HU215933B

HU215933B - Szintetikus peptidek és ezeket tartalmazó tüdő-felületaktív anyagok

Info

Publication number: HU215933B
Application number: HU9601563A
Authority: HU
Inventors: Hirosi Ohkawa; Eiji Ohtsubo; Tsunetomo Takei
Original assignee: Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 1999-03-29
Also published as: FI962355A0; CN1136813A; SK71496A3; RO118298B1; EP0733645A4; HU9601563D0; PL180020B1; PL314872A1; BG62777B1; KR960706507A; CA2178345A1; WO1995015980A1; NZ277095A; FI962355A; PT733645E; AU1199295A; ES2189825T3; DK0733645T3; CZ162396A3; CN1057099C

Abstract

A találmány tárgyát a következő speciális szekvenciával rendelkezőszintetikűs peptidek képezik: A–Xaa–Prő–Val–Xbb–Xcc–Lys–Arg–W–B, ahől Xaa nincs jelen, vagy jelentése H–Cys vagy H–Ser, Xbb jelentéseHis vagy Asn, Xcc jelentése Leű vagy Ile és W jelentése 12–20 Leűés/vagy Nle maradékból álló hidrőfób peptidrész, mely 1 Trp vagy 2–5Ile, vagy 2–5 Val és Nva aminősavmaradékőt is tartalmazhat, A nincsjelen, vagy jelentéseH–Phe–Gly–Ile–Prő–Cys–, B nincs jelen, vagyjelentése–Gly–Ala–Leű–Leű–OH vagy–Gly–Ala–Leű–Leű–Met–Gly–Leű–OH, valamint a szabad hidrőxil- vagy tiőlcsőpőrtőkőn képzett C14–18zsírsav-észterei. A találmány tárgya tővábbá ezt a szintetikűspeptidet, kőlin-főszfőgliceridet, sav-főszfőlipidet és zsírsav-analógőt tartalmazó tüdő-felületaktív anyag, valamint a szintetikűspeptidek előállítási eljárása is. ŕ

Description

A találmány új szintetikus peptidekre vonatkozik. A találmány közelebbről olyan új szintetikus peptidekre vonatkozik, amelyek lipidkeverékkel elegyíthetők, és nagy felületaktivitással rendelkeznek. A találmány tárgyát képezi ezeknek a szintetikus peptideknek az előállítási eljárása, valamint hatóanyagként ezeket a peptideket tartalmazó tüdő-felületaktív anyagot tartalmazó készítmények is. A készítmények légzőszervi distressz-szindrómák kezelésére alkalmasak.

A légzőszervi distressz-szindróma olyan megbetegedés, ahol a tüdőléghólyagok felületének a felületi aktivitása tüdő-felületaktív anyag hiányában csökkent. Ennek következtében a léghólyagok összeesnek, ez pedig komoly légzőszervi rendellenességeket okoz. Ez a szindróma gyakran lép fel a fejletlen újszülötteknél, és nagy halálozási arányt okoz. Ismert, hogy a tüdő-felületaktív készítmények nagymértékben hatásosak az újszülöttek légzőszervi distressz-szindrómájával szemben.

A felnőttek szintén szenvednek hipoxémiában, ennek különböző okai lehetnek, és nagyon sok esetben a mellkasi röntgenfelvételek szerint csiszoltüveg-szerű árnyék látható a tüdő mindkét felében, és a lélegzésnek lélegeztetőberendezéssel történő szabályozásának ellenére gátolt légzés jelentkezik. Ueda és munkatársai (Hiromoto Yasuda, „Biosurfactants. Chapter 3. Medical Practices Using Surfactants. Section 1. Clinical Applications of Surfactants. V. Aspiration Pneumonia and Surfactants.” 184. oldal, 1990, Science Fórum, Co. Ltd.) két esetben számoltak be felnőtteknél fellépő tüdőgyulladásról (azaz a következő esetekről: 1. nitrátgázbelélegzéses tüdőgyulladás és 2. visszatérő belélegzési tüdőgyulladás, amely agydaganatból származik, és ez okoz hipoxémiát, és vezet az általános egészségi állapot romlásához és légzéselégtelenséghez), amely esetekben lényeges javulásokat értek el, és életeket mentettek meg tüdő-felületaktív anyagnak a légzőrendszerbe történő injektálásával. A műtéti beavatkozásokat követően fellépő légzési rendellenességek felléphetnek szívműtétek után, mivel a műtétek alatt a légzést leállítják. Ilyen légzési hiányosságok esetén szintén beszámoltak a tüdő-felületaktív anyagok hatásságáról (Shuichi Nosaka és munkatársai, Journal of Japanese Medical Society fór Biological Interface, 22. kötet, 66. oldal, 1991).

Tüdő-felületaktív anyagoknak kívülről, a légzőrendszeren keresztül történő adagolásával végzett helyettesítéses terápia számottevő gyógyhatást mutat a légzőrendszeri distressz-szindróma esetén.

A közelmúltban négy apoproteintípust találtak, amelyek emlősök tüdő-felületaktív anyagában jellemző módon jelen vannak. Ezek az A apoprotein és a D apoprotein felületaktív anyagok, amelyek hidrofilek, továbbá a B apoprotein (továbbiakban SP-B jellel jelöljük) és a C apoprotein (a továbbiakban SP-C jellel jelöljük) felületaktív anyagok, amelyek hidrofóbok (Toyoaki Akino és Yoshio Kuroki, Respiration and Circulation, 38. kötet, 18. szám, 722. oldal, 1990; Hiromoto Yasuda és munkatársai, Biosurfactants: Chapter 2. The Biochemistry of Surfactants- Surfactants and Apoproteins, 131. oldal, 1990, Science Fórum, Co. Ltd.; WO 88/03170, illetve JP-A-1 501282).

Az SP-C (1. számú szekvencia) humántüdőből származik, és 35 aminosavból áll, nagymértékben hidrofób apoprotein, amely gazdag valinban és Y-terminális aminosavként fenil-alanint tartalmaz. A szarvasmarhák tüdejéből izolált SP-C (2. számú szekvencia), a sertések tüdejéből izolált SP-C (3. számú szekvencia), a patkányok tüdejéből izolált SP-C stb. 34-35 aminosavakat tartalmaz, és bár az aminosavszekvenciájuk az Y-terminálison különbözik egymástól, rendkívüli mértékben homológok a humán SP-C-vel.

A Hei-3-502095 számú japán közrebocsátási irat szerint az SP-C szerkezetének részét képező, a későbbiekben említett 32 aminosavból álló szekvenciával rendelkező szintetikus peptid (4. számú szekvencia) képezi azt a minimális egységet, amely nagy felületaktivitással rendelkezik, az ilyen peptidek és lipidek keverékei hatásosak a légzőszervi distressz-szindrómával szemben, és a minimális egységet képező peptidnek más, rövidebb aminosavszekvenciával rendelkező szintetikus peptid felületaktivitásával történő összehasonlítása azt mutatja, hogy a felületaktív hatás megszűnése nem egy speciális aminosav hiányának, hanem a peptidlánc hossza csökkenésének a következménye.

A jelen találmány feltalálói azt tapasztalták, hogy az SP—C szerkezetének részét alkotó szerkezettel rendelkező szintetikus peptidnek, melynek aminosav-összetétele eltérő a találmány tárgyát képezőtői, és lipidnek a keverékei (ezeket a továbbiakban TP-C jellel jelöljük) hatásosak a légzőszervi distressz-szindróma kezelésében, ebben a témában a feltalálók szabadalmi bejelentést (WO 93/21225) is tettek.

Szintetikus peptidek előállításánál általánosan elmondható, hogy a peptid aminosavszekvenciájának a meghosszabbodásával gyakrabban keletkeznek kevésbé értékes peptidek, nehezebbé válik az izolálás és a tisztítás, hosszabb idő szükséges azok előállításához, az ipari méretekben történő előállítás nehezebbé válik.

A tüdő-felületaktív készítményeket minőségük minél hosszabb megőrzésének céljából gyakran száraz porkészítményekként állítják elő, amelyeket felhasználás során fiziológiai sóoldatban készített szuszpenzió formájában adagolnak. A tüdő-felületaktív anyagok szuszpendálhatóságának javítása céljából javasolták szuszpendálószereknek, így mannitnak az adagolását (Hei-160451 számú japán közrebocsátási irat) és a liofilizálásnak -1 °C és -10 °C közötti hőmérsékleten történő lefolytatását. Ezek az eljárások azonban bonyolultak, és ezért szükség van ilyen szerek előállításának egyszerűbb módszereire.

Az SP-C-ből lipidkeverékkel előállított tüdő-felületaktív készítmény (a továbbiakban S-35 jellel jelöljük), amely kolin-foszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaz, rendkívül rosszul diszpergálható fiziológiai sóoldatban, és így nehéz belőle egyenletes szuszpenziót előállítani. Ennek oka, hogy a peptid ciszteincsoportjai között diszulfidkötések jönnek létre, amelynek következtében a peptid nagymértékben kohézív lesz, és a tüdő-felületaktív anyag pedig nagy hidrofobicitást mutat.

Mivel a TP-C-nek oldószerekben általában alacsony az oldhatósága, a tüdő-felületaktív készítmények

HU 215 933 Β előállításához trifluor-ecetsavat (TFA) kell használni. Az így előállított TP-C-nél fellép az a probléma, hogy túl hosszú ideig kell lefolytatni a bepárlást és a szárítást ahhoz, hogy a lehetőség szerint legtöbb TFA-t eltávolítsuk, továbbá az a probléma, hogy a tüdő-felületaktív készítmény előállítása során a visszamaradó TFA következtében a tüdő-felületaktív szuszpenzió savas lesz.

A jelen találmány feltalálói tanulmányozták a szintetikus peptideket, és arra az eredményre jutottak, hogy az olyan, a későbbiekben említett aminosavszekvencia, amely az A-terminálison hidrofil peptidrészű speciális szekvenciával és a C-terminálison főként Leu-t és/vagy Nle-t tartalmazó hidrofób peptidrésszel rendelkezik, könnyen izolálható és tisztítható, és ipari méretekben előállítható, emellett hangyasavban, TFA-ban, trifluoretanolban, dimetil-szulfoxidban (DMSO), kloroformban, kloroform/metanol elegyben, metanolban, etilénklór-hidridben és tetrahidrofuránban jól oldódik, és különösen jó az oldhatósága metanolban, összehasonlítva az SP-C és TP-C szintetikus peptidekkel. A jelen találmány feltalálói azt is tapasztalták, hogy a találmány szerinti szintetikus peptidekből és lipidkeverékekből a szokásos, -20 °C hőmérsékleten, vagy ez alatti hőmérsékleten lefolytatott liofilizálási eljárásokkal, szuszpendálószer nélkül előállított tüdő-felületaktív anyagok jó, egyenletes szuszpendálhatósággal rendelkeznek az S-35 vagy szintetikus tüdő-felületaktív anyagokkal (a továbbiakban SF-3 jellel jelöljük; Hei-2-87685 számú japán közrebocsátási irat) szemben, amelyek csak kolinfoszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaznak, vagy olyan anyaghoz viszonyítva (a továbbiakban S-TA jellel jelöljük; Sho-61-9924 számú japán közrebocsátási irat), amely zsírsavat, továbbá foszfolipidet, semleges lipidet, teljes koleszterint, szénhidrátot és kis mennyiségű, az emlősök tüdejében jelen lévő proteint tartalmazó anyagot tartalmaz, és ugyanakkor erős felületaktív hatással rendelkezik, amely azonos az S-35, S-TA, illetve TP-C-t és lipidkeveréket tartalmazó tüdő-felületaktív anyag ilyen hatásával.

A találmány tárgyát képezi szintetikus peptid, amely a következő általános képlettel rendelkezik

A-Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W-B, ahol

Xaa nincs jelen, vagy jelentése Η-Cys vagy H-Ser, Xbb jelentése His vagy Asn,

Xcc jelentése Leu vagy Ile és

W jelentése 12-20 Leu és/vagy Nle maradékból álló hidrofób peptidrész, mely 1 Trp vagy 2-5 Ile, vagy 2-5 Val és Nva aminosavmaradékot is tartalmazhat,

A nincs jelen, vagy jelentése H-Phe-Gly-Ile-Pro-Cys-,

B nincs jelen, vagy jelentése

-Gly-Ala-Leu-Leu-OH vagy —Gly—Alá—Leu-Leu-Met-Gly-Leu-OH, valamint a szabad hidroxil- vagy tiolcsoportokon képzett C|_{4 18} zsírsav-észterei.

A találmány szerinti szintetikus peptid az Xaa- Pro - Val-Xbb-Xcc-Lys- Arg általános képletnek megfelelő speciális szekvenciával rendelkező hidrofil peptidrészt, ahol Xaa nincs jelen, vagy jelentése Cys vagy Ser, Xbb jelentése His vagy Asn, Xcc jelentése Leu vagy Ile, tartalmaz az iV-terminálison, és egy hidrofób peptidrészt tartalmaz, amely főként Leu-ból és/vagy Nle-ből áll a C-terminálison, és ez a szintetikus peptid erős felületaktív hatású lipidkeverékkel történő elegyítés után.

Bár a hidrofób peptidrész hidrofób aminosavakat, így Leu-t, Nle-t, Ile-t, Val-t, Phe-t, Nva-t vagy Trp-t tartalmaz, főként 12 vagy több, előnyösen 12-20 Leu és/vagy Nle molekulát tartalmaz. Annak ellenére, hogy a szintézis könnyű lefolytathatósága szempontjából előnyös, ha a hidrofób peptidrész azonos hidrofób aminosavat tartalmaz, tartalmazhatja a hidrofób peptidrész Leu és Nle molekulák megfelelő szekvenciáját, vagy tartalmazhat 1 Trp, 2-5 Ile vagy 2-5 Val és Nva hidrofób aminosavat szekvenciájában.

A találmány szerinti szintetikus peptidek olyan szintetikus peptideket is magukban foglalnak, ahol az előzőekben említett szintetikus peptid M-terminális és/vagy C-terminális részéhez aminosavat vagy peptidet kapcsolunk. Az A-terminálishoz kapcsolt aminosav lehet Cys vagy Ser. Az A-terminálishoz adagolhatunk H-Phe-Gly-Ile-Pro- szekvenciával rendelkező peptidet is. Az előzőekben említett szintetikus peptidekben jelen lévő tiolcsoport vagy hidroxilcsoport 14-18 szénatomos zsírsavval, előnyösen palmitinsawal acilezhető vagy aceto-amido-metilezhető. A C-terminálishoz adott peptid lehet -Gly-Ala-Leu-Leu-OH vagy -Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-OH szekvenciájú.

A találmány szerinti szintetikus peptidek olyan szintetikus peptideket is magukba foglalnak (kivéve az olyan peptideket, amelyek a természetes SP-C parciális szerkezetét tartalmazzák), amelyek jó hidrofilicitással rendelkező peptidcsoportot tartalmaznak, és amelyek lipidkeverékkel történő elegyítés során jó felületaktív hatással rendelkeznek egy vagy több aminosavnak az adagolása, eltávolítása vagy helyettesítése esetén is.

A találmány szerinti szintetikus peptidek előállíthatók kémiai eljárásokkal.

A találmány szerinti szintetikus peptideket kémiai úton lépésenkénti kondenzációs módszerekkel vagy fragmens kondenzációs módszerekkel állíthatjuk elő, ezek lehetnek folyadék, vagy szilárd fázisú szintéziseljárások, így azidot használó eljárások, sav-kloridot használó eljárások, savanhidridet használó eljárások, vegyes savanhidridet használó eljárások, DCC-eljárások, aktivált észtert használó eljárások (p-nitro-fenol-észtert, phidroxi-szukcinimid-észtert, karbo-imidazolt használó módszerek), oxidációs-redukciós eljárások és DCC-aktiválásos eljárások.

A találmány vonatkozik a találmány szerinti szintetikus peptideknek olyan fragmens kondenzációs eljárással történő előállítására is, ahol intermedierként védett A-terminálissal és védett funkciós oldallánccal rendelkező hidrofil peptidcosportot használunk.

A lépésenkénti kondenzációs módszerrel szemben a fragmens kondenzációs eljárás esetén a cél vegyületek tisztítása könnyebb, ez az eljárás jobban alkalmazható nagy mennyiségben történő előállítás során, és a veszte3

HU 215 933 Β ségek is kisebbek ez utóbbi esetben. A találmány szerinti szintetikus peptidek előállíthatok a hidrofób résznek az előzetesen előállított, védett A-terminálissal és védett funkciós oldallánccal rendelkező hidrofil peptidrésszel folyadékfázisú vagy szilárd fázisú szintéziseljárásban történő kondenzálásával. Az Λ-terminális és a funkciós oldallánc védőcsoportjai nem különösebben korlátozottak, ezek a peptidszintéziseknél használt szokásos védőcsoportok lehetnek. A 9-fluorenil-metil-oxikarbonil-csoport (Fmoc), a 2-klór-benzil-oxi-karbonilcsoport (2-CLZ) és a ícrc-butil-oxi-karbonil-csoport (Boc) védőcsoportként használhatók a terminális aminosavcsoportnál, míg az Fmoc, a Boc és a karbo-benzoxi-csoport (Z) és a tozilcsoport (Tos) a Lys védőcsoportjaként, a Trt, Fmoc, Boc, Dnp, Bőm, Bzl és Tos a His és Mtr, a Pmc, Mts és Tos az Arg védőcsoportjaként használhatók. Ennek megfelelően a találmány szerinti szintetikus peptidek előállításánál intermedierként használható peptidek a következők: Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr), Fmoc-Pro-Val-Asn-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr) és Fmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys(Boc)-Arg(Mtr).

A találmányunk tárgyát képezi gyógyászati készítmény is légzőszervi distressz-szindróma kezelésére, amely hatóanyagként tüdő-felületaktív anyagot tartalmaz, amely az 1. igénypont szerinti szintetikus peptidet, kolinfoszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot, valamint kívánt esetben szokásos segédanyagot tartalmaz.

A tüdő-felületaktív anyagok (a továbbiakban „találmány szerinti felületaktív anyagok” kifejezéssel jelöljük ezeket) előállíthatok a találmány szerinti szintetikus peptidnek kolin-foszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmazó lipideleggyel történő elegyítése útján.

A készítményben a tömegarányokat célszerűen úgy állítjuk be, hogy a végtermék összes száraz tömegére számítva az összetétel a következő legyen: 0,1-5,0 tömeg/tömeg% szintetikus peptid, 50,6-80,5 tömeg/tömeg% kolin-foszfoglicerid, 4,5-37,6 tömeg/tömeg% sav-foszfolipid és 4,6-24,6 tömeg/tömeg% zsírsavanalóg.

A találmány szerinti felületaktív anyagban célszerűen alkalmazható kolin-foszfogliceridek a következők:

1.2- diacil-glicero-(3)-foszfokolinok, így 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-foszfokolin (dipalmitoil-foszfatidil-kolin),

1.2- disztearoil-glicero-(3)-foszfokolin, 1 -palmitoil-2sztearoil-glicero-(3)-foszfokolin és l-sztearoil-2-palmitoil-glicero-(3)-foszfokolin stb.; l-alkil-2-acil-glicero(3)-foszfokolinok, így l-hexadecil-2-palmitoil-glicero(3)-foszfokolin és l-oktadecil-2-palmitoil-glicero-(3)foszfokolin stb.; és l,2-dialkol-glicero-(3)-foszfokolinok, így 1,2-dihexadecil-glicero-(3)-foszfokolin stb. Az előzőekben ismertetett vegyületek a glicerilcsoport második szénatomjának megfelelően optikai izomerekként fordulhatnak elő, a D, L és DL alakok egyaránt alkalmazhatók találmány szerinti felületaktív anyagként. Az előzőekben említett egyetlen kolin-foszfoglicerid-származék mellett kolin-foszfogliceridként két vagy több, acilcsoporttal, előnyösen két telített 12-24 szénatomos acilcsoporttal rendelkező 1,2-diacil-glicero-(3)-foszfokolin, vagy ilyen vegyületeknek és az előzőekben említett egyetlen vegyületnek a keveréke is alkalmazható.

Megfelelő sav-foszfolipidek a következők: 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszforsav (L-a-foszfatidinsav), 1,2diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-L-szerin (foszfatidil-szerin),

1,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerin (foszfatidilglicerin) és l,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-(l)-L-mioinozit (foszfatidil-inozit). A felsorolt vegyületek egyes és kettes helyzete azonos vagy különböző acilcsoporttal lehet helyettesítve. Az acilcsoport előnyösen 12-24 szénatomos.

Megfelelő zsírsavanalógok a szabad zsírsavak alkálifémsói, zsírsavak alkil-észterei, zsírsav-glicerin-észterek és zsírsavamidok, vagy két vagy több ilyen vegyületnek zsíralkoholokkal vagy zsírsav-aminokkal alkotott keveréke.

Leírásunkban a „zsírsavanalóg” kifejezés az előzőekben felsorolt zsíralkoholokat és alifás aminokat foglalja magában.

Szabad zsírsavként mirisztinsav, palmitinsav vagy sztearinsav használható, előnyös a palmitinsav.

A felsorolt szabad zsírsavak nátrium-, kálium-, magnézium- és kalciumsói alkalmazhatók a zsírsavak alkálifémsóiként, előnyös a nátrium-palmitát. Zsírsav-alkilészterként rövid szénláncú 1 -4 szénatomos alkil-észterek alkalmazhatók, előnyös az etil-palmitát. Zsírsav-glicerin-észterként monoglicerin-észterek használhatók, előnyös a monopalmitin.

Zsíralkoholként 14-18 szénatomos alkoholok használhatók, előnyös a hexadecil-alkohol. Alifás aminként 14-18 szénatomos aminok használhatók, előnyös a hexadecil-amin.

Az előzőekben felsorolt kolin-foszfogliceridek, savfoszfolipidek és zsírsavanalógok származhatnak növényekből vagy állatokból, lehetnek félszintetikus termékek, vagy szintetikus termékek, vagy kereskedelmi termékek.

A találmány szerinti felületaktív anyagot előállíthatjuk a találmány szerinti peptid és az előzőekben említett lipidkeverék oldatának csökkentett nyomáson történő szárításával és bepárlásával, majd a visszamaradó anyagnak megfelelő szuszpendálófolyadékban történő szuszpendálásával, majd liofilizálással.

A találmány szerinti peptidoldat előállításához alkalmas oldószerek a hangyasav, a TFA, a trifluor-etanol, a DMSO, a kloroform/metanol elegy, a kloroform, a metanol, az etilén-klór-hidrid és a tetrahidrofurán.

A lipidkeverék oldatához megfelelő oldószer a kloroform és a kloroform/metanol elegy (1:2-5:1 térfogat/térfogat).

A szuszpendálófolyadék lehet víz és víz/etanol elegy (4:1-20:1 térfogat/térfogat), előnyös a víz/etanol elegy. A szuszpendálást 30-60 °C, előnyösen 40—50 °C hőmérsékleten 5-60 percig, előnyösen 15-30 percig folytatjuk le.

Az említett eljárással előállított találmány szerinti felületaktív anyag kis mennyiségű visszamaradó vizet tartalmaz. A felületaktív anyagot előnyösen addig szárítjuk, míg a visszamaradó víz mennyisége 5,0 tömeg/tömeg%, vagy kevesebb az össztömegre számítva.

HU 215 933 Β

Ha a felületaktív anyagot ilyen vízmennyiség eléréséig szárítjuk, a visszamaradó etanol nem mutatható ki abban az esetben, ha viz/etanol elegyét használjuk.

A találmány szerinti felületaktív anyag száraz porkészítményeket egyenletesen szuszpendálhatjuk vagy diszpergálhatjuk megfelelő mennyiségű egyértékű vagy kétértékű fémsót, például 0,9% nátrium-kloridot vagy 1,5 mmol kalcium-kloridot tartalmazó fiziológiai oldatban, vagy ilyen sókat tartalmazó fiziológiai pufferoldatban kézzel, vagy különböző sebességű keverővei, vagy ultrahanggal történő keveréssel.

Az előzőek szerint előállított találmány szerinti felületaktív anyag felületaktivitását, szuszpendálhatóságát és farmakológiai tulajdonságait a következőkben ismertetett módon vizsgáljuk.

1) Felületaktivitás © Felületi tenziót csökkentő hatás

A felületi tenziót csökkentő hatást Tanaka és munkatársai (Journal of Japanese Medical Society fór Biological Interface, 13. kötet, 2. szám, 87. oldal, 1982) szerint vizsgáltuk.

A találmány szerinti felületaktív anyag szuszpenzióját fiziológiai sóoldatban (54,0 cm² felületű) cseppentettük úgy, hogy 1 cm²-nyi felületen 1,0-2,0 pg felületaktív anyag volt. A felületet összenyomtuk, és expandáltuk 54,0-21,6 cm² közötti tartományban 2-5 perc alatt, és a felületi tenziót folyamatosan mértük 37 °C hőmérsékleten Wilhelmy-féle felületaktivitási mérleggel (Kyowa Interface Science Co. Ltd. cég gyártmánya). A maximális felületi tenzió 24,7-34,1 din/cm volt, a minimális felületi tenzió 0,2-8,7 din/cm volt, ami azt jelenti, hogy a találmány szerinti felületaktív anyag felületi tenziót csökkentő hatása révén a fiziológiai sóoldat felületi tenziója csökkent.

Hasonló módon mértük az SF-3 jelű anyag felületi tenziót csökkentő hatását, ennek során maximálisan 26,8-50,3 din/cm és minimálisan 1,0-13,5 din/cm felületitenzió-értékeket kaptunk.

A fiziológiai sóoldat felületi tenziója 37 °C hőmérsékleten 70,5 din/cm.

A találmány szerinti felületaktív anyag szuszpenzióját fiziológiaisóoldat-felületére cseppentettük úgy, hogy 1 cm²-nyi fiziológiaisóoldat/felületen 0,8-1,5 pg felületaktív anyag volt, és mértük a felületi tenziót különböző időpontokban vertikálislemez-módszerrel közvetlenül a szuszpenzió becseppentését követően. A méréseket 37 °C hőmérsékleten végeztük.

Az egyensúlyba hozási idő azt az időt jelenti, amelyre szükség van ahhoz, hogy a felületi tenzió a minta becseppentését követő időponttól számítva egy állandó értéket étjén el, és az ilyen időtartamot követően mért érték az egyensúlyi felületi tenzió.

A találmány szerinti felületaktív anyagok a gáz-folyadék határfelületen rövid, 30-60 másodperc idő után képeztek filmet, és a felületi tenziót 26,7-34,3 din/cm értékre csökkentették.

Hasonló módon vizsgáltuk az SF-3 jelű anyag gázfolyadék határfelületen történő szétoszlathatóságát, és a felületi tenzió ebben az esetben 120 másodperc után 38,1-52,9 din/cm érték volt.

Ez azt jelenti, hogy a találmány szerinti felületaktív anyag gyorsan oszlik szét a gáz-folyadék határfelületen, és gyorsan csökkenti a felületi tenziót.

® Gáz-folyadék határfelületen történő adszorbeálhatóság ml fiziológiai sóoldatban 0,2-1,0 mg találmány szerinti felületaktív anyagot tartalmazó fiziológiaisóoldat-szuszpenziókat készítettünk 37 °C hőmérsékleten, és a találmány szerinti szuszpendált felületaktív anyagnak vizsgáltuk a fiziológiai sóoldat gáz-folyadék határfelületén mért adszorpciós sebességét.

King és munkatársai (American Journal of Physiology, 223. szám, 715. oldal, 1972) szerint mértük az adszorbeálhatóságot.

Eszerint a szuszpenziót 5 cm átmérőjű, fiziológiai sóoldatot tartalmazó teílonedénybe injektáltuk, majd az elegyet mágneses keverővei kevertük. Az adszorbeálhatóságot a keverés leállítása után kapott felületitenzió-eltérésből határoztuk meg.

A találmány szerinti felületaktív anyag a felületi tenziót 28,3-36,8 din/cm értékkel csökkentette a keverés leállítását követő 30-100 másodperccel, és ezt követően a felületi tenzió állandó maradt.

Ez azt jelenti, hogy a szuszpendált formában lévő, találmány szerinti felületaktív anyag 30-100 másodperc alatt a gáz-folyadék határfelületen lebeg, illetve adszorbeálódik, és nagy felületaktivitású filmet képez.

Hasonló módon vizsgálva az SF-3 jelű anyag állandó 42,2-58,3 din/cm értékű felületi tenzióját 150 másodperc, vagy ennél hosszabb idő alatt értük el.

Ez azt jelenti, hogy az SF-3 jelű anyag gáz-folyadék határfelületi adszorpciós hatása gyengébb a találmány szerinti felületaktív anyagok ilyen hatásánál, és hogy a találmány szerinti felületaktív anyagok nagymértékben megnövelik a felületi adszorpciót.

2) Szuszpendálhatóság

A felületaktív anyagok szuszpendálhatósági vizsgálatát a Hei-4—76965 számú japán használati minta közrebocsátási irat szerint végeztük.

Eszerint a szuszpendálhatóságot a szuszpendálási művelet megkezdését követően meghatározott idővel kapott diszpergálhatóságból és a szuszpendálási művelet megkezdését követő 2 perccel kapott maximális diszpergált szemcseméretből számítottuk.

A diszpergálhatósági vizsgálatot a következők szerint végeztük: 60 mg tüdő-felületaktív anyagot 20 ml-es ampullákba vittünk be. Ezután minden ampullába beadagoltunk 2 ml fiziológiai sóoldatot, majd az ampullákat Iwaki KM Shaker-V-S típusú rázóberendezésre (Iwaki Sangyo Co. Ltd. cég terméke) helyeztük, és 270 löket/perc értékkel ráztuk. A minták diszpergálódását vizuálisan nagyítóüveg használatával értékeltük a rázás megkezdését követő 2 percen belül 30 másodpercenként, a rázás megkezdését követő 2 és 4 perc idő között 1 percenként, és a rázás megkezdését követő 4 perc elteltével 10 percenként.

A szuszpendáltságot minden időpontban két személy végezte, és ugyanaz a két személy végezte mind a tíz

HU 215 933 Β minta kiértékelését. A mintákat akkor tekintettük szuszpendáltnak, ha az edényben nem voltak kis mennyiségben összetapadt részecskék jelen, és ha a készítmény a fiziológiai sóoldatban egyenletesen volt diszpergálva, és egyenletes fehér szuszpenziót képezett.

A diszpergálhatóságot mindegyik személy egy meghatározott időpontban határozta meg a minták olyan százalékának a megadásával, amelynél az összes mintánál (10 ampulla) a szuszpenzió kialakulása teljes volt, és ezt az adatot a két személy által meghatározott értékek átlagaként jelöltük.

A maximálisan diszpergált részecskeméretet a következők szerint mértük. 60 mg tüdő-felületaktív anyagot 20 ml-es ampullákba vittünk. Ezután minden ampullába beadagoltunk 2 ml fiziológiai sóoldatot, majd az ampullákat folyamatosan ráztuk 2 percig az előzőekben ismertetett rázási körülmények között. A szuszpenzióban lévő legnagyobb részecskét mikroszkóppal kerestük meg, és körzővel határoztuk meg átmérőjét. Azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti felületaktív anyagok a legtöbb esetben két percen belül szuszpendálódtak, és maximális részecskeméretük 0,8 mm, vagy ennél kisebb volt, ami azt jelenti, hogy szuszpendálhatóságuk jó.

3) Farmakológiai tulajdonságok © Akut toxícítás

A találmány szerinti felületaktív anyagok akut toxicitását 5 hetes hím ICR egereken és patkányokon vizsgáltuk. Az egereknél az orális LD₅₀-, illetve peritoneális LD₅₀-érték 2,4-10,0 g/kg, illetve 1,0-5,0 g/kg volt, a patkányoknál ezek az értékek 1,5-5,0 g/kg és 1,5-2,5 g/kg voltak.

® Szubakut toxicitás

A találmány szerinti felületaktív anyagokat fejlett Wister patkányoknak intraperitoneálisan adagoltuk napi 300-600 mg/kg mennyiségben 1 hónapon át. A patkányok testtömegében nem volt eltérés, és nem volt anomália megfigyelhető szabad szemmel végzett hisztológiai vizsgálat alapján.

® Léghólyag térfogatát megtartó hatás

A fejletlen nyúlmagzatok alig termelnek tüdó-felületaktív anyagot a vemhesség első 27 napjában, és így tüdő-felületaktív anyag hiányos környezetben vannak. Ezeket az állatokat használtuk ezért az újszülötti légzőrendszeri distressz-szindróma vizsgálatára. Öt, a vemhesség 27. napjában lévő nyúlmagzatot használtunk, és különböző légúti nyomás alkalmazásával vizsgáltuk 37 °C hőmérsékleten a léghólyagok térfogatát (ezt a továbbiakban tüdőtérfogatként jelöljük).

A magzatok nyakát felvágtuk, és a légcsőhöz kapcsolt víznanométerrel folyamatos méréseket végeztünk a találmány szerinti felületaktív anyagoknak a légzőrendszerbe történő adagolását követően 5 perctől számítva. A légúti nyomást 30 H₂0cm értékre növeltük kétcsatornás, független vezérlésű 940-es számú fecskendőszivattyúval (Harward Co. cég, USA gyártmánya), így a léghólyagokat megnöveltük. A légúti nyomást ezután 0 H₂0cm értékre csökkentettük, így a léghólyagok összeesését idéztük elő, és eközben különböző H₂O-nyomások mellett mértük a tüdőtérfogatokat. A tüdőtérfogatokat ezután ml/1 kg testtömeg (ml/kg) értékben adtuk meg.

A találmány szerinti felületaktív anyagokat (60 mg/kg) 0,05-0,5 ml fiziológiai sóoldat-szuszpenzió közvetlen injektálásával adagoltuk be a légzőrendszerbe, ezek a szuszpenziók 1,0-6,0 tömeg/térfogat% felületaktív anyagot tartalmaztak.

A tüdőnek a nyomás 5 H₂Ocm-re történő csökkenésekor mért térfogata a visszamaradó működő kapacitást jelenti, és minél nagyobb ez a térfogat, annál hatásosabb a tüdő-felületaktív anyag.

Kontrollként a találmány szerinti felületaktív anyag helyett fiziológiai sóoldatot adagoltunk. A kontrollcsoport fejletlen nyúlmagzatainak a tüdőtérfogata (5 H₂Ocm-nél) 1-5 ml/kg volt, ez azt jelenti, hogy a léghólyagok alig tágultak ki.

A vemhesség 30. napját elért teljes magzatok normális mennyiségű tüdő-felületaktív anyagot tartalmaznak. Ezeknek a tüdőtérfogata (5 H₂Ocm-nél) 35-53 ml/kg, ami azt jelenti, hogy a léghólyagok megfelelő mértékben tágulnak, és normális légzés megy végbe.

SF-3 jelű anyag adagolása esetén a fejletlen magzatok tüdőtérfogata (5 H₂Ocm-nél) 15-25 ml/kg volt, ez a léghólyagok nem megfelelő kitágulását jelenti.

A találmány szerinti felületaktív anyagok adagolása esetén a tüdőtérfogatok (5 H₂Ocm-nél) 39-55 ml/kg értéket értek el, ez azt jelenti, hogy a találmány szerinti felületaktív anyagok a fejletlen magzatok tüdőtérfogatát normál szintre növelik.

Mint már említettük, a találmány szerinti szintetikus peptidek nagymértékben megnövelik a lipidkeverékek felületaktivitását. így előállíthatók a légzőrendszeri distressz-szindrómának a kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények, amelyek felületaktívak, szuszpendálhatók és gyógyhatásúak. Ezek a készítmények a találmány szerinti szintetikus peptideket magukba foglaló felületaktív anyagokból és lipidkeverékből állnak.

A találmány szerinti felületaktív anyagot hatóanyagként tartalmazó készítmények használhatók más olyan betegségek kezelésére is, ahol a tüdő-felületaktív anyagok terápiás hatással rendelkeznek, ilyenek a műtétek utáni légzési rendellenességek, az asztma, a hörghurut, az újszülötti nekrotikus bélhurut, a gyomor- és nyombélfekély, a különböző vírusok által okozott légzőrendszeri megbetegedések, a méhkürt-elzáródás. A készítmények alkalmazhatók a petevezeték-összenövés és a műtéteket követő szervösszenövés megakadályozására, és köptetőszerként.

A légzőrendszeri distressz-szindróma kezelésére a találmány szerinti gyógyászati készítmények 50-1000 mg találmány szerinti felületaktív anyagot tartalmaznak adagonként gyermekek, és 500-5000 mg felületaktív anyagot tartalmaznak adagonként felnőttek kezelésére. Az ilyen adagolási egységeket fiziológiailag elfogadható vízben, fiziológiai sóoldatban vagy pufferben 1,0-10,0 tömeg/térfogat% koncentrációban történő szuszpendálással állítjuk elő. A készítményeket gyakran a légzőrendszeri rendellenesség fellépését követően 72 órán belül injektálással vagy porlasztással adagoljuk a légzőrendszerbe 1-10-szer. A készítmények alkalmazhatók belélegzéssel is, azaz porként, szuszpendálás nélkül. Az adagolási mennyiség, az alkalmazás módja

HU 215 933 Β és gyakorisága a beteg tüneteitől és egyéb kezelésektől függ.

A találmány szerinti készítmény szükséges esetben tartalmazhat gyógyászati segédanyagokat, így stabilizálószert, konzerválószert, izotonizálószert, pufferanyagot, szuszpendálószert, antioxidánst és felületaktív anyagot, vagy pedig más hatóanyagot, így légcsőtágító antiallergiás szert, karcinosztatikus szert, vírusölő, gyulladásgátló és gombaölő szert.

Az adagolási egység lehet folyékony halmazállapotú vagy por. A találmány szerinti gyógyászati készítményeket tölthetjük lezárt tartályokba, így ampullákba, fiolákba, és tárolhatjuk steril készítményekként is.

Találmányunkat a következőkben a példákkal ismertetjük.

1) A peptid előállítása

A következő példákban a szintetizált peptid molekulatömegét atombombázásos tömegspektrográfiás úton (FABMS) mértük. A tömeg analizálására JMS-S102A (JEOL. Ltd. cég gyártmánya) berendezést és ionforrásként céziumágyút (10 KeeV) használtunk.

1. példa

A peptidet (A peptid, 5. számú szekvencia) fenilaceto-amido-metil (PAM) gyantafelületen szilárd fázisú szintézissel szintetizáltuk a „The Peptides” (Gross E. és Meinenhofe J. kiadók, Bárány G. és Merrifield R. szerzők, 2. kötet, 1-284. oldalak, Academic Press, New York, 1980) szerint.

A C-terminális leucin-csoportot íerc-butil-oxikarbonil-leucin (BOC-Leu) csoporttá alakítottuk, és a PAM-gyantához kötöttük oxi-metil-fenil-aceto-amidometil-kötés útján. A C-terminális kötése után a Boc-Leu-PAM gyantát (0,70 mol/g, 0,35 g) a peptidszintetizáló berendezés (990E modell, Beckman Instruments, Inc. cég gyártmánya) reakcióedényébe vittük. Ezután védett aminosavakat adagoltunk be az Y-terminális irányba a gyanta felületére szimmetrikus anhidrideljárással, így teljes mértékben védett peptid-O-gyantát képeztünk. Arginin kondenzálása során kettős kapcsolást végeztünk YY-diciklohexil-karbodiimidet/hidroxi-benzotriazolt használva [Connie és munkatársai, Chem. Bér., 103, 788-798 (1970)].

Minden aminosav Y-terminális aminocsoportját Boc csoporttal védtük, és a funkciós oldalláncokat az aminosawal lefolytatott reakció előtt a következő csoportokkal védtük:

Arg-Tos : tozilcsoport

Lys-2CLZ : 2-klór-benzil-oxi-karbonil-csoport

Cys-4MeBzl : 4-metil-benzil-csoport

His-Tos : tozilcsoport

A vegyületek kondenzációs reakcióját ninhidrin felhasználásával a kaiser-vizsgálattal határoztuk meg. A teljes mértékben védett peptid-O-gyantát (155 mg) 5 percig diklór-metánban duzzasztottuk. Ezután az Y-a-Bocvédőcsoportot 1% (térfogat/térfogat) indolt és 0,1% (térfogat/térfogat) etán-ditiolt tartalmazó TFA-val eltávolítottuk. Ezután a peptidet lehasítottuk a gyantáról a nem védett peptid-O-gyantának vízmentes hidrogén-fluoriddal (HF) (11 ml) történő kezelésével, amelyhez p-krezolt (1 ml), p-tio-krezolt (0,2 g) és DMSO-t (1 ml) adtunk. A kezelést 0 °C hőmérsékleten 60 percig végeztük.

A HF-t és a DMSO-t vákuumban 0 °C hőmérsékleten ledesztilláltuk. Az eltávolított peptidet és a gyantát ezután háromszor hideg dietil-éterrel (15 ml) mostuk, és az eltávolított peptidet négyszer hideg TFA-val (5 ml) történő mosással extraháltuk. Az extrahált folyadékot azonnal szűrtük, és jéghideg vizet (150 ml) adtunk hozzá, így a nyers peptid vált ki. A nyers peptidet ezután 1000 xg értéknél 0 °C hőmérsékleten 30 percig centrifugáltuk, majd a csapadékot kinyertük. A kapott csapadékot dietil-éterrel (15 ml) mostuk. Ezt a mosási eljárást dietil-éterrel, etil-acetáttal és desztillált vízzel megismételtük, így 84 mg A peptidet kaptunk.

A kapott nyers peptidet feloldottuk 50%-os vizes DMSO-oldatban, és ezt fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiásán (HPLC) tisztítottuk μ-Bondaspheres-t és C8-300 oszlopot használva, így a tiszta A peptidet összegyűjtöttük.

Az eluálást 5 percig végeztük, eluálószerként 0,1% TFA-t tartalmazó 50%-os vizes acetonitril-oldattal. Ezután az eluálást 30 percig folytattuk eluálószerként az előbb említett eluálószemek és 0,1% TFA-t tartalmazó 80%-os vizes acetonitril-oldatnak a lineáris koncentrációgradiensét használva.

Az eluátumban lévő peptid jelenlétét 245 nm-en vizsgáltuk (spektrofotométer; Japan Spectroscopic Co. Ltd. cég gyártmánya, 870-UV modell) differenciálrefraktométerrel (Shimadzu Manufacturing Corporation cég gyártmánya, RID-6A modell).

FABS (M+H+); 3837,1 (számított molekulatömeg: 3835,9).

2. példa

A peptidet (B peptid, 6. számú szekvencia) szilárd fázisú eljárást alkalmazva szintetizáltuk multipeptid szilárd fázisú szintézisrendszert, „Kokku-San”-t (márkanév, Kokusan Chemical Works Co. Ltd. cég gyártmánya) használva a „Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach”, E. Atherton és R. C. Sheppard (25-189. oldalak, Oxford University Press, Oxford) és Kenichi Akagi és munkatársai (Chem. Pharm. Bull., 37 (10), 2661-2664. oldalak, 1989) irodalmi helyen leírtak szerint.

Υ-α-9-Fluorenil-metil-oxi-karbonil-leucin-O-gyant át (Fmoc-Leu-O-gyanta) (0,20 mmol/0,5 g), amelyben az Υ-α-9-fluorenil-metil-oxi-kaibonil-leucin (Fmoc-Leu) a 4-(hidroxi-metil)-fenoxi-metil-kopolimer (1% divinilbenzolt tartalmazó sztirol) gyantához van kötve, használtunk kiindulási gyantaként. A gyantát 20 percig duzzasztottuk Y Y-dimetil-formamiddal (DMF), majd négyszer DMF-fel mostuk. Ezután beadagoltunk 20% piperidint DMF-ben, majd a reakcióelegyet a védőcsoportok eltávolítására ráztuk. Ezt a műveletet háromszor megismételtük, így a védőcsoportok eltávolítása teljessé vált. Ezután a kapott anyagot háromszor DMF-fel, háromszor Y-metil-2-pirrolidonnal és háromszor ismét DMF-fel mostuk a gyantában lévő piperidinfelesleg eltávolítására. A piperidin jelenlétét pH-papír alkalmazásával ellenőriztük.

HU 215 933 Β

A kapott elegyhez DMF-et (6 ml), Fmoc-Leu-t (0,5 mmol), A-hidroxi-benzotriazolt (0,5 mmol) és AA’-diizopropil-karbodiimidet (0,5 mmol) adtunk, majd a reakcióelegyet 90 percig ráztuk a kondenzációs reakció lefolytatása céljából. A gyantát ezután négyszer DMF-fel mostuk a feleslegben lévő reagens eltávolítására. A kondenzációs reakciót ninhidrin alkalmazásával a kaiser-vizsgálatban ellenőriztük.

A továbbiakban aminosavakat adtunk lépésenként a gyanta felületére az A-terminális irányba, és így peptidO-gyantát állítottunk elő, amelynek az A-terminális része és funkciós csoportjai teljes mértékben védettek voltak.

Az Arg, Lys, His, Pro és Cys bevitelére szolgáló kondenzációs reakciókat kétszer 120 percig folytattuk le.

Ezután a védett peptid-O-gyantához DMF-ben 20% piridint adtunk az A-terminális Fmoc védőcsoportjának eltávolítására. Ezután a peptid-O-gyantát hatszor DMFfel és hatszor metanollal mostuk, majd csökkentett nyomáson szárítottuk. A kapott szárított peptid-O-gyantához (100 mg) keverés és jéghűtés közben m-krezolt (0,2 ml), 1,2-etán-ditiolt (0,5 ml), tio-anizolt (1,2 ml), TFA-t (7,5 ml) és trimetil-szilil-bromidot (1,4 ml) adtunk. A kapott reakcióelegyet 120 percig kevertük jéghűtés közben a funkciós oldalláncokról a védőcsoportok és a gyantáról a peptid eltávolítására, majd üvegszűrőn (G3) szűrtük. A szűrletet csökkentett nyomáson mintegy 5 ml térfogatra pároltuk be bepárlóberendezésben. A visszamaradó anyaghoz dietil-étert adtunk a peptid kicsapása céljából. A kivált peptidet üvegszűrőn (G3) összegyűjtöttük, ötször dietil-éterrel mostuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk, így 60 mg B peptidet kaptunk.

Minden aminosav A-terminális aminocsoportja Fmoc csoporttal volt védve, a funkciós oldalláncok az aminosavakkal történő reakció előtt a következő védőcsoportokkal voltak védve:

Arg-Mtr : (4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonil-csoport)

Lys-Boc : (terc-butil-oxi-karbonil-csoport)

Cys-Trt : (tritilcsoport)

His-Trt : (tritilcsoport)

A nyers peptidből mintegy 100 mg mennyiséget feloldottunk TFA-ban (1 ml), és ennek négyszeres mennyiségét kitevő mobil fázisú oldószert, azaz TFA/diklór-metán (5:95 térfogat/térfogat) elegyben 10 mmol β-merkapto-etanolt adagoltunk be, így 20 mg/ml koncentrációjú mintaoldatot készítettünk HPLC-vel való tisztítás céljára, ahol Asahipak GS-510 oszlopot (0 7,5x500 mm, márkanév; Asahi Chemical Industry Co. Ltd. cég gyártmánya) használva, így a tiszta B peptidet begyűjtöttük.

Eluálószerként TFA/diklór-metán (5:95 térfogat/térfogat) elegyben 10 mmol β-merkapto-etanolt használtunk, és az eluálást 0,8 ml/perc sebességgel 80 percig végeztük. Az eluátumban lévő peptid jelenlétét 245 nm-nél (spektrofotométer; Japan Spectroscopic Co. Ltd. cég gyártmánya, 870-UV modell) differenciálrefraktométerrel (Shimadzu Corporation RID-6A modell) vizsgáltuk.

FABMS (M+H+); 3017,9 (számított molekulatömeg: 3016,9).

3. példa

A peptidet (C peptid, 7. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 3116,0 (számított molekulatömeg: 3115,1).

4. példa

A peptidet (D peptid, 8. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2663,7 (számított molekulatömeg: 2662,5).

5. példa

A peptidet (E peptid, 9. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2211,2 (számított molekulatömeg: 2209,9).

6. példa

A peptidet (F peptid, 10. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2647,5 (számított molekulatömeg: 2646,4).

7. példa

A peptidet (G peptid, 11. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 3018,1 (számított molekulatömeg: 3016,9).

8. példa

A peptidet (H peptid, 12. számú szekvencia) szilárd fázisú szintézissel szintetizáltuk szilárd fázisú multipeptid szintézisrendszert használva a 2. példában leírtak szerint.

Α-α-9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-norleucin-O'gyantát (Fmoc-Nle—O-gyanta, 0,20 mmol/0,5 g) használtunk kiindulási gyantaként. A gyantát 20 percig DMFfel duzzasztottuk, majd négyszer DMF-fel mostuk. Ezután beadagoltunk DMF-ben 20% piridint, és a reakcióelegyet a védőcsoportok eltávolítására ráztuk. Ezt a műveletet háromszor ismételtük meg a védőcsoportok teljes mértékben történő eltávolítására. Ezután a reakcióelegyet kilencszer DMF-fel mostuk a gyantában lévő felesleges piperidin eltávolítására. A visszamaradó piperidin mennyiségét pH-papírral ellenőriztük.

A reakcióelegyhez ezután DMF-et (6 ml), Fmoc-Nle-t (0,5 mmol), A-hidroxi-benzotriazolt (0,5 mmol) és AA’-diizopropil-karbodiimidet (0,5 mmol) adtunk, és a kapott reakcióelegyet 90 percig ráztuk, így lefolytattuk a kondenzációs reakciót. A gyantát ezután négyszer DMFfel mostuk a feleslegben lévő reagensek eltávolítására. A kondenzációs reakciót a kaiser-vizsgálatban ninhidrinnel ellenőriztük.

Ezután az aminosavakat adagoltuk be lépésenként a gyanta felületére az A-terminális irányban, így peptidO-gyantát állítottunk elő, amelynek A-terminális vége és funkciós csoportjai teljes mértékben védettek.

HU 215 933 Β

A kapott védett peptid-O-gyantához DMF-ben 20% piridint adtunk, így az A-terminális Fmoc védőcsoportját eltávolítottuk. A peptid-O-gyantát ezután hatszor DMFfel és hatszor metanollal mostuk, majd csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított peptid-O-gyantához (100 mg) keverés és jéghűtés közben w-krezolt (0,2 ml),

1,2-etán-ditiolt (0,5 ml), tio-anizolt (1,2 ml), TFA-t (7,5 ml) és trimetil-szilil-bromidot (1,4 ml) adtunk. A kapott reakcióelegyet 120 percig kevertük jéghűtés közben, így a funkciós oldalláncokról a védőcsoportokat és a gyantáról a peptidet eltávolítottuk, majd a reakcióelegyet üvegszűrőn (G3) szűrtük. A szűrletet csökkentett nyomáson mintegy 5 ml térfogatra pároltuk be bepárlóberendezésben. A visszamaradó anyaghoz étert adtunk a peptid kicsapása céljából. A kivált peptidet üvegszűrőn (G3) összegyűjtöttük, ötször dietil-éterrel mostuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk, így 65 mg H peptidet kaptunk.

Minden aminosav A-terminális aminocsoportja Fmoc csoporttal volt védett, a funkciós oldalláncokat az aminosavakkal végbemenő reakció előtt a következő csoportokat védtük:

Arg-Mtr: 4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonilcsoport

Lys-Boc: íerc-butil-oxi-karbonil-csoport

Cys-Trt: tritilcsoport

His-Boc: íerc-butil-oxi-karbonil-csoport

Mintegy 10 mg így kapott peptidet feloldottunk 3,0 ml kloroform/metanol (C/M, 2:1 térfogat/térfogat) elegyben. A mintát ezután Sephadex LH-60 oszlopon (0 2,5 χ 90 cm) tisztítottuk, az oszlopot C/M oldószereleggyel (2:1 térfogat/térfogat) hoztuk egyensúlyba, a tisztítási művelet után a tiszta H peptidet kaptuk.

Az eluátumban lévő peptid jelenlétét 245 nm-nél (spektrofotométer; Japan Spectroscopic Co. Ltd. cég gyártmánya, 870-UV modell) differenciálrefraktométerrel (Shimdazu Corporation cég gyártmánya, RID-6A modell) vizsgáltuk.

FABMS (M+H+); 2663,6 (számított molekulatömeg: 2662,5).

9. példa

A peptidet (I peptid, 13. számú szekvencia) a 8. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2560,4 (számított molekulatömeg: 2559,3).

10. példa

A peptidet (J peptid, 14. számú szekvencia) a 8. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2663,8 (számított molekulatömeg: 2662,5).

11. példa

A peptidet (K peptid, 15. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H⁺); 2663,5 (számított molekulatömeg: 2662,5).

12. példa

A peptidet (L peptid, 16. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2503,6 (számított molekulatömeg: 2502,4).

13. példa

A peptidet (M peptid, 17. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2736,7 (számított molekulatömeg: 2735,5).

14. példa

A peptidet (N peptid, 18. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2640,4 (számított molekulatömeg: 2639,4).

15. példa

A peptidet (O peptid, 19. számú szekvencia) a 8. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2640,3 (számított molekulatömeg: 2639,4).

16. példa

Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)

A cím szerinti peptidet (P peptid) szilárd fázisú módszerrel szintetizáltuk Peptide Synthesizer System 9050 rendszert (Millipore Corp. cég terméke) használva.

Kiindulási gyantaként Α-α-9-fluorenil-metil-karbonilA-a>-4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonil-arginin-O gyantát [Fmoc-Arg(Mtr)-O-gyanta] (0,20 mmol) használtunk, amelyben az Α-α-9-fluorenil-metil-karbonil-A-cú-4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonil-arginin [Fmoc-Arg(Mtr)j a 2-metoxi-4-alkoxi-benzil-alkohol-gyantához (Sasrin gyanta, márkanév, Bachem Co. Ltd. cég terméke) van kötve, és az aminosavakat egymás után adagoltuk a gyantafelület A-terminális irányába a Peptide Synthesizer System 9050 szintézisjegyzőkönyvének megfelelően, így az A-terminálison és a funkciós csoportokon teljes mértékben védett peptid-Ogyantát állítottunk elő.

A kapott, teljes mértékben védett peptid-O-gyantát ezután ötször metanollal mostuk, és a csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított peptid-O-gyantához (330 mg) keverés és jéghűtés közben TFA/diklór-metán oldatot (1:99 térfogat/térfogat) adtunk. A kapott reakcióelegyet jéghűtés közben kevertük 30 percig, majd 90 percig szobahőmérsékleten, így a peptidet eltávolítottuk a gyantáról, a peptid a védőcsoportokat még tartalmazta. A reakcióelegyet ezután üvegszűrőn (G3) szűrtük, és a szűrletet csökkentett nyomáson mintegy 5 ml térfogatra pároltuk be bepárlóberendezésben. A visszamaradó anyaghoz dietil-étert adtunk, így a peptidet kicsaptuk. A kivált peptidet üvegszűrőn (G3) összegyűjtöttük, majd ötször dietil-éterrel mostuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk. így 180 mg P peptidet kaptunk.

Az aminosavak A-terminális aminocsoportjai Fmoc csoporttal voltak védve, a funkciós csoportokat az amino9

HU 215 933 Β savakkal végbemenő reakció előtt a következő csoportokkal védtük:

Arg-Mtr : 4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonilcsoport

Lys-Boc : íerc-butil-oxi-karbonil-csoport

His-Trt : tritilcsoport

A kapott nyers pepiidhez TFA/diklór-metán (1:99 térfogat/térfogat) oldatot adtunk, így 10 mg/ml koncentrációjú mintaoldatot készítettünk, amelyet Asahipak GS-510 oszlopon (0 21,5 χ 500 mm, márkanév: Asahi Chemical Industry Co. Ltd. cég terméke) tisztítottunk, így a tiszta P peptidet összegyűjtöttük.

Eluálószerként TFA/diklór-metán (1:99 térfogat/térfogat) oldatot használva 8,1 ml/perc áramlási sebességgel 120 percig végeztünk eluálást. Az eluátumban lévő peptid jelenlétét 245 nm-nél (spektrofotométer; Japan Spectroscopic Co. Ltd. cég terméke, 870-UV modell) differenciálrefraktométerrel (Simdazu Corporation cég terméke, RJD-6A modell) vizsgáltuk.

FABMS (M+H+); 1405,0 (számított molekulatömeg: 1403,8).

17. példa

H-Nle-(Nle)14-Nle-O-gyantát szintetizáltunk szilárd fázisú multipeptid szintézisrendszerrel a 8. példában leírtak szerint.

Ezt követően a szintetizált H-Nle-(Nle)14—Nle-Ogyantához Fmoc-Arg(Mtr) helyett a P peptidet adtuk. A kapott elegyhez /V-hidroxi-benzotriazolt és N, A'-diizopropil-karbodiimidet adtunk, és a reakcióelegyet 8 órán át ráztuk. A kondenzációs reakciót kétszer folytattuk le. A reakció előrehaladását kaiser-vizsgálatban ninhidrinnel ellenőriztük.

Ezután a 8. példában leírtak szerint a funkciós csoportok védőcsoportjait és a gyantáról a peptidet eltávolítottuk, és ezt HPLC-vel tisztítottuk, így az I peptidet kaptuk (13. számú szekvencia).

FABMS (M+H+); 2560,2 (számított molekulatömeg: 2559,3).

18. példa

Az R peptidet állítottuk elő az E peptid tiolcsoportjának palmitinsavval történő észterezésével Sárin, Virender és Kumar eljárásával (EP 0458167A1 szerint).

FABMS (M+H⁺); 2448,5 (számított molekulatömeg: 2448,3).

1. összehasonlító példa

A peptidet (S peptid, 20. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H+); 2793,8 (számított molekulatömeg: 2792,6).

2. összehasonlító példa

A peptidet (T peptid, 21. számú szekvencia) a 2. példában leírtak szerint állítottuk elő.

FABMS (M+H⁺); 3018,3 (számított molekulatömeg: 3016,9).

A találmány szerinti szintetikus peptidek aminosavanalízise

A találmány szerinti szintetikus peptideket 5% (tömeg/térfogat) fenolt tartalmazó 12 n HC1/TFA oldattal (2:1 térfogat/térfogat) hidrolizáltuk vákuumban, 150 °C hőmérsékleten, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 és 72 óra ideig, majd a hidrolízis termékeit Simadzu Automatic Amino Acid Analysis System (LC-9A) rendszerrel analizáltuk a sav eltávolítását követően. Az M peptid Trp részét 4,2 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal lúgosán hidrolizáltuk 16, 24 és 32 órán át, majd HCl-oldattal semlegesítettük, majd az Amino Acid Analysis Systemmel analizáltuk. Az 1-72 órán át végzett hidrolízisek közül a nagyobb kitermelést mutató aminosavértékekből számított aminosav-összetételek azt mutatják, hogy azok lényegében megfelelnek a kémiai képletekből számított összetételeknek.

Az eredményeket az 1. táblázat mutatja.

HU 215 933 Β ε

s ’cS

Peptid

t-

6*0

CM

©_

1

8*0

rt ©*

c- CM

irt »4

t

1

i

t

1

rt •«4

o

*4 44

f

to o

•4 44

v> tíf

1

o

1

o

rt o

CM

1

00 o

1

© o

1

Φ o

t

o 0*4

t

15, β

1

©

z

c· ▼«4

·<

t

l

f ©

1

I

CM

1

o

WC

rt o

44

©_

(

© ©

t

rt o

in

1

o_

1

•

0

1

CM

a

J

00 o*

1

00

1

© o

1

w4 CM*

>

rt ©

o *4

1

σ> o

1

o

<o S2

rt e*T

«4

1

>-»

R4

rt o

O*

r- ©

-

σ> oó

•

1

rt o

1

U»4

°í o

© ©

1

«0 ©

4«4 ©

t

1

ac

r- o

rt * ©

o •

r- Q

00 4 ©

44 ^4

1

rt o

rt tfí

»

«

1

o

C- θ'

© o

o

44

00 ©

© ©

eo ©

rí

•

t* ©

r- l/í 44

1

Q-

e— ©

1-

CD ©

CM

1

t

eo e?

1

OJ

rt ©

rt* cT

©* 44

«4

•

00 4 o

*4 rí 44

1

© ©

1

a

co ef

© ©

o

© ©

rt cf

1

r- ©

1

«

ü

σ *<*

0» ©

©

1

o 44

I

0O ©

irt a

t

rt o

1

<

1

ca

é» o

*4

β 4 44

CM wT

rt 4 *4

o

P— eí «-4

1

CM »

•

1

-<

*·

©

o 44*

CM rí

1

rt *

rt o“

rt o

rt 2

o

-

CM*

rt ©

1

»

1

<

Amino- sav

5-

£

r> M4 ©

>* •M ©

5

« <

3

5

Φ *-4

£

z

£

Φ s

í

£

( A His-tartalom 1,0, kivéve az N és O peptid esetén, ahol az A_sx mennyisége 1,0.)

HU 215 933 Β

2) A találmány szerinti felületaktív anyagok előállítása

A találmány szerinti felületaktív anyagokat a találmány szerinti peptideknek három lipidkomponenssel, kolin-foszfogliceriddel, savas foszfolipiddel és zsírsavanalóggal történő összekeverésével állítottuk elő.

19. példa

Sterilizált 1,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolint (1350 mg), l,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint (az acilcsoport 14-24 szénatomos; Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke) (450 mg) és mirisztinsavat (200 mg) szobahőmérsékleten feloldottuk kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (1000 ml) és 25 mg A peptidet feloldottunk TFA-ban (1,0 ml). Az oldatokat összekevertük, majd szárítottuk, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradó anyagot viz/etanol elegyben (9:1 térfogat/térfogat) (100 ml) szuszpendáltuk 40 °C hőmérsékleten 15 percen át. A kapott szuszpenziót -50 °C hőmérsékleten fagyasztottuk, majd 36 órán át vákuumban 85-100 higanyp nyomáson szárítottuk, így a felületaktív anyagot (2070 mg) fehér porként kaptuk.

A kapott porban nem volt kimutatható mennyiségű etanol, és a felületaktív anyag össztömegére számítva a komponensek mennyisége a következő volt: 65,2% (tömeg/tömeg), 1,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 21,7% (tömeg/tömeg) l,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfosn-glicerin, 9,7% (tömeg/tömeg) mirisztinsav, 1,2% (tömeg/tömeg) A peptid és 2,2% (tömeg/tömeg) víz.

20. példa l,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolint (300,0 mg),

1.2- diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint (az acilcsoport 14-24 szénatomos; Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke) (100,0 mg) és palmitinsavat (40,0 mg) feloldottunk kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (300 ml), és 10,0 mg B peptidet feloldottunk kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (2,0 ml). Az oldatokat összekevertük, majd szárítottuk, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradó anyagot viz/etanol elegyben (9:1 térfogat/térfogat) (100 ml) szuszpendáltuk 45 °C hőmérsékleten 20 percen át. A kapott szuszpenziót -60 °C hőmérsékleten fagyasztottuk, és vákuumban 40 órán át 60-110 Hgp nyomáson szárítottuk, így 459,1 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot kaptunk.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a felületaktív anyag össztömegére számítva a komponensek mennyisége a következő volt: 65,3% (tömeg/tömeg) 1,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 21,8% (tömeg/tömeg) l,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfosn-glicerin, 8,7% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 2,2% (tömeg/tömeg) B peptid és 2,0% (tömeg/tömeg) víz.

21. példa l,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolint (280,0 mg),

1.2- dilauroil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint (120,0 mg) és palmitinsavat (27,0 mg) feloldottunk kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (150 ml), és 2,8 mg C peptidet feloldottunk kloroform/metanol elegyben (1:2 térfogat/térfogat) (0,5 ml). Az oldatokat összekevertük, majd szárítottuk, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradó anyagokat viz/etanol elegyben (8:2 térfogat/térfogat) (100 ml) szuszpendáltuk 40 °C hőmérsékleten 45 percen át. A kapott szuszpenziót -65 °C hőmérsékleten fagyasztottuk, és 36 órán át vákuumban 50-80 Hgp nyomáson szárítottuk, így 437,6 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot kaptunk.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a felületaktív anyag össztömegére számítva a komponensek mennyisége a következő volt: 64,0% (tömeg/tömeg) l,2-dipalmitoil-glicero-(3)foszfokolin, 27,4% l,2-dilauroil-sn-glicero-(3)-foszfosn-glicerin, 6,2% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 0,6% (tömeg/tömeg) C peptid és 1,8% (tömeg/tömeg) víz.

22. példa

A B peptid helyett a D peptidet és 1,2-diacil-snglicero-(3)-foszfo-sn-glicerin (14-24 szénatomos acilcsoport, Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke) helyett l-palmitoil-2-oleoÍl-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint használva a 21. példában leírtak szerint állítottunk elő 451,9 g mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 66,4% (tömeg/tömeg) l,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 22,1% (tömeg/tömeg) l-palmitoil-2-oleoil-snglicero-(3)-foszfo-sn-glicerin, 8,9% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 2,2% (tömeg/tömeg) D peptid és 0,4% (tömeg/tömeg) víz.

23. példa l,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolint (320,0 mg), l,2-dimirisztoil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint (80,0 mg) és palmitinsavat (60,0 mg) feloldottunk kloroform/metanol elegyben (1:1 térfogat/térfogat) (200 ml), és az E peptidet (14,0 mg) feloldottuk TFA-ban (0,3 ml). Az oldatokat összekevertük, majd szárítottuk, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradó anyagot viz/etanol elegyben (10:1 térfogat/térfogat) (50 ml) szuszpendáltuk 45 °C hőmérsékleten 60 percen át. A kapott szuszpenziót -45 °C hőmérsékleten fagyasztottuk, és vákuumban 24 órán át 50-110 Hgp nyomáson szárítottuk, így 479,2 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot kaptunk.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 66,8% (tömeg/tömeg) l,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 16,7% (tömeg/tömeg) 1,2-dimirisztoil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerin, 12,5% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 2,9% (tömeg/tömeg) E peptid és 1,1% (tömeg/tömeg) víz.

24. példa

A B peptid (10,0 mg) helyett az F peptidet (22,0 mg) és l,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerin (14-24 szénatomos acilcsoport, Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke) helyett 1-2-disztearoil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint használva a 20. példában leír12

HU 215 933 Β tak szerint állítottunk elő 463,9 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 64,7% (tömeg/tömeg) l,2-dipalmitoil-glicero-(3)foszfokolin, 21,6% (tömeg/tömeg) 1,2-disztearoil-snglicero-(3)-foszfo-sn-glicerin, 8,6% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 4,7% (tömeg/tömeg) F peptid és 0,4% (tömeg/tömeg) víz.

25. példa

A B peptid helyett a G peptidet használva állítottunk elő a 20. példában leírtak szerint 454,1 mg fehér, felületaktív port.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 66,1% (tömeg/tömeg), l,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 22,0% (tömeg/tömeg) l,2-acil-sn-glicero-(3)foszfo-sn-glicerin (14-24 szénatomos acilcsoport, Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke), 8,8% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 2,2% (tömeg/tömeg) G peptid és 0,9% (tömeg/tömeg) víz.

26. példa l,2-Dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolint (210 mg), l,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint (14-24 szénatomos acilcsoport, Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke) (90,0 mg) és sztearinsavat (33,0 mg) feloldottunk kloroform/metanol elegyben (3:1 térfogat/térfogat) (100 ml), és a H peptidet (1,9 mg) feloldottuk metanolban (0,5 ml). A kapott oldatokat összekevertük, és szárítottuk, majd csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradó anyagot víz/etanol elegyben (9:1 térfogat/térfogat) (90 ml) szuszpendáltuk 50 °C hőmérsékleten 15 percen át. A kapott szuszpenziót -55 °C hőmérsékleten fagyasztottuk, és 28 órán át vákuumban 100-120 Hgp nyomáson szárítottuk, így 340,2 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot kaptunk.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 61,7% (tömeg/tömeg) l,2-dipalmitoil-glicero-(3)foszfokolin, 26,5% (tömeg/tömeg) 1,2-diacil-snglicero-(3)-foszfo-sn-glicerin, 9,7% (tömeg/tömeg) sztearinsav, 0,5% (tömeg/tömeg) H peptid és 1,6% (tömeg/tömeg) víz.

27. példa l,2-Dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolint (210,0 mg), l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-(3)-foszfo-L-szerint (90,0 mg) és palmitinsavat (33,0 mg) feloldottunk kloroform/metanol elegyben (4:1 térfogat/térfogat) (100 ml), és az I peptidet (11,0 mg) feloldottuk TFA-ban (0,5 ml). A kapott oldatokat összekevertük, majd szárítottuk, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradó anyagot víz/etanol elegyben (9:1 térfogat/térfogat) (110 ml) szuszpendáltuk 45 °C hőmérsékleten 25 percen át. A kapott szuszpenziót -55 °C hőmérsékleten fagyasztottuk, és vákuumban 28 órán át 100-120 Hgp nyomáson szárítottuk, így 348,7 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot kaptunk.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 60,2% (tömeg/tömeg) 1,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 25,8% (tömeg/tömeg) l-palmitoil-2-oleoil-snglicero-(3)-foszfo-L-szerin, 9,5% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 3,2% (tömeg/tömeg) I peptid és 1,3% (tömeg/tömeg) víz.

28. példa

A B peptid helyett a J peptidet használva a 20. példában leírtak szerint állítottunk elő 459,3 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

29. példa

A B peptid helyett a K peptidet használva a 20. példában leírtak szerint állítottunk elő 452,5 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

30. példa

A B peptid helyett az L peptidet használva a 20. példában leírtak szerint állítottunk elő 456,6 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

31. példa

A B peptid helyett az M peptidet használva a 20. példában leírtak szerint állítottunk elő 453,9 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

32. példa

A B peptid helyett az N peptidet használva a 20. példában leírtak szerint állítottunk elő 452,5 mg fehér, porszerű afelületaktív anyagot.

33. példa

A B peptid helyett az O peptidet használva a 20. példában leírtak szerint állítottunk elő 458,1 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

34. példa l,2-Dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolint (30,0 mg) l,2-diacil-sn-glicero-(3)-foszfo-sn-glicerint (14-24 szénatomos acilcsoport, a Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke) (10,0 mg) és palmitinsavat (4,0 mg) feloldottunk kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (30 ml), és 1,0 mg Q peptidet feloldottunk kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (2,0 ml). A kapott oldatokat összekevertük, majd szárítottuk, és csökkentett nyomáson bepároltuk. A visszamaradó anyagot víz/etanol elegyben (9:1 térfogat/térfogat) (10 ml) szuszpendáltuk 45 °C hőmérsékleten 20 percen át. A kapott szuszpenziót -60 °C hőmérsékleten fagyasztottuk, és vákuumban 36 órán át 60-120 Hgp nyomáson szárítottuk, így 45,4 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot kaptunk.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, a komponensek mennyisége a felületaktív

HU 215 933 Β anyag össztömegére számítva a következő volt: 66,1% (tömeg/tömeg) 1,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 22,0% (tömeg/tömeg) l,2-diacil-sn-glicero-(3)foszfo-sn-glicerin, 8,8% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 2,2% (tömeg/tömeg) Q peptid és 0,9% (tömeg/tömeg) víz.

35. példa

A Q peptid helyett az R peptidet használva a 34. példában leírtak szerint állítottunk elő 45,7 mg fehér felületaktív port.

3. összehasonlító példa

B pepiidnek (10,0 mg) kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (2,0 ml) készített oldata helyett az S peptidnek (10,0 mg) TFA-ban (0,3 ml) készített oldatát használva a 21. példában leírtak szerint állítottunk elő 455,2 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 65,9% (tömeg/tömeg) l,2-dipalmitoil-glicero-(3)foszfokolin, 22,0% (tömeg/tömeg) 1,2-acil-sn-glicero(3)-foszfo-sn-glicerin (14-24 szénatomos acilcsoport; Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke), 8,8% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 2,2% (tömeg/tömeg) S peptid és 1,1% (tömeg/tömeg) víz.

4. összehasonlító példa

A B peptidnek (10,0 mg) kloroform/metanol elegyben (2:1 térfogat/térfogat) (2,0 ml) készített oldata helyett a T peptidnek (10,0 mg) TFA-ban (0,3 ml) készített oldatát használva a 21. példában leírtak szerint állítottunk elő 456,0 mg fehér, porszerű felületaktív anyagot.

A kapott por nem tartalmazott kimutatható mennyiségű etanolt, és a komponensek mennyisége a felületaktív anyag össztömegére számítva a következő volt: 65,8% (tömeg/tömeg) l,2-dipalmitoil-glicero-(3)-foszfokolin, 21,9% (tömeg/tömeg) 1,2-acil-sn-glicero-(3)foszfo-sn-glicerin (14-24 szénatomos acilcsoport; Sigma Chemical Co. Ltd. cég terméke), 8,8% (tömeg/tömeg) palmitinsav, 2,2% (tömeg/tömeg) T peptid és 1,3% (tömeg/tömeg) víz.

A 2. táblázatban adjuk meg a találmány szerinti felületaktív anyagok felületaktivitását és léghólyagtérfogatot megtartó hatását.

Mint már említettük, a találmány szerinti új szintetikus polipeptidek könnyen izolálhatok és tisztíthatok, és így ipari méretekben előállíthatok, jó az oldhatóságuk a szokásos oldószerekben és jobban, egyenletesebben szuszpendálhatók, és a szokásos készítményekkel azonos erősségű felületaktivitással rendelkeznek.

A találmány szerinti felületaktív anyag alkalmazható gyógyszerként légzőszervi distressz-szindróma kezelésére. Ez a betegség komoly légzőszervi rendellenességeket okoz.

HU 215 933 Β

2. táblázat

A találmány szerinti felületaktív anyagok felületi aktivitása és léghólyagtérfogatot fenntartó hatása

A példa száma	Felületi aktivitás	Léghólyag térfogatot fenntartó hatás
Felületi tenziot csökkentő hatás	Gaz-folyadék halarfelülelen való szétos zlási képesség	Gáz-folyadék határfelületen történő abszorbeálhatóság
Maxi* műm din/cm	Mini- mum idin/cm	Egyen- súlyba kerülést idd {másod- perc)	Egyensúlyi felületi tenzió din/cm	Egyen- súlyba kerúiési idő (másod- perc)	Egyensúlyi felületi tenzió din/cm	Tüdőter- fogat 5 HjOcm nyomásnál ml/kg
xs> /Új. példa	29,0	0,2	30	27,5	65	30,3	48
példa	24,7	0,5	30	26,7	30	29,2	55
£2). példa	32,6	4,3	60	33,1	SO	34,8	41
zt . példa	26,8	2,5	40	23,5	50	32,3	51
fÁ. példa	33,1	7,3	60	33,5	ICO	34,6	39
zs. 2$. példa	33,7	7,4	60	32,8	100	34,2	39
2? példa	27,2	Μ	60	28,3	40	•29,9	49
Z6 fpf. példa	27,2	8,7	60	27,5	'50	28,3	46
>6. példa	Λ, 1	3,9	60	34,3	95	36,8	40
példa	28,0	0,8	30	27,5	30	29,9	53
Ζ3 példa	31, 5	i,«	50	23,0	80	32,1	47
J34. példa	34, 2	1,2	60	33,1	100	34,5	40
példa	33,7	3,0	30	31,6	60	33,9	44
31 2%. példa	28,7	3,2	30	26,9	50	30,2	51
példa	30,8	2,1	50	29,8	70	31,9	49
példa	30,1	2,5	40	30,4	50	31,7	49
példa	33,4	3,9	60	31,3	90	32,9	45
3. összehasonlító példa	40,1	10,3	90	37,2	ISO	<1,5	28
4. összehasonlító példa	39,0	2,5	95	36,4	150	39,7	29

HU 215 933 Β

1. számú szekvencia

A szekvencia hossza: 35 A szekvencia formája: aminosav

Szekvenciatáblázat

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

phe-Gly-11 e-Pro-Cys-Cys-Pro-Va 1-Hi s-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-I le-Val1 5 10 ¹⁵

-Va1-Va1-Va1-Va1-Va1-Leu-Ile-Va1-Va1-Va1-1 le-Val -Gly-Ala-Leu-Leu20 25 30

-Met-Gly-Leu-ow

2. számú szekvencia Topológia: egyenes szénláncú

A szekvencia hossza: 34 A szekvencia típusa: peptid

A szekvencia formája: aminosav Szekvencia:

H - Leu-11e-Pro-Cys-Cys-Pro-Va1-Asn-I1e-Lys-Arg-Leu-Leu-Ile-Va1-Va115 10 15

- Val-Val-Val-Val-Leu-Leu-Va 1-Va1-Va1-1le-Val-Gly-Ala-Leu-Leu-Met20 25 30

- G l y-Leu-OH

3. számú szekvencia

A szekvencia hossza: 35 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

U- Leu-Arg- 11e-Pro-Cys-Cys-Pro-Va 1- Asn-Leu-Lys-Arg-Leu- Leu-Val-Val15 10 15

-Val-Val-Va1-Val-Val-Leu-Va 1

-Met-Gly-Leu-OH

4. számú szekvencia

A szekvencia hossza: 32

A szekvencia formája: aminosav

Va 1-Val-Va1-11 e-Va1-G1y- Ala-Leu-Leu25 30

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Cys-Cys-Pro-Val-H is-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-I1e-Va1-Va1—Va 1-Va 1 —Valis 10 15

-Val-Leu-I le-Val-Val-Val-Ile-Val-Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly -Leu-His-Ott 20 25 30

HU 215 933 Β

5. számú szekvencia A szekvencia hossza: 35 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: pepiid Szekvencia:

H-Phe-Gly-I le-Pro-Cys-Cys-Pro-Va1-H is-Leu-Lys-Arg-Leu- Leu-Leu-Leu1 5 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-Leu- Gly- A1 a- Leu-Leu20 25 30

-Met- Gly-Leu-öH
35
6. számú szekvencia A szekvencia hossza: 27 A szekvencia formája: aminosav	Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:
H-Cys-Pro-Val- His-Leu-	Lys-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-
1 5	10 15
-Leu- Leu-Leu- Leu- Leu-	-Leu- Leu-Gly-A1 a-Leu-Leu-oH
20	25
7. számú szekvencia A szekvencia hossza: 27 A szekvencia formája: aminosav	Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Cys- Pro-Va 1- H is-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu- Leu-Leu- Leu- Leu-Leu-Leu- Leu 15 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-

20	25
8. számú szekvencia A szekvencia hossza: 23 A szekvencia formája: aminosav	Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Cys-Pro-Va l- His- Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu15 10 15

- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-oh

20
9. számú szekvencia A szekvencia hossza: 19 A szekvencia formája: aminosav	Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Cys-Pro-Va 1-His-Leu- Lys-Arg- Leu-Leu- Leu-Leu - Leu-Leu- Leu-Leu-Leu15 10 15

-Leu-Leu-Leu-ow

HU 215 933 Β

10. számú szekvencia A szekvencia hossza: 23 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H- Ser- Pro-Val-His- Leu-Lys- Arg-Leu-Leu-Leu- Leu-Leu- Leu- Leu-Leu- Leu15 10 15

- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-oh

11. számú szekvencia A szekvencia hossza: 27 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Cys- Pro-Val- His- Leu- Lys-Arg-NIe-N1 e-N1 e-N1 e-N 1 e-N1 e-Nle-Nle-N1 e ¹⁵ 10 15

- Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Gly-Ala-Leu-Leu-OH 20 25

12. számú szekvencia Topológia: egyenes szénláncú

A szekvencia hossza: 23 A szekvencia típusa: peptid

A szekvencia formája: aminosav Szekvencia:

H-Cys-Pro-Val-His-Leu-Lys-Arg-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle 15 10 15

-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-ow

13. számú szekvencia A szekvencia hossza: 22 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Pro-Vat- His- Leu-Lys- Arg-NI e-N 1 e- N1 e-Nl e- NI e- NI e- N1 e-N 1 e-N 1 e- N1 e 15 10 15

-N l e-N 1 e-N 1 e-N le-N le-Nl e-0H

14. számú szekvencia A szekvencia hossza: 23 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Cys-Pro-Val-Hi s-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Nle 15 10 15

- N1 e-N 1 e-N 1 e-N le-Nle-N.le-NI e-oh

HU 215 933 Β

15. számú szekvencia A szekvencia hossza: 23 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia :

H-Cys- Pro- Val- H is-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-I le-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu15 10 15

-11 e- Leu- Leu- Leu-Leu-I le-Leu-OH

16. számú szekvencia Topológia: egyenes szénláncú

A szekvencia hossza: 23 A szekvencia típusa: peptid

A szekvencia formája: aminosav Szekvencia:

U-Cys- Pro-Val-His-Leu-Lys-Arg- Leu-Leu-Leu-Leu-Val-Leu-Nva-Leu-Val¹ 5 10 15

-Leu-Nva-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-on

17. számú szekvencia A szekvencia hossza: 23 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H-Cys-Pro-VaI-H i s-Leu-Lys-Arg- Leu- Leu-Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu 15 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Trp - OH 20

18. számú szekvencia A szekvencia hossza: 23 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

W-Cys-Pro-Va1- Asn-Leu-Lys-Arg- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu

5

- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OH

19. számú szekvencia A szekvencia hossza: 23 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

U-Cys-Pro-Va 1-Asn-I le-Lys-Arg-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nl 15 10 ¹⁵

-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-ow

HU 215 933 Β

20. számú szekvencia A szekvencia hossza: 27 A szekvencia formája: aminosav

Topológia: egyenes szénláncú A szekvencia típusa: peptid Szekvencia:

H- Cys-Pro-Val- Η i s-Leu-Lys-Arg- Va 1-Va 1-Va 1- Va 1- Va 1 - Val-Va 1-Va 1-Va 115 10 15

-Val-Val-Val-Val- Val-Val-Val-Gly-A la-Leu-Leu-oH 20 25

21. számú szekvencia Topológia: egyenes szénláncú

A szekvencia hossza: 27 A szekvencia típusa: peptid

A szekvencia formája: aminosav Szekvencia:

U-Cys-Pro-Val-His-Leu-Lys-Arg-Ile-Ile-Ile-Ile-Ile-I le-I le-I le-I le15 10 15

-I ie-I le-Ile-Ile-Ile-Ile-I le-Gly-Ala-Leu-Leu-oH

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Szintetikus peptid, amely a következő általános képlettel rendelkezik

A-Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W-B, ahol

Xaa nincs jelen, vagy jelentése Η-Cys vagy H-Ser,

Xbb jelentése His vagy Asn,

Xcc jelentése Leu vagy Ile és 35

W jelentése 12-20 Leu és/vagy Nle maradékból álló hidrofób peptidrész, mely 1 Trp vagy 2-5 Ile, vagy 2-5 Val és Nva aminosavmaradékot is tartalmazhat,

A nincs jelen, vagy jelentése H-Phe-Gly-Ile-Pro-Cys-,

B nincs jelen, vagy jelentése

-Gly-Ala-Leu-Leu-OH vagy -Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-OH, valamint a szabad hidroxil- vagy tiolcsoportokon kép- 45 zettC_{14 18} zsírsav-észterei. (Elsőbbsége: 1994. 12.07.)
2. Szintetikus peptid, amely a következő általános képlettel rendelkezik

A-Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W-B, ahol

Xaa nincs jelen, vagy jelentése Η-Cys vagy H-Ser, Xbb jelentése His,

Xcc jelentése Leu és

30 W jelentése 12-20 Leu és/vagy Nle maradékból álló hidrofób peptidrész, mely 1 Trp vagy 2-5 Ile, vagy 2-5 Val és Nva aminosavmaradékot is tartalmazhat,

A nincs jelen, vagy jelentése H-Phe-Gly-Ile-Pro-Cys-,

B nincs jelen, vagy jelentése

-Gly-Ala-Leu-Leu-OH vagy -Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-OH, valamint a szabad hidroxil- vagy tiolcsoportokon kép40 zett C_]4_₁₈ zsírsavészterei. (Elsőbbsége: 1993. 12. 08.)
3. Az 1. igénypont szerinti szintetikus peptid, ahol hidrofób peptidrészt alkotó 12-20 Leu és/vagy Ile maradék, 1 Trp vagy 3 Ile vagy 3 Val és 2 Nva maradékot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 12. 07.)
4. A 2. igénypont szerinti szintetikus peptid, ahol hidrofób peptidrészt alkotó 12-20 Leu és/vagy Nle maradék, 1 Trp, vagy 3 Ile, vagy 3 Val és két Nva maradékot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1993. 12. 08.)
5. A 2. igénypont szerinti szintetikus peptid, amely a

H-Phe-Gly-I le-Pro-Cys-Cys-Pro-Val-Hi s-Leu-Lys-Arg-Leu- Leu-Leu-Leu15 10 15

- Leu-Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-Leu- Leu- Leu- Leu- Leu-Leu- G1 y- A1 a- Leu-Leu20 25 30

-Met- Gly-Leu-ow 35

HU 215 933 Β

Μ-Cys- Pro-Va 1- H i s-Leu- Lys- Arg- Leu- Leu-Leu- Leu- Leu-Leu- Leu-Leu- Leu 15 10 15

-Leu-Leu-Leu- Leu- Leu-Leu- Leu-Cly-Ala-Leu-Leu-OM 20 25

H-Cys- Pro-Va 1- H is-Leu-Lys- Arg-Leu-Leu- Leu-Leu- Leu- Leu- Leu- Leu- Leuj 5 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu- Leu- Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-°H 20 25

H-Cys- Pro-Va 1- Ηi s- Leu-Lys- Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu1 5 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-oh 20

H-Cys- Pro- Va 1- H i s- Leu- Lys-Arg- Leu- Leu- Leu- Leu- Leu- Leu- Leu-Leu-Leu 15 10 15

-Leu-Leu-Leu-oh

H- Ser- Pro-Val-His-Leu-Lys- Arg-Leu-Leu-Leu- Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu15 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-oH

H-Cys- Pro-Va 1- His-Leu-Lys-Arg-Hle-Nle-HIe-Nle-Nle-Nle-Nle-Hle-Nle 15 10 15

-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-üle-Mle-Gly-Ala-Leu-Leu-OH 20 ²⁵

H-Cys-Pro-Val-His-Leu-Lys-Arg-Nle-Nle-NIe-Nle-Nle-NIe-Nle-Hle-Nl 15 10 15

-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-ow

HU 215 933 Β

W-Pro-Val- Hls-Leu-Lys-Arg-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle1 5 10 15

-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-Nle-OH

H-Cys-Pro-Val-Hi s-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu -NI e1 5 10 ¹⁵

-Nle-Nle-NI e-Nle-Nle-N.le-Nle-OH

H-Cys- Pro-Vei- His-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leul 5 10 15

-I le- Leu-Leu- Leu-Leu-I le-Leu-OH 20

H-Cys- Pro-Val- His-Leu- Lys-Arg- Leu- Leu-Leu-Leu-Val-Leu-Nva-Leu-Va 115 10 15

-Leu-Nva-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-ON 20

H-Cys-Pro-Val-His-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Leu-'Leu- Leu-Leu-Leu-Leu-Lfeu1 5 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Trp-OH szekvencia bármelyike, vagy a

H-Cy s- Pro-Val -His- Leu- Lys-Arg- Leu- Leu- Leu- Leu- Leu- Leu- Leu-Leu-Leu15 10 15

- Leu-Leu-Leu·: OH szekvencia 5-palmitoilezett terméke. (Elsőbbsége:
6. Az 1. igénypont szerinti szintetikus peptid,

1993.12.08.) amely a

M-Cys-Pro-Va 1- Asn-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu

15 10 15

-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ow

HU 215 933 Β

U-Cys-Pro-Val-Asn-Ile-Lys-Arg-Nle-Nle-Nle-Nle-Ni e-Nle-Nl e-N le-Nle1 5

-Nle-Nle-NIe-Nle-Nle-Nle-Nle-©W (Elsőbbsége: 1994. 12. 07.)
7. Eljárás a következő általános képlettel rendelkező szintetikus peptid 10

A-Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W-B, ahol

Xaa nincs jelen, vagy jelentése Η-Cys vagy H-Ser,

Xbb jelentése His vagy Asn,

Xcc jelentése Leu vagy He és 15

W jelentése 12-20 Leu és/vagy Nle maradékból álló hidrofób peptidrész, mely 1 Trp vagy 2-5 Ile, vagy 2-5 Val és Nva aminosavmaradékot is tartalmazhat,

A nincs jelen, vagy jelentése 20

H-Phe-Gly-Ile-Pro-Cys-,

B nincs jelen vagy jelentése

-Gly-Ala-Leu-Leu-OH vagy -Gly-Ala-Leu- Leu- Met- Gly-Leu -OH, valamint a szabad hidroxil- vagy tiolcsoportokon 25 képzett Ci4_i₈ zsírsav-észterei, előállítására, azzal jellemezve, hogy szilárd vagy folyadék fázisban a peptidkémiában szokásos módon fragmens kondenzációs vagy lépésenkénti kondenzációs módszert alkalmazunk, és kívánt esetben Ci₄-C₁₈ zsír- 30 sav-észter előállítására a kapott peptidet észterezzük. (Elsőbbsége: 1994.12. 07.)
8. Eljárás a következő általános képlettel rendelkező szintetikus peptid

A-Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W-B, 35 ahol

Xaa nincs jelen, vagy jelentése Η-Cys vagy H-Ser,

Xbb jelentése His,

Xcc jelentése Leu és

W jelentése 12-20 Leu és/vagy Nle maradékból álló 40 hidrofób peptidrész, mely 1 Trp vagy 2-5 Ile, vagy 2-5 Val és Nva aminosavmaradékot is tartalmazhat,

A nincs jelen, vagy jelentése

H-Phe-Gly-Ile-Pro-Cys-, 45

B nincs jelen, vagy jelentése

-Gly-Ala-Leu-Leu-OH vagy -Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-OH, valamint a szabad hidroxil- vagy tiolcsoportokon képzett C,₄ i₈ zsírsav-észterei, 50 előállítására, azzal jellemezve, hogy szilárd vagy folyadékfázisban a peptidkémiában szokásos módon fragmens kondenzációs vagy lépésenkénti kondenzációs módszert alkalmazunk, és kívánt esetben Ci₄-C₎₈ zsírsav-észter előállítására a kapott peptidet észterezzük. (Elsőbbsége: 1993. 12.08.)
9. Gyógyászati készítmény légzószervi distresszszindróma kezelésére, amely hatóanyagként tüdó-felületaktiv anyagként az 1. igénypont szerinti szintetikus peptidet, továbbá kolin-foszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot, valamint kívánt esetben szokásos segédanyagot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 12. 07.)
10. A 9. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely az 1. igénypont szerinti szintetikus peptidet, kolin-foszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 12. 07.)
11. A 9. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely a 3. igénypont szerinti szintetikus peptidet, kolinfoszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 12.07.)
12. A 9. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely a 6. igénypont szerinti szintetikus peptidet, kolinfoszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 12. 07.)
13. Gyógyászati készítmény légzőszervi distresszszindróma kezelésére, amely hatóanyagként tüdő-felületaktív anyagként a 2. igénypont szerinti szintetikus peptidet, továbbá kolin-foszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot, valamint kívánt esetben szokásos segédanyagot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1993.12. 08.)
14. A 13. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely a 2. igénypont szerinti szintetikus peptidet, kolinfoszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1993. 12.08.)
15. A 13. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely a 4. igénypont szerinti szintetikus peptidet, kolinfoszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1993. 12.08.)
16. A 13. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely az 5. igénypont szerinti szintetikus peptidet, kolin-foszfogliceridet, sav-foszfolipidet és zsírsavanalógot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1993. 12.08.)