KR20150089006A

KR20150089006A - 재구성된 폐 계면활성제

Info

Publication number: KR20150089006A
Application number: KR1020157012783A
Authority: KR
Inventors: 얀 요한손; 토레 쿠르스테드트
Original assignee: 키에시 파르마슈티시 엣스. 피. 에이.
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2015-08-04
Also published as: EP2922868A1; EP2922868B1; CN104812771B; AR093569A1; RU2656185C2; RU2015118702A; WO2014079898A1; HK1211964A1; CN104812771A; CA2891933A1; KR102122088B1; US9074018B2; US20140142021A1; CA2891933C; BR112015009486B1; ES2644317T3; BR112015009486A2

Abstract

본 발명은 인지질 혼합물 및 천연 계면활성 단백질 SP-B의 유사체 및 천연 계면활성 단백질 SP-C의 특정 유사체의 조합물을 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들의 약제학적 조성물 및 키트 및 RDS 및 기타 호흡기 장애의 치료 또는 예방을 위한 용도에 관한 것이다.

Description

재구성된 폐 계면활성제{RECONSTITUTED PULMONARY SURFACTANTS}

본 발명은 미숙아의 호흡 곤란 증후군(RDS) 및 기타 호흡기 장애의 예방 또는 치료를 위한 합성 폐 계면활성제에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 인지질 혼합물 및 천연 계면활성 단백질 SP-B의 유사체 및 천연 계면활성 단백질 SP-C의 특정 유사체의 조합물을 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이다.

인간의 폐는 폐포(alveoli)라고 부르는 수많은 작은 공기 주머니로 이루어지고, 여기서 혈액과 폐의 공기 공간 사이에 기체가 교환된다. 건강한 개체에서, 상기 교환은 호기의 말에 폐가 허탈하는(collapsing) 것을 방지하는 단백질 함유 계면활성제 복합체의 존재에 의하여 매개된다.

폐 계면활성제 복합체는 주로 지질로 이루어지고, 소량의 다양한 단백질을 함유한다. 적절한 수준의 이러한 복합체의 부재는, 폐의 기능 부전(malfunction)을 가져온다. 이러한 증후군을 호흡 곤란 증후군(Respiratory Distress Syndrome, RDS)이라고 부르고, 미숙아에게서 흔히 발병된다.

상기 증후군은 동물의 폐로부터 추출된 변형된 천연 계면활성제 조제물에 의하여 효과적으로 치료된다.

상업적으로 이용가능한 변형된 계면활성제 조제물은, 예를 들면, 돼지 폐로부터 얻은 포락탄트 알파(큐로서프(curosurf)^TM), 송아지 폐 세척으로부터 추출된 칼팩턴트(인파서프(Infasurf)^TM) 그리고 화학적으로 변형된 천연 소의(bovine) 폐 추출물인 베락탄트(서반타(Survanta)^TM)이다.

이들 계면활성제 조제물의 주요 구성성분은, 인지질 예를 들면 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), (PG) 및 계면활성 소수성 단백질 B 및 C(SP-B 및 SP-C)이다.

생산과 멸균 공정의 복잡성 및 면역 반응의 유발 가능성과 같은, 동물 조직으로부터의 계면활성제 조제물의 단점 때문에, 변형된 천연 계면활성제의 조성물을 모방하는 합성 계면활성제가 개발되어 왔다.

그러나, 이용가능한 문헌에 따르면, 지금까지 개발된 합성 계면활성제 중 어느 것도 동물로부터 추출된 계면활성제와 동일한 효능을 보여주는 것은 없다.

가능한 설명은 지금까지 개발된 상기 이용가능한 재구성된 계면활성제들은, 단 하나의 단백질성(펩티드) 성분을 포함하기 때문에 변형된 천연 계면 활성제의 완전한 단백질성 프로파일(proteinaceous profile)을 재현하지 못한다는 것이다.

이러한 이유로, 천연 계면활성 단백질 SP-B 및 SP-C의 유사체를 모두 포함하는 재구성된 계면활성제가 당해 기술분야, 예를 들면, WO 2008/044109, WO 2008/011559 및 WO 2010/139442에 제안되어 왔다.

그럼에도 불구하고, 재구성된 계면활성제가, 동물로부터 추출된 계면활성제의 것의 폐 순응도(lung compliance)에 관하여, 특히 호기의 말에 폐포 개방(patency) 등급 및 폐 가스 용적에 관하여 동일한 효능을 달성할 수 있는 가능성에 대해 여전히 회의가 있다.

이 점에 있어서, 본 출원인은 단백질성 프로파일에 더하여, 인지질 조성물은 호기의 말에 폐포를 안정화하기 위해 또한 매우 중요하다는 것을 알게 되었다.

특히, 본 출원인은 WO 2008/044109에 개시된 단백질 B 및 C의 대표적인 유사체 및 불포화 인지질이 풍부한 포락탄트 알파로부터 추출된 인지질 분획(fraction)을 포함하는 재구성된 계면활성제가 일회 호흡량(tidal volume) 및 폐 가스 용적(lung gas volume)에 관하여 포락탄트 알파의 것과 오버랩 가능한(overlappable) 결과를 가져오는 것을 알았다.

그래서 폐 순응도에 관하여 상기 특성을 향상시키는 데 도움이 될 수 있는 인지질 혼합물을 포함하는 재구성된 계면활성제를 제공하는 것은 매우 유리하다.

WO 2004/105726에는, 합성 계면활성제의 점도를 저감할 목적으로 고도불포화된(polyunsaturated) 인지질을 포함하는 지질 혼합물의 사용이 개시되어 있다.

불포화 인지질이 풍부한 천연 유도된 분획은, 일회 호흡량 및 폐 가스 용적에 관해 특성을 가지고 포락탄트 알파와 같은 변형된 천연 계면활성제의 것에 비해 열등하지 않은 재구성된 계면활성제 조제물을 제공하기 위해, 천연 SP-C 단백질의 특정 유사체 및 천연 단백질 SP-B의 특정 유사체와 유리하게 결합될 수 있음이 본 발명의 목적이고, 이제 확인되었다.

발명의 요약

본 발명은 지질 담체(carrier), 및 천연 계면활성 단백질 SP-B의 특정 폴리펩타이드 유사체와 천연 계면활성 단백질 SP-C의 특정 폴리펩타이드 유사체의 조합물을 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이다.

특히, 본 발명은

인지질 혼합물;

천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩타이드 유사체; 및

일반식:

(여기서:

Ω는 M 또는 황 원자 상에서 산화된 M, I, L 및 nL로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이고,

p는 0 또는 1이다)

에 의해 나타내어지는 천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩타이드 유사체를 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이고,

상기 인지질 혼합물은

i) 50 중량%의 양의 DPPC;

ii) 10 중량%의 양의 POPG; 및

iii) 30 내지 50% POPC, 10 내지 20% PLPC, 4 내지 10% P(:1)OPC, 5 내지 8% SLPC, 5 내지 8% DOPC, 1 내지 3% SAPC, 5 내지 15% SOPC, 1 내지 2% PAPC, 1 내지 3% PDPC, 0 내지 3.5% SOPE, 0 내지 8% SAPE, 0 내지 4% SLPE, 0 내지 2.5% PLPE, 0 내지 3.5% POPE, 0 내지 2.0% LAPE, 0 내지 2.% LLPE, 0 내지 10% PSM으로 필수적으로 이루어지는 40 중량%의 양의 불포화된 인지질의 천연 유도된 분획;

로 이루어지며,

i), ii) 및 iii)의 양은 모두 인지질 혼합물의 총 중량에 대해 계산된다.

본 발명은 또한 상기 청구된 재구성된 계면활성제 단독 또는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합한 것을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 약제로서 상기 청구된 재구성된 계면활성제의 용도를 제공한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 호흡 곤란 증후군(RDS) 및 기타 호흡기 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 상기 청구된 재구성된 계면활성제의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 호흡 곤란 증후군(RDS) 및 기타 호흡기 장애의 예방 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 청구된 재구성된 계면활성제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 호흡 곤란 증후군(RDS) 및 기타 호흡기 장애의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 환자에게 치료학적 유효량(therapeutically effective amount)의 상기 언급된 재구성된 계면활성제를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 a) 제 1 단위(unit) 제형(dosage form) 내 분말 형태의 본 발명의 재구성된 계면활성제; b) 제 2 단위 제형 내 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 c) 상기 제 1 및 제 2 제형을 함유하기 위한 용기(container) 수단을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다.

도 1은 2% ox Mini-B(Leu) + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 간-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 시간/압력의 함수로서의 일회 호흡량(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 2는 2% ox Mini-B(Leu) + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 간-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 폐 가스 용적(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 3은 2% ox Mini-B(Leu) + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 정제하지 않은 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 시간/압력 함수로서의 일회 호흡량(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 4는 2% ox Mini-B(Leu) + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 정제하지 않은 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 폐 가스 용적(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 5는 2% ox Mini-B(Leu) + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 시간/압력 함수로서의 일회 호흡량(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 6은 2% ox Mini-B(Leu) + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 폐 가스 용적(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 7은 2% ox Mini-B27 + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 시간/압력 함수로서의 일회 호흡량(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 8은 2% ox Mini-B27 + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 폐 가스 용적(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 9는 2% ox Mini-B(Leu) 또는 ox Mini-B27 + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 일정한 일회 호흡량에서 수행된 실험에서의 일회 호흡량(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.
도 10은 2% ox Mini-B(Leu) 또는 ox Mini-B27 + 2% SP-C33(Leu) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황-PC로 만들어진 재구성된 계면활성제 대(versus) 큐로서프^TM 및 대조군의 일정한 일회 호흡량에서 수행된 실험에서의 폐 가스 용적(ml/kg)에 관한 결과를 나타낸다.

정의

본 출원에서, 용어 "재구성된 계면활성제(reconstituted surfactant)"는, 재조합 기술 또는 합성 방법을 포함하는 임의의 수단에 의해 만들어진, 계면활성 단백질의 폴리펩타이드 유사체가 첨가되어 있는, 지질 담체를 의미한다.

용어 "천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩타이드 유사체"는, 예를 들면 인지질 혼합물과 같은, 지질 담체와의 혼합물에서, 폴리펩타이드가 폐 계면활성제 활성(activity)을 나타내는 한, 천연 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되거나 결실된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.

용어 "천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩타이드 유사체"는, 예를 들면 인지질 혼합물과 같은, 지질 담체와의 혼합물에서, 폴리펩타이드가 폐 계면활성제 활성을 나타내는 한, 천연 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되거나 결실된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.

용어 "Mini-B"는, 그 구조가 California NanoSystem Institute 웹사이트로부터 얻은 프레젠테이션에서 처음 일반적으로 개시된, 천연 SP-B 단백질의 N-말단 잔기(residue) 8-25 및 C-말단 잔기 63-78에 기초한 34-잔기 폴리펩타이드를 의미한다. 그 완전한(full) 서열은 이 후 RCSB Protein Data Bank에 개시되었다.

Waring AJ 등의 J Peptide Res 2005, 66, 364-374에서, 그 구조 및 활성에 대해 더 많은 정보가 보고되었다.

용어 "변이체(variants)"는, 지질 담체와의 혼합물에서, 펩타이드가 Mini-B의 활성을 유지하는 한, 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 아미노산 서열을 갖는 Mini-B 펩타이드의 폴리펩타이드 유사체를 의미한다.

본 명세서 내에 동정된(identified) 모든 아미노산 잔기는 천연 L-배열(configuration) 내이고, 본 명세서에서 동정된 서열은 다음의 표 1에 나타내어지는 바와 같이 아미노산 잔기의 표준 약어에 따라 기록된다.

[아미노산의 표 1]

본 텍스트에서 사용된 바와 같이, 용어 "인지질"은, 특징적인 부분으로서 글리세롤, 포스페이트기, 중성 또는 양성(zwitter) 이온 부위(moiety)로 구성된 지질의 계열(class)에 관한 것이고, 상기 법칙에서 하나의 예외는, 글리세롤 대신 스핑고신(sphingosine)으로부터 유도된, 스핑고미엘린(sphingomyelin)이다. 상기 글리세롤 부위 또는 스핑고신 잔기는, 차례대로, 포화되거나(예를 들면, 미리스트산, 팔미트산 및 스테아르산), 단일불포화되거나(예를 들면, 올레산) 또는 고도불포화될 수 있는(예를 들면, 리놀레산 및 아라키돈산), 장쇄 지방산(C₁₄-C₂₂)으로 에스테르화될 수 있다.

본 출원 내에 인용된 인지질 계열 및 종들은 하기 표 2에 사용된 약어와 함께 리스트된다.

[인지질의 표 2]

- 인지질: PLs;

- 포스파티딜콜린: PC;

- 포스파티딜에탄올아민: PE;

- 포스파티딜글리세롤: PG;

- 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol): PI;

- 포스파티딜세린: PS;

- 스핑고미엘린: SM;

- 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 디팔미토일-포스파티딜콜린으로서 일반적으로 알려짐: DPPC;

- 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 팔미토일-올레오일-포스파티딜콜린으로서 일반적으로 알려짐: POPC;

- 1-팔미토일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 팔미토일-리놀레오일-포스파티딜콜린으로서 일반적으로 알려짐: PLPC;

- 1-팔미톨레오일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 팔미톨레오일-올레오일-포스파티딜콜린으로서 일반적으로 알려짐: P(:1)OPC

- 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 스테아로일-올레오일-포스파티딜콜린으로서 일반적으로 알려짐: SOPC;

- 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 스테아로일-리놀레오일-포스파티딜콜린으로서 일반적으로 알려짐: SLPC;

- 1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 스테아로일-아라키도노일-포스포콜린(stearoyl-arachidonoyl-phosphocholine)으로서 일반적으로 알려짐: SAPC;

- 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 팔미토일-아라키도노일-포스포콜린으로서 일반적으로 알려짐: PAPC;

- 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 디올레오일-포스파티딜콜린으로서 일반적으로 알려짐: DOPC;

- 1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 팔미토일-도코사헥사에노일-포스파티딜콜린(palmitoyl-docosahexaenoyl-phosphatidylcholine)으로서 일반적으로 알려짐: PDPC;

- 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: DPPE;

- 1-팔미토일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 팔미토일-리놀레오일 포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: PLPE;

- 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 스테아로일-올레오일 포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: SOPE;

- 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 스테아로일-리놀레오일 포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: SLPE;

- 1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 스테아로일-아라키도노일-포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: SAPE;

- 1-리놀레오일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 리놀레오일-아라키도노일-포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: LAPE;

- 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 디리놀레오일-포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: DLPE;

- 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 디올레오일-포스파티딜에탄올아민으로서 일반적으로 알려짐: DOPE;

- 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, 팔미토일-올레오일-포스파티딜글리세롤로서 일반적으로 알려짐: POPG;

- 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, 디올레오일-포스파티딜글리세롤로서 일반적으로 알려짐: DOPG;

- 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린, 디팔미토일-포스파티딜세린으로서 일반적으로 알려짐: DPPS;

- 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, 디팔미토일-포스파티딜글리세롤로서 일반적으로 알려짐: DPPG;

- N-팔미토일-D-스핑고실포스포릴콜린(sphingosylphosphorylcholine): PSM

표현 "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은, 불포화된 인지질의 천연 유도된 분획(fraction)이 추가의 성분들을 매우 작은 양(0.1% w/w 미만)으로 각각 포함할 수 있고, 상기 분획의 활성 및 물성에 실질적으로 영향을 미치지 않음을 의미한다.

계면활성제 조제물을 위한 "계면활성제 활성"은 표면 장력을 낮출 수 있는 능력으로서 정의된다.

외인성(exogenous) 계면활성제 조제물의 인비트로(in vitro) 효능은 적절한 기구, 예를 들면 Wilhelmy Balance 및 Captive Bubble Surfactometer를 사용하여 표면 장력을 낮추는 능력을 측정함으로써 보통 평가된다.

외인성 계면활성제 조제물의 인비트로 효능은 다음의 파라미터를 측정함에 의해 보통 평가된다:

i) 폐 순응도의 지수인 일회 호흡량;

ii) 호기의 말에 폐포 공기 팽창 또는 개방의 지수이고, 이에 따라 호기의 말에 폐포 내 안정한 인지질 막을 형성할 수 있는 능력의 지수인, 폐 가스 용적;

iii) 폐 내 폐포의 총 용적의 백분율인 폐포 용적 밀도. 상기 백분율은, Berggren P 등의 Respiration Physiology, 1999, 115, 45-33의 단락 2.2.2에 개시된 방법에 따라, 폐포의 총 용적을 총 폐 용적(폐포 + 조직, 예를 들면 세기관지(bronchioli), 관(vessel) 제외)으로 나누어 계산된다. 상기 값은 전체 폐에 대해 측정된 폐 가스 용적과 유사하지만, 폐포 용적 밀도는 조직 절편(histological section)으로부터 측정된다.

본 명세서에서 사용된 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은, 내인성(endogenous) 계면활성제의 결핍 또는 기능 장애(dysfunction)와 관련된 호흡기 질환 또는 장애를 예방, 방지, 감소 또는 제거할 수 있는 재구성된 계면활성제의 양을 나타낸다.

"재조합(recombinant)"은, 예를 들면 세포 또는 핵산, 단백질 또는 벡터에 관해 사용될 때, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종의(heterologous) 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경(alteration)에 의해 변형된 것을 나타낸다.

본 명세서에서 사용될 때, 점 값(point value)에 적용된 용어 "약"은, ±5%의 변산도(variability)를 나타낸다.

본 발명의 구체적인 설명

본 발명은 식 (I)의 천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩타이드 유사체, 식 (II) 또는 (III)의 천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩타이드 유사체 및 불포화 인지질이 풍부한 천연 유도된 분획을 포함하는 인지질 혼합물을 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이다.

실제로 상기 재구성된 계면활성제 조제물은 일회 호흡량 및 폐 가스 용적과 관련하여 포락탄트 알파와 같은 변형된 천연 계면활성제에 열등하지 않은 특성을 가지는 것이 발견되었다.

특히, 단백질성 성분들 이외에 상기 인지질 조성물 또한 호기말양압(positive end-expiratory pressure, PEEP) 없이 환기된(ventilated) 동물 내 호기말에 폐포를 안정화하기 위해 매우 중요하다는 것이 발견되었다.

또한, 상기 청구된 인지질 혼합물을 사용하면서, 비록 식 (III)의 SP-B 유사체가 사용되더라도(이것은 식 (II)의 유사체보다 짧지만, DPPC 및 POPG의 단순(simple) 인지질 혼합물과 혼합될 때 점성의 조제물을 생성시킨다), 낮은 점도를 가지는 조성물을 제공하는 것이 가능하다는 것이 발견되었다.

유리하게는, 상기 SP-C 단백질의 폴리펩타이드 유사체는 일반식 (I)에 의해 나타내어진다:

여기서:

Ω는 M 또는 황 원자 상에서 산화된 M, I, L 및 nL로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이고, 바람직하게는 L(norLeucine)이며

p는 0 또는 1이다.

식 (I)의 폴리펩타이드의 예는 하기에 보고된다:

상기 폴리펩타이드 (Ia)는 SP-C33으로서 종래 기술분야에서 또한 나타내어져 왔다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 일반식 (I)의 상기 폴리펩타이드는, 당해 기술분야에서 SP-C33(Leu)로서 나타내어지는, 상기 폴리펩타이드 (Ic)이다.

상기 단백질 SP-B의 유사체는 일부의 상기 천연 단백질 또는 이들의 변형체에 대응하는 다른 폴리펩타이드로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 구현예에서, 상기 천연 단백질 SP-B의 유사체는 하기 일반식 (II)에 의해 나타내어지는 폴리펩타이드이다:

여기서:

θ는 L, I 및 C로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 C이며;

△는 W, I 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 W이며;

Ω는 M, I, L 및 nL로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 L이며;

Φ는 R 및 T로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 R이며;

f는 0 또는 1이다.

f는 0인 일반식 (II)에 따른 폴리펩타이드는 하기에 보고된다:

바람직하게는, 상기 폴리펩타이드 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)는 이황화결합된(disulfide linked) 분자의 형태일 수 있고, 여기서 상기 분자내 이황화결합은 위치 1 및 33에서의 두개의 C 잔기 사이 및/또는 위치 4 및 27에서의 두개의 C 잔기 사이이다.

상기 이황화결합된 폴리펩타이드 (IIa)는 당해 기술분야에서 Mini-B 및 산화된 Mini-B(ox Mini-B)로서 그 이황화결합된 형태로 나타내어진다 - Waring AJ 등의 J Peptide Res 2005, 66, 364-374 참조.

특히 바람직한, 상기 폴리펩타이드 (IIc)는 당해 기술분야에서 Mini-B(Leu) 및 ox Mini-B(Leu)로서 그 이황화결합된 형태로 WO 2008/044109에 나타내어진다.

f가 1인 일반식 (II)에 따른 폴리펩타이드는 하기에 보고된다:

바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 사이클릭 분자 형태일 수 있고, 여기서 상기 결합은 위치 8 및 40에서의 C 잔기 사이 및/또는 위치 11 및 34에서의 C 잔기 사이이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 천연 단백질 SP-B의 유사체는 하기 일반식 (III)에 의해 나타내어지는 폴리펩타이드이다:

여기서

X는 C, A 및 G, L, 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 C이며;

△는 W, L, nL(norLeucine) 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 W 또는 L이며;

Φ는 C, A 및 G, L, 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 C이며;

Σ는 S, G 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;

Ω는 C, L 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이고, 바람직하게는 C이며;

q는 0 또는 1이다.

유리하게는, 상기 폴리펩타이드는 사이클릭 분자 형태일 수 있고, 여기서 결합은 위치 1 및 27에서의 C 잔기 사이 및/또는 위치 4 및 21에서의 C 잔기 사이이다.

일반식 (III)을 포함하는 폴리펩타이드는 예를 들면 하기에 보고된다:

바람직한 폴리펩타이드는, 이후 본 명세서에서 ox Mini-B27로 나타내어지는, 그 이황화결합된 형태로의 식 (IIIb)의 것이다.

일반식 (I), (II) 및 (III)의 폴리펩타이드는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 재조합 기술 또는 합성 방법에 따라 제조될 수 있다.

고체상 펩타이드 합성에 대해서는 J.M. Steward 및 J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, 및 J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol.2, p. 46, Academic Press (New York), 1983에서, 고전적인(classical) 용액 합성에 대해서는 E. Schroder 및 K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965에서, 이용가능한 많은 기술들의 훌륭한 요약을 발견할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)에서 Merrifield에 의해 처음 기재된 고체상 합성 기술을 사용하여 또한 제조될 수 있다. 다른 폴리펩타이드 합성 기술은, 예를 들면 M. Bodanszky 등의 Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976)에서 뿐만 아니라, 또한 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 다른 참고 연구에서 발견될 수 있다.

상기 합성에서의 사용을 위한 적절한 보호기는 상기 문서 뿐만 아니라 J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973)에서 또한 발견될 것이다.

예를 들면, 일반식 (I)의 폴리펩타이드는 WO 00/47623에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.

f가 0인 경우의 일반식 (II)의 폴리펩타이드는 Waring AJ 등의 J Peptide Res 2005, 66, 364-374 또는 WO 2008/044109에 보고된 방법에 따라 제조될 수 있고, f가 1인 경우의 일반식 (II)의 폴리펩타이드는 WO 2008/011559의 교시에 따라 제조될 수 있다.

일반식 (III)의 폴리펩타이드는 WO 2009/018908에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 일반식 (I), (II) 및 (III)의 폴리펩타이드 및, 예를 들면 아세틸화 및 아미드화를 통한, 그들의 블록된(blocked) N- 및/또는 C-말단 유도체의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들면 염산, 아세트산 및 트리플루오로아세트산의 염을 포함한다.

상기 인지질 POPG는 유리하게는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태, 예를 들면 나트륨염(POPG Na)으로서 존재할 수 있다.

바람직하게는, 상기 일반식 (I)의 폴리펩타이드 및 상기 일반식 (II) 또는 (III)의 폴리펩타이드는, 일정한 조합으로서의 정량적인(quantitative) 비율로 및 일정한 양으로, 본 발명의 재구성된 계면활성제 내에 존재한다.

상기 재구성된 계면활성제에 대한 일반식 (I) 및 (II) 또는 (III)의 폴리펩타이드의 비율은 다양할 수 있다. 유리하게는 각각의 폴리펩타이드는 계면활성제의 중량에 기초하여 0.5 내지 10% 사이에 포함되는 양(w/w), 바람직하게는 1 내지 5%, 가장 바람직하게는 1 내지 3%의 양으로 존재할 수 있다.

상기 인지질 혼합물은 i) 50 중량% 양의 DPPC; ii) 10 중량% 양의 POPG; 및 iii) 40 중량% 양의 불포화 인지질의 천연 유도된 분획으로 이루어지고, 상기 i), ii) 및 iii)의 모든 양들은 상기 인지질 혼합물의 총 중량에 대해 계산된다.

차례로, 상기 불포화 인지질의 천연 유도된 분획은, 30 내지 50% POPC, 10 내지 20% PLPC, 4 내지 10% P(:1)OPC, 5 내지 8% SLPC, 5 내지 8% DOPC, 1 내지 3% SAPC, 5 내지 15% SOPC, 1 내지 2% PAPC, 1 내지 3% PDPC, 0 내지 3.5% SOPE, 0 내지 8% SAPE, 0 내지 4% SLPE, 0 내지 2.5% PLPE, 0 내지 3.5% POPE, 0 내지 2.0% LAPE, 0 내지 2.% LLPE, 0 내지 10% PSM으로 필수적으로 이루어진다.

상기 분획을 이루는 다른 성분들의 상대적인 양의 합계는 100%이어야 한다. 인지질 혼합물의 총 중량에 대한 이들의 절대양은 각 값에 0.4를 곱하여 계산될 수 있다.

상기 불포화 인지질의 천연-유도된 분획의 전형적인 조성물은 L-α-포스파티딜콜린 추출물의 중량에 기초하여, 약 45% POPC, 약 20% PLPC, 약 6% P(:1)OPC, 약 6% SLPC, 약 6% DOPC, 약 3% SAPC, 약 10% SOPC, 약 2% PAPC, 약 2% PDPC로 구성될 수 있다.

상기 분획의 다른 전형적인 조성물은 L-α-포스파티딜콜린 추출물의 중량에 기초하여, 약 35% POPC, 약 20% PLPC, 약 5% P(:1)OPC, 약 5% SLPC, 약 5% DOPC, 약 1% SAPC, 약 7% SOPC, 약 1% PAPC, 약 1% PDPC, 약 2% SOPE, 약 7% SAPE, 약 3% SLPE, 약 2% PLPE, 약 2% POPE, 약 2% LAPE, 약 1% LLPE, 약 1% PSM으로 구성될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 불포화 인지질의 천연-유도된 분획의 소스(source)로서, 다른 순도를 가지는 난황(egg yolk)으로부터 유도된 L-α-포스파티딜콜린이 사용될 수 있다(Sigma Aldrich Co, St. Louis, MO, USA).

예를 들면, 99% w/w 초과의 순도를 가지는 난황으로부터 유도된 L-α-포스파티딜콜린이 사용될 수 있다. 이는 필수적으로 다음의 조성을 가진다: L-α-포스파티딜콜린 추출물의 중량에 기초하여, 40 내지 50% POPC, 15 내지 20% PLPC, 5 내지 7% P(:1)OPC, 6 내지 7% SLPC, 6 내지 7% DOPC, 2 내지 3% SAPC, 10 내지 15% SOPC, 1 내지 2% PAPC, 1 내지 2% PDPC.

그렇지 않으면, 약 40% w/w의 순도를 가지는 난황으로부터 유도된 L-α-포스파티딜콜린이 사용될 수 있고, 이것은 다음의 조성을 가진다: L-α-포스파티딜콜린 추출물의 중량에 기초하여, 30 내지 40% POPC, 13 내지 18% PLPC, 3 내지 4% P(:1)OPC, 5 내지 6% SLPC, 5 내지 6% DOPC, 1 내지 2% SAPC, 6 내지 8% SOPC, 1 내지 2% PAPC, 1 내지 2% PDPC, 3 내지 3.5% SOPE, 7 내지 8% SAPE, 3.5 내지 4.5% SLPE, 2 내지 2.5% PLPE, 3 내지 3.5% POPE, 1.5 내지 2.0% LAPE, 1 내지 2% LLPE, 0.5 내지 1% PSM.

상기 불포화 인지질의 분획의 소스로서, 99% w/w 초과의 순도를 가지는 소 간(bovine liver)으로부터 유도된 L-α-포스파티딜콜린이 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 분획은 통상의 기술자에게 알려진 방법에 따라 크로마토그래피에 의해, 다른 소스, 예를 들면 토끼 간으로부터 단리될 수 있다.

이론적으로, 상기 불포화 인지질의 분획은 적절한 양으로 각 성분을 혼합함으로써 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 또한 제조될 수 있다.

인지질의 상대적인 양은 당해 기술분야에 알려진 방법에 따라, 예를 들면 Miroslav L 등의 J Chromatog A 2011, 1218, 5146-5156에 보고된 방법에 따라 LC-MS에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 재구성된 계면활성제는 추가의 성분, 예를 들면 중성 지질 예를 들면 트리아실글리세롤, 유리지방산, 콜레스테롤 및/또는 추가의 인지질 예를 들면 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, DPPS 및 DPPG, 및 DOPE를 포함할 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 상기 재구성된 계면활성제는, 90 내지 99 중량%의 인지질 혼합물, 바람직하게는 92 내지 98 중량%, 보다 바람직하게는 94 내지 96 중량%, 및 1 내지 10 중량%의 식 (I)의 펩타이드 및 식 (II), (III) 또는 (IV)의 펩타이드의 합, 바람직하게는 2 내지 8 중량%, 보다 바람직하게는 4 내지 6 중량%를 포함한다.

본 발명의 구현예 중 하나에서, 상기 재구성된 계면활성제는, 96 중량%의 인지질 혼합물, 2 중량%의 일반식 (I)의 폴리펩타이드 및 2 중량%의 일반식 (II)의 폴리펩타이드를 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 재구성된 계면활성제는, 96 중량%의 인지질 혼합물, 2 중량%의 일반식 (I)의 폴리펩타이드 및 2 중량%의 일반식 (III)의 폴리펩타이드를 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, RDS와 같은 질환의 치료를 위한 본 발명의 재구성된 계면활성제의 유효 도즈는, 질환의 유형, 투여 수단, 환자의 무게 및 생리학적 상태, 및 상기 치료가 예방을 위한 것인지 또는 치료법인지를 포함하는 많은 다른 인자에 따라 다양하다.

일반적으로, 상기 도즈는 체중의 kg 당 0.01 mg 내지 10 g, 바람직하게는 체중의 kg 당 0.1 내지 1 g에 포함되고, 투여 빈도는 상기 치료가 예방을 위한 것인지 또는 치료법인지에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로 약 50 mg/kg, 100 mg/kg, 또는 200 mg/kg의 도즈가 일 도즈로 투여된다. 신생아에의 사용을 위해서, 1회 또는 2회 투여가 일반적으로 충분하다.

비록 요구(needs)는 호흡기 질환의 중증도(severity) 및/또는 다른 변수에 따라 다양할 수 있지만, 유효 복용량을 위한 최적 범위의 결정은 당해 기술분야의 통상의 기술자의 지식 범위 내이다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기 재구성된 계면활성제를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.

상기 제제는 유리하게는 용액, 분산액(dispersion), 현탁액(suspension) 또는 건조 분말의 형태로 투여된다. 바람직하게는 상기 조성물은, 적절한 생리학적으로 허용가능한 용매 또는 재현탁(re-suspension) 담체, 예를 들면 물 또는 생리학적 식염수 수용액(0.9% w/v NaCl) 내에 용해되거나 현탁된 상기 재구성된 계면활성제를 포함한다.

본 발명의 상기 제제는, 바람직하게는 수용액 내 현탁액의 형태, 보다 바람직하게는 멸균(sterile) 상태이고, 이들은 선택적으로 pH 완충제, 희석제 및 기타 적절한 첨가제를 포함할 수 있다.

유리하게는, 상기 제제의 점도는, 당해 기술분야에 알려진 방법에 따라 시판 중인 보통의 점도계로 측정시, 20 센티포아즈(cP) 미만, 바람직하게는 15 cP 미만이다.

상기 제제는 단위(unit) 도즈 또는 다중(multi) 도즈 용기, 예를 들면 봉인된 앰풀(ampoule) 및 바이알 내에 존재할 수 있고, 또는 사용 전 즉시 멸균 액체 담체의 첨가만을 요구하는, 냉동된 또는 냉동 건조된(동결 건조된(lyophilized)) 조건으로 저장될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 상기 재구성된 계면활성제는 1회용 유리 바이알 내 완충된 생리학적 식염수 수용액 내 멸균 현탁액으로서 공급된다.

상기 약제학적 제제는 제약 산업에서 잘 알려진 통상의 기술에 따라 제조될 수 있다. 상기 기술은, 유기 용매 존재 하에 상기 폴리펩타이드를 상기 인지질과 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 용매는 이어서 투석 또는 질소 및/또는 진공에의 노출 하에 증발에 의해 제거되거나 또는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기타 적절한 기술, 예를 들면 동결 건조 및 분무 건조에 의해 제거된다.

수득된 분말은 이어서 액체 담체 또는 미세하게 나누어진(divided) 고체 담체 또는 둘 모두와 함께 균일하게 혼합된다.

폴리펩타이드 및 인지질의 상기 혼합물은, 예를 들면 멸균 여과(sterile filtration)에 의해 용매 제거 전에 멸균화될 수 있다. 특정의 기타 구현예에서, 상기 재구성된 계면활성제 조성물은 당해 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 최종적으로 멸균화된다.

본 발명의 재구성된 계면활성제의 투여는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법, 예를 들면 기관내 점적 투여(인퓨전(infusion) 또는 볼루스(bolus) 또는 카테터를 통해), 분무 투여 또는 분무화(nebulisation)에 의해 수행된다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에서 추가로 기재한 바와 같은 특정 용도에 따라, 농축된 계면활성제 제제 및 희석된 계면활성제 제제 양쪽 모두의 사용을 고려한다. 농축된 계면활성제 조성물은 전형적으로 "볼루스" 형태 투여를 위해 사용되는 반면, 희석된 계면활성제 조성물은 전형적으로 "세척(lavage)"형태 투여를 위해 사용된다.

유리하게는, "볼루스" 형태 투여를 위해, (액체 담체의 첨가 후) 용액 또는 현탁액의 ml 당 중량에 관한 상기 재구성된 계면활성제 농도는, 5 내지 100 mg/ml의 범위, 바람직하게는 20 내지 80 mg/ml이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 재구성된 계면활성제가 생리학적 식염수(0.9% w/v 물 내 염화 나트륨) 내 현탁액으로서 기관내 점적 투여(instillation)에 의해 투여될 때, 상기 농도는 약 80 mg/ml이다.

세척 투여를 위해 사용될 때, 전형적인 계면활성제 농도는 (용액 또는 현탁액의 ml 당 mg 계면활성제에 관해) 약 0.1 내지 20 mg/ml이고, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 10 mg/ml이다.

농도에 의존하기 대문에, 희석된 제제의 점도는 훨씬 낮을 것이다.

약제학적 치료로서 사용될 때, 본 발명의 재구성된 계면활성제를 포함하는 제제는 단독으로 또는 선택적으로 호흡기 질환 또는 장애의 치료에 사용되는 다른 화합물 또는 조성물과 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 만일 환자가 박테리아 감염에 의한 호흡기 장애를 위해 치료받고 있다면, 본 발명의 상기 재구성된 계면활성제는 박테리아 감염을 치료하기 위해 사용되는 다른 화합물, 예를 들면 항생제와 함께 투여될 수 있다.

이와는 달리, 특정한 경우에, 예를 들면 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia)와 같은 합병증(complication)을 예방하기 위해, 본 발명의 상기 재구성된 계면활성제는 부데소니드 및 베클로메타손 디프로피오네이트와 같은 코르티코스테로이드와 함께 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 상기 재구성된 계면활성제, 및 상기 재현탁 담체는 적절한 용기 수단 내에 동시에 별도로 포장될 수 있다. 적절한 용기 수단 내 성분들의 상기 별도 포장(packaging)은 키트(kit)로서 또한 기재된다.

따라서, 본 발명은 또한, a) 제 1 단위(unit) 제형(dosage form)으로 분말 형태의 본 발명의 재구성된 계면활성제; b) 제 2 단위 제형으로 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 c) 상기 제 1 및 제 2 제형을 함유하기 위한 용기 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 생리학적 식염수 수용액이고, 보다 바람직하게는 멸균이다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 상기 재구성된 계면활성제 및 이들의 제제를 투여하기 위한 다양한 방법이 이용가능하고, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 잘 알려져 있다.

질환의 유형, 예를 들면 호흡 곤란 증후군을 가진 유아(infant) 또는 성인에 따라, 다른 치료 방법이 적절할 수 있다.

전형적으로, 상기 계면활성제는 연속 또는 간헐적 양압 환기(intermittent positive pressure ventilation, IPPV)하에 유지된 환자(예를 들면, 미숙아)에게 기관내 점적 투여에 의해 투여된다.

대안적으로, 상기 계면활성제는 기관(trachea)에 놓인 얇은 카테터의 사용에 의해 투여될 수 있고, 상기 환자의 호흡은, 비강 지속적 양압 환기(nasal Continuous Positive Airway Pressure, nCPAP)로서 알려진 방법에 따라 특별히 디자인된 비강 장치, 예를 들면, 마스크, 프롱(prong) 또는 튜브와 함께 지원된다.

높은 점도는 얇은 카테터를 통한 계면활성제의 통과를 보다 어렵게 만들기 때문에, 후자의 접근법은 오직 낮은 점도를 가지는 계면활성제와 함께 가능할 것이다.

환자가 폐 염증, 폐 감염 또는 폐 좌상(pulmonary contusion)과 관련된 호흡 곤란 상태로부터 고통 받는 경우, 특정 치료법(treatment modalities)이 추천될 수 있다. 하나의 상기 치료 방법에서, 본 발명의 계면활성제 조성물과 함께 환자의 폐의 세척이 단일(single) 또는 다중 치료로서 수행된다.

본 발명의 상기 재구성된 계면활성제는 호흡기 질환과 관련된 증상 또는 상태의 발달을 예방, 지연, 경감(alleviate), 저지(arrest) 또는 억제를 위해 적합하다.

특히, 미숙아에서의 호흡 곤란 증후군(RDS) 또는 급성 폐 손상(ALI), 성인의 RDS(ARDS), 태변 흡입 증후군(MAS) 및 기관지폐이형성증(BPD)를 포함하는 계면활성제 결핍 또는 기능 장애와 관련된 기타 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 유용하다.

또한, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 천식, 호흡기 감염(예를 들면 폐렴, 폐포자충(pneumocystis carinii), 낭포성 섬유증 및 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus))의 예방 및/또는 치료 뿐만 아니라, 장액성중이염(serous otitis media)(중이염(glue car))의 치료를 위해 유용할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

실시예

실시예 1 - 재구성된 계면활성제의 제조

물질

인지질 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤(POPG), 99% 초과의 순도를 가지는 난황으로부터 유도된 L-α-포스파티딜콜린(이후 본 명세서에서, 순수 난황-PC) 및 약 40%의 순도를 가지는 난황으로부터 유도된 L-α-포스파티딜콜린(이후 본 명세서에서 정제되지 않은 난황-PC)이 구입되었다. 토끼 간으로부터 유도된 포스파티딜콜린 분획(이후 본 명세서에서, 간-PC)이 Curstedt T. Analysis of molecular species of ether analogues of phosphatidylcholines from biological samples. Biochim Biophys Acta 1977;489:79-88에 보고된 바와 같이, Lipidex-5000 상에서 크로마토그래피에 의해 단리되었다.

폴리펩타이드 SP-C33(Leu) 및 ox-Mini-B(Leu)가 WO 2008/044109에 개시된 바와 같이 제조되었고, 반면에 폴리펩타이드 ox Mini-B27은 WO 2009/018908에 개시된 바와 같이 제조되었다.

재구성된 계면활성제의 제조

클로로포름/메탄올 98:2(v/v) 내에 용해된, 인지질은 DPPC:POPG:난황-PC(간-PC) 50:10:40의 중량비로 혼합되었다.

대응하는 재구성된 계면활성제의 조제물(계면활성제 A 및 B)은 각 폴리펩타이드를 2 중량%의 양으로 첨가함에 의해 제조되었다. 수득된 계면활성제는 질소 하에 증발되고, 0.9% w/w NaCl 수용액 내에 80 mg/ml의 농도로 재현탁되었다.

실시예 2 - 2% ox Mini -B( Leu ) + 2% SP - C33 ( Leu ) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 간- PL 로 만들어진 재구성된 계면활성제로 인비보 ( in vivo ) 실험

미성숙 신생 토끼(임신연령(gestational age) 27일)가 태어났을 때, 200 mg/kg의 재구성된 계면활성제 조제물(80 mg/ml)로 처리되었다. 동일 도즈의 포락탄트 알파(큐로서프^TM)를 받은 동물은 양성으로 제공되고, 비처리된 한배 새끼(littermate)는 음성 대조군으로서 제공되었다. 상기 신생 토끼들은 표준화된 시퀀스의 피크 흡입(insufflation) 압력으로 동시에 환기되었다. 폐를 열기 위해, 압력을 우선 1분 동안 35 cmH₂O로 설정하였다. 상기 폐포모집술(recruitment manoeuvre) 이후, 압력은 15분 동안 25 cmH₂O로, 추가로 20 및 15 cmH₂O로 낮아졌다. 최종적으로, 압력은 다시 5분 동안 25 cmH₂O까지 상승하고, 이후 폐는 추가의 5분 동안 질소와 함께 환기되고, 이어서 가스 용적 측정을 위해 절개되었다. 상기 실험들은 PEEP 없이 수행되었다. 일회 호흡량 및 폐 가스 용적 모두 중앙값(median value)으로서 주어진다.

상기 폐들은 4% 중성 포르말린 내에 액침(immersion)하여 고정되고, 탈수되며, 파라핀 내에 포매된다(embedded). 횡단면은 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에옥신(eoxin)으로 염색되었다. 폐포 용적 밀도는, 참고 용적으로서 총 실질(parenchyma)을 사용하는 컴퓨터 지원 이미지 분석기로 측정되었다.

상기 결과는, 합성 인지질로서 간-PL 및 DPPC 및 POPG에 기초한 인지질 혼합물, 각각 2%의 SP-C33Leu 및 ox Mini-B(Leu)를 포함하는 재구성된 계면활성제는 큐로서프^TM과 유사한 일회 호흡량(도 1) 및 폐 가스 용적(도 2)을 얻는 것을 나타낸다. 또한, 표 3으로부터, 상기 재구성된 계면활성제는 오직 인지질 혼합물만인 것보다 현저히 높고 큐로서프^TM과 유사한 폐포 용적 밀도를 얻는 것으로 이해될 수 있다.

표 3: 조산 토끼에서 폐포 용적 밀도(%)

실시예 3 - 2% ox Mini -B( Leu ) + 2% SP - C33 ( Leu ) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 정제되지 않은 난황 - PC 로 만들어진 재구성된 계면활성제로 인비보 실험

상기 실험은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다.

일회 호흡량 및 폐 가스 용적 모두는 중앙값으로서 도 3 및 도 4에 보고된다.

상기 결과는 또한 50% DPPC, 40% 난황-PC 및 10% POPG를 함유하는 인지질 혼합물을 포함하는 재구성된 계면활성제는 큐로서프^TM과 유사한 일회 호흡량 및 폐 가스 용적을 가지는 것을 나타낸다.

실시예 4 - 2% ox Mini -B( Leu ) + 2% SP - C33 ( Leu ) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황 - PC 로 만들어진 재구성된 계면활성제로 인비보 실험

상기 실험은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다.

일회 호흡량 및 폐 가스 용적 모두는 중앙값으로서 도 5 및 도 6에 보고된다.

상기 결과는, 비록 순수 난황-PC가 사용되었음에도 불구하고, 대응하는 재구성된 계면활성제는 큐로서프^TM과 유사한 폐 가스 용적을 가지지만, 현저하지는 않으나 다소 작은 일회 호흡량을 가지는 것을 나타낸다.

실시예 5 - 2% ox Mini -B27 + 2% SP - C33 ( Leu ) + 50% DPPC + 10% POPG + 40% 순수 난황 - PC 로 만들어진 재구성된 계면활성제로 인비보 실험

상기 실험은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다. 그러나, SP-B 유사체로서, ox Mini-B(Leu) 대신 ox Mini-B27로서 인용된 폴리펩타이드가 사용되었다.

이것은 ox Mini-B(Leu)의 보다 짧은 유사체이지만, 상기 폴리펩타이드는 DPPC:POPG 7:3(w/w)로 이루어지는 인지질 혼합물과 혼합될 때 점성의 조제물을 생성한다.

수득된 일회 호흡량 및 폐 가스 용적 모두는 중앙값으로서 도 7 및 도 8에 보고된다.

상기 재구성된 계면활성제는 큐로서프^TM보다 다소 작은 일회 호흡량을 얻지만, 폐 가스 용적은 유사하였다. 또한 80 mg/ml의 수용성 현탁액 형태의 대응하는 제제는 낮은 점도를 가졌다.

실시예 6 - 일정한 일회 호흡량으로 인비보 실험

미성숙 신생 토끼(임신연령 27일)가 태어났을 때, 200 mg/kg의 다른 계면활성제 조제물(80 mg/ml)로 처리되었다. 동일 도즈의 큐로서프^TM를 받은 동물은 양성으로 제공되고, 비처리된 한배 새끼는 음성 대조군으로서 제공되었다. 상기 신생 토끼들은 표준화된 일회 호흡량을 얻기 위해 개개의 압력으로 동시에 환기되었다. 6 ml/kg의 일정한 일회 호흡량이 사용되었다.

폐를 열기 위해, 압력을 우선 1분 동안 35 cmH₂O로 설정하였다. 상기 폐포모집술 이후, 30분 동안 일회 호흡량을 6-8 ml/kg 사이로 유지하기 위해 압력을 낮췄다. 상기 실험들은 PEEP 없이 수행되었다.

다음의 샘플이 평가되었다:

1. DPPC 50% + 난황PC 40% + POPG 10% + SP-C33Leu 2% + Mini-B27 2%

2. DPPC 50% + 난황PC 40% + POPG 10% + SP-C33Leu 2% + Mini-BLeu 2%

3. 큐로서프^TM

4. 비처리된 대조군

일회 호흡량 및 폐 가스 용적 모두는 중앙값으로서 도 9 및 도 10에 보고된다.

Mini-B27 또는 Mini-BLeu를 함유하는 재구성된 계면활성제 조제물은 동물들이 PEEP 없이 생리학적 일회 호흡량(약 6 ml/kg)으로 환기될 때, 실험에서 큐로서프^TM로 처리된 동물과 유사한 폐 가스 용적을 가지는 것으로 나타난다.

SEQUENCE LISTING <110> Chiesi Farmaceutici spa <120> RECONSTITUTED PULMONARY SURFACTANTS <130> 1521PCT <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Met Gly 20 25 30 Leu <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 2 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Ile Gly 20 25 30 Leu <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 3 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Leu Gly 20 25 30 Leu <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is norLeu <400> 4 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Xaa Gly 20 25 30 Leu <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 5 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 6 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Leu 20 25 30 <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 7 Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 8 Cys Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 9 Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Leu Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Leu Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 10 Cys Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Leu Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Leu Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 11 Phe Pro Cys Pro Leu Pro Tyr Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys 1 5 10 15 Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu 20 25 30 Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser 35 40 <210> 12 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTEHTIC PEPTIDE <400> 12 Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys 1 5 10 15 Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu 20 25 30 Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser 35 40 <210> 13 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 13 Phe Pro Cys Pro Leu Pro Tyr Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys 1 5 10 15 Arg Ile Gln Ala Leu Ile Pro Lys Gly Gly Arg Leu Leu Pro Gln Leu 20 25 30 Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser 35 40 <210> 14 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 14 Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys 1 5 10 15 Arg Ile Gln Ala Leu Ile Pro Lys Gly Gly Arg Leu Leu Pro Gln Leu 20 25 30 Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys Ser 35 40 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 15 Cys Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys 20 25 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 16 Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys 20 25 <210> 17 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 17 Ala Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Ala Ala 20 25 <210> 18 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC PEPTIDE <400> 18 Gly Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Gly Gly 20 25

Claims

인지질 혼합물;
천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩타이드 유사체; 및
일반식:

(여기서:
Ω는 M 또는 황 원자 상에서 산화된 M, I, L 및 nL(노르류신)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
p는 0 또는 1이다)
에 의해 나타내어지는 천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩타이드 유사체를 포함하는 재구성된 계면활성제이고,
상기 인지질 혼합물은
i) 50 중량%의 양의 DPPC;
ii) 10 중량%의 양의 POPG; 및
iii) 30 내지 50% POPC, 10 내지 20% PLPC, 4 내지 10% P(:1)OPC, 5 내지 8% SLPC, 5 내지 8% DOPC, 1 내지 3% SAPC, 5 내지 15% SOPC, 1 내지 2% PAPC, 1 내지 3% PDPC, 0 내지 3.5% SOPE, 0 내지 8% SAPE, 0 내지 4% SLPE, 0 내지 2.5% PLPE, 0 내지 3.5% POPE, 0 내지 2.0% LAPE, 0 내지 2.% LLPE, 0 내지 10% PSM으로 필수적으로 이루어지는 40 중량%의 양의 불포화 인지질의 천연 유도된 분획;
으로 이루어지며,
i), ii) 및 iii)의 양은 모두 인지질 혼합물의 총 중량에 대해 계산된 재구성된 계면활성제.
제1항에 있어서,
상기 천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩타이드 유사체는 식

에 의해 나타내어지는 서열로 이루어지는 재구성된 계면활성제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩타이드 유사체는 일반식 (II)에 의해 나타내어지는 재구성된 계면활성제

(여기서:
θ는 L, I 및 C로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 C이며;
△는 W, I 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 W이며;
Ω는 M, I, L 및 nL로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 L이며;
Φ는 R 및 T로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 R이며;
f는 0 또는 1의 값을 가지는 정수이다.).
제3항에 있어서,
f는 0인 일반식 (II)의 폴리펩타이드 유사체는 식들

에 의해 나타내어지는 서열의 군으로부터 선택되는 재구성된 계면활성제.
제3항에 있어서,
f는 1인 일반식 (II)의 폴리펩타이드는 식들

에 의해 나타내어지는 서열의 군으로부터 선택되는 재구성된 계면활성제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩타이드 유사체는 일반식 (III)에 의해 나타내어지는 재구성된 계면활성제

(여기서
X는 C, A 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 C이며;
△는 W, L, nL 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 W 또는 L이며;
Φ는 C, A 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 C이며;
Σ는 S, G 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
q는 0 또는 1이다.).
제6항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 식들

에 의해 나타내어지는 서열의 군으로부터 선택되는 재구성된 계면활성제.
제1항 내지 제7항 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 불포화 인지질의 천연 유도된 분획은 난황으로부터 유도된 L-α-포스파티딜콜린인 재구성된 계면활성제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재구성된 계면활성제를 포함하는 약제학적 제제이고, 상기 제제는 용액, 분산액, 현탁액 또는 건조 분말의 형태이며, 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되는 약제학적 제제.
제9항에 있어서,
상기 제제는 수용성 현탁액 형태인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 재구성된 계면활성제는 5 내지 100 mg/ml에 포함되는 농도의 상기 수용성 현탁액인 약제학적 제제.
a) 제 1 단위 제형으로 분말 형태의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재구성된 계면활성제;
b) 제 2 단위 제형으로 약제학적으로 허용가능한 담체; 및
c) 상기 제 1 및 제 2 제형을 함유하기 위한 용기 수단을 포함하는 키트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로서의 용도를 위한 재구성된 계면활성제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
미숙아에서의 호흡 곤란 증후군(RDS)의 예방 및 치료 또는 계면활성제 결핍 또는 기능 장애와 관련된 기타 질환의 예방 또는 치료 용도를 위한 재구성된 계면활성제.
제14항에 있어서,
상기 질환은, 성인의 RDS(ARDS), 태변 흡입 증후군(MAS) 및 기관지폐이형성증(BPD)을 포함하는 재구성된 계면활성제.