KR100635541B1 - 신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 FEX-2의 리간드를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 탐식세포의 표면에 발현된 FEX-2에 결합하여 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인의 분비는 억제하여 염증성 질환을 치료할 수 있는 효과가 있다.
FEX-2, 염증성 질환, 탐식세포, 항염증성 사이토카인

Description

신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Novel pharmaceutical composition for preventing or treating diseases or disorders associated with inflammation}
도 1은 인간 FEX-2 단백질의 각 도메인을 도시화한 모식도이다.
도 2는 L/FEX-2 세포 표면에 FEX-2가 발현되는지를 FEX-2 단클론 항체를 이용하여 유세포 분석기로 분석한 결과이다. 대조군으로는 마우스 면역글로불린을 사용하였다.
도 3은 L/FEX-2 세포에 의한 노화된 적혈구 또는 정상 적혈구의 부착 및 탐식 정도를 정상 적혈구 및 L/Mock세포와 비교한 결과이다.
도 4는 FEX-2 단클론 항체에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식의 억제 정도를 나타낸 결과이다.
None: L/FEX-2 세포에 아무것도 처리하지 않은 경우
5G3: L/FEX-2 세포를 FEX-2 단클론 항체와 전배양한 경우
IgG1: L/FEX-2 세포를 마우스 면역글로불린과 전배양한 경우
도 5는 적혈구의 노화에 따른 포스파티딜세린의 발현 정도를 아넥신 V 항체를 이용하여 유세포 분석기로 측정한 결과이다.
도 6은 적혈구의 노화에 따른 L/FEX-2 세포와의 부착 정도를 측정한 결과이다.
도 7은 여러 종류의 인지질이 L/FEX-2 세포에 부착되는 정도를 나타낸 그래프이다.
PI: 포스파티딜이노시톨, PE: 포스파티딜에탄올아민
PS: 포스파티딜세린, PC: 포스파티딜콜린
PA: 포스파티딘산, PG: 포스파티딜글리세롤
도 8은 여러 종류의 인지질의 처리에 따른 L/FEX-2 세포에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식의 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
None: 인지질을 첨가하지 않음.
PI: 포스파티딜이노시톨, PE: 포스파티딜에탄올아민
PS: 포스파티딜세린, PC: 포스파티딜콜린
PA: 포스파티딘산, PG: 포스파티딜글리세롤
도 9는 포스파티딜세린 또는 포스파티딜콜린의 첨가 농도에 따른 L/FEX-2 세포에 대한 노화된 적혈구의 부착 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 포스파티딜세린의 구조적 유도체에 의한 L/FEX-2 세포에 대한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 억제 정도를 나타낸 결과이다.
None: 인지질을 첨가하지 않음.
PS: 포스파티딜세린
PDS: 포스포-D-세린
PLS: 포스포-L-세린
도 11은 항 Fas-항체를 처리한 Jurkat T 세포 및 엑토포사이드(ectoposide)를 처리한 U937 세포에서 세포 사멸 정도를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 12는 L/FEX-2 세포와 L/Mock 세포에서 자연사멸세포의 탐식 정도를 관찰한 사진이다.
a: L/Mock 세포
b: L/FEX-2 세포
도 13은 포스파티딜세린 또는 FEX-2 단클론 항체에 의한 L/FEX-2 세포의 자연사멸세포 탐식 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
None: 아무것도 처리하지 않음.
PS: 포스파티딜세린, PC: 포스파티딜콜린
5G3: FEX-2 단클론 항체, IgG1: 마우스 면역글로불린
도 14는 L/FEX-2 세포에 FEX-2 단클론 항체의 처리에 따른 항염증성 사이토카인의 분비정도를 측정한 결과이다.
Con: 아무것도 처리하지 않은 대조군
IgG: 마우스 면역글로불린 IgG1 처리
5G3: FEX-2 단클론 항체 처리
도 15는 대식세포의 표면에 FEX-2가 발현되는지 여부를 FEX-2 단클론 항체를 이용하여 유세포 분석기로 분석한 결과이다. 대조군으로는 마우스 면역글로불린 IgG1을 사용하였다.
도 16은 포스파티딜세린 또는 FEX-2 단클론 항체에 의한 대식세포의 사멸세포 탐식 억제정도를 나타낸 그래프이다.
PS: 포스파티딜세린
IgG: 마우스 면역글로불린
5G3: FEX-2 단클론 항체
도 17은 LPS로 자극시킨 J774 대식세포주에 FEX-2에 대한 여러 종류의 리간드의 처리에 따른 항염증성 사이토카인 및 염증성 사이토카인의 분비정도를 측정한 결과이다.
대조군: 아무것도 처리하지 않음
LPS: LPS로 자극시킴
LPS+AR: LPS로 자극시킨 다음 노화된 적혈구를 처리함.
LPS+PC: LPS로 자극시킨 다음 포스파티딜콜린 리포좀을 처리함.
LPS+PS: LPS로 자극시킨 다음 포스파티딜세린 리포좀을 처리함.
LPS+IgG: LPS로 자극시킨 다음 마우스 면역글로불린을 처리함.
LPS+5G3: LPS로 자극시킨 다음 FEX-2 단클론 항체를 처리함.
본 발명은 신규한 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이 다. 보다 구체적으로 본 발명은 FEX-2의 리간드를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 약학적 조성물은 탐식세포의 표면에서 발현되는 FEX-2에 결합하여 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 활성을 가지고 있다.
염증(Inflammation)은 세포 및 조직의 손상이나 감염에 대한 국부적인 또는 전신적인 방어기작이다. 염증은 주로 면역계를 이루는 수많은 체액성 매개체(humoral mediator)가 직접 반응하거나 국부적 또는 전신적 작동 시스템(effector system)을 자극함으로써 일어나는 연쇄적인 생체반응에 의해 유발된다. 이러한 염증반응에 관여하는 매개체들로는 PMN(polymorphonuclear leukocytes), CTL (cytotoxic T lymphocyte), NK 세포, 대식세포 등과 같은 면역세포와 사이토카인 등이 있다. 염증성 질환은 특히, 염증성 사이토카인의 불균형과 효과세포(effector cell)의 상호작용에 의해 야기된다. 주요 염증성 질환으로는 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염 및 만성 부비동염 등과 같은 비염 및 부비동염; 급성화농성 중이염 및 만성화농성 중이염 등과 같은 중이염; 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴 및 바이러스성 폐렴 등과 같은 폐렴; 급성 또는 만성 위염; 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염 등과 같은 장염; 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 등과 같은 관절염; 및 당뇨성 안질환 등이 있다.
현재까지 알려진 주요한 염증성 사이토카인으로는 대식세포 및 단핵구 세포에 의해 생성되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1, IL-6 및 IL-18 등이 있다. 이 중에서 TNF-α는 저농도에서 적절한 지혈 및 방어 작용을 수행하지만, 고농도에서는 전신 또는 특정조직에서 IL-1과 같은 다른 종류의 염증성 사이토카인과 함께 작용하여 염증반응을 악화시킨다.
한편, TGF-β는 특정 세포의 증식을 촉진 또는 억제하는 활성이 있는 사이토카인으로서 림프구 반응의 길항 효과 및 대식세포 활성화 억제 등과 같은 활성을 가지고 있어서 대표적인 항염증성 사이토카인으로 알려져 있다.
한편, 염증성 사이토카인의 불균형에 의한 염증성 질환을 치료하기 위하여 상기 염증성 사이토카인을 억제하고 항염증성 사이토카인의 생성을 촉진하고자 하는 연구가 다양하게 이루어지고 있다.
염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 억제하는 방법으로는 사이토카인이 외부자극에 의해 분비되는 것을 억제하는 생산 억제 방법과 사이토카인이 대상세포를 자극하는 것을 조절하는 작용 억제 방법이 있다. 사이토카인의 생산 억제제로는 IL-1과 TNF-α 생산억제제인 SK&F 86002, 테트라드린(tetradrine), WIN 67694 등이 보고 된 바 있으며, 사이토카인의 작용 억제제로는 IL-1 수용체 길항제(antagonist)인 IL-1 ra, 수용성 TNF-α 수용체, 사이토카인 항체 등이 개발된 바 있다.
이에 본 발명자들은 새로운 염증성 질환의 치료제를 연구하던 중, FEX-2의 리간드가 탐식세포의 표면에 발현되는 FEX-2에 결합하여 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인의 분비는 억제하여 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 FEX-2의 리간드를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 탐식세포에서 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하거나 또는 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FEX-2의 리간드를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 탐식세포에서 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하거나 또는 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 염증성 질환 치료용 약학적 조성물은 FEX-2의 리간드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 'FEX-2'는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 랫트 및 마우스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간 FEX-2이다. 가장 바람직하게는 상기 FEX-2는 포유동물의 탐식세포에서 발현되는 것임을 특징으로 한다.
본 발명자들은 fas-1 도메인을 포함하는 부분적인 인간 cDNA를 공지된 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 검색하고 이 중에서 아직까지 그 특성이 규명되지 않은 cDNA를 선발하였다. 상기 cDNA를 기초로 하여 프라이머를 디자인한 후 인간 비장으로부터 추출한 총 RNA를 주형으로 하고 상기에서 디자인된 프라이머로 RT-PCR 및 5' RACE PCR을 수행함으로써 fas-1 도메인을 포함하는 인간 유전자를 새롭게 클로닝하였다(실시예 1 참조).
상기 본 발명자들이 합성한 유전자는 7개의 fas-1 도메인, 23개의 EGF-유사 도메인, 1개의 X-링크 도메인 및 1개의 막 횡단 도메인을 가지고 있었다(도 1 참조). 상기와 같은 도메인 구조를 근거로 하여 상기 유전자를 FEX-2로 명명하고 상기 유전자 서열을 진뱅크에 등록하였다(AY311388). 인간 FEX-2의 전체 염기서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다.
본 발명자들은 상기 FEX-2의 기능을 확인하고자 다양한 실험을 수행한 결과, 상기 FEX-2가 노화된 세포 및 사멸 세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린을 특이적으로 인식함으로써 상기 세포의 부착 및 탐식을 매개한다는 사실을 FEX-2 유전자로 형질전환 된 섬유아세포를 이용하여 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 노화된 세포 및 사멸 세포의 탐식에 관여하는 대식세포의 표면에 FEX-2가 발현되며 상기 대식세포의 탐식작용이 FEX-2에 의해 매개되는 것임을 확인하였다. 이로부터 본 발명자들은 상기 FEX-2가 포스파티딜세린의 신규한 수용체임을 규명하였다.
나아가, 본 발명자들은 활성화된 탐식세포인 대식세포 또는 FEX-2 유전자로 형질전환 된 섬유아세포에 FEX-2에 대한 리간드를 처리한 결과 항염증성 사이토카인의 분비가 촉진되고 염증성 사이토카인의 분비는 억제됨을 확인하였다. 따라서, FEX-2의 리간드를 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 FEX-2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고 이를 마우스 섬유아세포인 L 세포에 형질전환하여 L/FEX-2 세포를 제조한 다음(실시예 1 참조), 상기 세포가 노화된 세포 및 사멸 세포의 부착 및 탐식에 관여하는지를 조사하였다(실시예 4 참조). 그 결과, L/FEX-2 세포가 노화된 적혈구 세포를 선택적으로 인식하여 부착하고 탐식함을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4 참조). 따라서, 상기 L/FEX-2 세포에 의한 노화된 적혈구 세포의 부착 및 탐식은 FEX-2에 의해 매개된 것임을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명의 다른 실시예에서는 FEX-2에 의한 노화된 세포의 부착에 있어서 FEX-2의 인식 부위를 동정한 결과(실시예 5 참조), 노화가 진행됨에 따라 적혈구의 표면에 포스파티딜세린의 발현정도가 증가하고(도 5 참조), L/FEX-2 세포와의 부착 정도도 증가함을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 또한, FEX-2는 노화된 적혈구 세포 표면의 포스파티딜세린 만을 특이적으로 인식하며(도 7 내지 도 9 참조), FEX-2는 음성 전하에 의해 포스파티딜세린을 인식하는 것이 아니라 포스파티딜세린의 구조를 특이적으로 인식함을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
또한, 본 발명자들은 노화된 세포 뿐 만 아니라 자연사멸세포의 경우에도 세포 표면에 포스파티딜세린이 발현된다는 사실로부터 L/FEX-2 세포에 의해 자연사멸세포가 탐식되는지를 조사한 결과(실시예 6 참조), FEX-2는 노화된 세포뿐만 아니라 자연사멸세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린을 인식하여 부착 및 탐식을 매개함을 알 수 있었다(도 12 및 도 13 참조).
한편, 본 발명자들은 L/FEX-2 세포에 FEX-2 단클론 항체를 처리하고 항염증성 사이토카인의 분비량을 측정한 결과(실시예 6 참조), L/FEX-2 세포에 FEX-2 단클론 항체를 처리함으로써 항염증성 사이토카인의 분비량이 증가됨을 확인할 수 있었다(도 14 참조).
또한, 본 발명자들은 노화된 세포 및 자연사멸세포의 탐식은 주로 대식세포에 의해 이루어지기 때문에 대식세포의 표면에 FEX-2가 발현되는지와 상기 대식세포의 탐식 작용이 FEX-2에 의해 매개되는지를 조사하였다(실시예 7 참조). 그 결과, 대식세포에서 FEX-2가 발현되며(도 15 참조), 대식세포의 탐식 작용은 대식세포의 표면에 존재하는 FEX-2가 자연사멸세포의 표면에 발현된 포스파티딜세린을 특이적으로 인식함으로써 이루어진다는 사실을 확인할 수 있었다(도 16 참조). 따라서, FEX-2가 포스파티딜세린의 신규한 수용체임을 규명할 수 있었다.
포스파티딜세린 의존성 자연사멸세포의 탐식은 항염증성 사이토카인인 TGF-β의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인인 TNF-α의 분비는 억제한다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 대식세포의 표면에 존재하는 FEX-2에 대한 리간드가 대식세포의 탐식과정에서 발생되는 시그날과 동일한 시그날을 활성화된 대식세포에 전달하여 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진할 수 있는지 여부를 조사하였다(실시예 <7-3> 참조). 그 결과, 포스파티딜세린 또는 FEX-2 단클론 항체 처리에 의해 활성화된 대식세포는 대식세포가 노화된 세포를 탐식하는 경우와 유사하게 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인의 분비는 억제함을 확인할 수 있었다(도 17 참조).
따라서, 본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 'FEX-2 리간드'를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 'FEX-2 리간드'는 FEX-2에 결합하는 모든 종류의 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 FEX-2 리간드는 탐식세포의 표면에서 발현되는 FEX-2에 결합하여 활성화된 탐식세포에서 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인의 분비를 억제할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 상기에서 탐식세포로는 전문적인 탐식세포인 대식세포 뿐 만 아니라 상피세포 및 섬유아세포와 같은 비전문적인 탐식세포도 포함된다. 상기 FEX-2 리간드로는 가장 바람직하게는, 포스파티딜세린 및 그 유도체 또는 항-FEX-2 항체일 수 있다.
상기 포스파티딜세린은 천연에 존재하는 지방질의 일종으로서 세린기, 인산기, 글리세롤과 2개의 지방산기가 결합된 물질이다. 상기 포스파티딜세린은 1948년 폴크(Folch)에 의해 분리된 후 수 많은 연구가 수행됨으로써 치매 치료 및 뇌기능 개선, 간질 치료, 스트레스 내성과 같은 효과가 있음이 보고 된 바 있다. 본 발명에서 포스파티딜세린은 특별히 한정되지는 않으며 천연으로부터 유래되었거나 합성된 것을 사용하거나 또는 상업적으로 구입한 것을 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기에서 포스파티딜 유도체로는 포스포-L-세린이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 포스파티딜세린은 분말, 과립, 페이스트 및 액상의 형태를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포스파티딜세린은 염의 형태일수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용될 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 염으로는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염 및 황산염을 들 수 있다.
본 발명에서 항-FEX-2 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 FEX-2 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
다클론 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 랫트와 같은 여러 온혈 동물로부터 당해 분야의 통상적인 기술 중의 하나를 사용하여 제조할 수 있다. 즉, 항원을 복막내, 근육내, 안내 또는 피하 주사를 통해 동물을 면역시킨다. 상기 항원에 대한 면역성은 보조제, 예를 들어 프로운트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 증가시킬 수 있다. 부스터(booster) 면역처리에 따른 다음, 혈청의 소형 샘플을 수집하고 목적하는 항원에 대한 반응성을 시험한다. 동물의 역가가 일단 항원에 대한 이의 반응성의 관점으로 정체 상태에 도달하면, 다량의 다클론 면역혈청을 1주 마다의 출혈 또는 동물을 방혈시킴으로써 수득할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다(Kennettm McKearn, and Bechtol(eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980). 단클론 항체는 FEX-2 단백질을 면역원으로 하여 동물을 면역화시키고, 면역화된 동물의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, FEX-2 단백질을 선택적으로 인식하는 하이브리도마를 선별하며, 선별한 하이브리도마를 배양하고, 하이브리도마의 배양액으로부터 항체를 분리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 단클론 항체는 FEX-2 단백질을 선택적으로 인식하는 항-FEX-2 항체를 생산하는 상기의 하이브리도마를 동물 에 주입하고, 주입 후 일정기간이 지난 다음 회수한 동물의 복수로부터 분리함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 제조한 인간 FEX-2 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 5G3는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학원 유전자원센터 유전자은행(KCTC)에 2004년 5월 21일자로 기탁번호 KCTC-10639BP로 기탁하였다.
한편, 본 발명에 따른 FEX-2 리간드는 순수한 형태 또는 적합한 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 상기에서 약학적 조성물은 상기 FEX-2 리간드를 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제조될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 상기에서 '염증성 질환'으로는 단순 염증 자체 또는 상기 염증 반응에 의해 유발되는 모든 질환이 포함된다. 예를 들면, 이에 한정 되지는 않으나 염증, 염증성 장 질환, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthro sis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 탐식세포에서 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하거나 또는 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 스크리닝 방법은 (a) FEX-2가 발현되는 탐식세포와 후보물질을 배양 하는 단계; 및
(b) 탐식세포에서 분비되는 항염증성 사이토카인 또는 염증성 사이토카인의 생성량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 FEX-2가 발현되는 탐식세포란 대식세포 또는 FEX-2로 형질전환된 마우스의 섬유아세포인 L세포가 바람직하다.
상기 항염증성 사이토카인 또는 염증성 사이토카인의 생성량을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 ELISA법을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
인간 FEX-2 cDNA의 클로닝
<1-1> 발현 벡터의 제조
fas-1 도메인을 포함하는 신규한 세포부착분자를 동정하기 위하여 fas-1 도메인을 포함하는 서열을 진뱅크(Genbank)와 셀레라 게노믹스(Celera genomics)의 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 검색하였다. 그 결과, 특징이 규명되지 않은 인간의 부분적인 cDNA 클론(FLJ00112, DZKZp434E0321, CD44-like precursor FELL)이 검색되었다. 상기의 전체 길이 cDNA 서열은 RT-PCR과 5' RACE PCR에 의해 인간 비 장 세포로부터 제조하였다.
먼저, 상기에서 fas-1 도메인을 포함하고 있는 것으로 검색된 3 종류의 인간 비장의 부분적인 cDNA 클론를 기초로 하여 2쌍의 프라이머(서열번호 2 내지 서열번호 5)를 디자인하였다(표 1). 인간의 비장으로부터 추출한 RNA 2μg을 주형으로 하고 상기에서 디자인한 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 역전사효소 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행함으로써 fas-1 도메인을 포함하는 단백질의 부분적인 cDNA를 2 부분으로 나누어서 수득하였다. 상기에서 PCR 반응은 PCR 시스템(Expand high fidelity PCR system, Roche)을 사용하여 95℃에서 2분간 반응시킨 후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, 3.6kb와 2.0kb의 증폭 산물을 각각 수득하였다. 상기 증폭 산물 중 3.6kb cDNA를 제한효소 ClaI 및 SacI(TaKaRa) 로 절단한 다음 pBluescript-KS(+)(Stratagene) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터'pBS-Fex23'를 제조하였다. 또한, 상기 증폭 산물 중 2.0kb cDNA를 제한효소 SacI 및 HindⅢ(TaKaRa)로 절단한 다음 pET-29b벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터를'pET-Fex45'를 제조하였다. 그 다음 상기 두개의 cDNA 염기서열을 합치기 위해 pET-FEX45를 EcoRⅠ으로 잘라서 수득한 단편을 크레나우(klenow) 효소로 처리하여 블런트(blunt) 단편으로 제조한 다음 이를 다시 SacⅠ으로 잘라서 상기 재조합 벡터 PET-Fex23의 동일한 제한효소자리에 클로닝하여 재조합 벡터 'pET-Fex2345'를 제조하였다.
fas-1 도메인을 포함하는 cDNA 의 5' 말단은 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 인간의 비장으로부터 수득한 RNA를 표 1에 나타낸 프라이머(서열번호 6)로 증폭하여 cDNA를 제조하고 상기 cDNA를 주형으로 하여 표 1에 나타낸 프라이머(서열번호 7 및 서열번호 8)와 5' RACE system(5' RACE system for Rapid Amplification of cDNA Ends version 2.0, Invitrogen)에서 제공하는 어댑터 프라이머를 사용하여 제조자가 지시하는 방법에 따라 5' RACE PCR을 수행하여 증폭 산물을 수득하였다. 그 다음 상기 증폭 산물을 염기서열 분석기(Applied Biosystems AB13700)에서 분석하여 FEX-2의 5' 말단의 염기서열을 밝혀낸 후 상기 5'말단 염기서열을 기초로 하여 프라이머를 제조하였다. 인간의 비장으로부터 추출한 RNA 2μg을 주형으로 하고 상기의 5' 말단 염기서열을 기초로 디자인한 프라이머 쌍(서열번호 9 및 서열번호 10)을 사용하여 역전사효소 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행함으로써 2.5kb의 5' 말단 cDNA를 수득하였다. 상기 증폭산물을 제한효소 EcoRI 및 ClaⅠ(TaKaRa)으로 절단하여 pBluescript-KS(+)벡터(Stratagene)의 동일한 제한효소 위치에 삽입함으로써 재조합 벡터'pBS-Fex1'를 제조하였다. 완전한 염기서열을 발현벡터에 클로닝하기위해 우선 상기에서 제조한 pET-Fex2345를 KpnⅠ과 HindⅢ로 잘라서 pcDNA3.1(-)/Myc-His 벡터(Invitrogen)의 동일한 제한효소 위치에 삽입하여 'pcDNA-Fex45'를 제조하였다. 또한, 다시 pET-Fex2345를 BamHⅠ과 KpnⅠ으로 잘라서 pcDNA-Fex45의 동일한 제한효소 위치에 삽입하여 'pcDNA-Fex2345'를 제조한 후 마지막으로 상기 pBS- Fex1을 EcoRⅠ과 ClaⅠ으로 잘라서 pcDNA-Fex2345의 동일한 제한효소 위치에 삽입하여 완전한 염기서열을 클로닝하였다.
상기에서 제조된 플라스미드를 염기서열 분석기(Applied Biosystems AB13700)에서 분석한 후 염기서열은 진뱅크(GenebankTM accession number AY311388)에 등록하였고 상기에서 제조된 FEX-2의 완전한 염기서열을 포함하는 발현 벡터를 'pcDNA-Fex2'라 명명하였다.
상기 염기서열 분석 결과로부터 추정된 아미노산 서열은 스캐빈저 수용체 FEX-2(Scavenger receptor FEX-2)(Adachi H. et al., J. Biol. Chem. 277:34264-34270, 2002)와 히알루로난 수용체 스타빌린-2(encocytic hyaluronan receptor Stabilin-2)(Politz O. et al., Biochem J. 362:155-164, 2002)와 거의 동일한 것으로 나타났으며 그들의 도메인 구조는 7개의 fas-1 도메인, 23개의 EGF-유사 도메인, 1개의 X-링크 도메인 및 1개의 막횡단 도메인을 가지고 있었다(도 1).
Fex-2 발현 벡터의 클로닝에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
Fex23 센스 5'-tgc ccc atc gat gtg atg aaa c-3' 2
Fex23 안티센스 5'-caa aca aga gct ccc gct gca caa t-3' 3
Fex45 센스 5'-gca gcg gga gct ctt gtt tga cct g-3' 4
Fex45 안티센스 5'-ccc gtc caa gct tgc aca gtg tcc t-3' 5
RACE-GSP-1 안티센스 5'-tcc cag ctt act cag tgg cca ggc-3' 6
RACE-GSP-2 안티센스 5'-cag gcc cat cat att tgc aca ctg tag ac-3' 7
RACE-GSP-3 안티센스 5'-agt taa ttt ggc agg ggt cca cag gc-3' 8
Fex1 센스 5'-aag gca ggt ctc acc tat ctc ctg g-3' 9
Fex1 안티센스 5'-tca caa atg cat gtc ccg ttg c-3' 10
<1-2> L 세포의 형질전환
상기 실시예 <1-1>의 발현 벡터 pcDNA-Fex2로 마우스 섬유아세포인 L 세포(ATCC CCL-1, 동경대학의 생물물리학과 다케치 박사로부터 제공받음)를 형질전환하였다. 상기 L 세포를 10% 열불활성화 FBS, 페니실린G 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다.
상기에서 선택된 L 세포를 재조합 벡터 pcDNA-Fex2로 형질전환하기 위하여 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen)을 사용하였으며 제조자가 지시하는 방법에 따라 형질전환하였다. 형질전환한 후 48시간에 G418(400 μg/ml)을 처리하여 10 내지 12일 동안 배양하면서 저항성을 나타내는 각각의 콜로니를 분리하였다. 상기와 같은 방법으로 형질전환된 세포를 L/FEX-2로 명명하였다. 음성 대조군(L/Mock)으로는 FEX-2 유전자가 포함되지 않은 벡터인 pcDNA3.1(-)/Myc-His로 형질전환한 세포를 사용하였다.
<실시예 2>
인간 FEX-2에 대한 단클론 항체의 제조
인간의 FEX-2에 대한 단클론 항체를 제조하기 위해서 인간 FEX-2의 전체 아미노산 서열(서열번호 1) 중 아미노산 1173번부터 1727번에 해당하는 염기서열을 포함하는 cDNA를 제조하였다. 상기 cDNA는 상기 실시예 <1-1>의 pCDNA-fex2 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머(서열번호 11 및 서열번호 12)를 사용하여 PCR을 수 행함으로써 수득하였다(표 2). PCR은 95℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 25회 반복수행하였다. 상기 증폭된 산물을 제한효소 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로 절단하여 pET43.1a벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 삽입하였다.
항원으로 사용된 재조합 단백질의 제조에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
hFex2-4E5 센스 5'-aaa aag gat cca cag tgt ttg ctc c-3' 11
hFex2-4E5 안티센스 5'-ttt tac tcg aga ctt ttg gga gat agc-3' 12
상기에서 제조된 발현 벡터를 'pET-4E5'라 명명한 다음 단백질 발현과 분리는 <2-1>에서의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 단클론 항체의 제조는 다이노나사(Dinona Inc., Seoul, Korea)에 의뢰하여 제조하였다. 즉, 상기에서 제조된 재조합 단백질 20μg을 6 마리의 쥐에 2주 간격으로 면역접종하여 양성의 하이브리도마 클론(clone 5G3)을 수득하고 이를 쥐의 복강에 주입시켜 복수로 채취함으로써 단클론 항체를 얻었다. 상기 단클론 항체의 아형(isotype)은 이소스트립 마우스 단클론항체 이소타이핑 키트(IsoStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit, Roche)를 사용하여 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 단클론 항체의 아형은 IgG1 람다 체인(lambda chain)으로 확인되었다.
상기 본 발명의 인간 FEX-2 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 5G3는 부 다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학원 유전자원센터 유전자은행(KCTC)에 2004년 5월 21일자로 기탁번호 KCTC-10639BP로 기탁하였다.
<실시예 3>
L/FEX-2 세포 표면에서 FEX-2의 발현 여부 확인
상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포 표면에서 FEX-2가 발현되는지 여부를 상기 실시예 <2-3>에서 제조한 FEX-2 단클론 항체(5G3)를 이용하여 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다.
L/FEX-2 세포를 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지가 포함된 플레이트에서 완전히 배양(confluent) 한 다음 상기 플레이트에 0.25% 트립신과 0.05% EDTA를 함유하는 PBS 완충액을 처리하여 플레이트 표면으로부터 세포를 분리하였다. 상기 세포를 PBS 완충액으로 2회 세척한 후 이를 다시 PBS 완충액에 재현탁하였다. 상기 세포 현탁액에 FEX-2 단클론 항체(5G3)를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 여기에 10μg/ml의 FITC와 결합된 이차 토끼 항-마우스 면역글로불린 G(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 그 다음 5-와트 레이저가 장착된 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 488nm에서 분석하였다. 대조군으로는 FEX-2 단클론 항체 대신 마우스 면역글로불린(IgG1)을 사용하였다.
실험 결과, L/FEX-2 세포의 표면에 FEX-2가 발현됨을 확인할 수 있었다. 그 러나, L/Mock 세포의 표면에는 FEX-2가 발현되지 않는 것으로 나타났다. 또한, FEX-2 단클론 항체 대신 마우스 면역글로불린을 사용한 경우에도 FEX-2의 발현이 검출되지 않았다(도 2).
<실시예 4>
FEX-2에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식
<4-1> L/FEX-2 세포에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식
상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포와 대조군인 L/Mock 세포에 노화된 적혈구가 부착 및 탐식되는지 여부를 조사하였다. 먼저, 이를 위해 정상 성인의 자발적 공여자로부터 채혈한 정상 적혈구를 헤마토크릿 20%가 되도록 PBS로 희석한 후 37℃에서 4일간 배양함으로써 노화된 적혈구 세포를 제조하였다. 그 다음 L/FEX-2 세포, L/Mock 세포 및 정상 L 세포를 각각 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)가 포함된 6-웰 플레이트에서 완전히(confluent) 배양한 후 노화된 적혈구 또는 정상 적혈구를 최종 헤마토크릿 1%가 되도록 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 배양액을 PBS로 5회 세척하고 광학현미경으로 노화된 적혈구 및 정상 적혈구의 부착 정도를 관찰하였다. 임의로 선택한 100개의 L/FEX-2 세포에 부착된 적혈구의 수를 계수하여 평균값을 구하였다. 탐식 분석은 세포를 PBS로 세척한 다음 물로 10초간 처리하여 탐식되지 않은 세포를 모두 용해시켰다. 그 후 L/FEX-2 세포를 디프 퀵 염색용 킷트(Diff quick staining kit, IMEM Ins., San Marcos, CA, USA)를 사용하여 염색하고, 임의로 선택한 5 군데에서 적혈구를 탐식한 세포의 수를 계수하였다. 부착 및 탐식지표(%)는 전체 L/FEX-2 세포 중에서 적혈구를 부착 및 탐식한 세포의 수를 백분율로 나타낸 것이다.
실험 결과, 노화된 적혈구가 L/FEX-2 세포에 부착되며 탐식됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 노화된 적혈구는 대조군인 정상 L 세포와 L/Mock 세포에는 거의 부착하지 않았으며, 탐식되지 않았다. 또한, 정상 적혈구의 경우에는 L/FEX-2 세포에 의한 부착 및 탐식이 거의 일어나지 않았다(도 3).
상기 결과로부터 FEX-2는 노화된 세포의 선택적인 부착과 탐식을 알 수 있었다.
<4-2> 항-FEX-2 단클론 항체에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 억제
노화된 적혈구의 부착 및 탐식이 FEX-2에 의한 것인지를 확인하기 위해 FEX-2에 대한 단클론 항체(5G3)가 노화된 적혈구 세포의 부착 및 탐식을 억제하는지를 조사하였다.
상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포에 상기 실시예 2의 인간 FEX-2 단클론 항체(5G3) 100μg/ml를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 전배양하였다. 이때, 대조군으로는 상기 FEX-2 단클론 항체를 대신하여 마우스 면역글로불린(IgG1)을 첨가하였다. 그 다음 상기 실시예 <4-1>의 노화된 적혈구를 헤마토크릿 1%가 되도록 첨가하고 37℃에서 1시간동안 추가로 배양하였다. 배양이 완료된 후 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 정도를 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 분석하였다. 이때, 상 기 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 정도는 항체와 전배양하지 않은 L/FEX-2 세포의 경우와 비교하여 억제 정도를 백분율로 나타냈다.
실험 결과, L/FEX-2 세포를 FEX-2 단클론 항체(5G3)와 전배양한 경우 노화된 적혈구의 부착 및 탐식이 크게 저해되었다. 이에 비해 상기 L/FEX-2 세포를 마우스 면역글로불린과 전배양한 경우에는 노화된 적혈구의 부착 및 탐식에 큰 영향을 주지 않았다(도 4).
상기 실험 결과로부터 노화된 적혈구 세포의 부착 및 탐식은 FEX-2에 의해 매개되며 항-FEX-2 항체에 의해 억제된다는 사실을 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
FEX-2에 의한 노화된 적혈구의 부착에 있어서 FEX-2의 인식 부위 동정
<5-1> 적혈구의 노화에 따른 세포표면의 포스파티딜세린 발현 정도 측정
자연사멸세포는 세포 표면에 'eat me' 시그날을 나타냄으로써 대식세포에 의해 탐식된다. 상기 시그날의 대표적인 것이 포스파티딜세린(phospatidylserine)이다. 이에 FEX-2에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식이 노화된 적혈구의 표면에 발현되는 포스파티딜세린을 FEX-2가 특이적으로 인식할 것이라고 가정하고, 이를 확인하기 위하여 먼저, 노화 정도에 따른 적혈구의 포스파티딜세린의 발현정도를 측정하였다. 아넥신 V(annexin V)는 칼슘에 의존적으로 인지질과 결합하는 단백질로서 포스파티딜세린에 강력한 친화성을 가지고 있다고 알려져 있다. 이에 아넥신 V 항체를 사용하여 적혈구의 노화과정에서 세포표면에 발현되는 포스파티딜세린의 양을 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다. 즉, 정상 성인의 자발적 공여자로부터 채혈한 정상 적혈구를 PBS에서 37℃로 각각 0일, 2일 및 4일간 배양한 후 아넥신 V 세포사멸 검출 키트(Santacruz)를 사용하여 포스파티딜세린의 발현 정도를 제조자의 지시에 따라 유세포 분석기로 측정하였다.
실험 결과, 노화가 진행됨에 따라 적혈구의 세포 표면에 포스파티딜세린의 발현 정도가 증가함을 확인할 수 있었다(도 5).
<5-2> 적혈구의 노화에 따른 FEX-2와의 부착 정도 조사
상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 L/FEX-2 세포와 노화된 적혈구 세포를 함께 배양하였다. 이때, 상기 노화된 적혈구 세포는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 및 5일간 배양한 적혈구 세포를 사용하였다. 배양이 완료된 후 노화된 적혈구와 L/FEX-2 세포와의 부착 정도를 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 분석하였다.
실험 결과, 적혈구의 배양 시간이 길어질수록 즉, 적혈구의 노화가 진행됨에 따라 L/FEX-2 세포와의 부착 정도가 증가함을 알 수 있었다(도 6).
<5-3> 여러 종류의 인지질에 대한 L/FEX-2 세포의 부착 활성
적혈구가 노화됨에 따라 세포표면의 포스파티딜세린이 증가하고 이를 FEX-2가 인식한다는 사실을 확인하기 위하여, 여러 종류의 인지질에 대한 L/FEX-2 세포의 부착 활성을 조사하였다. 포스파티딜콜린(phosphatidlycholine, PC), 포스파티 딜세린(phosphatidlyserine, PS), 포스파티딜이노시톨(phospatidylinositol, PI), 포스파티딜에탄올아민(phsophatidylethanolamine, PE), 포스파티딘산(phosphatidic acid, PA) 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidylgycerol, PG)과 같은 인지질을 포함하는 리포좀을 이전에 보고 된 방법을 사용하여 제조하였다(Oka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:9535-9540, 1998; Fadok, V. A. et al., Nature 405:85-90, 2000). 즉, PS:PC(PS 리포좀), PI:PC(PI 리포좀), PG:PC(PG 리포좀), PE:PC(PE 리포좀) 및 PA:PC(PA 리포좀)를 각각 50:50의 몰 비율로 혼합하여 리포좀을 제조하였으며, PC만을 포함하는 리포좀(PC 리포좀)을 제조하였다. 상기 리포좀 혼합물을 클로로포름과 혼합하고 질소 기체 하에서 건조시킨 다음 최종 농도가 5mM이 되도록 PBS에 재현탁하여 얼음 위에서 10분간 초음파 처리하였다. 또한, 상기 리포좀 제조시 총 인지질에 대해 1% 농도의 N-(lissamin rhodamine B sulfonyl)-L-α-포스파티딜에탄올아민(Avanti Polar Lipids)을 첨가하여 형광 표지된 인지질 리포좀을 제조하였다. 상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포를 DMEM 배지에서 완전히 배양한 후 여기에 상기에서 제조한 여러 종류의 인지질 리포좀을 각각 100μM씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 PBS로 충분히 세척하고 L/FEX-2에 대한 인지질 리포좀의 부착 정도를 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 분석하였다. 또한, 인지질 리포좀의 탐식 정도는 상기 L/FEX-2 세포에 세포용해완충액(1% TritonX-100)을 첨가하여 용해시켰다. 그 다음 탐식된 리포좀의 양을 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescent microplate reader)(Biolumin 960, Molecular Dynamics)를 사용하여 측정하였다. 이때, 자극 파장(excitation wavelength)은 549nm로 하였고 방출 파장(emission wavelength)은 565nm로 하였다. 대조군으로는 L/Mock 세포를 사용하였다.
실험 결과, L/FEX-2 세포에 대한 인지질 리포좀의 부착 정도는 PS 리포좀의 경우 가장 높게 나타났으며, 다른 종류의 인지질 리포좀의 경우에는 대조군과 유사한 정도로만 나타났다(도 7). 또한, L/FEX-2에 의한 인지질 리포좀의 탐식 정도는 PS 리포좀이 다른 인지질 리포좀 및 대조군에 비해 매우 높은 것으로 나타났다(결과 미도시).
<5-4> 여러 종류의 인지질 리포좀에 의한 L/FEX-2 세포에 대한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 억제
상기 실시예 <5-3>에서 제조한 PS 리포좀, PI 리포좀, PG 리포좀, PE 리포좀, PA 리포좀 및 PC 리포좀과 L/FEX-2 세포를 전배양한 후 노화된 적혈구 세포와 배양하여 L/FEX-2 세포에 대한 적혈구의 부착 및 탐식이 억제되는지를 조사하였다. 즉, 상기 실시예 <4-1>과 동일하게 L/FEX-2 세포를 배양하되, PS 리포좀, PI 리포좀, PG 리포좀, PE 리포좀, PA 리포좀 및 PC 리포좀을 각각 100μM씩 첨가하여 37℃로 30분 동안 전배양하였다. 이때, 대조군에는 인지질 리포좀을 첨가하지 않았다. 상기 L/FEX-2 세포에 상기 실시예 <4-2>과 동일한 방법으로 노화된 적혈구를 처리하고 배양하였다. 배양이 완료된 후 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 정도는 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 분석하였다. 상기 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 정도는 대조군을 100%로 하였을 때의 상대적인 값으로 나타냈다.
실험 결과, L/FEX-2 세포를 PS 리포좀과 전배양한 경우에 노화된 적혈구의 부착 및 탐식이 매우 크게 억제됨을 알 수 있었다. 반면, L/FEX-2 세포를 PS 리포좀을 제외한 다른 종류의 리포좀과 함께 전배양한 경우에는 노화된 적혈구의 부착은 거의 억제되지 않았으며 탐식 정도는 대조군에 비해 오히려 약간 증가하는 양상을 나타냈다(도 8).
<5-5> PS 리포좀의 첨가 농도에 따른 L/FEX-2에 대한 노화된 적혈구의 부착 억제
상기 실시예 <5-3>에서 제조한 PS 리포좀의 첨가 농도를 달리하여 L/FEX-2 세포와 전배양한 다음 노화된 적혈구와 배양하여 적혈구의 부착 및 탐식 정도를 조사하였다. 대조군에는 PS 리포좀 대신 PC 리포좀을 첨가하였다. 즉, 상기 실시예 <5-4>와 동일한 방법으로 실험하되 PS 리포좀를 0, 0.1, 1, 10 및 100μM의 농도로 각각 첨가하였다. 배양이 완료된 후 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 L/FEX-2 세포에 대한 노화된 적혈구의 부착 정도를 측정하였다.
실험 결과, L/FEX-2 세포를 PS 리포좀과 함께 전배양한 경우에는 PS 리포좀의 첨가 농도에 의존적으로 L/FEX-2 세포에 대한 노화된 적혈구의 부착이 억제되는 것으로 나타났다. 반면, L/FEX-2 세포를 PC 리포좀과 함께 전배양한 경우에는 L/FEX-2에 대한 노화된 적혈구의 부착에 영향을 주지 않았다(도 9).
상기 실험 결과로부터 FEX-2는 노화된 적혈구의 표면에 발현되는 포스파티딜세린을 특이적으로 인식하여 노화된 세포를 부착하고 탐식함을 알 수 있었다.
<5-6> 포스파티딜세린의 구조적 유도체에 의한 L/FEX-2 세포에 대한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 억제
FEX-2가 PS를 특이적으로 인식하는지 여부를 더욱 확인하기 위하여, 포스파티딜세린의 구조적 유도체(structural analogue)인 포스포-L 세린(phosphor-L-serine, PLS)과 포스포-D-세린(phosphor-D-serine, PDS)을 이용하여 L/FEX-2 세포에 대한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 억제 정도를 조사하였다.
상기 실시예 <5-4>와 동일한 방법으로 실험을 수행하되 인지질 리포좀으로서 PS 리포좀과 포스포-L-세린 및 포스포-D-세린(Sigma)를 각각 사용하였다. 이때, 대조군에는 인지질 리포좀을 첨가하지 않았다. 상기 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 정도는 대조군을 100%로 한 경우에 대해 상대적인 값으로 나타냈다.
실험 결과, L/FEX-2 세포를 PDS와 전배양한 경우에는 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 정도에 큰 영향을 주지 않았다. 반면에, L/FEX-2 세포를 PLS와 전배양한 경우에는 PS 리포좀을 사용한 경우와 유사하게 노화된 적혈구의 부착 및 탐식이 크게 억제되는 것으로 나타났다(도 10).
상기 실험 결과로부터 FEX-2가 음성 전하에 의해 포스파티딜세린을 인식하는 것이 아니라, 포스파티딜세린의 구조를 특이적으로 인식함을 알 수 있었다.
<실시예 6>
FEX-2에 의한 자연사멸세포의 부착 및 탐식
<6-1> 세포의 사멸 유도
세포 표면에서의 포스파티딜세린의 발현은 노화된 세포 뿐 만 아니라 자연사멸세포의 경우에도 대표적인 'eat me' 시그날로서 널리 알려져 있다. 이에 FEX-2가 자연사멸세포의 부착 및 탐식도 매개하는지 여부를 확인하고자, 세포의 사멸을 유도하여 자연사멸세포를 제조하였다.
인간 백혈병 Jurkat T 세포(한국세포주은행) 및 인간 단핵구 백혈병(premyelomonocytic leukemic) U937 세포(한국세포주은행)의 사멸을 유도하였다. 상기 세포는 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. Jurkat T 세포의 세포 사멸 유도는 공지의 방법에 따라 상기 Jurkat T 세포를 항-Fas 항체(CH-11) 100ng/ml가 첨가된 배지에 접종하여 6시간 동안 배양함으로써 세포 사멸을 유도하였다(Oka, K. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:9535-40, 1998). 또한, U937 세포의 세포 사멸 유도는 공지의 방법에 따라 상기 U937 세포를 엑토포사이드(ectoposide) 100ng/ml가 첨가된 배지에 접종하여 4시간 동안 배양함으로써 세포 사멸을 유도하였다(Bave, U., et. al., J Immunol 165:3519-26, 2000). 상기 세포의 사멸 정도는 세포 표면에 발현된 포스파티딜세린의 양을 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 아넥신 V 세포사멸 검출 키트(Santacruz)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석함으로써 측정하였다.
실험 결과, 항-Fas 항체를 처리한 Jurkat T 세포 및 엑토포사이드를 처리한 U937 세포에서 모두 세포 사멸이 유도되었음을 확인할 수 있었다(도 11).
<6-2> L/FEX-2에 의한 자연사멸세포의 탐식
상기 실시예 <6-1>에서 세포사멸을 유도한 Jurkat T 세포와 U937 세포를 상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포와 함께 배양한 다음 탐식 정도를 분석하였다. 상기 L/FEX-2 세포를 6-웰 플레이트에서 완전히 배양한 후 상기 자연사멸세포인 Jurkat T 세포 또는 U937 세포 1ㅧ 106개를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 PBS로 5회 세척하고 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 세포를 디프 퀵 염색용 키트(Diff quick staining kit, IMEM Ins., San Marcos, CA, USA)를 사용하여 염색 한 후 임의로 선택한 5 군데에서 사멸세포를 탐식한 세포의 수를 계수하였다.
실험 결과, 대조군인 L/Mock 세포에서는 사멸이 유도된 Jurkat T 세포가 거의 탐식되지 않았으나(도 12의 a), L/FEX-2 세포의 경우에는 많은 수의 Jurkat T 사멸세포가 탐식되는 것으로 나타났다(도 12의 b). 또한 U937세포를 사용한 실험에서도 유사한 결과를 얻었다(결과 미도시). 상기 L/FEX-2 세포는 세포사멸이 유도되지 않은 Jurkat T 세포 및 U937 세포는 탐식하지 않았다(결과 미도시).
<6-3> PS 리포좀과 FEX-2 단클론 항체에 의한 사멸세포 탐식의 억제
상기 실시예 <6-2>에서 L/FEX-2 세포에 의한 사멸세포의 탐식이 FEX-2가 사 멸세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린을 인식함으로써 일어나는지 여부를 확인하고자 PS 리포좀과 FEX-2 단클론 항체가 L/FEX-2 세포에 의한 사멸세포의 탐식을 억제하는지를 조사하였다.
상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포를 DMEM 배지를 포함하는 6-웰 플레이트에서 완전히 배양한 후 상기 실시예 <2-3>의 FEX-2 단클론 항체(5G3) 100μg/ml, 마우스 면역글로불린(IgG1) 100μg/ml, 실시예 <6-3>의 PS 리포좀 및 PC 리포좀 각각 100μM을 각각 첨가하여 전배양하였다. 여기에 상기 실시예 <6-1>에서 세포 사멸을 유도한 Jurkat T 세포 또는 U937 세포 1×106개를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 완료된 후 PBS로 5회 세척하고 세포를 상기 실시에 <4-1>과 동일한 방법으로 디프 퀵 염색용 키트(Diff quick staining kit, IMEM Ins., San Marcos, CA, USA)를 사용하여 염색한 후 임의로 선택한 5 군데에서 사멸세포를 탐식한 세포의 수를 계수하였다. 상기에서 계수한 탐식한 세포의 수는 L/FEX-2 세포와 사멸세포만을 배양한 경우와 비교하여 탐식 억제 정도를 백분율로 나타냈다.
실험 결과, 포스파티딜세린과 FEX-2 단클론 항체 5G3에 의해 L/FEX-2의 사멸세포 탐식이 거의 완벽하게 억제되었다. 반면에 PC 리포좀과 마우스 면역글로불린에 의해서는 탐식의 억제 정도가 미약한 것으로 나타났다(도 13).
이로부터, FEX-2가 노화된 세포뿐 만 아니라 자연사멸세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린을 인식하여 탐식할 수 있음을 알 수 있었다.
<6-4> FEX-2 단클론 항체의 처리에 따른 L/FEX-2세포로부터 분비되는 항염증성 사이토카인의 분석
상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포를 DMEM 배지를 포함하는 6-웰 플레이트에서 완전히 배양한 후 상기 실시예 <2-3>의 FEX-2 단클론 항체(5G3) 100μg/ml 또는 마우스 면역글로불린(IgG1) 100μg/ml를 각각 첨가하여 배양하였다. 배양이 완료된 후 배지를 회수하여 생성된 TGF-β의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 측정하였다.
실험 결과, 본 발명의 FEX-2 단클론 항체를 첨가한 경우 항염증성 사이토카인인 TGF-β의 생성이 촉진됨을 확인할 수 있었다(도 14).
<실시예 7>
대식세포의 표면에서 발현되는 FEX-2에 의한 자연사멸세포의 탐식
<7-1> 대식세포에서 FEX-2의 발현 여부 조사
자연사멸세포 및 노화된 세포의 탐식에 관여하는 대식세포에서 FEX-2가 발현되는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 먼저, 정상 성인의 자발적 공여자로부터 혈액을 채취하고 상기 혈액에서 단핵세포를 분리한 다음 10% 사람 혈청이 포함된 X-비보 10(Bio Whitaker)에서 7일 정도 배양하여 대식세포로 분화시킨 후 β-글루칸 을 처리하여 활성화시킴으로써 인간 단핵세포에서 유래한 대식세포(human monocyte derived macrophage, HMDM)를 제조하였다. 그 다음 THP-1 인간 단핵세포주(한국세포주은행)에 PMA를 10ng/ml의 농도로 처리하여 72시간 동안 배양함으로써 대식세포로 분화시켰다. 상기 두 종류의 대식세포와 마우스 대식세포주인 P388D1(한국세포주은행)의 세포 표면에 FEX-2가 발현되는지 여부를 상기 실시예 2의 FEX-2 단클론 항체 5G3을 이용하여 유세포 분석기로 분석하였다.
실험 결과, 활성화된 HMDM, THP-1 및 P388D1 대식세포에서 모두 FEX-2가 발현됨을 확인할 수 있었다(도 15).
<7-2> PS 리포좀 및 FEX-2 단클론 항체에 의한 대식세포의 자연사멸세포 탐식 억제
상기 실시예 <7-1>의 세 종류의 대식세포의 자연사멸세포 탐식이 PS 리포좀 및 FEX-2 단클론 항체에 의해 억제되는지 여부를 조사하였다.
먼저, 상기 실시예 <7-1>의 대식세포를 상기 실시예 <5-3>의 PS 리포좀 또는 상기 실시예 <2-3>의 FEX-2 단클론 항체와 30분간 전배양하였다. 여기에 상기 실시예 <6-1>의 세포 사멸이 유도된 Jurkat T 세포 또는 U937 세포를 1×106개씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 대조군으로는 상기 FEX-2 단클론 항체를 대신하여 마우스 면역글로불린(IgG1)을 사용하였다. 대식세포의 탐식 억제 정도는 상기 실시예 <6-3>과 동일한 방법으로 조사하였다.
실험 결과, 활성화된 HMDM, THP-1 및 P388D1은 모두 PS 리포좀과 FEX-2 단클론 항체 5G3에 의해 탐식이 크게 억제된 것으로 나타났다. 반면, 마우스 면역글로불린에 의해서는 거의 억제되지 않은 것으로 나타났다(도 16).
상기 실험 결과로부터, 대식세포의 표면에 발현되는 FEX-2가 자연사멸세포의 포스파티딜세린을 특이적으로 인식하여 대식세포에 의한 자연사멸세포의 부착 및 탐식을 매개함을 확인할 수 있었다.
<7-3> FEX-2 리간드 처리에 따른 대식세포로부터 분비되는 항염증성 사이토카인의 분석
포스파티딜세린 의존성 사멸세포의 탐식은 항염증성 사이토카인인 TGF-β의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인인 TNF-α의 분비는 억제한다고 알려져 있다(Fadok V. A. et al., J. Clin. Invest., 101:890-898, 1998; McDonald P. P. et al., J. Immunol. 163:6164-6172, 2000). 이에 대식세포의 표면에 발현되는 FEX-2에 대한 여러 종류의 리간드를 활성화된 대식세포에 처리하고 상기 리간드에 의한 대식세포의 항염증성 사이토카인 또는 염증성 사이토카인의 분비 정도를 측정하였다. 먼저, 마우스 대식세포주 J774(한국세포주은행)를 LPS(10ng/ml)로 처리하여 자극시킨 후 PS 리포좀 또는 PC 리포좀 100μM, 노화된 적혈구 세포, FEX-2 단클론 항체 5G3 및 마우스 면역글로불린 IgG 100μg/ml 씩을 각각 첨가하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 배지를 회수하여 TGF-β 및 TNF-α의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 측정하였다. 대조군에 는 아무런 처리를 하지 않았다.
실험 결과, LPS만을 처리하여 자극시킨 대식세포에서는 염증성 사이토카인인 TNF-α의 분비가 증가하는 것으로 나타났다. 한편, LPS 처리 후 노화된 적혈구 세포, PS 리포좀 및 FEX-2 단클론 항체 5G3을 처리한 경우에는 대식세포에서 항염증성 사이토카인인 TGF-β의 분비가 촉진되고 염증성 사이토카인인 TNF-α의 분비가 감소되는 것으로 나타났다. 반면에, PC 리포좀 및 마우스 면역글로불린 IgG를 처리한 경우에는 LPS로 자극시킨 대식세포와 거의 동일한 양상을 나타냈다(도 17).
이로부터 대식세포의 표면에 발현되는 FEX-2 단백질에 대한 리간드로서 작용하는 PS 리포좀 및 FEX-2 단클론 항체는 대식세포가 노화된 세포를 탐식하는 경우와 동일한 시그날이 전달되도록 함으로써 대식세포의 항염증 사이토카인의 분비를 촉진하여 염증을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 대식세포의 표면에 발현된 FEX-2에 결합하여 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인의 분비는 억제하여 염증성 질환을 치료할 수 있는 효과가 있다.
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Claims (10)

  1. 항-FEX-2 항체 또는 포스포-L-세린을 유효성분으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FEX-2가 포유동물로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FEX-2가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 FEX-2가 탐식세포의 표면에서 발현되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-FEX-2 항체가 다클론 또는 단클론 항체임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단클론 항체가 하이브리도마(기탁번호 KCTC 10639BP)에 의해 생성되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환이 염증, 염증성 장 질환, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. (a) FEX-2를 세포에 형질전환시키는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 제조된 FEX-2가 형질전환된 세포와 후보물질을 배양하는 단계; 및
    (c)상기 (b)단계의 FEX-2 발현 세포에서 분비되는 항염증성 사이토카인의 생성량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포가 섬유아세포 또는 탐식세포인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법.
  10. 삭제
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