RO118298B1 - Peptida sintetica, procedeu pentru prepararea acesteia, surfactantul pulmonar si agentul terapeutic continand aceasta peptida - Google Patents

Peptida sintetica, procedeu pentru prepararea acesteia, surfactantul pulmonar si agentul terapeutic continand aceasta peptida Download PDF

Info

Publication number
RO118298B1
RO118298B1 RO96-01163A RO9601163A RO118298B1 RO 118298 B1 RO118298 B1 RO 118298B1 RO 9601163 A RO9601163 A RO 9601163A RO 118298 B1 RO118298 B1 RO 118298B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
peptide
sequence
leu leu
synthetic peptide
val
Prior art date
Application number
RO96-01163A
Other languages
English (en)
Inventor
Tsunetomo Takei
Eiji Ohtsubo
Hirosi Ohkawa
Original Assignee
Tokyo Tanabe Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Tanabe Co filed Critical Tokyo Tanabe Co
Publication of RO118298B1 publication Critical patent/RO118298B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/785—Alveolar surfactant peptides; Pulmonary surfactant peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

Inventia se refera la o peptida sintetica, avand urmatoarea secventa specifica: Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W (in care Xaa este absent sau Lys sau Ler; Xbb reprezinta His sau Asn, Xcc reprezinta Leu sau Ile si W reprezinta o portiune peptidica hidrofila); la un procedeu pentru prepararea peptidei; la surfactantul pulmonar, cuprinzand peptida, si la un agent terapeutic pentru sindromul de jena respiratorie.

Description

Invenția de față se referă la o peptidă sintetică, la un procedeu pentru prepararea acesteia, la un surfactant pulmonar și la un agent terapeutic conținând această peptidă, administrate în tratarea sindromului de jenă respiratorie.
Este cunoscut faptul că sindromul de jenă respiratorie este o boală în care activitatea superficială a suprafeței alveolare este scăzută datorită lipsei unui surfactant pulmonar. Aceasta conduce la colapsul alveolelor și, ca urmare, la dereglări respiratorii severe. Acest sindrom este întâlnit în special la nou-născuții prematuri și prezintă o rată înaltă a mortalității. Se cunoaște faptul că, respectiv, compozițiile de surfactanți pulmonari sunt foarte eficiente împotriva sindromului de jenă respiratorie neonatal. Adulții sunt, de asemenea, afectați de hipoxemie, datorită diferitelor cauze, și există multe exemple în care umbre difuze, de tip sticlă pisată, se observă în ambii plămâni, în fotografiile cu raze X ale pieptului, și are loc insuficiența respiratorie în ciuda controlului respirației cu un respirator. S-au prezentat (Ueda și colab., Hiromoto Yasuda, “Biosurfactants, Chapter 3 Medical Practices Using Surfactants, Section 1, Clinical Applications of Surfactants, V.Aspiration Pneumonia and Surfactants”, p. 184,1990, Science Forum Co. Ltd.) două cazuri de pneumonie la adulți [adică cazurile: 1) pneumonie datorată aspirării de gaz nitros și 2) pneumonie cu aspirație recurentă, datorată unei tumori pe creier, care a cauzat hipoxemie și a condus la deteriorarea stării generale și la insuficiență respiratorie, cazuri în care s-au obținut îmbunătățiri semnificative și au fost salvate vieți prin injectarea de surfactant pulmonar în tractul respirator. Insuficiența respiratorie postoperatorie poate avea loc după operații de inimă, deoarece respirația este oprită în cursul operației. De asemenea, a fost prezentat efectul surfactanților pulmonari asupra unor astfel de insuficiențe respiratorii (Shuichi Nosaka și colb., Journal of Japanese Medical Society for Biological Interface, Vol.22, p.66,1991). Terapia de substituire a administrării de surfactanți pulmonari din exterior și calea tractului respirator prezintă efecte terapeutice semnificative pentru sindromul de jenă respiratorie. Recent au fost găsite 4 tipuri de apoproteine care sunt unice pentru surfactanții pulmonari ai mamiferelor. Acestea sunt apoproteina surfactant A și apoproteina surfactant D, care sunt hidrofile, și apoproteina surfactant B (la care ne vom referi în continuare ca SP-B) și apoproteina surfactant C (la care ne vom referi în continuare ca SP-C), care sunt hidrofobe (Toyoaki Akino și Yoshio Kuroki, Respiration and Circulation, vol.38, nr.18, p.722,1990; Hiromoto Yasuda și colb., Biosurfactants: Chapter 2. The Biochemistry of Surfactants - Surfactants and Apoproteins, p. 131, 1990, Science Forum Co. Ltd.). SP-C (secvența nr. 1) derivată din plămânii umani constă din 35 aminoacizi și este o apoproteina puternic hidrofobă, bogată în valină și având fenil-alanină ca amino-acid N-terminal. SP-C-urile izolate din plămâni bovini (secvența nr. 2), porcini (secvența nr. 3), din plămâni de șobolani etc. constau, de asemenea, din 34 până la 35 aminoacizi și deși secvențele de aminoacizi N-terminale diferă pentru diferite specii, acestea prezintă o mare asemănare cu SP-C umană. în brevetul JP Hei-3-502095 se indică, de asemenea, faptul că peptidă sintetică (secvența nr. 4), cu secvența de 32 aminoacizi menționată mai jos, care este parte din structura SP-C, este unitatea minimă care prezintă o puternică activitate superficială. Faptul că amestecuri ale acestei peptide și lipide sunt eficiente împotriva sindromului de jenă respiratorie și faptul că activitatea superficială a acestei unități minime de peptidă, comparativ cu aceea a altor peptide sintetice cu secvențe mai scurte de aminoacizi, arată că pierderea activității superficiale nu se datorește pierderii unui anumit aminoacid, ci reducerii lungimii lanțului peptidic. Anterior, s-a constatat că amestecuri dintr-o peptidă sintetică (la care ne vom referi ca TP-C), a cărei structură este parte din structura SP-C, și o lipidă sunt eficiente în tratamentul sindromului de jenă respiratorie (Cererea de brevet JP Hei-5-518188).
RO 118298 Β1 în ceea ce privește producerea peptidelor sintetice, se spune în general că pe măsură ce secvența de aminoacizi a peptidei devine lungă, formarea de peptide defectuoase în timpul producției devine frecventă, izolarea și purificarea devin dificile, timpul necesar pro- 50 ducției devine mare, producția de masă devine dificilă etc. De asemenea, din considerații de stabilitate, compozițiile de surfactanți pulmonari sunt adesea furnizate sub formă de compoziții de pudre uscate, pentru a fi administrate ca suspensii fiziologic saline.
Metode ca, de exemplu, adăugarea de agenți de suspensie ca manitol (brevet JP Hei-1-60451) și liofilizarea la o temperatură de înghețare între -1 ° și -10°C au fost pro- 55 puse pentru îmbunătățirea formării de suspensii a surfactantului pulmonar. Totuși, aceste metode sunt complicate și s-a dorit dezvoltarea unor metode mai simple de producere a agenților. Compoziția de surfactant pulmonar (la care ne referim ca S-35), realizată prin amestecarea SP-C cu un amestec de lipide alcătuit dintr-o fosfogliceridă a colinei, o fosfolipidă acidă și un analog de acid gras, are o dispersabilitate extrem de scăzută în serul fizio- 60 logic, făcând dificilă prepararea unei suspensii suficient de uniforme pentru a fi utilizată ca o compoziție. Motivele includ formarea de legături disulfură prin reziduurile de cisteină din peptidă, care fac ca peptidă să fie foarte coezivă, ceea ce conduce la hidrofobicitatea ridicată a surfactantului pulmonar ca atare. întrucât TP-C are solubilitate scăzută în solvenții uzuali, a fost necesară utilizarea acidului trifluoracetic (TFA) pentru a prepara compoziția de 65 surfactant pulmonar. TP-C a prezentat astfel probleme întrucât a necesitat un timp lung de concentrare și uscare pentru a îndepărta cât mai mult TFA și suspensia de surfactant pulmonar a devenit acidă în cursul preparării compoziției de surfactant pulmonar datorită TFA-ului rezidual.
S-au studiat astfel cu atenție peptidele sintetice, luând în considerare cele de mai 70 sus, și s-a ajuns la concluzia că noile peptide sintetice (denumite în continuare “peptide sintetice conform invenției”), care conțin secvența de aminoacizi menționată mai jos cu o parte peptidică hidrofilă a unei secvențe specifice la capătul N-terminal și o parte peptidică hidrofobă constând în principal din Leu și/sau Nle la capătul C-terminal, sunt ușor de izolat și purificat, pot fi produse în cantități mari, sunt ușor solubile în acid formic, TFA, trifluoro- 75 etanol, dimetilsulfoxid (DMSO), cloroform, amestecuri cloroform-metanol, metanol, etilenclorhidrină și tetrahidro-furan și, în special, au o solubilitate semnificativă în metanol, în comparație cu SP-C și TP-C sintetice. S-a constatat, de asemenea, că surfactanții pulmonari preparați din peptidele sintetice conform invenției și amestecurile de lipide prezintă, chiar când au fost produse prin metode de liofilizare normală, efectuate la sau sub -20°C, sau fără 80 adăugarea de agent de suspensie, o formare uniformă a suspensiei comparativ cu S-35 sau cu un surfactant pulmonar sintetic (denumit în continuare “SF-3, brevet JP Hei-2-87685) constând numai dintr-un amestec de lipide alcătuit dintr-o fosfogliceridă a colinei, o fosfolipidă acidă și un analog de acid gras, sau cu o substanță (denumită în continuare “S-TA”, brevet JP Sho-61-9924) conținând, pe lângă un acid gras, o substanță alcătuită dintr-o fos- 85 folipidă, o lipidă neutră, colesterol total, hidrați de carbon și mici cantități de proteine prezente în plămânii mamiferelor, care prezintă o activitate superficială echivalentă cu cea a S-35, S-TA sau a unui surfactant pulmonar constând din TP-C, și un amestec de lipide.
Problema pe care o rezolvă invenția este de a produce o peptidă sintetică, de a furniza un procedeu pentru prepararea peptidei sintetice, un surfactant pulmonar și un agent 90 terapeutic pentru sindromul de jenă respiratorie.
Peptidă sintetică, conform invenției, înlătură dezavantajele menționate mai sus prin aceea că are secvența specifică Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W, în care Xaa poate să lipsească sau să reprezinte Cys sau Ser, Xbb reprezintă His sau Asn, Xcc reprezintă Leu sau lle și W reprezintă o parte peptidică hidrofobă, constând din 12 pănă la 20 resturi Leu 95 și/sau Nle.
RO 118298 Β1
Cei 12...20 aminoacizi hidrofobi care constituie partea peptidică hidrofobă a peptidei sintetice, conțin 1 până la 5 resturi de lle, Val, Nva și/sau Trp.
Peptidă sintetică cu secvența specifică este reprezentată de oricare din secvențele nr. 5...19, sau este un produs S-acetamidometilat al peptidei cu secvența nr. 8 sau un produs S-palmitoilat al peptidei cu secvența nr. 9.
Un alt obiect al prezentei invenții constă într-o peptidă pentru sinteză (intermediară) în care restul N-teminal și catenele laterale funcționale din porțiunea hidrofilă a peptidei reprezentată de secvența specifică Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg în care Xaa este fie absent, fie reprezintă Cys sau Ser, Xbb reprezintă His sau Asn și Xcc reprezintă Leu sau lle, sunt protejate.
Această peptidă este reprezentată de Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr), Fmoc-Pro-Val-Asn-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr) sau Fmoc-Pro-Val-Asn-lle-Lys(Boc)-Arg(Mtr).
De asemenea, invenția mai are ca obiect un procedeu pentru prepararea unei peptide sintetice având caracteristicile de mai sus, prin reacția de condensare a părții peptidice hidrofobe a unei peptide sintetice având caracteristicile de mai sus cu peptidă pentru sinteză având caracteristicile menționate mai sus.
Alt obiect al invenției de față este un surfactant pulmonar care constă dintr-o peptidă sintetică având caracteristicile de mai sus, o fosfogliceridă a colinei, o fosfolipidă acidă și un acid gras.
Un ultim obiect al invenției de față constă într-un agent terapeutic pentru sindromul de jenă respiratorie care conține drept ingredient activ un surfactant pulmonar constând dintr-o peptidă sintetică având caracteristicile de mai sus, o fosfogliceridă a colinei, o fosfolipidă acidă și un acid gras.
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W (Xaa poate să nu fie prezentă sau poate reprezenta Cys sau Ser, Xbb reprezintă His sau Asn, Xcc reprezintă Leu sau lle și W reprezintă partea hidrofobă). Peptidă sintetică, conform invenției, conține o parte peptidică hidrofilă, descrisă prin secvența specifică mai jos, menționată la capătul N-terminal, și o parte peptidică având o parte peptidică hidrofobă constând, în principal, din Leu/NIe la capătul C-terminal și este o peptidă sintetică care prezintă o puternică activitate superficială în combinație cu un amestec de lipide.
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg (Xaa poate să nu fie prezentă sau poate reprezenta Cys sau Ser, Xbb reprezintă His sau Asn și Xcc reprezintă Leu sau lle). Deși partea peptidică hidrofobă este alcătuită din aminoacizi hidrofobi ca Leu, Nle, lle, Val, Phe, Nva și Trp, este, în principal, constituită din 12 sau multe și, de preferință, 12...20 molecule de Leu și/sau Nla. Deși este de preferat în ceea ce privește ușurința sintezei etc., ca această parte peptidică hidrofobă să fie alcătuită din același amino-acid hidrofob, poate fi alcătuită dintr-o secvență adecvată de molecule de Leu și Nle sau poate conține 1 până la 5 molecule de lle, Val, Nva Trp sau alți aminoacizi hidrofobi în secvența sa. Peptidele sintetice, conform invenției, includ, de asemenea, peptide sintetice în care un amino-acid sau o peptidă este adăugată la capătul N-terminal și/sau capătul C-terminal al peptidei sintetice mai sus menționate. Amino-acidul care poate fi adăugat la capătul N-terminal, poate fi Cys sau Ser. Mai mult, o peptidă cu secvența Phe-Gly-lle-Pro poate fi adăugată la capătul N-terminal. Grupa tiol sau grupa hidroxil prezente în peptidă sintetică mai sus menționată pot fi acilate cu un acid gras cu 14 până la 18 atomi de carbon și, de preferință, cu acid palmitic sau pot fi acetamidometilate. Peptidă care trebuie adăugată la capătul C-terminal poate avea secvența Gly-AlaLeu-Leu sau Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu. Mai mult, peptidă sintetică, conform invenției, include, de asemenea, peptide sintetice (cu excepția peptidelor având structura parțială a SP-C naturale) care conțin o grupă peptidică care prezintă o bună proprietate de hidrofilie și care prezintă activitate superficială bună când este combinată cu amestecuri de lipide chiar la adăugarea, îndepărtarea și substituția unuia sau mai multor aminoacizi componenți.
RO 118298 Β1
Peptida sintetică, conform invenției, poate fi produsă prin procedee chimice sau de inginerie genetică, deși procedeele chimice sunt preferate în ceea ce privește izolarea și purificarea. Procedeele chimice de preparare a peptidei sintetice, conform invenției, includ procedee de lungire în etape și procedee de condensare a fragmentelor implicând procedee 150 de sinteză în fază lichidă și în fază solidă ca, procedee cu azidă, cu cloruri acide, cu anhidride acide, cu anhidride acide mixte, cu DCC, cu esteri activați (metoda cu p-nitrofenolester, metoda cu ester de p-hidroxisuccinimidă, metoda cu carboimidazol etc.), procedee de oxido-reducere, și procedee de activare cu DCC.
Invenția de față tratează, de asemenea, un procedeu de condensare a fragmentelor 155 pentru producerea de peptide sintetice, conform invenției, în care o grupă peptidică hidrofilă, protejată la capătul N-terminal, și catenele laterale cu grupe funcționale protejate servesc drept intermediar pentru procedeu. în comparație cu procedeul de lungire în etape, procedeul condensării fragmentelor conduce la o purificare mai ușoară a substanței vizate, este mai adecvată sintezei în cantități mari și se caracterizează prin aceea că pierderile datorate 160 erorilor neașteptate pot fi prevenite. Peptidele sintetice, conform invenției, pot fi produse condensând partea hidrofobă cu partea peptidică hidrofilă, protejată la capătul N-terminal, preparată anterior, și cu catene laterale cu grupe funcționale, protejate printr-o metodă de sinteză în fază lichidă sau fază solidă. Grupele protectoare pentru capătul N-terminal și catenele laterale cu grupe funcționale nu sunt limitate în mod special atâta timp cât protejează 165 grupele care sunt utilizate în sinteza normală de peptide. Grupele 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), 2-clorobenziloxi-carbonil (2-CLZ) sau t-butiloxi-carbonil (Boc) pot fi utilizate ca grupe protectoare pentru grupe amino-acid terminal, Fmoc, Boc sau grupa carbobenzoxi (Z) sau grupa tosil (Tos) pot fi utilizate ca grupe protectoare pentru Lys, Trt, Fmoc, Boc, Dnp, Bom,
Bzl sau Tos pot fi utilizate ca grupe protectoare pentru His și Mtr, Pmc, Mts sau Tos pot fi 170 utilizate ca grupe protectoare pentru Arg. Astfel, peptidele care pot fi utilizate ca intermediari pentru producerea peptidei sintetice, conform invenției, includ Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-LeuLys(Boc)-Arg(Mtr), Fmoc-Pro-Val-Asn-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr) și Fmoc-Pro-Val-Asn-lleLys(Boc)-Arg(Mtr). Surfactantul pulmonar (denumit în continuare “surfactantul conform invenției”) poate fi produs prin combinarea unei peptide sintetice, conform invenției, cu un 175 amestec de lipide constând dintr-o fosfogliceridă a colinei, o fosfolipidă acidă și un analog de acid gras. Este adecvată fixarea rapoartelor compozițiilor astfel, încât rapoartele în greutate ale fiecăruia dintre aceste componente în raport cu greutatea totală uscată a produsului final să fie 0,1...5,0% (gr/gr) pentru peptida sintetică, 50,6...80,5% (gr/gr) pentru fosfogliceridă colinei, 4,5...37,6% (gr/gr) pentru fosfolipidă acidă și 4,6...24,6% (gr/gr) pentru 180 analogul de acid gras. Exemple de fosfogliceride ale colinei care pot fi utilizate în mod adecvat pentru surfactantul conform invenției includ 1,2-diacilglicero-(3)-fosfocoline ca 1,2dipalmitoliglicero-(3)-fosfocolina (dipalmitoil-fosfatidilcolina), 1,2-distearoilglicero-(3)fosfocolina, 1 -palmitoil-2-stearoilglicero-(3)-fosfocolina și 1 -stearoil-2-palmitoilglicero-(3)fosfocolina, etc; 1-alchil-2-acilglicero-(3)-fosfocoline ca 1-hexadecil-2-palmit-oilglicero-(3)- 185 fosfocolina și 1-octadecil-2-palmitoilglicero-(3)-fosfocolina etc; și 1,2-dialchilglicero-(3)fosfocolina ca 1,2-hexadecilglicero-(3)-fosfocolina etc. Deși există izomeri optici datorită celui de al doilea carbon al restului de glicerina pentru compușii de mai sus, oricare dintre formele D-, L- și DL- poate fi utilizată pentru surfactantul conform invenției. în afara fosfogliceridelor de colină menționate mai sus, utilizate ca atare, pot fi utilizate ca fosfogliceride de colină 190 amestecuri alcătuite din două sau mai multe 1,2-diacilglicero-(3)-fosfocoline cu grupe acil, de preferință două grupe acil saturate cu 12 până la 24 atomi de carbon sau amestecuri de astfel de amestecuri și compușii individuali mai sus menționați.
RO 118298 Β1
Exemple de fosfolipide acide adecvate includ acid 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosforic (acid L-a-fosfatidic), 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-L-serină (fosfatidilserina), 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerol (fosfatidilglicerol) și 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-(1 )-L-mio-inositol(fosfatidil inositol). Pozițiile 1 și 2 ale acestor compuși pot fi substituite cu aceeași grupă acil sau cu grupe acil diferite. Aici este de preferat ca grupa acil să aibe între 12 și 24 atomi de carbon. Exemple de analogi de acizi grași adecvați includ acizi grași liberi, săruri de metale alcaline ale acizilor grași, esteri alchilici ai acizilor grași, esteri cu glicerina ai acizilor grași și amide grase și amestecuri alcătuite din doi sau mai mulți din compușii de mai sus și alcooli grași și amine grase. Prezenta specificare “analogi de acizi grași” include alcoolii grași mai sus menționați și aminele alifatice. Acidul miristic, acidul palmitic sau acidul stearic pot fi utilizați ca acid gras liber deși este preferat acidul palmitic. Sărurile de sodiu, sărurile de potasiu, sărurile de magneziu și sărurile de calciu ale acizilor grași liberi mai sus menționați pot fi utilizate ca sare a unui acid gras cu un metal alcalin, de preferință, palmitatul de sodiu. Alchil-esterii inferiori cu 1 până la 4 atomi de carbon pot fi utilizați ca alchil-esteri ai acizilor grași de preferință, palmitatul de etil. Monoglicerin-esterii pot fi utilizați ca glicerin-esteri ai acidului gras, de preferință, monopalmitinul. Alcoolii cu 14 până la 18 atomi de carbon pot fi utilizați ca alcool gras, de preferință, alcoolul hexadecilic. Pot fi utilizate ca amine alifatice amine cu 14 până la 18 atomi de carbon, preferată fiind hexadecil-amina. Fosfoglicerida colinei, fosfolipida acidă și analogul de acid gras mai sus menționate pot fi produși izolați din plante sau animale, produși semi-sintetici sau produși chimici sintetici și, de asemenea, pot fi utilizați și produșii corespunzători, disponibili comercial. Surfactantul conform invenției poate fi obținut prin uscarea și solidificarea sub presiune redusă a unui amestec din soluțiile de peptide conform invenției și a unui amestec de lipide mai sus menționat, apoi suspendarea reziduului astfel obținut într-un lichid de suspensie corespunzător și apoi liofilizarea.
Exemple de solvenți care pot fi utilizați pentru a prepara soluția peptidei conform invenției pot fi acidul formic, TFA, trifluoroetanolul, DMSO, cloroform-metanolul, cloroformul, metanolul, etilen-clorhidrina și tetrahidrofuranul. Exemple de solvenți care pot fi utilizați pentru prepararea soluției de amestec de lipide includ cloroformul și cloroform-metanolul [1:2...5:1 (v/v)]. Exemple de lichid de suspensie includ apa și amestecuri apă-etanol [4:1...20:1 (v/v)] fiind preferate amestecurile apă-etanol. Operația de formare a suspensiei este efectuată timp de 5...60 min și, de preferință, timp de 15...30 min la 3O...6O°C și, preferabil, la 4O...5O°C. Surfactantul conform invenției preparat prin acest procedeu conține în orice caz o mică cantitate de apă reziduală. Totuși, este preferabil ca surfactantul să fie uscat până când raportul de greutate al apei reziduale este 5,0% (gr/gr) sau mai puțin, față de greutatea totală. Dacă surfactantul este uscat până la acest nivel, reziduul etanolic va deveni nedetectabil în cazurile în care sunt utilizate amestecurile apă-etanol. Compozițiile pudre uscate ale surfactantului conform invenției pot fi suspendate și dispersate uniform într-o soluție cu o concentrație fiziologică adecvată a unei sări de metal monovalent sau bivalent, de exemplu 0,9% clorură de sodiu sau 1,5 mM clorură de calciu, sau o soluție tampon fiziologică conținând astfel de săruri, utilizând un amestecător de mână sau un mixer cu viteză variabilă, sau un aparat de generare de unde ultrasonice. Activitatea superficială, proprietatea de a forma suspensie și proprietățile farmacologice ale surfactantului conform invenției, astfel obținut, vor fi descrise în continuare.
(1) Activitatea superficială
1) Efectul de scădere a tensiunii superficiale
Efectele de scădere a tensiunii superficiale au fost măsurate conform metodei lui
Tanaka și colab., (Journal of Japanese Medical Society for Biologica! Interface, voi.13,
Nr.2, p.87,1982). O suspensie a surfactantului conform invenției a fost picurată în ser fiziologic (cu o arie superficială de 54,0 cm2), astfel încât să existe 1,0...2,0 pg din surfactantul
RO 118298 Β1
245 conform invenției per 1 cm2. Aria superficială menționată a fost comprimată și extinsă între 54,0 și 21,6 cm2 în timp de 2 până la 5 min, și tensiunea superficială a fost măsurată continuu la 37°C cu o balanță Wilhelmy ele măsurare a suprafeței (produsă de Kyowa Interface Science Co.Ltd.).Tensiunile superficiale maxime au fost 24,7...34,1 dyne/cm și tensiunile superficiale minime au fost 0,2...8,7 dyne/cm, indicând faptul că efectele de scădere a tensiunii superficiale a surfactanților conform invenției scad tensiunea superficială a serului fiziologic. Măsurători conform aceleiași metode, ale efectului de scădere a tensiunii superficiale a SF-3, au dus la tensiuni superficiale maxime de 26,8...50,3 dyne/cm și la tensiuni superficiale minime de 1,0...13,5 dyne/cm. Tensiunea superficială a serului fiziologic ca atare la 37°C a fost 70,5 dyne/cm.
2) Răspândirea la interfața gaz-lichid
O suspensie a surfactantului conform invenției a fost picurată pe suprafața serului fiziologic astfel, încât să fie 0,8...1,5 pg surfactant per 1 cm2 suprafață de ser fiziologic, și variația în timp a tensiunii superficiale a fost măsurată prin metoda talerului vertical din punctul imediat următor picurării suspensiei. Temperatura de măsurare a fost 37°C. Echilibrarea se referă la timpul necesar ca tensiunea superficială să atingă o valoare fixă din momentul imediat următor picurării probei, și valoarea după un astfel de timp este denumită tensiune superficială de echilibru. Surfactanții conform invenției au format un film la interfața gaz-lichid într-un timp scurt de 30...60 s și au scăzut tensiunea superficială la 26,7...34,3 dyne/cm. Măsurători conform aceleiași metode a efectului de răspândire a SF-3 au arătat că tensiunea superficială a fost de 38,1...52,9 dyne/cm după 120 s. Aceasta a indicat faptul că surfactantul conform invenției s-a răspândit rapid la interfața gaz-lichid și a scăzut rapid tensiunea superficială.
3) Adsorbabilitatea la interfața gaz-lichid
Au fost preparate suspensiile de ser fiziologic conținând o cantitate de 0,2...1 mg surfactant conform invenției, per 1 ml la 37°C, și s-a măsurat viteza de adsorbție a surfactanților conform invenției, în suspensie, la interfața gaz-lichid a serului fiziologic. Adsorbabilitatea a fost măsurată conform metodei lui King et al. {American Joumal of Physiology, Nr.223, p.715, 1972). Suspensia s-a injectat la baza unui recipient de teflon cu diametru de 5 cm conținând ser fiziologic care a fost apoi agitat cu un agitator magnetic. Adsorbabilitatea s-a determinat din variația tensiunii superficiale după oprirea agitării. Surfactantul conform invenției a scăzut tensiunea superficială la o valoare cuprinsă între 28,3 și 36,8 dyne/cm în 30 până la 100 s după oprirea agitării, și tensiunea superficială a rămas constantă. Aceasta indică faptul că surfactanții conform invenției, în suspensie, au plutit și s-au adsorbit la interfața gaz-lichid în 30 până la 100 s, formând un film cu o puternică activitate superficială. Când s-a măsurat în același mod, SF-3 a indicat faptul că tensiuni superficiale constante de
42,2 până la 58,3 dyne/cm s-au atins în 150 s sau mai mult. Aceasta indică faptul că efectul de adsorbiție la interfața gaz-lichid a SF-3 este mai scăzut decât acela al surfactanților conform invenției și că surfactantul conform invenției are o mare capacitate de a promova adsorbția superficială.
(2) Proprietatea de a forma suspensie
Testele de formare a suspensiei, ale surfactantului pulmonar, au fost efectuate în conformitate cu metoda indicată în publicația japoneză de model de utilitate Nr. Hei-4-76965. Proprietatea de a forma suspensie s-a evaluat din eficientele de dispersie la anumiți timpi după pornirea operației de formare a suspensiei, și din dimensiunea particulelor celor mai dispersate la 2 minute după pornirea operației de formare a suspensiei. Testele de eficiență a dispersiei au fost efectuate după cum urmează. O cantitate de 60 mg din fiecare surfactant pulmonar a fost introdusă în flacoane de 20 ml. S-au adăugat apoi 2 ml ser foziologic în fiecare din flacoane, și acestea au fost plasate pe un agitator de tip Iwaki KM Shaker-V-S
250
255
260
265
270
275
280
285
290
RO 118298 Β1 (produs de Iwaki Sangyo Co.Ltd.) și agitate prin scuturare la o viteză de 270 curse/min. Condițiile de dispersare pentru fiecare probă au fost observate vizual cu o lupă la fiecare 30 s în timpul primelor 2 minute după începerea agitării, la fiecare 1 min între 2 și 4 min de la începerea agitării și la fiecare 10 min după 4 min de la începerea agitării. Condițiile de formare a suspensiei au fost evaluate la fiecare timp specificat de 2 persoane, fiecare persoană evaluând câte 10 probe. Probele s-au considerat suspensii când nu au mai existat mase mici în container și când compoziția a fost dispersată uniform în serul fiziologic, pentru a forma o suspensie albă, consistentă. Eficiența dispersiei a fost determinată de fiecare persoană la fiecare timp specificat ca procentaje ale probelor pentru care suspensia a fost completă în raport cu numărul total de probe (10 flacoane) și a fost indicată ca medie a valorilor determinate de cele două persoane. Dimensiunile particulelor cu dispersie maximă au fost măsurate după cum urmează. O cantitate de 60 mg din fiecare surfactant pulmonar a fost introdusă în flacoane de 20 ml. S-au adăugat apoi 2 ml ser foziologic în fiecare din flacoane, și flacoanele au fost agitate continuu timp de 2 min, în aceleași condiții de agitare prin scuturare, menționate mai sus. S-a căutat cea mai mare particulă din suspensie cu un microscop, și diametrul ei a fost determinat prin măsurare cu un șubler. S-a constatat astfel că surfactanții conform invenției au format în majoritate suspensie în 2 min, și că dimensiunea maximă a particulelor a fost de 0,8 mm sau mai puțin, indicând o bună proprietate de a forma suspensie.
(3) Proprietăți farmacologice
1) Toxicitate acută
Toxicitățile acute ale surfactanților conform invenției au fost testate utilizând șoareci ICR masculi în vârstă de 5 săptămâni și șobolani Wister. Dozele letale LD^ orală și LD50 peritoneală pentru șoareci au fost de 2,4...10,0 g/kg și respectiv 1,0...5,0 g/kg, în timp ce, cele pentru șobolani au fost de 1,5...5,0 g/kg și respectiv 1,5...2,5 g/kg.
2) Toxicitate subacută
Surfactanții conform invenției au fost administrați intraperitoneal șobolanilor Wister maturi, în doze zilnice de 300...600 mg/kg, timp de 1 lună. Nu au existat variații în greutatea șobolanilor și nu s-au observat anomalii la observarea histologică cu ochiul liber.
3) Efecte de menținere a volumului alveolar
Fetușii imaturi de iepure aproape nu produc surfactant pulmonar la o perioadă de gestație de 27 zile și suferă o lipsă a surfactantului pulmonar. Aceștia sunt astfel utilizați ca animale model pentru studiul sindromului de jenă respiratorie la nou-născuți. S-au utilizat 5 fetuși de iepure la o perioadă de gestație de 27 zile și s-a măsurat volumul alveolar (denumit în continuare volum pulmonar) sub presiuni de aer variate la 37°C.
S-a tăiat gâtul fetusului și s-au făcut măsurători continue cu un manometru cu apă atașat la trahee de la 5 min după administrarea surfactantului conform invenției pe calea tractului respirator. Presiunea de aer s-a ridicat la 30 cm H2O cu o pompă seringă cu două canale independente nr.940 (produsă de Harvard Co., USA) pentru expandarea alveolelor. Presiunea de aer s-a redus apoi la 0 cm H2O pentru colapsul alveolelor, în timp ce se măsoară volumul plămânilor la mai multe presiuni de H2O. Volumul plămânilor s-a indicat apoi în mililitri per 1 kg greutate (ml/kg). Surfactanții conform invenției (60 mg/kg) s-au administrat prin injectarea directă în tractul respirator a 0,05...0,5 ml suspensie de ser fiziologic cu concentrații de surfactant de 1,0...6,0% (gr/vol). Volumul plămânilor la punctul în care presiunea s-a redus la 5 cm H2O indică capacitatea reziduală funcțională și cu cât acest volum este mai mare, cu atât activitatea surfactantului pulmonar este mai importantă. Ca martor, s-a administrat ser fiziologic în locul surfactantului conform invenției. Volumul pulmonar (la 5 cm H2O) al fetușilor imaturi de iepuri din grupului martor a fost de 1 ...5 ml/kg, indicând faptul că alveolele erau abia expandate. Fetușii la termen normal, la o perioadă de
R0118298 Β1
345 gestație de 30 zile prezintă nivele normale de surfactant pulmonar. Volumul lor pulmonar (la 5 cm H2O) este 35...53 ml/kg, indicând o expandare normală a alveolelor și faptul că respirația poate decurge normal. în cazurile în care s-a administrat SF-3, volumul pulmonar (la 5 cm H2O) al fetușilor imaturi a fost de 15...25 ml/kg, indicând o expandare inadecvată a alveolelor. în cazurile în care s-au administrat surfactanții conform invenției, volumul pulmonar (la 5 cm H2O) a fost de 39...55 ml/kg, indicând faptul că surfactanții conform invenției îmbunătățesc volumul pulmonar al fetușilor imaturi la nivele normale. După cum s-a descris mai sus, peptidele sintetice conform invenției posedă efectul de a mări puternic activitatea superficială a amestecurilor de lipide. Este astfel posibilă prepararea de agenți terapeutici pentru sindromul de jenă respiratorie, care sunt eficace în ceea ce privește activitatea superficială, proprietatea de a forma suspensie și proprietățile farmacologice, din surfactanții conform invenției, alcătuiți din peptidele sintetice, conform invenției, și un amestec de lipide. Compozițiile având ca ingredient activ surfactantul conform invenției pot fi, de asemenea, utilizate în tratamentul altor boli pentru care surfactanții pulmonari prezintă un efect terapeutic incluzând insuficiențe respiratorii postoperatorii, astm, bronșită, anterită necrotică neonatală, ulcere gastrice și duodenale, boli respiratorii cauzate de viruși și obstrucție tubală, și în prevenirea aderenței oviductului și a aderențelor postoperatorii ale organelor, și ca expectorante. Agenții terapeutici pentru sindromul de jenă respiratorie, conform invenției, conțin
50...1000 mg din surfactantul conform invenției per doză pentru utilizarea la copii și 500...5000 mg din surfactant per doză la adulți. Astfel de doze sunt preparate prin formarea de suspensie în apă, ser fiziologic sau soluții tampon, etc care pot fi fiziologic tolerate, la concentrații de 1,0—10,0 (gr/vol). Acestea sunt apoi utilizate prin administrare în timp de 72 h după apariția problemelor respiratorii, prin injectarea sau pulverizarea în tractul respirator 1 până la 10 ori. Compozițiile pot fi, de asemenea, inspirate ca atare, adică sub formă de pudră și fără formarea de suspensie. Dozarea, metoda de utilizare și frecvența pot fi schimbate în mod adecvat conform simptomelor pacientului și tratamentului concurent. Agentul terapeutic, conform invenției, poate conține, după necesitate, adaosuri farmaceutice ca agent de stabilizare, conservant, agent de isotonizare, agent de tamponare, agent de suspensie, agent antioxidare și surfactant sau astfel de medicamente ca bronhodilatatoare, agent antialergic, agent carcinostatic, agent antiviral, agent antiinflamator și agent antifungic. Dozarea poate lua în mod adecvat forma unui lichid sau a unei pudre. Agenții terapeutici conform invenției pot fi introduși în containere sigilate ca flacoane și fiole și păstrate sub formă de compoziții sterile.
Prin aplicarea invenției se obține următorul avantaj: obținerea unor peptide în cantități mari, ușor solubile, surfactanții pulmonari preparați din aceste peptide sintetice se prezintă ca o suspensie uniformă, peptidele prezentând și o activitate superficială mărită.
Se dau în continuare 19 exemple de realizare a invenției.
(1) Prepararea în exemplele descrise mai jos, greutatea moleculară a peptidei sintetizate a fost măsurată printr-o metodă de spectrometrie de masă cu bombardare atomică rapidă (FABMS). Analizorul de masă utilizat a fost un JMS-S102A (JEOL Ltd.) și ca sursă de ioni a fost utilizată o sursă de cesiu (10 KeV).
Exemplul 1. Peptidă (peptidă A) indicată prin secvența nr. 5 a fost sintetizată pe o suprafață de rășină fenilacetamidometil (PAM) printr-o metodă de sinteză în fază solidă conform metodei descrise în “The Peptides” (Ed. Gross E. și Meinenhofe J., autori G. Barany și R. Merrifield, voi. 2, pag. 1-284, Academic Press, New York, 1980).
Reziduul leucină C-terminal a fost transformat în f-butiloxicarbonil-leucină (Boc-Leu) și legat de rășina PAM printr-o legătură oximetilfenilacetamidometil. După legarea capătului C-terminal, rășina Boc-Leu-PAM (0,70 mol/g, 0,35 g) a fost transferată în vasul de reacție
350
355
360
365
370
375
380
385
RO 118298 Β1 a unui sintetizor de proteine (Model 990E, Beckman Instrumente, Inc.). Aminoacizii cărora li s-a aplicat tratamente de protejare s-au adăugat apoi în sensul capătului N-terminal pe suprafața rășinii printr-o metodă a anhidridei simetrice pentru a sintetiza o peptidă-O-rășină complet protejată. Totuși, la condensarea argininei, a fost efectuată o dublă cuplare utilizând Ν,Ν-diciclohexilcarbodi-imidă/hidroxibenzotriazol (Connie și colb., Chem.Ber., 103, 788798,1970). Grupele amino N-terminale ale tuturor aminoacizilor au fost protejate cu grupa
Boc și catenele laterale funcționale au fost protejate cu următoarele grupe înainte de utilizarea aminoacizilor în reacție:
Arg-Tos Lys-2CLZ Cys-4MeBzl His-Tos : (tosil) : (2-clorbenziloxicarbonil) : (4-metilbenzil) : (tosil)
Reacțiile de condensare ale acestora au fost confirmate prin metoda de testare cu ninhidrină (ninhydrin method kaiser test). Rășina-O-peptidă complet protejată (155 mg) a fost gonflată timp de 5 minute în diclormetan. Grupa protectoare Ν-α-Boc a fost îndepărtată apoi cu TFA conținând 1% (v/v) îndoi și 0,1% (v/v) etandiol. Apoi peptidă a fost scindată de pe rășină prin tratarea rășinii-O-peptidei neprotejate cu acid fluorhidric anhidru (HF) (11 ml), căruia i s-au adăugat p-cresol (1 ml), p-tiocresol (0,2 g) și DMSO (1 ml), timp de 60 min la 0°C. Acidul fluorhidric și DMSO au fost distilate sub vid la 0°C. Peptidă îndepărtată și rășina au fost spălate de trei ori cu dietileter rece (15 ml) și peptidă îndepărtată a fost extrasă prin spălare de patru ori cu TFA rece (5 ml). Extractul lichid a fost liofilizat imediat și s-a adăugat apă de la gheață (150 ml) pentru a precipita peptidă brută. Peptidă brută a fost apoi centrifugată la 1000 x g și 0°C timp de 30 min și recuperată ca precipitat. Acest precipitat a fost spălat cu dietil-eter (15 ml). După repetarea acestui proces de spălare utilizând dietileter, acetat de etil și apă distilată, s-au obținut 84 mg peptidă A. Această peptidă brută s-a dizolvat într-o soluție apoasă de DMSO 50% și a fost purificată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță, în fază inversă (HPLC), utilizând μ-Bondaspheres, și o coloană C8-300 pentru a se obține peptidă pură A. Eluarea a fost efectuată timp de 5 min, utilizând o soluție apoasă 50% de acetonitril, conținând 0,1% TFA. Apoi eluarea s-a efectuat timp de 30 min cu un gradient de concentrație liniar, format din eluantul mai sus menționat și o soluție apoasă 80% de acetonitril conținând 0,1% TFA. Prezența peptidei în eluant a fost monitorizată la 245 nm (sprectrofotometru; Japan Spectroscopie Co. Ltd. Model 870-UV) și cu un refractometru diferențial (Shimadzu Manufacturing Corporation Model RID-6A). FABMS (M+H+); 3837,1 (masa moleculară calculată; 3835,9).
Exemplul 2. Peptidă (peptidă B) cu secvența nr. 6 a fost sintetizată printr-o metodă în fază solidă, utilizând sistemul de sinteză în fază solidă a multi-peptidelor “Kokku-San” (nume comercial: Kokusan Chemical works Co. Ltd.), și conform metodelor indicate în “Solid Phase Peptide Synthesis-A Practicai Approach”de E.Atherton și R.C.Sheppard (pag. 25189, Oxford University Press, Oxford) și de Kenichi Akagi et al. (Chem.Pharm.Bull., 37(10), pag. 2661-2664, 1989). Ν-α-9-fluorenilmetiloxicarbonil-leucina-O-rășina (Fmoc-Leu-Orășina) (0,20 mmol/0,5 g), în care Ν-α-9-fluorenilmetiloxicarbonil-leucina (Fmoc-Leu) este legată de un copolimer rășină (stiren 1% divinilbenzen) 4-(hidroximetil)fenoximetil, a fost utilizată ca rășină de bază. Rășina a fost gonflată timp de 20 min cu N,N-dimetilformamidă (DMF) și apoi spălată de patru ori cu DMF. S-au adăugat apoi 20% piperidină în DMF, și amestecul a fost agitat prin scuturare, pentru a se îndepărta grupele protectoare. Această operație a fost repetată de trei ori, pentru îndepărtarea completă a grupelor protectoare, după care a urmat spălarea de trei ori cu DMF, de trei ori cu N-metil-2-pirolidonă și încă o dată cu DMF, pentru a îndepărta excesul de piperidină din rășină. La acest moment, prezența piperidinei a fost verificată utilizând hârtie de pH. S-au adăugat apoi DMF (6 ml),
RO 118298 Β1
Fmoc-Leu (0,5 mmol), N-hidroxibenzotriazol (0,5 mmol) și N,N’-diizopropilcarbodiimidă (0,5 mmol), și amestecul a fost agitat prin scuturare timp de 90 min, pentru a realiza reacția 440 de condensare. Rășina a fost apoi spălată de patru ori cu DMF, pentru a elimina excesul de reactivi. Această reacție de condensare a fost testată cu metoda de testare cu ninhidrină (ninhydrin method kaiser test). Schema de sinteză a fost urmărită astfel și s-au adăugat etapă cu etapă aminoacizi din direcția N-terminală pe suprafața rășinii pentru a forma o rășină O-peptidă cu capătul N-terminal și grupe funcționale total protejate. Reacțiile de con- 445 densare pentru introducerea Arg, Lys, His, Pro și Cys au fost efectuate de două ori timp de 120 min fiecare. Apoi s-a adăugat 20% piridină în DMF rășinii-O-peptidei protejate pentru a îndepărta grupa protectoare Fmoc de la capătul N-terminal. Rășina-O-peptidă a fost apoi spălată de șase ori cu DMF și de șase ori cu metanol și uscată sub presiune redusă. S-au adăugat apoi m-cresol (0,2 ml), 1,2-etandiol (0,5 ml), tioanisol (1,2 ml), TFA (7,5 ml) și bro- 450 mura de trimetilsilil (1,4 ml) rășinii-O-peptidei (100 mg) sub agitare și răcire cu gheață. Amestecul s-a agitat apoi timp de 120 min în timp ce a fost răcit cu gheață, pentru a îndepărta grupele protectoare de la catenele funcționale laterale și a îndepărta peptidă din rășină, filtrată apoi printr-o frită (G3). Filtratul a fost apoi concentrat sub presiune redusă la aproximativ 5 ml, cu un evaporator. S-a adăugat apoi dietil-eter pentru a precipita peptidă. 455 Acest precipitat de peptidă a fost colectat pe o frită (G3), spălat de cinci ori cu dietil-eter și, după uscarea sub presiune redusă, s-au obținut 60 mg peptidă B.
Grupele amino N-terminale ale tuturor aminoacizilor au fost protejate cu grupa Fmoc și catenele laterale funcționale au fost protejate cu următoarele grupe înainte de utilizarea aminoacizilor în reacție: 460
Arg-Mtr : (4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil)
Lys-Boc : (t-butiloxicarbonil)
Cys-Trt : (tritil)
His-Trt : (tritil)
Aproximativ 100 mg din peptidă brută au fost dizolvate în TFA (1 ml) și s-a adăugat 465 de patru ori această cantitate de solvent ca fază mobilă, de exemplu 10 mM β-mercaptoetanol în TFA diclormetan (5:95, v/v), pentru a prepara o probă soluție de concentrație 20 mg/ml pentru purificare prin HPLC utilizând o coloană Asahipak GS-510 (φ 7,5 x 500 mm) (nume comercial: Asahi Chemical Industry Co.Ltd.) pentru a colecta astfel peptidă pură B. Ca eluant s-a utilizat β-mercaptoetanol 10 mM în TFA diclormetan (5:95, v/v) și eluarea a avut loc 470 la un debit de 0,8 ml/min timp de 80 min. Prezența peptidei în eluant a fost monitorizată la 245 nm (sprectrofotometru; Japan Spectroscopie Co. Ltd. Model 870-UV) și cu un refractometru diferențial (Shimadzu Corporation Model RID-6A).
FABMS (M+H+); 3017,9 (masa moleculară calculată; 3016,9).
Exemplul 3. Peptidă (peptidă C) cu secvența nr. 7 a fost preparată în același mod 475 ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 3116,0 (masa moleculară calculată; 3115,1).
Exemplul 4. Peptidă (peptidă D) cu secvența nr. 8 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 2663,7 (masa moleculară calculată; 2662,5). 480
Exemplul 5. Peptidă (peptidă E) cu secvența nr. 9 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 2211,2 (masa moleculară calculată; 2209,9).
Exemplul 6. Peptidă (peptidă F) cu secvența nr. 10 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2. 485
FABMS (M+H+); 2647,5 (masa moleculară calculată; 2646,4).
RO 118298 Β1
Exemplul 7. Peptida (peptida G) cu secvența nr. 11 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 3018,1 (masa moleculară calculată; 3016,9).
Exemplul 8. Peptida (peptida H) cu secvența nr. 12 a fost sintetizată prin metoda în fază solidă utilizând un sistem de sinteză multi-peptide în fază solidă, în același mod ca în exemplul 2.
Ν-α-9-fluorenilmetiloxicarbonil-norleucina-O-rășina (Fmoc-Nle-O-rășină) (0,20 mmol/0,5 g) a fost utilizată ca rășină de bază. Rășina a fost gonflată timp de 20 min în DMF și apoi spălată de patru ori cu DMF. S-a adăugat apoi o soluție 20% piperidină în DMF și amestecul s-a agitat prin scuturare pentru a se îndepărta grupele protectoare. Această operație a fost repetată de trei ori pentru a se îndepărta complet grupele protectoare. A urmat spălarea de nouă ori cu DMF pentru a îndepărta excesul de piperidină din rășină. Prezența piperidinei reziduale a fost verificată în această etapă utilizând hârtie de pH. S-au adăugat apoi DMF (6 ml), Fmoc-Leu (0,5 mmol), N-hidroxibenzotriazol (0,5 mmol) și N,N’-diizopropilcarbodiimidă (0,5 mmol), și amestecul a fost agitat prin scuturare timp de 90 min pentru a realiza reacția de condensare. Rășina a fost apoi spălată de patru ori cu DMF, pentru a elimina excesul de reactivi. Această reacție de condensare a fost testată cu metoda de testare cu ninhidrină (the ninhydrin method kaiser test). Planul de sinteză a fost astfel urmat și s-au adăugat aminoacizii etapă cu etapă din direcția N-terminală pe suprafața rășinii pentru a forma o peptidă-O-rășină având capătul N-terminal și grupele funcționale total protejate. Reacțiile de condensare pentru introducerea Arg, Lys, His, Pro și Cys au fost efectuate de două ori timp de 120 min fiecare. După aceea, s-a adăugat peptidei-O-rășinii protejate o soluție de 20% piridină în DMF pentru a îndepărta grupa protectoare Fmoc de la capătul N-terminal. Peptida-O-rășină a fost apoi spălată de șase ori cu DMF și de șase ori cu metanol și uscară sub presiune redusă. S-au adăugat apoi m-cresol (0,2 ml), 1,2-etandiol (0,5 ml), tioanisol (1,2 ml), TFA (7,5 ml) și bromura detrimetilsilil (1,4 ml) peptidei-O-rășini uscate (100 mg) sub agitare și răcire cu gheață. Amestecul s-a agitat apoi timp de 120 min sub răcire cu gheață, pentru a îndepărta grupele protectoare din catenele funcționale laterale și pentru a îndepărta peptida din rășină și apoi filtrată printr-o frită (G3). Filtratul s-a concentrat sub presiune redusă într-un evaporator la aproximativ 5 ml. S-a adăugat apoi dietil-eter pentru precipitarea peptidei. Acest precipitat de peptidă a fost colectat cu o frită (G3), spălat de cinci ori cu dietil-eter și la uscare sub presiune redusă s-au obținut 65 mg peptidă H. Grupele amino N-terminale ale tuturor aminoacizilor au fost protejate cu grupa Fmoc și catenele laterale funcționale au fost protejate cu următoarele grupe înaintea utilizării aminoacizilor în reacție:
Arg-Mtr : (4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil)
Lys-Boc : (t-butiloxicarbonil)
Cys-Trt : (tritil)
His-Boc : (t-butiloxicarbonil)
S-au dizolvat aproximativ 10 mg din peptidă în 3,0 ml dintr-un solvent amestec cloroform-metanol (C/M) 2:1 (v/v). Proba a fost apoi purificată cu o coloană Sephadex LH-60 (φ 2,5 x 90 cm) care a fost echilibrată cu solvent în amestec (C/M) 2:1 (v/v) pentru a se obține peptida H pură. Prezența peptidei în eluant a fost urmărită la 245 nm (spectrofotometru; Japan Spectroscopie Co. Ltd. Model 870-UV) și cu un refractometru diferențial (Shimadzu Corporation Model RID-6A).
FABMS (M+H+); 2663,6 (masa moleculară calculată; 2662,5).
Exemplul 9. Peptida (peptida I) cu secvența nr. 13 a fost preparată în același mod ca în exemplul 8.
FABMS (M+H+); 2560,4 (masa moleculară calculată; 2559,3).
RO 118298 Β1
Exemplul 10. Peptidă (peptidă J) cu secvența nr. 14 a fost preparată în același mod ca în exemplul 8.
FABMS (M+H+); 2663,8 (masa moleculară calculată; 2662,5).
Exemplul 11. Peptidă (peptidă K) cu secvența nr. 15 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 2663,5 (masa moleculară calculată; 2662,5).
Exemplul 12. Peptidă (peptidă L) cu secvența nr. 16 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 2503,6 (masa moleculară calculată; 2502,4).
Exemplul 13. Peptidă (peptidă M) cu secvența nr. 17 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 2736,7 (masa moleculară calculată; 2735,5).
Exemplul 14. Peptidă (peptidă N) cu secvența nr. 18 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 2640,4 (masa moleculară calculată; 2639,4).
Exemplul 15. Peptidă (peptidă O) cu secvența nr. 19 a fost preparată în același mod ca în exemplul 8.
FABMS (M+H+); 2640,3 (masa moleculară calculată; 2639,4).
Exemplul 16. Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)
Peptidă (peptidă P) din titlu a fost sintetizată printr-o metodă în fază solidă utilizând Peptide Synthesizer System 9050 (Millipore Corp.). N-a-9-fluorenilmetilcarbonil-N-iu-4metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil-arginina-O-rășina (Fmoc-Arg(Mtr)-O-rășină) (0,20 mmol), în care N-a-9-fluorenilmetil-carbonil-N-<o-4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil-arginina (Fmoc-Arg(Mtr)) este legată de 2-metoxi-4-alcoxibenzilalcool-rășină (rășina Sasrin, nume comercial al Bachem Co., Ltd.), a fost utilizată ca rășină de bază și aminoacizii s-au adăugat în mod secvențial în direcția N-terminală pe suprafața rășinii conform protocolului de sinteză al Peptide Synthesizer System 9050 pentru a sintetiza o peptidă-O-rășină cu capătul N-terminal și grupele funcționale complet protejate. Peptida-O-rășină complet protejată a fost apoi spălată de cinci ori cu metanol și uscată sub presiune redusă. O soluție TFA-diclormetan (1:99, v/v) a fost apoi adăugată la peptida-O-rășină uscată (330 mg) sub agitare și răcire cu gheață. Amestecul s-a agitat apoi cu răcire cu gheață timp de 30 min și apoi s-a agitat timp de 90 min la temperatura camerei, pentru a îndepărta peptidă cu rășină cu grupele protectoare încă atașate de peptidă. Amestecul a fost apoi filtrat pe o frită (G3) și apoi filtratul a fost concentrat sub presiune redusă cu un evaporator la aproximativ 5 ml. S-a adăugat apoi dietil-eter pentru precipitarea peptidei. Precipitatul de peptidă a fost apoi colectat pe o frită (G3), apoi spălat de cinci ori cu dietil-eter și uscat sub presiune redusă. S-au obținut astfel 180 mg peptidă P. Grupele amino N-terminale ale tuturor aminoacizilor au fost protejate cu grupa Fmoc și catenele laterale funcționale au fost protejate cu următoarele grupe înaintea utilizării aminoacizilor în reacție:
Arg-Mtr : (4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil)
Lys-Boc : (t-butiloxicarbonil)
His-Trt : (tritil)
S-a adăugat apoi peptidei brute o soluție TFA-diclormetan (1:99, v/v) pentru a prepara o soluție de concentrație 10 mg/ml care a fost purificată prin HPLC utilizând o coloană Asahipak GS-510 (φ 21,5 x 500 mm) (nume comercial: Asahi Chemical Industry Co.Ltd.) pentru a se obține peptidă pură P. Ca eluant s-a utilizat o soluție TFA-diclormetan (1:99, v/v) și eluarea a avut loc la un debit de 8,1 ml/min timp de 120 min. Prezența peptidei în eluant a fost monitorizată la 245 nm (sprectrofotometru; Japan Spectroscopie Co. Ltd. Model 870UV) și cu un refractometru diferențial (Shimadzu Corporation Model RID-6A). FABMS (M+H+): 1405,0 (masa moleculară calculată; 1403,8).
540
545
550
555
560
565
570
575
580
585
RO 118298 Β1
Exemplul 17. H-Nle-(Nle)14-Nle-O-rășina a fost preparată printr-un sistem de sinteză de multi-peptide în fază solidă, conform exemplului 8. Apoi, după adăugarea DMF la H-Nle-(Nle)14-Nle-O-rășină, în locul Fmoc-Arg(Mtr) s-a adăugat peptidă P. Apoi s-au adăugat N-hidroxibenzotriazol și Ν,Ν’-diizopropilcarbo-diimida, și amestecul s-a agitat prin scuturare timp de 8 h. Această reacție de condensare a fost efectuată de două ori. Reacția de condensare a fost verificată prin metode de testare cu ninhidrină (the ninhydrin method kaiser test). Apoi, conform exemplului 8, grupele protectoare ale grupelor funcționale au fost eliminate și peptidă s-a îndepărtat din rășină și s-a purificat prin HPLC, pentru a se obține peptidă (peptidă I) cu secvența nr. 13.
FABMS (M+H+): 2560,2 (masa moleculară calculată; 2559,3).
Exemplul 18. O peptidă (peptidă Q) cu grupele tiol ale peptidei D în forma acetamidometilată (ACM) a fost preparată în același mod ca în exemplul 4, cu excepția faptului că s-a utilizat Fmoc-Cys(AMC) în loc de Fmoc-Cys(Trt).
FABMS (M+H+): 2734,7 (masa moleculară calculată; 2733,6).
Exemplul 19. S-a preparat peptidă R prin esterificarea grupelor tiol ale peptidei E cu acid palmitic, conform metodei descrise de Sarin, Virender și Kumar (EP 0458167A1). FABMS (M+H+): 2448,5 (masa moleculară calculată; 2448,3).
Exemplul 1 comparativ. Peptidă (peptidă S) cu secvența nr. 20 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 2793,8 (masa moleculară calculată; 2792,6).
Exemplul 2 comparativ. Peptidă (peptidă T) cu secvența nr. 21 a fost preparată în același mod ca în exemplul 2.
FABMS (M+H+); 3018,3 (masa moleculară calculată; 3016,9).
Analiza compoziției în aminoacizi a peptidelor sintetice conform invenției.
Peptidele sintetice conform invenției au fost hidrolizate în mediu acid cu o soluție 12N de HCI-TFA (2:1 (v/v)) conținând 5% fenol (gr/v) sub vid la 150°C timp de 1,2, 4, 6,12, 24, 48 și 72 h și produșii de hidroliză au fost analizați cu un sistem automat de analiză a aminoacizilor Shimadzu (LC-9A) după îndepărtarea acidului. Partea Trp a peptidei M a fost hidrolizată alcalin cu o soluție apoasă de hidroxid de sodiu 4,2N timp de 16,24 și 32 h și apoi neutralizată cu HCI, care apoi a fost analizată prin sistemul de analiză pentru aminoacizi. Compoziția în aminoacizi, calculată din valorile de amino-acid care au indicat recuperări mai mari în hidrolizele care au durat un timp cuprins între 1 și 72 h, a indicat valori care au corespuns valorilor calculate din formulele chimice. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.
ο Ol \Ο tn οι \o o co \O cn
H 0,9 CM 1,0 1,0 1 0,8 0,9 6'0 2,7 15,6 1 1,0 • » • t
ω co T“ o 1,0 r— T*“ 0,6 Ύ— 16,5 00 cm' t 1 1,0 1 1 1 1
O 0,9 CM 1 1 0,8 0,9 t 0,9 1 o 1 15,8 1 1 <D T~
z CM_ - 1 1 0,7 1 o 16,8 1 i CM r- t t 1 1 O r-
6Ό t— o 1 1 0,6 l 0,9 15,7 « 1 o 1 1 • 6'0
—I cm_ o_ <D 1 1 co o 1 3,9 co T““ « 1 0,8 1 a cm 1 a
0,9 o O 1 1 0,9 1 o 13,6 σ> cm“ 1 • 1 1 1
- 0,9 O_ 1 0,7 1 - 8,9 1 1 0,9 1 7,9 t 1 •
— o_ O_ t « 1 1 6‘0 0,9 1 1 00 o 1 16,1 1 1 1
T ro 0,9 1,0 I 1 0,7 0,8 a 1 0,9 1 15,9 1 1
0 ro 0,8 1,0 T” 1 00 o’ 0,8 0,8 co' 1 « 0,7 1 15,7 a 1 a
LL o 0,7 o_ 1 0,8 1 CM 16,9 1 1 00 o 1 1 1 1 1
IU 0,9 0,9 o 1 t 1 00 o* co 1 1 co o' 1 • 1 a
o 0,8 0,8 o f 1 0,9 « 0,9 16,8 1 1 0,7 1 1 t a
o o_ t— 6‘0 o 1 1 o 1 0,8 20,5 1 1 6'0 1 1 1 1 t
co 0,9 - o Τ’ CM 1 co o o_ 18,7 1 t CM 1 1 1 1
< O V 1,0 3,2 1 cd 0,9 0,9 19,5 o T~ CO cm 0,9 1 1 1 t
acid Lys O) k_ < His Gly 4_ Φ ω Cys Ala Val Leu 0) Met O να. Phe Nle 05 > z Q. Asx
(Valorile sunt pentru cazul în care conținutul His este fixat la 1,0 cu excepția peptidelor N și 0 pentru care valorile sunt pentru cazul în care Asx este fixat la 1,0). 640
RO 118298 Β1 (2) Prepararea surfactanților conform invenției
Surfactanții conform invenției au fost preparați amestecând peptidele conform invenției cu cele trei componente lipidice ale fosfogliceridei colinei, fosfolipide acide și, analog, de acid gras.
Exemplul 20. Cantități sterilizate de 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină (1350 mg), 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină (cu grupa acil având 14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.) (450 mg) și acid miristic (200 mg) au fost dizolvate la temperatura camerei într-un amestec cloroform-metanol (2:1 (v/v)) (1000 ml) și o cantitate de 25 mg peptidă A s-a dizolvat în TFA (1,0 ml). Aceste soluții au fost amestecate și apoi uscate și solidificate sub presiune redusă. Reziduul astfel obținut a fost suspendat într-un amestec apă-etanol (9:1 (v/v)) (100 ml) timp de 15 min la 40°C. S-a înghețat această suspensie la temperatura de -50°C și apoi s-a uscat timp de 36 h la un vid de 85...100 μ Hg, obținându-se astfel surfactantul (2070 mg) sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră, și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 65,2% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)fosfocolină, 21,7% (gr/gr) pentru 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 9,7% (gr/gr) pentru acid miristic, 1,2% (gr/gr) pentru peptidă A și 2,2% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 21. Compușii 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină (300,0 mg), 1,2-diacilsn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină (cu grupa acil având 14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.) (100,0 mg) și acid palmitic (40,0 mg) s-au dizolvat într-un amestec cloroform-metanol (2:1 (v/v)) (300 ml) și 10 mg peptidă A au fost dizolvate într-un amestec cloroform-metanol (2:1 (v/v)) (2,0 ml). Aceste soluții au fost amestecate și apoi uscate și solidificate sub presiune redusă. Reziduul astfel obținut a fost suspendat într-un amestec apăetanol (9:1 (v/v)) (100 ml) timp de 20 min la 45°C. După înghețarea aceastei suspensii la temperatura de -60°C și apoi uscarea timp de 40 h la un vid de 60...110 μ Hg, s-au obținut 459,1 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 65,3% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 21,8% (gr/gr) pentru 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 8,7% (gr/gr) pentru acid palmitic, 2,2% (gr/gr) pentru peptidă B și 2,0% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 22. Compușii 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină (280,0 mg), 1,2-dilau roilsn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină (120,0 mg) și acid palmitic (27,0 mg) s-au dizolvat într-un amestec cloroform-metanol (2:1 (v/v)) (150 ml) și o cantitate de 2,8 mg peptidă C a fost dizolvată într-un amestec cloroform-metanol (2:1 (v/v)) (0,5 ml). Aceste soluții au fost amestecate și apoi uscate și solidificate sub presiune redusă. Reziduul obținut a fost suspendat într-un amestec apă-etanol (8:2 (v/v)) (100 ml) timp de 45 min la 40°C. După înghețarea acestei suspensii la temperatura de -65°C și uscarea timp de 36h la un vid de
50...80 μ Hg, s-au obținut 437,6 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră, și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 64,0% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)fosfocolină, 27,4% (gr/gr) pentru 1,2-dilauroil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 6,2% (gr/gr) pentru acid palmitic, 0,6% (gr/gr) pentru peptidă C și 1,8% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 23. în afara utilizării peptidei D în locul peptidei B și a utilizării 1-palmitoil-2oleoil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerinei în locul 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerolului (cu grupa acil având 14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.) s-au efectuat aceleași operații ca cele din exemplul 21 pentru a se obține 451,9 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 66,4% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 22,1% (gr/gr) pentru 1-palmitoil-2oleoil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 8,9% (gr/gr) pentru acid palmitic, 2,2% (gr/gr) pentru peptidă D și 0,4% (gr/gr) pentru apă.
RO 118298 Β1
695
Exemplul 24. Compușii 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină (320,0 mg), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină (80,0 mg) și acidul palmitic (60,0 mg) s-au dizolvat într-un amestec cloroform-metanol (1:1 (v/v)) (200 ml) și peptidă E (14,0 mg) a fost dizolvată în TFA (0,3 ml). Aceste soluții au fost amestecate și apoi uscate și solidificate sub presiune redusă. Reziduul obținut a fost suspendat într-un amestec apă-etanol (10:1 (v/v)) (50 ml) timp de 60 min la 45°C. După înghețarea aceastei suspensii la temperatura de -45°C și uscarea timp de 24 h la un vid de 50...110 μ Hg, s-au obținut 479,2 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 66,8% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 16,7% (gr/gr) pentru 1,2-dimiristoil-snglicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 12,5% (gr/gr) pentru acid palmitic, 2,9% (gr/gr) pentru peptidă E și 1,1% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 25. în afara utilizării peptidei F (22,0 mg) în locul peptidei B (10,0 mg) și a utilizării 1,2-distearoil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerinei în locul 1,2-diacil-sn-glicero-(3)fosfo-sn-glicerinei (cu grupa acil având 14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.), s-au efectuat aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 463,9 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 64,7% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 21,6% (gr/gr) pentru 1,2-distearoil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 8,6% (gr/gr) pentru acid palmitic, 4,7% (gr/gr) pentru peptidă F și 0,4% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 26. în afara utilizării peptidei G în locul peptidei B, s-au efectuat aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 454,1 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 66,1% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 22,0% (gr/gr) pentru 1,2- diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-snglicerină (cu grupa acil având 14...24 atomi de carbon; (produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.), 8,8% (gr/gr) pentru acid palmitic, 2,2% (gr/gr) pentru peptidă G și 0,9% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 27.1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină (210,0 mg), 1,2-diacil-sn-glicero- (3)-fosfo-sn-glicerină (cu grupa acil având 14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.)(90,0 mg) și acid stearic (33,0 mg) s-au dizolvat într-un amestec cloroform-metanol (3:1 (v/v)) (100 ml) și peptidă H (1,9 mg) a fost dizolvată în metanol (0,5 ml). Aceste soluții au fost amestecate și apoi uscate și solidificate sub presiune redusă. Reziduul obținut a fost suspendat într-un amestec apă-etanol (9:1 (v/v)) (90 ml) timp de 15 min la 50°C. După înghețarea aceastei suspensii la temperatura de -55°C și uscarea timp de 28 h la un vid de 100...120 μ Hg, s-au obținut 340,2 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră, și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 61,7% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 26,5% (gr/gr) pentru 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 9,7% (gr/gr) pentru acid stearic, 0,5% (gr/gr) pentru peptidă H și 1,6% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 28.1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină (210,0 mg), 1 -palmitoil-2-oleoil-snglicero-(3)-fosfo-L-serină (90,0 mg)și acid palmitic (33,0 mg) au fost dizolvate într-un amestec cloroform-metanol (4:1 (v/v)) (100 ml) și peptidă I (11,0 mg) a fost dizolvată în TFA (0,5 ml). Aceste soluții au fost amestecate și apoi uscate și solidificate sub presiune redusă. Reziduul obținut a fost suspendat într-un amestec apă-etanol (9:1 (v/v)) (110 ml) timp de 25 min la 45°C. După înghețarea acestei suspensii la temperatura de -55°C și apoi uscarea timp de 28 h la un vid de 100...120 μ Hg, s-au obținut 348,7 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 60,2% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 25,8% (gr/gr) pentru 1-palmitoil-2-oleoil-snglicero-(3)-fosfo-L-serină, 9,5% (gr/gr) acid palmitic, 3,2% (gr/gr) peptidă I și 1,3% (gr/gr) apă.
700
705
710
715
720
725
730
735
740
RO 118298 Β1
Exemplul 29. Cu excepția faptului că se utilizează peptidă J în locul peptidei B, au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21 pentru a se obține 459,3 mg surfactant sub forma unei pudre albe.
Exemplul 30. Cu excepția faptului că se utilizează peptidă K în locul peptidei B, au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21 pentru a se obține 452,5 mg surfactant sub forma unei pudre albe.
Exemplul 31. Cu excepția faptului că se utilizează peptidă L în locul peptidei B, au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 456,6 mg surfactant sub forma unei pudre albe.
Exemplul 32. Cu excepția faptului că se utilizează peptidă M în locul peptidei B, au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 453,9 mg surfactant sub forma unei pudre albe.
Exemplul 33. Cu excepția faptului că se utilizează peptidă N în locul peptidei B, au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 452,5 mg surfactant sub forma unei pudre albe.
Exemplul 34. Cu excepția faptului că se utilizează peptidă O în locul peptidei B, au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 458,1 mg surfactant sub forma unei pudre albe.
Exemplul 35.1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină (30,0 mg), 1,2-diacil-sn-glicero- (3)-fosfo-sn-glicerină (cu grupa acil având 14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.)(10,0 mg) și acid palmitic (4,0 mg) au fost dizolvate într-un amestec cloroform-metanol (2:1 (v/v)) (30 ml) și 1,0 mg peptidă Q a fost dizolvată într-un amestec cloroform-metanol (2:1 (v/v)) (2,0 ml). Aceste soluții au fost amestecate și apoi uscate și solidificate sub presiune redusă. Reziduul obținut a fost suspendat într-un amestec apă-etanol (9:1 (v/v)) (10 ml) timp de 20 min la 45°C. După înghețarea acestei suspensii la temperatura de -60°C și apoi uscarea timp de 36 h la un vid de 60...120 μ Hg, s-au obținut 45,4 mg surfactant sub formă de pudră albă. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 66,1% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 22,0% (gr/gr) pentru 1,2-diacilsn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină, 8,8% (gr/gr) pentru acid palmitic, 2,2% (gr/gr) peptidă Q și 0,9% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 36. Cu excepția faptului că se utilizează peptidă R în locul peptidei Q, au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 35 pentru a produce 45,7 mg surfactant sub forma unei pudre albe.
Exemplul 3 comparativ. Cu excepția faptului că se utilizează o soluție de peptidă S (10 mg) în TFA (0,3 mg) în locul soluției de peptidă B (10 mg) într-un amestec cloroformmetanol (2:1 (v/v)) (2,0 ml), au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 455,2 mg surfactant sub forma unei pudre albe. Nu s-au găsit cantități detectabile de etanol în această pudră, și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 65,9% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 22,0% (gr/gr) pentru 1,2-diacil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină (cu grupa acil având
14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.), 8,8% (gr/gr) pentru acid palmitic, 2,2% (gr/gr) pentru peptidă S și 1,1% (gr/gr) pentru apă.
Exemplul 4 comparativ. Cu excepția faptului că se utilizează o soluție de peptidă
T (10 mg) în TFA (0,3 mg) în locul soluției de peptidă B (10 mg) într-un amestec cloroformmetanol (2:1 (v/v)) (2,0 ml), au fost efectuate aceleași operații ca cele din exemplul 21, pentru a se obține 456,0 mg surfactant sub forma unei pudre albe. Nu s-au găsit cantități
RO 118298 Β1 detectabile de etanol în această pudră și conținutul fiecăruia dintre componenți în raport cu greutatea totală a surfactantului a fost de 65,8% (gr/gr) pentru 1,2-dipalmitoilglicero-(3)-fosfocolină, 21,9% (gr/gr) pentru 1,2-acil-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerină (cu grupa acil având
14...24 atomi de carbon; produs de Sigma Chemical Co.,Ltd.), 8,8% (gr/gr) pentru acid palmitic, 2,2% (gr/gr) pentru peptidă T și 1,3% (gr/gr) pentru apă.
Tabelul 2 prezintă rezultatele testelor asupra activității superficiale și efectelor de menținere a volumului spațiului alveolar a surfactanților conform invenției.
Aplicații potențiale în industrie
După cum este descris mai sus, polipeptidele sintetice conform invenției sunt ușor de izolat și purificat, pot fi preparate prin procedee care permit o producție în cantitate mare, au solubilități mari în solvenți uzuali și prezintă o suspendabilitate mai uniformă și activități superficiale la fel de puternice comparativ cu compozițiile convenționale. Invenția poate fi de aceea utilizată ca agenți terapeutici pentru sindromul de jenă respiratorie, care este o boală ce produce disfuncții respiratorii severe.
Tabelul 2
795
800
805
Activități superficiale și efecte de menținere a volumului alveolar ale surfactanților conform invenției
Activitate superficială Efecte de menținere a volumului alveolar
Efectul de scădere a tensiunii superficiale Răspândirea la o interfață gaz-lichid Absorbabilitatea la interfața gaz-lichid
Max dyne /cm Min dyne /cm Timp de echilibrare sec Tensiune superficială de echilibru dyne/cm Timp de echilibrare sec Tensiune superficială de echilibru dyne/cm Volum pulmonar (la 5 cm H2O) ml/kg
Exemplul 20 29,0 0,2 30 27,5 65 30,3 48
Exemplul 21 24,7 0,5 30 26,7 30 29,2 55
Exemplul 22 32,6 4,3 60 33,1 90 34,8 41
Exemplul 23 26,8 2,5 40 28,5 50 32,3 51
Exemplul 24 33,1 7,3 60 33,5 100 34,6 39
Exemplul 25 33,7 7,4 60 32,8 100 34,2 39
Exemplul 26 27,2 1,1 60 28,3 40 29,9 49
Exemplul 27 27,2 8,7 60 27,5 50 28,3 46
Exemplul 28 34,1 3,9 60 34,3 95 36,8 40
Exemplul 29 28,0 0,8 30 27,6 30 29,9 53
Exemplul 30 31,5 1,6 50 28,0 80 32,1 47
Exemplul 31 34,2 1,2 60 33,1 100 34,5 40
Exemplul 32 33,7 3,0 30 31,6 60 33,9 44
810
815
820
825
830
835
RO 118298 Β1
Tabelul 2 (continuare)
Activitate superficială Efecte de menținere a volumului alveolar
Efectul de scădere a tensiunii superficiale Răspândirea la o interfață gaz-lichid Absorbabilitatea la interfața gaz-lichid
Max dyne /cm Min dyne /cm Timp de echilibrare sec Tensiune superficială de echilibru dyne/cm Timp de echilibrare sec Tensiune superficială de echilibru dyne/cm Volum pulmonar (la 5 cm H2O) ml/kg
Exemplul 33 28,7 3,2 30 26,9 50 30,2 51
Exemplul 34 30,8 2,1 50 29,8 70 31,9 49
Exemplul 35 30,1 2,5 40 30,4 50 31,7 49
Exemplul 36 33,4 3,9 60 31,3 90 32,9 45
Exemplul 3 comparativ 40,1 10,3 90 37,2 180 41,5 28
Exemplul 4 comparativ 39,0 2,5 95 36,4 150 39,7 29
Tabel de secvențe
Secvența nr: 1
Lungimea secvenței: 35
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
Secvență
Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile 15 10 15
Val Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala
25 30
Leu Leu Met Gly Leu
Secvența nr: 2
Lungimea secvenței: 34
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
RO 118298 Β1
Secvență
Leu Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Ile Lys Arg Leu Leu Ile Val 1 5 10 15
Val Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu 20 25 30
Leu Met Gly Leu
885
Secvența nr: 3
Lungimea secvenței: 35
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Leu Arg Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Val 1 5 10 15
Val Val Val Val Val Val Leu Val Val Val Val Ile Val Gly Ala
25 30
Leu Leu Met Gly Leu
890
895
900
Secvența nr: 4
Lungimea secvenței: 32
Forma secvenței: amino-acid 905
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
Secvență »
Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val
10 15910
Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly
2530
Leu His
Secvența nr: 5
Lungimea secvenței: 35915
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
Secvență
Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu920
5 1015
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala
2530
Leu Leu Met Gly Leu
925
Secvența nr: 6
Lungimea secvenței: 27
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
930
RO 118298Β1
Secvență
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu
25
Secvența nr: 7
Lungimea secvenței: 27
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
25
Secvența nr: 8
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență >
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
Secvența nr: 9
Lungimea secvenței: 19
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență >
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu
Secvența nr: 10
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
RO 118298 Β1
Secvența nr: 11 980
Lungimea secvenței: 27
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
Secvență985
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
1015
Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Gly Ala Leu Leu
2025
990
Secvența nr: 12
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență 995
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
1 5 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
20 1000
Secvența nr: 13
Lungimea secvenței: 22
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle 1 5 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
Secvența nr: 14
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
1005
1010
1015
1020
Secvența nr: 15
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
1025
RO 118298 Β1
Secvență
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu
5 10 15
Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ile Leu
Secvența nr: 16
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Nva Leu 15 10 15
Val Leu Nva Lau Leu Leu Leu Val
Secvența nr: 17 >
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență »
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp
Secvența nr: 18
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
Secvența nr: 19
Lungimea secvenței: 23
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă Secvență
Cis Pro Val Asn Ile Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle 15 10 15
Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle
RO 118298 Β1
Secvența nr: 20
Lungimea secvenței: 27
Forma secvenței: amino-acid
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
Secvență
Cys Pro Val His Leu Lys Arg Val Val Val Val Val Val Val Val 15 10 15
Val Val Val Val Val Val Val Val Gly Ala Leu Leu
25
Secvența nr: 21
Lungimea secvenței: 27
Forma secvenței: amino-acid »
Topologie: catenă liniară
Tip de secvență: peptidă
Secvență
Cys Pro Val His Leu Lys Arg lle lle lle lle lle lle lle lle
5 10 15 lle lle lle lle lle lle lle lle Gly Ala Leu Leu

Claims (8)

  1. Revendicări
    1080
    1085
    1090
    1095
    1100
    1. Peptidă sintetică, catacterizată prin aceea că are secvența specifică Xaa-ProVal-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W în care Xaa poate să lipsească sau să reprezinte Cys sau Ser, Xbb reprezintă His sau Asn, Xcc reprezintă Leu sau lle și W reprezintă o parte peptidică hidrofobă constând din 12 pană la 20 resturi Leu și/sau Nle.
  2. 2. Peptidă sintetică, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, respectiv, cei 12...20 aminoacizi hidrofobi care constituie partea hidrofobă a peptidei sintetice, conțin 1 până la 5 resturi de lle, Val, Nva și/sau Trp.
  3. 3. Peptidă conform revendicării 1 sau 2, caracterizată prin aceea că peptidă sintetică cu secvența specifică este reprezentată de oricare din secvențele nr. 5...19, sau este un produs S-acetamidometilat al peptidei cu secvența nr. 8 sau un produs S-palmitoilat al peptidei cu secvența nr. 9.
  4. 4. Peptidă pentru sinteză, caracterizată prin aceea că restul N-teminal și catenele laterale funcționale, din porțiunea hidrofilă a peptidei, reprezentată de secvența specifică Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg în care Xaa este fie absent, fie reprezintă Cys sau Ser, Xbb reprezintă His sau Asn și Xcc reprezintă Leu sau lle, protejate.
  5. 5. Peptidă pentru sinteză, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că este reprezentată de Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr), Fmoc-Pro-Val-Asn-LeuLys(Boc)-Arg(Mtr) sau Fmoc-Pro-Val-Asn-lle-Lys(Boc)-Arg(Mtr).
  6. 6. Procedeu pentru prepararea unei peptide sintetice, având caracteristicile din revendicarea 1, caracterizat prin aceea că se supune reacției de condensare a părții peptidice hidrofobe a unei peptide sintetice având caracteristicile din revendicările 1 sau 2 cu peptidă pentru sinteză având caracteristicile din revendicările 4 sau 5.
    1105
    1110
    1115
    1120
    RO 118298 Β1
  7. 7. Surfactant pulmonar, caracterizat prin aceea că acesta constă dintr-o peptidă sintetică având caracteristicile din revendicările 1,4 sau 5, o fosfogliceridă a colinei, o fosfo-
    1125 lipidă acidă și un acid gras.
  8. 8. Agent terapeutic pentru sindromul de jenă respiratorie, caracterizat prin aceea că acesta conține drept ingredient activ un surfactant pulmonar constând dintr-o peptidă sintetică având caracteristicile din revendicările 1, 4 sau 5, o fosfogliceridă a colinei, o fosfolipidă acidă și un acid gras.
RO96-01163A 1993-12-08 1994-12-07 Peptida sintetica, procedeu pentru prepararea acesteia, surfactantul pulmonar si agentul terapeutic continand aceasta peptida RO118298B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30765793 1993-12-08
PCT/JP1994/002057 WO1995015980A1 (fr) 1993-12-08 1994-12-07 Nouveau peptide synthetique, tensioactif pulmonaire contenant ledit peptide et remede contre le syndrome de souffrance respiratoire

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO118298B1 true RO118298B1 (ro) 2003-04-30

Family

ID=17971685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO96-01163A RO118298B1 (ro) 1993-12-08 1994-12-07 Peptida sintetica, procedeu pentru prepararea acesteia, surfactantul pulmonar si agentul terapeutic continand aceasta peptida

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5827825A (ro)
EP (1) EP0733645B1 (ro)
JP (1) JP3644035B2 (ro)
KR (1) KR100342806B1 (ro)
CN (1) CN1057099C (ro)
AT (1) ATE234865T1 (ro)
AU (1) AU682738B2 (ro)
BG (1) BG62777B1 (ro)
CA (1) CA2178345A1 (ro)
CZ (1) CZ162396A3 (ro)
DE (1) DE69432313T2 (ro)
DK (1) DK0733645T3 (ro)
ES (1) ES2189825T3 (ro)
FI (1) FI962355A0 (ro)
HU (1) HU215933B (ro)
NO (1) NO962403L (ro)
NZ (1) NZ277095A (ro)
PL (1) PL180020B1 (ro)
PT (1) PT733645E (ro)
RO (1) RO118298B1 (ro)
SK (1) SK71496A3 (ro)
WO (1) WO1995015980A1 (ro)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996017872A1 (fr) * 1994-12-07 1996-06-13 Tokyo Tanabe Company Limited Intermediaire pour la production d'un peptide surfactant
AU2322097A (en) * 1996-03-27 1997-10-17 Ortho Pharmaceutical Corporation Lyophilized pulmonary surfactant peptide compositions
JPH11217397A (ja) * 1997-11-27 1999-08-10 Saburo Aimoto ペプチドチオールエステルの製造方法
IT1308180B1 (it) * 1999-02-12 2001-12-07 Chiesi Farma Spa Peptidi sintetici aventi la capacita' di diminuire la tensionesuperficiale e loro impiego nella preparazione di un surfattante
BR9906091A (pt) * 1999-12-22 2002-06-04 Conselho Nacional Cnpq Usos de resina de troca aniÈnica (epm-7) como suporte sólido para a sìntese peptìdica e para cromatografia de afinidade
US6998384B2 (en) 2001-12-12 2006-02-14 The Penn State Research Foundation Surfactant prevention of lung complications from cancer chemotherapy
ES2295961T3 (es) * 2003-12-31 2008-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Proceso para la sintesis peptidica utilizacndo una cantidad reducida de agente de desproteccion.
EP1744761A4 (en) * 2004-04-28 2010-01-13 Molecules For Health Inc METHOD FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF RESTENOSIS AND OTHER PROLIFERATIVE VASCULAR DISORDER
US7638493B2 (en) * 2004-04-29 2009-12-29 Sannamu Lee Artificial pulmonary surfactant compositions and use of the same
KR100635541B1 (ko) * 2004-10-12 2006-10-18 경북대학교 산학협력단 신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US7582312B2 (en) * 2004-11-15 2009-09-01 Discovery Laboratories, Inc. Methods to produce lung surfactant formulations via lyophilization and formulations and uses thereof
US7464012B2 (en) * 2004-12-10 2008-12-09 L'air Liquide, Societe Anonyme A Directoire Et Conseil De Surveillance Pour L'etude Et L'exploitation Des Procedes Georges Claude Simplified process simulator
EP1841458B9 (en) 2005-01-06 2012-12-12 Discovery Laboratories, Inc. Surfactant treatment regimen for treating or preventing bronchopulmonary dysplasia
WO2007084136A2 (en) * 2006-01-23 2007-07-26 Ony, Inc. Treatment of acute respiratory distress syndrome
CA2663795A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Discovery Laboratories, Inc. Pulmonary surfactant formulations and methods for promoting mucus clearance
EP2022798A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-11 CHIESI FARMACEUTICI S.p.A. Synthetic pulmonary surfactant peptides
CN101980721B (zh) 2008-04-02 2013-03-13 国立大学法人德岛大学 含有合成肽的抗原药物赋形剂和使用其的粘膜疫苗
WO2013188016A2 (en) 2012-05-04 2013-12-19 Discovery Laboratories, Inc. Surfactant therapy for exposure to ionizing radiation

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988003170A1 (en) * 1986-10-24 1988-05-05 Whitsett Jeffrey A Pulmonary hydrophobic surfactant-associated proteins
JPH01501282A (ja) * 1986-12-08 1989-05-11 ホイツトセツト，ジエフリー　エイ． 肺胞疎水性界面活性物質関連タンパク質
ATE163013T1 (de) * 1987-11-04 1998-02-15 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Alveolare oberflächenaktive proteine
US5260273A (en) * 1988-01-06 1993-11-09 The Scripps Research Institute Pulmonary surfactant protein and related polypeptide
SE8803713D0 (sv) * 1988-10-18 1988-10-18 Kabigen Ab Biologically active lipoprotein and its use
JPH05294996A (ja) * 1992-04-17 1993-11-09 Tokyo Tanabe Co Ltd 合成ペプチド、それを含有する肺サーファクタント及び呼吸窮迫症候群治療剤

Also Published As

Publication number Publication date
DE69432313D1 (de) 2003-04-24
FI962355A (fi) 1996-06-06
NZ277095A (en) 1997-09-22
EP0733645A1 (en) 1996-09-25
CA2178345A1 (en) 1995-06-15
CN1136813A (zh) 1996-11-27
CZ162396A3 (en) 1996-10-16
DK0733645T3 (da) 2003-07-14
NO962403D0 (no) 1996-06-07
FI962355A0 (fi) 1996-06-06
WO1995015980A1 (fr) 1995-06-15
AU1199295A (en) 1995-06-27
ES2189825T3 (es) 2003-07-16
JP3644035B2 (ja) 2005-04-27
SK71496A3 (en) 1996-11-06
ATE234865T1 (de) 2003-04-15
PT733645E (pt) 2003-07-31
HUT74880A (en) 1997-02-28
BG100554A (bg) 1996-12-31
CN1057099C (zh) 2000-10-04
HU215933B (hu) 1999-03-29
AU682738B2 (en) 1997-10-16
NO962403L (no) 1996-06-07
KR100342806B1 (ko) 2002-11-29
EP0733645A4 (en) 1998-12-09
EP0733645B1 (en) 2003-03-19
HU9601563D0 (en) 1996-08-28
US5827825A (en) 1998-10-27
DE69432313T2 (de) 2003-10-16
BG62777B1 (bg) 2000-07-31
PL314872A1 (en) 1996-09-30
PL180020B1 (en) 2000-12-29
KR960706507A (ko) 1996-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0350506B1 (en) Pulmonary surfactant protein and related polypeptide
RO118298B1 (ro) Peptida sintetica, procedeu pentru prepararea acesteia, surfactantul pulmonar si agentul terapeutic continand aceasta peptida
CN102459327B (zh) 包含表面活性剂蛋白质b(sp-b)和表面活性剂蛋白质c(sp-c)的类似物的改良重构的表面活性剂组合物
EP1005485B1 (en) Therapeutic pulmonary lavage with diluted surfactants
JP4754073B2 (ja) 表面活性をもつ人工ペプチドおよび人工のサーファクタントの製造におけるその使用
US8337815B2 (en) Pulmonary surfactant formulations
CA2022443A1 (en) Pulmonary surfactant protein fragments
JP2008526868A (ja) 表面活性剤処置療法
JPH07502500A (ja) 抗酸化性を有する合成肺表面活性剤
CN108676088A (zh) 合成的肺表面活性肽
JP3376582B2 (ja) 合成ペプチド、それを含有する肺サーファクタント及び呼吸窮迫症候群治療剤
RU2144925C1 (ru) Новые синтетические пептиды, легочная поверхностно-активная композиция, лекарственный препарат для лечения респираторного дистресс-синдрома
WO2007001094A1 (ja) 人工肺サーファクタント組成物
PT1192184E (pt) Ésteres de proteína c surfactantes
WO1996017872A1 (fr) Intermediaire pour la production d&#39;un peptide surfactant