view of surface activity, suspendability and pharmacological properties.
  • the therapeutic agent for respiratory distress syndrome provided by the present invention is a single dose of 50 to 100 Omg of the surfactant of the present invention for children and 500 to 500 Omg for adults. contains. Suspend this dose in water, physiological saline, or a physiologically acceptable buffer, and adjust the concentration to 1.0 to 10.0% (W / V). Use by injecting or spraying 1 to 10 times into the respiratory tract within 72 hours immediately after expression. In addition, they can be inhaled directly as powder without suspension. Dosage, use and frequency may be adjusted as appropriate for the condition of the patient and the combination therapy.
  • the therapeutic agent of the present invention may contain, if necessary, pharmaceutical additives such as stabilizers, preservatives, isotonic agents, buffers, suspending agents, antioxidants and surfactants, or bronchodilators, antiallergic agents, Drugs such as anticancer agents, antibacterial agents, antiviral agents, anti-inflammatory agents, and antifungal agents can be contained.
  • pharmaceutical additives such as stabilizers, preservatives, isotonic agents, buffers, suspending agents, antioxidants and surfactants, or bronchodilators, antiallergic agents
  • Drugs such as anticancer agents, antibacterial agents, antiviral agents, anti-inflammatory agents, and antifungal agents can be contained.
  • Lys-2CLZ (2-chlorobenzyloxycarbonyl).
  • HF and DMS 0 were distilled off under vacuum at 0 ° C.
  • the cut peptide and resin were washed three times with cold getyl ether (15 ml), and then the cut peptide was extracted by washing four times with cold TFA (5 ml).
  • the extract was filtered immediately and added to ice-cold water (150 ml) to precipitate the crude peptide.
  • the crude peptide was centrifuged at 100 ⁇ X, 0 ° C. for 30 minutes and collected as a precipitate.
  • the precipitate was washed with getyl ether (15 ml). This washing step was repeated using dimethyl ether, ethyl acetate, and distilled water to obtain 84 mg of peptide A.
  • eluent As an eluent, a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA was used for elution for 5 minutes. Next, elution was performed for 30 minutes with a linear concentration gradient using the same eluent and 80% aqueous acetonitrile containing 0.1% TFA.
  • the presence of the peptide in the eluate was monitored using a 245 nm (spectrophotometer; model 870-UV, JASCO Corporation) and differential refractometer (Model RID-6A, Shimadzu Corporation). did.
  • peptide B The peptide of [SEQ ID NO: 6] (peptide B) was synthesized by E. Atherton and RC Sheppard in “Solid phase peptide synthesis—a practical approach, p. 25—189, 1989, Oxford University Press, Oxford) "and Kenich, Akagi et al., Chem. Pharm. Bull., 37 (10), p2661-2664 (1989).
  • the solid phase was synthesized using "Mr. Cook” (trade name; manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.).
  • the peptide was cut from the resin and filtered through a glass filter (G3).
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to about 5 m 1 by evaporation and the peptide was precipitated by adding getyl ether.
  • the peptide precipitate was collected by filtration with a glass filter (G3), washed five times with ethyl ether, and dried under reduced pressure to obtain 60 mg of peptide B.
  • the amino group at the N-terminus of all amino acids was protected with an Fmoc group, and the functional side chains were protected with the following groups before use in the reaction.
  • the peptide of SEQ ID NO: 8 (peptide D) was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the peptide (peptide E) of [SEQ ID NO: 9] was prepared in the same manner as in Example 2. Prepared.
  • the peptide of SEQ ID NO: 10 (peptide F) was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the peptide of SEQ ID NO: 11 (Peptide G) was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the peptide of SEQ ID NO: 12 (Peptide H) was subjected to solid-phase synthesis using a multi-peptide solid-phase synthesis system according to Example 2.
  • N-monofluoromethylmethyloxycarborunoluleucine-O-resin (Fmoc-Nle-O-resin) (0.20 mmol / 0.5 g) was used. After the resin was swollen with DMF for 20 minutes, the resin was washed four times with DMF. A 20% piperidine-DMF solution was added and shaken to perform deprotection. This operation was repeated three times to complete the deprotection. Then, the resin was washed 9 times with DMF to remove excess piperidine in the resin. At this time, the residue of piperidine was confirmed by pH test paper.
  • the peptide was cut out of the resin and filtered through a glass filter (G3).
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to about 5 ml with an evaporator, and getyl ether was added to precipitate the peptide.
  • the peptide precipitate was collected by filtration with a glass filter (G3), washed five times with ethyl ether, and dried under reduced pressure to obtain 65 mg of peptide H.
  • the amino group at the N-terminus of all amino acids was protected with an Fmoc group, and the functional side chains were protected with the following groups, and used in the reaction.
  • Lys-Boc (t-butyloxycarbonyl). Cys-Trt; (trityl).
  • a peptide of SEQ ID NO: 13 (peptide I) was prepared in the same manner as in Example 8.
  • the peptide of SEQ ID NO: 14 (peptide J) was prepared in the same manner as in Example 8.
  • a peptide of SEQ ID NO: 15 (peptide K) was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the peptide of SEQ ID NO: 16 (peptide L) was prepared according to the method of Example 2.
  • the peptide of SEQ ID NO: 17 (Peptide M) was prepared according to the method of Example 2.
  • the peptide of SEQ ID NO: 18 (peptide N) was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the peptide of SEQ ID NO: 19 (peptide 0) was prepared in the same manner as in Example 8.
  • the title peptide (peptide P) was synthesized in a solid phase using a peptide synthesizer system 9050 (Millipore).
  • N--9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-N- ⁇ -4-Methoxy-1,2,3,6,-Trimethylbenzenesulfonium L-arginine (Fmoc-Arg (Mtr)) is coupled to 2-methoxy-41-alkoxybenzyl alcohol-resin (Sasrin resin, Bachem, trade name) N- ⁇ -9-full Orenylmethyloxycarbonyl ⁇ — ⁇ — 4—Methoxy 2,3,6, —Trimethylbenzenesulfonylarginine 10-resin (Fmoc—Arg (Mtr) 10-resin) (0.2 Using Ommo 1), the amino acid is sequentially extended in the N-terminal direction on the resin while monitoring according to the synthesis protocol of peptide synthesizer system 950, and the N-terminal and functional groups are completely protected. Synthetic method was used to synthesize bepeptido O-resin.
  • the peptide precipitate was collected by filtration with a glass filter (G3), washed five times with getyl ether, and dried under reduced pressure to obtain 18 Omg of peptide P.
  • the amino acids at the N-terminal of all amino acids were protected with Fmoc, and the functional side chains were protected with the following groups before use in the reaction.
  • the eluent was eluted with a TFA-dichloromethane (1:99 V) solution at a flow rate of 8.1 m 1 / min for 120 minutes.
  • the presence of the peptide in the eluate was monitored using a 245 nm (spectrophotometer; JASCO Corporation model 870-UV) and a differential refractometer (Shimadzu Corporation model RID-6A).
  • H-Nle- (Nle) 14-Nle-0-resin was synthesized by a multi-phase solid phase synthesis system.
  • acetoamide methyl (ACM) form of the thiol group of peptide D (peptide Q) was converted to Fmoc-Cys-Trt in Example 4 by Fmoc-Cys-ACM.
  • ACM acetoamide methyl
  • Peptide R was prepared by palmitating the thiol group of peptide E according to the method of Sarin, Virender Kumar et al. (EP 0 458 167A1).
  • a peptide (peptide T) of [SEQ ID NO: 21] was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the synthetic peptide of the present invention was prepared by adding 12% hydrochloric acid containing 5% (vZv) phenol to TFA [2: 1 (V / V)] under vacuum at 150 ° C for 1, 2, 4, After acid hydrolysis for 6, 12, 24, 48, and 72 hours to remove the acid, the hydrolyzed product was analyzed using a Shimadzu amino acid automatic analysis system (LC-19A).
  • the Trp of peptide M was alkali-hydrolyzed with a 4.2N aqueous sodium hydroxide solution for 16, 24, and 32 hours, and then neutralized with hydrochloric acid.
  • the analysis was performed using an automatic amino acid analysis system.
  • the amino acid value that showed higher recovery in the hydrolysis for 1 to 72 hours was adopted, and the amino acid composition value was calculated. The calculated value was almost the same as the calculated value.
  • the surfactant of the present invention was prepared by mixing the synthetic peptide of the present invention with three components of a lipid component such as choline phosphoglyceride, acidic phospholipid and fatty acids.
  • 1,2-dipalmitoyl glycerol— (3) phosphocholine (300.0 mg), 1,2-diacyl-sn—glycerol (3) —phospho-sn-glycerol (14-24 carbon atoms : Sigma) ("100. 0 mg) and palmitic acid (40.0 mg) were dissolved in a mixture of chloroform and methanol in a mixture [2: 1 (V / V)] (300 ml). O mg was dissolved in a mixture of formaldehyde and methanol [2: 1 (VZV)] (2 O ml). These solutions were mixed and evaporated to dryness under reduced pressure.
  • the obtained residue was suspended in a mixed solution of water and ethanol [9: 1 (V / V)] (100 ml) at 45 ° C for 20 minutes. This suspension was frozen at 160 ° C. and dried at a vacuum of 60 to 110 / Hg for 40 hours to obtain 459.1 mg of a surfactant as a white powder.
  • the obtained residue was suspended in a water-ethanol mixture [8: 2 (V / V)] (100 ml) at 40 ° C. for 45 minutes. This suspension was frozen at -65 C and dried at a vacuum of 50 to 80 Hg for 36 hours to obtain 437.6 mg of a white powdered surfactant.
  • Peptide D was used in place of peptide B, and 1,2-diacyl-sn-glycerol (3) -phospho-sn-glycerol (14 to 24 carbon atoms in the acyl group: Sigma)
  • 1,2-diacyl-sn-glycerol (3) -phospho-sn-glycerol 14 to 24 carbon atoms in the acyl group: Sigma
  • Palmi toluu 2-oleoleyl sn—glycerose— (3) —phospho sn—glycerol was used, and the white surfactant powder was 451.9 mg.
  • 1,2-dipalmitoyl glycerol (3) -phosphocholine 320.
  • Peptide F (22.0 mg) was used instead of peptide B (10. O mg), and 1,2-diacyl-sn-glycerol (3) -phospho-sn-glycerol (carbon
  • 1,2-distearoyl-sn-glycerol- (3) -phospho-sn-glycerol was used instead of (numbers 14 to 24: manufactured by Sigma) was performed to produce 463.9 mg of a white surfactant powder.
  • a white surfactant powder (4.54.1 mg) was produced in the same manner as in [Example 21] except that peptide B was used instead of peptide B.
  • a white surfactant powder of 459.3 mg was produced in the same manner as in Example 21 except that peptide J was used in place of peptide B.
  • a white surfactant powder (452.5 mg) was produced in the same manner as in [Example 21] except that peptide K was used instead of peptide B. (Example 31)
  • a white surfactant powder (4.56.6 mg) was produced in the same manner as in Example 21 except that peptide L was used instead of peptide B. (Example 32)
  • a white surfactant powder of 452.5 mg was produced in the same manner as in [Example 21] except that peptide N was used instead of peptide B.
  • a white surfactant powder was produced in the same manner as in Example 21 except that peptide 0 was used in place of peptide B, and 585 mg of white surfactant powder was produced.
  • 1,2-dino, ° noremitoyl glycerone (3) phosphocholine (30.Omg), 1,2 _diacyl-sn—glycemic port — (3) —phospho-sn-glycerol 24 pieces: Sigma) (10.O mg) and palmitic acid (4.Omg) were dissolved in a mixture of form-methanol (2: 1 (V / V)) (30 ml). Then, 1.0 mg of peptide Q was dissolved in a mixture of mouth form and methanol [2: 1 (V / V)] (2. Oml). These solutions were mixed and evaporated to dryness under reduced pressure.
  • the obtained residue was suspended in a water-ethanol mixture [9: 1 (V / V)] (1 Oml) at 45 ° C for 20 minutes.
  • the suspension was frozen at 160 ° C. and dried at a vacuum of 60 to 120 / Hg for 36 hours to obtain 45.4 mg of a white powdered surfactant.
  • Phosphocholin is 65.9% (WZW) 1,2—Diacyl—sn—Glycerol (3) —Phosphosn—Glycerol (12.44 carbon atoms of the acyl group: Sigma) is 2 2 2.0% (W / W), palmitic acid was 8.8% (WZW), peptide S was 2.2% (W / W) and water was 1.1%.
  • Table 2 shows the results of the surface activity of the surfactant of the present invention and the effect of maintaining the alveolar cavity volume. Industrial applicability
  • the novel synthetic polypeptide of the present invention is easy to isolate and purify, is produced by a method capable of mass production, has high solubility in general solvents, and has a higher solubility than conventional pharmaceuticals. It showed good homogeneity and comparable strong surface activity.
  • Example 26 27.2 1.1 60 28.3 40 29.9 49 Room Example 27 27.2 8.7 60 27.5 50 28.3 ⁇ ⁇ , Room; fife example 28 34.1 3.9 60 34.3 95 36.8 AC)
  • Example 29 28.0 0.8 30 27.6 30 29.9 53
  • Example 30 31.5 1.6 50 28.0 80 32.1 47
  • Example 31 34.2 1.2 60 33.1 100 34.5 40
  • Example 32 33.7 3.0 30 31.6 60 33.9 44
  • Example 33 28.7 3.2 30 26.9 50 30.2 51
  • Example 34 30.8 2.1 50 29.8 70 31.9 49
  • Example 35 30.1 2.5 40 30.4 50 31.7 49
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  • Val Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu Met
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Description

明 細 書 新規な合成べプチ ド、 それを含有する肺サ一ファクタン ト及び呼吸窮 迫症候群治療剤 技術分野
本発明は、 新規な合成べプチ ドに関する。 詳しくは、 脂質混合物と配 合することにより強力な表面活性作用を有する合成べプチ ド、 該合成べ プチ ドの製造中間体、 該合成べプチ ドの製造方法、 該合成べプチ ドと脂 質混合物からなる肺サ一ファクタン ト及び該肺サーファクタン トを有効 成分として含有する呼吸窮迫症候群治療剤に関する。 背景技術
呼吸窮迫症候群は、 肺サーファクタン 卜の欠乏により肺胞表面の表面 活性が低下し、 肺胞が虚脱する結果、 重篤な呼吸障害をきたす疾病であ り、 未熟な新生児に多症し死亡率が高い。 新生児の呼吸窮迫症候群に対 しては、 肺サーファクタント製剤が卓効を示すことが知られている。 また、 成人においても種々の原因で低酸素血症となり、 レスピレーター などによる呼吸管理にもかかわらず、 胸 SI5 X線写真上、 両肺に瀰漫性の スリガラス様陰影をきたし、 呼吸不全におちいる例が多々見られる。 上 田らは成人の肺炎 2例 （①硝酸ガス誤吸入性肺炎及び②脳腫瘍由来の反 復性嚥下性肺炎において、 低酸素血症から全身性状態が悪化し呼吸不全 をきたした症例） に対して肺サ一ファクタン トを気道内に注入すること により著明な改善を得、 救命したことを報告している 〔安田寛基ら 「バ ィォサ一ファクタン ト、 第 3章サーファクタン 卜の臨床、 第 1節サーフ ァクタントの臨床応用、 V誤引性肺炎とサーファクタント」 第 1 8 4頁、 1 9 9 0年、 株式会社サイエンスフオーラム） 〕 。 更に、 心臓手術時に は呼吸を止めるため、 術後呼吸不全を起こす例がみられる力 その呼吸 不全に対して肺サーファクタン 卜が効果を示すという報告もある （野坂 修一ら、 日本界面医学会雑誌第 2 2巻第 6 6頁、 1 9 9 1年） 。
このように、 外部から経気道的に肺サーファクタン 卜を投与する補充 療法は、 呼吸窮迫症候群に対し顕著な治療効果が認められる。
近年、 哺乳動物の肺サーファクタン トに特異的なアポ蛋白質として親 水性のサーファクタントアポ蛋白質 A及びサーファクタン トアポ蛋白質 D、 並びに疎水性のサーファクタン トアポ蛋白質 B (以下 「S P— B」 という。 ） 及びサーファクタン トアポ蛋白質 C (以下 「S P— C」 とい う。 ） の 4種が確認された 〔アポ蛋白質の構造と機能についての総説 （秋 野豊明、 黒木由夫著、 呼吸と循環、 第 3 8巻第 1 8号第 7 2 2頁、 1 9 9 0 年 ； 安田寛基ら、 バイオサーフ ァ クタン ト、 第 2章 サーファクタン ト の生化学 —サーファクタントとアポ蛋白質、 第 1 3 1頁、 1 9 9 0年、 株式会社サイエンスフォーラム） 〕 。
ヒ 卜肺由来の S P— C 〔配列番号 1〕 は、 アミノ酸 3 5個からなり、 N末端ァミ ノ酸がフヱ二ルァラニンでバリ ンに富み疎水性が極めて強い アポ蛋白質である。 またゥシ 〔配列番号 2〕 、 ブタ 〔配列番号 3〕 、 ラ ッ ト等の肺から単離された S P— Cも、 アミノ酸 3 4〜 3 5個からなり、 N末端側のァミ ノ酸配列が動物種により異なっているがヒ トとの相同性 が極めて高い。
また、 特表平 3 - 5 0 2 0 9 5号公報には、 下記の配列で示される S P 一 Cの部分構造をもつアミ ノ酸 3 2個の合成ペプチ ド 〔配列番号 4〕 が 高い表面活性を示す最小単位であり、 このべプチドと脂質との混合物が、 呼吸窮迫症候群治療に効果的であること、 この最小単位のペプチ ドとこ れより短いァミノ酸配列を有する合成べプチドとの表面活性の比較から、 表面活性の喪失は、 特定のアミ ノ酸の喪失に起因するのではなく、 ぺプ チ ドの鎖長の長さの減少によることが記載されている。
先に本発明者の一部は、 S P - Cの部分構造をもつ合成ペプチ ド （以 下 「T P— C」 という。 ） と脂質との混合物が、 呼吸窮迫症候群治療に 効果的であることを知り、 特許出願した （特願平 5— 5 1 8 1 8 8号） 。 一般的に合成べプチ ドの製造には、 そのァミ ノ酸配列が長くなるにつ れて製造時の未成熟なぺプチ ドの生成頻度が高くなり、 単離 ·精製が困 難となること、 製造に長時間を要すること及び大量製造が困難なこと等 の欠点があるといわれている。
また、 肺サ一ファクタン ト製剤は、 品質保全の点から、 用時に生理食 塩水懸濁液として投与する乾燥粉末製剤として提供されることが多い。 肺サーファクタン ト製剤の懸濁性の改善法として、 マンニトール等の懸 濁化剤を添加する方法 （特公平 1 - 6 0 4 5 1号公報） 及び凍結乾燥時 に一次凍結温度を一 1〜一 1 0 °Cで行う凍結法 （特公平 4 - 7 6 9 6 5 号公報） が提案されているが、 操作が煩雑であり、 より簡便な製剤の製 造法の開発が望まれていた。
S P— Cをコリ ンホスホグリセリ ド、 酸性リ ン脂質及び脂肪酸類から なる脂質混合物に配合した肺サーファクタン ト （以下 「S— 3 5」 とい う。 ） 製剤は、 ペプチ ド中に存在するシスティ ン残基がジスルフィ ド結 合を形成するためべプチ ドの凝集性が高いこと、 肺サーファクタン ト自 体の疎水性が強いこと等の要因から、 生理食塩水に対する分散性が極め て悪く、 製剤として使用できる程度に均一な懸濁液とすることが困難で めった
T P— Cは一般溶媒に対する溶解性が低いため、 肺サーファクタン ト 製剤の調製の際ト リフルォロ酢酸 （T F A ) を使用する必要があった。 従って、 T F Aを極力除去するため濃縮 ·乾燥時間に長時間を要し、 肺 サ一ファクタン ト製剤中に残留する T F Aにより肺サ一ファクタン ト懸 濁液が酸性化する、 という欠点を有していた。 発明の開示
本発明者らは、 上記知見に鑑み、 合成ペプチ ドにっき、 鋭意研究した ところ、 N末端側に特定配列の親水性ペプチ ド部分を、 C末端側に主と して Leu及び 又は Nleから構成される疎水性べプチ ド部分を有する下 記ァミ ノ酸配列を含有する新規な合成べプチ ド （以下 「本発明合成ぺプ チ ド」 という。 ） が、 単離 ·精製が容易であること、 大量製造が可能で あるこ と、 ギ酸、 T F A、 ト リ フルォロエタノール、 ジメチルスルホキ シ ド （D M S O ) 、 ク ロ口ホルム、 ク ロ口ホルム メ タノール混合液、 メ タノール、 エチレンクロロ ヒ ドリ ン又はテ トラ ヒ ドロフラ ンに良く溶 解し、 特にメタノ一ルに対する溶解度が合成 S P— C及び T P— Cに比 ベ著しく高いこと、 本発明合成べプチドと脂質混合物から調製される肺 サーファクタン トが、 懸濁化剤無添加、 - 2 CTC以下で行う通常の凍結 乾燥法により製造した場合でも、 S— 3 5又はコリ ンホスホグリセリ ド、 酸性リ ン脂質及び脂肪酸類からなる脂質混合物のみからなる合成肺サー ファクタン ト （以下 「 S F— 3」 という。 ： 特公平 2— 8 7 6 8 5号公 報） 又は哺乳動物の肺臓組織に存在するリ ン脂質、 中性脂質、 総コレス テロール及び炭水化物並びに微量の蛋白質からなる物質のほかに脂肪酸 を含有する物質 （以下 「S - T A J という。 ： 特公昭 6 1 — 9 9 2 4号 公報） に比べ、 均一懸濁性が良好で、 しかも T P— Cと脂質混合物から なる肺サ一フ ァ クタン ト、 S— 3 5又は S— T Aと同等の強力な表面活 性作用を有することを知り、 本発明を完成させた。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W
( Xaaは存在しないか又は Cys若しくは Serを表し、 Xbbは His又は Asnを表し、 Xccは Leu又は lieを表し、 Wは疎水性ペプチ ド部分を表 す。 ）
本発明合成べプチ ドは、 N末端側に下記特定配列で表される親水性べ プチ ド部分を、 C末端側に主として Leu及び Z又は Nleから構成される 疎水性べプチ ド部分を有するぺプチ ド部分を含有し、 脂質混合物と配合 することにより強力な表面活性作用を示す合成べプチ ドである。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg
( Xaは存在しないか又は Cys若しくは Serを表し、 Xbbは His又は Asn を表し、 Xccは Leu又は lieを表す。 ）
疎水性ペプチド部分は、 Leu、 Nle、 Ile、 Val、 Phe、 Nva及び Trp 等の疎水性ァミ ノ酸により構成されるが、 主として Leu及び Z又は Nle が 1 2個以上、 好ましくは 1 2〜2 0個により構成される。 この疎水性 ぺプチ ド部分は、 合成の容易さ等のため単一の疎水性ァミ ノ酸によ 0構 成されていることが好ましいが、 Leu及び Nleが任意に配列されていて も良く、 また配列中に 1〜5個の Ile、 Val、 Nva、 Trp等の疎水性ァ ミ ノ酸が含まれていても良い。
また、 本発明合成ペプチドには、 上記合成ペプチ ドの N末端及びノ又 は C末端にァミ ノ酸又はべプチ ドが付加された合成べプチ ドも包含され る。 N末端に付加するアミノ酸としては Cys又は Serが挙げられ、 更に、 N末端に配列 Phe— Gly - lie - Pro又は Phe - Gly一 lie - Proのぺ プチドを付加することもできる。 上記の合成べプチド中に存在するチォー ル基又は水酸基は、 炭素数 1 4〜 1 8の脂肪酸、 好ましくはパルミチン 酸でァシル化されていても良く、 又はァセ トアミ ドメチル化されていて も良い。 C末端に付加するペプチドとしては、 配列 Gly— Ala— Leu - Leu又は Gly - Ala - Leu一 Leu - Met - Gly - Leuが挙げられる。 更に、 本発明合成ペプチドには、 構成アミノ酸の 1又は複数個が付加、 欠失及び/又は置換されていても良い親水性べプチ ド部分を含有する合 成べプチド （ただし、 天然 S P— Cの部分構造を有するぺプチドを除く。 ） であって、 脂質混合物と配合することにより強力な表面活性作用を示す 合成べプチ ドが包含される。
本発明合成ペプチ ドは、 化学的又は遺伝子工学的手法により製造する ことができるが、 単離 ·精製の点から化学的製造法が好ま しい。
本発明合成ペプチドの化学製造方法としては、 逐次延長法 （stepwise el ongation ) 又は断片縮合法 fragment condensation ) によ るアジ ド法、 酸クロライ ド法、 酸無水物法、 混合酸無水物法、 D C C法、 活性化エステル法 （ p—二 トロフヱニルエステル法、 p—ヒ ドロキシコ ハク酸イ ミ ドエステル法、 カルボイ ミグゾール法等） 、 酸化還元法若し くは D C C -活性化法等の液相合成法又は固相合成法が挙げられる。 本発明は、 N末端及び官能性側鎖を保護した親水性ペプチ ド部分を製 造中間体とする本発明合成べプチ ドの断片縮合法による製造法をも提供 する。
断片縮合法は逐次延長法に比べ、 目的物の精製が容易で大量合成に適 した製造法であり、 不慮の失敗による損失を防止できるという特徴を有 している。 予め調製した N末端及び官能性側鎖を保護した親水性べプチ ド部分と疎水性べプチ ド部分とを液相合成法又は固相合成法により縮合 させることにより、 本発明合成ペプチ ドを製造することができる。 N末 端及び官能性側鎖の保護基としては、 通常のぺプチ ド合成において使用 される保護基であれば特に制限されることはないが、 末端アミ ノ基の保 護基としては 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル （Fmoc ) 、 2 ―クロロべンジルォキシカルボニル （2 - CLZ ) 又は t 一ブチルォキシ カルボニル （Boc ) 基が、 Lysの保護基としては Fmoc、 Boc 、 カル ボベンゾキシ （Z ) 又は トシル （Tos ) 基が、 His の保護基として は Trt、 Fmoc Boc Dnp Bom、 Bzl又は Tos基が、 Argの保 護基としては Mtr Pmc、 Mts又は Tos基が挙げられる。 すなわち、 本発明合成べプチドの製造中間体として使用できるぺプチドとして、 Fmoc - Pro - Val - His (Trt) - Leu - Lys (Boc) 一 Arg (Mtr) 、 Fmoc— Pro— Val— Asn— Leu— Lys (Boc) - Arg (Mtr) 又 は Fmoc— Pro— Val— Asn— lie— Lys (Boc) — Arg (Mtr) 力 挙げられる。
本発明合成べプチ ドに脂質混合物としてコリ ンホスホグリセリ ド、 酸 性リ ン脂質及び脂肪酸類を配合することにより肺サーファクタン ト （以 下 「本発明サーファクタン ト」 という。 ） を製造することができる。 配合比は最終生成物の乾燥総重量に対するこれらの成分の重量比率が、 合成ペプチ ドは 0. 1 5. 0 % (WZW) 、 コリ ンホスホグリセリ ド は 5 0. 6 8 5. 0 % (WZW) 、 酸性リ ン脂質は 4. 5 3 7. 6 % (WZW) 、 脂肪酸類は 4. 6 2 4. 6 % (W/W) となるように 設定するのが適当である。
本発明サーファクタン トにおいて使用できるコリ ンホスホグリセリ ド としては、 1 2—ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリ ン （別 名ジパルミ トイルホスファチジルコリ ン） 、 1 , 2—ジステアロイルグ リセロー （3 ) —ホスホコリ ン、 1 一パルミ トイルー 2—ステアロイル グリセロー （ 3 ) —ホスホコリ ン若しくは 1 —ステアロイルー 2—パル ミ トイルグリセロー （ 3 ) —ホスホコリ ン等の 1 , 2—ジァシルグリセ 3) —ホスホコリ ン、 1 キサデシルー 2 レミ トイルグリ セロー （ 3 ) —ホスホコリ ン若しくは 1 一才クタデシルー 2 レミ ト ィルグリセロー （ 3 ) —ホスホコリ ン等の 1 一アルキル— 2—ァシルグ リセ口— （3) —ホスホコリ ン又は 1 , 2—ジへキサデシルグリセロー (3) —ホスホコリ ン等の 1 , 2—ジアルキルグリセ口— （3 ) —ホス ホコ リ ンが適当である。 これらの化合物についてはグリセロール残基の 2位の炭素に基づく光学異性体が存在するが、 本発明サーファクタン ト においては D体、 L体又は D L体のいずれを問わず使用することができ る。 このほかにコ リ ンホスホグリセリ ドとしては、 上述の単品からなる コ リ ンホスホグリセリ ド以外に、 炭素数が 1 2〜 2 4個のァシル基、 好 ましくは、 飽和ァシル基を 2個有する 1 , 2 —ジァシルグリセ口— （3 ) 一ホスホコリ ンの 2種以上からなる混合物、 更には当該混合物と上述の 単品との混合物も使用することができる。
酸性リ ン脂質としては、 1 , 2 —ジァシル— s n —グリセ口— （3 ) 一 リ ン酸 （別名 L— α —ホスファチジン酸） 、 1 , 2 —ジァシルー s n ーグリセロー （3 ) —ホスホー Lーセリン （別名ホスファチジルセリン） 、 1 , 2 —ジァシルー s n —グリセロー （ 3 ) —ホスホー s n —グリセロー ル （別名ホスファチジルグリセロール） 又は 1 , 2 —ジァシルー s n— グリセロー （ 3 ) —ホスホー （ 1 ) 一 L— m y o —イノシ トール （別名 ホスファチジルイノシトール） が適当である。 これらの化合物において、 1位及び 2位は同一種類又は異なる種類のァシル基でそれぞれ置換され ていてもよい。 ここで、 ァシル基の炭素数は 1 2〜 2 4個が好ましい。 脂肪酸類としては、 遊離脂肪酸、 脂肪酸のアルカリ金属塩、 脂肪酸ァ ルキルエステル、 脂肪酸グリセリ ンエステル若しくは脂肪酸アミ ド又は これらの 2種以上からなる混合物、 更には脂肪アルコール又は脂肪族ァ ミ ンが適当である。
本明細書において 「脂肪酸類」 とは、 ここでいう脂肪アルコール及び 脂肪族ァミ ンも包含する意味である。
遊離脂肪酸としてはミ リスチン酸、 パルミチン酸又はステアリ ン酸が 適当であるが、 パルミチン酸が好ましい。
脂肪酸のアル力 リ金属塩としては上記遊離脂肪酸のナ ト リゥム塩、 力 リウム塩、 マグネシウム塩又はカルシウム塩が適当であるが、 好ましく はパルミチン酸ナ ト リウムである。 脂肪酸アルキルエステルとしては炭 素数 1〜 4の低級アルキルエステルが適当であるが、 好ましくはパルミ チン酸ェチルエステルである。 脂肪酸ダリセリ ンエステルとしてはモノ グリセリ ンエステルが適当であるが、 好ましくはモノパルミチンである。 脂肪酸アミ ドとしてはパルミチン酸アミ ドが好ましい。
脂肪アルコールとしては炭素数 1 4〜 1 8のアルコールが適当である 力 、 好ましくはへキサデシルアルコールである。 脂肪族ァミ ンとしては 炭素数 1 4〜 1 8のァミ ンが適当であるが、 好ましくはへキサデシルァ ミ ンである。
上述のコリ ンホスホグリセリ ド、 酸性リ ン脂質及び脂肪酸類は動植物 から分離された製品、 半合成品又は化学合成品のいずれでもよく、 それ らの市販品を使用することができる。
本発明サーファクタン トは、 本発明合成べプチ ド溶液と上記脂質混合 物溶液との混合溶液を減圧乾固し、 得られた残留物を適当な懸濁溶媒を 用いて懸濁し、 次いで凍結乾燥する方法により製造することができる。 本発明合成べプチ ド溶液の調製に使用される溶媒としては、 例えば、 ギ酸、 T FA、 ト リフルォロエタノール、 DMS O、 クロ口ホルム メ 夕ノール、 クロ口ホルム、 メタノール、 エチレンクロロヒ ドリ ン又はテ トラヒ ドロフラン等が挙げられる。
脂質混合物溶液の調製に使用される溶媒としては、 例えば、 クロロホ ノレム、 クロ口ホルム メタノール 〔 1 ： 2〜5 ： 1 (VZV) 〕 が挙げ られる。
懸濁溶媒としては水又は水—エタノール混合液 〔4 ： 1〜20 ： 1 (V /V) 〕 が挙げられるが、 水—エタノール混合液が好ましい。 懸濁は 30 〜6 0°C、 好ましくは 4 0〜 5 0 °Cで、 5〜 6 0分間、 好ましくは 1 5 〜 3 0分間かけて行う。
本発明サ一ファクタン トには製法上、 微量の水分の残存は避けられな いが、 その残存重量比率が総重量に対して 5. 0 % (Wノ W) 以下にな るまで乾燥することが望ましい。 かかる程度まで乾燥すれば、 水—エタ ノール混合液を用いる場合、 エタノールの残存は検出不能となる。
また、 本発明サーファクタン ト乾燥粉末製剤は、 シェイクハン ド、 可 変速度式ミ クスチヤ一又は超音波発生装置により、 適切な生理的な濃度 の 1価又は 2価金属塩、 例えば 0. 9 %塩化ナトリウム若しくは 1. 5mM 塩化カルシウム又はそれらを含有する生理的な緩衝液を用いて均一に懸 濁分散させて使用することができる。
次に、 このようにして製造された本発明サーファクタン卜の表面活性、 懸濁性及び薬理学的性質について詳述する。
( 1 ) 表面活性
①表面張力低下作用 ；
表面張力低下作用の測定を田中らの方法 （日本界面医学会雑誌、 第 1 3 巻第 2号第 8 7頁、 1 9 8 2年） に準じて行った。
本発明サ一ファクタン ト懸濁液を生理食塩水 （表面積 ； 5 4. 0 c m2 ) 上に、 1 c m2あたり本発明サ一ファタタン トが 1. 0〜2. 0 μ g となるように滴下し、 該表面積を 5 4. 0〜2 1. 6 c m2の範囲内で 2 〜 5分かけて圧縮 ·拡張した際の表面張力をウイルヘルミ一表面張力測 定装置 （協和界面科学株式会社製） により、 3 7°Cで連続的に測定した。 本発明サーファクタン 卜の表面張力低下作用は、 最大表面張力が 2 4. 7— 3 4. 1 d y n e c m、 最小表面張力が 0. 2〜8. 7 d y n e c mであり、 生理食塩水の表面張力を低下させることが認められた。 同様にして測定した S F - 3の表面張力低下作用は、 最大表面張力が
2 6. 8〜5 0. 3 d y n eZcm、 最小表面張力が 1. 0- 1 3. 5 d y n e Z c mであった。
なお 3 7 °Cにおける生理食塩水の当初の表面張力は 7 0. 5 d y n e / c mであった。
②気液界面拡散作用 ；
生理食塩水の液面に、 表面積 1 c m2あたり 0. 8〜 1. の本発 明サ一ファクタン ト懸濁液を滴下し、 滴下直後からの表面張力を垂直板 法により経時的に測定した。 測定温度は 3 7°Cであった。
なお、 到達時間とは、 試料の滴下直後から表面張力が一定値にまでに 要する時間をいい、 平衡表面張力とはその時の値をいう。
本発明サーファクタン トは 3 0〜 6 0秒という短時間で気液界面に膜 を形成し、 表面張力を 2 6. 7〜3 4. 3 d y n e Z c mにまで低下さ せた。
同様にして測定した S F— 3の気液界面拡散作用は、 1 2 0秒経過後 の表面張力が 3 8. 1〜5 2. 9 d y n e_ c mであった。
このことは本発明サーファクタン 卜が気液界面に素早く拡散し、 急速 に表面張力を低下させる作用を有していることを示している。
③気液界面吸着作用 ；
l m l あたり 0. 2〜 1. Omgの本発明サ一ファクタントを含有す る 3 7°Cの生理食塩水懸濁液を調製し、 懸濁された本発明サーファクタ ン 卜の生理食塩水気液界面への吸着速度を測定した。
吸着速度の測定はキングらの方法 （American Journal of Physiology, 第 2 2 3巻第 7 1 5頁、 1 9 7 2年） に従った。
すなわち、 懸濁液を生理食塩水の入っている直径 5 c mのテフロン水 槽の底に注入後、 マグネティ ックスターラーでゆっ く り攪拌し、 攪拌を 停止した後の表面張力の変動値より吸着速度を求めた。
本発明サーファクタントは、 攪拌を停止してから 3 0〜 1 0 0秒経過 後に、 表面張力を 2 8. 3〜3 6. 8 d y n e / c mの範囲に低下させ、 その後、 一定値を示した。
これは懸濁状態にある本発明サーファクタン トが 3 0〜 1 0 0秒で気 液界面に浮上吸着し、 強い表面活性をもつ膜を形成したことを示してい る。
同様にして測定した S F— 3は、 表面張力が 4 2. 2 -5 8. 3 d y n e / c mの範囲で一定値を示し、 その所要時間は 1 5 0秒以上であった。
このことは S F— 3の気液界面吸着作用が本発明サーファクタン トよ り も弱いことを示し、 本発明サーファクタ ン 卜が強力な表面吸着促進力 をもつことを示している。
( 2 ) 懸濁性
肺サーファクタン 卜の懸濁性試験を、 特公平 4 - 7 6 9 6 5号公報記 載の方法に準じて行った。
すなわち、 懸濁開始後所定時間ごとの分散率及び懸濁開始後 2分経過 時の最大分散粒子径により、 懸濁性を判定した。
分散率の試験は、 2 0 m l容バイアルに肺サーフ ァクタ ン ト 6 0 m g を分取し、 生理食塩水 2 m 1を注入し、 当該バイアルをイワキ KMシェ一 カー V— S型振盪器 （イワキ株式会社製） に装着して 2 7 0ス トローク Z分で振盪し、 振盪開始後 2分まで 3 0秒ごと、 2分以降 4分まで 1分 ごとに、 更に 4分以降 1 0分までは 2分ごとに各試料の分散状態を容器 の外からルーペを通して肉眼で観察することにより行った。
懸濁状態の判定は、 各時間ごとに各試料 1 0本ずつ 2人で行い、 懸濁 したか否かの判断は容器内に小塊を全く認めず、 製剤が生理食塩水中に 均一に分散して白色のやや粘稠性の懸濁液が形成されたか否かで行った。 分散率は各人が各時間ごとに懸濁が完了した試料の全本数 （ 1 0本） に対する百分率を求め、 これの 2人による平均値で表示した。 最大分散粒子径は各試料を 20m l容バイアルに肺サーフ ァ クタ ン ト 60 m gを分取し、 生理食塩水 2 m 1を注入し、 上述と同一の振盪条件 で 2分間連続して振盪し、 懸濁液中の最大粒子を顕微鏡を用いて探し出 し、 その直径をノギスで測定することにより求めた。 本発明サ一ファク タ ン トは、 いずれも大部分が 2分以内に懸濁し、 しかもその最大粒子径 は 0. 8 mm以下であり、 懸濁性が良好であった。
(3) 薬理学的性質
①急性毒性 ；
5週令の雄性 I CR系マウス及びウィスター系ラッ トを用いて本発明 サーファクタン トの急性毒性を試験した。 マウスでの経口 L D5。及び腹腔 内 LD5。は、 2. 4〜1 0. O g/k g及び 1. 0〜5. O gZk gであ り、 ラッ トでのそれらは 1. 5〜5. O gZk g及び 1. 5〜2. 5 g / k gであった。
②亜急性毒性 ：
毎日 300〜600mgZk gずつ 1月間、 本発明サーファクタ ン ト をウィスター系成熟ラッ トに腹腔内投与したが、 体重の変化及び主要臓 器の肉眼的、 組織学的観察における異常は認められなかった。
③肺胞腔容量維持作用 ；
在胎期間 27日の兎未熟胎仔は肺サーファクタン トを殆ど産生せず、 肺サーファクタン ト欠乏状態にあることから、 新生児呼吸窮迫症候群の モデル動物とされている。
この在胎期間 27曰の兎胎仔 5匹を用いて、 気道内圧の増減下におけ る肺胞腔容量 （以下、 肺容量という。 ） を 37 °Cで測定した。
測定は胎仔の頸部を切開し、 気管に接続させた水マノメーターを用い て、 本発明サ一ファクタン トを経気道的に投与した 5分後から連続的に 行われた。 気道内圧を、 気管に接続させた 2チャンネル独立駆動シリ ン ジポンプ N o. 9 4 0 (米国ハーバー ド社製） を用いて 3 0 c m水圧ま で加圧し、 肺胞を拡張した。 次いで、 気道内圧を 0 c m水圧まで減圧し 肺胞を収縮させ、 各水圧における肺容量を測定した。 肺容量は体重 l k g あたりのミ リ リ ツ トノレ （m 1ノ k g ) で表示した。
本発明サーフ ァ クタ ン ト （6 0m g/k g) の投与はその濃度が 1.
0〜6. 0 % (WZV) になるように調整した生理食塩水懸濁液 0. 05 〜0. 5 m 1を気道内に直接注入する方法で行った。
機能的残気量を示す減圧時の 5 c m水圧の肺容量が大きいほど肺サー ファクタン ト活性が高いことを意味する。
対照として、 本発明サーファクタン ト懸濁液に代えて生理食塩水を投 与した。 対照群では、 在胎期間 2 7曰の兎未熟胎仔の肺容量 （5 c m水 圧） は 1〜5 m 1 Zk gで、 肺胞が殆ど拡張していなかった。
また、 正常レベルの肺サーファクタン トを有する在胎 3 0曰の満期胎 仔は、 肺容量 （5 c m水圧） が 3 5〜5 3m l /k gであり、 肺胞が十 分に拡張しており、 正常な呼吸を営むことが可能であることを示す。
S F - 3を投与した場合には、 未熟胎仔の肺容量 （5 c m水圧） が 1 5~2 5m l /k と肺胞の拡張が不十分であつた。
本発明サーファクタン トを投与した未熟胎仔の肺容量 （5 c m水圧） は 3 9〜 5 5m l k gを示し、 本発明サーファクタントが未熟胎仔の 肺容量を正常レベルまで改善することが認められた。
以上のように、 本発明合成べプチ ドは、 脂質混合物の表面活性を強力 に賦活する作用を有する。 従って、 本発明合成ペプチ ドと脂質混合物か らなる本発明サーファクタン トからは、 表面活性、 懸濁性及び薬理学的 性質から有効な呼吸窮迫症候群治療剤を調製することができる。
本発明サーファクタントを有効成分とする製剤は、 肺サ一ファクタン トが治療効果を示す疾病、 例えば、 術後呼吸不全、 喘息、 気管支炎、 新 生児壊死性腸炎、 胃 ，十二指腸潰瘍、 ウィルスによる呼吸器疾患、 耳管 閉塞症等の治療、 卵管癒着及び術後の臓器癒着の防止並びに去痰剤とし て使用することができる。
本発明により提供される呼吸窮迫症候群治療剤は 1回投与量として、 小児用には、 5 0〜 1 0 0 Omg、 成人用には 5 0 0〜5 0 0 O mgの 本発明サーファクタン トを含有する。 この用量を水、 生理食塩液又は生 理的に許容される緩衝液等に懸濁し、 濃度が 1. 0〜 1 0. 0 % (W/ V) になるように調整し、 これを呼吸障害発現直後から 7 2時間以内に 気道内に 1〜 1 0回注入又は噴霧することにより使用する。 そのほか、 懸濁させることなく、 そのまま粉末剤として直接、 吸入させることもで きる。 用量、 使用法及び回数は患者の症状及び併用療法に応じて適宜変 更しても良い。
本発明治療剤には必要に応じて安定剤、 保存剤、 等張化剤、 緩衝剤、 懸濁化剤、 抗酸化剤及び界面活性剤等の医薬品添加物又は気管支拡張剤、 抗アレルギー剤、 制癌剤、 抗菌剤、 抗ウィルス剤、 抗炎症剤、 抗真菌剤 等の医薬品を含有させることができる。
剤型は液剤又は用時に懸濁して用いる粉末剤が適当である。 本発明治 療剤はバイアル瓶又はアンプル瓶等の密封容器内に充填され、 無菌製剤 として保存される。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。
( 1 ) ぺプチ ドの製造
以下の実施例において、 合成したぺプチ ドの分子量を高速原子衝撃法 (F ABMS) により測定した。 質量分析計には、 J MS— S 1 0 2 A 型 （日本電子株式会社製） を使用し、 イオン源はセシウムガン （1 OKeV) を用いた。
〔実施例 1〕
〔配列番号 5〕 記載のペプチド （ペプチ ド A) を 「ザ， ペプチド （The Peptides) 」 〔グロス （Gross, E.) 及びマイネンホーフ （Meinenhofe, J.) 編、 バラニー （Barany，G.) 及びメ リ フィ ール ド （Merr if ield, R. ) 著、 第 2巻第 1〜 284頁、 アカデミ ックプレス、 ニューヨーク、 1 980 年） 〕 に記載の方法に従い、 固相合成法によりフエニルァセ トアミ ドメ チル （P AM) 樹脂上で合成した。
C末端ァミ ノ酸残基のロイシンを t 一ブチルォキシカルボ二ルーロイ シン （B o c— L e u) とし、 ォキシメ チルフヱニルァセ トア ミ ド結合 を介して P AM樹脂に結合させた。 C末端結合後 B o c - L e u - PAM 樹脂 （0. T O mo l Zg O. 3 5 g) をべプチ ド合成装置 （モデル 9 9 0 E、 べックマン社製） の反応容器に移した。 保護処理を施したァ ミノ酸を予め形成した対称無水物法により樹脂上で N末端方向に延長し、 完全に保護したペプチ ド一 0—樹脂を合成した。 但し、 アルギニンの縮 合に際しては、 N , N—ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド Zヒ ドロキン ベンゾト リアゾール [コニー等、 Chem. Ber. , 103， 788- 798(1970) ] を用 いてダブル力ップリ ングした。
なお、 全てのァミノ酸の N末端のァミノ基は、 Boc基で保護し、 官能 性側鎖を以下の基により保護し、 反応に使用した。
Arg-Tos ； ( 卜 シノレ） .
Lys - 2CLZ ； ( 2—クロ口べンジルォキシカルボニル） .
Cys - 4MeBzl ； (4一メチルベンジル） .
His一 Tos ； (トシル） .
この縮合反応の確認はニンヒ ドリン法によるカイザーテス卜で行った。 完全に保護したペプチ ド一 0—樹脂 （ 1 55mg) を塩化メチレン中 で 5分間膨潤させた。 N — ひ一 Boc保護基を 1 % ( v / v ) イ ン ドール 及び 0. 1 % ( v / v ) エタンジチオールを含有する T F Aを用いて脱 保護した。 次いで、 この脱保護したペプチ ド一 0—樹脂を、 p —クレゾ一 ノレ （ 1 m l ) 、 p —チォクレゾール （0. 2 g) 及び DM S 0 ( l m l ) を添加した無水フッ化水素 （H F) ( 1 l m l ) で、 0 °Cにて 6 0分間 処理し、 ペプチ ドを樹脂から切り出した。
H F及び D M S 0を真空下、 0 °Cにて留去した。 この切り出したぺプ チ ド及び樹脂を冷ジェチルエーテル （ 1 5 m l ) で 3回洗浄し、 次いで 切り出したペプチ ドを冷 T F A ( 5 m l ) で 4回洗浄することにより抽 出した。 この抽出液を直ちに濾過し、 氷冷水 （ 1 5 0 m l ) に加えて粗 製のぺプチドを沈澱させた。 次いで、 この粗製のぺプチ ドを、 1 0 0 0 X g, 0 °Cにて 3 0分間遠心分離し沈澱物として回収した。 この沈澱物 をジェチルエーテル （ 1 5 m l ) で洗浄した。 この洗浄工程を、 更にジ ェチルエーテル、 酢酸ェチル、 蒸留水を用いて繰り返し行いペプチ ド A を 8 4 m g得た。
この粗製のぺプチドを 5 0 % DM S 0水溶液に溶解し、 //—ボンダス フェアー、 C 8 — 3 0 0カラムによる逆相系高速液体クロマトグラフィー (H P L C ) で精製し、 純粋なペプチ ド Aを採取した。
溶離液としては、 0. 1 % T F Aを含む 5 0 %ァセ トニト リル水溶液 を用い 5分間溶出した。 次いで、 同溶離液と 0. 1 % T F Aを含む 8 0 %ァセ トニト リル水溶液による直線的な濃度勾配により 3 0分間溶出し
/ト o
溶出液中のぺプチドの存在は、 2 4 5 n m (分光光度計 ； 日本分光株 式会社モデル 8 7 0 - U V) および示差屈折計 （島津製作所株式会社モ デル R I D— 6 A) でモニタ一した。
F A BM S (M+ H + ) ; 3 8 3 7. 1 (分子量の計算値 ； 3 8 3 5. 9)
〔実施例 2〕
〔配列番号 6〕 のペプチド （ペプチド B) をァセルトン （E. Atherton) 及びシヱパー ド （R. C. Sheppard) 著 「ソリ ッ ドフェイズペプチ ド シンティシス ( Solid phase peptide synthesis― a practical approach , p. 25— 189, 1989 , Oxford University Press , Oxford ) 」 及び Kenich, Akagi et al . ， Chem . Pharm . Bull. ， 37 (10) , p2661 - 2664 ( 1989) に記載の方法を参考に、 マルチペプチ ド固相合成システム 「コックさん」 （商品名 ； 国産化学株 式会社製） により固相合成した。
初発の樹脂として、 N— ひ 一 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二 ノレ一ロイシン （ Fmoc— Leu ) を 4— (ヒ ドロォキシメチル） フエノキ シメチルーコポリ （スチレン 1 %ジビニルベンゼン） 樹脂に結合させた N— α— 9ーフルォレニルメチルォキシカルボ二ルーロイシン一 0—樹 脂 （Fmoc - Leu - 0 -樹脂） （0. Z Ommo l ZO. 5 g) を使用 した。 その樹脂を N, N—ジメチルホルムアミ ド （DMF) で 2 0分間 膨潤させた後、 DM Fで 4回樹脂を洗浄した。 20 %ピぺリ ジン一 DM F 溶液を加え振盪し脱保護を行った。 この脱保護を完全に行うためにこの 操作を 3回繰り返した。 次いで、 樹脂中の過剰のピぺリ ジンを除去する ため DMFで 3回、 N—メチルー 2—ピロリ ドンで 3回、 更に、 DMF で 3回洗浄した。 この際、 ピぺリ ジンの有無の確認を p H試験紙で行つ た。
その後、 DMF (6m l ) 、 Fmoc - Leu (0. 5mmo l ) 、 N— ヒ ドロキシベンゾト リアゾール （ 0. 5 m m o 1 ) 及び N , Ν' ージィ ソプロピルカルポジイ ミ ド （ 0. 5 mm ο 1 ) を加え 9 0分間振盪し縮 合反応を行った。 次いで、 DMFで 4回樹脂を洗浄し、 過剰の試薬を除 去した。 この縮合反応の確認は、 ニンヒ ドリ ン法によるカイザーテス ト で行つた。
このようにして合成計画に従い、 順次ァミ ノ酸を樹脂上で N末端方向 に延長し、 N末端及び官能基を完全に保護したぺプチ ド- 0 -樹脂を合 成した。
なお、 Arg、 Lys、 His. Pro、 Cysの導入時の縮合反応は、 1 20 分、 2回行った。
その後、 保護したぺプチ ドー 0—樹脂に 2 0 %ピぺリ ジン一 DMF溶 液を加え N末端の Fm o c保護基の脱保護を行い、 このペプチ ド— 0 - 樹脂を DMFで 6回、 メタノールで 6回洗浄し、 減圧乾燥した。 その乾 燥したペプチ ド一 O—樹脂 （ l O O mg) に氷冷下で攪拌しながら、 m —クレゾール （0. 2m l ) 、 1 , 2—エタンジチオール （0. 5m l ) 、 チオア二ソ一ル （ 1. 2m l ) 、 T FA (7. 5m l ) 及びト リメチル シリルブロマイ ド （ 1. 4m l ) を加えた後、 1 2 0分間氷冷下で攪拌 し、 官能性側鎖の脱保護とともにペプチ ドを樹脂から切り出し、 グラス フィルター （G 3 ) で濾過した。 この濾過液をエバポレイ夕一により約 5 m 1 にまで減圧濃縮し、 ジェチルエーテルを加えてぺプチ ドを沈殿さ せた。 このペプチ ド沈殿物をグラスフィルター （G 3) で濾取し、 ジェ チルエーテルで 5回洗浄した後、 減圧乾燥してぺプチ ド Bを 6 0 mg取 得した。
なお、 全てのアミ ノ酸の N末端のアミ ノ基は、 Fmoc基で保護し、 官 能性側鎖を以下の基により保護し、 反応に使用した。
Arg - Mtr ； (4—メ トキシー 2、 3、 6— トリメチルベンゼンス ルホニル） .
Lys - Boc ； ( t 一ブチルォキシカルボニル） .
Cys一 Trt ； (トリチル） . His— Trt ； (ト リチル） .
この粗製のペプチ ド約 1 0 0 m gを T F A ( l m l ) で溶解し、 4倍 量の移動相溶媒即ち 1 O mM^—メルカプトエタノール含有 T F A—ジ クロロメタン （ 5 ： 9 5， V/ V) 溶液を添加し 2 0 m g/m 1 の試料 溶液を調製し、 アサヒパック （ Asahipak) G S— 5 1 0 (0.7. 5 x 5 0 0 mm) カラム （商標、 旭化成社製） による H P L Cで精製し、 純 粋なぺプチ ド Bを採取した。
溶離液としては、 1 0 mM ;3—メルカプトエタノール含有 T F A—ジ クロロメタン （5 ： 9 5 , V/ V) 溶液を用い、 0. 8 m 1 i nの 流速で 8 0分間溶出した。 溶出液中のペプチドの存在は、 2 4 5 nm (分 光光度計 ； 日本分光株式会社モデル 8 7 0 - UV) および示差屈折計 （島 津製作所株式会社モデル R I D - 6 A) でモニターした。
FABMS ( + H+) ; 3 0 1 7. 9 (分子量の計算値 ； 3 0 1 6. 9 )
〔実施例 3〕
〔配列番号 7〕 のペプチ ド （ペプチ ド C) を実施例 2と同様の方法で 調製した。
FABMS (M+H + ) ; 3 1 1 6. 0 (分子量の計算値 ； 3 1 1 5. 1 )
〔実施例 4〕
[配列番号 8〕 のペプチ ド （ペプチド D) を実施例 2と同様の方法で 調製した。
FABMS (M+H + ) ； 2 6 6 3. 7 (分子量の計算値 ； 2 6 6 2. 5)
〔実施例 5〕
〔配列番号 9〕 のペプチ ド （ペプチ ド E) を実施例 2と同様の方法で 調製した。
F A BM S (M+ H+) ; 2 2 1 1. 2 (分子量の計算値 ； 2 2 0 9. 9)
〔実施例 6〕
〔配列番号 1 0〕 のべプチ ド （ぺプチ ド F) を実施例 2と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+H + ) ； 2 6 47. 5 (分子量の計算値 ； 2 6 4 6. 4 )
〔実施例 7〕
〔配列番号 1 1〕 のペプチ ド （ペプチ ド G) を実施例 2と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+H + ) ; 3 0 1 8. 1 (分子量の計算値 ； 3 0 1 6. 9)
〔実施例 8〕
〔配列番号 1 2〕 のペプチ ド （ペプチ ド H) を実施例 2に準じてマル チペプチ ド固相合成システムにより固相合成した。
初発の樹脂として、 N—な一フルォニルメチルォキシカルボ二ルーノ ルロイシン一 O—樹脂 （Fmoc— Nle— O—樹脂） （0. 20mmo l /0. 5 g) を使用した。 その樹脂を DMFで 20分間膨潤させた後、 DM Fで 4回樹脂を洗浄した。 2 0 %ピぺリジン— DM F溶液を加え振 盪し脱保護を行った。 この脱保護を完全に行うためにこの操作を 3回繰 り返した。 次いで、 樹脂中の過剰のピぺリ ジンを除去するため DM Fで 9回洗浄した。 この際、 ピぺリ ジンの残留を p H試験紙で確認した。 その後、 DMF (6 m l ) 、 Fmoc一 Nle (0. 5 mm o 1 ) 、 N - ヒ ドロキシベンゾトリアゾール （0. 5mmo l ) 及び N, N' —ジィ ソプロピルカルボジィ ミ ド （ 0. 5 mm o 1 ) を加え 9 0分間振盪し縮 合反応を行った。 次いで、 DMFで 4回樹脂を洗浄し、 過剰の試薬を除 去した。 この縮合反応の確認は、 ニンヒ ドリ ン法によるカイザ一テス ト で行つた。
このようにして合成計画に従い、 順次ァミ ノ酸を樹脂上で N末端方向 に延長し、 N末端及び官能基を完全に保護したペプチ ド一 0—樹脂を合 /¾した。
なお、 Arg、 Lys、 His, Proの導入時の縮合反応は、 1 2 0分、 2 回行った。
その後、 保護したぺプチ ドー 0—樹脂に 2 0 %ピぺリ ジン— DM F溶 液を加え N末端の Fmoc保護基の脱保護を行い、 このペプチ ド一 0 -樹 脂を DMFで 6回、 メタノールで 6回洗浄し、 減圧乾燥した。 その乾燥 したべプチ ドー O—樹脂 （ 1 0 0 m g) に氷冷下で攪拌しながら、 m— クレゾ一ル （0. 2m l ) 、 1 , 2—エタンジチオール （ 0. 5m l ) 、 チオア二ソール （ 1. 2 m l ) 、 T FA (7. 5m l ) 及び ト リ メチル シリルブロマイ ド （ 1. 4 m l ) を加えた後、 1 2 0分間氷冷下で攪拌 し、 官能性側鎖の脱保護とともにペプチ ドを樹脂から切り出し、 グラス フィルター （G 3 ) で濾過した。 この濾過液をエバポレイタ一により約 5 m 1 にまで減圧濃縮し、 ジェチルエーテルを加えてぺプチ ドを沈殿さ せた。 このペプチ ド沈殿物をグラスフィルター （G 3) で濾取し、 ジェ チルエーテルで 5回洗浄した後、 減圧乾燥してべプチ ド Hを 6 5 m g取 ½した。
なお、 全てのァミ ノ酸の N末端のァミ ノ基は、 Fmoc基で保護し、 官 能性側鎖を以下の基により保護し、 反応に使用した。
Arg - Mtr ； (4ーメ トキシー 2、 3、 6— ト リメチルベンゼンス ルホニル）
. Lys - Boc ； ( t 一ブチルォキシカルボニル） . Cys - Trt ； (ト リチル） .
His— Boc ； ( t —ブチルォキシカルボ二ル） .
このべプチド約 1 0mgを 3. 0m lのクロ口ホルム一メタノール （ C /M) 2 : 1 , (V/V) 混合溶媒に溶解した。 同試料を CZM混合溶 媒 2 : 1 , ( VZ V) で平衡化したセフアデクス L H— 6 0カラム （ 0 2. 5 c mx 9 0 c m) により精製し、 純粋なぺプチ ド Hを採取した。 溶出液中のぺプチ ドの存在は、 2 4 5 nm (分光光度計 ； 日本分光株 式会社モデル 8 7 0 - U V) 及び示差屈折計 （島津製作所株式会社 ； モ デル R I D— 6 A) でモニタ一した。
FABMS (M + H + ) ; 2 6 6 3. 6 (分子量の計算値 ； 2 6 6 2.
5)
〔実施例 9〕
〔配列番号 1 3〕 のべプチ ド （ぺプチ ド I ) を実施例 8と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+H + ) ; 2 5 60. 4 (分子量の計算値 ； 2 5 5 9.
3)
〔実施例 1 0〕
〔配列番号 1 4〕 のべプチド （ぺプチ ド J ) を実施例 8と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+H + ) ； 26 6 3. 8 (分子量の計算値 ； 2 6 6 2.
5)
〔実施例 1 1〕
〔配列番号 1 5〕 のべプチ ド （ぺプチド K) を実施例 2と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+H + ) ； 26 63. 5 (分子量の計算値 ； 26 6 2.
5) 〔実施例 1 2〕
〔配列番号 1 6〕 のべプチ ド （ぺプチ ド L) を実施例 2の方法に準じ て調製した。
FABMS (M+ H + ) ； 2 5 0 3. 6 (分子量の計算値 ； 2 5 0 2. 4 )
〔実施例 1 3〕
〔配列番号 1 7〕 のペプチ ド （ペプチ ド M) を実施例 2の方法に準じ て調製した。
FA BMS (M+ H + ) ； 2 7 3 6. 7 (分子量の計算値 ； 2 7 3 5. 5 )
〔実施例 1 4〕
〔配列番号 1 8〕 のべプチ ド （ぺプチ ド N) を実施例 2 と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+ H + ) ； 2 6 4 0. 4 (分子量の計算値 ： 2 6 3 9. 4 )
〔実施例 1 5〕
〔配列番号 1 9〕 のべプチ ド （ぺプチ ド 0) を実施例 8と同様の方法 で調製した。
FA BMS (M+H + ) ； 2 6 4 0. 3 (分子量の計算値 ； 2 6 3 9. 4 )
〔実施例 1 6〕 Fmoc一 Pro一 Val - His (Trt) 一 Leu - Lys ( Boc ) 一 Arg ( Mtr )
標題のぺプチド （ぺプチド P) をべプチドシンセサイザーシステム 9050 型 （ミ リポア社製） により固相合成した。
初発の樹脂として N— - 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル 一 N— ω— 4—メ トキシ一 2 , 3 , 6, — ト リ メチルベンゼンスルホ二 ルーアルギニン （Fmoc— Arg ( Mtr ) ) を 2—メ トキシー 4一アルコ キシベンジルアルコール—樹脂 （サスリ ン （Sasrin) 樹脂、 バッケィム (Bachem) 社、 商標） に結合させた N— α— 9—フルォレニルメチル ォキシカルボ二ルー Ν— ω— 4—メ トキシー 2, 3， 6 , — ト リ メチル ベンゼンスルホ二ルーアルギニン一 0—樹脂 （Fmoc— Arg (Mtr) 一 0—樹脂） （0. 2 Ommo 1 ) を使用し、 ペプチドシンセサイザーシス テム 9 0 5 0型の合成プロ トコールに従い、 モニターしながら順次ァ ミ ノ酸を樹脂上で N末端方向に延長し、 N末端及び官能基を完全に保護し たべプチ ドー O—樹脂を合成した。
その後、 完全に保護したぺプチ ドー 0—樹脂をメタノールで 5回洗浄 し、 減圧乾燥した。 その乾燥したペプチ ド一 0—樹脂 （3 3 O mg) に 氷冷下で攪拌しながら、 T FA—ジクロロメタン （ 1 ： 9 9, V/ V) 溶液を加えた後、 3 0分間氷冷下で攪拌し、 次いで、 9 0分間室温で攪 拌し、 保護基をつけたままべプチ ドを樹脂から切り出し、 グラスフィル ター （G 3) で濾過した。 この濾過液をエバポレーターにより約 5 m 1 にまで減圧濃縮し、 ジェチルエーテルを加えてぺプチ ドを沈殿させた。 このペプチド沈殿物をグラスフィルター （G 3) で濾取し、 ジェチルェ一 テルで 5回洗浄した後、 減圧乾燥してぺプチド Pを 1 8 Omg取得した。 なお、 全てのァミノ酸の N末端のァミ ノ酸は、 Fmo cで保護し、 官 能性側鎖を以下の基により保護し、 反応に使用した。
A r g— M t r ; (4—メ トキシー 2, 3, 6— ト リ メチルベンゼンス ノレホニノレ）
L y s - B o c ； ( t一ブチルォキシカルボニル）
H i s - T r t ； ( ト リチル）
この粗製のペプチド Pに T F A—ジクロロメタン （ 1 ： 99， V/V) 溶液を添加し 1 O m g Zm l の試料溶液を調製し、 アサヒパッ ク ( A s a h i p a k ) G S— 5 1 0 ( 02 1. 5 x 5 0 0 mm) カラム (商標、 旭化成社製） による H P L Cで精製し、 純粋なぺプチ ド Pを採 取した。
溶離液としては、 T FA—ジクロロメタン （ 1 ： 9 9. Vノ V) 溶液 を用い、 8. 1 m 1 /m i nの流速で 1 2 0分間溶出した。 溶出液中の ぺプチ ドの存在は、 2 4 5 nm (分光光度計 ； 日本分光株式会社モデル 870 -UV) 及び示差屈折計 （島津製作所株式会社モデル R I D - 6 A) でモニターした。
FABMS (M + H + ) ； 1 4 0 5. 0 (分子量の計算値 ； 1 4 0 3. 8 )
〔実施例 1 7〕
実施例 8に準じて H - Nle— (Nle) 14一 Nle— 0—樹脂をマルチ ぺプチ ド固相合成システムにより合成した。
次いで、 合成した H— Nle— (Nle) 14一 Nle - O—樹脂に D M F を添加後、 Fmoc— Arg (Mtr) の代わりにペプチド Pを N—ヒ ドロキ シベンゾト リァゾール及び N , N ' —ジイソプロピルカルボジイ ミ ドを 加え 8時間振盪し縮合反応を 2回行った。 なお、 この縮合反応の確認は、 ニンヒ ドリ ン法によるカイザーテス トで行つた。
その後、 実施例 8の方法に従って、 官能性側鎖の脱保護とともにぺプ 'チドを樹脂から切り出し、 HP LCによる精製を行い、 〔配列番号 1 3〕 のペプチ ド （ペプチド I ) を調製した。
FABMS (M+H + ) ； 2 5 60. 2 (分子量の計算値 ； 2 5 5 9. 3)
〔実施例 1 8〕
ペプチ ド Dのチオール基のァセ トアミ ドメチル （ACM) 体 （ぺプチ ド Q) を実施例 4における Fmoc— Cys - Trtを Fmoc - Cys一 ACM に代えた以外は同様の方法で調製した。
FABMS (M+H + ) ； 2 7 3 4. 7 (分子量の計算値 ； 2 7 3 3. 6)
〔実施例 1 9〕
Sarin, Virender Kumarら方法 （ EP 0 458 167A1 ) に準じて、 ペプチ ド Eのチオール基をパルミチン酸エステル化し、 ぺプ チ ド Rを調製した。
FABMS (M+H+) ； 2 4 4 8. 5 (分子量の計算値 ； 2 4 4 8. 3)
〔参考例 1〕
〔配列番号 2 0〕 のペプチ ド （ペプチ ド S) を実施例 2と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+H+) ； 2 7 9 3. 8 (分子量の計算値 ； 2 7 9 2. 6)
〔参考例 2〕
〔配列番号 2 1〕 のべプチ ド （ぺプチ ド T) を実施例 2と同様の方法 で調製した。
FABMS (M+H + ) ; 3 0 1 8. 3 (分子量の計算値 ； 3 0 1 6. 9)
〔本発明合成べプチ ドのァミ ノ酸組成分析〕
本発明合成べプチ ドを 5 % (vZv) フエノールを含む 1 2規定塩酸 — T FA 〔2 ： 1 ( V/V) 〕 で、 真空下、 1 5 0 °Cにて 1、 2、 4、 6、 1 2、 2 4、 4 8及び 7 2時間酸加水分解し、 酸を除いた後に、 加 水分解生成物を島津アミ ノ酸自動分析システム （L C一 9 A) により分 析した。 なお、 ペプチ ド Mの Trp については、 4. 2規定水酸化ナ ト リ ゥム水溶液で 1 6、 24、 32時間アルカリ加水分解後、 塩酸で中和し、 ァミ ノ酸自動分析システムにより分析した。 1〜 7 2時間加水分解にお いて、 より高い回収を示したアミ ノ酸値を採用し、 アミ ノ酸組成値を算 出したところ、 計算値とほぼ一致する値を示した。
結果を表 1 に示す。
to
〇 ϋι O
表 1 本発明合成べプチドのァミノ酸組成
Figure imgf000031_0001
(Hisを 1.0としたときの値：ベアチト' N.0は、 Asx を 1.0としたときの値）
(2) 本発明サーファクタン トの製造
本発明サーファクタン トを、 本発明合成べプチ ドと脂質成分としてコ リ ンホスホグリセリ ド、 酸性リ ン脂質及び脂肪酸類の 3成分とを、 混合 して調製した。
〔実施例 2 0〕
無菌処理した 1， 2—ジパルミ トイルグリセ口— （ 3 ) —ホスホコ リ ン （ 1 3 5 0 m g ) 、 1 , 2—ジァシルー s η—グリセロー （ 3 ) —ホ スホー s η—グリセロール （アンル基の炭素数 1 4〜2 4個 ： シグマ社 製） （ 4 5 0 m g) 及びミ リスチン酸 （ 2 0 0 m g) を常温でクロロホ ノレムーメ タノール混合液 〔2 : 1 (V/V) ] ( 1 0 0 0 m l ) に溶解 し、 ペプチ ド Aの 2 5 mgを T FA ( 1. 0 m l ) に溶解した。 これら の溶液を混合し、 減圧乾固した。 得られた残留物を 4 0 °Cで 1 5分間か けて水一エタノール混合液 〔9 : 1 (V/V) 〕 ( 1 0 0 m l ) に懸濁 した。 この懸濁液を一 5 0 °Cで凍結させて真空度 8 5~ 1 0 0 // H gで 3 6時間乾燥し、 サ一ファクタン ト （ 2 0 7 0 mg) を白色粉末として
•R=た。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2 -ジパルミ トイルグリセ口— （3) 一ホスホコリ ンは 6 5. 2 % (WZW) 、 1 , 2—ジァシルー s n—グ リセ口— （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロールは 2 1. 7 % (WZW) 、 及びミ リスチン酸は 9. 7 % (W/W) 、 ぺプチド Aは 1. 2 % (W/ W) 及び水 2. 2 % (W/W) であった。
〔実施例 2 1〕
1 , 2—ジパルミ トイルグリセ口— （ 3 ) —ホスホコリ ン （ 3 0 0. 0 m g ) 、 1， 2—ジァシルー s n—グリセロー （ 3 ) —ホスホー s n -グリセロール （ァシル基の炭素数 1 4〜 24個： シグマ社製） （"1 00. 0 m g) 及びパルミチン酸 （4 0. 0 m g) をクロ口ホルム一メ タノー ル混合液 〔 2 : 1 ( V/ V) 〕 ( 3 0 0 m l ) に溶解し、 ぺプチ ド Bの 1 0. O m gをクロ口ホルム ' メタノール混合液 〔 2 : 1 ( V Z V ) 〕 ( 2. O m l ) に溶解した。 これらの溶液を混合し、 減圧乾固した。 得 られた残留物を 4 5 °Cで 2 0分間かけて水一エタノール混合液 〔 9 : 1 (V/V) 〕 ( 1 0 0 m l ) に懸濁した。 この懸濁液を一 6 0 °Cで凍結 させて真空度 6 0〜 1 1 0 / H gで 4 0時間乾燥し、 白色粉末のサーフ ァクタン トを 4 5 9. 1 m g得た。
この粉末中にはェタノ一ルの残存は認められず、 サーファタタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2—ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリ ンは 6 5. 3 % (W/W) 、 1 , 2 —ジァシル— s n—グ リセ口— （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロールは 2 1. 8 % (Wノ W) 、 及びパルミチン酸は 8. 7 % (WZW) 、 ペプチ ド Bは 2. 2 % (Ψ W) 及び水 2. 0 % (W/W) であった。
〔実施例 2 2〕
1 ， 2 — ジノ、°ルミ トイルグリセロ ー （ 3 ) —ホスホコリ ン （ 2 8 0. 0 m g) 、 1 , 2 —ジラウロイル— s n—グリセ口— （3 ) —ホスホ— s n—グリセロール （ 1 2 0. Omg) 及びパルミチン酸 （2 7. O mg) をクロ口ホルム一メタノール混合液 〔2 ： 1 (V/V) ) ( 1 5 0 m l ) に溶解し、 ペプチ ド Cの 2. 8 m gをクロ口ホルム · メタノール混合液 〔 1 ： 2 (VZV) 〕 （0. 5 m l ) に溶解した。 これらの溶液を混合 し、 減圧乾固した。 得られた残留物を 4 0 °Cで 4 5分間かけて水 -エタ ノール混合液 〔8 : 2 (V/V) 〕 ( 1 0 0 m l ) に懸濁した。 この懸 濁液を— 6 5 Cで凍結させて真空度 5 0〜 8 0 H gで 3 6時間乾燥し、 白色粉末のサーファクタン トを 4 3 7. 6 m g得た。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サ一ファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1， 2—ジパルミ トイルグリセ口— （3) 一ホスホコリ ンは 6 4. 0 % (W/W) 、 1， 2—ジラウロイルー s n ーグリセロー （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロールは 2 7. 4 % (W/ W) 、 及びパルミチン酸は 6. 2 % (W/W) 、 ペプチ ド Cは 0. 6 % (WZW) 及び水 1. 8 % (W/W) であった。
〔実施例 2 3〕
ペプチド Bの代わりにペプチド Dを用い、 又、 1 , 2—ジァシルー s n ーグリセロー （ 3 ) —ホスホ— s n—グリセロール （ァシル基の炭素数 1 4〜2 4個 ： シグマ社製） の代わりに 1 一パルミ トイルー 2—ォレオ ィルー s n—グリセ口— （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロールを用いた 以外は 〔実施例 2 1〕 と同様な操作を行い、 白色のサーファクタン ト粉 末を 4 5 1. 9 m g製造した。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1， 2—ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリ ンは 6 6. 4 % (W/W) 、 1 —パルミ トイルー 2—ォレ オイル一 s n—グリセ口— （3) —ホスホー s n—グリセロールは 2 2. 1 % (W/W) 、 及びパルミチン酸は 8. 9 % (W/W) 、 ペプチ ド D は 2. 2 % (WZW) 及び水 0. 4 % (WZW) であった。
〔実施例 2 4〕
1 , 2—ジパルミ トイルグリセロー （ 3 ) —ホスホコリ ン （ 3 2 0.
0 m g) 、 1 , 2—ジミ リス トイルー s η—グリセロー （ 3 ) -ホスホ 一 s η—グリセロール （80. Omg) 及びパルミチン酸 （60. 0 mg) をクロ口ホルムーメ夕ノール混合液 〔 1 : 1 (VZV) 〕 ( 200 m l ) に溶解し、 ぺプチ ド E ( 1 4. Omg) を T FA (0. 3m l ) に溶解 した。 これらの溶液を混合し、 減圧乾固した。 得られた残留物を 4 5°C で 60分間かけて水一エタノール混合液 〔1 0 ： 1 (VZV) 〕 (50ml ) に懸濁した。 この懸濁液を一 4 5 °Cで凍結させて真空度 5 0〜 1 1 0 / H gで 2 4時間乾燥し、 白色粉末のサーファクタン トを 4 7 9. 2 m g 得た。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サ一ファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2 -ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリ ンは 66. 8 % (W/W) 、 1， 2—ジミ リス トイルー s n —グリセ口— （3 ) —ホスホ— s n—グリセロールは 1 6. 7 % (W/ W) 、 及びパルミチン酸は 1 2 · 5 % (WZW) 、 ペプチ ド Eは 2. 9 % (W/W) 及び水 1. 1 % (W/W) であった。
〔実施例 2 5〕
ペプチ ド B ( 1 0. O mg) の代わりにペプチ ド F (2 2. 0 m g) を用い、 また、 1， 2—ジァシルー s n—グリセロー （3) —ホスホ— s n—グリセロール （ァシル基の炭素数 1 4〜 2 4個 ： シグマ社製） の 代わりに 1 , 2—ジステアロイル— s n—グリセ口— （3) —ホスホー s n—グリセロールを用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同様な操作を行い、 白色のサーファクタン ト粉末を 4 6 3. 9 mg製造した。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1， 2 -ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリ ンは 64. 7 % (W/W) 、 1 , 2—ジステアロイルー s n ーグリセロー （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロールは 2 1. 6 % (W/ W) 、 及びパルミチン酸は 8. 6 % (W/W) 、 ペプチ ド Fは 4. 7 % (W/W) 及び水 0. 4 % (W/W) であった。
〔実施例 2 6〕
ぺプチ ド Bの代わりにべプチド Gを用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同 様にして白色のサーファクタント粉末を 4 5 4. 1 m g製造した。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サ一ファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2—ジパルミ トイルグリセロー （3) 一ホスホコ リ ンは 6 6. 1 % (W/W) 、 1 , 2—ジァシル— s n—グ リセ口— （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロール （ァシル基の炭素数 1 4 〜 2 4個 ： シグマ社製） は 2 2. 0 % (W/W) 、 及びパルミチン酸は 8. 8 % (W/W) 、 ペプチ ド Gは 2. 2 % (W/W) 及び水 0. 9 %
(W/W) であった。
〔実施例 2 7〕
1. 2—ジパルミ トイルグリセ口— （3) —ホスホコリン （2 1 Omg) 、 1 , 2—ジァシルー s n—グリセロー （ 3 ) —ホスホ— s n—グリセ口一 ノレ （ァシル基の炭素数 1 4〜 2 4個 ： シグマ社製） （9 0. O mg) 及 びステアリン酸 （33. Omg) をクロ口ホルム—メタノール混合液 〔3 ： 1 (V/V) ] ( 1 0 0 m l ) に溶解し、 ペプチ ド H ( 1. 9 m g) を メタノール （0. 5 m l ) に溶解した。 これらの溶液を混合し、 減圧乾 固した。 得られた残留物を 5 0°Cで 1 5分間かけて水ーェタノール混合 液 〔9 ： 1 (VZV) 〕 (9 0m l ) に懸濁した。 この懸濁液を一 5 5 °Cで凍結させて真空度 1 0 0〜 1 2 0；/ Η gで 2 8時間乾燥し、 白色粉 末のサーファクタン トを 3 4 0. 2 mg得た。
この粉末中にはェタノ一ルの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1， 2 -ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリ ンは 6 1. 7 % (W/W) 、 1 , 2—ジァシルー s n—グ リセロー （3) —ホスホー s n—グリセロールは 26. 5 % (W/W) 、 及びステアリ ン酸は 9. 7 % (WZW) 、 ペプチ ド Hは 0. 5 % (WZ W) 及び水 1. 6 % (WZW) であった。
〔実施例 2 8〕
1， 2—ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリン （2 1 Omg) 、
1 ーノ、。ルミ トイルー 2—ォレオイル一 s n—グリセロー （ 3 ) —ホスホ 一 Lーセリ ン （ 9 0. 0 m g) 及びパルミチン酸 （ 3 3. O m g) をク ロロホルム—メタノ一ル混合液 〔 4 : 1 (V/V) ] ( 1 0 0 m l ) に 溶解し、 ペプチ ド I ( 1 1 . O m g) を T F A ( 0. 5 m l ) に溶解し た。 これらの溶液を混合し、 減圧乾固した。 得られた残留物を 4 5 °Cで 2 5分間かけて水一エタノール混合液 〔9 ： 1 (V/V) ] ( 1 1 0 m l ) に懸濁した。 この懸濁液を— 5 5 °Cで凍結させて真空度 1 0 0〜 1 2 0 〃11 で2 8時間乾燥し、 白色粉末のサ一ファクタントを 3 4 8. 7 m g
½た o
この粉末中にはエタノ一ルの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2 -ジパルミ トイルグリセ口— （3 ) 一ホスホコリ ンは 6 0. 2 % (W/W) 、 1 —パルミ トイル— 2 —ォレ オイル— s n—グリセロー （3 ) —ホスホー Lーセリ ンは 2 5. 8 % (W /W) 、 及びパルミチン酸は 9. 5 % (W/W) 、 ぺプチ ド I は 3. 2 % (W/W) 及び水 1 . 3 % (W W) であった。
〔実施例 2 9〕
ぺプチ ド Bの代わりにべプチ ド Jを用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同 様にして白色のサーファクタン ト粉末を 4 5 9. 3 m g製造した。
〔実施例 3 0〕
ペプチド Bの代わりにペプチ ド Kを用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同 様にして白色のサーファクタント粉末を 4 5 2. 5 m g製造した。 〔実施例 3 1〕
ペプチ ド Bの代わりにペプチ ド Lを用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同 様にして白色のサーファクタン ト粉末を 4 5 6. 6 m g製造した。 〔実施例 3 2〕
ペプチド Bの代わりにペプチド Mを用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同 様にして白色のサーファクタント粉末を 4 5 3. 9 m g製造した。 〔実施例 3 3〕
ペプチ ド Bの代わりにペプチ ド Nを用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同 様にして白色のサーファクタン ト粉末を 4 5 2. 5 m g製造した。
〔実施例 3 4〕
ペプチ ド Bの代わりにペプチ ド 0を用いた以外は 〔実施例 2 1〕 と同 様にして白色のサーファクタン ト粉末を 4 5 8. l m g製造した。
〔実施例 3 5〕
1， 2—ジノ、°ノレミ トイルグリセ口一 （3) —ホスホコリン （30. Omg) 、 1 , 2 _ジァシルー s n—グリセ口 — （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロー ノレ （ァシル基の炭素数 1 4〜 2 4個 ： シグマ社製） （ 1 0. O m g) 及 びパルミチン酸 （4. Omg) をクロ口ホルム一メタノール混合液 〔2 ： 1 (V/V) ] (3 0 m l ) に溶解し、 ペプチ ド Qの 1. O mgをクロ 口ホルム · メタノール混合液 〔2 : 1 (V/V) ] (2. Om l ) に溶 解した。 これらの溶液を混合し、 減圧乾固した。 得られた残留物を 4 5 °Cで 20分間かけて水一エタノール混合液 〔9 : 1 (V/V) 〕 ( 1 Oml ) に懸濁した。 この懸濁液を一 6 0 °Cで凍結させて真空度 6 0〜 1 2 0 / H gで 3 6時間乾燥し、 白色粉末のサーファクタン トを 4 5. 4mg得 た。
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サーファタタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1, 2 -ジパルミ トイルグリセロー （3) —ホスホコリ ンは 66. 1 % (WZW) 、 1 , 2—ジァシル一 s n—グ リセロー （3) —ホスホー s n—グリセロールは 22. 0 % (W W) 、 及びパルミチン酸は 8. 8 % (W/W) 、 ペプチ ド Qは 2. 2 % (W/ W) 及び水 0. 9 % (W/W) であった。
〔実施例 3 6〕
ペプチ ド Qの代わりにペプチド Rを用いた以外は 〔実施例 3 5〕 と同 様にして白色のサーファクタン ト粉末を 4 5. 7 m g製造した。 〔参考例 3〕
ぺプチド B ( 1 0. O m g) をクロ口ホルム—メタノール混合液 〔2 ： 1 (V/V) ] ( 2. 0 m 1 ) に溶解した溶液の代わりに、 ペプチ ド S
5 ( 1 0. O m g) を T F A ( 0. 3 m 1 ) に溶解した溶液を用いた以外 は 〔実施例 2 1〕 と同様にして、 サーファクタン トを 4 5 5. 2 m g得
7 o
この粉末中にはェタノ一ルの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2—ジパルミ トイルグリセロー （3)
10 一ホスホコリ ンは 6 5. 9 % (WZW) 1 , 2 —ジァシル— s n —グ リセロー （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロール （ァシル基の炭素数 1 4 2 4個 ： シグマ社製） は 2 2. 0 % (W/W) 、 及びパルミチン酸は 8. 8 % (WZW) 、 ペプチド Sは 2. 2 % (W/W) 及び水 1 . 1 % であった。
15 〔参考例 4〕
ぺプチド B ( 1 0. 0 m g) をクロロホルムーメタノ一ル混合液 〔 2 ： 1 (V/V) 〕 ( 2. O m l ) に溶解した溶液の代わりに， ペプチ ド T ( 1 0. O m g) を T F A ( 0. 3 m 1 ) に溶解した溶液を用いた以外 は 〔実施例 2 1〕 と同様にして、 サーファクタントを 4 5 6. O m g得
20 o
この粉末中にはェタノールの残存は認められず、 サーファクタン トの 総重量に対する各成分の含量は、 1 , 2 -ジパルミ トイルグリセロー （3) 一ホスホコリ ンは 6 5. 8 % (W/W) 1 , 2 -ジァシルー s n—グ リセロー （ 3 ) —ホスホー s n—グリセロール （ァシル基の炭素数 1 4
25 2 4個 ： シグマ社製） は 2 1 . 9 % (W/W) 、 及びパルミチン酸は
8. 8 % (W/W) 、 ペプチ ド Tは 2. 2 % (W/W) 及び水 1 . 3 % であった。
本発明サーファクタン 卜の表面活性及び肺胞腔容量維持作用の結果を 表 2に示す。 産業上の利用可能性
上述のように本発明である新規な合成ポリぺプチ ドは、 単離 ·精製が 容易でありかつ大量製造が可能な方法で作られ、 一般溶媒に対する溶解 性が高く、 従来の製剤に比べ、 良好な均一懸濁性及び同等の強力な表面 活性を示した。
従って、 重篤な呼吸障害をきたす疾病である呼吸窮迫症候群の治療剤 として利用することができる。
表 2 本発明サーファクタ ン 卜の表面活性及び肺胞腔容量維持作用 表 面 活 性
肺胞腔容量 表面張力低下作用 気液界面拡散作用 不 BE]寸 Ί \rrri
気液界面吸着作用
取大 平衡 平衡 肺容量 到達時間 到達時間
dyne dyne 表面張力
sec 表面張力 (5cm水圧） sec
/c / cm ayne/ cm dyne/ cm ml/kg 室饰例 20 29.0 0.2 30 27.5 65 30.3 卖施例 21 24.7 0.5 30 26.7 30 29.2 実施例 22 32.6 4.3 60 33.1 90 34.8 41 実施例 23 26.8 2.5 40 28.5 50 32.3 51 実施例 24 33.1 7.3 60 33.5 100 34.6 39 実施例 25 33.7 7.4 60 32.8 100 34.2 39 実施例 26 27.2 1.1 60 28.3 40 29.9 49 室施例 27 27.2 8.7 60 27.5 50 28.3 Λ Ρ, 室; fife例 28 34.1 3.9 60 34.3 95 36.8 A C) 実施例 29 28.0 0.8 30 27.6 30 29.9 53 実施例 30 31.5 1.6 50 28.0 80 32.1 47 実施例 31 34.2 1.2 60 33.1 100 34.5 40 実施例 32 33.7 3.0 30 31.6 60 33.9 44 実施例 33 28.7 3.2 30 26.9 50 30.2 51 実施例 34 30.8 2.1 50 29.8 70 31.9 49 実施例 35 30.1 2.5 40 30.4 50 31.7 49 実施例 36 33.4 3.9 60 31.3 90 32.9 45 参考例 3 40.1 10.3 90 37.2 180 41.5 28 参考例 4 39.0 2.5 95 36.4 150 39.7 29 配 列 表 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 35
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ペプチ ド
配列
Phe lily lie Pro し ys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu He Val 1 5 10 15
Val Val Val Val Val Leu lie Val Val Val He Val Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
配列番号 ： 2
配列の長さ ： 34
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Leu lie Pro Cys し ys Pro Val Asn lie Lys Arg Leu Leu lie Val Val
1 5 10 15
Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu Met
20 25 30
Gly Leu 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 35
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Leu Arg lie Pro Cys ys Pro Va Asn Leu Lys Arg Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Val Val Val Val Val Leu Val Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
配列番号 ： 4
配列の長さ ： 32
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val 1 5 10 15
Val Leu He Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His
20 25 30 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 35
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Phe bly He Pro し ys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
配列番号 ： 6
配列の長さ ： 27
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu
20 25
配列番号 ： Ί
配列の長さ ： 27
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
20 25
配列番号 ： 8
配列の長さ ： 23
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
20
配列番号 ： 9
配列の長さ ： 1 9
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu 配列番号 ： 1 0
配列の長さ ： 2 3
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： ペプチ ド
配列
ier Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
20
配列番号 ： 1 1
配列の長さ ： 2 7
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle 1 5 10 15 Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Gly Ala Leu Leu
20 25
配列番号 ： 1 2
配列の長さ ： 2 3
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle 1 5 10 15 Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
20 配列番号 ： 13
配列の長さ ： 22
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle 1 5 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle
20
配列番号 ： 14
配列の長さ ： 23
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
し ys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Nle 1 5 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
20
配列番号 ： 15
配列の長さ ： 23
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列 Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15 lie Leu Leu Leu Leu lie Leu
20
配列番号 ： 16
配列の長さ ： 23
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys ro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Nva Leu Val
1 5 10 15
Leu Nva Leu Leu Leu Leu Val
20
配列番号 ： 1 7
配列の長さ ： 2 3
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
し ys Pro Val his Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp
20
配列番号 ： 1 8
配列の長さ ： 2 3 配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
20
配列番号 ： 1 9
配列の長さ ： 2 3
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val Asn l ie Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nl e Nl e 1 5 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
20
配列番号 ： 2 0
配列の長さ ： 2 7
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Val Val Val Val Val Val Val Val Val 1 5 10 15 Val Val Val Val Val Val Val Gly Ala Leu Leu
20 25
配列番号 ： 2 1
配列の長さ ： 2 7
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Cys Pro Val His Leu Lys Arg lie lie lie lie lie lie lie lie lie
1 5 10 15 lie lie lie lie lie lie lie Gly Ala Leu Leu
20 25

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記特定配列を含有する合成べプチ ド。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W
(Xaaは存在しないか又は Cys若しくは Serを表し、 Xbbは His又は Asnを表 し、 Xccは Leu又は lieを表し、 Wは疎水性ペプチ ド部分を表す。 ）
2. 疎水性ペプチ ド部分が、 Leu及び 又は Nle 1 2〜2 0個により構 成されるぺプチ ドである請求項 1記載の合成べプチ ド。
3. 疎水性ペプチ ド部分中に、 Leu及び Nleを除く疎水性アミ ノ酸を含 有する請求項 1又は 2記載の合成べプチ ド。
4. 疎水性ペプチ ド部分中に、 Ile、 Val Nva又は Trpを 1〜 5個含有す る請求項 1乃至 3記載の合成べプチ ド。
5. 特定配列を含有する合成ペプチドが配列番号 5〜 1 9に記載のいず れか又は配列番号 8のべプチ ドの S—ァセ トアミ ドメチル体若しく は配 列番号 9のぺプチ ドの S—パルミ トイル体である請求項 1記載の合成べ プチ ド。
6. 下記特定配列で表される親水性べプチド部分中の N末端及び官能性 側鎖が保護された合成用べプチ ド。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg
(Xaaは存在しないか又は Cys若しくは Serを表し、 Xbbは His又は Asnを表 し、 Xccは Leu又は lieを表す。 ）
7. 合成用ぺプチドが Fmoc-Pro-Val- His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr) ヽ Fmoc-Pro-Val -Asn-Leu-Lys (Boc) -Arg(Mtr)又 Fmoc-Pro-Val -Asn- He -Lys(Boc)-Arg(Mtr)である請求項 6記載の合成用べプチ ド。
8. 請求項 1乃至 4記載の疎水性べプチド部分と請求項 6又は 7記載の 合成用べプチ ドとを縮合させることを特徴とする請求項 1記載の合成べ プチ ドの製造法。
9 . 特定配列を含有する合成ペプチド、 コリ ンホスホグリセリ ド、 酸性 リ ン脂質及び脂肪酸類からなる肺サーファクタン ト。
10 . 特定配列を含有する合成ペプチド、 コリ ンホスホグリセリ ド、 酸 性リ ン脂質及び脂肪酸類を含有する肺サーファクタ ン トを有効成分とし て含む呼吸窮迫症候群治療剤。
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