WO2005105111A1

WO2005105111A1 - 人工肺サーファクタント組成物およびその使用方法

Info

Publication number: WO2005105111A1
Application number: PCT/JP2005/008234
Authority: WO
Inventors: Sannamu Lee; Ko Yukitake; Yoshihiro Nakamura
Original assignee: Fukuoka University
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2005-11-10
Also published as: US20120329870A1; AU2005247319B2; CA2564868C; WO2005115405A1; WO2005115405A8; EP1744761A4; CA2564868A1; US20080050414A1; US8029815B2; AU2005247319A1; US8932617B2; EP1744761A1

Abstract

　この発明に係る人工肺サーファクタント組成物は、タンパク質やペプチドを含まない混合脂質系またはかかる混合脂質にタンパク質もしくはペプチドを添加した混合系からなる肺表面活性薬組成物である。この発明の人工肺サーファクタント組成物は、新生児、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎などによる呼吸不全、喘息による呼吸困難およびその予防などに対して有用でかつ安価に調製することができる。

Description

明細書

人工肺サーファクタント組成物およびその使用方法

技術分野

[0001] この発明は、人工肺サーファクタント組成物およびその使用方法に関し、更に詳細には、新規な化学組成を有する肺表面活性薬組成物であって呼吸窮迫症候群治療剤などとして有用でかつ安価に調製可能な人工肺サーファクタント組成物およびその使用方法に関する。

背景技術

[0002] 現在、肺の急性疾患にお!、て、死亡率が高!、新生児呼吸窮迫症候群 (RDS)、また重篤な呼吸障害をきたす急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)の治療薬としては、牛肺から抽出された肺サーファタタント成分を調製した人工肺サーファタタントが適用されている (例えば、非特許文献 1及び非特許文献 2参照。 ) ₀

[0003] 肺サーファクタントは、肺胞細胞で生成され分泌される脂質一タンパク質複合体であって、肺胞の表面張力を低下することにより肺機能を司る生命維持に必須の物質である。肺胞内に存在する肺サーファクタントは、約 10 %のタンパク質と、リン脂質を中心とする脂質成分とから成り立つている (例えば、非特許文献 3参照。 ) ₀肺サーファクタントは、脂質のうち、特に中性リン脂質である L- α -フォスファチジルコリン（PC) が多ぐ全脂質の 80.5 %を占め、酸性脂質である L- α -フォスファチジルグリセロール（PG)が 9.1 %、 L- α -フォスファチジルイノシトール (PI)が 2.6 %、その他コレステロールが 7.3 %と力も構成されている。特に注目すべき事は、 PCのうち、飽和アルキル化合物からなるジパルミトイル -L- α -フォスファチジルコリン（DPPC)が 47.7 %と約半分を占めていることが肺を虚脱から防ぐ要因であると考えられている。しかし、 DPPC を含むリン脂質のみでは肺サーファタタント活性がなヽ事から、少量含まれるタンパク質成分が重要である事が明らかにされた (例えば、非特許文献 4参照。 ) ₀

[0004] 肺サーファクタントは、 RDSや ADRSへの適用という側面のみならず、肺炎などの炎症性肺疾患、また近年死亡率が急速に上昇して!/、る肺ガン等による重篤な呼吸不全症状の緩和という観点からも、その必要性が増している。さらに、気管支での肺サーファタタント物質の分泌も知られていて、それらが末梢気道の閉塞を防ぎ去痰的役割をしているとも言われている（例えば、非特許文献 5参照。 )₀さらに、肺サーファクタントの吸入によりアレルギー誘発喘息発作の予防が可能である（例えば、非特許文献 6 参照。）など、呼吸障害の改善を必要とする多くの疾病に対する有用性が期待されている。

[0005] Fujiwaraらは、人工肺サーファタタントのヒト RDSに対する効果を報告し、サーファタテン (登録商標）（Surfacten (登録商標)）として、世界で初めて RDS治療薬として完成させた (例えば、特許文献 1参照。 )oサーファタテン (登録商標）は、牛肺から活性成分を抽出後、リン脂質 (75.0 % - 95.5 %)、中性脂質 (1.8 % - 14.0 %)、タンパク質 (5% 以下)に調製されたものである。しかし、使用されているタンパク質及びリン脂質 (特に DPPC)は、高価であることから、これら力調製された人工肺サーファタタントであるサーファタテン (登録商標)も、当然のことながら、非常に高価なものとなり、使用分野も非常に限定されているという問題がある。

[0006] 一方、 ARDS発症は 10万人あたり 15から 20人と報告されている。基礎疾患が治療出来るにもかかわらず、急性期の治療に用いた人工換気、酸素による肺損傷のため、不幸な転帰を取る場合も多ぐその死亡率は 50 %前後と極めて高い。これに対して、 ARDSの早期に人工肺サーファタタントを大量に投与し肺機能を改善させ、肺損傷を最小に抑える治療法は、死亡率を 20%にまで低下させることができる（例えば、非特許文献 7参照。 )₀肺サーファタタントは、このように重篤な呼吸不全の治療に重要であるが、同時に、上述の如ぐ去痰、喘息発作の軽減などにも有効である。

[0007] 以上のことより、人工肺サーファタタントは、呼吸器疾患の治療に携わる医療関係者の間から、多くの種々の肺疾患への適用の可能性が指摘されているにもかかわらず、非常に高価であるために、現在、日本では、その保険診療が認められているのは RDSのみである。また、サーファタテン (登録商標）は、牛由来のタンパク質を含んでいるため、その抗原性および未知の病原性による感染の可能性、例えば狂牛病などの問題を包含している。そこで、安価で副作用のない人工合成サーファタタントの開発が強く望まれている。

[0008] このような要望に応えるために、 1991年、 Cochraneらによって、人工合成サーファタタントが初めて報告された (例えば、非特許文献 8参照。 )₀このうち、現在、アミノ酸 21 残基力もなる人工合成ペプチド KLと脂質とからなる脂質—ペプチド複合体

4

(Surfaxin)が臨床化されつつあり、新たに ARDSに対する治療薬として期待されている (例えば、非特許文献 9参照。 )₀

[0009] この他に、合成ペプチドと脂質混合物とからなる肺サーファタタントと、該肺サーファクタントとを有効成分として含有する呼吸窮迫症候群治療剤が記載されている (例えば、特許文献 2及び特許文献 3参照。 )₀これらの肺サーファタタントは、コリンホスホダリセリド、特定配列の合成ペプチド、酸性リン脂質及び脂肪酸類力なっている。非特許文献 1 :肺表面活性物質の現在：吉田清一編、真興交易医書出版部、東京、 1990

非特干文献 2： Molecular Basis of Disease: Pulmonary surfactant , ed., RiordanJ. R., Biochim. Biophys. Acta, 1408, 77—363, 1998

非特許文献 3 :Veldhuizen, R.， et al, Biochim. Biophys. Acta, 1408, 90-108, 1998 非特許文献 4 : Robertson, B.， and Halliday, H. L., Biochim. Biophys. Acta, 1408, 341-362, 1998

非特許文献 5 : Liu M., et al., J. Appl. Physiol, 71, 742-748, 1991

非特許文献 6 : Babu, K.S., et al" Eur. Respir. J" 21:1046-1049, 2003

非特許文献 7 : Gregory, T.J., et al" Am. J. Respir. Crit. Car. Med., 155,

1309-1315, 1997

非特許文献 8 : Cochrane C. G. and Revak S. D.， Science, 254, 566-568, 1991 非特許文献 9 :Wiswell, T.， et al" Pediatrics, 109, 1081-1087, 2002

特許文献 1：特公昭 61— 9925号公報

特許文献 2：特開平 5 - 294996号公報

特許文献 3 :WO95Zl5980号公報

発明の開示

[0010] 本発明者らは、タンパク質やペプチドを必須の成分としなくとも、安価で調製可能な人工肺サーファクタント組成物にっ、て鋭意研究した結果、安価な脂質を新たに組み合わせることによって調製できる脂質混合系からなる人工肺サーファクタント組成物が、市販のサーファタテン (登録商標）と同等の表面活性を有することを見出した。さらに、研究を重ねた結果、その脂質組成物にペプチドを加えたペプチド脂質混合系も、表面活性のみならず動物肺においても、サーファタテン (登録商標）と同等の表面活性を有することを見出して、この発明を完成するに至った。

[0011] この発明に係る人工肺サーファクタント組成物は、低コストで調製できるため、 RDS や ADRSだけでなぐ急性肺炎、肺ガン、喘息等による呼吸機能障害の緩和および予防、肺炎、風邪などによって生じる痰の除去など、サーファタタント不足あるいは機能不全などを伴う疾病への幅広、適用の可能性を有して、る。

[0012] したがって、この発明は、タンパク質やペプチドを必須の成分としな、、安価な脂質を組み合わせた脂質混合系カゝらなる人工肺サーファタタント組成物または脂質混合系にタンパク質もしくはペプチドを加えたタンパク質/ペプチド—脂質混合系力もなる人工肺サーファクタント組成物であって、急性肺疾患等のサーファタタント不足や機能不全などを伴う疾病などに有効で、かつ、低コストで調製可能な人工肺サーファタタント組成物を提供することを目的として!/ヽる。

[0013] この発明はまた、上記人工肺サーファクタント糸且成物を、サーファタタント不足あるいは機能不全などを伴う疾病の治療もしくは予防に使用することからなる使用方法を提供することを目的としている。

[0014] 上記目的を達成するために、この発明は、タンパク質やペプチドを含まない脂質混合系からなる、低コストで調製可能な人工肺サーファクタント組成物を提供する。

[0015] この発明はまたペプチド脂質混合系からなる、低コストで調製可能な人工肺サーファクタント組成物を提供する。

[0016] この発明は、その態様としては、リン脂質、高級アルコールおよび高級脂肪酸を主たる配合成分とすることからなる人工肺サーファクタント組成物が提供される。更に好ましい態様として、この発明は、乾燥総重量に対して、リン脂質を 20— 60%、好ましくは 30— 50%、高級アルコールを 30— 70%、好ましくは 40— 60%、高級脂肪酸を 1 - 30%、好ましくは 5 - 20%程度含有することからなる人工肺サーファクタント組成物を提供する。

[0017] この発明は、その別の形態としては、上記組成にさらにペプチドを約 2— 10%、好ましくは約 1— 5%程度を含んだ人工肺サーファクタント組成物を提供する。

[0018] この発明の更に別の形態としては、上記人工肺サーファクタント糸且成物を、 RDS、

ADRS、急性肺炎、肺ガン、喘息等による呼吸機能障害の緩和および予防、肺炎、風邪などによって生じる痰の除去など、サーファタタント不足や機能不全などを伴う疾病に適用することからなる人工肺サーファクタント組成物の使用方法が提供される。

[0019] この発明のその他の目的、特長ならびにその他の態様などは、下記図面を参照して、下記説明により明らかである。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]種々の合成肺サーファタタントペプチドの一次化学構造を示す図である。

[図 2a]種々の脂質混合系の表面張力ならびに表面積曲線を示すグラフである。

[図 2b]OD— eggPC PA系の様々な組成比における表面張力ならびに表面積曲線を示すグラフである。

[図 3]脂質各種ペプチド混合系における表面張力ならびに表面積曲線を示すダラフである。

[図 4]大豆レシチン脂質混合系及びそのペプチド混合系の結果を示す図である。

[図 5a]肺洗浄ラットを用いての肺機能の回復実験の結果を示す図である。

[図 5b]肺洗浄ラットを用いての肺機能の回復実験の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0021] この発明にお、て、まず、肺サーファタタントの活性発現メカニズムを考慮するとき、肺サーファタタントは安定な単分子膜及び二分子膜を形成する必要がある。肺圧の上昇、減少に伴っての単分子膜-二分子膜平衡を形成する上で、リン脂質は必須と考えられる。リン脂質の中でも肺の呼気の圧縮時の虚脱を防ぐために、これまで DPPCは必須であり、さらに少量の PGも必要であると考えられていた。

[0022] し力し、 DPPCは非常に高価であるため、 DPPCを用いた人工肺サーファタタント組成物も必然的に高価なものとなり、その適用範囲が非常に限られるという大きな欠点がある。したがって、この発明においては、 DPPCの代替物を使用することから、高価な DPPCを使用する必要がないこと、または必要に応じて DPPCを使用する場合でも、その使用量を最小限に抑えることができるという極めて大きな利点がある。しかし、この発明において使用できる力かる代替物としては、比較的安価な卵黄力抽出され精製された egg PC及び安価な卵黄レシチン、分別大豆レシチンなどのリン脂質を選択して使用するのがよい。また、飽和アルキル鎖を持つ DPPCの代わりになる代替物としては、例えば、飽和高級アルコール (例えば 1ーォクタデカノール、 OD)および分別大豆レシチンの不飽和脂肪鎖を水素化した水素化レシチンなども使用することができる。さらに、酸性成分として、従来の人工肺サーファタタント脂質として良く用いられている高級脂肪酸 (例えば、パルミチン酸（PA)、ステアリン酸など)も使用するのがよい。その他、中性脂質（例えば、トリァシルグリセロールやコレステロール、サポニン等)なども使用することができる。

[0023] したがって、この発明に係る人工肺サーファクタント組成物は、リン脂質、高級アルコールおよび高級脂肪酸を主たる配合成分とする脂質混合系または脂質混合系にタンパク質もしくはペプチドを加えたタンパク質/ペプチド—脂質混合系からなっていることを特長としている。

[0024] この発明の人工肺サーファクタント糸且成物に使用することができるリン脂質としては、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンまたはその他の天然素材抽出レシチン、分別大豆レシチンの不飽和脂肪鎖を水素化した水素化レシチンなどや、 DPPCなどのフォスファチジルコリン類が挙げられる。また、リン脂質の割合は、乾燥総重量に対して約 20— 60%、好ましくは約 30— 50%程度であるのがよい。この発明において使用することができる DPPC以外のフォスファチジルコリン類としては、炭素数が 12— 24個のァシル基、好ましくは飽和ァシル基を 2個有するフォスジァシルファチジルコリン類、例えば、ジステアロイルフォスファチジルコリン、パルミトイルステアロイルフォスファチジルコリンなどが挙げられる。その他のフォスファチジルコリン類も使用することができ、例えば、ジァシルフォスファチジルコリン、へキサデシルパルミトイルフォスファチジルコリン、ォクタデシルパルミトイルフォスファチジルコリン等のアルキルァシルフォスファチジルコリン、ジへキサデシルフォスファチジルコリン等のジアルキルフォスファチジルコリンなどが使用することができる。

[0025] 高級アルコールとしては、例えば、炭素原子数 14— 20を有する飽和もしくは不飽和脂肪アルコールまたは、炭素数 14— 20の高級飽和もしくは不飽和脂肪族ァミンなどが挙げられ、例えば、ォクタデカノール、へキサデ力ノールなどの飽和高級アルコールなどが使用できる。高級アルコールの割合は、乾燥総重量に対して約 30— 70 %、好ましくは約 40— 60%程度であるのがよ、。

[0026] 高級脂肪酸としては、例えば、炭素原子数 14— 20の飽和もしくは不飽和脂肪酸が挙げられ、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などが例示される。高級脂肪酸の割合は、感想総重量に対して、約 1 30%、好ましくは約 5— 20%程度含有されているのがよい。

[0027] さらに、この発明の人工肺サーファクタント組成物には、その他の成分として、中性脂質、例えば、トリァシルグリセロールやコレステロール、サポニンなども使用することができる。

[0028] 一方、人工肺サーファタタントに含まれるタンパク質は、リン脂質の単分子膜—二分子膜平衡をスムーズに行うための触媒的な作用をしていると考えられている（ Perez-Gil, J., and Keough, K. M. W., Biochim. Biophys. Acta, 1408, 203 - 217, 1998)。したがって、この発明の人工肺サーファクタント糸且成物は、上述したごとぐその組成が上記脂質混合系だけに限定されるものではなぐ必要に応じて、タンパク質やペプチドなどを添加することもできる。この発明に使用することができる人工肺サーファタタントペプチドの好ましい例としては、図 1に例示する本発明者が開発したぺプチドが挙げられる (発明者:李相男、杉原剛介、柴田功及び雪竹浩、特願 2003— 98 607 ·特開 2004— 305006)。それらの性質、効果などの詳細は上記特許出願明細書に記載されているので、上記特許出願明細書の記載は本明細書の一部を構成する。この発明の人工肺サーファクタント組成物には、サーファタタント蛋白またはサーファタタントペプチドなどが約 2— 10%、好ましくは約 1— 5%程度の割合で更に含まれるのがよい。

[0029] この発明に係る人工肺サーファクタント組成物は、上記脂質または上記脂質とこれらペプチドとを所定の割合で混合して調製することができる。人工肺サーファタタント組成物は、表面張力一面積ダイアグラムを用いてそのサーファタタント活性表面活性を測定することによって評価することができる。この測定には、対象として、呼吸障害の治療薬とされている脂質系のみで構成され、ペプチドを含まない Exosurf (登録商標）、 DPPCを主成分としリジン (K)およびロイシン (L)の合成ペプチドを含んだ Surfaxinとサーファタテン (登録商標）とを用いても測定を行なった。

[0030] この発明に係る人工肺サーファクタント組成物は常法に従って製剤化することができ、例えば、液剤、懸濁剤や、粉末剤などの剤型で適用することができ、ノィアル又はアンプル等の密封容器内に充填し、無菌製剤として保存するのがよい。この発明の人工肺サーファクタント組成物には、必要に応じて、安定剤、保存剤、等張化剤、緩衝剤、懸濁化剤、抗酸化剤及び界面活性剤などの薬理学的に許容可能な添加物又は気管支拡張剤、抗アレルギー剤、制癌剤、抗菌剤、抗ウィルス剤などの医薬品が含有されていてもよい。

[0031] この発明に係る人工肺サーファクタント組成物を、例えば、呼吸窮迫症候群に対する治療剤として適用する場合、その用量、使用法及び回数は患者の症状及び併用療法に応じて適宜変更するのがよい。その 1回投与量は、例えば、小児用には、 50 1000 mg、成人用には 500— 5000 mgの範囲であるのがよい。その用量は、例えば、水、生理食塩液又は生理的に許容される緩衝液などに懸濁し、濃度が 1. 0- 10. 0% (WZV)になるように調整することができ、これを呼吸障害発現直後から 72 時間以内に気道内に 1— 10回程度注入又は噴霧することにより使用することがよい。この発明の人工肺サーファクタント組成物をそのまま粉末剤としても使用する場合には直接吸人させることもできる。

実施例

[0032] 以下、この発明を実施例によって説明するが、この発明は実施例によって一切限定されるものではなぐ下記実施例はこの発明を例示的に説明するためだけに記載されたものである。

[0033] 1.材料

材料としては下記のものを使用した。卵黄から精製されたリン脂質 L- a -フォスファチジルコリン（egg PC) (Avanti PolarLipids, Inc.社製)、水素化大豆レシチン（SLPホヮイト H ;辻製油株式会社製、日本)、大豆レシチン (分別レシチン SLP— PC70 ;辻製油株式会社製、日本)、水素化大豆レシチン (大豆レシチン SLP— PC70を水素化したもの)、卵黄レシチン及びその他の脂質 (和光純薬株式会社製、日本)および試薬（和光純薬株式会社製、日本)を使用した。ペプチドは、自動合成機を用いて合成し 7こタロ \ 製し 7こ (Kiyota, T., Lee, S., and bugihara, G., Biochemistry, 35, 丄《319り, 1996)。

[0034] 対照として使用する薬剤は、呼吸障害の治療薬とされている脂質系のみで構成され、ペプチドを含まな、 Exosurf (登録商標）、 DPPCを主成分としリジン（K)および口イシン (L)の合成ペプチドを含んだ Surfaxinとサーファタテン (登録商標）（三菱ゥェルファーマ株式会社製、日本）についても測定を行なった。 Exosurf (登録商標）及び Surfaxinは、それぞれ DPPC- 1- hexadecanoH loxapol (84 ： 16 ： 0.25 w/w)および DPPC-PG-PA- KL4 (75 ： 25 ： 10 ： 3 w/w)に調製した。

[0035] 2.試料 (脂質又ペプチド脂質混合物)の調製

下記に示す合成ペプチド、脂質、脂肪酸およびアルコールをそれぞれ所定配合量に秤量し、クロ口ホルム Zメタノールに溶解した。必要に応じて上記脂質混合試料にペプチドを適当濃度 (w/w)となるように秤量し添加した。上記脂質混合液 (又はぺプチド含有混合液)に、窒素ガスを吹き込み、その後減圧乾燥し、完全に有機溶媒を揮発させ、容器の壁面にフィルムを形成させた。これに、水を加えて撹拌し、懸濁液を調製後凍結乾燥した。これに生理食塩水を加え撹拌、懸濁液とし、それを各試料溶液とした。なお、対照として使用したサーファタテン (登録商標）は、その生体への使用法に準じて 120 mgを生理食塩水 4mlに懸濁して使用した。

[0036] (A)図 2aに使用する試料

(1)試料 1 :

サーファタテン (登録商標）

(2)試料 2 :

1ーォクタデカノール 85%

パルミチン酸 15%

(3)試料 3 :

1ーォクタデカノール 35%

フォスファチジルコリン 40%

パルミチン酸 25% (4)試料 4 :

1ーォクタデカノール 35% 卵黄レシチン 40% パルミチン酸 25%

(5)試料 5 :

フォスファチジルコリン 85% パルミチン酸 15%

(6)試料 6 :

1ーォクタデカノール 30% フォスファチジルコリン 35% パルミチン酸 25% コレステロール 10%

(7)試料 7 :

1ーォクタデカノール 25% フォスファチジルコリン 40% パルミチン酸 25% 卜リグリセローノレ 10%

(8)試料 8 :

1ーォクタデカノール 30% フォスファチジルコリン 35% パルミチン酸 15% コレステロ一ノレ 10% トリグリセローノレ 10% )図 2bに使用する試料

(1)試料 1 :

サーファタテン (登録商標）

(2)試料 2 :

1ーォクタデカノール 70% フォスファチジルコリン 10% パルミチン酸 20%

(3)試料 3 :

1ーォクタデカノール 40% フォスファチジルコリン 40% パルミチン酸 20%

(4)試料 4 :

1ーォクタデカノール 10% フォスファチジルコリン 70% パルミチン酸 20%

(5)試料 5 :

1ーォクタデカノール 80% フォスファチジルコリン 10% パルミチン酸 10%

(6)試料 6 :

1ーォクタデカノール 40% フォスファチジルコリン 50% パルミチン酸 10%

(7)試料 7 :

1ーォクタデカノール 10% フォスファチジルコリン 80% パルミチン酸 10% )図 3に使用する試料

(1)試料 1 :

サーファタテン (登録商標）

(2)試料 2 :

1ーォクタデカノール 85% パルミチン酸 10% ペプチド Hel 7-11- P24 5%

(3)試料 3 :

1ーォクタデカノール 35% フォスファチジルコリン 40% パルミチン酸 20% ペプチド Hel 7-11- P24 5%

(4)試料 4 :

1ーォクタデカノール 35% フォスファチジルコリン 40% パルミチン酸 20% ペプチド Hel 13-5 5%

(5)試料 5 :

1ーォクタデカノール 35% フォスファチジルコリン 40% パルミチン酸 20% KL 5%

4

)図 4に対する試料

(1)試料 1

Exosurf (登録商標）

(2)試料 2

Surfaxin

(3)試料 3

水素化大豆レシチン PC70 40% 大豆レシチン PC70 40% パルミチン酸 20%

(4)試料 4

水素化大豆レシチン 40% 大豆レシチン PC70 40% パルミチン酸 20%

(5)試料 5

水素化大豆レシチン 40%

大豆レシチン PC70 40%

パルミチン酸 17.5%

Hel 13-5 2.5%

(6)試料 6

水素化大豆レシチン PC70H 40%

大豆レシチン PC70 40%

パルミチン酸 17.5%

Hel 13-5 2.5%

(7)試料 7 :

1ーォクタデカノール 35%

水素化大豆レシチン 40%

パルミチン酸 20%

ペプチド Hel 13-5 5%

[0040] 3.表面張力面積ダイアグラム作成実験方法

表面張力は Acoma Wilhelmy Balance (アコマ医科工業株式会社製、日本)〖こより測定した。テフロン (登録商標)水槽 (78 X 138 X 30 mm)に生理食塩水を張り、閉鎖された液面を作成した。上記液面の気-液界面に 20 1の脂質混合物を展開し、自発的に拡がるまで 3分間放置した。この間の表面張力の変化を水槽中に垂直に懸垂された白金プレートを用いて表面拡散率（surface spreading rate)として記録した。 3分後に形成された単分子膜は、最大 45 cm²から最小 9 cm²までの表面積に、 3分/ cycle の速度で圧縮'膨張を繰り返した。白金プレートに作用する表面張力は、力変により電気信号に変換され、表面積の変化とともに X-Y記録計により自動的に連続記録した。この循環はもはやこれ以上変化はみられないというところまで続けた。図の表記は一般に 7回目の循環のデータを示す。

[0041] 4.ラット肺洗浄による肺サーファタタント欠乏モデル試験体重 500g前後の成熟ラットに気管切開を行い、肺を温生食で洗浄して肺サーファタタント欠乏モデルを作成した。 100%酸素下で人工換気を行い、この発明により構成される 2種類の人工肺サーファタタント [ペプチドを含む系（水素化大豆レシチン一大豆レシチン PC70— PA—Hel 13-5: 40： 40 :1 7.5： 2.5)およびペプチドを含まない系 (水素化大豆レシチン一大豆レシチン PC70— PA、 40： 40： 20)]を投与して延命効果および肺コンプライアンスを測定した。比較対照としては広く臨床で使用されている牛肺サーファタタント由来であるサーファタテン (登録商標)、 Surfaxin, Exosurf (登録商標）の 3種類の肺サーファタタントおよび肺サーファタタント無投与（生理食塩水 2 ml投与）を用いた。それぞれのサーファタタントの懸濁法及び投与量は、生体へのサ一ファタテン (登録商標）投与法に準じて、生理食塩水を用いて濃度 30 mg/mlの懸濁液を作成し、 1 mlを経気道的に投与した。尚、肺機能のパラメータとしては、肺コンプライアンス (換気量/気道圧差)を用いて、洗浄前、洗浄後、サーファタタント投与直前、投与直後、 30、 60、 90、 120、 150および 180分後に測定した。肺コンプライアンスは、肺洗浄前は 0.60 ml/cm H 0前後あった。それを、肺洗浄をして、肺コンプライ

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アンスが 0.2 ml/cm H 0前後になるまで行い、肺サーファクタント欠乏モデルが作成

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されていることを確認した。この確認後、ぞれぞれのサ一ファクタント群毎に 6匹以上のラットを使用して、各種のサーファタタント投与実験を行った。

[0042] 実験結果

肺サーファタタントの表面活性は、 Wilhelmy表面張力計で表面張力表面積曲線を測定したとき、ヒステレシス曲線を描くことが特長である。一般に圧縮時の表面張力の低下速度が速いほど、又自発的な表面拡散能力が速やかなものほど良好な肺サ一ファタタント活性を示すといわれている。すなわち、ヒステリシスカーブの形成する面積の大きい程、又圧縮時の表面張力の小さいものほど良好であると考えられる。図 2に示すごとぐサーファタテン (登録商標）の圧縮時の最小表面張力は 7 mNm— ¹また各拡張時の最大張力は 45 mNm"¹である。

[0043] 図 2aおよび図 2bは、サーファタテン (登録商標）を対象として、種々の脂質組成を有する人工肺サーファクタント組成物の表面張力表面積曲線の結果を示している。図 2aに示す如く、二成分系の OD— PA (85： 15)、 egg PC— PA (85： 15)および OD -PC (40： 60)においては、良好のヒステリシスカーブは得られなかった力 OD-egg PC-PA (35:40:25)においては、最小表面張力（13 mNm"¹)はサーファタテン（登録商標）には及ばないまでも良好な曲線が得られた (図中ライン 3)。また、 OD- egg PCPC— PAに、コレステロール (Ch)及び飽和ァシルトリグリセロール（TG)またその混合系を加えても、改善は見られなカゝつた。

[0044] 次に、 OD— egg PC— PAにおいて良好な結果が得られたので、それらの組成を変えた系で実験を試みた（図 2b)。 OD及び egg PCの多い系（図中、ライン 2、 4、 5、 7) では、サーファタテン (登録商標）に比べて、良好な結果は得られなかったが、 OD及び egg PCの値が近いものが良好な結果を示した（図中、ライン 3、 6)。 PAにおいては、 10%を含むもの（OD— egg PC -PA (40： 50： 10)より 20% (OD— egg PC- PA (40： 40： 20)の方が拡張圧時の表面張力の値が大きかったことから、ヒステリシス力ーブが描く面積は大きかった。一般に、ヒステリシスカーブが描く面積が大きい方が良、結果を与えると言われて、るが、拡張時の表面張力の値にっ、てはインビボ (in vivo)との関連は明らかでない。

[0045] 図 3は脂質ペプチド混合系の結果を示す。 HD— egg PC— PAの系に種々のぺプチドをカ卩えたとき一般に良好のカーブが得られた。例えば、 Hel 7-ll— P24、 P24 、 Hel 13-5等の間には余り差はなかった。臨床第 3相にあると言われている Surfaxin も他のペプチドと同様であった。

[0046] 図 4は大豆レシチン脂質混合系及びそのペプチド混合系の結果を示す。対照として実験した Exosurf (登録商標）および Surfaxinの結果も同時に示す。興味ある事に、試された大豆脂質系においても、 HD-egg PC- PA系と同様の良好なヒステリシス力ーブが得られた。また OD 水素化大豆 PC— PA(35:40:25)においては良好のヒステリシスカーブは得られな力つた。さらに興味あることに、大豆水素化 PCにペプチド含む系においては、拡張時の拡散力は若干弱いものの、圧縮時の表面張力の低下は、サーファタテン (登録商標）のそれより良好であった（図中、ライン 5)。しかし、 Exsosurf (登録商標）や Surfaxinにお、てはサーファタテン (登録商標)様の曲線は得られなかつた o

[0047] 上述のごとぐいくつかの脂質混合系については、サーファタテン (登録商標）と比較して、肺サーファクタントとして良好なヒステレシス曲線を描くことが分力つた。この事は、ペプチドやタンパク質が存在していなくても、脂質混合系のみで十分に肺サーファタタント表面活性を有する事ができることを示している。これらの中には、圧縮時の表面活性の最低値はサーファタテン (登録商標）に比べてやや高、ものの表面圧の早急な低下がみられるものもあった。

[0048] 5.肺洗浄ラットを用いての肺能力の回復実験の結果

体重 500g前後のラットの肺を温生食で洗浄し肺サーファタタント欠乏モデルを作成し、 100 %酸素下に人工換気を行い、この発明により構成される人工肺サーファクタントを投与して延命効果および肺コンプライアンス (換気量/気道圧差)を洗浄前、洗浄後サ一ファクタント投与直前、投与直後、 30、 60、 90、 120、 150、 180分後に測定し、肺機能における効果を検討した。肺サーファタタントは、この発明により構成されるペプチド含有人工肺サーファタタント（OD— egg PC-PA-Hel 13-5; 35： 40： 20： 5 )及び（水素化大豆レシチン一大豆レシチン PC70— PA—Hel 13-5; 40： 40： 17.5： 2.5)およびそれぞれのペプチドを含まない系（OD— egg PC -PA： 35： 40： 25) (水素化大豆レシチン—大豆レシチン PC70-PA； 40： 40： 20)、サーファタテン（登録商標）、 Surfaxin、 Exosurf (登録商標）の 7種類を使用し、肺サーファタタント無投与例には生理食塩水 2 mlを投与した。肺サーファタタントの投与量はそれぞれ 60 mg (30 mg/ml)とした（図 5)。

[0049] 肺洗浄により全てのラットの肺コンプライアンスは 0.2 ml/cm H 0前後に低下した。

2

これに対して、サーファタタント無投与群の肺コンプライアンスは、その後も低下して、肺洗浄後 1時間以内に全例死亡した。

[0050] 肺サーファクタントタンパク質を含むサーファタテン (登録商標)の投与群ラットは、投与直後より肺コンプライアンスが 0.255 ml/cm H 0に上昇し、 30分後には 0.288

2

ml/cm H 0となり、以後実験終了の洗浄後 3時間まで 0.3 ml/cm H 0前後を維持し

2 2 た。ペプチドを含む Surfaxinは、投与直後の肺コンプライアンスは 0.179 ml/cm H〇

2 と低下し、 30分後では 0.248 ml/cm H 0、 60分では 0.279 ml/cm H 0となったが、

2 2

90分後には 0.24 ml/cm H 0と低下し、終了時の 3時間後の肺コンプライアンスは

2

0.237 ml/cm H 0であった（図 5a)。この発明により構成されるペプチドを含む人工肺サーファタタント（水素化大豆レシチン一大豆レシチン PC70— PA— Hel 13-5 ; 40： 40： 17.5： 2.5)は、投与直後の肺コンプライアンスは 0.237 ml/cm H 0と上昇し、 30

2

分後には 0.275 ml/cm H 0、 60分後には 0.268 ml/cm H 0となった。し力し、 90分

2 2

後には 026 ml/cm H 0となり、終了時の 3時間後の肺コンプライアンスは 0.3 ml/cm

2

H 0で、投与直後から 150分後の肺コンプライアンスの回復は若干サーファタテン（

2

登録商標）に劣るが、 180分後では同等の回復を示した。また、 Surfaxinと比較すれば、全ての測定時間で良好な肺コンプライアンスが認められた。 OD-egg PC— PA— Hel 13-5においては、大豆脂質系に比べて、コンプライアンスの回復はやや弱かつたものの、 Surfaxinと比較すれば良好であつた。

[0051] ペプチドを含まな!/、系につ!/、ては、 Exosurl (登録商標)は、投与直後の肺コンプライアンスが 015 ml/cm H 0に低下し、 30分後には 0.165 ml/cm H 0に、 60分後以降

2 2

は 0.17 ml/cm H 0のままであった (図 5b)。この発明の OD— egg PC— PAでは、投与

2

直後の肺コンプライアンスの低下は 0.198 ml/cm H 0と認められず、 30分後には

2

0.211 ml/cm H 0、 60分後には 0.18 ml/cm H 0となった。し力し、 90分後には 0.20

2 2

ml/cm H 0と上昇し、以後 0.21ml/cm H 0前後の肺コンプライアンスを示した。また、

2 2

全ての測定時間において、この発明のサーファタタントと同様にペプチドを含まない

Exosur 登録商標)より良好な結果を示した。また、 3時間後の肺コンプライアンスは 0.237 ml/cm H 0であった。水素化大豆レシチン一大豆レシチン PC70— PAにおい

2

ても同様であった。

[0052] 以上の実験結果から。ラット肺サーファタタント欠乏モデルにおいて、大豆脂質ペプチド混合系では牛肺サーファタタント由来の天然アポ蛋白を含むサーファタテン (登録商標）に比べて投与直後から 150分間は、肺機能改善効果は若干弱いが、 180分後には同等の機能を示し、合成ペプチドを含む Surfaxinよりも全ての実験時間を通じて優れた機能を示した。また、ペプチドを含まない大豆脂質混合系と Exosurf (登録商標）との比較では全ての実験時間を通じて大豆脂質混合系は優れた機能を示した。

産業上の利用可能性

[0053] この発明に係る人工肺サーファクタント組成物は、サーファタテン (登録商標）に比ベて非常に低コストで調整ができるため、医薬品として、 RDSや ADRSへの適用は勿論の事、肺ガン等による重篤な末期症状の呼吸窮迫の緩和および予防、去痰、喘息の呼吸困難症状の緩和および予防に使用できる。また、牛肺などの生物由来のタンパク質等を原料としない完全人工調整肺サーファタタントであるため、未知の感染症、狂牛病やアレルギーの問題の除去なども可能である。また使用される脂質は、全て、医薬品等に混合されるなどして適用がなされている。更に、大豆レシチンは、医薬品としても使用されているため、毒性についても問題はないと考えられる。これらの事から、この発明に係る人工肺サーファクタント組成物は広範囲な肺疾患医薬品として適用することができる。

Claims

請求の範囲

[I] リン脂質と、高級アルコールと、高級脂肪酸とから構成される混合脂質からなる人工肺サーファクタント組成物。

[2] タンパク質またはペプチドをさらに含むことからなる請求項 1に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[3] 乾燥総重量にして、前記リン脂質を 20— 60重量％、前記高級アルコールを 30— 70 重量％、前記高級脂肪酸を 1 30重量％含有することからなる請求項 1または 2に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[4] 乾燥総重量に対して、前記リン脂質を 30— 50重量％、前記高級アルコールを 40—

60重量％、前記高級脂肪酸を 5— 20%重量含有することからなる請求項 1または 3 のいずれか 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[5] 前記タンパク質またはペプチドがさらに乾燥総重量にして 1— 10重量％含有していること力もなる請求項 2ないし 4のいずれか 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[6] 前記タンパク質またはペプチドがさらに乾燥総重量にして 2— 5重量％含有していること力もなる請求項 2な、し 5の、ずれ力 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物

[7] 前記リン脂質が、 DPPC、卵黄レシチン、大豆レシチンまたはその他の天然素材抽出レシチンであることからなる請求項 1な!、し 6の!、ずれ力 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[8] 前記高級アルコールが炭素原子数 14— 20を有する飽和もしくは不飽和脂肪アルコールまたは、炭素数 14— 20の高級飽和もしくは不飽和脂肪族ァミンであることからなる請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[9] 前記高級アルコールがォクタデカノールであること力もなる請求項 1な、し 8の、ずれ力 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[10] 前記高級脂肪酸が、炭素原子数 14— 20の飽和もしくは不飽和脂肪酸を用いること力もなる請求項 1な、し 9の、ずれか 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物。

[II] 前記高級脂肪酸がパルミチン酸であることからなる請求項 1ないし 10のいずれか 1項に記載の人工肺サーファクタント組成物。

請求の範囲第 1項ないし第 11項のいずれか 1項に記載の人工肺サーファタタント組成物をサーファタタント不足あるいは機能不全に起因する疾患に対して使用すること力もなる人工肺サーファクタント組成物の使用方法。