JP2006510629A - 被検体における免疫応答を調節するための組成物および方法 - Google Patents

被検体における免疫応答を調節するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、被検体での免疫応答を調節し、特に腫瘍、顕著には固形腫瘍や感染症のある被検体を処置するための組成物および方法に関する。開示されているのは、被検体でのγδ Ｔ細胞の活性を調節する方法などによる被検体での自然免疫の調節方法である。開示されているのは、サイトカインおよびγδ Ｔ細胞活性化因子との組み合わせ、特定の投与計画および薬用量でγδ Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで顕著に増殖すること、さらには被検体の免疫防御が顕著に増加することである。好ましいγδ Ｔ細胞活性化因子には、ＢｒＨＰＰ（ブロモヒドリンピロホスフェート又はPhosphostim）、ＣＢｒＨＰＰ、ＨＤＭＡＰＰ、ＣＨＤＭＡＰＰ及びＥｐｏｘ−ＰＰが挙げられる。

Description

本発明は、被検体における免疫応答、特に被検体におけるＴ細胞応答を調節するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、被検体でのγδ Ｔ細胞の活性を調節するなどの方法で、被検体における先天性免疫を調節する効率的な方法を開示するものである。さらに本発明は、固形腫瘍、特に転移を伴う腫瘍の処置に前記方法および化合物を利用できることを示すものである。
ヒト末梢血γδ Ｔ細胞はその大半がＶγ９／Ｖδ２遺伝子によってコードされるγδ ＴＣＲヘテロダイマーを発現し、クラスＩ ＭＨＣに対するＮＫ系統受容体をいくらか発現し、ＣＤ４やＣＤ８についてはほとんど発現しない。これらの細胞は、ウイルス感染細胞（Ｐｏｃｃｉａら（１９９９）、寄生生物感染細胞（Ｃｏｎｓｔａｎｔら（１９９５））または腫瘍細胞（Ｆｏｕｒｎｉｅ ｅｔ Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ （１９９６））に対して、強い非ＭＨＣ制限細胞溶解活性を呈することが明らかになっている。また、これらの細胞は、結核、マラリア、野兎病、大腸菌症などのいくつかの無関係な感染症との関連で、さらにはＢ−細胞腫瘍によって（概要については、Ｈａｙｄａｙ，２０００を参照のこと）、生理学的に増幅される。
こうした細胞の抗感染活性とは別に、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞または骨髄細胞系からのリンパ腫および白血病（Ｆｉｓｃｈら、１９９７；Ｓｅｌｉｎら、１９９２；Ｓｉｃａｒｄら、２００１；Ｓｔｕｒｍら、１９９０；Ｚｈｅｎｇら、２００１ａ）、乳癌（Ｂａｎｋら、１９９３）、神経膠芽腫（Ｆｕｊｉｍｉｙａら、１９９７；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９７）、腎細胞癌（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙら、１９９５；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００１；Ｍｉｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９４）、上咽頭癌（Ｚｈｅｎｇら、２００１ｂ）、肺腺癌（Ｆｅｒｒａｒｉｎｉら、１９９６）といった極めて幅広い起源に由来する多種多様な腫瘍細胞系を溶解できることが短期細胞毒性試験で明らかになった。
微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）では、Ｖγ９／Ｖδ２＋リンパ球は、天然ホスホ抗原およびアルキルアミンと呼ばれる構造的に関連した一組の非ペプチド抗原を自発的に認識する。Ｂ細胞腫瘍では、γδ Ｔ細胞に対する抗原の性質はまだ同定されていない。Ｖγ９／Ｖδ２＋リンパ球も、事前の曝露なく、さまざまなウイルス感染細胞型、ウイルス活性化細胞型または腫瘍細胞型に応答する。繰り返すが、こうした状況で原因となる抗原は分かっていない（概要についてはＦｉｓｃｈ，２０００を参照のこと）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、Ｖγ９／Ｖδ２ ２＋リンパ球が、治療用アミノビスホスホネートなどの合成薬に応答し（Ｅｓｐｉｎｏｓａ，２００１にて概説）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化につながることが明らかになっている。天然非ペプチド抗原の認識は、Ｖγ９−ＣＤＲ３領域とＶδ２−ＣＤＲ３領域の両方に所在するアミノ酸残基を介して、γδ ＴＣＲによって行われる。ＣＤ１またはＭＨＣ分子による処理と提示はどちらも関与していないが、非ペプチド抗原によるＶγ９／Ｖδ２＋リンパ球の活性化には細胞と細胞との接触が必要であるようにみえる（Ｌａｎｇ，１９９５；Ｍｏｒｉｔａ，１９９５；Ｍｉｙａｇａｗａ，２００１、Ｒｏｊａｓ，２００２）。
刺激性の（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）細菌抗原には、多くの場合はホスフェート基が存在することから、かつてホスホ抗原と呼ばれていた小さな非ペプチド化合物であることが明らかになっている（Ｂｅｈｒら、１９９６；Ｂｅｌｍａｎｔら、２０００；Ｃｏｎｓｔａｎｔら、１９９４；Ｐｏｑｕｅｔら、１９９８；Ｔａｎａｋａら、１９９５）。
メバロン酸塩経路の内在性代謝産物：ＩＰＰ
Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞については、微生物細胞と哺乳動物細胞の両方にみられる従来のメバロン酸塩経路を介して生成される、イソペンテニルピロホスフェートまたはＩＰＰなどの内在性代謝産物（ミクロモル範囲で作用）によって活性化させることもできる（Ｅｓｐｉｎｏｓａら、２００１ｂ；Ｔａｎａｋａら、１９９５）。後者の細胞におけるＩＰＰの生成は、細胞ストレスおよびトランスフォーメーションの状況で上方制御可能なものである。特に、昨今の研究で、腫瘍細胞におけるＩＰＰの内在産生レベルとＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による細胞溶解に対するその感受性との相関が報告されている（Ｇｏｂｅｒら、２００３）。
内在性代謝産物を調節する化合物：スタチンおよびアミノビスホスホネート
メバロン酸塩経路の内在性代謝産物がＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の認識に対して果たす直接的な役割とも一貫して、ＩＰＰ生合成を妨げる薬剤（スタチンなど）あるいはＩＰＰの蓄積につながる薬剤（アミノビスホスホネートなど。後述）で細胞を処理すると、それぞれ処理細胞のＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞刺激特性が低下または亢進する（Ｇｏｂｅｒら、２００３； Ｋａｔｏら、２００１）。
アミノビスホスホネートも、メバロン酸塩経路における酵素であるＦＰＰ合成酵素を阻害し、その阻害によってＩＰＰなどの上流のイソプレノイド脂質が蓄積・放出されると考えられている。アミノビスホスホネート化合物は、がん患者での骨への転移を治療すべくヒトでの治療に用いられてきたもので、パミドロネート６０〜９０ｍｇを静脈内注射する治療後に多発性骨髄腫を有するヒトの成人で１から３週間以内に循環γδ Ｔ細胞が増加することを示す、ホスホ抗原アゴニストによって誘導されるヒトＶγ９／Ｖδ２＋リンパ球のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖に対する最初のまとまった証拠となった（Ｋｕｎｚｍａｎｎら、１９９９）。しかしながら、このような化合物は抗原提示細胞による提示を必要とし、純なＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞培養におけるサイトカイン分泌から評価したところ、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞活性の実質的な刺激を生むことはできない。さらに、パミドロネートはγδ Ｔ細胞の活性力価が極めて低く、γδ Ｔ細胞数がせいぜい２倍になるだけであるとの報告がある（Ｗｉｌｈｅｌｍら、２００３）。
比活性の高いホスホ抗原
最近になって、γδ Ｔ細胞を直接活性化する力価の高いγδ Ｔ細胞活性化ピロホスフェート含有化合物がいくつか報告されている。特に、ホスファリヒドリン（phosphalyhydrin）およびホスホエポキシド化合物が、Ｊ．Ｊ．Ｆｏｕｒｎｉｅのグループによって報告された。現在では、γδ Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を刺激する目的で、ヒトで行われている臨床研究にはＢｒＨＰＰ（ブロモヒドリンピロホスフェート）とも呼ばれる（Ｒ，Ｓ）−３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェートが用いられている。原核微生物及び真核微生物に特異な「ロメール」または「非メバロン酸塩」経路と呼ばれるイソプレノイド生合成経路で、比活性の高い（ナノモル範囲またはこれよりもよい範囲でＥＣ５０）他のピロホスフェート含有化合物が生成される（Ｆｅｕｒｌｅら、２００２；Ｊｏｍａａら（２００３）；Ｊｏｍａａら、１９９９ａ；Ｊｏｍａａら、１９９９ｂ；Ｒｏｈｍｅｒら、１９９３）。
上述したアミノビスホスホネートおよびスタチンとは対照的に、式Ｉ〜式ＸＶＩＩにあげた化合物などの比活性の高いホスホ抗原化合物は、サイトカインの分泌を基準にモニタリングして判断すると、ミリモル濃度での培養中にてＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞クローンの個体群でＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞活性を調節できる。ホスホ抗原の厳密な認識モードは分からないままであるが、遺伝子移入実験によって、Ｖγ９／Ｖδ２ ＴＣＲがホスホ抗原による活性化に対して直接的に影響していることが示されている（Ｂｕｋｏｗｓｋｉら、１９９５）。このため、Ｖγ９／Ｖδ２ ＴＣＲを結晶解析して導かれた昨今の構造データは、抗原側の負に荷電したホスフェート残基とＴＣＲ側の正に荷電したいくつかのアミノ酸との間の静電相互作用による、ホスホ抗原とγδ ＴＣＲとの対応する相互作用と整合する（Ａｌｌｉｓｏｎら、２００１）。
γδ Ｔ細胞活性化化合物の投与を伴う処置方法
上記にかかわらず、さまざまな化合物群から得たアナログの合成とｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験を含むホスホ抗原に関する研究から、高いγδ Ｔ細胞活性化をもたらす構造、特に本明細書にて記載の式Ｉの化合物が明らかになる。しかしながら、比活性の高いホスホ抗原をｉｎ ｖｉｖｏで使うための方法または処置計画については何ら提案されていない。このため、γδ Ｔ細胞活性を大幅に高められるだけの十分なｉｎ ｖｉｖｏでの刺激を伴う戦略に対する方法または処置計画も提案されていない。
一面では、ｉｎ ｖｉｖｏでの好適なモデルがないことから、γδ Ｔ細胞活性化化合物に基づく処置計画の研究ができずにいる。ｉｎ ｖｉｖｏでのさまざまなモデルによって、生来の免疫系の一般的な免疫監視機能を示す徴候が得られており、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはγδ Ｔ細胞などの生来のエフェクター細胞の欠損マウスでは腫瘍発生率の有意な増加が認められる（Ｇｉｒａｒｄｉら、２００１；Ｋｉｍら、２０００；Ｓｍｙｔｈら、２０００）。しかしながら、ヒトでは、これらの細胞個体群がマウスの場合に比して少々異なっているため、十分に注意しなければ上記の結果をヒトの場合に当てはめることはできない。特に、ヒトＶγ９／Ｖδ２細胞個体群などには、齧歯類で公式に同等であるとされているものがない。
上記に鑑みて、いくつかの化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を持つことが明らかになってはいるが、こうした化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの活性ならびに、広義には刺激に応答してのｉｎ ｖｉｖｏでのγδ Ｔ細胞動態は、いまだ探求されていない。このため、治療に適した条件下にて、被検体においてｉｎ ｖｉｖｏでγδ Ｔ細胞を選択的に活性化するには、効率のよい方法が必要である。
さらに、腫瘍の処置、ことさら固形腫瘍、特に転移を伴う固形腫瘍の処置に向けた、ｉｎ ｖｉｖｏでの循環γδ Ｔ細胞の多様な増加を刺激することを含む治療戦略は、まったく開発されていない。腫瘍に対する処置の安全性ならびに有効性は、さまざまな要因で変わることがあり、処置についても、腫瘍の増殖動態、腫瘍細胞の薬剤耐性、全身腫瘍細胞負荷、細胞に対して治療がおよぼす毒性作用、腫瘍以外の組織、患者の組織内での治療薬の分布などによって影響されることがある。一次腫瘍が大きくなればなるほど、診断される前に多数の細胞（薬剤耐性および薬剤感受性）が転移して患者に病気が再発する確率が高くなる。ヒトに起こるがん全体の９０％以上を固形腫瘍と癌腫が占め、リンパ腫や白血病の治療にモノクローナル抗体ならびに抗毒素を用いることが検討されてはいるが、このような薬剤の多くは癌腫や他の固形腫瘍に対する臨床試験では非常に効果の薄いものであった。エフェクター細胞をベースにした処置にこれほど効果のないことに対して考えられる理由のひとつに、細胞を固形腫瘍に移動させるのが容易ではない点があげられる。あるいは、仮に腫瘍塊の中に入り込めたとしても、これらの細胞は、腫瘍細胞間のしっかりとした結合、線維性ストロマ、間質の圧較差、結合部位のバリアなどがゆえに均一に分散されない場合がある。
発明の概要
本発明は、γδ Ｔ細胞の活性、特に、γδ Ｔ細胞の活性化および増殖を、被検体でｉｎ ｖｉｖｏにて効率よく調節する上で利用できる特定の組成物および方法を開示するものである。これらの組成物および方法は、被検体、特に腫瘍のある被検体、さらには固形腫瘍のある被検体での免疫療法に特に適している。とはいえ、本発明は、他の疾患、特に感染症に羅患した被検体の治療にも役立つことがある。
本発明者らによる本明細書に記載の組成物および方法は、一連の結果に立脚している。一態様では、比活性の高いピロホスフェート化合物によってｅｘ ｖｉｖｏで活性化させた自家γδ Ｔ細胞を利用した治療戦略によって、ｅｘ ｖｉｖｏで刺激したγδ Ｔ細胞を転移性腎細胞癌の処置に利用する進行中の臨床研究で、ヒトの患者における抗腫瘍活性の指標を示す。別の態様では、本発明による組成物および方法は、γδ Ｔ細胞の生物活性のｉｎ ｖｉｖｏでの亢進ならびに、γδ Ｔ細胞個体群の多様な増殖の両方を含むγδ Ｔ細胞の活性を調節する過程を伴う、動物での第１の周知の実験から得られた一連の所見に立脚している。さらに、γδ Ｔ細胞活性化とγδ Ｔ細胞媒介抗腫瘍活性の評価試験に適合させた新規なＮｏｄ−Ｓｃｉｄマウスモデルでは、動物に投与した力価の高いγδ Ｔ細胞活性化化合物によって、γδ Ｔ細胞活性をｉｎ ｖｉｖｏにて調節でき、γδ Ｔ細胞が固形腫瘍に浸透し、さらには固形腫瘍、特には転移性腫瘍の塊を減らす上で、このような処置が効果的であることが明らかになった。転移性固形腫瘍のあるヒトの患者から得た培養中で新鮮な細胞に対しては、γδ Ｔ細胞活性化因子刺激γδ Ｔ細胞の抗腫瘍効果が観察されたが、同じ患者から得た非腫瘍細胞に対しては、このような効果は観察されなかった。このような発見に基づいて、本発明者らは、γδ Ｔ細胞の活性を調節できる化合物を用いる固形腫瘍の治療法を考案した。
さらに実験を行って、比活性の高いγδ Ｔ細胞活性化因子のｉｎ ｖｉｖｏでの動態を求めた。これによって、このような化合物を投与し、感染、自己免疫疾患、腫瘍を処置することまたは防止することを含む、免疫応答の調整が望ましい広範囲にわたる用途で、上記化合物を処置に利用する方法が得られた。特に、ｉｎ ｖｉｖｏでのγδ Ｔ細胞動態を解明したところ、特に以下のような所見が得られた。
（ａ）投与計画に応じて、γδ Ｔ細胞活性化因子を利用して、サイトカインの放出と細胞個体群の増殖によって示される細胞の活性化を含め、γδ Ｔ細胞の活性を繰返し調節することができ、薬剤投与の間隔を特定の間隔にすることでγδ Ｔ細胞活性が最適な形で再刺激されること、
（ｂ）サイトカイン、特にＩＬ−２、さらには特定用量のＩＬ−２を投与計画に加えるとにより、γδ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖が改善されること、
（ｃ）γδ Ｔ細胞活性を亢進できるγδ Ｔ細胞活性化因子に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性をｉｎ ｖｉｖｏの薬用量投与計画に置き換える方法、
（ｄ）γδ Ｔ細胞活性化因子を利用してγδ Ｔ細胞活性を高められる特定の薬用量および投与計画。
一態様では、本発明は、少なくとも１回の処置で、治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子を薬学的に許容可能な担体と一緒に、このような処置が必要な温血動物に投与する工程を含む、腫瘍の処置方法を開示するものである。特に好ましい態様では、少なくとも１回の処置で、治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子を薬学的に許容可能な担体と一緒に、このような処置が必要な温血動物に投与する工程を含む、固形腫瘍の処置方法が得られる。また、少なくとも１回の処置で、治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子を薬学的に許容可能な担体と一緒に、このような処置が必要な、転移した固形腫瘍のある温血動物に投与する工程を含む、固形腫瘍の処置方法も得られる。前記腫瘍の処置方法は、好適な方法で実施可能なものである。好ましくは、前記方法は、固形腫瘍のある温血動物のγδ Ｔ細胞を治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子と接触させる工程を含み、あるいは場合により、前記方法は、固形腫瘍のある温血動物の血流中に治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子を提供する工程を含む。特定の実施形態では、前記腫瘍は転移した固形腫瘍である。あるいは、前記腫瘍が血液腫瘍であり、好ましくはリンパ腫である。場合により、前記腫瘍は転移性腫瘍である。好ましくは、前記腫瘍は、肺の腫瘍と、結腸直腸の腫瘍と、前立腺の腫瘍と、乳房の腫瘍と、類表皮頭頸部の腫瘍と、からなる群から選択される。本発明の好ましい態様では、前記腫瘍は腎臓がんであり、好ましくは転移性の腎臓がんである。あるいは、前記腫瘍は、黒色腫と、卵巣がんと、膵臓がんと、神経芽細胞腫と、頭頸部がんと、膀胱がんと、腎臓がんと、脳腫瘍と、胃がんと、からなる群から選択される。好ましくは、前記方法が少なくとも２回の処置を含む。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を処置間隔約２週間から約８週間で投与し、一層好ましくは処置間隔約３週間から約４週間で投与する。場合により、少なくとも３回、４回または６回の処置を前記動物に対してほどこす。好ましくは、前記温血動物でγδ Ｔ細胞の生物活性を亢進させる。好ましくは、前記温血動物で循環γδ Ｔ細胞数を増やす。特定の実施形態では、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の量は、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を増殖させ、少なくとも３０％、４０％、５０％または６０％に達し、あるいは全循環リンパ球の３０〜９０％に達するのに十分な量である。別の特定の実施形態では、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の量は、被検体のγδ Ｔ細胞個体群を少なくとも１０倍に増加するのに十分な量である。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の投与後４日目から８日目の間に前記γδ Ｔ細胞個体群を評価し、一層好ましくは前記γδ Ｔ細胞活性化因子の投与後５日目、６日目または７日目にこれを評価する。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞個体群をフローサイトメトリーで評価する。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞はＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞である。場合により、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を静脈内注入で投与し、好ましくは前記注入を約５から約１２０分間で行い、一層好ましくは約５から約３０分間で行う。さらに好ましい態様では、これらの方法にはさらに、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２を投与することを含む。
もうひとつの態様では、２回以上の処置で、治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子を、薬学的に許容可能な担体と一緒に、このような処置が必要な温血動物に投与することを含み、γδ Ｔ細胞活性化因子は、処置間隔約２週間から約８週間で２回以上の処置にて投与される、温血動物での腫瘍疾患の処置方法が開示される。また、（ａ）温血動物のγδ Ｔ細胞を治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子と接触させ、（ｂ）工程（ａ）での前記接触後に工程（ａ）を約２週間から約８週間以内に少なくとも１回繰り返すことを含む、温血動物でγδ Ｔ細胞を刺激するための方法も開示される。また、（ａ）温血動物の血流に治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子を提供し、（ｂ）工程（ａ）での前記接触後に工程（ａ）を約２週間から約８週間以内に少なくとも１回繰り返すことを含む、温血動物でγδ Ｔ細胞を刺激するための方法も開示される。場合により、工程（ｂ）は、前記方法が工程（ａ）を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回または少なくとも６回繰り返すことを含むものであってもよい。
また、本発明者らは、固形腫瘍のある温血動物のγδ Ｔ細胞を、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を増大させ、全循環リンパ球の少なくとも３０％、４０％、５０％または６０％、あるいは３０〜９０％を達成するのに十分な量のγδ Ｔ細胞活性化因子と接触させる工程を含む、固形腫瘍の処置方法を開示するものである。また、固形腫瘍のある温血動物の血流中に、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を増大させ、全循環リンパ球の少なくとも３０％、４０％、５０％または６０％、あるいは３０〜９０％を達成するのに十分な量のγδ Ｔ細胞活性化因子を提供する工程を含む、固形腫瘍の処置方法も得られる。好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与後４日目から８日目の間、最も好ましくは約５日目、６日目または７日目に、γδ Ｔ細胞個体群を評価する。
本発明の一態様は、γδ Ｔ細胞個体群を増やすことである。本発明は、固形腫瘍のある温血動物のγδ Ｔ細胞を、被検体においてγδ Ｔ細胞個体群を少なくとも１０倍に増加するのに十分な量のγδ Ｔ細胞活性化因子と接触させる工程を含む、固形腫瘍の処置方法を包含する。また、固形腫瘍のある温血動物の血流中に、被検体においてγδ Ｔ細胞個体群を処置前のレベルと比して少なくとも１０倍に増加するのに十分な量のγδ Ｔ細胞活性化因子を提供する工程を含む固形腫瘍の処置方法も包含される。好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与後４日目から８日目の間、最も好ましくは約５日目、６日目または７日目にγδ Ｔ細胞個体群を評価する。好ましくは、γδ Ｔ細胞個体群をフローサイトメトリーで評価する。
また、腫瘍処置用医薬品の製造にγδ Ｔ活性化因子を使用する方法であって、前記γδ Ｔ活性化因子を薬学的に許容可能な担体と混合し、前記医薬品を前記被検体に投与することを含む方法も本発明に包含される。好ましくは、前記腫瘍は固形腫瘍である。特定の実施形態において、前記腫瘍は転移した固形腫瘍である。あるいは、前記腫瘍が血液腫瘍であり、好ましくはリンパ腫である。場合により、前記腫瘍は転移性腫瘍である。好ましくは、前記腫瘍は、肺の腫瘍と、結腸直腸の腫瘍と、前立腺の腫瘍と、乳房の腫瘍と、類表皮頭頸部の腫瘍と、からなる群から選択される。本発明の好ましい態様では、前記腫瘍は腎臓がんであり、好ましくは転移性の腎臓がんである。あるいは、前記腫瘍は、黒色腫と、卵巣がんと、膵臓がんと、神経芽細胞腫と、頭頸部がんと、膀胱がんと、腎臓がんと、脳腫瘍と、胃がんと、からなる群から選択される。好ましくは、前記医薬品を少なくとも２回投与し、一層好ましくは約２週間から約８週間の処置間隔で投与し、さらに一層好ましくは、約３から約４週間の処置間隔で投与する。場合により、前記医薬品を少なくとも３回、４回または６回投与する。好ましくは、前記医薬品は前記被検体でγδ Ｔ細胞の生物活性を高めるものである。好ましくは、前記医薬品は前記被検体で循環γδ Ｔ細胞数を増やすものである。特定の実施形態では、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の量は、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を増大させ、全循環リンパ球の３０〜９０％を達成するのに十分な量である。他の特定の実施形態では、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の量は、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を少なくとも１０倍に増やすのに十分な量である。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の投与後４日目から８日目の間、一層好ましくは前記γδ Ｔ細胞活性化因子の投与後７日目に前記γδ Ｔ細胞個体群を評価する。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞個体群をフローサイトメトリーで評価する。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞はＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞である。場合により、前記医薬品を静脈内注入で投与し、好ましくは前記注入を約５から約１２０分間行い、一層好ましくは約５から約３０分間行う。さらに好ましい態様では、この方法は、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２をさらに投与することを含むものであってもよい。
本発明の方法の一態様では、サイトカインを投与せずにγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。他の態様では、本発明の方法は、哺乳動物被検体でγδ Ｔ細胞の活性を調節するための製剤組成物の製造に、γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを利用することを含み、このγδ Ｔ細胞活性化因子およびインターロイキン−２ポリペプチドを別々に被検体に投与する。
本明細書に記載の方法の好ましい態様ではいずれも、少なくとも２回、３回、４回または６回の処置を前記動物に対して施す。本明細書に記載の方法の好ましい態様ではいずれも、約２から約８週間の処置間隔、あるいは一層好ましくは、処置間隔約３から約４週間をあけて、２回以上の処置でγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。
本明細書にて記載の方法ではいずれも、本方法の温血動物は、齧歯類または非ヒト霊長類であっても構わない。好ましい態様では、本方法の温血動物はヒトである。
本発明の態様の好ましい態様ではいずれも、これらの方法を用いることで、前記温血動物または前記被検体でのγδ Ｔ細胞の生物活性が高まるか、あるいは前記温血動物または前記被検体での循環γδ Ｔ細胞数が増加する。好ましくは、本発明の方法に記載のγδ Ｔ細胞はＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞である。
例をあげて説明したように、本発明の方法については、固形腫瘍の処置ならびに転移した固形腫瘍の処置に利用できる。他の態様では、本発明の方法を血液腫瘍の処置に利用してもよい。好ましくは、このような処置が必要なヒトに対して、前記疾患の処置に適した用量でγδ Ｔ活性化因子を投与する。しかしながら、好ましい用量ならびに特に有効な用量については、本明細書にてさらに説明する。場合により、本明細書に記載のいずれの方法においても、ヒト用量のＥＣ５０よりも多い用量でγδ Ｔ活性化因子を投与し、各々がヒト用量のＥＣ５０よりも多い１以上のさらなる用量を、２から８週間の処置間隔をあけた後に、少なくともさらに１回の追加処置で投与する。
本明細書にて記載の方法ではいずれも、本発明はさらに、サイトカインを投与するものである。本明細書に記載の方法の好ましい態様ではいずれも、サイトカインはＩＬ−２である。好ましくは、インターロイキン−２ポリペプチドを低用量で投与する。本発明の方法のいずれかのさらなる態様では、サイトカイン、最も好ましくはインターロイキン−２ポリペプチドを、１から１０日間の時間をかけて投与する。好ましくは、インターロイキン−２ポリペプチドを、１日あたり０．２から２ＭＵ、さらに一層好ましくは０．２から１．５ＭＵ、なお好ましくは０．２から１ＭＵの一日用量で投与する。サイトカイン、好ましくはインターロイキン−２ポリペプチドの一日用量については、１回の注射または２回の注射で投与する。好ましくは、処置開始時にγδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で投与する。
好ましい態様では、有効量のγδ Ｔ活性化因子およびサイトカイン、好ましくはインターロイキン−２ポリペプチドを、その投与が必要な被検体に、１から１０日間の時間をかけて別々に投与することを含む、被検体においてγδ Ｔ細胞を刺激するための方法あるいは、被検体において、がん、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を処置する方法が得られる。好ましくは、処置開始時にγδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で投与する。好ましくは、処置開始時にγδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で投与し、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２を、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与後１０日間の期間内に、少なくとも２、３、４または５日間投与する。また、本発明は、別々に利用できるγδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを含む、哺乳動物被検体でのγδ Ｔ細胞の活性調節用の製品も包含する。
本発明はさらに、哺乳動物被検体でのγδ Ｔ細胞の活性を調節するための製剤組成物の製造に、γδ Ｔ細胞活性化因子およびインターロイキン−２ポリペプチドを使用することに関するものであり、γδ Ｔ細胞活性化因子およびインターロイキン−２ポリペプチドを別々に被検体に投与する。好ましくは、前記γδ Ｔ活性化因子は合成γδ Ｔ活性化因子である。好ましくは、前記インターロイキン−２ポリペプチドを低用量で投与する。好ましくは、前記インターロイキン−２ポリペプチドを、１から１０日間の時間をかけて投与する。一層好ましくは、前記インターロイキン−２ポリペプチドを、１日あたり０．２から２ＭＵ、なお一層好ましくは０．２から１．５ＭＵ、さらに好ましくは０．２から１ＭＵの一日用量で投与する。場合により、インターロイキン−２ポリペプチドの前記一日用量については、１回の注射または２回の注射で投与する。好ましくは、処置開始時に前記γδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で投与する。場合により、前記γδ Ｔ細胞活性化因子は、γδ Ｔリンパ球のＴ受容体のリガンドである。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を少なくとも２回投与し、一層好ましくは約２週間から約８週間の処置間隔、なお一層好ましくは約３から約４週間の処置間隔で投与する。場合により、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を少なくとも３回、４回または６回投与する。好ましくは、前記製剤組成物は、前記被検体でγδ Ｔ細胞の生物活性を亢進するものである。好ましくは、前記製剤は、前記被検体の循環γδ Ｔ細胞数を増加させる。好ましくは、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を増大させ、全循環リンパ球の３０〜９０％を達成するのに十分な量で、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。場合により、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を少なくとも１０倍に増やすのに十分な量で、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞はＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞である。場合により、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を静脈内注入で投与し、好ましくは前記注入を約５から約１２０分間で行い、一層好ましくは約５から約３０分間で行う。場合により、前記被検体は、がん、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患のあるヒト被検者である。特定の実施形態では、前記製剤組成物を利用して被検体のがんを処置する。好ましくは、前記がんが固形腫瘍である。特定の実施形態では、前記がんは転移した固形腫瘍である。あるいは、前記がんが血液腫瘍であり、好ましくはリンパ腫である。場合により、前記がんは転移性腫瘍である。好ましくは、前記がんは、肺の腫瘍と、結腸直腸の腫瘍と、前立腺の腫瘍と、乳房の腫瘍と、類表皮頭頸部の腫瘍と、からなる群から選択される。本発明の好ましい態様では、前記がんは腎臓がんであり、好ましくは転移性の腎臓がんである。あるいは、前記がんは、黒色腫と、卵巣がんと、膵臓がんと、神経芽細胞腫と、頭頸部がんと、膀胱がんと、腎臓がんと、脳腫瘍と、胃がんと、からなる群から選択される。他の特定の実施形態では、前記製剤組成物を利用して、被検体の感染症を処置する。さらなる特定の実施形態では、前記製剤組成物を利用して、被検体の自己免疫疾患を処置する。別の特定の実施形態では、前記製剤組成物を利用して、被検体でのγδ Ｔ細胞による溶解の影響を受けやすい病原細胞によって引き起こされる、あるいは関連した疾患を処置する。
本発明は、有効量のγδ Ｔ活性化因子およびインターロイキン−２ポリペプチドを、その投与が必要な被検体に、別々に投与することを含む、被検体において、がん、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を処置するための方法に関するものである。好ましくは、前記γδ Ｔ活性化因子は合成γδ Ｔ活性化因子である。好ましくは、前記インターロイキン−２ポリペプチドを低用量で投与する。好ましくは、前記インターロイキン−２ポリペプチドを、１から１０日間の時間をかけて投与する。一層好ましくは、前記インターロイキン−２ポリペプチドを、１日あたり０．２から２ＭＵ、なお一層好ましくは０．２から１．５ＭＵ、さらに好ましくは０．２から１ＭＵの一日用量で投与する。場合により、インターロイキン−２ポリペプチドの前記一日用量については、１回の注射または２回の注射で投与する。好ましくは、処置開始時に前記γδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で投与する。場合により、前記γδ Ｔ細胞活性化因子はγδ Ｔリンパ球のＴ受容体のリガンドである。特定の実施形態では、前記γδ Ｔ細胞活性化因子はＰＥＤ化合物またはＰＨＤ化合物であり、これを処置開始時に１０から５０ｍｇ／ｋｇの用量で１回の注射にて投与し、前記インターロイキン−２ポリペプチドについては、１日あたり０．２から２ＭＵの一日用量で１から１０日間の時間をかけて投与する。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を、少なくとも２回、一層好ましくは約２週間から約８週間の処置間隔、さらに一層好ましくは約３から約４週間の処置間隔で投与する。場合により、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を少なくとも３回、４回または６回投与する。好ましくは、前記製剤組成物は、前記被検体でγδ Ｔ細胞の生物活性を亢進するものである。好ましくは、前記製剤は、前記被検体の循環γδ Ｔ細胞数を増加させる。好ましくは、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を増大させ、全循環リンパ球の３０〜９０％を達成するのに十分な量で、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。場合により、被検体でγδ Ｔ細胞個体群を少なくとも１０倍に増やすのに十分な量で、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。好ましくは、前記γδ Ｔ細胞はＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞である。場合により、前記γδ Ｔ細胞活性化因子を静脈内注入で投与し、好ましくは前記注入を約５から約１２０分間で行い、一層好ましくは約５から約３０分間で行う。好ましくは、前記方法は、がんの処置方法である。好ましくは、前記がんが固形腫瘍である。特定の実施形態では、前記がんは転移した固形腫瘍である。あるいは、前記がんが血液腫瘍であり、好ましくはリンパ腫である。場合により、前記がんは転移性腫瘍である。好ましくは、前記がんは、肺の腫瘍と、結腸直腸の腫瘍と、前立腺の腫瘍と、乳房の腫瘍と、類表皮頭頸部の腫瘍と、からなる群から選択される。本発明の好ましい態様では、前記がんは腎臓がんであり、好ましくは転移性の腎臓がんである。あるいは、前記がんは、黒色腫と、卵巣がんと、膵臓がんと、神経芽細胞腫と、頭頸部がんと、膀胱がんと、腎臓がんと、脳腫瘍と、胃がんと、からなる群から選択される。
本明細書では、本明細書に記載の方法のいずれにおいても利用できる多数の好適なγδ Ｔ細胞活性化因子が得られる。好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子は、γδ Ｔ細胞クローン、好ましくはＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の純粋な個体群で、γδ Ｔ細胞の活性を調節できるか、または好ましくはその増殖を誘導できる化合物である。一層好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子は、１００ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、あるいは最も好ましくは１ｍＭ未満の濃度でγδ Ｔ細胞活性化因子が培養中に存在する場合に、γδ Ｔ細胞クローンの個体群でγδ Ｔ細胞の活性を調節できる化合物である。さらに好ましいγδ Ｔ細胞活性化因子については、本明細書にて詳細に説明する。
特に好ましいγδ Ｔ細胞活性化因子は、式（ＩＩ）の化合物を含む組成物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｘはハロゲン（好ましくは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌから選択される）であり、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は、１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ｎは２から２０の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）である。好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋であるか、またはヌクレオシドである。一層好ましくは、ＹはＯ−Ｃａｔ＋である。好ましくは、Ｒ１はメチルである。好ましくは、ＡはＯまたはＣＨ２である。一層好ましくは、ＡはＯである。好ましくは、ｎは２である。好ましくは、Ｘは臭化物である。好ましくは、ＢはＯである。好ましくは、ｍは１または２である。一層好ましくは、ｍは１である。好ましくは、このような化合物を、約１０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの用量で、薬学的に許容可能な担体と一緒にヒトに投与する。他の好ましい態様では、このような化合物を２以上の処置で投与し、好ましくは、この化合物を、式（Ａ）単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（１０からｙ）＊Ｎ（Ａ）（式中、Ｎは処置と処置との間の週数であり、ｙは１００である）に基づいて算出される用量でヒトに投与し、一層好ましくは、式Ｂ単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（５から６０）＊Ｎ（Ｂ）で算出される用量でヒトに投与、あるいは、好ましくは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、ヒトに投与する。なお一層好ましくは、式（Ｃ）単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（１０から１００）＊Ｎ（Ｃ）（式中、Ｎは、約３から約４の間であるような、処置と処置との間の週数である）に基づいて算出される用量で、静脈内注入によって、前記γδ Ｔ活性化因子をヒトに投与する。
他の特に好ましいγδ Ｔ細胞活性化因子は、式（ＸＩＩ）の化合物を含む組成物を含む。
Figure 2006510629
（式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一であっても異なっていてもよく、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｗは−ＣＨ−または−Ｎ−であり、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ３）アシル、アルデヒド、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコールまたは（Ｃ２〜Ｃ３）エステルであり、Ｃａｔ＋は１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）である。好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋であるか、またはヌクレオシドである。一層好ましくは、ＹはＯ−Ｃａｔ＋である。好ましくは、ＡはＯまたはＣＨ２である。一層好ましくは、ＡはＯである。一層好ましくは、Ｒ３およびＲ５はメチルであり、Ｒ４は水素である。一層好ましくは、Ｒ６は−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯ−ＣＨ３または−ＣＯ−ＯＣＨ３である。好ましくは、ＢはＯである。好ましくは、ｍは１または２である。一層好ましくは、ｍは１である。場合により、ＷとＣとの間の二重結合は、トランス（Ｅ）またはシス（Ｚ）の立体配座である。一層好ましくは、ＷとＣとの間の二重結合はトランス（Ｅ）の立体配座である。好ましくは、このような化合物を、約１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、あるいはなお一層好ましくは１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの用量で、薬学的に許容可能な担体と一緒にヒトに投与する。他の好ましい態様では、このような化合物を２以上の処置で投与し、好ましくは、この化合物を、式（Ａ）単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．００１からｙ）＊Ｎ（Ａ）（Ｎは、処置と処置との間の週数であり、ｙは１００である）に基づいて算出される用量でヒトに投与し、好ましくは、式Ｂ単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０１から２０）＊Ｎ（Ｂ）に基づいて算出される用量でヒトに投与し、好ましくは、式Ｃ単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０１から５）＊Ｎ（Ｃ）に基づいて算出される用量でヒトに投与し、好ましくは、式Ｄ単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０２から５）＊Ｎ（Ｄ）に基づいて算出される用量あるいは好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇの用量でヒトに投与する。最も好ましくは、前記γδ Ｔ活性化因子を、式（Ｅ）単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０１から２０）＊Ｎ（Ｅ）（式中、Ｎは約３から約４になるような、処置と処置との間の週数である）に基づいて算出される用量で静脈内注入してヒトに投与する。
本明細書に記載の方法の好ましい態様のいずれにおいても、γδ Ｔ活性化因子は合成γδ Ｔ活性化因子である。
本明細書に記載の方法の他の好ましい態様のいずれにおいても、γδ Ｔ細胞活性化因子は、ホスホハロヒドリン（ＰＨＤ）化合物、ホスホエポキシド（ＰＥＤ）化合物、アルキルアミンから選択される。一層好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子は、以下の化合物すなわち、
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート（ＢｒＨＰＰ）、
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート（ＩＨＰＰ）、
３−（クロロメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート（ＣｌＨＰＰ）、
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−トリホスフェート（ＢｒＨＰＰＰ）、
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−トリホスフェート（ＩＨＰＰＰ）、
α，γ−ジ−［３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル］−トリホスフェート（ジＢｒＨＴＰ）、
α，γ−ジ−［３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル］−トリホスフェート（ジＩＨＴＰ）、
３，４，−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−ジホスフェート（Ｅｐｏｘ−ＰＰ）、
３，４，−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−トリホスフェート（Ｅｐｏｘ−ＰＰＰ）、
α，γ−ジ−３，４，−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−トリホスフェート（ジ−Ｅｐｏｘ−ＴＰ）から選択される。
他の態様では、γδ Ｔ細胞活性化因子はＰＥＤ化合物またはＰＨＤ化合物であり、処置開始時に、１０から５０ｍｇ／ｋｇの用量を１回の注射で投与され、インターロイキン−２ポリペプチドは、１日あたり０．２から２ＭＵの一日用量で１から１０日間の時間をかけて投与される。
さらなる態様では、本発明は、２回以上の処置で、式ＸＩＩの化合物を含む組成物を薬学的に許容可能な担体と一緒に、温血動物に投与することを含み、γδ Ｔ細胞活性化因子は、２回以上の処置で、約２週間から約８週間の処置間隔をあけて投与される、温血動物でγδ Ｔ細胞を刺激するための方法を提供するものである。
さらなる態様では、本発明は、２回以上の処置で、式ＩＩの化合物を含む組成物を薬学的に許容可能な担体と一緒に、温血動物に投与することを含み、γδ Ｔ細胞活性化因子は、２回以上の処置で、約２週間から約８週間の処置間隔をあけて投与される、温血動物でγδ Ｔ細胞を刺激するための方法を提供するものである。
本発明のもうひとつの態様では、ＨＤＭＡＰＰ化合物を含む組成物を、約１０μｇ／ｋｇから約２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、薬学的に許容可能な担体と一緒に被検者に投与することを含む、被検者でγδ Ｔ細胞を刺激するための方法が開示される。さらなる態様では、本発明は、ＣＨＤＭＡＰＰ化合物を含む組成物を、約１０μｇ／ｋｇから約２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、薬学的に許容可能な担体と一緒に被検者に投与することを含む、被検者でγδ Ｔ細胞を刺激するための方法を提供するものである。
さらなる態様では、本発明は、ＣＢｒＨＰＰ化合物を含む組成物を、約５ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの用量で、薬学的に許容可能な担体と一緒に被検者に投与することを含む、被検者でγδ Ｔ細胞を刺激するための方法を提供するものである。
また、本発明は、γδ Ｔ細胞活性化因子を被検体に投与するための方法を提供するものである。よって、本発明のいずれの方法でも、前記方法は、γδ Ｔ細胞活性化因子を静脈内注入で投与することを含み得る。好ましくは、それぞれの注入を約５から約１２０分間行い、あるいは一層好ましくは、約５から約３０分間行う。最も好ましくは、特定の日（２４時間未満の期間内など）に、γδ Ｔ細胞活性化因子の上記のような注入を１回だけ（シングルショットとも呼ばれる）行う。好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与時すなわち処置サイクルごとに、１回だけ注入を行う。
特に好ましい一態様では、本発明は、被検者においてγδ Ｔ細胞を調節する方法であって、好ましくは静脈内注入によって、式ＸＩＩの化合物を含む組成物を、前記被検者に、被検体の体重１キログラムあたり前記化合物を１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、あるいは、なお一層好ましくは１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは単回投与（シングルショット）、かつ好ましくは注入による場合は２４時間未満の時間内で投与することを含む方法に関するものである。特に好ましい一態様では、本発明は、被検者においてＶγ９／Ｖδ２＋Ｔ細胞を調節する方法であって、好ましくは静脈内注入によって、（それぞれ式ＸＶおよびＸＶＩ）のＨＤＭＡＰＰ化合物またはＣＨＤＭＡＰＰ化合物を含む組成物を、前記被検者に、被検体の体重１キログラムあたり前記化合物を１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、あるいは、なお一層好ましくは１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは単回投与（シングルショット）、かつ好ましくは注入による場合は２４時間未満の時間内で投与することを含む方法に関するものである。
さらになお別の態様では、本発明は、薬学的に許容可能な担体と一緒に、治療有効量のＣＨＤＭＡＰＰを活性成分として含有する製剤組成物を提供するものである。また、薬学的に許容可能な担体と一緒に、治療有効量のＣＢｒＨＰＰを活性成分として含有する製剤組成物も得られる。
詳細な説明
定義
本発明に関する限り、「γδ Ｔ細胞の活性を調節する」という表現は、被検体でこのような細胞の数および／または生物活性の増加を引き起こすまたは増加を助けることを意味する。よって、調節するとは、被検体でのこのような細胞の増殖の調整（刺激など）および／または、たとえば、サイトカイン（ＴＮＦαまたはＩＦＮγなど）分泌の誘発を含むがこれに限定されるものではない。上述したように、γδ Ｔ細胞は通常、健常な成人被検者の場合で全循環リンパ球の約１〜１０％を占める。本発明を利用すれば、被検体のγδ Ｔ細胞個体群を有意に増加させ、特に、全循環リンパ球の３０〜９０％、一般に４０〜９０％、一層好ましくは５０〜９０％に達することができる。一般的な実施形態では、本発明は、被検体でのγδ Ｔ細胞の選択的増殖を、全循環リンパ球の６０〜９０％、好ましくは７０〜９０％、一層好ましくは８０〜９０％にできるようにするものである。また、調節には、上記に加えてあるいは上記に代える形で、被検体におけるγδ Ｔ細胞の生物活性、特にその細胞溶解活性またはそのサイトカイン分泌活性の調整を含む。本発明は、標的細胞に対するγδ Ｔ細胞の生物活性を高めるための新規な条件ならびに戦略を定義するものである。
本明細書にて使用する場合、γδ Ｔ細胞の活性の調節に関しての「ＥＣ５０」という用語は、このようなγδ Ｔ細胞の活性に関して最大応答または効果の５０％が得られる効率的な対象組成物濃度を示す。
本明細書にて使用する場合、γδ Ｔ細胞の活性の調節に関しての「ＥＣ１００」という用語は、このようなγδ Ｔ細胞の活性に関して最大応答または効果が得られる効率的な対象組成物濃度を示す。
上記ならびに以下で数値的な表現を用いる場合、これらの表現は、上限および下限を表す数を含むことを想定している。たとえば、「１から３」とは「１以上３以下」の範囲を意味し、「１から３の範囲」とは「１以上３以下」を意味する。算用数字（３など）ではなく単語で数を記述している場合（「三」など）にも同じことが当てはまる。
「〜を含む」を用いる場合、これは、好ましくは「本質的に〜からなる」と置き換え可能であり、一層好ましくは「〜からなる」と置き換え可能である。
数に鑑みて「約」を用いる場合、これは、好ましくは数＋／−１５％、一層好ましくは数プラス５％、最も好ましくは「約」のない数それ自体を意味する。たとえば、「約１００」とは「８５以上１１５以下」を意味し得る。たとえば「約１から約３」または「約１から約３の間」など、数字の範囲について「約」を用いる場合は、好ましくは、最後のセンテンスの数についての「約」の定義は、範囲の最初と最後を定義する数それぞれに別々に適用される。好ましくは、数値について「約」を用いる場合、「約」を削除することが可能である。
「毎週」とは「１週間に約１回」ということ（約１週間の処置間隔で２回以上の処置を行うことを意味する）であり、ここでの約は、好ましくは＋／−１日（すなわち、「６日から８日ごと」と置き換えられる）を意味し、最も好ましくは、「毎週」は「７日に１回」を意味する。
「３週ごと」または「３週間ごと」は、「３週間に約１回」ということ（約３週間の処置間隔で２回以上の処置を行うことを意味する）であり、ここでの約は、好ましくは＋／−３日間（すなわち１８日から２４日ごとと置き換えられる）を意味し、最も好ましくは、「毎週」は「２１日に１回」（＝３週目ごと）を意味する。
本明細書全体をとおして、「増殖性疾患の処置」または「腫瘍の処置」または「がんの処置」などの表現がγδ Ｔ細胞活性化因子に関して用いられる場面では、これは以下のような意味を持つ。
ａ）増殖性疾患の処置（＝処置するための）方法であって、γδ Ｔ細胞活性化因子を（好ましくは薬学的に許容可能な担体材料中で）、前記疾患の処置を可能にする用量（＝治療有効量）、好ましくは上記および下記にて好ましいとして示す用量（量）で、このような処置が必要な温血動物、特にヒトに（少なくとも１回の処置のために）投与する工程を含む方法；
ｂ）（特にヒトにおいて）γδ Ｔ細胞活性化因子を増殖性疾患の処置に用いること、あるいは前記処置に用いられるγδ Ｔ細胞活性化因子；
ｃ）増殖性疾患処置用の医薬品の製造にγδ Ｔ細胞活性化因子を用いること；および／または
ｄ）増殖性疾患の処置に適した１回分用量のγδ Ｔ細胞活性化因子を含む医薬品、あるいは、本願を出願した国で特許査定になる主題に従って、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）の任意の組み合わせ；
ｅ）前記γδ Ｔ細胞活性化因子を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、増殖性疾患処置用の医薬品の製造にγδ Ｔ細胞活性化因子を用いる方法。「増殖性疾患」ではなく腫瘍疾患または特定の腫瘍（大腸腫瘍、大腸癌腫または大腸がん；または前立腺腫瘍、前立腺癌腫または前立腺がんなど）について言及する場合、カテゴリａ）〜ｅ）も包含される。これは、特許性のある主題に沿って、上記ａ）〜ｅ）に準じて「増殖性疾患」をそれぞれの腫瘍疾患に代えられることを意味する。
本明細書にてさらに説明するように、いくつかのγδ Ｔ細胞活性化因子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてナノモル濃度レベルおよびピコモル濃度レベルでγδ Ｔ細胞の活性を調節することが明らかになっている。第１および第２のγδ Ｔ活性化因子すなわちＢｒＨＰＰおよびＨＤＭＡＰＰを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの研究から、これらの化合物が霊長類でｉｎ ｖｉｖｏにてγδ Ｔ細胞の生物活性の亢進ならびに高い率での増殖を誘導できることが明らかになっている。これにより、ｉｎ ｖｉｖｏでγδ Ｔ細胞を刺激する、新しい戦略が可能となる。
また、γδ Ｔ細胞を刺激する戦略が、固形腫瘍をはじめとするヒトでの腫瘍の処置、さらには転移した固形腫瘍の処置にも功を奏し得ることも明らかになっている。γδ Ｔ細胞細胞活性化化合物であるＢｒＨＰＰ（Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍとも呼ばれる）を臨床研究に利用して、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化させたγδ Ｔ細胞を導入することで転移性腎臓癌腫のあるヒトを処置すると、固形腫瘍を効果的に処置できることを示した。簡単に説明すると、患者のサイタフェレシスから高濃縮Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を多数生成するように設計された養子細胞免疫治療プロセスに、ＢｒＨＰＰを利用した。ｅｘ ｖｉｖｏでの刺激によって、臨界数のエフェクター細胞を治療目的で生成できる。２週間の製造プロセスでＢｒＨＰＰ刺激γδ Ｔ細胞を得た。最初の細胞調製物は、新鮮なサイタフェレシスまたは冷凍サイタフェレシスのいずれかから得た血液に由来するＰＢＭＣからなる。これらの細胞を閉じた系で２週間増大させ、独特なＧＭＰ−グレードのＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍでの刺激の後に、培養液に規定薬用量のＩＬ−２を順次加える。この製造プロセスは、最後の分離または精製工程がない上に、支持細胞を使う必要もなく、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍによって得られる特定のＴＣＲ媒介シグナルで、Ｖγ９Ｖδ２サブセットのＩＬ−２依存性増殖を十分トリガーでき、これが培養中で優勢になるなど、従来のＣＤ８＋Ｔ細胞系またはクローンを用いる現行の細胞治療法と比較するとかなり単純である。冷凍サイタフェレシス１種類から何通りかの用量のγδ細胞製品を製造できる。一般に、サイタフェレシス由来の冷凍ＰＢＭＣ１億で、２０億から５０億個の細胞が得られる。ＢｒＨＰＰ刺激γδ Ｔ細胞は、現在、転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）のフェーズＩの臨床試験で利用されている。この試験は現在、最初の細胞１０億個の用量で正しい寛容を得た上で、細胞４０億個という第２の用量レベルで行われている。評価可能な患者では、抗腫瘍活性の徴候が疾患の安定という形で認められたことから、進行中の試験から得られる予備の結果は見込みのあるものである。
また、自家γδ Ｔ細胞は、標的細胞比に対するエフェクターの機能として、転移性腎細胞癌のある患者から得た腫瘍細胞を溶解できるが、同じ患者から得た正常な（非腫瘍）細胞の溶解は実質的に引き起こさないことも明らかになっている。本明細書にて説明するように、ＢｒＨＰＰは、健常なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を特異的に増大する合成ホスホ抗原である。これらの増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はリンパ腫標的を溶解し、樹立腎癌細胞（ＲＣＣ）系もいくらか溶解した。
本研究では、ＲＣＣ患者から得た一次正常腎細胞および腫瘍腎細胞を樹立し、ＢｒＨＰＰがこれらの患者のＰＢＭＣに対しておよぼす影響について調査した。これにより、自家設定で一次正常および腫瘍腎細胞に対して増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の溶解能を評価することができた。この細胞毒性活性を、ＬＡＫ細胞（リンフォカイン活性化キラー細胞）などの他の自家エフェクター細胞と比較した。
本発明者らは、固形腫瘍、さらには転移性腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏでの処置に化合物ＢｒＨＰＰも利用できるのではないかということを示唆する一連の実験を実施した。ある一組の実験で、本発明者らは、ヒトγδ Ｔ細胞を導入したがんのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルを利用して、γδ Ｔ細胞活性化因子が培養中で転移性腎細胞腫瘍細胞の増殖を防止または抑制できることを示した。
本発明者らはさらに、何種類かのγδ Ｔ細胞活性化因子を用いる一連の実験で、霊長類のγδ Ｔ細胞の薬物動態を解明した。得られるのは、霊長類においては、刺激されたγδ Ｔ細胞がγδ Ｔ細胞活性化因子の投与から約５日から７日後にピーク数に達するという所見である。さらに、これらの結果から、γδ Ｔ細胞活性化因子を繰返し投与して、γδ Ｔ細胞活性をｉｎ ｖｉｖｏで再刺激できるということも明らかになった。しかしながら、γδ Ｔ細胞の再刺激は、γδ Ｔのピーク増加前には行わないようにし、実質的に１回目の刺激の前の率までγδ Ｔ細胞個体群がもどされたら、このような再刺激を行うのが最適である。さらに、γδ Ｔ細胞を刺激する目的での化合物の投与は毎回、たとえば本明細書にて示す例における注入などの方法で、シングルショットで行うのが最適である。２つのγδ Ｔ細胞活性化因子すなわちＢｒＨＰＰとＨＤＭＡＰＰを比べる一例において、最適なγδ Ｔ細胞生物活性と増殖の亢進が得られる薬用量を求めた。それぞれの化合物のＥＣ５０を求めるにあたり、比較によってｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏのＥＣ５０薬用量の対応が明らかになった。興味深いことに、ＨＤＭＡＰＰ化合物の活性を評価したところ、先に報告された活性との比較で、この化合物では低用量の投与計画を利用できることが明らかになった。これは、霊長類でのＥＣ５０で確認できた。
よって、第１の態様では、本発明は、腫瘍の処置、好ましくは固形腫瘍の処置に関するものであり、γδ Ｔ細胞活性化因子を、治療有効量で、温血動物、特にヒト、好ましくはこのような処置が必要なヒトに投与する。
本発明の方法および組成物を用いると、以下の疾病を含むがこれに限定されるものではない、さまざまながんや他の増殖性疾患を処置できる。
−扁平上皮細胞癌など、膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、頚部、甲状腺および皮膚の癌腫をはじめとする癌腫；
−白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫をはじめとする、リンパ細胞系の造血腫瘍；
−急性および慢性の骨髄性白血病および前骨髄球性白血病をはじめとする骨髄細胞系の造血腫瘍；
−線維肉腫および横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｃｏｍａ）をはじめとする間葉由来の腫瘍；
−黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫、神経膠腫をはじめとする他の腫瘍；
−星状膠細胞、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫をはじめとする中枢神経系および末梢神経系の腫瘍；
−線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫をはじめとする間葉由来の腫瘍；
−黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞腺がんおよび奇形癌腫をはじめとする他の腫瘍。
上述したように、本発明の方法は、自己免疫疾患または感染症の処置または防止にも利用できるものである。
上記ならびに下記にて、腫瘍、腫瘍疾患、癌腫またはがんについて言及され、また、元の臓器または組織および／または他のいずれかの場所における転移が示唆され、あるいは、またはこれに加えて、腫瘍および／または転移がどのような場所にあるかを問わない。
好ましい態様では、γδ Ｔ細胞活性化因子は、γδ Ｔ細胞の生物活性を高めることができ、好ましくは、γδ Ｔ細胞の増殖を刺激しながら、あるいは未刺激で、γδ Ｔ細胞の活性化を亢進、特にγδ Ｔ細胞からのサイトカイン分泌を亢進するか、あるいはγδ Ｔ細胞の細胞溶解活性を高める。よって、一態様において、本発明は、疾患、特に増殖性疾患、一層好ましくは固形腫瘍、特に転移した固形腫瘍を処置するための方法に関するものであり、式Ｉの化合物、特に式Ｉ〜ＸＶＩＩのγδ Ｔ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰと、ＣＢｒＨＰＰと、ＨＤＭＡＰＰ ＨＤＭＡＰＰと、ｅｐｏｘＰＰと、からなる群から選択されるγδ Ｔ細胞活性化因子を含むγδ Ｔ細胞活性化因子を、被検体で活性γδ Ｔ細胞を増加するのに十分な量と条件、好ましくはγδ Ｔ細胞によってサイトカイン分泌を増大できるおよび／またはγδ Ｔ細胞の細胞溶解活性を高めるのに十分な量と条件で投与する。一般的な実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで求めたγδ Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を、少なくとも２、３、４、１０、５０、１００倍に増やすことができる。
サイトカイン分泌および細胞溶解活性については、適当なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたは本明細書に記載の例にあげたアッセイを用いて評価できる。たとえば、ＴＮＦ−α感受性細胞を利用してバイオアッセイでのＴＮＦ−α放出の測定について説明した、Ｅｓｐｉｎｏｓａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１、第２７６巻、第２１号、１８３３７〜１８３４４）に記載の方法でサイトカイン分泌を求めることができる。簡単に説明すると、γδ Ｔ１０４個／ウェルの細胞を刺激物プラス２５単位のＩＬ２／ウェルと一緒に培養液１００μｌ中で３７℃で２４時間インキュベートした。続いて、この上清５０μｌを、培養液にアクチノマイシンＤ（２μｇ／ｍｌ）とＬｉＣｌ（４０ｍＭ）を加えたものに細胞３×１０４個／ウェルで蒔いたＷＥＨＩ細胞５０μｌに加え、３７℃で２０時間インキュベートした。ＴＮＦ−α感受性細胞の生存度を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドアッセイで求めた。１ウェルあたり３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ；リン酸緩衝生理食塩水中、２．５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加え、３７℃で４時間のインキュベーション後、可溶化バッファ（２０％ＳＤＳ、６６％ジメチルホルムアミド、ｐＨ４．７）５０μｌを加え、吸光度（５７０ｎｍ）を測定した。続いて、精製ヒトγＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ロッキーヒル（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ））を用いて得た標準曲線から、ＴＮＦ−α放出のレベルを算出した。活性化Ｔ細胞によって放出されたインターフェロン−γを、サンドイッチ酵素結合免疫酵素測定アッセイで測定した。γδ Ｔ５×１０４個／ウェルの細胞を、刺激物プラス２５単位のＩＬ２／ウェルと一緒に培養液１００μｌ中にて３７℃で２４時間インキュベートした。続いて、マウスモノクローナル抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ、カリフォルニア州カマリロ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ））を用いた酵素結合免疫酵素測定アッセイ用に上清５０μｌを収集した。
細胞溶解活性に合った好ましいアッセイのひとつが５１Ｃｒ放出アッセイである。典型的なアッセイでは、自家の正常細胞系および腫瘍標的細胞系、あるいはＤａｕｄｉなどの対照の感受性標的細胞系やＲａｊｉなどの対照の耐性標的細胞系といったγδ Ｔ細胞の細胞溶解活性を４ｈ ５１Ｃｒ放出アッセイで測定する。具体例では、標的細胞を細胞２×１０３個／ウェルの量で利用し、１００μＣｉ ５１Ｃｒで６０分間標識した。エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比については３０：１から３．７５：１の範囲とした。標準的な式［（実験−自発的放出／合計−自発的放出）×１００］を利用して比溶解（パーセンテージで表現）を算出する。
もうひとつの態様では、本発明は、疾患、特に増殖性疾患、一層好ましくは固形腫瘍、特に転移した固形腫瘍の処置方法であって、γδ Ｔ細胞活性化因子、特に式Ｉ〜ＸＶＩＩに記載のγδ Ｔ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰと、ＣＢｒＨＰＰと、ＨＤＭＡＰＰ ＨＤＭＡＰＰと、ｅｐｏｘＰＰと、からなる群から選択されるγδ Ｔ細胞活性化因子を、被検体でγδ Ｔ細胞個体群の増殖を刺激でき、特に全循環リンパ球の３０〜９０％、一般に４０〜９０％、一層好ましくは５０〜９０％を達成するのに十分な量と条件で投与する方法に関するものである。一般的な実施形態では、本発明は、被検体でのγδ Ｔ細胞の選択的増殖を全循環リンパ球の６０〜９０％、好ましくは７０〜９０％、一層好ましくは８０〜９０％にできるものである。全循環リンパ球のパーセンテージについては、従来技術において周知の方法で求めることができる。全循環リンパ球中のγδ Ｔ細胞のパーセンテージを求めるための好ましい方法のひとつに、適切なプロトコールの例を本明細書に記載の例で説明するフローサイトメトリーを利用するものがある。
もうひとつの実施形態では、本発明は、疾患、特に増殖性疾患、一層好ましくは固形腫瘍、特に転移した固形腫瘍の処置方法であって、γδ Ｔ細胞活性化因子、特に式Ｉ〜ＸＶＩＩに記載のγδ Ｔ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰと、ＣＢｒＨＰＰと、ＨＤＭＡＰＰ ＨＤＭＡＰＰと、ｅｐｏｘＰＰと、からなる群から選択されるγδ Ｔ細胞活性化因子を、被検体でγδ Ｔ細胞個体群の増殖を刺激でき、特に被検体におけるγδ Ｔ細胞の数を２倍よりも増加、一般に少なくとも１０倍、一層好ましくは少なくとも２０倍増加するのに十分な量と条件で投与する方法に関するものである。一般的な実施形態では、本発明は、被検体におけるγδ Ｔ細胞の選択的増殖を、被検体におけるγδ Ｔ細胞数の少なくとも２、４、１０、２０または５０倍、一層好ましくは少なくとも１００または２００倍に増加できるものである。被検体のγδ Ｔ細胞数については、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の投与前後に患者から血液試料を得て、試料中に含まれるγδ Ｔ細胞数の差を求めることで評価すると好ましい。γδ Ｔ細胞数を求めるための好ましい方法のひとつに、適切なプロトコールの例を本明細書に記載の例で説明するフローサイトメトリーを利用するものがある。
もうひとつの態様では、本発明は、疾患、特に増殖性疾患、一層好ましくは固形腫瘍、特に転移した固形腫瘍の処置方法であって、γδ Ｔ細胞活性化因子、特に式Ｉ〜ＸＶＩＩに記載のγδ Ｔ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰと、ＣＢｒＨＰＰと、ＨＤＭＡＰＰ ＨＤＭＡＰＰと、ｅｐｏｘＰＰと、からなる群から選択されるγδ Ｔ細胞活性化因子を、被検体でγδ Ｔ細胞個体群の増殖を刺激でき、特に被検体における循環γδ Ｔ細胞数として少なくともγδ Ｔ細胞５００個／ｍｍ３、一般に少なくともγδ Ｔ細胞１０００個／ｍｍ３、一層好ましくは少なくともγδ Ｔ細胞２０００個／ｍｍ３を達成するのに十分な量と条件で投与する。被検体の循環γδ Ｔ細胞数については、前記γδ Ｔ細胞活性化因子の投与前後に患者から血液試料を得て、一定容量の試料に含まれるγδ Ｔ細胞数を求めることで評価すると好ましい。γδ Ｔ細胞数を求めるための好ましい方法のひとつに、適切なプロトコールの例を本明細書に記載の例で説明するフローサイトメトリーを利用するものがある。
さらなる態様では、本発明は、増殖性疾患、特に固形腫瘍、さらには転移した固形腫瘍を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、γδ Ｔ細胞活性化因子、特に式Ｉ〜ＸＶＩＩに記載のγδ Ｔ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰと、ＣＢｒＨＰＰと、ＨＤＭＡＰＰ ＨＤＭＡＰＰと、ｅｐｏｘＰＰと、からなる群から選択されるγδ Ｔ細胞活性化因子を、γδ Ｔ細胞生物活性または個体群増殖についての最大の効果の半分が得られる単回投与有効濃度値（ＥＣ５０）よりも高い（好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％高い）用量、あるいは一層好ましくは、最大の効果が得られる単回投与有効濃度値の少なくとも５０％、または一層好ましくは少なくとも６０％、７５％、８５％または好ましくは約５０％から１００％の用量で温血動物、特にヒトに投与する療法に関するものである。
好ましい態様では、好ましくは各々が本明細書にて記載の用量範囲内にある１とおりまたはそれ以上（好ましくは少なくとも２とおり）のさらなる用量を、特に処置サイクル間の間隔を前の処置後から１週間より長くした、あるいは好ましくは２週間よりも長くした、一層好ましくは前の処置後から約２から約８週間、最も好ましくは約３から約４週間後とした、１または好ましくは２以上のさらなる処置サイクルで投与する。通常、２以上の処置サイクルで、１から８週間、好ましくは３から４週間の投与間隔をあけて一用量を投与する上記の処置計画の方が、もっと低用量で頻繁に処置を行い、γδ Ｔ細胞生物活性の増加量が少ない、あるいはγδ Ｔ細胞個体群の増殖が少ない方法よりも好ましい。
好ましくは、処置のための式Ｉの化合物の薬用量（単回投与）は約１μｇ／ｋｇおよび約１．２ｇ／ｋｇである。
化合物群に関連した上記の薬用量ならびに個々の化合物については、代表的な化合物について本明細書でさらに説明するように、最適な用量に変更できる点は明らかであろう。それにもかかわらず、γδ Ｔ細胞の生物活性を有意に増大する、あるいは被検体におけるγδ Ｔ細胞個体群を有意に増加するのに十分な用量の化合物を投与すると好ましい。前記用量をヒトに投与する際には、２から１８０分間、好ましくは２から１２０分間、一層好ましくは約５から約６０分間、あるいは最も好ましくは約３０分間または約６０分間での静脈内（ｉ．ｖ．）投与を利用すると好ましい。
好ましい代表的な化合物では、式ＩＩからＸＩの化合物を、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５μｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇの薬用量（単回投与）で投与する。最も好ましくは、３週間ごとまたは４週間ごとに処置を行う（３週間に１回または３週目ごとの処置）薬用量（単回投与）は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５μｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇである。この用量をヒトに投与する際には、２から１８０分間、好ましくは２から１２０分間、一層好ましくは約５から約６０分間、あるいは最も好ましくは約３０分間または約６０分間での静脈内（ｉ．ｖ．）投与を利用すると好ましい。
好ましい代表的な化合物では、式ＸＩＩからＸＶＩＩの化合物を、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇの薬用量（単回投与）で投与する。最も好ましくは、３週間ごとまたは４週間ごとに処置を行う（３週間に１回または３週目ごとの処置）薬用量（単回投与）は、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇである。この用量をヒトに投与する際には、２から１８０分間、好ましくは２から１２０分間、一層好ましくは約５から約６０分間、あるいは最も好ましくは約３０分間または約６０分間での静脈内（ｉ．ｖ．）投与を利用すると好ましい。
他の態様では、γδ Ｔ細胞活性化因子の薬用量を、非ヒト動物でのその最大耐量または最高被検量の関数として求めることができる。よって、本発明は、増殖性疾患、特に固形腫瘍、さらには転移した固形腫瘍を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、γδ Ｔ細胞活性化因子、特に式Ｉに記載のγδ Ｔ細胞活性化因子、特にＢｒＨＰＰと、ＣＢｒＨＰＰと、ＨＤＭＡＰＰ ＨＤＭＡＰＰと、ｅｐｏｘＰＰと、からなる群から選択されるγδ Ｔ細胞活性化因子を、（単回投与）最大耐量（ＭＴＤ）の約１から約１００％、好ましくは約２５から１００％の用量で、温血動物、特にヒトに投与する療法について開示するものである。
処置サイクル
別の方法において、本発明者らは、γδ Ｔ細胞調節ピロホスフェート化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの動態に基づいてγδ Ｔ細胞活性の調節を改善する投与計画を考案した。
本発明は、哺乳動物の被検体でのγδ Ｔ細胞の活性の調節方法であって、化合物の２回目の投与前に、γδ Ｔ細胞活性、好ましくはγδ Ｔ細胞率（γδ Ｔ細胞数）を実質的に基線の率に戻すことのできる処置サイクルに従って、投与を必要としている被検体に、γδ Ｔ細胞活性化因子を有効量で投与する方法を提供するものである。本明細書にてさらに説明するように、好ましい実施形態では、患者のγδ Ｔ細胞率が実質的に基線の率に戻るまでには少なくとも約１週間であるが、一層好ましくは少なくとも約２週間必要である。
実施例でさらに示すように、本発明者らは、サイクルが約７日間よりも短いとγδ Ｔ細胞活性の好適な刺激を得られないことを見いだした。好ましいサイクルの過程は、少なくとも１週ごとのサイクルであるが、一層好ましくは少なくとも２週ごとのサイクル（少なくとも約１４日間）、あるいは一層好ましくは少なくとも３週間ごとまたは４週間ごとであるとはいえ、２週から４週間ごとの範囲内でいずれかの日数でのサイクルであれば好ましい。また、同じく有効であると思われるのが、最大８週間ごと、すなわちたとえば５週間ごと、６週間ごと、７週間ごとまたは８週間ごとのサイクルである。
好ましい一実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与を２週間ごとから４週間ごとのサイクル（すなわち、約１４日から２８日周期で繰り返すサイクル）の初日に行う。好ましい実施形態では、２週ごとから４週間ごと、あるいは好ましくは３週間ごとのサイクルの初日にのみγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。
好ましい実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与を１週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日に行う。好ましい実施形態では、１週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日にのみγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。好ましい実施形態では、１週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日にのみγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。
特に好ましい実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与を３週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日に行う。好ましい実施形態では、３週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日にのみγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。好ましい実施形態では、３週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日にのみγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する。
上述したように、好ましくは少なくとも２サイクル、あるいは一層好ましくは少なくとも３サイクルにわたって被検体の処置を行う。他の態様では、さらに多くのサイクル数で処置を継続してもよく、たとえば、少なくとも４、５、６またはさらに多くのサイクル数が考えられる。各サイクルの最後に、腫瘍が制御されるか腫瘍退縮が起こるまで、そして臨床的に寛容のある限り投薬サイクルを繰り返してもよい。腫瘍の「制御」は上記にて定義したとおり十分に知られている臨床パラメータである。好ましい実施形態では、投薬サイクルを最大約８サイクルまで繰り返す。
サイトカインでの同時処置
他の実施形態では、本発明の方法はサイトカインを投与することをさらに含む。本発明の化合物についてはさらに他の投与と併用してもよいし併用しなくてもよいが、好ましい態様では、サイトカインを投与することが可能であり、この場合の前記サイトカインは、γδ Ｔ細胞活性化化合物で処置したγδ Ｔ細胞個体群の増殖を亢進することができ、好ましくは、サイトカインによってγδ Ｔ細胞個体群の増殖を誘導でき、これがγδ Ｔ細胞活性化化合物を前記サイトカインのない状態で投与したときに得られる増殖量よりも多い。好ましいサイトカインのひとつにインターロイキン−２ポリペプチドがある。
γδ Ｔ細胞増殖誘導活性のあるサイトカイン、最も好ましくはインターロイキン−２ポリペプチドを、一般に１から１０日間の時間をかけて低用量で投与する。γδ Ｔ細胞活性化因子については、一般にはサイクルの開始時に単回用量で投与すると好ましい。
好ましい態様では、サイトカイン、最も好ましくはＩＬ−２を、毎日から最大で約１０日間、好ましくは約３日から１０日の期間、あるいは最も好ましくは約７日間投与する。好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子の投与と同日（２４時間以内など）にサイトカインの投与を開始する。サイトカインについては、約３日から１０日の前記療法内の好適なスキームで投与可能であることは理解できよう。たとえば、一態様では、サイトカインを毎日投与するのに対し、他の態様ではサイトカインを毎日投与する必要はない。サイトカインを約７日から約１４日間投与する場合、４週間ごとの処置サイクルが好ましい。最初の成分を約４日間投与する場合、３週間ごとに１日の処置サイクルが好ましい。
よって、本発明は、合成γδ Ｔ細胞活性化因子とサイトカインの使用方法にも関するものである。最も好ましい実施形態では、このサイトカインはインターロイキン−２ポリペプチドである。このサイトカインを利用して、哺乳動物の被検体でのγδ Ｔ細胞の活性調節用の製剤組成物を製造することができる。具体的には、γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを別々に投与する。なお一層好ましくは、インターロイキン−２ポリペプチドを、一般に１から１０日間の時間をかけて低用量で投与する。好ましい実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化因子を、一般には処置開始時に単回用量で投与する。
特に、本発明は、γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを利用して、被検体のがんを処置するための製剤組成物を製造することに関するものであり、前記γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを別々に被検体に投与する。一層好ましくは、インターロイキン−２ポリペプチドを、一般に１から１０日間の時間をかけて低用量で投与および／またはγδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で処置開始時に投与する。
他の具体的な実施形態では、本発明は、γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを利用して、被検体の感染症を処置するための製剤組成物を製造することに関するものであり、前記γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを別々に被検体に投与する。一層好ましくは、インターロイキン−２ポリペプチドを、一般に１から１０日間の時間をかけて低用量で投与および／またはγδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で処置開始時に投与する。
さらなる実施形態では、本発明は、γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを利用して、被検体の自己免疫疾患を処置するための製剤組成物を製造することに関するものであり、前記γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを別々に被検体に投与する。一層好ましくは、インターロイキン−２ポリペプチドを、一般に１から１０日間の時間をかけて低用量で投与および／またはγδ Ｔ細胞活性化因子を単回用量で処置開始時に投与する。
また、本発明は、被検体のがん、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を処置するための方法であって、投与が必要な被検体に、γδ Ｔ細胞活性化因子およびインターロイキン−２ポリペプチドを有効量で別々に投与することを含む方法に関するものである。
上記の方法ならびに処置については、単独で使用してもよいし、他の活性剤または処置との組み合わせで使用してもよい。たとえば、腫瘍を処置する場合、化学療法、放射線療法または遺伝子療法などの処置または他の抗腫瘍剤と本発明を併用することができる。
また、本発明は、哺乳動物の被検体でγδ Ｔ細胞の活性を調節する目的で、別々に使用できるγδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを含む製品にも関するものである。
好ましい実施形態では、γδ Ｔ活性化因子を用いての１回目の処置サイクルの間と以後のγδ Ｔ活性化因子での処置サイクルにサイトカインを投与する。しかしながら、１回目の処置サイクルではサイトカインを投与しないようにするなど、本発明の処置計画を変更してもよい点は理解できよう。すなわち、この方法は、
（ａ）１週間ごとから４週間ごとのサイクル、あるいは一層好ましくは２週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日に合成γδ Ｔ活性化因子を投与し、サイトカインを投与しない１回目の処置サイクルを被検体に少なくとも１回ほどこし、
（ｂ）１週間ごとから４週間ごとのサイクル、あるいは一層好ましくは２週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日に合成γδ Ｔ活性化因子を投与し、１日から約１０日の期間サイトカインを投与することを含む２回目の処置サイクルを少なくともほどこし、
（ｃ）場合により、工程（ｂ）を適当なサイクル数だけ繰り返すことを含み得る。
他の態様では、以後の１以上の処置サイクルではサイトカインを投与しないなど、本発明の処置計画を部分的に変更してもよい点は理解できよう。すなわち、この方法は、
（ａ）１週間ごとから４週間ごとのサイクル、あるいは一層好ましくは２週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日に合成γδ Ｔ活性化因子を投与し、１日から約１０日の期間サイトカインを投与することを含む１回目の処置サイクルを被検体に少なくとも１回ほどこし、
（ｂ）１週間ごとから４週間ごとのサイクル、あるいは一層好ましくは２週間ごとから４週間ごとのサイクルの初日に合成γδ Ｔ活性化因子を投与し、サイトカインを投与しない２回目の処置サイクルを少なくともほどこし、
（ｃ）場合により、工程（ａ）または（ｂ）を適当なサイクル数だけ繰り返すことを含む。
使用形態
本明細書にて開示するように、γδ Ｔ細胞活性化因子はシングルショットで投与すると好ましいものである。２回以上の投与がなされる処置に用いる場合、処置サイクルの開始時にγδ Ｔ細胞活性化因子をシングルショットで投与すると好ましい。実験に関するセクションで説明するように、このような投与スケジュールによって、被検体でのγδ Ｔ細胞の活性が顕著に増大する。活性成分については、一般には注射または経口投与などの異なる経路で投与できる。注射は、静脈内注射、腹腔内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射などの形でさまざまな組織に実施できるものである。
最も好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子を静脈内（ｉ．ｖ．）投与によって投与する。好ましくは、前記注入を２から１８０分間、好ましくは２から１２０分間、一層好ましくは約５から約３０分間、最も好ましくは約１０から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間をかけて行う。本明細書にてさらに説明するように、本発明は、γδ Ｔ細胞調節作用を得るにはγδ Ｔ細胞活性の軽い刺激で十分であることを開示するものである。よって、好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化化合物の血清半減期が、たとえば血清半減期約４８時間未満、約２４時間未満または約１２時間未満といった具合に短いときには、短時間で注入を行う。前記短時間での注入については、好ましくは約１０分間から６０分間、あるいは一層好ましくは約３０分間行う。
投与計画にγδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドの両方が含まれる場合、前記化合物を別々に投与するのが好ましい。本発明に関する限り、「別々に投与する」という表現は、異なる部位に、あるいは異なる経路で、あるいは異なるスケジュールで活性成分を被検体に投与することを示す。このため、通常は投与前に成分同士が混合されることはないが、適宜分離させた容器に入れて独特なパッケージで組み合わせるようにしてもよい。
好ましい実施形態では、活性成分を異なるスケジュールで投与する。すなわち、合成γδ Ｔ細胞活性化因子を処置開始時にシングルショットで投与し、インターロイキン−２ポリペプチドを一般に１日から１０日間という長めの時間をかけて投与する。実験に関するセクションに示すように、このような投与スケジュールを用いると、被検体でのγδ Ｔ細胞の活性が顕著に増大する。
これらの活性成分については、一般には注射または経口投与などの異なる経路で投与できる。注射は、静脈内注射、腹腔内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射などの形でさまざまな組織に実施できるものである。合成活性化因子に好ましい投与経路は静脈内注射と筋肉内注射である。サイトカインに好ましい投与経路は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射である。
本発明の具体的な一実施形態は、（ｉ）ＰＥＤ化合物またはＰＨＤ化合物から選択される合成γδ Ｔ活性化因子と、（ｉｉ）インターロイキン−２ポリペプチドとを、被検体のがん、感染症または自己免疫疾患を処置するための製剤組成物の製造に利用することであって、前記合成γδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを別々に被検体に投与することに関するものである。一層好ましくは、インターロイキン−２ポリペプチドを、一般に１から１０日間の時間をかけて低用量で投与および／または合成γδ Ｔ活性化因子を単回用量で処置開始時に投与し、好ましくは０．５から８０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは１から６０、なお一層好ましくは２から６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
γδ Ｔ細胞活性化因子の薬用量
上述したように、γδ Ｔ細胞の活性を増大させる上でγδ Ｔ細胞活性化因子の投与に適した具体的な薬用量範囲を本明細書にて開示する。ただし、活性化因子の用量については、活性化因子の性質、その比活性、ＥＣ５０、安定性および／または薬物動態ならびに、被検体のタイプなどに応じて、当業者が適宜変更すればよいことは理解できよう。γδ Ｔ細胞活性化因子に関してこれを行うためのいくつかの方法も本明細書に記載しておく。好ましくは、γδ Ｔ細胞活性化因子を、０．０１から２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５から８０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは０．１から６０、なお一層好ましくは１から６０ｍｇ／ｋｇの用量でヒト被検者に投与する。活性化因子については、単回用量で処置開始時に投与してもよいし、数日間に分けて投与してもよい。しかしながら、本発明は、活性化因子を単回用量で処置開始時に投与すると有意に高い効果が得られることを示している。一般的な薬用量は１から６０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは１から５０ｍｇ／ｋｇである。適切な薬用量を推定するには、動物での実験を平均体重および平均体表面積で正規化して利用すればよい。たとえば、カニクイザル（平均体重約３ｋｇ、平均体表面積約０．３ｍ２）での有効用量２から３００ｍｇ／ｋｇが、ヒト被検者（平均体重約６５ｋｇ、平均体表面積約１．８ｍ２）での有効薬用量０．５から８０ｍｇ／ｋｇに相当することを算出できる。なお、合成活性化因子を用いてｉｎ ｖｉｖｏで観察される毒性が低いことに鑑みて、上記よりも多い薬用量を含め、上記とは異なる薬用量を利用してもよい点は理解されたい。
本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性に基づいて、他のγδ Ｔ細胞活性化因子に適した薬用量範囲を求める目的で利用できる方法を提供するものである。一態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏのγδ Ｔ細胞刺激活性の対応関係、特にＥＣ５０値の対応関係を示す、２種類のγδ Ｔ細胞活性化因子についてのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの用量作用曲線を提供するものである。よって、本発明は、γδ Ｔ細胞活性化因子の薬用量ならびに、本明細書に記載の例に基づいて前記被験化合物を被検者に投与する際の薬用量を求める方法を提供するものでもある。化合物に合った適切な薬用量範囲については、（ａ）好ましくは本明細書の例に記載のアッセイ法を利用して、化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏでのγδ Ｔ活性化力価を求め、（ｂ）被験化合物の前記活性と、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性が既知の化合物、好ましくはＢｒＨＰＰまたはＨＤＭＡＰＰ化合物を用いて得られたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性とを比較し、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性が既知の化合物の場合に比例させる形でｉｎ ｖｉｖｏでの薬用量または薬用量範囲をコンピュータで算出することで求められる。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を求めることには、ＥＣ５０を求めることが含まれる。このようにして、たとえば非ヒト哺乳動物の被検体、好ましくはカニクイザルでの研究に合った開始用量を選択する上で有用な薬用量の範囲を求めることができる。上記の範囲内で異なる用量を被検体に投与し、たとえば本明細書に記載のアッセイを利用してγδ Ｔ細胞活性を評価することで、さらに厳密な数値を得ることも可能である。
また、本発明は、γδ Ｔ細胞活性の増大を刺激するにはγδ Ｔ細胞活性の軽い刺激で十分だということを示すものでもある。よって、好適なγδ Ｔ細胞活性化化合物には、半減期の短い化合物と半減期の長い化合物とが含まれる。一態様では、血清半減期が、たとえば血清半減期約４８時間未満、約２４時間未満または約１２時間未満といった具合に短いγδ Ｔ細胞活性化因子を、γδ Ｔ細胞生物活性または個体群増殖についての最大の効果の半分（ＥＣ５０）が得られる単回投与有効濃度値よりも高い（好ましくは、ＥＣ５０の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％または１５０％）用量、あるいは一層好ましくは、少なくとも５０％、あるいは一層好ましくは、最大の効果が得られる単回投与有効濃度値の少なくとも６０％、７５％、８５％または好ましくは約５０％から１００％（ＥＣ１００）の用量で投与する。好ましくは、前記投与を約１０分間から約６０分間かけて静脈内注入により行う。
他の態様では、最大耐量（ＭＴＤ）の関数として適切な薬用量を求めることができる。ＭＴＤは標準的な手順で求められる。好ましくは、温血動物では、経口投与または静脈内投与の場合のＭＴＤを、死に至ることがなく、かつ、処置した温血動物の個体（この用語は、ここでは主に動物を示すもので、ヒトについては下記を参照のこと）で体重が４０パーセント（％）未満、好ましくは２５パーセント未満落ちる単回投与の用量として求める。動物での用量範囲の研究でＭＴＤが明らかにならなかった場合の他の態様では、試験を行った中で最も高い用量をＭＴＤに代えて利用してもよい。
ＭＴＤは、腫瘍のタイプ、年齢域、性別、腫瘍の段階などで定義できる患者の個体群次第で違ってくることがある。動物の場合、ＭＴＤを求める最も好ましい方法は、以下に示す実施例であげる方法に近いものでよいが、ヒトの場合、通常ＭＴＤは、毒物の研究がすでになされている最も感受性の高い動物種のＬＤ１０（すなわち、動物の１０％が死に至る致死用量）の１／１０など、極めて低用量での１単回投与から開始して求められる。次の用量レベルへの用量増分は、米国国立癌研究所の改訂共通毒性基準でみてグレード２の毒性が認められない限りは１００％であり、このような毒性が認められた場合は用量増分６７％になる。次の用量レベルへの用量増分は２５％から６７％の範囲である。たとえば、通常は患者３名を１用量レベルで処置し、一過程の処置で急性毒性について観察を行った上で、患者の人数を増やすようになっている。患者３名全員にＤＬＴ（用量限定毒性）が生じなければ、次の患者３名からなる集団に次に高い用量で処置を行う。この患者３名のうち２名以上でＤＬＴが生じた場合は、続いてさらに３名の患者を次に低い用量で処置するが、患者６名がすでにその用量で処置を受けている場合はこの限りではない。この用量で処置した患者３名のうち１名でＤＬＴが生じた場合は、さらに３名の患者を同じレベルで処置する。これらの患者間でのＤＬＴの発生率が六分の一であれば、次の集団を次に高い用量で処置する。通常、ある用量レベルで処置を行った患者６名のうち２名以上でＤＬＴが生じた場合に、ＭＴＤを超えたとみなし、さらに３名の患者を上述したようにして次に低い用量で処置する。ＭＴＤは、ＤＬＴの発生率が３３％未満で検討した中での最高用量として定義される。通常、同じ患者で以後の過程に用量を増分すること−−すなわち患者内での用量増分−−は認められない。あるいは、開始用量よりも後ろのレベルへの用量の増分が１００％、６７％、５０％および４０％であり、以後はどのレベルでも３３％になる、フィボナッチ数列を改変して用量段階を定義してもよい。最後に、Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８９（１５）、１９９７、ｐ．１１３８〜１１４７に記載の方法でＭＴＤを求めればよい。
ＤＬＴには通常、薬剤関連死と、発熱性好中球減少症（米国国立癌研究所の改訂共通毒性基準も参照のこと）を含むグレード３と４のほとんどの薬剤関連毒性が入る（が、これに限定されるものではない）。特に実施例を参照のこと。
上記の方法ならびに用途では、好ましくは被検体が、がん、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患のある被検体などの被検者である。本発明は特に、γδ Ｔ細胞溶解に対する感受性のある病的細胞が存在することで生じるあるいはこれに関連したあらゆる症状の処置に好適である。
本発明は特に、リンパ腫、膀胱がん、多発性骨髄腫、腎細胞癌などの固形腫瘍または造血腫瘍のある被検体の抗腫瘍免疫を刺激するのに適している。
それにもかかわらず、本発明は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ＨＢＶなどから選択されるウイルスに感染した被検体で抗ウイルス免疫応答を刺激するのにも適している。
また、本発明は、結核、マラリア、野兎病、大腸菌症などを引き起こす病原体に感染した被検体で免疫応答を刺激するのにも適している。
さらに、本発明は、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチなどの自己免疫疾患のある被検体、あるいは、喘息、気道過敏症などをはじめとするアレルギー疾患のある被検体を処置する（たとえば被検体の免疫応答を刺激するなど）にも適している。
特に明記しない限り、温血動物、特にヒトに投与する場合の本明細書にて記載の薬用量は、それぞれの化合物の純粋な形態（アニオン形態）でのものを示してある。合成バッチに左右される活性成分の純度レベルを利用して、実際の薬用量からアニオン形態へ、またその逆といった具合に薬用量を調節することが可能である。
合成γδ Ｔリンパ球活性化因子
本発明の有利な一態様が、合成γδ Ｔリンパ球活性化化合物を使用することにある。特に、本発明は、規定の活性化化合物を特定の投与スケジュールに沿って用いて、単一の代謝経路をトリガーすることで、γδ Ｔ細胞の持つ潜在的かつ標的となる増殖と活性化をｉｎ ｖｉｖｏで得られることを示すものである。
「合成γδ Ｔリンパ球活性化化合物」という用語と「合成γδ Ｔ細胞活性化化合物」という用語は同義であり、γδ Ｔリンパ球を活性化することが可能な人工生成分子を示す。さらに、合成γδ Ｔリンパ球活性化化合物という用語は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成される分子を示す。一層好ましくは、γδ Ｔリンパ球のＴ受容体のリガンドである。活性化因子は、ペプチド、脂質、小分子など、さまざまな性質のもので構わない。精製あるいは（化学合成または微生物学的プロセスによって）人工的に生成された内在性リガンドまたは断片またはその誘導体、あるいは実質的に同じ抗原特異性を持つ抗体であってもよい。活性化因子は、最も好ましくは、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球を選択的に活性化できる合成化合物である。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の選択的活性化とは、その化合物に、特定の細胞個体群に対する選択的作用があり、基本的にＶδ１ Ｔ細胞などの他のＴ細胞サブタイプを活性化することはないことを示す。このような選択性は、本願に開示のとおり、好ましい化合物がＶγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の増殖または生物活性の選択的活性化または標的活性化を引き起こし得ることを示唆している。
好ましくは、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、培養中にてγδ Ｔ細胞クローンの個体群でγδ Ｔ細胞の活性を調節できる化合物である。合成γδ Ｔリンパ球は、好ましくは培養中にγδ Ｔ細胞活性化因子が１００ｍＭ未満の濃度で含まれるときに、ミリモル濃度でγδ Ｔ細胞クローンのγδ Ｔ細胞個体群の活性を調節できる。場合により、合成γδ Ｔリンパ球は、好ましくは培養中にγδ Ｔ細胞活性化因子が１０ｍＭ未満の濃度で含まれ、あるいは一層好ましくは１ｍＭの濃度で含まれるときに、ミリモル濃度でγδ Ｔ細胞クローンの個体群でのγδ Ｔ細胞の活性を調節できる。本明細書にて記載のように、γδ Ｔ細胞の活性の調節については、好ましくはサイトカイン分泌を評価し、最も好ましくはＴＮＦ−α分泌を評価するなどの好適な手段で、評価することが可能なものである。なお、純粋なγδ Ｔ細胞クローンの個体群を得るための方法が、Ｄａｖｏｄｅａｕら（１９９３）およびＭｏｒｅａｕら（１９８６）に記載されており、これらの開示内容を本明細書に援用する。好ましくは、この化合物は、培養中のγδ Ｔ細胞数を少なくとも２０％、５０％またはそれ以上増やすことができ、あるいは一層好ましくは、培養中のγδ Ｔ細胞数を少なくとも２倍にできるものである。
合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（Ｉ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｃａｔ＋は、１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を示し、
ｍは１から３の整数であり、
Ｂは、Ｏ、ＮＨまたは加水分解可能な任意の基であり、
Ｙ＝Ｏ−Ｃａｔ＋、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、基−Ａ−Ｒであるか、ヌクレオシドと、オリゴヌクレオチドと、核酸と、アミノ酸と、ペプチドと、タンパク質と、単糖と、オリゴ糖と、多糖と、脂肪酸と、単純脂質と、複合脂質と、葉酸と、テトラヒドロ葉酸と、リン酸と、イノシトールと、ビタミンと、補酵素と、フラボノイドと、アルデヒドと、エポキシドと、ハロヒドリンと、からなる群から選択されるラジカルであり、
Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、
Ｒは、場合により少なくとも１個のヘテロ原子で中断された、直鎖状、分枝状または環状の、芳香族または非芳香族の、飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ５０炭化水素基であり、前記炭化水素基は、アルキルと、アルキレニルと、アルキニルと、エポキシアルキルと、アリールと、複素環と、アルコキシと、アシルと、アルコールと、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）と、エステルと、アミンと、アミノ基（−ＮＨ２）と、アミド（−ＣＯＮＨ２）と、イミンと、ニトリルと、ヒドロキシル（−ＯＨ）と、アルデヒド基（−ＣＨＯ）と、ハロゲンと、ハロゲノアルキルと、チオール（−ＳＨ）と、チオアルキルと、スルホンと、スルホキシドと、これらの組み合わせと、からなる群から選択される１個またはいくつかの置換基で置換可能である、アルキル、アルキレニルまたはアルキニルを含み、好ましくはアルキルまたはアルキレンを含む。
特定の実施形態において、上記にて定義したような置換基は、上に明記した置換基のうちの少なくとも１つで置換される。
好ましくは、置換基は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルと、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレニルと、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルと、（Ｃ２〜Ｃ６）エポキシアルキルと、アリールと、複素環と、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシと、（Ｃ２〜Ｃ６）アシルと、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコールと、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）と、（Ｃ２〜Ｃ６）エステルと、（Ｃ１〜Ｃ６）アミンと、アミノ基（−ＮＨ２）と、アミド（−ＣＯＮＨ２）と、（Ｃ１〜Ｃ６）イミンと、ニトリルと、ヒドロキシル（−ＯＨ）と、アルデヒド基（−ＣＨＯ）と、ハロゲンと、（Ｃ１〜Ｃ６）ハロゲノアルキルと、チオール（−ＳＨ）と、（Ｃ１〜Ｃ６）チオアルキルと、（Ｃ１〜Ｃ６）スルホンと、（Ｃ１〜Ｃ６）スルホキシドと、これらの組み合わせと、からなる群から選択される。
一層好ましくは、置換基は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルと、（Ｃ２〜Ｃ６）エポキシアルキルと、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレニルと、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシと、（Ｃ２〜Ｃ６）アシルと、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコールと、（Ｃ２〜Ｃ６）エステルと、（Ｃ１〜Ｃ６）アミンと、（Ｃ１〜Ｃ６）イミンと、ヒドロキシルと、アルデヒド基と、ハロゲンと、（Ｃ１〜Ｃ６）ハロゲノアルキルと、これらの組み合わせと、からなる群から選択される。
なお一層好ましくは、置換基は、（Ｃ３〜Ｃ６）エポキシアルキルと、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシと、（Ｃ２〜Ｃ３）アシルと、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコールと、（Ｃ２〜Ｃ３）エステルと、（Ｃ１〜Ｃ３）アミンと、（Ｃ１〜Ｃ３）イミンと、ヒドロキシルと、ハロゲンと、（Ｃ１〜Ｃ３）ハロゲノアルキルと、これらの組み合わせと、からなる群から選択される。好ましくは、Ｒは（Ｃ３〜Ｃ２５）炭化水素基であり、一層好ましくは（Ｃ５〜Ｃ１０）炭化水素基である。
本発明に関する限り、「アルキル」という用語は、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ヘンエイコシル、ドコシルならびに、これらの他の異性体などの基を意味する。（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルならびに、これらの他の異性体を意味する。（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルは、具体的には、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルを意味する。
「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの不飽和エチレン結合を有する、上記にて定義したアルキル基を示し、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの不飽和アセチレン結合を有する、上記にて定義したアルキル基を示す。（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレンとしては、エテニル、プロペニル（１−プロペニルまたは２−プロペニル）、１−または２−メチルプロペニル、ブテニル（１−ブテニル、２−ブテニルまたは３−ブテニル）、メチルブテニル、２−エチルプロペニル、ペンテニル（１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル）、ヘキセニル（１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル）ならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルとしては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニルまたは５−ヘキシニルならびに、これらの他の異性体があげられる。
「エポキシアルキル」という用語は、エポキシド基を有する、上記にて定義したアルキル基を示す。特に、（Ｃ２〜Ｃ６）エポキシアルキルとしては、エポキシエチル、エポキシプロピル、エポキシブチル、エポキシペンチル、エポキシヘキシルならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ２〜Ｃ３）エポキシアルキルとしては、エポキシエチルおよびエポキシプロピルがあげられる。
「アリール」基は、６から１８個の炭素原子を有する、単環式芳香族炭化水素、二環式芳香族炭化水素または三環式芳香族炭化水素である。一例として、特に、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチルまたはアントラセニル基があげられる。
「複素環」基は、１以上のヘテロ原子、好ましくは１から５個の環内ヘテロ原子を有する、５から１８個の環を含む基である。これらの基は、単環式や二環式であってもよいし、三環式であってもよい。また、芳香族であってもなくても構わない。好ましくは、かつＲ５については具体的に、これらの基は芳香族複素環である。芳香族複素環の例としては、ピリジン基、ピリダジン基、ピリミジン基、ピラジン基、フラン基、チオフェン基、ピロール基、オキサゾール基、チアゾール基、イソチアゾール基、イミダゾール基、ピラゾール基、オキサジアゾール基、トリアゾール基、チアジアゾール基、トリアジン基があげられる。二環の例としては、特に、キノリン基、イソキノリン基、キナゾリン基（２個の６員環の場合）ならびにインドール、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、インダゾール（６員環および５員環の場合）があげられる。非芳香族複素環は、特に、ピペラジン、ピペリジンなどを含む。
「アルコキシ」基は、−Ｏ−（エーテル）結合によって分子に結合した、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシとしては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシとしては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシがあげられる。
「アルシル（ａｌｃｙｌ）」基は、−ＣＯ−（カルボニル）基によって分子に結合した、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ２〜Ｃ６）アシルとしては、アセチル、プロピルアシル、ブチルアシル、ペンチルアシル、ヘキシルアシルならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ２〜Ｃ３）アシルとしては、アセチル、プロピルアシル、イソプロピルアシルがあげられる。
「アルコール」基は、少なくとも１個の水酸基を含有する、上記にて定義したアルキル基に相当する。このアルコールには、第１級、第２級または第３級が可能である。（Ｃ１〜Ｃ６）アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールがあげられる。
「エステル」基は、−ＣＯＯ−（エステル）結合によって分子に結合した、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ２〜Ｃ６）エステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステルならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ２〜Ｃ３）エステルとしては、メチルエステルおよびエチルエステルがあげられる。
「アミン」基は、−Ｎ−（アミン）結合によって分子に結合した、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ１〜Ｃ６）アミンとしては、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミンならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）アミンとしては、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミンがあげられる。
「イミン」基は、（−Ｃ＝Ｎ−）結合を有する、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ１〜Ｃ６）イミンとしては、メチルイミン、エチルイミン、プロピルイミン、ブチルイミン、ペンチルイミン、ヘキシルイミンならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）イミンとしては、メチルイミン、エチルイミン、プロピルイミンがあげられる。
ハロゲンには、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが可能であり、一層好ましくはＢｒまたはＦである。
「ハロゲノアルキル」基は、少なくとも１個のハロゲンを有する、上記にて定義したアルキル基に相当する。これらの基には、同一または異なるハロゲン原子を含有する、モノハロゲン化または多ハロゲン化したものが可能である。たとえば、この基には、トリフルオロアルキル（ＣＦ３−Ｒ）が可能である。（Ｃ１〜Ｃ６）ハロゲノアルキルとしては、ハロゲノメチル、ハロゲノエチル、ハロゲノプロピル、ハロゲノブチル、ハロゲノペンチル、ハロゲノヘキシルならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）ハロゲノアルキルとしては、ハロゲノメチル、ハロゲノエチル、ハロゲノプロピルがあげられる。
「チオアルキル」基は、−Ｓ−（チオエーテル）結合によって分子に結合した、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ１〜Ｃ６）チオアルキルとしては、チオメチル、チオエチル、チオプロピル、チオブチル、チオペンチル、チオヘキシルならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）チオアルキルとしては、チオメチル、チオエチル、チオプロピルがあげられる。
「スルホン」基は、−ＳＯＯ−（スルホン）結合によって分子に結合した、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ１〜Ｃ６）スルホンとしては、メチルスルホン、エチルスルホン、プロピルスルホン、ブチルスルホン、ペンチルスルホン、ヘキシルスルホンならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）スルホンとしては、メチルスルホン、エチルスルホン、プロピルスルホンがあげられる。
「スルホキシド」基は、−ＳＯ−（スルホキシド）基によって分子に結合した、上記にて定義したアルキル基に相当する。（Ｃ１〜Ｃ６）スルホキシドとしては、メチルスルホキシド、エチルスルホキシド、プロピルスルホキシド、ブチルスルホキシド、ペンチルスルホキシド、ヘキシルスルホキシドならびに、これらの他の異性体があげられる。（Ｃ１〜Ｃ３）スルホキシドとしては、メチルスルホキシド、エチルスルホキシド、プロピルスルホキシド、イソプロピルスルホキシドがあげられる。
「ヘテロ原子」は、Ｎ、ＳまたはＯを示す。
「ヌクレオシド」としては、アデノシン、チミン、ウリジン、シチジンおよびグアノシンがあげられる。
特定の実施形態では、炭化水素基はシクロペンタジエンまたはフェニルなどのシクロアルキレニルであるか、あるいは、フラン、ピロール、チオフェン、チアゾール、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピランまたはピラジンなどの複素環である。好ましくは、シクロアルキレニルまたは複素環は、シクロペンタジエン、ピロールまたはイミダゾールからなる群から選択される。好ましい実施形態では、シクロアルキレニルまたは複素環はアルコールによって置換される。好ましくは、前記アルコールは（Ｃ１〜Ｃ３）アルコールである。
他の実施形態では、炭化水素基は、１個または数個の二重結合を持つアルキレニルである。好ましくは、このアルキレニル基には二重結合が１個ある。好ましくは、アルキレニル基は（Ｃ３〜Ｃ１０）アルキレニル基であり、一層好ましくは（Ｃ４〜Ｃ７）アルキレニル基である。好ましくは、前記アルキレニル基は少なくとも１個の官能基で置換される。一層好ましくは、この官能基は、ヒドロキシ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ、アルデヒド、（Ｃ２〜Ｃ３）アシルまたは（Ｃ２〜Ｃ３）エステルからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、炭化水素基は、基−ＣＨ２ＯＨで置換されたブテニルである。場合により、前記アルケニル基には、トランス（Ｅ）またはシス（Ｚ）型のアイソフォームが可能であり、一層好ましくはトランスアイソフォーム（Ｅ）である。最も好ましい実施形態では、アルキレニル基は（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニルである。他の好ましい実施形態では、アルキレニル基は、イソペンテニル、ジメチルアリルまたはヒドロキシジメチルアリルである。
別の実施形態では、炭化水素基はアシルで置換されたアルキル基である。一層好ましくは、炭化水素基は、（Ｃ１〜Ｃ３）アシルで置換された（Ｃ４〜Ｃ７）アルキル基である。
さらに好ましい実施形態では、Ｒは以下の選択肢からなる群から選択される。
Figure 2006510629
式中、ｎは２から２０の整数であり、Ｒ１は（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ２は、ハロゲン化（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ハロゲン化（Ｃ２〜Ｃ３）アシルまたは（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ−（Ｃ２〜Ｃ３）アシルである。好ましくは、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｒ２はハロゲン化メチル（−ＣＨ２−Ｘ、Ｘはハロゲンである）、ハロゲン化（Ｃ２〜Ｃ３）アセチルまたは（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ−アセチルである。ハロゲン化メチルまたはアセチルには、モノハロゲン化、ジハロゲン化またはトリハロゲン化したものが可能である。好ましくは、ｎは２から１０の整数であるか、２から５の整数である。一層好ましい実施形態では、ｎは２である。最も好ましい実施形態では、ｎは２であり、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はハロゲン化メチルであり、一層好ましくはモノハロゲン化メチルであり、なお一層好ましくは臭化メチルである。特に好ましい実施形態では、ｎは２であり、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は臭化メチルである。最も好ましい実施形態では、Ｒは３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イルである。
Figure 2006510629
式中、ｎは２から２０の整数であり、Ｒ１はメチル基またはエチル基である。好ましくは、ｎは２から１０の整数であるか、２から５の整数である。一層好ましい実施形態では、ｎは２であり、Ｒ１はメチルである。
Figure 2006510629
式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一であっても異なっていてもよく、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｗは−ＣＨ−または−Ｎ−であり、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ３）アシル、アルデヒド、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコールまたは（Ｃ２〜Ｃ３）エステルである。一層好ましくは、Ｒ３およびＲ５はメチルであり、Ｒ４は水素である。一層好ましくは、Ｒ６は、−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯ−ＣＨ３または−ＣＯ−ＯＣＨ３である。場合により、ＷとＣとの間の二重結合はトランス（Ｅ）またはシス（Ｚ）の立体配座である。一層好ましくは、ＷとＣとの間の二重結合はトランス（Ｅ）の立体配座である。
基Ｙはプロドラッグの設計を可能にするものである。したがって、Ｙは、被検体の特定の領域で切断可能な酵素不安定基（ｅｎｚｙｍｏｌａｂｉｌｅ ｇｒｏｕｐ）である。基Ｙはまた、標的基であってもよい。好ましい実施形態では、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、基−Ａ−Ｒであるか、ヌクレオシドと、単糖と、エポキシドと、ハロヒドリンと、からなる群から選択されるラジカルである。好ましくは、Ｙは酵素不安定基である。好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、基−Ａ−Ｒであるか、またはヌクレオシドである。第１の好ましい実施形態では、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋である。第２の好ましい実施形態では、Ｙはヌクレオシドである。
好ましい実施形態では、Ｃａｔ＋はＨ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、（ＣＨ３ＣＨ２）３ＮＨ＋である。
好ましい実施形態では、Ａは、Ｏ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２である。一層好ましくは、ＡはＯまたはＣＨ２である。
好ましい実施形態では、Ｂは、ＯまたはＮＨである。一層好ましくは、ＢはＯである。
好ましい実施形態では、ｍは１または２である。一層好ましくは、ｍは１である。
特定の一実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＩＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｘはハロゲン（好ましくは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌから選択される）であり、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ｎは２から２０の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）である。好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋であるか、またはヌクレオシドである。一層好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋である。好ましくは、Ｒ１はメチルである。好ましくは、ＡはＯまたはＣＨ２である。一層好ましくは、ＡはＯである。好ましくは、ｎは２である。好ましくは、Ｘは臭化物である。好ましくは、ＢはＯである。好ましくは、ｍは１または２である。一層好ましくは、ｍは１である。
たとえば、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
Figure 2006510629
式中、Ｘ、Ｒ１、ｎ、ｍおよびＹは上述した意味を持つ。
好ましい一実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（Ｖ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｘはハロゲン（好ましくは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌから選択される）であり、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ｎは２から２０の整数である。好ましくは、Ｒ１はメチルである。好ましくは、ｎは２である。好ましくは、Ｘは臭化物である。
最も好ましい実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＶＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
好ましくは、ｘ Ｃａｔ＋は１または２Ｎａ＋である。
他の最も好ましい実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＶＩＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
好ましくは、ｘ Ｃａｔ＋は１または２Ｎａ＋である。
特定の一実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＶＩＩＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、ｎは２から２０の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）である。好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋であるか、またはヌクレオシドである。一層好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋である。好ましくは、Ｒ１はメチルである。好ましくは、ＡはＯまたはＣＨ２である。一層好ましくは、ＡはＯである。好ましくは、ｎは２である。好ましくは、ＢはＯである。好ましくは、ｍは１または２である。一層好ましくは、ｍは１である。
たとえば、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＩＸ）または式（Ｘ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｒ１、ｎ、ｍおよびＹは上述した意味を持つ。
好ましい一実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＸＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ｎは２から２０の整数である。好ましくは、Ｒ１はメチルである。好ましくは、ｎは２である。
最も好ましい実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＸＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
好ましくは、ｘ Ｃａｔ＋は１または２Ｎａ＋である。
特定の一実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＸＩＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一であっても異なっていてもよく、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｗは−ＣＨ−または−Ｎ−であり、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ３）アシル、アルデヒド、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコールまたは（Ｃ２〜Ｃ３）エステルであり、Ｃａｔ＋は、１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）である。好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋であるか、またはヌクレオシドである。一層好ましくは、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋である。好ましくは、ＡはＯまたはＣＨ２である。一層好ましくは、ＡはＯである。一層好ましくは、Ｒ３およびＲ５はメチルであり、Ｒ４は水素である。一層好ましくは、Ｒ６は、−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯ−ＣＨ３または−ＣＯ−ＯＣＨ３である。好ましくは、ＢはＯである。好ましくは、ｍは１または２である。一層好ましくは、ｍは１である。場合により、ＷとＣとの間の二重結合はトランス（Ｅ）またはシス（Ｚ）の立体配座である。一層好ましくは、ＷとＣとの間の二重結合はトランス（Ｅ）の立体配座である。
たとえば、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＸＩＩＩ）または（ＸＩＶ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｗ、ｍおよびＹは、上述した意味を持つ。好ましくは、Ｗは−ＣＨ−である。好ましくは、Ｒ３およびＲ４は水素である。好ましくは、Ｒ５はメチルである。好ましくは、Ｒ６は−ＣＨ２−ＯＨである。
最も好ましい実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＸＶ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
他の最も好ましい実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化因子は、式（ＸＶＩ）の化合物を含む。
Figure 2006510629
化合物の具体例としては、以下のものがあげられる。
（Ｅ）１−ピロホスホノブタ−１，３−ジエン
（Ｅ）１−ピロホスホノペンタ−１，３−ジエン
（Ｅ）１−ピロホスホノ−４−メチルペンタ−１，３−ジエン
（Ｅ，Ｅ）１−ピロホスホノ−４，８−ジメチルノナ−１，３，７−トリエン
（Ｅ，Ｅ，Ｅ）１−ピロホスホノ−４，８，１２−トリメチルトリデカ−１，３，７，１１−テトラエン
（Ｅ，Ｅ）１−トリホスホノ−４，８−ジメチルノナ−１，３，７−トリエン
４−トリホスホノ−２−メチルブテン
α，β−ジ−［３−メチルペント−３−エニル］−ピロホスホネート
１−ピロホスホノ−３−メチルブト−２−エン
α，γ−ジ−［３−メチルブト−２−エニル］−トリホスホネート
α，β−ジ−［３−メチルブト−２−エニル］−ピロホスホネート
アリル−ピロホスホネート
アリル−トリホスホネート
α，γ−ジ−アリル−ピロホスホネート
α，β−ジ−アリル−トリホスホネート
（Ｅ，Ｅ）４−［（５’−ピロホスホノ−６’−メチル−ペンタ−２’，４’−ジエニルオキシメチル）−フェニル］−フェニル−メタノン
（Ｅ，Ｅ）４−［（５’−トリホスホノ−６’−メチル−ペンタ−２’，４’−ジエニルオキシメチル）−フェニル］−フェニル−メタノン
（Ｅ，Ｅ，Ｅ）［４−（９’−ピロホスホノ−２’，６’−ジメチル−ノナ−２’，６’，８’−トリエニルオキシメチル）−フェニル］−フェニル−メタノン
（Ｅ，Ｅ，Ｅ）［４−（９’−ピロホスホノ−２’，６’，８’−トリメチル−ノナ−２’，６’，８’−トリエニルオキシメチル）−フェニル］−フェニル−メタノン
５−ピロホスホノ−２−メチペンテン
５−トリホスホノ−２−メチペンテン
α，γ−ジ−［４−メチルペント−４−エニル］−トリホスホネート
５−ピロホスホノ−２−メチペント−２−エン
５−トリホスホノ−２−メチペント−２−エン
９−ピロホスホノ−２，６−ジメチノナ−２，６−ジエン
９−トリホスホノ−２，６−ジメチノナ−２，６−ジエン
α，γ−ジ−［４，８−ジメチルノナ−２，６−ジエニル］−トリホスホネート
４−ピロホスホノ−２−メチブテン
４−メチル−２−オキサ−ペント−４−エニルオキシメチルピロホスフェート
４−メチル−２−オキサ−ペント−４−エニルオキシメチルトリホスフェート
α，β−ジ−［４−メチル−２−オキサ−ペント−４−エニルオキシメチル］−ピロホスフェート
α，γ−ジ−［４−メチル−２−オキサ−ペント−４−エニルオキシメチル］−トリホスフェート
ホスホハロヒドリン（Ｒ＝１ｓｔ））
３−（ハロメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート
３−（ハロメチル）−３−ペンタノール−１−イル−ジホスフェート（ｄｉｐｈｓｏｐｈａｔｅ）
４−（ハロメチル）−４−ペンタノール−１−イル−ジホスフェート
４−（ハロメチル）−４−ヘキサノール−１−イル−ジホスフェート
５−（ハロメチル）−５−ヘキサノール−１−イル−ジホスフェート
５−（ハロメチル）−５−ヘプタノール−１−イル−ジホスフェート
６−（ハロメチル）−６−ヘプタノール−１−イル−ジホスフェート
６−（ハロメチル）−６−オクタノール−１−イル−ジホスフェート
７−（ハロメチル）−７−オクタノール−１−イル−ジホスフェート
７−（ハロメチル）−７−ノナノール−１−イル−ジホスフェート
８−（ハロメチル）−８−ノナノール−１−イル−ジホスフェート
８−（ハロメチル）−８−デカノール−１−イル−ジホスフェート
９−（ハロメチル）−９−デカノール−１−イル−ジホスフェート
９−（ハロメチル）−９−ウンデカノール−１−イル−ジホスフェート
１０−（ハロメチル）−１０−ウンデカノール−１−イル−ジホスフェート
１０−（ハロメチル）−１０−ドデカノール−１−イル−ジホスフェート
１１−（ハロメチル）−１１−ドデカノール−１−イル−ジホスフェート
１１−（ハロメチル）−１１−トリデカノール−１−イル−ジホスフェート
１２−（ハロメチル）−１２−トリデカノール−１−イル−ジホスフェート
１２−（ハロメチル）−１２−テトラデカノール−１−イル−ジホスフェート
１３−（ハロメチル）−１３−テトラデカノール−１−イル−ジホスフェート
１３−（ハロメチル）−１３−ペンタデカノール−１−イル−ジホスフェート
１４−（ハロメチル）−１４−ペンタデカノール−１−イル−ジホスフェート
１４−（ハロメチル）−１４−ヘキサデカノール−１−イル−ジホスフェート
１５−（ハロメチル）−１５−ヘキサデカノール−１−イル−ジホスフェート
１５−（ハロメチル）−１５−ヘプタデカノール−１−イル−ジホスフェート
１６−（ハロメチル）−１６−ヘプタデカノール−１−イル−ジホスフェート
１６−（ハロメチル）−１６−オクタデカノール−１−イル−ジホスフェート
１７−（ハロメチル）−１７−オクタデカノール−１−イル−ジホスフェート
１７−（ハロメチル）−１７−ノナデカノール−１−イル−ジホスフェート
１８−（ハロメチル）−１８−ノナデカノール−１−イル−ジホスフェート
１８−（ハロメチル）−１８−エイコサノール−１−イル−ジホスフェート
１９−（ハロメチル）−１９−エイコサノール−１−イル−ジホスフェート
１９−（ハロメチル）−１９−ヘンエイコサノール−１−イル−ジホスフェート
２０−（ハロメチル）−２０−ヘンエイコサノール−１−イル−ジホスフェート
２０−（ハロメチル）−２０−ドコサノール−１−イル−ジホスフェート
２１−（ハロメチル）−２１−ドコサノール−１−イル−ジホスフェート
２１−（ハロメチル）−２１−トリコサノール−１−イル−ジホスフェート
特に、
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート（ＢｒＨＰＰ）
５−ブロモ−４−ヒドロキシ−４−メチルペンチルピロホスホネート（ＣＢｒＨＰＰ）
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート（ＩＨＰＰ）
３−（クロロメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート（ＣｌＨＰＰ）
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−トリホスフェート（ＢｒＨＰＰＰ）
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−トリホスフェート（ＩＨＰＰＰ）
α，γ−ジ−［３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル］−トリホスフェート（ジＢｒＨＴＰ）
α，γ−ジ−［３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル］−トリホスフェート（ジＩＨＴＰ）
ホスホエポキシド（Ｒ＝２ｎｄ））
３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−ジホスフェート（Ｅｐｏｘ−ＰＰ）
３，４，−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−トリホスフェート（Ｅｐｏｘ−ＰＰＰ）
α，γ−ジ−３，４，−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−トリホスフェート（ジ−Ｅｐｏｘ−ＴＰ）
３，４−エポキシ−３−エチル−１−ブチル−ジホスフェート
４，５−エポキシ−４−メチル−１−ペンチル−ジホスフェート
４，５−エポキシ−４−エチル−１−ペンチル−ジホスフェート
５，６−エポキシ−５−メチル−１−ヘキシル−ジホスフェート
５，６−エポキシ−５−エチル−１−ヘキシル−ジホスフェート
６，７−エポキシ−６−メチル−１−ヘプチル−ジホスフェート
６，７−エポキシ−６−エチル−１−ヘプチル−ジホスフェート
７，８−エポキシ−７−メチル−１−オクチル−ジホスフェート
７，８−エポキシ−７−エチル−１−オクチル−ジホスフェート
８，９−エポキシ−８−メチル−１−ノニル−ジホスフェート
８，９−エポキシ−８−エチル−１−ノニル−ジホスフェート
９，１０−エポキシ−９−メチル−１−デシル−ジホスフェート
９，１０−エポキシ−９−エチル−１−デシル−ジホスフェート
１０，１１−エポキシ−１０−メチル−１−ウンデシル−ジホスフェート
１０，１１−エポキシ−１０−エチル−１−ウンデシル−ジホスフェート
１１，１２−エポキシ−１１−メチル−１−ドデシル−ジホスフェート
１１，１２−エポキシ−１１−エチル−１−ドデシル−ジホスフェート
１２，１３−エポキシ−１２−メチル−１−トリデシル−ジホスフェート
１２，１３−エポキシ−１２−エチル−１−トリデシル−ジホスフェート
１３，１４−エポキシ−１３−メチル−１−テトラデシル−ジホスフェート
１３，１４−エポキシ−１３−エチル−１−テトラデシル−ジホスフェート
１４，１５−エポキシ−１４−メチル−１−ペンタデシル−ジホスフェート
１４，１５−エポキシ−１４−エチル−１−ペンタデシル−ジホスフェート
１５，１６−エポキシ−１５−メチル−１−ヘキサデシル−ジホスフェート
１５，１６−エポキシ−１５−エチル−１−ヘキサデシル−ジホスフェート
１６，１７−エポキシ−１６−メチル−１−ヘプタデシル−ジホスフェート
１６，１７−エポキシ−１６−エチル−１−ヘプタデシル−ジホスフェート
１７，１８−エポキシ−１７−メチル−１−オクタデシル−ジホスフェート
１７，１８−エポキシ−１７−エチル−１−オクタデシル−ジホスフェート
１８，１９−エポキシ−１８−メチル−１−ノナデシル−ジホスフェート
１８，１９−エポキシ−１８−エチル−１−ノナデシル−ジホスフェート
１９，２０−エポキシ−１９−メチル−１−エイコシル−ジホスフェート
１９，２０−エポキシ−１９−エチル−１−エイコシル−ジホスフェート
２０，２１−エポキシ−２０−メチル−１−ヘンエイコシル−ジホスフェート
２０，２１−エポキシ−２０−エチル−１−ヘンエイコシル−ジホスフェート
２１，２２−エポキシ−２１−メチル−１−ドコシル−ジホスフェート
２１，２２−エポキシ−２１−エチル−１−ドコシル−ジホスフェート。
特に、
３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−ジホスフェート（Ｅｐｏｘ−ＰＰ）
３，４，−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−トリホスフェート（Ｅｐｏｘ−ＰＰＰ）
α，γ−ジ−３，４，−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−トリホスフェート（ジ−Ｅｐｏｘ−ＴＰ）
ウリジン５’−トリホスフェート−（３，４−エポキシメチルブチル）（Ｅｐｏｘ−ＵＴＰ）
ホスホエポキシド（Ｒ＝３ｒｄ））
（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニルピロホスフェート（ＨＤＭＡＰＰ）
（Ｅ）−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エニルピロホスホネート（ＣＨＤＭＡＰＰ）。
これらの化合物は、それ自体は従来技術において周知のさまざまな手法で生成できるものである。こうした手法のうちのいくつかは、ＰＣＴ国際公開第００／１２５１６号、同第００／１２５１９号、同第０３／０５０１２８号、同第０３／００９８５５号に開示されており、その開示内容を本明細書に援用する。
最も好ましい実施形態では、合成γδ Ｔリンパ球活性化化合物は、ＨＤＭＡＰＰと、ＣＨＤＭＡＰＰと、Ｅｐｏｘ−ＰＰと、ＢｒＨＰＰと、ＣＢｒＨＰＰと、からなる群から選択され、一層好ましくはＨＤＭＡＰＰ、ＣＨＤＭＡＰＰ、ＢｒＨＰＰ、ＣＢｒＨＰＰであり、なお一層好ましくはＨＤＭＡＰＰである。
あるいは、潜在的に効率は低めではあるが、本発明で用いる他の活性化因子に、国際公開第９５／２０６７３号に開示されているホスホ抗原、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）（米国特許第５，６３９，６５３号）、３−メチルブト−３−エニルピロホスホネート（Ｃ−ＩＰＰ）がある。これら両引用文献の開示内容を本明細書に援用する。
Ｙ基としてヌクレオシドを含む化合物は、たとえば、以下の反応によって調製可能である。Ｙで提供される官能基のタイプと反応性によっては、感受性官能基の保護／非保護の相またはカップリング反応と相互作用可能な相をはじめとする以下の例を、専門家であれば必要に応じて適宜変更できる。
Figure 2006510629
式中、−Ｏ−Ｖは、トシル、メシル、トリフリル（ｔｒｉｆｌｙｌｅ）、ブロシルまたはブロミウムなどから選択される、Ｖで始まる良い基（ｇｏｏｄ ｇｒｏｕｐ）であり、ＰＰはピロホスフェート基を示し、ＰＰＰはトリホスフェート基を示し、Ｒ−Ａ−は上述した意味であり、Ｎｕｃｌはヌクレオシドである。好ましくは、Ｎｕｃｌ−Ｏ−Ｖは、５’−Ｏ−トシルアデノシン、５’−Ｏ−トシルウリジン、５’−Ｏ−トシルシチジン、５’−Ｏ−トシルチミジンまたは５’−Ｏ−トシル−２’−デオキシアデノシンからなる群から選択される。
たとえば、Ｒが基１）の化合物では、以下のような反応の流れにすることができる。
Figure 2006510629
式中、−Ｏ−Ｖは、トシル、メシル、トリフリル（ｔｒｉｆｌｙｌｅ）、ブロシルまたはブロミウムなどから選択される、Ｖで始まる良い基（ｇｏｏｄ ｇｒｏｕｐ）であり、ＰＰはピロホスフェート基を示し、Ｎｕｃｌはヌクレオシドである。好ましくは、Ｎｕｃｌ−Ｏ−Ｖは、５’−Ｏ−トシルアデノシン、５’−Ｏ−トシルウリジン、５’−Ｏ−トシルシチジン、５’−Ｏ−トシルチミジンまたは５’−Ｏ−トシル−２’−デオキシアデノシンからなる群から選択される。これについてはＤａｖｉｓｓｏｎら（１９８７）に開示されており、その開示内容を本明細書に援用する。
中性ｐＨは、Ｄａｖｉｓｓｏｎら（１９８７）およびＤａｖｉｓｓｏｎら（１９８６）に記載されているものと同様の条件で実施可能な求核置換反応であり、その開示内容を本明細書に援用する。
また、この反応を利用し、基Ｙとして単糖を含む化合物を調製することができる。この場合、Ｎｕｃｌ−Ｏ−ＶがＭｏｎｏＳａｃ−Ｏ−Ｖに置き換わり、Ｍｏｎｏｓａｃが単糖である。たとえば、本明細書に援用する刊行物ＮｉｌｓｓｏｎおよびＭｏｓｂａｃｈ（１９８０）に記載されているような化合物メチル−６−Ｏ−トシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに対応するＭｏｎｏＳａｃ−Ｏ−Ｙ基または市販のマンノーストリフレート化合物を用いることが可能である。
また、この反応を利用し、基Ｙとしてオリゴ糖を含む化合物を調製することもできる。この場合、Ｎｕｃｌ−Ｏ−ＶがｏｌｉｇｏＳａｃ−Ｏ−Ｖに置き換わり、ｏｌｉｇｏＳａｃがオリゴ糖である。たとえば、刊行物（Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第７７巻、第２２５〜２２８ページ、その開示内容を本明細書に援用する）に記載されているように、化合物６Ａ−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−シクロデキストリンに対応するｏｌｉｇｏＳａｃ−Ｏ−Ｙ基を用いることが可能である。
さらに、この反応を利用し、基Ｙとして多糖を含む化合物を調製することもできる。この場合、Ｎｕｃｌ−Ｏ−ＶがｐｏｌｙＳａｃ−Ｏ−Ｖに置き換わり、ｐｏｌｙＳａｃが多糖である。たとえば、開示内容を本明細書に援用する刊行物Ｎｉｌｓｓｏｎら（１９８１）およびＮｉｌｓｓｏｎおよびＭｏｓｂａｃｈ（１９８０）に記載されているように、トシル化多糖に対応するｐｏｌｙＳａｃ−Ｏ−Ｙ基を用いることが可能である。この多糖支持体の水酸基のトシル化による活性化に基づくカップリング手法によって、水性媒体または有機媒体中で共有結合を得ることができる。
また、この反応を利用し、アセタールまたは官能基を保護する他の基の形で保護アルデヒド官能基を有する誘導体をＮｕｃｌの代わりに選択すれば、基Ｙとしてアルデヒド誘導体を含む化合物を調製することができる。
あるいは、Ｙ基としてヌクレオシドを含む化合物を以下の反応で調製することが可能である。
Figure 2006510629
式中、ＰＰＰはトリホスフェート基を示し、Ｒ−Ａは上述した意味であり、ＤＭＦはジメチルホルムアミドであり、Ｎｕｃｌはヌクレオシドである。この反応は、開示内容を本明細書に援用するＫｎｏｒｒｅら（１９７６）またはＢｌｏｏｍら、米国特許第５，６３９，６５３号（１９９７）に記載されているものと同様の条件で、式Ｎｕｃｌ−Ｏ−ＰＰＰのアルコールおよびヌクレオチドから実施可能なものである。
たとえば、Ｒが基１）の化合物では、以下のような反応の流れにすることができる。
Figure 2006510629

式中、ＰＰＰはトリホスフェート基を示し、ＤＭＦはジメチルホルムアミドであり、Ｎｕｃｌはヌクレオシドである。
この反応を、刊行物Ｋｎｏｒｒｅら（１９７６）の著者らによって示されているように、オリゴヌクレオチド５’−トリホスフェートγ−エステルの調製に適用することも可能である。
核酸、特にリボ核酸をＹ基として含む化合物を、刊行物Ｆ．Ｈｕａｎｇら（１９９７）に記載されているものと同様の条件で調製することが可能である。著者らは、遊離末端ホスフェート基を含むどのような分子にも適用可能な触媒ＲＮＡからの普遍的な方法について説明している。イソペンテニルピロホスフェートまたはチアミンピロホスフェートなどのホスホハロヒドリン基と構造的に関連した化合物が、これらの著者らによって使用または言及されている（Ｆ．Ｈｕａｎｇら（１９９７）の８９６８ページを参照のこと）。また、８９６５ページの「Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅ ６ ｐｐｐＲＮＡ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ」というセクションに記載のカップリング手法の実験条件（特にｐＨ条件）もハロヒドリン官能基の存在と両立できる点に注意されたい。
アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質誘導体をＹ基として含む化合物については、エポキシド官能基上のチオール官能基または第１級アミンの周知の反応性を利用して得ることができる（ＳＮ２反応）。このタイプのカップリングには、エポキシド官能基を有する、いまだ「リンカー」と呼ばれている中間基が伝統的に必要である。このタイプのカップリングを用いる反応の流れの一例を以下にあげておく。
Figure 2006510629
式中、ＰＰはピロホスフェート基を表し、Ｒ−Ａは上述した意味であり、Ｒ’−ＳＨは、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質誘導体である。第１相は、開示内容を本明細書に援用するＤａｖｉｓｓｏｎら（１９８７）およびＤａｖｉｓｓｏｎら（１９８６）に記載されているものと同様の条件で、初期化合物のテトラブチルアンモニウム塩とグリシジルトシレートまたはエピクロロヒドリンなどの市販の化合物から実施可能なものである。この反応はまた、スリホスフェート（ｔｈｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）化合物を用いて実施可能である。あるいは、Ｒ’−ＳＨの代わりに第１級アミンＲ’−ＮＨ２を利用してもよい。Ｒ’−ＳＨを用いる反応がない場合は、最初の反応を利用してエポキシド誘導体を含む化合物を調製することができる。
あるいは、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質誘導体をＹ基として含む化合物を、以下の反応で調製することも可能である。
Figure 2006510629
式中、ＰＰＰはトリホスフェート基を示し、ＰＰはピロホスフェート基を示し、Ｐはホスフェート基を示し、Ｒ−Ａは上述した意味であり、Ｒ’−ＮＨは、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質誘導体である。この反応は、開示内容を本明細書に援用するＫｎｏｒｒｅら（１９７６）に記載されているものと同様の条件で、化合物（Ｒ−Ａ−ＰＰＰ）と式Ｒ−ＮＨ２のアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質から実施可能である。この反応には、化合物Ｒ−ＮＨ２の感受性官能基の保護が必要であり、そうでなければカルボジイミド（特に、カルボキシル官能基）と反応する可能性がある。
リン酸、ピロリン酸、三リン酸、四リン酸またはポリリン酸のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩またはテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩を、市販の対応する酸から調製することが可能である。また、この反応手法に従って、開示内容を本明細書に援用するＬｉｕら（１９９９）の刊行物に記載されているメタントリスホスホン酸の誘導体などの関連の構造を持つ誘導体を調製することも可能である。
上述した反応は、ヒドロキシル、アミン、ホスフェートまたはチオール官能基の反応性を利用して、分子または生体分子の極めて大きなスペクトルに外挿（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅ）可能である。これによって、反応ＡまたはＢに従ってヒドロキシル官能基を活性化して、イノシトール誘導体を調製可能である。また、反応ＤまたはＥに従って第１級アミン官能基の反応性を求めて、葉酸（ビタミンＢ９）またはテトラヒドロ葉酸の誘導体を調製可能である。
もちろん、他のタイプのカップリングを考慮することもでき、専門家には反応に関する多数の選択肢があり得る。
よって、カルボン酸またはフェノール基のリン酸化によるカップリングを利用して、脂肪酸、脂質または特定のフラボノイド誘導体を形成することができる。
サイトカイン
上述したように、この方法は、活性因子の特定を組み合わせで特定のスケジュールに沿って用いることに立脚している。本発明では、一層好ましくは合成活性化因子との組み合わせでサイトカインを併用するが、このサイトカインはインターロイキン−２ポリペプチドである。
インターロイキン−２ポリペプチドは、ヒト由来であっても動物由来であってもよく、好ましくはヒト由来のものである。これは、野生型ヒト（または動物）ＩＬ−２タンパク質の配列あるいは、その生物学的に活性な断片、変異体または類似体、すなわち、ＩＬ−２受容体に結合でき、かつ、本発明の方法でγδ Ｔ細胞の活性化を誘導できる断片、変異体または類似体を含み得る。
基準配列である野生型ヒトインターロイキン−２タンパク質は、たとえばジーンバンクでの受託番号ＮＰ０００５７７、ＡＡＫ２６６６５、ＰＯ１５８５、ＸＰ０３５５１１などとして従来技術において入手可能であり、その開示内容を本明細書に援用する。
「変異体」という用語は、特に、多型、スプライシング、変異などによって生じるものなどの、天然の変異体を示す。よって、このような自然界に発生する変異体には、基準のＩＬ−２タンパク質配列と比較したときに、１以上のアミノ酸残基の１つまたはいくつかの変異、欠失、置換および／または付加が含まれることがある。
また、「変異体」という用語は、たとえば、齧歯類、ウシ、ブタ、ウマなどのさまざまな哺乳動物種起源のＩＬ−２ポリペプチドも含む。一層好ましくは、ＩＬ−２ポリペプチドはヒト由来のものであり、すなわち、ヒトＩＬ−２タンパク質またはその変異体、断片または類似体の配列を含む。
また、「変異体」という用語は、基準のＩＬ−２タンパク質配列と比較したときに、１以上のアミノ酸残基の１つまたはいくつかの変異、欠失、置換および／または付加を含み、ＩＬ−２受容体に結合でき、かつ、本発明の方法でγδ Ｔ細胞の活性化を誘導できる合成ポリペプチドなどの合成ＩＬ−２変異体も含む。好ましい合成ＩＬ−２変異体は、ＩＬ−２基準タンパク質の一次配列とのアミノ酸配列同一性が少なくとも７５％であり、一層好ましくは少なくとも８０％、なお一層好ましくは少なくとも８５または９０％である。配列間の同一性は、一般に、ＣＬＵＳＴＡＬ法を用いるなどの周知のさまざまな方法で求められる。
また、変異体には、従来の適度なストリンジェンシーで、基準ＩＬ−２タンパク質またはその断片をコードする核酸配列とハイブリダイズされる核酸配列でコードされるＩＬ−２ポリペプチドも含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、たとえば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ中、４０〜４２℃で１２時間のインキュベーションである。
ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体に結合し、本発明の方法でγδ Ｔ細胞の活性化を誘導する機能が保たれた、基準ＩＬ−２タンパク質の断片であってもよい。このような断片は、受容体結合部位など、ＩＬ−２の官能基ドメインを少なくとも１つ含有する。断片には、完全な基準配列の好ましくは少なくとも４０％、５０％または好ましくは、少なくとも６０％が含まれる。
類似体はインターロイキン−２と同じ受容体を利用してポリペプチドを指定するため、γδ Ｔリンパ球で同様の活性化信号を媒介することになる。
インターロイキン−２ポリペプチドはさらに、付加アミノ酸、糖、脂質など、天然配列に付加された異種残基を含むものであってもよい。これはまた、化学的、酵素的またはマーカー（放射性など）基であってもよい。付加された残基または部分は、安定化剤、形質移入促進剤などとなることがある。
ＩＬ−２ポリペプチドは、可溶性の精製された形であってもよいし、生物学的に活性なペプチド、タンパク質、脂質などの他の分子とコンジュゲートまたは複合体化されたものであってもよい。ＩＬ−２ポリペプチドは、化学合成、酵素合成、遺伝子（組換えＤＮＡなど）合成またはこれらの組み合わせなどの従来技術において周知の手法で生成すればよいものである。医薬品グレードのＩＬ−２ポリペプチドも商業的供給源から調達できる。
インターロイキン−２ポリペプチドについては、低用量すなわち、三分子複合体ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３０として定義されるＩＬ２の高親和性受容体を発現する細胞をｉｎ ｖｉｖｏ標的できるだけの十分な用量で投与すると好ましい。実用上、ヒトでは、このような用量は臨床試験で実験的に規定されており、皮下注射の場合で１平方メートルあたり０．２から２百万単位（たとえば、ｂｕｚｉｏら２００１を参照）である。
このＩＬ−２ポリペプチドについては、１日から１０日の時間をかけて、１日あたり０．１から３百万単位（Ｍｉｌｌｉｏｎ Ｕｎｉｔ）の注射で投与すると好ましい。好ましくは、１日あたり０．２から２ＭＵ、なお一層好ましくは０．２から１．５ＭＵ、さらに好ましくは０．２から１ＭＵの一日用量を投与する。一日用量の投与は、１回の注射で行ってもよいし数回行ってもよく、一般には同じ注射を２回行う。ＩＬ−２での処置を、１日から９日間、なお一層好ましくは３日から７日間続けると好ましい。最適な効果が達成されるのは５日間の処置後であるように思われる。
本発明の好ましい実施形態
好ましい実施形態では、本発明の方法に従って、化合物ＢｒＨＰＰ、ＣＢｒＨＰＰ、ＨＤＭＡＰＰ、ＣＨＤＭＡＰＰおよびｅｐｏｘＰＰを用いる。
ＢｒＨＰＰおよびＥｐｏｘＰＰ
ＢｒＨＰＰの合成は、実施例１ならびに、開示内容を本明細書に援用するＥｓｐｉｎｏｓａ（２００１）に記載されている。ＥｐｏｘＰＰの合成は、開示内容を本明細書に援用する欧州特許第１１０９８１８ Ｂ１号に記載されている。
（１）本発明は特に、疾患、特に腫瘍、特に固形腫瘍、さらには上記または下記にて定義するような好ましい疾患のうちのひとつを処置することであって、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰを、２週間ごとから最大８週間ごと、好ましくは３週間ごとまたは４週間ごとの間隔をあけて、式（Ａ）
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．１からｙ）＊Ｎ （Ａ）
（式中、Ｎ（整数または分数）は、処置と処置との間の週数（約２週間から約８週間）すなわち、Ｎは約２から約８、好ましくは約３から４である）に従って算出される用量でヒトに対して２回以上投与し、一層好ましくは、処置用量を、式Ｂ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（５から１００）＊Ｎ； （Ｂ）
に従って算出し、
なお一層好ましくは、式Ｃ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（１０から１００）＊Ｎ； （Ｃ）
に従って算出し、
さらになお一層好ましくは、式Ｄ
単回用量（ｍｇ／ｍ２）＝（５から６０）＊Ｎ （Ｄ）
（式中、式Ａ〜Ｄの各々において、Ｎは約２から約８であるか、または好ましくは約３から４である（それぞれ、約２週間から約８週間と約３週間から約４週間の処置間隔に相当））に従って算出し、
式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰは、好ましくは、
（ａ）ヒトでは、約３週間ごとから約４週間ごと、好ましくは３週間ごとまたは４週間ごとに、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、または
（ｂ）ヒトでは、約４週間ごとから約８週間ごと、好ましくは約５週間ごと、６週間ごと、７週間ごとまたは８週間ごとに、用量が約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、投与され、
この投与は、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間で、好ましくはｉ．ｖ．注入で行われることを特徴とする、処置に関するものである。
（２）また、本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、最も好ましくは転移のある腫瘍疾患を処置することであって、前記腫瘍が、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択され、最も好ましくは消化管の腫瘍であり、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんであるか、あるいは泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんであり、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰを、温血動物、特にヒトに投与する処置にも関するものである。
（３）また、本発明は、好ましくは、個体においてγδ Ｔ細胞を刺激するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法、好ましくは、腫瘍疾患、好ましくは固形腫瘍、あるいは自己免疫疾患または感染症を処置するための療法であって、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰが、
（ａ）ヒトに対して、おおよそＥＣ５０値とＥＣ１００値の間、一層好ましくはＥＣ５０の少なくとも１１０％、１２０％、１５０％または１７５％、
（ｂ）ヒトに対して、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの用量かつ、
必要があれば、最初の用量について上述した用量範囲に各々が入る、１またはそれ以上（好ましくは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８または少なくとも１０）のさらなる用量を、さらなる処置サイクルで投与し、好ましくは、前の用量での投与から、処置をほどこした個体でγδ Ｔ細胞個体群が基底レベルまで十分回復できるだけの時間、特に前の処置後１週間を超える日数、２週間を超える日数、さらには、前の処置後２週から８週間、特に３週から４週間、特にその処置後３週間経過後の各用量で１回投与されるような形で、個体に組成物を投与する。
一層好ましくは、（１）〜（３）で、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰを、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、３週間ごとにヒトに投与するか、または式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰを、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、４週間ごと（４週間に１回）に投与する。この用量をヒトに投与するのは、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間での静脈内（ｉ．ｖ．）投与によると好ましい。
一層好ましくは、疾患の進行、容認できない毒性、完全に応答したと判断した後の１または好ましくは２サイクル、あるいは何らかの理由で患者が同意を取り下げるまで、前記処置を繰り返す。
（４）本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、特に（ｉ）結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰを、１週間ごとから８週間ごとに、最大耐量（ＭＴＤ）または非ヒト動物で試験を行った最大用量の８０％未満、一層好ましくは５０％未満の用量で温血動物に投与する療法にも関するものである。
好ましくは、前記式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰでヒトを毎週処置する場合、用量は、ＭＴＤの約１から約６０％、好ましくは約１０から約６０％、たとえば約５から約３５％の範囲であり、たとえばＭＴＤの約３０から約３５％の範囲である。好ましくは、ＢＲＨＰＰでは、用量は、ＭＴＤの約５から約６０％、好ましくは約１０から約６０％の範囲であり、特に約１０から約４５％の範囲、ことさら約３０から約４５％の範囲である。
（５）本発明は、好ましくは、疾患、特に、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍疾患、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＶＩＩＩの化合物、特にＢＲＨＰＰまたはＥｐｏｘＰＰを、最大の効果の半分が得られる有効濃度値（ＥＣ５０）と最大の効果が得られる有効濃度値（ＥＣ１００）との間の用量あるいは、ＥＣ５０とＥＣ５０の２００％との間、あるいは好ましくは、ＥＣ５０値の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１６０％、１７５％または２００％の用量で、１週間ごとから８週間ごとの間で温血動物に投与する療法にも関するものである。
ＣＢｒＨＰＰ
ＣＢｒＨＰＰの合成は好適な方法で実施可能である。好ましい例では、ＰＣＴ特許国際公開第０３／０５０１２８号、Ｂｒｏｎｄｉｎｏら（１９９６）またはＶａｌｅｎｔｉｊｎら（１９９１）に記載の方法で３−メチルブト−３−エニルピロホスホネート（Ｃ−ＩＰＰ）を調製し、これをＥｓｐｉｎｏｓａら（２００１ａ）の方法に従ってＣＢｒＨＰＰに転換する。上記に引用した参考文献各々を本明細書に援用する。
（１）本発明は特に、疾患、特に腫瘍、特に固形腫瘍、さらには上記または下記にて定義するような好ましい疾患のうちのひとつを処置することであって、ＣＢｒＨＰＰ化合物を、２週間ごとから最大８週間ごと、好ましくは３週間ごとや４週間ごとの間隔をあけて、式（Ａ）
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．１からｙ）＊Ｎ （Ａ）
（式中、Ｎ（整数または分数）は、処置と処置との間の週数（約２週間から約８週間）すなわち、Ｎは約２から約８、好ましくは約３から４である）に従って算出される用量でヒトに対して２回以上投与し、一層好ましくは、処置用量を、式Ｂ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（５から１００）＊Ｎ； （Ｂ）
に従って算出し、
なお一層好ましくは、式Ｃ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（１０から１００）＊Ｎ； （Ｃ）
に従って算出し、
さらになお一層好ましくは、式Ｄ
単回用量（ｍｇ／ｍ２）＝（５から６０）＊Ｎ （Ｄ）
（式中、式Ａ〜Ｄの各々において、Ｎは約２から約８であるか、または好ましくは約３から４である（それぞれ、約２週間から約８週間と約３週間から約４週間の処置間隔に相当））に従って算出し、
ＣＢｒＨＰＰは、好ましくは、
（ａ）ヒトでは、約３週間ごとから約４週間ごと、好ましくは３週間ごとまたは４週間ごとに、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、または
（ｂ）ヒトでは、約４週間ごとから約８週間ごと、好ましくは約５週間ごと、６週間ごと、７週間ごとまたは８週間ごとに、用量が約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、投与され、
この投与は、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間で、好ましくはｉ．ｖ．注入で行われることを特徴とする、処置に関するものである。
（２）また、本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、最も好ましくは転移のある腫瘍疾患を処置することであって、前記腫瘍が、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択され、最も好ましくは消化管の腫瘍であり、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんであるか、あるいは泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんであり、ＣＢｒＨＰＰを、温血動物、特にヒトに投与する処置にも関するものである。
（３）また、本発明は、好ましくは、個体においてγδ Ｔ細胞を刺激するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法、好ましくは、腫瘍疾患、好ましくは固形腫瘍、あるいは自己免疫疾患または感染症を処置するための療法であって、
（ａ）ヒトに対して、おおよそＥＣ５０値とＥＣ１００値の間、一層好ましくはＥＣ５０の少なくとも１１０％、１２０％、１５０％または１７５％、
（ｂ）ヒトに対して、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの用量かつ、
必要があれば、最初の用量について上述した用量範囲に各々が入る、１またはそれ以上（好ましくは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８または少なくとも１０）のさらなる用量を、さらなる処置サイクルで投与し、好ましくは、前の用量での投与から、処置をほどこした個体でγδ Ｔ細胞個体群が基底レベルまで十分回復できるだけの時間、特に前の処置後１週間を超える日数、２週間を超える日数、さらには、前の処置後２週から８週間、特に３週から４週間、特にその処置後３週間経過後の各用量で、ＣＢｒＨＰＰを１回投与する。
一層好ましくは、（１）〜（３）で、ＣＢｒＨＰＰを、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、３週間ごとにヒトに投与するか、またはＣＢｒＨＰＰを、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから約１．２ｇ／ｋｇ、一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、４週間ごと（４週間に１回）に投与する。この用量をヒトに投与するのは、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間での静脈内（ｉ．ｖ．）投与によると好ましい。
一層好ましくは、疾患の進行、容認できない毒性、完全に応答したと判断した後の１または好ましくは２サイクル、あるいは何らかの理由で患者が同意を取り下げるまで、前記処置を繰り返す。
（４）本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、特に（ｉ）結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、ＣＢｒＨＰＰを、１週間ごとから８週間ごとに、最大耐量（ＭＴＤ）の８０％未満、一層好ましくは５０％未満の用量で温血動物に投与する療法にも関するものである。
好ましくは、前記ＣＢｒＨＰＰ化合物でヒトを毎週処置する場合、用量は、ＭＴＤの約１から約６０％、好ましくは約１０から約６０％、たとえば約５から約３５％の範囲であり、たとえばＭＴＤの約３０から約３５％の範囲である。好ましくは、ＣＢｒＨＰＰでは、用量は、ＭＴＤの約５から約６０％、好ましくは約１０から約６０％の範囲であり、特に約１０から約４５％の範囲、ことさら約３０から約４５％の範囲である。特別な場合で、ＣＢｒＨＰＰの用量を約２から約１８ｍｇ／ｍ２にすることが可能である。
（５）本発明は、好ましくは、疾患、特に、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍疾患、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、ＣＢｒＨＰＰを、最大の効果の半分が得られる有効濃度値（ＥＣ５０）と最大の効果が得られる有効濃度値（ＥＣ１００）との間の用量あるいは、ＥＣ５０の１１０％と２００％との間、あるいは好ましくは、ＥＣ５０値の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１６０％、１７５％または２００％の用量で、１週間ごとから８週間ごとの間で温血動物に投与する療法にも関するものである。
ＨＤＭＡＰＰ
Ｈｉｎｔｚら（２００１）に記載の非メバロン酸塩（ＭＥＰ）経路のｌｙｔＢ成分欠損Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのＨＤＭＡＰＰの単離以来、多数の実験室でＨＤＭＡＰＰの化学合成が行われてきている。合成ＨＤＭＡＰＰと、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｙｔＢ変異体から単離された天然化合物は、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の刺激にあたって同じ活性を示した。ヒト末梢血単核細胞のＨＤＭＡＰＰに対する反応性がゆえにＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞が抑制され、細胞表面での活性化マーカーの上方制御、炎症性サイトカインの分泌、ＩＬ−２による同時刺激の存在下でのＶγ９／Ｖδ２亜個体群の増殖につながった。（ＩＰＰのＥＣ５０が約１μＭであるのに比して）ＨＤＭＡＰＰはＥＣ５０値が約０．１ｎＭであることが報告されたことから、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａなどの病原細菌ならびに、ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａといった原生寄生生物に対する周知のＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞反応性は、もっぱらＨＤＭＡＰＰのみがゆえに生じているのではないかと仮定される。
本発明者らが解明したＶγ９／Ｖδ２＋Ｔ細胞刺激のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ ｖｉｖｏ薬力学から、γδ Ｔ細胞活性の調節にあたってＨＤＭＡＰＰが驚くほど有効であり、低用量の投与計画で哺乳動物に投与できることが分かっている。
ＨＤＭＡＰＰを合成するための好ましい方法が、実施例２およびＷｏｌｆｆら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）４３：２５５５およびＨｅｃｈｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）４３：８９２９に記載されており、これらの開示内容からＨＤＭＡＰＰ化合物の調製方法に関する教示部分を本明細書に援用する。
（１）本発明は特に、疾患、特に腫瘍、特に固形腫瘍、さらには上記または下記にて定義するような好ましい疾患のうちのひとつを処置することであって、式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰを、２週間ごとから最大８週間ごと、好ましくは３週間ごとや４週間ごとの間隔をあけて、式（Ａ）
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．１からｙ）＊Ｎ （Ａ）
（式中、Ｎ（整数または分数）は、処置と処置との間の週数（約２週間から約８週間）すなわち、Ｎは約２から約８、好ましくは約３から４である）に従って算出される用量でヒトに対して２回以上投与し、一層好ましくは、処置用量を、式Ｂ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．００１から１００）＊Ｎ； （Ｂ）
に従って算出し、
なお一層好ましくは、式Ｃ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０１から５）＊Ｎ； （Ｃ）
に従って算出し、
さらになお一層好ましくは、式Ｄ
単回用量（ｍｇ／ｍ２）＝（０．０２から２．５）＊Ｎ （Ｄ）
（式中、式Ａ〜Ｄの各々において、Ｎは約２から約８であるか、または好ましくは約３から４である（それぞれ、約２週間から約８週間と約３週間から約４週間の処置間隔に相当））に従って算出し、
式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰは、好ましくは、
（ａ）ヒトでは、約３週間ごとから約４週間ごと、好ましくは３週間ごとまたは４週間ごとに、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、または
（ｂ）ヒトでは、約４週間ごとから約８週間ごと、好ましくは約５週間ごと、６週間ごと、７週間ごとまたは８週間ごとに、用量が約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、投与され、
この投与は、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間で、好ましくはｉ．ｖ．注入で行われることを特徴とする、処置に関するものである。
（２）また、本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、最も好ましくは転移のある腫瘍疾患を処置することであって、前記腫瘍が、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択され、最も好ましくは消化管の腫瘍であり、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんであるか、あるいは泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんであり、前記式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰを、温血動物、特にヒトに投与する処置にも関するものである。
（３）また、本発明は、好ましくは、個体においてγδ Ｔ細胞を刺激するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法、好ましくは、腫瘍疾患、好ましくは固形腫瘍、あるいは自己免疫疾患または感染症を処置するための療法であって、
（ａ）ヒトに対して、おおよそＥＣ５０とＥＣ１００の間、一層好ましくはＥＣ５０の少なくとも１１０％、１２０％、１５０％または１７５％、
（ｂ）ヒトに対して、約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量かつ、
必要があれば、最初の用量について上述した用量範囲に各々が入る、１またはそれ以上（好ましくは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８または少なくとも１０）のさらなる用量を、さらなる処置サイクルで投与し、好ましくは、前の用量での投与から、処置をほどこした個体でγδ Ｔ細胞個体群が基底レベルまで十分回復できるだけの時間、特に前の処置後１週間を超える日数、２週間を超える日数、さらには、前の処置後２週から８週間、特に３週から４週間、特にその処置後３週間経過後の各用量で、式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰを１回投与する。
一層好ましくは、（１）〜（３）で、式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰを、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、３週間ごとにヒトに投与するか、または式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＡＭＰＰを、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、４週間ごと（４週間に１回）に投与する。この用量をヒトに投与するのは、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間での静脈内（ｉ．ｖ．）投与によると好ましい。
一層好ましくは、疾患の進行、容認できない毒性、完全に応答したと判断した後の１または好ましくは２サイクル、あるいは何らかの理由で患者が同意を取り下げるまで、前記処置を繰り返す。
（４）本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、特に（ｉ）結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰを、１週間ごとから８週間ごとに、最大耐量（ＭＴＤ）の８０％未満、一層好ましくは５０％未満の用量で温血動物に投与する療法にも関するものである。
好ましくは、前記式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰでヒトを毎週処置する場合、用量は、ＭＴＤの約１から約６０％、好ましくは約１０から約６０％、たとえば約５から約３５％の範囲であり、たとえばＭＴＤの約３０から約３５％の範囲である。好ましくは、ＨＤＭＡＰＰでは、用量は、ＭＴＤの約５から約６０％、好ましくは約１０から約６０％の範囲であり、特に約１０から約４５％の範囲、ことさら約３０から約４５％の範囲である。特別な場合で、ＨＤＭＡＰＰの用量を約２から約１８ｍｇ／ｍ２にすることが可能である。
（５）本発明は、好ましくは、疾患、特に、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍疾患、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、式ＸＩＩの化合物、特にＨＤＭＡＰＰを、最大の効果の半分が得られる有効濃度値（ＥＣ５０）と最大の効果が得られる有効濃度値（ＥＣ１００）との間の用量あるいは、ＥＣ５０の１１０％と２００％との間、あるいは好ましくは、ＥＣ５０値の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１６０％、１７５％または２００％の用量で、１週間ごとから８週間ごとの間で温血動物に投与する療法にも関するものである。
ＣＨＤＭＡＰＰ
ＣＨＤＭＡＰＰの合成は、好適な方法で実施可能なものである。一例として、リン酸化またはホスホネーション（phosphonation）の前にＥ−ヒドロキシジメチルアリルタイプのシントンを生成することを目的とした、Ｎａｋａｍｕｒａら（１９７３）、ＺｏｒｅｔｉｃおよびＺｈａｎｇ（１９９６）またはＵｍｂｒｅｉｔおよびＳｈａｒｐｌｅｓｓ（１９７７）の方法があげられ、その開示内容を本明細書に援用する。リン酸化またはホスホネーションについては、開示内容を本明細書に援用するＰＣＴ特許出願国際公開第０３／０５０１２８号、Ｂｒｏｎｄｉｎｏら（１９９６）またはＶａｌｅｎｔｉｊｎら（１９９１）に記載の方法で実施可能である。
（１）本発明は特に、疾患、特に腫瘍、特に固形腫瘍、さらには上記または下記にて定義するような好ましい疾患のうちのひとつを処置することであって、ＣＨＤＭＡＰＰ化合物を、２週間ごとから最大８週間ごと、好ましくは３週間ごとや４週間ごとの間隔をあけて、式（Ａ）
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．１からｙ）＊Ｎ （Ａ）
（式中、Ｎ（整数または分数）は、処置と処置との間の週数（約２週間から約８週間）すなわち、Ｎは約２から約８、好ましくは約３から４である）に従って算出される用量でヒトに対して２回以上投与し、一層好ましくは、処置用量を、式Ｂ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（５から１００）＊Ｎ； （Ｂ）
に従って算出し、
なお一層好ましくは、式Ｃ
単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（１０から１００）＊Ｎ； （Ｃ）
に従って算出し、
さらになお一層好ましくは、式Ｄ
単回用量（ｍｇ／ｍ２）＝（５から６０）＊Ｎ （Ｄ）
（式中、式Ａ〜Ｄの各々において、Ｎは約２から約８であるか、または好ましくは約３から４である（それぞれ、約２週間から約８週間と約３週間から約４週間の処置間隔に相当））に従って算出し、
ＣＨＤＭＡＰＰは、好ましくは、
（ａ）ヒトでは、約３週間ごとから約４週間ごと、好ましくは３週間ごとまたは４週間ごとに、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、または
（ｂ）ヒトでは、約４週間ごとから約８週間ごと、好ましくは約５週間ごと、６週間ごと、７週間ごとまたは８週間ごとに、用量が約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、投与され、
この投与は、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間で、好ましくはｉ．ｖ．注入で行われることを特徴とする、処置に関するものである。
（２）また、本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、最も好ましくは転移のある腫瘍疾患を処置することであって、前記腫瘍が、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択され、最も好ましくは消化管の腫瘍であり、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんであるか、あるいは泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんであり、ＣＨＤＭＡＰＰを、温血動物、特にヒトに投与する処置にも関するものである。
（３）また、本発明は、好ましくは、個体においてγδ Ｔ細胞を刺激するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法、好ましくは、腫瘍疾患、好ましくは固形腫瘍、あるいは自己免疫疾患または感染症を処置するための療法であって、
（ａ）ヒトに対して、おおよそＥＣ５０とＥＣ１００の間、一層好ましくはＥＣ５０の少なくとも１１０％、１２０％、１５０％または１７５％、
（ｂ）ヒトに対して、約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量かつ、
必要があれば、最初の用量について上述した用量範囲に各々が入る、１またはそれ以上（好ましくは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８または少なくとも１０）のさらなる用量を、さらなる処置サイクルで投与し、好ましくは、前の用量での投与から、処置をほどこした個体でγδ Ｔ細胞個体群が基底レベルまで十分回復できるだけの時間、特に前の処置後１週間を超える日数、２週間を超える日数、さらには、前の処置後２週から８週間、特に３週から４週間、特にその処置後３週間経過後の各用量で、ＣＨＤＭＡＰＰを１回投与する。
一層好ましくは、（１）〜（３）で、ＣＨＤＭＡＰＰを、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、３週間ごとにヒトに投与するか、またはＣＨＤＡＭＰＰを、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、なお一層好ましくは約２０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇあるいは、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、４週間ごと（４週間に１回）に投与する。この用量をヒトに投与するのは、２分から１２０分間、一層好ましくは約５分から約３０分間、最も好ましくは約１０分から約３０分間、たとえば約３０分間などの時間での静脈内（ｉ．ｖ．）投与によると好ましい。
一層好ましくは、疾患の進行、容認できない毒性、完全に応答したと判断した後の１または好ましくは２サイクル、あるいは何らかの理由で患者が同意を取り下げるまで、前記処置を繰り返す。
（４）本発明は、好ましくは、腫瘍疾患、特に（ｉ）結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、式ＣＨＤＭＡＰＰを、１週間ごとから８週間ごとに、最大耐量（ＭＴＤ）の８０％未満、一層好ましくは５０％未満の用量で温血動物に投与する療法にも関するものである。
好ましくは、前記ＣＨＤＭＡＰＰでヒトを毎週処置する場合、用量は、ＭＴＤの約１から約６０％、好ましくは約１０から約６０％、たとえば約５から約３５％の範囲であり、たとえばＭＴＤの約３０から約３５％の範囲である。好ましくは、ＣＨＤＭＡＰＰでは、用量は、ＭＴＤの約５から約６０％、好ましくは約１０から約６０％の範囲であり、特に約１０から約４５％の範囲、ことさら約３０から約４５％の範囲である。特別な場合で、ＣＨＤＭＡＰＰの用量を約２から約１８ｍｇ／ｍ２にすることが可能である。
（５）本発明は、好ましくは、疾患、特に、結腸直腸などの消化管と、肺腫瘍、特に非小細胞肺癌腫と、乳房腫瘍と、類表皮腫瘍と、腎臓と、前立腺などの泌尿生殖器と、膵臓と、脳腫瘍（および／またはその転移）と、から選択される固形腫瘍疾患、最も好ましくは消化管の腫瘍、特に結腸直腸がん、さらには消化管がん、特に結腸直腸がんあるいは、泌尿生殖器の腫瘍、特に前立腺がんを、特にこのような腫瘍が転移性である場合に処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ療法であって、ＣＨＤＭＡＰＰを、最大の効果の半分が得られる有効濃度値（ＥＣ５０）と最大の効果が得られる有効濃度値（ＥＣ１００）との間の用量あるいは、ＥＣ５０の１１０％と２００％との間、あるいは好ましくは、ＥＣ５０値の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１６０％、１７５％または２００％の用量で、１週間ごとから８週間ごとの間で温血動物に投与する療法にも関するものである。
本発明のさらなる態様および利点については、実験に関する以下のセクションで開示するが、これはあくまでも一例にすぎず、本願の範囲を限定するものではない。本願には多数の参考文献を引用しているが、これらの引用文献各々の内容を本明細書に援用する。
実施例１
ＢｒＨＰＰの合成
ガラス製品および設備をすべて使用前に数時間乾燥させた。特に明記しない限り、試薬と開始材料についてはフルカ（Ｆｌｕｋａ）から入手した。三ナトリウム（Ｒ，Ｓ）−３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェート（ＢｒＨＰＰ）を以下の手順で白色の非晶質粉末として生成した。塩化トシル（４．８ｇ、２５ｍｍｏｌ）と４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−）ピリジン（３．４ｇ、２７．５ｍｍｏｌ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））とを、氷浴中で冷却した２５０ｍｌ容の三首フラスコにて、磁気攪拌下で無水ジクロロメタン９０ｍｌと混合した。続いて、３−メチル−３−ブテン−１−オール（２．２ｇ、２５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン約１０ｍｌに加えた溶液を、注射器でフラスコの隔壁からゆっくりと導入した後、氷浴を取り除いた。反応をシリカゲルＴＬＣ（ペンタン／酢酸エチル、８５：１５（ｖ／ｖ））でモニタリングした。一定速度で攪拌しながら２時間経過後、混合物をヘキサン１リットルに希釈して沈殿させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。この濾過／懸濁工程についてはジエチルエーテルを用いて繰り返し、得られた油状物をシリカゲル（ペンタン／酢酸エチル、８５：１５（ｖ／ｖ））での液体クロマトグラフィで精製したところ、３−メチル−３−ブテン−１−イル−トシレートの黄色の油状物（５．６ｇ、２３．５ｍｍｏｌ、収率９４％）が得られ、これを乾燥Ｎ２下４℃に維持した（陽性モデルＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２４１ ［Ｍ＋Ｈ］＋；ｍ／ｚ ２５８［Ｍ＋ＮＨ４］＋、ｍ／ｚ ２６３［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｍ／ｚ ２５８のＭＳ２］：ｍ／ｚ １９０（Ｃ５Ｈ８損失））。
脱イオン水（ＮＨ４ＯＨでｐＨ９に調節）１００ｍｌに溶解させたピロリン酸二水素二ナトリウム（５１．５ｍｍｏｌ、１１．１ｇ）を、カチオン交換ＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８（４２ｇ、Ｈ＋の形態で２００ｍｅｑ）カラムに通し、脱イオン水（ｐＨ９）１５０ｍｌで溶出した。回収した溶液を水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムでｐＨ７．３に中和し、凍結乾燥させた。得られた吸湿性の粉末を無水アセトニトリルで可溶化し、減圧下で繰返し水分を蒸発させてさらに乾燥させた。得られたトリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）ハイドロゲノピロホスフェート（ＨＰＡＥＣにより純度９７．５％；下記参照）を無水条件にてモレキュラーシーブ下、−２０℃で保管（濃度、〜０．５Ｍ）した。無水アセトニトリル中、トリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）ハイドロゲノピロホスフェート（０．５ Ｍ、２．５ｅｑ）５０ｍｍｏｌを含有する溶液１００ｍｌを、氷浴中で冷却した２５０ｍｌ容の三首フラスコにて、磁気攪拌下で、注射器で隔壁を介して導入した３−メチル−３−ブテン−１−イル−トシレート２０ｍｍｏｌ（４．８ｇ）とゆっくりと混合した。２０分後、氷浴を取り除き、反応物を室温にて２４時間攪拌下に放置した。この反応物をＨＰＡＥＣ（下記参照）で分析し、水分を蒸発させ、アンモニウムハイドロゲノカーボネート（２５ｍＭ）の溶液（９８容量％）と２−プロパノール（２容量％）で構成される混合物５０ｍｌに希釈した。得られた混合物を、事前にアンモニウムハイドロゲノカーボネート（２５ｍＭ）の溶液（９８容量％）および２−プロパノール（２容量％）２００ｍｌで平衡化しておいたカチオン交換ＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８（ＮＨ４＋、７５０ｍｅｑ）カラムに通した。同じ溶液２５０ｍｌをゆっくりと流してカラムを溶出し、氷浴中に保持したフラスコに回収した。回収された液体を凍結乾燥させ、得られた白色の粉末をアンモニウムハイドロゲノカーボネート（０．１Ｍ）１３０ｍｌで可溶化し、アセトニトリル／２−プロパノール（ｖ／ｖ）３２０ｍｌで終えた。攪拌後、無機ピロホスフェートおよびモノホスフェートの白色沈殿物を遠心分離（２１００×ｇ、１０℃、８分間）で除去した。この手順を３回繰返し、上清を回収して乾燥させ、得られた油状物を水１２０ｍｌで希釈した。未反応トシレートの残りを分液漏斗にてクロロホルム／メタノール（７：３（ｖ／ｖ））で３回抽出し、最終的に水相を凍結乾燥させた。得られた白色の粉末を再度アセトニトリル／クロロホルム／メタノール（５０：３５：１５（ｖ／ｖ））で２回洗浄し、穏やかなＮ２流下で乾燥させた。この手順で純粋な３−メチル−３−ブテン−１−イル−ピロホスフェート三アンモニウム塩１１．２５ｍｍｏｌが得られ（収率７５％）、これを酸化できるよう水２００ｍｌに溶解させた。３−メチル−３−ブテン−１−イル−ピロホスフェート６ｍｍｏｌについて、ＢｒＨＰＰの酸性溶液（ｐＨ２．１）５．８ｍｍｏｌ（２．３ｇ）が蒸発した後に生じる、黄色を帯びた色が出現するようになるまで、４℃に維持したＢｒ２（０．１Ｍ）の水溶液を滴下して加え、これをＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８〜２００（ＮＨ４＋、４８ｍｅｑ）に通すことで、すみやかに中和した。凍結乾燥後に得られたＢｒＨＰＰのアンモニウム塩を水に溶解させ、Ｄｉｏｎｅｘ ＯｎＧｕａｒｄ−Ａｇ（２ｍｅｑ／単位）カートリッジとｍｉｌｌｉ−Ｑ水で溶出した（１００ｍｅｑ、２１ｇ）ＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８〜２００（Ｎａ＋）のオンラインカラムに通すことで、ブロミドと分離した。ＢｒＨＰＰ（Ｎａ＋）の無色のストック溶液を０．２μＭのＡｃｒｏｄｉｓｃ ２５膜で濾過し、アリコートとして−２０℃で保持した。
ＨＰＬＣ−１ｍｌ／分、２０℃で、下記に示す三次元勾配で溶出した分析用Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ５μＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）上のＨＰＬＣ（ＳｐｅｃｔｒａシステムＰ１０００ ＸＲ装置）でＢｒＨＰＰを最終精製した。検出器の上流すなわち、溶離液の一部を１９０μｌ／分でオンラインＭＳ検出器（下記参照）に分配し、残りの８１０μｌ／分をＷａｔｅｒｓ ９９６フォトダイオードアレイ検出器に送った。λ＝２２６ｎｍでの単波長検出は、２５μｌ（Ｒｈｅｏｄｙｎｅインジェクター）に注入したＢｒＨＰＰ ６μｇで７ミリ吸収（ｍｉｌｌｉａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）単位のものであった。勾配プログラムについては以下のとおりとした。溶媒Ａ、アセトニトリル；溶媒Ｂ、５０ｍＭ酢酸アンモニウム；溶媒Ｃ、水；０〜７分間、Ｃ中５％Ｂ；７．１〜１１分間、１００％Ｃ；１２〜１５分間、１００％Ａ；１５〜１７分間、１００％Ｃ。
実施例２
Ｈｅｃｈｔら（２００２）の方法によるＨＤＭＡＰＰの合成
（Ｅ）−４−クロロ−２−メチルブト−２−エン−１−オール
ＴｉＣｌ４（２８５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１６４．５μＬ）をＮ２下にて乾燥ＣＨ２ＣＬ２ ３ｍＬに溶解させる。この溶液を−８０から−９０Ｃまで冷却し、市販の２−メチル−２−シニルオキシラン（ｃｉｎｙｌｏｘｉｒａｎｅ）（９８．２μＬ、１ｍｍｏｌ）８４ｍｇをＣＨ２ＣＬ２ ０．４ｍＬに加えた溶液を、攪拌しながら滴下して加える。９０分後、１Ｎ ＨＣｌ ５ｍＬを加えて反応混合物を急冷する。室温まで温めた後、相同士を分離し、水性層をジエチルエーテル２０ｍＬで４回抽出する。混合有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させる。溶媒の蒸発とフラッシュクロマトグラフィ（ペンタン／ジエチルエーテル１：１ｖ／ｖ）での精製によって、純粋な生成物９３ｍｇが得られる。
（Ｅ）−４−クロロ−２−メチルブト−２−エン−１−オールから得られる（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチルブト−２−エニル４−ジホスフェート
ＭｅＣＮ ３００μＬ中にトリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）水素ピロホスフェート２２７ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、（Ｅ）−４−クロロ−２−メチルブト−２−エン−１−オール（２５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ ２５０μＬに加えた溶液に室温にてゆっくりと添加し、朱色の溶液を得る。２時間後、溶媒を減圧下にて除去する。オレンジ色の油状物をＨ２Ｏ ３ｍＬに溶解させ、２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ２０ｍＬで平衡化しておいたＤＯＷＥＸ ５０ ＷＸ８（１×４ｃｍ、ＮＨ４＋フォーム）カラムに上記の溶液を通す。このカラムを２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ２０ｍＬで展開する。画分を一緒にし、凍結乾燥させて純粋な生成物０．１９ｍｍｏｌ（９０％）を得る。
実施例３
ＢｒＨＰＰ非−ＧＬＰ研究
３．１．材料および方法
３．１．１．動物
−第１群：モーリシャス国マエブール、フェルネー（Ｆｅｒｎｅｙ）Ｓ．Ｅ．に所在するＣ．Ｒ．Ｐ． Ｌｅ Ｖａｌｌｏｎから得た、目的を持って繁殖させた健康な雄のカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）５匹。研究開始時の体重範囲３．７から４．６ｋｇ。
−第２群：Ｃ．Ｒ．Ｐ．Ｌｅ Ｖａｌｌｏｎから得た、目的を持って繁殖させた健康なカニクイザル１０匹（雄５匹と雌５匹）。研究開始時の体重範囲１．８から３．５ｋｇ、年齢２から３歳。
牧畜条件については、監視温度、湿度、換気、照明サイクルを含む欧州での要件に合わせた。第１群の動物をＢｉｏｍａｔｅｃｈ（フランス、シャッセシュールローヌ）で飼育し、第２群の動物をＭＤＳ（フランス、Ｌｅｓ Ｏｎｃｉｎｓ）で飼育した。
いずれの実験も進行前に地元の倫理委員会に通した。
３．１．２．ホスホ抗原
三ナトリウム（Ｒ，Ｓ）−３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−ジホスフェートＢｒＨＰＰの合成およびキャラクタリゼーションについては、過去に説明がある（上記参照、Ｅｓｐｉｎｏｓａ、２００１で実施されているようなもの）。本明細書に記載の実験用のロットには、ＧＭＰ条件下でＰＣＡＳ−ＳＥＬＯＣ（フランス、リマイ）が製造およびキャラクタライズしたものを用いた。滅菌と臨床単位調製はＧＬＰ下でＡＸＣＥＬＬ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（フランス、サン−ジェニスラルジャンティエール）が行った。滅菌水溶液中でのＢｒＨＰＰの滴定については、電気伝導度検出（ＤＩＯＮＥＸ ＤＸ６００システム）を行う高性能アニオン交換クロマトグラフィで実施した。
３．１．３．投薬および血液サンプリング
−第１群：注射や採血を行う前に、動物にＺｏｌｅｔｉｌＮＤ １００（Ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ−Ｚｏｌａｚｅｐａｍ、フランス、カーロス、Ｖｉｒｂａｃ）６ｍｇ／ｋｇを筋肉内注射して麻酔をかけた。
−第２群：麻酔をかけずに動物を手で押さえて注射と採血を行った。
−４日間ＢｒＨＰＰのみで処置（第１群）：０日目に、生理食塩水１０ｍｌにＢｒＨＰＰ １ｍｇ／ｋｇを加えたものを動物２匹に与えた（外の（ｅｘｔｅｒｎａｌ）伏在静脈に導入したマイクロフレックス注入セット）後、生理食塩水２０ｍｌ中４ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇを、１日目、２日目、３日目に同じようにして与えた（注入時間：１０分から１５分間）。
−ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２同時処置（第１群）：最終容量５０ｍｌで生理食塩水に加えたＢｒＨＰＰを２０ｍｇ／ｋｇを１回で、または４ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態のＢｒＨＰＰで１６．７ｍｇ／ｋｇまたは３．３ｍｇ／ｋｇ）ずつ１日５回に分けて、上記と同じようにして動物５匹に与えた（注入時間：３０分間）。ＩＬ２（１バイアルあたり１８百万ＵＩ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、米国Ｃｈｉｒｏｎ社）を滅菌水１ｍｌに再懸濁させ、最終濃度１．８百万ＵＩ／ｍｌで１０ｍｌになるまで４％ＨＳＡを用いて希釈した。１回目の処置サイクルでは、すべての動物に対して、５日間０．９百万単位のＩＬ２を１日２回注射する形で同用量のＩＬ２を与えた。２回目の処置サイクルでは、以下のＩＬ２処置を皮下注射で動物にほどこした：０．１５百万単位を１日２回で９日間（動物Ｚ０５９）、０．３百万単位を１日２回で５日間（Ｚ１３５）、０．９百万単位を１日２回で５日間（動物Ｚ７１４）または９日間（動物Ｘ９７３）。
動物１匹にＢｒＨＰＰを８０ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態で６６．６ｍｇ／ｋｇ）＋０．６百万単位を１日１回皮下注射することからなるＩＬ２で９日間の同時処置をほどこした。
−ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２同時処置（第２群）：常に３０分以内で約５０ｍｌの注射ができるように（頭部または外の伏在静脈に導入したマイクロフレックス注入セット）、ＢｒＨＰＰを適切な最終濃度（注射する用量と最後に記録された体重によって決まる）まで生理食塩水で希釈した。すべての動物に、１日あたり０．６百万ＩＵのＩＬ２を７日間与えた。ＩＬ２を、滅菌水中ＩＬ２を０．３百万ＩＵずつ２回に分け、８時間の間隔をあけて皮下注射した。対照動物にはＩＬ２しか与えなかった。
大腿血管／動脈から１週間に２回、血液試料（１から４ｍｌ）を採取し、ＥＤＴＡ含有チューブに入れた。フローサイトメトリー分析を行う前に、チューブを室温（ＲＴ）にて一晩シップ（ｓｈｉｐ）した。
３．１．４．フローサイトメトリー
サル全血について、抗−ＣＤ３−ＰＥ抗体および抗−Ｖガンマ９−ＦＩＴＣ抗体および／または抗Ｖｄ２抗体（ＣＤ３−ＰＥ：ＳＰ３４クローン、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、フランス、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ）で二重染色した後、１週間に２回、フローサイトメトリーで末梢γδリンパ球を分析した。
抗Ｖガンマ９、クローン７Ｂ６は、ヒトＶガンマ９に対して産生させたモノクローナルであるが、カニクイザルの細胞と交差反応する。これをタンパク質Ａでの親和性クロマトグラフィによって精製し、上述したようにしてＦＩＴＣに結合させた。本発明者らは、この抗体が、市販（Ｅｎｄｏｇｅｎ、マサチューセッツ州ウォーバーン）ＴＣＲ２７３２クローン（リーサスモンキーで他のＶｇ９抗体について、Ｓｈｅｎ、２００２で過去に説明されているとおりであるが、データ表示はない）で染色されるＶｄ２陽性細胞の大半を染色することを確認した。
簡単に説明すると、サルの血液５０μｌを、抗−ＣＤ３−ＰＥ抗体５μｌと抗−デルタ２−ＦＩＴＣ抗体６μｌまたは抗−ガンマ９−ＦＩＴＣ抗体１０μｌを用いて、ＲＴにて１５分間インキュベートする。抗体を１×ＰＢＳ ３ｍｌで洗浄し、ＲＴにて１３００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を破棄する。ＯｐｔｉＬｙｓｅ Ｃ試薬（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ−Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス、マルセイユ）を製造業者の指示通りに用いて赤血球を溶解させる。最終工程で、染色された白血球を遠心分離によって回収し、ＰＢＳ＋０．２％ＰＦＡ ３００μｌに再懸濁させる。分析の直前に、較正したＦｌｏｗ ＣｏｕｎｔＴＭ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ−Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス、マルセイユ）５０μｌを細胞に加え、該当する個体群の絶対数を計数できるようにする。
第２群では、ＣＤ２０−ＦＩＴＣ（２Ｈ７クローン）；ＣＤ３−ＰＥ（ＳＰ３４クローン）；ＣＤ４−ＦＩＴＣ（Ｍ−Ｔ４７７クローン）；ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＳＫ１クローン）（いずれもフランス、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ ＣｌａｉｘのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を使用して、デュアルカラー（ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ）フローサイトメトリーでリンパ球のサブセットも平行して分析した。
Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、ロワシー、フランス）でＥｘｐｏ３２ソフトウェアを用いてフローサイトメトリーを実施した。
３．１．５．サイトカイン検出
血清サイトカイン（ＴＮＦａおよびＩＮＦｇ）を検出し、それぞれＢＩＯＳＯＵＲＣＥ ＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎＴＭ ＥＬＩＳＡサルＴＮＦａおよびＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎＴＭ ＥＬＩＳＡサルＩＮＦｇ（フランス、モンルージュのＣｌｉｎｉＳｃｉｅｎｃｅｓから購入）を製造業者の指示通りに用いて定量化した。
３．１．６．血液学および血清臨床化学
投与の直前直後と１週間に２回、サルのハンドリング（ｈａｎｄｌｉｎｇ）部位で伝統的な血液パラメータの追跡（赤血球、血小板全白血球数および分化した白血球数、ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度）を実施した。
第２群のすべての動物について、注射後４８時間または７２時間に、１６の血液化学パラメータを測定した（ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、ブドウ糖、尿素、総コレステロール量、総ビリルビン量、総タンパク質量、アルブミン、グロブリン、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アスパラテートアミノトランスフェラーゼ、アルカリアミノトランスフェラーゼ）。
３．１．７．生体パラメータの追跡
生体パラメータと臨床パラメータ（一般行動、皮膚、毛、呼吸器系、中枢神経系）に変化がないかどうか、動物を毎日観察し、さらには注射の間と注射後にも観察した。動物の体重を３日に１回（第１群）または１週間ごと（第２群）の定期的に計測した。
（第２群の不眠の動物について）ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２（またはＩＬ２のみ）の注入前と注入終了時に毎回、さらには投与後５日間は１日１回、体温を測定した。投与前と投与終了時に毎回、第２群のすべての動物について心拍数と血圧を記録した。
病的状態／死亡の徴候がないかどうか、すべての動物を少なくとも１日２回観察した。
３．１．８．生検組織標本
２回目の投与の９日後に、ペントバルビタールナトリウムを静脈内注射して第２群の動物５匹を屠殺し、放血し、薬剤の臓器毒性を評価するために完全検視を行った。臓器試料を秤量し、以後の処理のためにＲＰＭＩ培地（ギブコ−ＢＲＬ − Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に回収した。
リンパ系臓器試料（胸腺、扁桃腺、骨髄、腸間膜、鼠径部および気道内リンパ節）を、滅菌した注射器のプランジャで慎重かつ機械的に解離させ、ＲＰＭＩ培地中で数回洗浄し、ナイロン膜（Ｓｃｒｙｎｅｌ ＮＹＨＣ １００μｍナイロン、フランスのＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入）で２回濾過した。続いて、抗−ＣＤ３−ＰＥ抗体と抗−ガンマ９−ＦＩＴＣ抗体で細胞を二重染色し、上述したようにフローサイトメトリーで分析した。
３．２．結果
３．２．１．ＢｒＨＰＰのみではｉｎ ｖｉｖｏでｇ９ｄ２細胞の再現可能な増殖は誘導されない
本発明者らは最初に、ＢｒＨＰＰの注射だけでｇ９ｄ２陽性Ｔ細胞の活性化をｉｎ ｖｉｖｏで支持できるかどうかを試験した。
最初の一連の実験で、サル４匹にＢｒＨＰＰを０．２ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態で０．１７ｍｇ／ｋｇ）注射して１日５回の処置を行い、動物４匹に生理食塩水を注射して処置した。ＢｒＨＰＰをこの用量で注射しても、生命徴候または直腸温で評価した限り、処置済みの非ヒト霊長類に毒性は生じなかった。Ｖｇ９Ｖｄ２ Ｔ細胞を追跡したところ、処置した動物２匹でＶｇ９Ｖｄ２がわずかに増加（％）し、プラシーボ群では増加は認められないが、この増殖は有意ではなかった（データ表示なし）ことが明らかになった。
これよりも分子の用量を上げれば、さらに一貫した活性化または増殖を誘導できるのかどうかを試験するために、他の２匹の動物に、用量を増やしながらＢｒＨＰＰを１日４回注射（１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、あるいはそれぞれこれと等価な用量である０．８３ｍｇ／ｋｇ、３．３３ｍｇ／ｋｇ、１３．３３ｍｇ／ｋｇ、２６．６ｍｇ／ｋｇ、アニオン形態のＢｒＨＰＰ）した。
繰り返すが、処置した２匹の動物では毒性も熱も何ら観察されなかった。Ｖｇ９Ｖｄ２の追跡を行ったところ、１回目の注射後２日目に減少したが、２匹とも９日目に基底レベルまで戻った（図１）ことが明らかになった。ＣＤ２５およびＣＤ６９についての調査研究では有意な結果は得られなかったが、これらのマーカーは非ヒト霊長類細胞の研究には最適なものでなかったのかもしれない。
ＢｒＨＰＰ処置時にＶｇ９Ｖｄ２細胞の目的の応答が得られなかったことについては、少なくとも、ｉ）ＢｒＨＰＰはピロホスフェートを含有する小分子であるため、極めて短時間で排泄または分解されてしまい、細胞の活性化を可能にする上で十分に標的細胞と接触できなかったか、ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでのｇ９ｄ２細胞の増殖には、ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合と同様に、サイトカイン、特にＩＬ２の存在が必要であるという２つの可能性が考えられる。
本発明者らは、現時点では分子をｉｎ ｖｉｖｏで追跡できる十分な感受性のある分析方法を知らないが、Ｖｇ９Ｖｄ２細胞を誘因するにはｉｎ ｖｉｖｏでの血清濃度で十分ではないかと思われた。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、本発明者らならびに他の研究者（Ｌａｎｇ、１９９５）が、Ｖｇ９Ｖｄ２細胞の活性化が分子の添加後数分以内に起こることを明らかにしている。ｉ）このような小分子で可能性のある迅速な腎臓クリアランスと、ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでの分解プロセスの２つの機序が、ｉｎ ｖｉｖｏでの分子の活性化を妨げている可能性がある。霊長類の血清に含まれる分子の半減期についての研究から、この分子の半減期は３７℃で約１時間であることが明らかになった。この分子が分解される主な機序は、最初のホスフェートの除去によって、分子生物学的に不活性になることである。それにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏで血球または臓器に関連する分解プロセスがそれ以上起こらないのであれば、比較的多い量で静脈内経路から注射される分子の濃度を相応の時間２０ｎＭ ＥＣ５０未満に維持しなければならない。
細胞の活性化についての解明を試みるべく、本発明者らは低用量のｒｈＩＬ２とＢｒＨＰＰの同時注射について試験を行った。
３．２．２．ＢｒＨＰＰ＋ＩＬ２は、カニクイザルのｉｎ ｖｉｖｏにてＶｇ９Ｖｄ２細胞の再現可能な一過性の増殖を誘導する
動物４匹と対照例（第１群の動物）１匹とを、ＢｒＨＰＰまたは生理食塩水と低用量のｒｈＩＬ２との組み合わせで処置した。この動物群は、ＢｒＨＰＰのみを注射した際にＶｇ９Ｖｄ２の増加が認められなかった動物２匹と、新たな動物３匹とで構成されていた。ＢｒＨＰＰ処置した動物４匹のうち、動物２匹にはＢｒＨＰＰを４ｍｇ／ｋｇずつ１日５回注射し、動物２匹には２０ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態で１６．７ｍｇ／ｋｇ）を１回注射した。ＢｒＨＰＰ処置した動物と対照例とに、５日間皮下注射で０．９百万単位を１日２回投与することからなる同じｒｈＩＬ２療法をほどこした。対照動物については、まず生理食塩水とＩＬ２で処置した上で、１４日後にＢｒＨＰＰをシングルショットと２回目のＩＬ２を５日間投与することで処置した。
動物を血液学的に追跡したところ、ＢｒＨＰＰ処置した動物ならびに対照例でリンパ球数が２から４に増えることは、ＩＬ２投与と整合することが明らかになった。
ＣＤ３陽性細胞での増加率（％）とＶｇ９Ｖｄ２の絶対数の具体的な増加を、すべてのＢｒＨＰＰ処置動物で観察した（図２）。３日目にすでにわずかに増加していたところへ７日目に増殖が認められ、１０日目には処置前のレベル近辺まで戻ったことから、この増加は一過性である。ＩＬ２だけで処置した対照動物では、絶対数にわずかな増加が認められたが、パーセンテージは増加しなかったため、他のリンパ球サブセット同様に、末梢Ｖｇ９Ｖｄ２も、ＩＬ２投与時にわずかに増加するのではないかと考えられた。ＩＬ２だけでのサイクルの後、対照動物にＢｒＨＰＰを投与すると、処置した動物の場合と整合する増殖が起こるため、この動物を対照として有効なものとした。
Ｖｇ９Ｖｄ２の絶対増加率は、同じ用量を５日の注射に分けた（×８および×１８）（図１ｃ）動物よりも、ＢＲＨＰＰ（×３０および×４０）の用量を１回で与えた２匹の動物での方が高かった。これはおそらく、数回にわたる注射の有害作用か個々の注射用量が少なすぎるかのいずれかが原因であろう。注射を１回で行えば少なくとも効率的かつ実用的であるため、次の実験は生成物を１回で注射して行った。
３．２．３．カニクイザルにおけるＢｒＨＰＰの用量範囲の作用
分子の用量範囲による作用を評価するために、新たな動物１０匹（第２群動物）に対して新たな実験を設定した。雄が１匹と雌が１匹の２匹の動物のサブグループを、ＢｒＨＰＰで用量を増やしながら（０、０．２、４、２０、８０ｍｇ／ｋｇ）処置し、ＩＬ２で７日間同時処置した。
繰り返すが、ＩＬ２だけで処置した動物には、他のリンパ球サブセットと比較して同じ次元でのＶｇ９Ｖｄ２細胞のわずかな増加であった。
用量０．２ｍｇ／ｋｇでは、Ｖｇ９Ｖｄ２の絶対数と％の両方について対照動物と区別がつかなかった。７日目に４から８０ｍｇ／ｋｇ（図３ａ）からのＶｇ９Ｖｄ２の絶対数と％の両方で、用量範囲による作用を観察したところ、明らかにプラトーには達していなかった。繰り返すが、％と絶対数は短時間で処置前のレベルに戻った。
この処置の間にはプラトーに達しないため、１回目の注射の２１日後に、Ｖｇ９Ｖｄ２が処置前のレベルに戻ってから、用量を２０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇの範囲にして、もう一度同じ動物を処置した。１回目の処置が２回目の処置に対しておよぼす潜在的な影響を最小限に抑えるために、新たな用量（１２０および１６０ｍｇ／ｋｇ）については１回目の処置でほとんど応答しなかった動物（すなわち、最初の処置過程で０．２および４ｍｇ／ｋｇで処置した動物、図３ｂ）に与えた。
この２回目の注射後の増加のタイムラインは、上述したものとほぼ同じであった。最高濃度で、循環Ｖｇ９Ｖｄ２のレベルが循環ＣＤ３陽性細胞の約８０％に達し（図３ｂ）、絶対数は平均でＶｇ９Ｖｄ２細胞１０，０００個／ｍｍ３に達した点に注意されたい。Ｖｇ９Ｖｄ２の数とパーセンテージは５日目から７日目の間のピークの後に減少したが、注射前のレベルに戻るまでには、用量が最大の２つではより時間がかかるように思われる。
注射１と注射２でためたデータから、応答ピーク時のＶｇ９Ｖｄ２細胞の絶対数とパーセンテージの両方について、明らかに用量範囲による作用があることが分かった（図３ｃおよび図３ｄ）。特にエラーバーで示すように１２０ｍｇ／ｋｇの群で、０．２から４ｍｇ／ｋｇの間は有効用量がなかったにもかかわらず、プラトーを得るにはこれよりも高い用量が必要となり、個々には若干のバラツキがあったとはいえ、上記の用量範囲による作用が観察される。
３．２．４．ＩＬ２スケジュールの影響
第１群の動物５匹にＢｒＨＰＰを注射した後、異なる用量とタイムスケジュールでＩＬ２を注射した。図６に示されるように、用量が０．１５百万単位と低いときであっても、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を支持するには１日２回で十分であり、明らかにこれよりも高い用量（０．３および０．９百万単位を１日２回）の場合と等しい。ＩＬ２での処置を６日以上行ったときに、Ｖγ９Ｖδ２の増殖の長さが長くなるようには見えないが、もっと多くの動物を試験してこの点を明らかにすべきである。興味深いことに、０．６百万単位のＩＬ２を１日１回の注射で皮下注射した動物でも、Ｖγ９Ｖδ２細胞の増殖が認められた（データ表示なし）。
３．２．５．ホスホ抗原＋ＩＬ２誘導増殖を少なくとも５回連続して再現することが可能
最近になって、ホスホ抗原含有調製物（すなわちＢＣＧ）のリコール注射に対するメモリタイプの応答が、霊長類のモデルで示唆された。本発明者らは、合成リガンドの純粋な調製物とＩＬ２同時処置でこのような応答が得られるのかどうかの試験を行った。
第１群の動物を２０ｍｇ／ｋｇのシングルショットで２回目に処置し、７日間のＩＬ２とＶｇ９Ｖｄ２の増加をフローサイトメトリーでモニタリングした。２回の注射で得られた倍増量を図４ａに示す。Ｖｇ９Ｖｄ２の増幅タイミングは１回目の注射のときと同じであった。１回目の注射のときにシングルショットのＢｒＨＰＰで処置した２匹の動物では、２回目の注射での増幅率がわずかに低下した。１日５回、ＢｒＨＰＰを４ｍｇ／ｋｇずつ注射して処置した２匹の動物では、２回目の注射で増幅率がわずかに高かったが、これはおそらく、上述したように何回かに分けて注射をするよりも１回で注射をする方が効果が高いことを反映しているのであろう。
上述したように、この用量範囲のアッセイでは第２群の動物に連続２回注射を行った。興味深いことに、１回目に８０ｍｇ／ｋｇで処置した上で２０ｍｇ／ｋｇでの処置を行った２匹の動物では、１回目のＢｒＨＰＰ注射を２０ｍｇ／ｋｇにした動物どれと比べても増殖は少なかった（図４ｂ）。１回目に２０ｍｇで処置した後に８０ｍｇで処置した動物では、１回目の注射で８０ｍｇ／ｋｇで処置した動物の場合に匹敵する増幅が見られた。総合すれば、これらの結果から、ＢｒＨＰＰ＋ＩＬ２増加に対するＶｇ９Ｖｄ２の応答を２回繰り返すことができるが、増殖率は低くなる場合があろうと考えられる。
連続注射がＶｇ９Ｖｄ２の応答に対しておよぼすと考えられる影響をさらによく理解するために、第２群の動物５匹（サブグループ１つあたり動物１匹）を、２回目の注射の２１日後に３回目のＢｒＨＰＰ注射サイクルで処置し、さらに２１日後に４回目のサイクルで処置した。
繰り返すが、Ｖγ９Ｖδ２の増殖動態は上述したものと同じであり、ピークは５日目から９日目の間にあった。図３ｃに示されるように、動物１匹で３回目の注射のときに大幅な増加が見られた（×２８）。興味深いことに、この動物は、１２０ｍｇ／ｋｇの２回目の注射後に基底レベルに戻らなかった唯一の個体であった（動物２０３４、図３Ｂ）。１回目の２過程にわたる処置でＩＬ２しか与えられなかった対照動物では、１回目の２処置サイクルにおいてこの用量で処置した動物４匹で得られた値に匹敵する、４０前後の増加が得られた（図４ｂ）。他の３匹の動物では、増幅が４０未満であり、同じ用量で注射１または２にて処置した動物での増幅よりも低かった。
８０ｍｇ／ｋｇのＢｒＨＰＰおよびＩＬ２の４回目の注射で処置した動物５匹で、Ｖｇ９Ｖｄ２の検出可能な増加が認められたが、これは３回目の注射で得られたよりは低かった（図４ｂ）。
要するに、ＢｒＨＰＰ＋ＩＬ２の同時処置によるＶｇ９Ｖｄ２の増殖の誘導は何回か再現可能であることが分かった。これらの実験では、本発明者らはＢｒＨＰＰの注射を２０日間またはそれ以上の間隔で行って、連続４回の増殖を達成できた。
３．２．６．ホスホ抗原での攻撃時におけるｇ９ｄ２ Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインの短期産生
Ｖｇ９Ｖｄ２細胞は、ホスホ抗原での攻撃時にＴＮＦａおよびＩＦＮｇをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する周知の細胞である。これらの細胞が上記サイトカインのｉｎ ｖｉｖｏにおける起源となり得るか否かを評価するために、ＢｒＨＰＰ注射のすぐ後に何匹かの動物の血清を採取した。
１回目の用量範囲アッセイ（０から８０ｍｇ／ｋｇ）で注射直前と注射の１時間後ならびに４時間後に、第２群の動物から血清試料を採取し、ＴＮＦａとＩＦＮｇに特異的なＥＬＩＳＡでアッセイした。
処置した動物すべてにおいて、ＩＦＮγの評価から有意な結果は得られなかった。
ＢｒＨＰＰ注射の１時間後に最高用量（８０ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物の血清において、ＴＮＦαが検出可能であった（図５ａ）。ＴＮＦａの血清レベルは急速に低下し、ＢｒＨＰＰ注射の４時間後には検出できなくなり、血液中のＶｇ９Ｖｄ２が増加する間も検出できないままであった。このことから、Ｖｇ９Ｖｄ２によって細胞内の予め形成されたプールからＴＮＦａが急速に産生され、以後、この薬剤による最初の活性化後にはほとんど産生されないと考えられる。
上記薬剤での増殖後の細胞のサイトカイン産生能を試験するために、第２群の動物２匹に対して、Ｖｇ９Ｖｄ２のレベルがピークにあった８０ｍｇ／ｋｇでの４回目の注射から７日後に、８０ｍｇ／ｋｇで５回目のＢｒＨＰＰ注射（ＩＬ２なし）を行った。図５Ｂに示されるように、処置した動物の血清ではＴＮＦａとＩＦＮｇのどちらも検出可能であった。ＴＮＦａの産生は、注射の４時間後にレベルが検出不能になる１回目の実験の場合と同じ動態をとった。逆に、ＩＦＮｇは注射の１時間後に検出可能になり、注射の４時間後に増加したことから、このサイトカインが、ゆっくりとではあるが、持続的に産生されるのではないかと考えられる。
３．２．７．ＢｒＨＰＰ単独注射またはＩＬ２を併用した場合の毒性の欠如
ＢｒＨＰＰのみまたはＩＬ２との併用で処置したどの動物でも、臨床パラメータまたは血液化学パラメータ（材料および方法を参照）に変動は認められなかった。血液学的な視点からいうと、ＩＬ２で処置したすべての動物で、リンパ球の一過性の増加（２から５倍）が観察された。最高用量のＢｒＨＰＰで処置した動物では、末梢血でのＶｇ９Ｖｄ２のピークに対応して、リンパ球増加が観察された。
処置した動物の中には血清中に検出可能なレベルでＴＮＦαおよびＩＦＮγ炎症性サイトカインが存在していた個体があったにもかかわらず、処置したどの動物でも直腸温が大きく影響することはなかった点に注意されたい。
実施例４
カニクイザルでのＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（ＢｒＨＰＰ）Ｉ．Ｖ．薬力学研究
このＧＬＰ研究の目的は、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（ＢｒＨＰＰ、２００ｍｇ；ＧＭＰバッチ）のみの場合とＩＬ−２と併用した場合について、カニクイザルに数回のｉ．ｖ．投与をした後における薬力学的特性をさらに探求することにあった。特に、この研究では、以下の項目を評価するつもりでいた。
−Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍの注射とγδ Ｔ細胞末梢増幅との間の用量−作用関係；
−雄と雌の動物に２回目、３回目、最大５回までＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍを投与したときの薬力学的作用；
−Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍでの処置後に全身性サイトカインを投与することでｉｎ ｖｉｖｏで誘導したγδ Ｔ細胞の機能；
−ＩＬ−２だけで処置した場合の作用と０．６百万ＩＵ／日／動物の選択用量の正当性の確認
動物２匹（雄１匹＋雌１匹）ずつからなる５つの群に、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍをさまざまな用量レベルでゆっくりと注入（３０分間で５０ｍｌ）しながらｉ．ｖ．投与した。雄には、屠殺前にＢｒＨＰＰを続けて２回注射（０日目と２２日目）し、雌には４回注射（０日目、２２日目、５２日目、８４日目）した。４回目の処置に対する応答レベルに応じて選択した２匹の雌に、全身性サイトカイン薬用量についてγδ細胞末梢が増加している間の９１日目にＢｒＨＰＰだけを追加で注射した。
試験生成物の投与スケジュールを以下の表１にまとめておく。
Figure 2006510629
表１に示す用量レベルは、それぞれの用量に０．６を乗算することで、これに相当する純粋な（アニオン）形態のＢｒＨＰＰに変換できる。よって、表１の用量０．２、４、２０、５０、８０、１２０、１６０ｍｇ／ｋｇはそれぞれ、アニオン形態のＢｒＨＰＰで０．１２、２．４、１２、３０、４８、７２、９６ｍｇ／ｋｇと等しい。
ＩＬ−２を以下の頻度でｓ．ｃ．投与した。０日目から６日目までと２２日目から２８日目まではすべての動物；２５日目から５８日目までと８４日目から９０日目まではすべての雌。ＩＬ−２を約８時間あけて０．３百万ＩＵずつ２回のｓ．ｃ．注射で投与したが、これは０．６百万ＩＵ／日／動物に相当する。
結果
ＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍおよびＩＬ−２の１回目と２回目の投与を行ったところ、末梢Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞が７日目に明らかに用量に関連して上昇した。これを図７に示す。
１回目のわずかに効率的な被験用量は、γδ細胞数を２０倍に増やした、４ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態のＢｒＨＰＰで２．４ｍｇ／ｋｇ）、２０ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態のＢｒＨＰＰで１２ｍｇ／ｋｇ）であった。ＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの推定ＥＣ５０値は１２０ｍｇ／ｋｇ（７２ｍｇ／ｋｇアニオン形態のＢｒＨＰＰ）前後であり、循環γδ細胞数を１００倍に増やした。試験を行った中で最も高い用量で、循環Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は処置前と比して２００倍以上に増え、末梢リンパ球の大多数を占めていた。
この研究では、ＩＬ−２単独ではｉｎ ｖｉｖｏでγδ Ｔ細胞の特異的増幅が誘導されないことを確認した。
Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍによる処置が血清中でのサイトカイン（ＩＮＦγおよびＴＮＦａ）の産生に対しておよぼす作用について２回研究した。
−１回目の注入後、処置したすべての動物で：ＢｒＨＰＰ注射の１時間後に８０ｍｇ／ｋｇを与えた両方の動物で、全身性ＴＮＦａが有意に産生される（血清濃度６０から１２０ｐｇ／ｍｌ前後）ことが実証された。
−４回目の注射のピーク（７日目）の間に８０ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態のＢｒＨＰＰで４８ｍｇ／ｋｇ）（ＩＬ−２なし）与えた雌２匹（Ｆ２０３２＆Ｆ２０３４）。両方の動物についての血清ＴＮＦａおよびＩＮＦγ濃度の展開を以下の曲線に示す（図８参照）。
このように、ＢｒＨＰＰ／ＩＬ−２の同時処置時にｉｎ ｖｉｖｏで増幅されたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は、検出可能な量の全身性サイトカインも産生する。
実施例５
霊長類での補助的な薬力学的研究
よって、本発明者らは、用量または注射間の間隔を変えて行うＢｒＨＰＰの連続的な注射に対するｉｎ ｖｉｖｏでのγδ Ｔ細胞応答の特徴をさらに証明する目的で、雄のカニクイザルで他の非ＧＬＰ薬力学的研究を行った。本発明者らは、雄では、
−２０または８０ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態で１２または４８ｍｇ／ｋｇに相当）のＢｒＨＰＰを８週間おきに少なくとも３回連続して注射すると、末梢におけるγδ細胞率と絶対数が有意に増加し、
−２０ｍｇ／ｋｇ（アニオン形態で１２ｍｇ／ｋｇに相当）のＢｒＨＰＰを４週間おきに少なくとも４回連続して注射しても、やはりγδ細胞率と絶対数が検出可能な程度に増加する
ということを明らかにした。
そこで、本発明者らは、ＢｒＨＰＰ／ＩＬ−２の同時処置によって誘導されるγδ Ｔ細胞の少なくとも４回の連続した末梢増幅が、雄と雌のカニクイザルでは区別なくいくつかの条件下で得られることを示す。
実施例６
ＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍおよびＢｒＨＰＰのＩ．Ｖ．投与後のカニクイザルにおける二相反復用量毒性研究
この非ＧＬＰ研究のフェーズ１の目的は、２匹のカニクイザル（雄１匹、雌１匹）からなる群で、用量を増やしながらＢｒＨＰＰの最大耐量（ＭＴＤ）を求めることであった。この研究の第２の目的は、研究のフェーズ１で求めたＭＴＤで、２匹のカニクイザル（雄１匹、雌１匹）でＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍを２週間毎日ｉ．ｖ．投与することに伴う毒性を特徴付けることであった。３日または４日ごとに用量レベルを高めた（フェーズ１）後、推定最大耐量（ＭＴＤ）で２週間毎日（フェーズ２）動物を処置した。
合計で４匹のカニクイザル（雄２匹と雌２匹）を２つの群に分け、ＢｒＨＰＰを１時間の注入時間で以下のようにして静脈内投与して処置した。
−フェーズ１（用量を増加）：
第１群（雄１匹および雌１匹）に、３日または４日ごとに用量レベルを増やしながら（１６０、４００、６００、９００、１２００ｍｇ／ｋｇ）ＢｒＨＰＰおよび／またはＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（ＢｒＨＰＰ、２００ｍｇ）をｉ．ｖ．投与した。これらの用量に等しいアニオン形態のＢｒＨＰＰはそれぞれ、９６、２４０、３６０、５４０、７２０ｍｇ／ｋｇである。ＢｒＨＰＰについては、最終的には用量４、１０または１５ｍＬ／ｋｇで乳酸加リンゲルを用いて希釈される、注射用の水に加えて再構成して溶液の形にした。
−フェーズ２（一定用量）：
第２群（雄１匹および雌１匹）に毎日９００ｍｇ／ｋｇ／日（アニオン形態のＢｒＨＰＰで５４０ｍｇ／ｋｇ／日に相当）で２週間、ＢｒＨＰＰをｉ．ｖ．投与した。
死亡や臨床的な徴候がないかどうか、動物を毎日調べた。フェーズ１では研究開始前と投与日、フェーズ２では、フェーズ２の検視日を含めて１週間に２回、体重を記録した。飼料の消費量を、フェーズの少なくとも７日前から開始して毎日推定した。研究開始前と、フェーズ１では投与日、フェーズ２では７日目、さらには両フェーズの終了時に、血液学的、血液生化学的および／または末梢血リンパ球サブセット分析調査を実施した。研究開始前と、フェーズ１では投与日、フェーズ２では１日目と処置終了時に、心電図と血圧を記録した。フェーズ２の１日目と１４日目に、試験対象物の血漿濃度を求めるための血液をサンプリングした。各フェーズの終了時、動物の完全肉眼死後検査を行い、組織を保存した。フェーズ２では、すべての動物について選択した体器官を秤量し、選択した組織の顕微鏡検査を行った。
結果
処置フェーズの間、予定外の死は全く起こらず、関連の臨床的徴候も特に見当たらなかった。どちらのフェーズでもＢｒＨＰＰでの処置は動物の体重増加に何ら影響をおよぼさず、飼料消費量に影響はなかった。
どちらのフェーズでもＢｒＨＰＰは血圧に影響しなかった。フェーズ１では、処置に関連した血液学的または血液化学的な変化は特に見当たらなかった。フェーズ２では、両方の動物でリンパ球数の増加が見られたが、これはＢｒＨＰＰの薬理学的活性がゆえのものかもしれない。
雌では絶対胸腺重量がわずかに少なめだった。
フェーズ１またはフェーズ２の間と肉眼死後検査後のいずれにおいても関連の所見は見られなかった。フェーズ２において、雌では胸腺と腸間膜リンパ節にリンパ球欠乏が認められたのに対し、雄では逆の傾向（腸間膜リンパ節での濾胞胚中心の増加）が見られた。
実施例７
ＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍのＩ．Ｖ．投与後のラットにおける２週間反復用量毒性研究
このＧＬＰ研究の目的は、ラットに２週間毎日ｉ．ｖ．投与した後のＢｒＨＰＰの潜在的な毒性を評価することであった。１１６匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、雄１０匹と雌１０匹の対照群（第１群）１つと、雄１０匹と雌１０匹の処置群（第２群から第４群）３つの合計４つの群に分けた。第２群、第３群、第４群にそれぞれに、８０、１５０、３００ｍｇ／ｋｇ／日（それぞれアニオン形態で４８、９０、１８０ｍｇ／ｋｇに相当）のＢｒＨＰＰを投与した。各処置群には雌６匹と雄６匹のサテライト群も用意した。サテライトの動物は、薬物動態を調べる目的で割り当てたものである。
注射用の滅菌水の溶液と乳酸加リンゲルとしてゆっくりと静脈内注射（０．４ｍＬ／分）して、ＢｒＨＰＰを用量レベル８０、１５０または３００ｍｇ／ｋｇ／日で毎日投与した。対照群には、ビヒクル（高用量群の剤形に近い浸透圧にするために１％ナトリウムを加えてある）を同一の実験条件で与えた。５ｍＬ／ｋｇの一定薬用量を用いた。
死亡や臨床的な徴候がないかどうか、動物を毎日調べた。体重と飼料の消費量を１週間に２回記録した。処置前と処置期間終了時に眼科診察を行った。ＢｒＨＰＰのレベルを求めるための血液試料を、１日目と処置期間終了時にサテライトの動物から採取した。発情サイクルをモニタリングするために、前処理時と処置期間終了時に雌では膣洗浄を実施した。２週目の終わりに、主要な動物すべての血液学的、血液生化学的および尿検査を実施した。研究が終わったら、すべての動物を屠殺し、肉眼死後検査を実施し、特定の臓器を秤量して保存した。対照群と３００ｍｇ／ｋｇ／日の群の動物から得た組織を選択し、顕微鏡検査を行った。
結果
研究の間、予定外の死は全く起こらなかった。１５０および３００ｍｇ／ｋｇ／日（それぞれアニオン形態で９０および１８０ｍｇ／ｋｇに相当）を用いたすべての動物において、多くの場面で投与時の啼鳴が見られた。ＢｒＨＰＰで処置した雌で用量に関連する多めの平均体重増加が見られた。
対照動物とＢｒＨＰＰ処置動物との平均飼料消費量は同様であった。処置期間終了時、３００ｍｇ／ｋｇ／日（アニオン形態で１８０ｍｇ／ｋｇに相当）の動物で関連の眼科的所見は見られなかった。血液学的、生化学的または尿のパラメータのいずれにおいても毒性の有意性に変化はなかった。処置期間終了時、どのＢｒＨＰＰ処置群でも対照群と比較して臓器重量の関連した差はなかった。処置期間終了時、どのＢｒＨＰＰ処置群でも肉眼死後検査での関連の所見はなかった。顕微鏡検査では、対照動物とＢｒＨＰＰ処置動物の両方で尾静脈にわずかな変化が観察されたが、これは毎日静脈内投与を行ったことによる機械的な損傷が原因であった。３００ｍｇ／ｋｇ／日を用いた動物の他の臓器や組織に関連の所見は認められなかった。ＢｒＨＰＰの血中濃度に関する上記以外の結果、発情サイクルと毒物動態の監視内容については、現在分析している。
結論
試験を行った中で最も高い用量で、上記の研究実験の条件にて、ＢｒＨＰＰの副作用が観察されないレベル（ＮＯＡＥＬ）は３００ｍｇ／ｋｇ／日（アニオン形態で１８０ｍｇ／ｋｇに相当）であるとした。
実施例８
ＲＣＣ患者の自家一次腫瘍細胞に対するＢｒＨＰＰ増幅γδ Ｔ細胞の細胞毒性の分析
本研究の目的は次のとおりである。
・ＲＣＣ患者から正常および腫瘍一次腎細胞の獲得
・ＢｒＨＰＰがこれらの患者のＰＢＭＣに対しておよぼす作用の調査
・自家設定での正常および腫瘍一次腎細胞に対して増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の溶解能の調査。この細胞毒性活性をＬＡＫ細胞（リンフォカイン活性化キラー細胞）などの他の自家エフェクター細胞と比較した。
８．１ 材料および方法
患者
この研究に含まれるｍＲＣＣ患者（Ｎ＝１２）は腎明細胞癌腫があり、腎部分摘出または腎全摘出を行った。患者にはいずれも、事前の処置は行わなかった。
１２名の患者のうち７名は、研究の主な部分について試験の初期フェーズ後には含めなかった。ｍＲＣＣ患者らからインフォームドコンセントを得た。
末梢血ガンマデルタＴ細胞の増殖
１２名のＲＣＣ患者（５０ｍｌ）の血液試料を、腎摘出直前と腎摘出から２ヶ月が経過する前に採取した。フィコール−ハイパック密度勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。１名の健常なボランティアから得たＰＢＭＣを対照として利用した。
１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清（放射線照射胎仔クローン、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を加えたＲＰＭＩ １６４０の２４ウェルのプレートにて、２×１０６／ｍｌで１０百万ＰＢＭＣを培養した。
３μＭのＢｒＨＰＰ分子（バッチＩＮＰＡ−０２１４）と１００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２の存在下、１５日間でポリクローナルＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞系が特異的に増大した。
３日目ごとに、培養液の半分に対応する容積分を、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２しか含有しない新しい培地と交換した。
ＬＡＫ細胞の獲得
ｍＲＣＣ患者から得たＰＢＭＣ５百万を、１０００ＵＩ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で６ウェルのプレートにて３日間培養した。これらの細胞毒性活性を自家増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と平行して４時間５１Ｃｒ放出アッセイで評価し、両個体群の細胞毒性効率を比較した。
腫瘍／正常細胞系の確立および培養
コラゲナーゼ（３００Ｕ／ｍｌ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（５００Ｕ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（３０００Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた酵素消化で腫瘍断片から自家一次腫瘍細胞系を引き出した。腫瘍とは距離をあけて採取した腎臓の正常断片にも同じプロトコールを適用し、短期正常腎細胞を引き出した。
１０％ＦＣＳとＵｌｔｒｏｓｅｒ（ギブコＢＲＬ、スコットランド）を加えたダルベッコ変法イーグル培地で、これらの細胞を培養した。
細胞型の特徴付け
患者から得たＰＢＭＣを、冷凍するか上述したようにして培養で直接使用する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養前に、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）およびフィコエリスリン−シアニン５（ＰＣ５）コンジュゲート抗体の以下の組み合わせを用いて、ＮＫ、αβおよびγδ Ｔ細胞個体群（いずれもＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから購入）を決定するためにＲＣＣ患者を分析した。：ＣＤ３−ＰＣ５／Ｖδ２−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ１−ＰＥ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ５６−ＰＥ。培養１５日目、増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞バルクで三重染色を行った。以下の抗体の組み合わせを実施した。
ＣＤ３−ＰＣ５／Ｖδ２−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＣＤ１６−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＣＤ２−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＣＤ５６−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＣＤ６９−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＮＫＧ２Ａ−ＰＥ（ＩｇＧ２ｂ）、ＣＤ９４−ＰＥ（ＩｇＧ１）、ＣＤ１５８ａ，ｂ，ｅ−ＰＥ（ＩｇＧ１）。
アイソタイプの対照物を利用して、バックグラウンドレベルを測定した。単回染色試料での補償を設定し、低前方散乱要素を分析から除外し、１０，０００のイベントを回収し、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
間接的な単色蛍光法によって、正常および腫瘍一次腎細胞を表現型決定した。細胞（２×１０５）を以下の抗体と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。
抗−ＨＬＡ−Ａ２、抗−ＨＬＡ−ＢＣ（クローンＢ１．２３．２）、抗−ＨＬＡ−ＡＢＣ（クローンＷ６／３２）、ＣＤ５４、抗−ＭＩＣＡ（Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ博士から入手したクローンＢＡＭ１９５（イタリア、ジェノバ））、Ｇ２５０−ＦＩＴＣ（Ｈｉｒｓｃｈ Ｆ博士Ｈｏｐｉｔａｌ Ｐａｕｌ Ｂｒｏｕｓｓｅから入手、パリ）、抗−ヒト線維芽細胞（クローンＡＤ０２ディアノヴァ、ハンブルグ）。
細胞をホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、フィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲートヤギ抗−マウスＩｇと一緒に４℃で２０分間インキュベートした。
細胞溶解活性アッセイ
４ｈ５１Ｃｒ放出アッセイで、増大したγδエフェクターＴ細胞の、自家正常および腫瘍標的細胞系、対照の感受性標的細胞系Ｄａｕｄｉおよび対照の耐性標的細胞系Ｒａｊｉに対する細胞毒性を試験した。同じ患者のＬＡＫエフェクターＴ細胞をアッセイに含め、γδ Ｔ細胞のうちのひとつに対する溶解能を比較した。
・標的細胞については、細胞２×１０３個／ウェルの量で使用し、１００μＣｉ５１Ｃｒで６０分間標識した。エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比は３０：１から３．７５：１の範囲とした。
・標準式（（実験−自発的放出／全−自発的放出）×１００）を用いて特異的溶解（パーセンテージで表現）を算出した。データは３重ウェルの平均である。
８．２ 結果
ＲＣＣのある患者のＰＢＭＣでのＴＣＲ Ｖδ２保持Ｔ細胞の選択的増殖
まず、ｍＲＣＣ患者の末梢血からの休止γδ Ｔ細胞をＢｒＨＰＰが増大する機能を、健康なボランティア１名のγδ Ｔ細胞増殖と比較した。患者７名は、血液を採取していなかった（ＢＡＺ、ＤＥＮ、ＧＯＵ、ＳＡＮ）か、病状が明細胞（または従来の細胞）腎癌（ＣＯＵ、ＦＡＢおよびＲＯＵ）ではないため研究に入れることができなかった。
評価可能な患者では、材料および方法で説明したようにしてＰＢＭＣを刺激した。分析した患者１２名について、このうち７名（７／１２または５８％）すなわち、ＢＥＬ、ＦＯＵＲ、ＭＯＲ、ＰＯＵ、ＱＵＩ、ＶＡＧおよびＺＥＮにＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞増幅が認められた。これらのｍＲＣＣ患者は、基線においてγδ Ｔ細胞が１．６％から４．２％であったが、これがＢｒＨＰＰ（ｎ＝７）での刺激後に７３．３％から９４．８％まで増大した。
患者５名すなわち、ＣＨＡ、ＣＨＡＲ、ＰＡＳ、ＳＡＵおよびＳＣＨは、彼らのＶγ９Ｖδ２個体群について特異的にｉｎ ｖｉｔｒｏで増大するのが不可能であったため、細胞毒性試験に入れなかった。これらの「ＢｒＨＰＰ非応答患者」は、基線におけるγδ Ｔ細胞が０．６％から３．８％であったが、これが刺激後（ｎ＝５）に４．７％から１９．６％まで増大した。
腎摘出前の血液試料を入手できた場合、この試料で実験を行った。腎摘出後に採取した血液試料で同一の増幅結果を得られるかどうか確認した（データ表示なし）。
「ＢｒＨＰＰ応答患者」の細胞型特徴付け
効果細胞
ＢｒＨＰＰに応答するｍＲＣＣ患者由来の増殖したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の表現型解析を実施した。患者ＱＵＩおよびＦＯＵＲのデータについては、以下に詳述する理由から示していない。これらの細胞の大半が表現型Ａｇ経験細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）であり、ＬＦＡ−１またはＣＤ２のような接着分子を発現し、同時刺激分子ＮＫＧ２Ｄを発現した。γδ Ｔ細胞の中には、ＣＤ６９およびＨＬＡ−ＤＲの発現で確認すると、活性化表現型が維持されているものもあった。自己のＣＤ８、ＣＤ５６またはＣＤ１６を発現する異なる亜個体群も同定できた。阻害ヘテロダイマー複合体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａはγδ Ｔ細胞のほぼ半分発現されたが、キラーＩｇ様受容体ファミリ（ＣＤ１５８ａ；ｂ；ｅ）に属する受容体は、極めて限られたサブセットにおいて発現された。
標的細胞
短期ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後に、応答患者から採取した腫瘍および正常腎細胞の表現型解析を行った。患者ＱＵＩは、正常な腎細胞を得られなかったことから除外した。他の６名の患者はいずれも、正常な細胞と腫瘍細胞の両方にて高いレベルでクラスＩ ＭＨＣ分子を発現し、接着分子ＣＤ５４に対して陽性であった。予想通り、Ｇ２５０は、さまざまなレベルではあるが腫瘍細胞で特異的に発現された。マーカーＡＳ０２は、培養中、線維芽細胞汚染レベルを示した。これは、患者ＢＥＬ、ＭＯＲ、ＰＯＵ、ＶＡＧおよびＺＥＮの正常な細胞で４．７％から５８．３％、腫瘍の対応物で６．７％から５３．２％の範囲であった。ＺＥＮ以外、線維芽細胞（γδ Ｔ細胞溶解に耐性の細胞型である）汚染レベルが腫瘍培養で対応する正常な細胞培養よりも高かった。患者ＦＯＵＲは、腫瘍培養のみで線維芽細胞が増殖している（ＡＳ０２陽性細胞の９８．５％）ため大幅な汚染を示した点に注意することが重要である。よって、患者ＦＯＵＲを研究の主要な部分から除外した。ＢＡＭ１９５染色によって読み取れるＭＩＣＡ発現レベルは、ＢＥＬ正常腎細胞以外、試験したすべての細胞で低めである。
ｍＲＣＣ患者由来の増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
ＢＥＬ、ＭＯＲ、ＰＯＵ、ＶＡＧ、及びＺＥＮの患者５名について、増幅γδ Ｔ細胞の溶解活性を、伝統的な対照標的（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ）、選択した患者の一次自家正常および腫瘍細胞系に対して、４ｈ標準５１Ｃｒ放出アッセイで測定した。個々のデータと、これらの５名の患者で得られた結果の平均を図９Ａおよび図９Ｂにあげておく。
・ＢｒＨＰＰで増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は、３０：１の比での一次腫瘍細胞系に対する特異的溶解が３６．７＋／−５．４％（範囲２９．１から４３．１％）であったのに対し、一次正常細胞系は同じ比のときに１２．５＋／−５．０％（範囲７．０から１８．９％）溶解した。これらの結果は試験した５名の患者の平均である。
・自家効果細胞による腫瘍細胞の溶解レベルは、正常対照に比して有意に高い。二方向に対応のあるスチューデントのＴ検定では、ｐ値はＥ／Ｔ比３０：１でｐ＝０．０００２、Ｅ／Ｔ比１５：１でｐ＝０．０１、Ｅ／Ｔ比７．５：１でｐ＝０．０４である。
すべての分析培養で、γδエフェクターＴ細胞が、対照の感受性標的細胞系Ｄａｕｄｉ（６８．３＋／−１４．２％）に強い溶解活性を呈し、対照の陰性標的細胞系Ｒａｊｉ（１２．９＋／−５．０％）には極めて低い活性を示した。
患者ＺＥＮでは、自家ＬＡＫ細胞による溶解を調査した。予想通り、ＬＡＫ細胞はＤａｕｄｉ細胞系とＲａｊｉ細胞系に対して溶解活性を示したが、正常細胞および腫瘍細胞に対しても匹敵する効率で溶解活性を示した。これらの結果については、他の患者で確認する必要があるが、いずれにしてもＬＡＫ細胞媒介溶解の特異性がないことは明らかである。
８．３ 考察
この研究では、本発明者らは、ＢｒＨＰＰ刺激によって、ＲＣＣ患者由来の末梢Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、事例では５８％（患者１２名のうち７名）ｉｎ ｖｉｔｒｏにて増大できることを明らかにした。これらの細胞は、細胞毒性アッセイから読み取った限り、自家腎臓腫瘍細胞に対して選択的な溶解性を示し、腎臓の正常細胞には溶解性を持たなかった。
しかしながら、これらの培養中での線維芽細胞による汚染レベルがまちまち（線維芽細胞のパーセンテージは正常細胞で４．７％から５８．３％の範囲、腫瘍細胞で６．７％から５３．２％の範囲）であることから、増大されたγδ Ｔ細胞の一次腫瘍細胞に対する溶解活性が最小になることがある。この一次細胞培養の汚染によって細胞毒性アッセイのＥ／Ｔ比が変わった。
この試験を一層よい条件で実現するために、本発明者らは、特定の抗体（クローンＡＳ０２、Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて線維芽細胞を取り除いた上で、精製腎臓腫瘍細胞を培養することを提案した。
本発明者らは、増大されたγδ Ｔ細胞が線維芽細胞を溶解しないことを確認した。この研究の１名の患者（患者ＦＯＵＲ）から得た腫瘍細胞の培養物では線維芽細胞による汚染が９８．５％であった。増大された自家Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を用いて細胞毒性アッセイを行ったところ、これらの細胞は３０：１比で４．０％溶解するが、Ｄａｕｄｉは同じ比で７５．４％溶解することが明らかになった。
結論として、この研究から、評価可能な患者全員で、自家ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢｒＨＰＰ刺激γδ Ｔ細胞によって、正常な細胞を溶解せずに一次腫瘍細胞を特異的に溶解できることが分かった。
実施例９
ＢｒＨＰＰ化合物およびＨＤＭＡＰＰ化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏでの薬用量応答の比較
９．１ 材料および方法
９．１．１ ｉｎ ｖｉｖｏ
動物
目的を持って繁殖させた８匹の健康な雄のカニクイザル（M．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）。研究開始時、体重３．５から４ｋｇの範囲で、３７から４１月齢であった。
牧畜条件については、監視温度、湿度、換気、照明サイクルを含む欧州での要件に合わせた。動物をステンレス鋼製のケージに入れて個別に飼育した。餌は、新鮮な果物を毎日加えて拡大された霊長類用の完全食（Ｕ．Ａ．Ｒ．、Ｖｉｌｌｅｍｏｉｓｓｏｎ、Ｅｐｉｎａｙ／Ｏｒｇｅ、フランス）を自由に与えた。
灌流の前に動物にＺｏｌｅｔｉｌ（商標）１００（Ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ−Ｚｏｌａｚｅｐａｍ、フランス、カーロス、Ｖｉｒｂａｃ）を６ｍｇ／ｋｇ筋肉内注射して麻酔をかけた。
ＨＤＭＡＰＰ／ＩＬ２
ＨＤＭＡＰＰ：最初は２１．５ｍＭ。
本明細書に記載の方法に従ってＨＤＭＡＰＰを生成した。これを０．２２μＭのマイクロフィルタで濾過して滅菌した。ＨＤＭＡＰＰ水溶液を冷凍保存する。
ＩＬ２：Ｃｈｉｒｏｎ（米国エミリービル）から入手したＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を１バイアルあたり１８Ｍ ＵＩで、−２０℃にて保存し、滅菌水１ｍｌで再構成して注射用とした。この１８Ｍ ＩＵ／ｍｌの開始溶液をｑｓｐ水１０ｍｌで希釈し、３００μｌ（０．６Ｍ ＩＵ）の用量を毎日注射した。希釈溶液のバッチを各々４℃で最大３日間保存する。
注射／血液サンプリング
雄のカニクイザルに、乳酸加リンゲルをビヒクルとして用いて総容量５０ｍｌで３０分間の灌流を行い、ＨＤＭＡＰＰをｉ．ｖ．投与した。
注射したＨＤＭＡＰＰの用量：２．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０２ｍｇ／ｋｇ．。
滅菌水に加えた１日あたり０．６Ｍ ＩＵのＩＬ２を用いて、動物を皮下的に５日間同時処置した。
投与前、ＨＤＭＡＰＰ灌流の４日後、５日後、７日後、１１日後、１４日後に、該当する血球個体群をフローサイトメトリー分析するために血液を採取した。
大腿血管／動脈からヘパリン−リチウム含有チューブに血液試料（１から４ｍｌ）を採取した。フローサイトメトリー分析の前に、チューブを室温（ＲＴ）にて一晩シップ（ｓｈｉｐ）した。
フローサイトメトリー
大腿血管／動脈からヘパリン−リチウム含有チューブに血液試料（１から４ｍｌ）を採取した。フローサイトメトリー分析の前に、チューブを室温（ＲＴ）にて一晩シップ（ｓｈｉｐ）した。
サル全血について、抗−Ｖガンマ９ＦＩＴＣ抗体、抗−ＣＤ３ＰＥ抗体、及び抗−ＣＤ６９ＰＣ５抗体（Ｖガンマ９−ＦＩＴＣ：７Ｂ６クローン、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで生成、精製、ＦＩＴＣ結合させた；ＣＤ３−ＰＥ：ＳＰ３４クローン、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、フランス、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ；ＣＤ６９ＰＣ５：ＦＮ５０クローン、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ−Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス、マルセイユ）で三重染色後、フローサイトメトリーで末梢γδリンパ球を分析した。
簡単に説明すると、サルの血液５０μｌを、抗−ガンマ９−ＦＩＴＣ抗体１０μｌ、抗−ＣＤ３−ＰＥ抗体５μｌ、抗−ＣＤ６９ＰＣ５抗体５μｌを用いて、ＲＴにて１５分間インキュベートした。抗体を１×ＰＢＳ ３ｍｌで洗浄し、ＲＴにて１３００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を破棄した。ＯｐｔｉＬｙｓｅ Ｃ試薬（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ−Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス、マルセイユ）を製造業者の指示通りに用いて赤血球を溶解させた。最終工程で、染色された白血球を遠心分離によって回収し、１×ＰＢＳ＋０．２％ＰＦＡ ３００μｌに再懸濁させた。分析の直前に、較正したＦｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ−Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス、マルセイユ）５０μｌを細胞に加え、該当する個体群の絶対数を計数できるようにした。
Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、ロワシー、フランス）でＥｘｐｏ３２ソフトウェアを用いてフローサイトメトリーを実施した。
９．１．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖アッセイとｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＮＦα放出アッセイを、基本的には実施例３で説明したようにして実施する。
９．２ 結果
９．２．１ ｉｎ ｖｉｖｏ
８匹の被験動物について、以下の表２に示すスケジュールでＨＤＭＡＰＰ注射を行った。
Figure 2006510629
カニクイザルにＨＤＭＡＰＰをさまざまな用量で連続静脈内注射することによる影響をモニタリングした。同じ細胞の末梢γδ Ｔ細胞および絶対血球数のパーセンテージの個々の曲線を、それぞれの動物について求めた。
２．６ｍｇ／ｋｇのＨＤＭＡＰＰを５週間ずつあけて４回続けて注射した後、ｉｎ ｖｉｖｏでの増幅を評価した。４回連続してＨＤＭＡＰＰ処置することで、５日目にそれぞれＣＤ３＋のうちγδ細胞が約６０、５５、６０、４０％となった）。
２０または８０ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（登録商標）を４週間または８週間ずつあけて４回続けて注射した後、ｉｎ ｖｉｖｏでの増幅を評価した。４回連続してＢｒＨＰＰ処置することで、本明細書の上述した例で説明したように、それぞれγδ細胞が繰返し増加した。
フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を求めて判断したＨＤＭＡＰＰとＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。ＨＤＭＡＰＰについては表２に示すとおり４とおりの用量で試験し、図示のように、さまざまな注射回数（２．５ｍｇ／ｋｇ：３回注射；０．５ｍｇ／ｋｇ：５回注射；０．１ｍｇ／ｋｇ：３回注射；０．０２ｍｇ／ｋｇ：３回注射）でデータを得た。
ＢｒＨＰＰについては、０、０．１２、２．４、１２、４８、７２、９６ｍｇ／ｋｇという７とおりの用量で試験した。図面には、ＨＤＭＡＰＰで５日目と７日目、ＢｒＨＰＰで７日目に計数したγδ Ｔ細胞数が示してある。上述したように、γδ Ｔ細胞増殖のピークは注射後５日目に見られた。それぞれの用量範囲について、結果を（ａ）絶対細胞数（／ｍｍ３血液）でのγδ Ｔ細胞の倍増量、（ｂ）絶対細胞数（／ｍｍ３血液）、（ｃ）全循環リンパ球のγδ Ｔ細胞パーセンテージ、及び（ｄ）全循環リンパ球のパーセンテージの倍増量で表してある。
図１０Ａおよび図１０Ｂはそれぞれ、ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰの絶対細胞数（／ｍｍ３血液）を示している。
図１１Ａおよび図１１Ｂはそれぞれ、ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰの全循環リンパ球のγδ Ｔ細胞のパーセンテージを示している。
図１２Ａおよび図１２Ｂはそれぞれ、ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰの絶対細胞数（／ｍｍ３血液）でのγδ Ｔ細胞の倍増量を示している
図１３Ａおよび図１３Ｂはそれぞれ、ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰの全循環リンパ球のパーセンテージの倍増量を示している。
９．２．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性におけるＢｒＨＰＰとＨＤＭＡＰＰの比較
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイを用いて、ＢｒＨＰＰとＨＤＭＡＰＰの生物活性を比較した。ヒトＰＢＭＣ由来のγδ Ｔ細胞増幅のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物活性（ｒｈＩＬ２の存在下）を、ＴＮＦα放出アッセイで評価した。ｉｎ ｖｉｖｏでの活性については、上述したようにして求め、図１０〜図１３に示してある。比較の目的で、今までに本発明者らが評価した中では最も力価の高いアミノビスホスホネートであるアミノビスホスホネート化合物Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ（登録商標）をｉｎ ｖｉｖｏでの比較に含めた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較を図１４に示す。図１４は、化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＣ５０を示しており、ＢｒＨＰＰではＥＣ５０が約３０ｎＭであるのに対し、ＨＤＭＡＰＰではＥＣ５０は約０．６ｎＭであり、力価にほぼ５０倍の差がある。
ｉｎ ｖｉｖｏでの比較を図１５に示す。図１５は、化合物のｉｎ ｖｉｖｏでのＥＣ５０を示しており、ＢｒＨＰＰではＥＣ５０が約１ｎＭであるのに対し、ＨＤＭＡＰＰではＥＣ５０は約５ｐＭであり、力価に約２対数差がある。対照的に、力価の小さいＺｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ（登録商標）でＥＣ５０値約１μＭが示された。
実施例１０
ヒトγδ Ｔ細胞Ｎｏｄ−Ｓｃｉｄ／腫瘍モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの効力
Ｎｏｄ−ＳＣＩＤ／腫瘍マウスモデルを用いることが前提のこのプロジェクトの目的は、ヒトＭＮＣをＢｒＨＰＰによってｉｎ ｖｉｖｏで単回刺激した後のヒトγδ Ｔ細胞の増殖について研究し、かつ展開したγδ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効力を研究することであった。
材料および方法
Ｎｏｄ−ＳＣＩＤ／腫瘍をセットアップし、Ｎｏｄ−ＳＣＩＤのＢｒＨＰＰでヒトＭＮＣを刺激するための予備研究を以下のようにして実施した。
＊ ＡＴＣＣ（７８６−Ｏ、Ｋａｃｉ１、Ｇ４０１およびＧ４０２）から購入した以下の腎臓腫瘍細胞系を利用して、モデルを構築した。７８６−０およびＫａｃｉ−１細胞系は腎明細胞癌腫（ＲＣＣ）、Ｇ４０１横紋筋様およびＧ４０２ ｌｅｉｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｍａであった。
８〜１２週齢のＮｏｄ−ＳＣＩＤマウスを細胞系のレシピエントとして利用した。
それぞれのマウスの左脇腹上部に、細胞２〜５×１０６個をＤ０日目に皮下注射した。腫瘍の見た目と増殖の進み具合を毎週確認した。
腫瘍の見た目と発達は、細胞系と移植細胞数に左右される。たとえば、細胞２×１０６個を移植後、７８６−ＯおよびＫａｃｉ−１には３から４週間必要であるが、Ｇ４０１および４０２には２週間必要であった。
＊ ０日目、ＩＰ ５０×１０６ ＰＢＭＣ（健康なドナーから採取、ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ ｆｒａｎｓａｉｓ ｄｕ ｓａｎｇ）をマウスに注射した後、１０００ＩＵのＩＬ２と混合したＢｒＨＰＰ ４０ｍｇ／ｋｇで刺激した（ＩＰ）。Ｄ５と３日ごとに、マウスを５００ＵＩのＩＬ２で処置した。Ｎｏｄ−ＳＣＩＤ／ヒト（ｈｕ）ＢｒＨＰＰ処置マウスの腹膜腔でヒトγδ Ｔ細胞を発達させた。
抗腫瘍効力
Ｎｏｄ−ＳＣＩＤマウスでの腫瘍の発達とヒトγδ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの刺激を利用して、γδ Ｔ細胞の抗腫瘍作用をｉｎ ｖｉｖｏで研究した。固形腫瘍の体積が＞３０ｍｍ３（式Ａ２×Ｂ／２で算出；式中、ＡとＢはそれぞれ腫瘍の長さと幅を示す）となった３週間後に、７８６−０細胞系２×１０６を移植することで、腫瘍モデルを構築した。マウスを無作為化し、ＰＢＭＣのＩＰを与え、刺激のためにＢｒＨＰＰで処置した。いくつかの群を構成した。
Ａ−負の対照群：この群のマウスには腫瘍細胞系だけを与えた。
Ｂ−ＰＢＭＣ群：マウスに５０×１０６ＰＢＭＣをＩＰ注射した。
Ｃ−研究群：５０×１０６ＰＢＭＣを与えた後のマウスをＢｒＨＰＰおよびＩＬ２で処置した。
それぞれの群について、パラメータを以下のようにして観察した。
−腫瘍の大きさと体積を毎週チェック
−ヒトγδ Ｔ細胞対ａｂヒトＴ細胞のパーセンテージで腹膜腔および血液回収細胞におけるヒトＴ細胞の表現型を毎週判断
−血清学的ＴＮＦおよびＩＮＦチェック
−屠殺時：１−ヒト白血球細胞のホーミングとその表現型（ＩＰ、肝臓、肺、脾臓、骨髄、血液、胸腺および腫瘍）についての表現型研究。
２−レシピエントマウスの腫瘍の免疫組織学化学（ＩＨＣ）的研究。
結果
・腫瘍成長：７８６−Ｏ腫瘍をヒトＩＬ２で処置しても、活性は誘導されなかった。この群と非処置マウス群との間に腫瘍の大きさに違いは観察されなかった。
ＢｒＨＰＰ処置後の最初の数日間における腫瘍の成長を図１５に示す。
ＰＢＭＣ／ＢｒＨＰＰおよびＩＬ２処置群では、処置後の最初の数日間は腫瘍が大きくなったが、その後は腫瘍の大きさが急激に小さくなった。７日目から先は腫瘍の大きさが縮小していることを図１９に示す。ＰＢＭＣ群では、短時間の拘束後、大きさが大きくなり、この群と負の対照例の群とで腫瘍の大きさに有意な差は観察されなかった。
・表現型解析およびヒト細胞のホーミング：腹膜腔で：処置マウスのＩＰ表現型を毎週チェックしたところ、ＢｒＨＰＰ処置マウスでのみヒトγδ Ｔ細胞の存在が明らかになった。血液中のγδ Ｔ細胞の相対数を図１６に示し、腹膜腔での場合を図１７に示す。ヒトγδ Ｔ細胞はヒトＣＤ３Ｔ細胞の高いパーセンテージをなす。マウスレシピエントの臓器で：屠殺時に表現型解析を行う（ＰＢＭＣおよびＢｒＨＰＰ処置または非処置群で４週間後）；これらの臓器に存在する主なヒト細胞はヒトＣＤ３＋Ｔ細胞であり、Ａｂ ＴｃＲの発現率９９％である。しかしながら、腫瘍では、ヒトγδ細胞はＢｒＨＰＰ処置群にしか存在しなかった。
・ＩＨＣ：屠殺時に得た腫瘍の切片４μｍで、γδ Ｔ細胞はＰＢＭＣ ＢｒＨＰＰ処置マウスの腫瘍にしか存在しないことが確認された。腫瘍内のヒトγδ Ｔ細胞の頻度がＢｒＨＰＰ処置の遅延と相関しているように見える。
結論
ここで得たデータから、γδのｉｎ ｖｉｖｏでの効力が明らかになった。γδ Ｔ細胞は、その活性をＢｒＨＰＰ刺激後２週間発揮する。腫瘍が消えてなくなり、処置１２週間後に新たな腫瘍の再発が観察されなかったマウスの群では、上記の作用は持続性で安定している。１０匹のマウスのうち４匹では、腫瘍は完全には消えなかったが、この群ですら、腫瘍の成長は止まり、腫瘍の大きさは１２週間後も安定したままであった。ＢｒＨＰＰ未処置マウスのＴＩＬはａｂＴ細胞で構成されていたが、本発明者らはこの群で腫瘍活性を観察できなかった。
実施例１１
ヒトにおける進行性／転移性固形腫瘍を処置する目的でのＢｒＨＰＰの投与
Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍは、新たな臨床エントリすなわち薬剤物質ブロモヒドリンピロホスフェート（ＢｒＨＰＰ）をベースにしたものであり、これは免疫コンピテント細胞すなわち抗腫瘍活性を持つＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞亜個体群の特定のアゴニストである。Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（ＢｒＨＰＰ、２００ｍｇ）は、がんの免疫治療用のＢｒＨＰＰの静脈製剤であり、進行性／転移性固形腫瘍のある患者での最初の臨床試験では低用量のＩＬ−２（ｓ．ｃ．１Ｍ ＩＵ／ｍ２／日）と併用される。
臨床試験
いままでＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍがヒトに投与されることはなかった。Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍを用いる計画したフェーズＩの臨床試験の主な目的は、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ単独の場合と一定用量のＩＬ−２と併用した場合の安全性と寛容を評価することにある。この臨床試験は、進行性／転移性固形腫瘍のある患者の系列的なコホートで行う単一治療群（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）、非盲検、国内の多数の機関で行う用量増分試験である。各用量レベルごとに３〜６名の患者からなるコホートで、従来の用量増分設計（Ｆｉｂｒｏｎａｃｃｉ）を用いる。患者のコホートにはすべて、３週間ごとに処置を反復サイクルで実施する。１回目のサイクルはＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ単独を注入する１回の投与からなり、２回目のサイクルから先は、１百万ＩＵ／ｍ２／日のＩＬ−２を加える（全体の期間は７日間）。Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍの開始用量は、ＢｒＨＰＰアニオン形態での１１８ｍｇ等量に相当する２００ｍｇ／ｍ２（５ｍｇ／ｋｇ）である。Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ単独の場合とＩＬ−２と併用した場合の薬物動態および薬力学的特性についてもこの研究で評価する。
Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（ＢｒＨＰＰ、２００ｍｇ）は、注入時に溶液に入れて再構成される、凍結乾燥させた無発熱原性滅菌白色粉末である。
Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（ＢｒＨＰＰ、２００ｍｇ）の各バイアルには、アニオン形態でのＢｒＨＰＰが２００ｍｇと賦形剤としてのα−ラクトースモノハイドレート（ＵＳＰ）５０ｍｇとが入っている。
Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ（ＢｒＨＰＰ、２００ｍｇ）は、−２０℃での保存期間が６ヶ月である。現在、安定性に関するさらなる研究が行われている。これらの研究が終わるまで、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍは光の当たらない場所で−２０℃±５℃で保管すべきである。
Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍは、開封して再構成したらすみやかに使い切るタイプのものである。Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍの再構成は、使用する直前に注射用水２ｍｌで行い、１００ｍｇ／ｍｌの溶液にする。再構成品に必要な量だけ、全体量１００ｍｌの乳酸加リンゲル緩衝液注入ビヒクルに希釈する。この希釈溶液は無色透明である。
Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍを１時間かけて静脈内投与する。
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ＢｒＨＰＰの用量を増やしながら連続して静脈内注射を行っても、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）の末梢血でのγδ細胞増幅は持続されない。動物２匹に対して、ＢｒＨＰＰを毎日１、４、１６、３２ｍｇ／ｋｇずつ与え、それぞれのＰＢＭＣをフローサイトメトリーで監視した。ＢｒＨＰＰ投与後２０日目まで全血を抗−デルタ２−ＦＩＴＣ抗体と抗−ＣＤ３−ＰＥ抗体で染色した。 Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓでは、ＢｒＨＰＰとＩＬ２を同時投与することで、再現可能なγδ細胞の増加が誘導される。２匹の動物に、ＢｒＨＰＰを２０ｍｇ／ｋｇ（「１回用量」）与え、他の２匹には５日間かけて毎日ＢｒＨＰＰを４ｍｇ／ｋｇずつ（「分割用量」）与えた。いずれの場合も５日間毎日０．９百万ＵＩのＩＬ２を同時注射した。ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２で同時処置した４匹の動物では末梢γδ細胞の増加が認められ、７日目がピークであった。対照例として、５匹目の動物をＩＬ２だけで処置したところ、末梢γδ率に何ら変化は認められなかった。１４日目に、この動物にＢｒＨＰＰ／ＩＬ２を同時投与すると、７日後のγδ率と同じ増加量で答えられることが明らかになった。 投与７日後におけるＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの全血のフローサイトメトリー分析。これらのグラフは、投与７日後にＩＬ２のみ（Ｚ６０４ Ｄ７ ＩＬ２のみ）またはＢｒＨＰＰおよびＩＬ２（Ｚ６０４、Ｘ９７３、Ｚ０５９、Ｚ１３５、Ｚ７１４、Ｄ７ ＩＬ２＋ＢｒＨＰＰ）で処置した動物の全血の抗−デルタ２−ＦＩＴＣ／抗−ＣＤ３−ＰＥ染色を示している。 ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２を同時注射したＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓで循環γδ細胞の絶対数が５から４０倍増加する。末梢γδ細胞の絶対数については、ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２を同時注射した４匹の動物でのフローサイトメトリーによって求めた。末梢γδ細胞数は、動物次第で投与７日後にそれ以前と比して５から４０倍多かった。全量２０ｍｇ／ｋｇのＢｒＨＰＰ注射で平均して２４倍の増加が得られ、単回用量の方が分割用量の場合よりも効率的だった。 ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２の投与時における末梢γδ細胞率の増加は用量依存性である。 上側のパネル：１０匹の動物（２０３１から２０４０までの番号を付す）について、各用量に動物２匹ずつ（雄１匹＋雌１匹）、ＢｒＨＰＰの量を増やしながら（０、０．２、４、２０、８０ｍｇ／ｋｇ）１回目の注射を行った。 下側のパネル：同じ動物に対して、１回目の注射から３週間後に、ＢｒＨＰＰの量をさらに増やして（２０、８０、１２０、１６０ｍｇ／ｋｇ）２回目の注射を行った。１回目の注射での用量が最も少なかった動物（０．２ｍｇ／ｋｇと４ｍｇ／ｋｇの群）に、今度は最も多い用量（１２０ｍｇ／ｋｇと１６０ｍｇ／ｋｇ）で注射を行い、１回目の注射が２回目の注射に対して影響する可能性を最小限に抑えた。 ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２での同時処置時における循環γδ細胞数の増加も用量依存性である。末梢γδ細胞数の倍増量を、処置前のγδ絶対数に対する処置７日後のγδ絶対数の比として算出した。同一用量群の動物間にも若干の食い違いがあるが、この増加は明らかに用量依存性である。 抗−ガンマ９−ＦＩＴＣ抗体と抗−ＣＤ３−ＰＥ抗体で染色した状態での、ＢｒＨＰＰ １６０ｍｇ／ｋｇを与える前と５日後における動物Ｎｏ．２０３４の全血のフローサイトメトリー画像。 霊長類のγδ細胞は、１回目と２回目のＢｒＨＰＰ／ＩＬ２同時処置にｉｎ ｖｉｖｏで等しく応答する。２０ｍｇ／ｋｇでの１回目のＢｒＨＰＰ処置（分画済みまたは未分画）７日後に観察されたγδ細胞数の平均増幅量は、２０ｍｇ／ｋｇでのＢｒＨＰＰリコール後に観察された平均増加量に匹敵する。 ｉｎ ｖｉｖｏでのγδ増幅量はＢｒＨＰＰ／ＩＬ２の連続投与後に減少する。この実験では、２匹の動物に、８０ｍｇ／ｋｇそして２２日間の後に２０ｍｇ／ｋｇを、または２０ｍｇ／ｋｇの後に８０ｍｇ／ｋｇを連続して与えた。いずれの場合も、γδ細胞数倍増量の応答は、特定の用量で１回目の注射のときよりも１回目のリコールでの方が低い（左側のパネル）。さらに、５匹の雌に対して、３週間間隔で８０ｍｇ／ｋｇで２回目、３回目のリコールで処置をした。得られた増幅率は、依然として検出可能であるが、リコールごとに低くなっていく（右側のパネル）。 ＢｒＨＰＰ／ＩＬ２同時処置後にｉｎ ｖｉｖｏで血清ＴＮＦαが生成される。ＴＮＦαについては、まずＩＬ２と、ＢｒＨＰＰを用量（０から８０ｍｇ／ｋｇ、それぞれの用量で動物２匹ずつ、図３Ａ参照）を増やしながら用いて処置した上で、ＢｒＨＰＰ注射の１時間後と４時間に、サルの血清に対するＥｌｉｓａで検出した。 ｉｎ ｖｉｖｏで末梢ＢｒＨＰＰ増幅霊長類γδ細胞はＢｒＨＰＰの攻撃に応答してサイトカインを産生する。４回目のＢｒＨＰＰ／ＩＬ２処置として、雌２０３２および２０３４にＢｒＨＰＰを８０ｍｇ／ｋｇ与えたところ、γδ細胞数がそれぞれ３倍および７．９倍に増加した。γδ細胞の末梢ピークの時点（４回目の注射後５日目）で、これらの動物に再度ＢｒＨＰＰを（ＩＬ２なしで）８０ｍｇ／ｋｇ注射したところ、注射の６０分後と１２０分後にＥｌｉｓａで血清ＩＮＦγおよびＴＮＦαが検出された。 ＩＬ２同時処置の内容が異なっても末梢γδ率の維持には影響しない。２０ｍｇ／ｋｇのＢｒＨＰＰと同時に、以下のＩＬ２処置を動物の皮下に対してほどこした。０．１５百万単位を１日２回で９日間（動物Ｚ０５９）、０．３百万単位を１日２回で５日間（Ｚ１３５）、０．９百万単位を１日２回で５日間（動物Ｚ７１４）または９日間（動物Ｘ９７３）。 Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ用量の増加に応答した霊長類のγδ細胞数倍増量。 ＰｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍおよびＩＬ−２を１回目と２回目で投与し、フローサイトメトリーで判断したところ、７日目に末梢Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞で明らかに用量関連性の上昇が認められた。これを図７に示す。 Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ処置霊長類での血清サイトカイン（ＩＮＦγおよびＴＮＦα）の産生。 Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍでの処置が血清中でのサイトカイン（ＩＮＦγおよびＴＮＦα）産生の生成に対しておよぼす影響について２回検討した。 −１回目の注入後、処置をほどこしたすべての動物：ＢｒＨＰＰ注射の１時間後に８０ｍｇ／ｋｇを与えた動物両方で全身のＴＮＦαが有意に産生（血清濃度６０ｐｇ／ｍｌおよび１２０ｐｇ／ｍｌ前後）されることが証明された。 −４回目の注射のピーク（７日目）の間に８０ｍｇ／ｋｇを（ＩＬ−２なしで）与えた２匹の雌（Ｆ２０３２＆Ｆ２０３４）。 両方の動物で血清ＴＮＦαおよびＩＮＦγの濃度の増加が示されたことから、ＢｒＨＰＰ／ＩＬ−２の同時処置時にｉｎ ｖｉｖｏで増幅したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞も検出可能な量の全身のサイトカインを生成することが分かる。 ｍＲＣＣ患者から増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性。 ５名の患者について４ｈ標準５１Ｃｒ放出アッセイで、従来の対照標的（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ）、選択した患者の一次（ｐｒｉｍａｒｙ）自家健常細胞系および腫瘍細胞系に対してＢｒＨＰＰ増幅γδ Ｔ細胞の溶解活性を測定した。 ｍＲＣＣ患者から増大したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性。 ５名の患者について４ｈ標準５１Ｃｒ放出アッセイで、従来の対照標的（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ）、選択した患者の一次（ｐｒｉｍａｒｙ）自家健常細胞系および腫瘍細胞系に対してＢｒＨＰＰ増幅γδ Ｔ細胞の溶解活性を測定した。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１０Ａは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて絶対細胞数（／ｍｍ３血液）を示す。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１０Ｂは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて絶対細胞数（／ｍｍ３血液）を示す。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１１Ａは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて全循環リンパ球のγδ Ｔ細胞パーセンテージを示す。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１１Ｂは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて全循環リンパ球のγδ Ｔ細胞パーセンテージを示す。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１２Ａは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて絶対細胞数（／ｍｍ３血液）のγδ Ｔ細胞倍増量を示す。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１２Ｂは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて絶対細胞数（／ｍｍ３血液）のγδ Ｔ細胞倍増量を示す。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１３Ａは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて倍増量を全循環リンパ球のパーセンテージで示す。 ＨＤＭＡＰＰおよびＢｒｈＰＰでのｉｎ ｖｉｖｏ（サル）用量範囲研究。フローサイトメトリーでγδ Ｔ細胞数を決定して得られるＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの用量範囲作用を図１０〜図１３に示す。 図１３Ｂは、それぞれＨＤＭＡＰＰおよびＢｒＨＰＰについて倍増量を全循環リンパ球のパーセンテージで示す。 ＢｒＨＰＰおよびＨＤＭＡＰＰのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性の比較。化合物ＢｒＨＰＰ、ＨＤＭＡＰＰおよびアミノビスホスホネート化合物Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ（登録商標）についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＣ５０を示す。ヒトＰＢＭＣ由来（ｒｈＩＬ２の存在下）のγδ Ｔ細胞増幅のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物活性をＴＮＦα放出アッセイで評価した。 ＢｒＨＰＰおよびＨＤＭＡＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの活性の比較。化合物についてのｉｎ ｖｉｖｏでのＥＣ５０を示し、ＢｒＨＰＰではＥＣ５０は約１ｎＭであるのに対し、ＨＤＭＡＰＰではＥＣ５０は約５ｐＭである。これに反して、力価が低いＺｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ（登録商標）のＥＣ５０値は約１μＭであった。フローサイトメトリーを用いてγδ Ｔ細胞を計数し、ヒトＰＢＭＣ由来のδＴ細胞増幅の生物活性を評価した。 ヒトγδ Ｔ細胞Ｎｏｄ−Ｓｃｉｄ／腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性 Ｎｏｄ−ＳｃｉｄマウスにヒトＰＢＭＬおよびＢｒＨＰＰでの処置をほどこした後最初の数日間における腫瘍の増殖を図１５に示す。 ヒト細胞の表現型解析とホーミング：腹膜腔：処置済みマウスのＩＰ表現型を毎週チェックしたところ、ＢｒＨＰＰ処置マウスでのみヒトγδ Ｔ細胞の存在が明らかになった。血液中のγδ Ｔ細胞の相対数を図１６に示し、腹膜腔については図１７に示す。ヒトγδ Ｔ細胞は、ヒトＣＤ３ Ｔ細胞のパーセンテージが高いことを示す。マウスレシピエントの臓器：屠殺時（ＰＢＭＣおよびＢｒＨＰＰ処置４週間後の群または未処置群）に表現型解析を実施する；これらの臓器に存在する主要なヒト細胞は、Ａｂ ＴｃＲ発現率９９％のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞である。しかしながら、腫瘍では、ヒトγδ細胞は、ＢｒＨＰＰ処理群だけに存在した。 腫瘍の大きさは処置後最初の数日間は大きくなったが、その後、ＰＢＭＣ／ＢｒＨＰＰおよびＩＬ２処置群では腫瘍の大きさがすみやかに小さくなった。図１９は、７日目以降の腫瘍の大きさが小さくなったことを示している。ＰＢＭＣ群では、進行が短期間停止した後に大きくなり、この群の腫瘍の大きさと負の対照例の腫瘍の大きさとの間には有意な差は何ら認められなかった。 ヒトγδ Ｔ細胞Ｎｏｄ−Ｓｃｉｄ／腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性 Ｎｏｄ−ＳｃｉｄマウスにヒトＰＢＭＬおよびＢｒＨＰＰでの処置をほどこした後最初の数日間における腫瘍の増殖を図１５に示す。 ヒト細胞の表現型解析とホーミング：腹膜腔：処置済みマウスのＩＰ表現型を毎週チェックしたところ、ＢｒＨＰＰ処置マウスでのみヒトγδ Ｔ細胞の存在が明らかになった。血液中のγδ Ｔ細胞の相対数を図１６に示し、腹膜腔については図１７に示す。ヒトγδ Ｔ細胞は、ヒトＣＤ３ Ｔ細胞のパーセンテージが高いことを示す。マウスレシピエントの臓器：屠殺時（ＰＢＭＣおよびＢｒＨＰＰ処置４週間後の群または未処置群）に表現型解析を実施する；これらの臓器に存在する主要なヒト細胞は、Ａｂ ＴｃＲ発現率９９％のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞である。しかしながら、腫瘍では、ヒトγδ細胞は、ＢｒＨＰＰ処理群だけに存在した。 腫瘍の大きさは処置後最初の数日間は大きくなったが、その後、ＰＢＭＣ／ＢｒＨＰＰおよびＩＬ２処置群では腫瘍の大きさがすみやかに小さくなった。図１９は、７日目以降の腫瘍の大きさが小さくなったことを示している。ＰＢＭＣ群では、進行が短期間停止した後に大きくなり、この群の腫瘍の大きさと負の対照例の腫瘍の大きさとの間には有意な差は何ら認められなかった。 ヒトγδ Ｔ細胞Ｎｏｄ−Ｓｃｉｄ／腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性 Ｎｏｄ−ＳｃｉｄマウスにヒトＰＢＭＬおよびＢｒＨＰＰでの処置をほどこした後最初の数日間における腫瘍の増殖を図１５に示す。 ヒト細胞の表現型解析とホーミング：腹膜腔：処置済みマウスのＩＰ表現型を毎週チェックしたところ、ＢｒＨＰＰ処置マウスでのみヒトγδ Ｔ細胞の存在が明らかになった。血液中のγδ Ｔ細胞の相対数を図１６に示し、腹膜腔については図１７に示す。ヒトγδ Ｔ細胞は、ヒトＣＤ３ Ｔ細胞のパーセンテージが高いことを示す。マウスレシピエントの臓器：屠殺時（ＰＢＭＣおよびＢｒＨＰＰ処置４週間後の群または未処置群）に表現型解析を実施する；これらの臓器に存在する主要なヒト細胞は、Ａｂ ＴｃＲ発現率９９％のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞である。しかしながら、腫瘍では、ヒトγδ細胞は、ＢｒＨＰＰ処理群だけに存在した。 腫瘍の大きさは処置後最初の数日間は大きくなったが、その後、ＰＢＭＣ／ＢｒＨＰＰおよびＩＬ２処置群では腫瘍の大きさがすみやかに小さくなった。図１９は、７日目以降の腫瘍の大きさが小さくなったことを示している。ＰＢＭＣ群では、進行が短期間停止した後に大きくなり、この群の腫瘍の大きさと負の対照例の腫瘍の大きさとの間には有意な差は何ら認められなかった。 ヒトγδ Ｔ細胞Ｎｏｄ−Ｓｃｉｄ／腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性 Ｎｏｄ−ＳｃｉｄマウスにヒトＰＢＭＬおよびＢｒＨＰＰでの処置をほどこした後最初の数日間における腫瘍の増殖を図１５に示す。 ヒト細胞の表現型解析とホーミング：腹膜腔：処置済みマウスのＩＰ表現型を毎週チェックしたところ、ＢｒＨＰＰ処置マウスでのみヒトγδ Ｔ細胞の存在が明らかになった。血液中のγδ Ｔ細胞の相対数を図１６に示し、腹膜腔については図１７に示す。ヒトγδ Ｔ細胞は、ヒトＣＤ３ Ｔ細胞のパーセンテージが高いことを示す。マウスレシピエントの臓器：屠殺時（ＰＢＭＣおよびＢｒＨＰＰ処置４週間後の群または未処置群）に表現型解析を実施する；これらの臓器に存在する主要なヒト細胞は、Ａｂ ＴｃＲ発現率９９％のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞である。しかしながら、腫瘍では、ヒトγδ細胞は、ＢｒＨＰＰ処理群だけに存在した。 腫瘍の大きさは処置後最初の数日間は大きくなったが、その後、ＰＢＭＣ／ＢｒＨＰＰおよびＩＬ２処置群では腫瘍の大きさがすみやかに小さくなった。図１９は、７日目以降の腫瘍の大きさが小さくなったことを示している。ＰＢＭＣ群では、進行が短期間停止した後に大きくなり、この群の腫瘍の大きさと負の対照例の腫瘍の大きさとの間には有意な差は何ら認められなかった。 ヒトγδ Ｔ細胞Ｎｏｄ−Ｓｃｉｄ／腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性 Ｎｏｄ−ＳｃｉｄマウスにヒトＰＢＭＬおよびＢｒＨＰＰでの処置をほどこした後最初の数日間における腫瘍の増殖を図１５に示す。 ヒト細胞の表現型解析とホーミング：腹膜腔：処置済みマウスのＩＰ表現型を毎週チェックしたところ、ＢｒＨＰＰ処置マウスでのみヒトγδ Ｔ細胞の存在が明らかになった。血液中のγδ Ｔ細胞の相対数を図１６に示し、腹膜腔については図１７に示す。ヒトγδ Ｔ細胞は、ヒトＣＤ３ Ｔ細胞のパーセンテージが高いことを示す。マウスレシピエントの臓器：屠殺時（ＰＢＭＣおよびＢｒＨＰＰ処置４週間後の群または未処置群）に表現型解析を実施する；これらの臓器に存在する主要なヒト細胞は、Ａｂ ＴｃＲ発現率９９％のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞である。しかしながら、腫瘍では、ヒトγδ細胞は、ＢｒＨＰＰ処理群だけに存在した。 腫瘍の大きさは処置後最初の数日間は大きくなったが、その後、ＰＢＭＣ／ＢｒＨＰＰおよびＩＬ２処置群では腫瘍の大きさがすみやかに小さくなった。図１９は、７日目以降の腫瘍の大きさが小さくなったことを示している。ＰＢＭＣ群では、進行が短期間停止した後に大きくなり、この群の腫瘍の大きさと負の対照例の腫瘍の大きさとの間には有意な差は何ら認められなかった。

Claims (79)

  1. 薬学的に許容可能な担体と一緒に、固形腫瘍の処置が必要な温血動物においてこのような処置をするための製剤組成物の製造に用いる、γδ Ｔ細胞活性化因子の使用。
  2. 固形腫瘍を処置するための方法であって、このような処置が必要な温血動物に、少なくとも１回の処置で、治療有効量のγδ Ｔ細胞活性化因子を、薬学的に許容可能な担体と一緒に、温血動物に対して投与する工程を含む、固形腫瘍を処置するための方法。
  3. 動物に少なくとも２回の処置をほどこす、請求項１に記載の使用。
  4. 動物に少なくとも３回の処置をほどこす、請求項１に記載の使用。
  5. 動物に少なくとも４回の処置をほどこす、請求項１に記載の使用。
  6. 動物に少なくとも６回の処置をほどこす、請求項１に記載の使用。
  7. 約２週間から約８週間の処置間隔をあけて２回以上の処置でγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
  8. 約３週間から約４週間の処置間隔をあけて２回以上の処置でγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
  9. 薬学的に許容可能な担体と一緒に、腫瘍の処置が必要な温血動物においてこのような処置するための製剤組成物の製造に用いる、γδ Ｔ細胞活性化因子の使用であって、約２週間から約８週間の処置間隔をあけて２回以上の処置でγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する、使用。
  10. 動物に少なくとも２回の処置をほどこす、請求項９に記載の使用。
  11. 動物に少なくとも３回の処置、好ましくは少なくとも４回の処置をほどこす、請求項９に記載の使用。
  12. 動物に少なくとも６回の処置をほどこす、請求項９に記載の使用。
  13. 腫瘍が血液腫瘍である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
  14. 処置対象となる腫瘍がリンパ腫である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
  15. 腫瘍が固形腫瘍である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
  16. 温血動物または被検体においてγδ Ｔ細胞の生物活性が増大する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
  17. 温血動物または被検体において循環γδ Ｔ細胞数が増加する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
  18. 被検体でγδ Ｔ細胞個体群を増大させ、全循環リンパ球の３０〜９０％を達成するのに十分な量でγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
  19. 被検体でγδ Ｔ細胞個体群を少なくとも１０倍に増やすのに十分な量のγδ Ｔ細胞活性化因子を投与する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
  20. 腫瘍が転移性腫瘍であり、前記疾患の処置に適した用量でこのような処置が必要なヒトにγδ Ｔ活性化因子を投与する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
  21. 処置対象となる腫瘍が、肺の腫瘍と、結腸直腸の腫瘍と、前立腺の腫瘍と、乳房の腫瘍と、類表皮頭頸部の腫瘍と、からなる群から選択される、請求項１〜８、１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。
  22. 処置対象となる腫瘍が腎臓がんである、請求項１〜８、１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。
  23. 処置対象となる腫瘍が転移性の腎臓がんである、請求項１〜８、１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。
  24. 処置対象となる増殖性疾患が、黒色腫と、卵巣がんと、膵臓がんと、神経芽細胞腫と、頭頸部がんと、膀胱がんと、腎臓がんと、脳腫瘍と、胃がんと、からなる群から選択される、請求項１〜８、１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。
  25. γδ Ｔ細胞活性化因子が、化合物が１ｍＭ未満の濃度で培養中に存在する場合にγδ Ｔ細胞クローンの純粋な個体群でγδ Ｔ細胞の増殖を誘導できる前記化合物を含む組成物である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
  26. γδ Ｔ細胞活性化因子が、式（Ｉ）
    Figure 2006510629
    〔式中、Ｃａｔ＋は、１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、
    ｍは１から３の整数であり、
    Ｂは、Ｏ、ＮＨまたは加水分解可能な任意の基であり、
    Ｙ＝Ｏ−Ｃａｔ＋、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、基−Ａ−Ｒであるか、ヌクレオシドと、オリゴヌクレオチドと、核酸と、アミノ酸と、ペプチドと、タンパク質と、単糖と、オリゴ糖と、多糖と、脂肪酸と、単純脂質と、複合脂質と、葉酸と、テトラヒドロ葉酸と、リン酸と、イノシトールと、ビタミンと、補酵素と、フラボノイドと、アルデヒドと、エポキシドと、ハロヒドリンと、からなる群から選択されるラジカルであり、
    Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、
    Ｒは、場合により少なくとも１個のヘテロ原子で中断された、直鎖状、分枝状または環状の、芳香族または非芳香族の、飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ５０炭化水素基であり、前記炭化水素基は、アルキルと、アルキレニルと、アルキニルと、エポキシアルキルと、アリールと、複素環と、アルコキシと、アシルと、アルコールと、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）と、エステルと、アミンと、アミノ基（−ＮＨ２）と、アミド（−ＣＯＮＨ２）と、イミンと、ニトリルと、ヒドロキシル（−ＯＨ）と、アルデヒド基（−ＣＨＯ）と、ハロゲンと、ハロゲノアルキルと、チオール（−ＳＨ）と、チオアルキルと、スルホンと、スルホキシドと、これらの組み合わせと、からなる群から選択される１個またはいくつかの置換基で置換可能である、アルキル、アルキレニルまたはアルキニルを含み、好ましくはアルキルまたはアルキレンを含む〕の化合物を含む組成物である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
  27. γδ Ｔ細胞活性化因子が、式（ＩＩ）
    Figure 2006510629
    〔式中、Ｘはハロゲン（好ましくは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌから選択される）であり、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は、１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ｎは２から２０の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）〕の化合物を含む組成物である、請求項２６に記載の使用。
  28. 式（ＩＩ）の化合物がＢｒＨＰＰである、請求項２７に記載の使用。
  29. 式（ＩＩ）の化合物がＣＢｒＨＰＰである、請求項２７に記載の使用。
  30. 式（ＩＩ）の化合物がｅｐｏｘＰＰである、請求項２７に記載の使用。
  31. γδ Ｔ細胞活性化因子を、１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの用量でヒトに投与する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の使用。
  32. γδ Ｔ細胞活性化因子を、式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（１０からｙ）＊Ｎ （Ｉ）
    （式中、Ｎは処置と処置との間の週数、ｙは１００である）に基づいて算出される用量でヒトに投与する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の使用。
  33. γδ Ｔ細胞活性化因子を、式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（５から６０）＊Ｎ （Ｉ）
    に基づいて算出される用量でヒトに投与する、請求項３２に記載の使用。
  34. 式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（１０から１００）＊Ｎ （Ｉ）
    （式中、Ｎは、約３から約４の間であるような、処置と処置との間の週数である）に基づいて算出される用量で、静脈内注入によって、γδ Ｔ活性化因子をヒトに投与する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の使用。
  35. ヒト被検者においてＶγ９/Ｖδ２＋ Ｔ細胞を調節するための製剤組成物の製造に用いる、ＣＢｒＨＰＰ化合物の使用であって、ＣＢｒＨＰＰ化合物を、被検者の体重１キログラムあたり前記化合物１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの用量で前記被検者に投与する、使用。
  36. ヒト被検者においてＶγ９/Ｖδ２＋ Ｔ細胞を調節するための製剤組成物の製造に用いる、ＣＢｒＨＰＰ化合物の使用であって、ＣＢｒＨＰＰ化合物を、被検者の体重１キログラムあたり前記化合物１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの用量で２４時間未満の時間内に前記被検者に投与する、使用。
  37. γδ Ｔ細胞活性化因子を、５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇの用量でヒトに投与する、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の使用。
  38. γδ Ｔ細胞活性化因子を約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の使用。
  39. 温血動物においてγδ Ｔ細胞を刺激するための製剤組成物の製造に用いる、請求項２７に記載の化合物の使用であって、約２週間から約８週間の処置間隔をあけて２回以上の処置で前記化合物を温血動物に投与する、使用。
  40. γδ Ｔ細胞活性化因子が、式（ＸＩＩ）
    Figure 2006510629
    〔式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一であっても異なっていてもよく、水素または（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｗは−ＣＨ−または−Ｎ−であり、Ｒ６は、（Ｃ２〜Ｃ３）アシル、アルデヒド、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコールまたは（Ｃ２〜Ｃ３）エステルであり、Ｃａｔ＋は１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）〕の化合物を含む組成物である、請求項２６に記載の使用。
  41. 式（ＸＩＩ）の化合物がＨＤＭＡＰＰである、請求項４０に記載の使用。
  42. 式（ＸＩＩ）の化合物がＣＨＤＭＡＰＰである、請求項４０に記載の使用。
  43. γδ Ｔ細胞活性化因子を、式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．００１からｙ）＊Ｎ （Ｉ）
    （Ｎは、処置と処置との間の週数であり、ｙは１００である）に基づいて算出される用量でヒトに投与する、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の使用。
  44. γδ Ｔ細胞活性化因子を、式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０１から２０）＊Ｎ （Ｉ）
    に基づいて算出される用量でヒトに投与する、請求項４３に記載の使用。
  45. γδ Ｔ細胞活性化因子を、式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０１から５）＊Ｎ （Ｉ）
    に基づいて算出される用量でヒトに投与する、請求項４３に記載の使用。
  46. γδ Ｔ細胞活性化因子を、式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０.０２から５）＊Ｎ （Ｉ）
    に基づいて算出される用量でヒトに投与する、請求項４３に記載の使用。
  47. γδ Ｔ細胞活性化因子を、１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの用量でヒトに投与する、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の使用。
  48. 式（Ｉ）：
    単回用量（ｍｇ／ｋｇ）＝（０．０１から２０）＊Ｎ （Ｉ）
    （式中、Ｎは、約３から約４の間であるような、処置と処置との間の週数である）に基づいて算出される用量で、静脈内注入によって、γδ Ｔ活性化因子をヒトに投与する、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の使用。
  49. 式（ＩＩ）
    Figure 2006510629
    〔式中、Ｘはハロゲン（好ましくは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌから選択される）であり、ＢはＯまたはＮＨであり、ｍは１から３の整数であり、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は、１個の（またはいくつかの、同一であっても異なっていてもよい）有機または鉱物カチオン（プロトンを含む）を表し、ｎは２から２０の整数であり、Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＣＨＦ、ＣＦ２またはＣＨ２であり、Ｙは、Ｏ−Ｃａｔ＋、ヌクレオシドまたはラジカル−Ａ−Ｒ（式中、Ｒは１）、２）または３）からなる群から選択される）〕の化合物を、ヒト被検者においてＶγ９/Ｖδ２＋ Ｔ細胞を調節するための製剤組成物の製造に用いる使用であって、前記化合物を、被検者の体重１キログラムあたり前記化合物１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの用量で前記被検者に投与する、使用。
  50. ヒト被検者においてＶγ９/Ｖδ２＋ Ｔ細胞を調節するための製剤組成物の製造に用いる、ＨＤＭＡＰＰ化合物またはＣＨＤＭＡＰＰ化合物の使用であって、ＨＤＭＡＰＰ化合物またはＣＨＤＭＡＰＰ化合物を、被検者の体重１キログラムあたり前記化合物１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの用量で前記被検者に投与する、使用。
  51. ヒト被検者においてＶγ９/Ｖδ２＋ Ｔ細胞を調節するための製剤組成物の製造に用いる、ＨＤＭＡＰＰ化合物またはＣＨＤＭＡＰＰ化合物の使用であって、ＨＤＭＡＰＰ化合物またはＣＨＤＭＡＰＰ化合物を、被検者の体重１キログラムあたり前記化合物１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの用量で２４時間未満の時間内に前記被検者に投与する、使用。
  52. γδ Ｔ細胞活性化因子を、１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの用量でヒトに投与する、請求項５０または５１に記載の使用であって、ＨＤＭＡＰＰ化合物またはＣＨＤＭＡＰＰ化合物を、被検者の体重１キログラムあたり前記化合物１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの用量で２４時間未満の時間内に前記被検者に投与する、使用。
  53. γδ Ｔ細胞活性化因子を、１０μｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇの用量でヒトに投与する、請求項５０または５１に記載の使用。
  54. γδ Ｔ細胞活性化因子を、１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの用量でヒトに投与する、請求項５０または５１に記載の使用。
  55. 有効量のγδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを、それらの投与が必要な被検体に別々に投与することをさらに含む、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の使用。
  56. インターロイキン−２ポリペプチドを１日から１０日間の時間をかけて投与する、請求項５５に記載の使用。
  57. γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを、哺乳動物の被検体でγδ Ｔ細胞の活性を調節するための製剤組成物の製造に用いる使用であって、γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを被検体に別々に投与し、インターロイキン−２ポリペプチドを１日から１０日間の時間をかけて投与する、使用。
  58. 有効量のγδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを、それらの投与が必要な被検体に別々に投与することを含み、インターロイキン−２ポリペプチドを１日から１０日間の時間をかけて投与する、被検体においてγδ Ｔ細胞を刺激するための方法。
  59. 有効量のγδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを、それらの投与が必要な被検体に別々に投与することを含み、インターロイキン−２ポリペプチドを１日から１０日間の時間をかけて投与する、被検体において、がん、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を処置するための方法。
  60. インターロイキン−２ポリペプチドを低用量で投与する、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の使用。
  61. インターロイキン−２ポリペプチドを、１日あたり０．２から２ＭＵ、さらに一層好ましくは０．２から１．５ＭＵ、なお好ましくは０．２から１ＭＵの一日用量で投与する、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の使用。
  62. インターロイキン−２ポリペプチドの一日用量を１回の注射または２回の注射で投与する、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の使用。
  63. γδ Ｔ細胞活性化因子を処置開始時に単回用量で投与する、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の使用。
  64. γδ Ｔ細胞活性化因子を処置開始時に単回用量で投与し、インターロイキン−２ポリペプチドを、前記処置開始から１０日以内の間に少なくとも２日間投与する、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の使用。
  65. γδ Ｔ細胞活性化因子がγδ Ｔリンパ球のＴ受容体リガンドである、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の使用。
  66. γδ Ｔ細胞活性化因子がＰＥＤ化合物またはＰＨＤ化合物であり、これを処置開始時に１０から５０ｍｇ／ｋｇの用量で１回の注射にて投与し、インターロイキン−２ポリペプチドを１日あたり０．２から２ＭＵの一日用量で１日から１０日間の時間をかけて投与する、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の使用。
  67. 被検体が、がん、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を有するヒト被検者である、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の使用。
  68. γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを、被検体におけるがんを処置するための製剤組成物の製造に用いる使用であって、前記合成γδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを被検体に別々に投与する、使用。
  69. γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを、被検体における感染症を処置するための製剤組成物の製造に用いる使用であって、前記合成γδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを被検体に別々に投与する、使用。
  70. γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを、被検体における自己免疫疾患を処置するための製剤組成物の製造に用いる使用であって、前記合成γδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを被検体に別々に投与する、使用。
  71. γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを、γδ Ｔ細胞による溶解の影響を受けやすい病原細胞によって引き起こされる、あるいはこのような細胞に関連した疾患を被検体において処置するための製剤組成物の製造に用いる使用であって、前記合成γδ Ｔ活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドを被検体に別々に投与する、使用。
  72. 哺乳動物の被検体でγδ Ｔ細胞の活性を調節する目的で、別々に使用できるγδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを含む、製品。
  73. γδ Ｔ活性化因子を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、固形腫瘍を処置するための医薬品の製造に用いる、γδ Ｔ活性化因子の使用。
  74. γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを、哺乳動物の被検体でγδ Ｔ細胞の活性を調節するための製剤組成物の製造に用いる使用であって、γδ Ｔ細胞活性化因子とインターロイキン−２ポリペプチドとを別々に被検体に投与する、使用。
  75. γδ Ｔ細胞活性化因子を静脈内注入によって投与する、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の使用。
  76. 各注入を約５分から約１２０分間で行う、請求項１〜７５のいずれか１項に記載の使用。
  77. 各注入を約５分から約３０分間で行う、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の使用。
  78. 治療有効量のＣＨＤＭＡＰＰを活性成分として薬学的に許容可能な担体と一緒に含有する、製剤組成物。
  79. 治療有効量のＣＢｒＨＰＰを活性成分として薬学的に許容可能な担体と一緒に含有する、製剤組成物。
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