BR112015009486B1

BR112015009486B1 - Surfactante reconstituído, formulação farmacêutica, kit e uso de surfactante reconstituído

Info

Publication number: BR112015009486B1
Application number: BR112015009486-4A
Authority: BR
Inventors: Jan Johansson; Tore Cursted
Original assignee: Chiesi Farmaceutici S.P.A
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2022-06-14
Also published as: ES2644317T3; US9074018B2; CN104812771A; BR112015009486A2; KR20150089006A; HK1211964A1; AR093569A1; US20140142021A1; KR102122088B1; EP2922868A1; CA2891933A1; EP2922868B1; WO2014079898A1; CA2891933C; CN104812771B; RU2656185C2; RU2015118702A

Abstract

surfactante reconstituído, formulação farmacêutica, kit e uso de surfactante reconstituído. a presente invenção é direcionada a um surfactante reconstituído que compreende uma mistura de fosfolipídios e uma combinação de análogos específicos da proteína surfactante nativa sp-c com análogos da proteína surfactante nativa sp-b. a invenção é também direcionada a composições farmacêuticas e kits destas e a seu uso para o tratamento ou a profilaxia de síndrome da angústia respiratória (rds) e de outros transtornos respiratórios.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]. A presente invenção refere-se a surfactantes pulmonares sintéticos para o tratamento ou a profilaxia de síndrome da angústia respiratória (RDS) em lactentes prematuros e de outros transtornos respiratórios.

[002]. Especificamente, a invenção refere-se a um surfactante reconstituído que compreende uma combinação de análogos específicos da proteína surfactante nativa SP-C com análogos da proteína surfactante nativa SP-B e uma mistura de fosfolipídios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003]. O pulmão humano é composto por um grande número de pequenas bolsas de ar, chamadas alvéolos, nas quais ocorre a troca de gases entre o sangue e os espaços aéreos dos pulmões. Em indivíduos sadios, essa troca é mediada pela presença de um complexo surfactante contendo uma proteína que impede o colapso dos pulmões no final da expiração.

[004]. O complexo surfactante pulmonar é constituído primariamente por lipídio e contém quantidades mínimas de várias proteínas. A ausência de níveis adequados desse complexo resulta em mau funcionamento do pulmão. Essa síndrome é chamada de Síndrome da Angústia Respiratória (RDS) e afeta comumente os lactentes pré-termo.

[005]. A referida síndrome é tratada eficientemente com preparados de surfactantes naturais modificados, extraídos de pulmões de animais.

[006]. Preparados de surfactantes modificados disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, poractant alfa (Curosurf™), derivado de pulmão suíno, calfactant (Infasurf™), extraído do lavado de pulmões de neonatos bovinos, e beractant (Survanta™), um surfactante pulmonar bovino natural modificado quimicamente.

[007], Os principais constituintes desses preparados contendo surfactantes são fosfolipídios, como 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), (PG) e as proteínas surtactantes hidrofóbicas B e C (SP-B e SP-C).

[008]. As desvantagens decorrentes do preparado de surfactantes a partir de tecidos animais, tais como os processos complicados de produção e de esterilização e a possível indução de reações imunes, fizeram com que fossem desenvolvidos surfactantes sintéticos buscando imitar a composição dos surfactantes naturais modificados.

[009]. No entanto, de acordo com a literatura disponível, nenhum dos surfactantes sintéticos desenvolvidos até o momento demonstrou a mesma eficácia que aquela dos surfactantes extraídos de animais.

[0010]. Uma possível explicação é que os surfactantes reconstituídos disponíveis, desenvolvidos até o momento, não reproduzem o perfil proteico completo dos surfactantes naturais modificados, pois os primeiros compreendem apenas um componente proteico (peptídico).

[0011]. Por esses motivos, surfactantes reconstituídos compreendendo ambos os análogos das proteínas surfactantes nativas SP-B e SP-C foram propostos na técnica, por exemplo, em WO 2008/044109, WO 2008/011559 e WO 2010/139442.

[0012]. Apesar disso, ainda persiste o ceticismo a respeito da possibilidade de que surfactantes reconstituídos pudessem alcançar a mesma eficácia em termos de complacência pulmonar que aquela dos surfactantes extraídos de animais, especialmente em termos de volumes gasosos pulmonares e grau de permeabilidade alveolar no final da expiração.

[0013]. A esse respeito, o Requerente descobriu que, além do perfil proteico, a composição de fosfolipídios é também muito importante para estabilizar os alvéolos no final da expiração.

[0014]. Especificamente, o Requerente descobriu que surfactantes reconstituídos compreendendo análogos das proteínas B e C, revelados em WO 2008/044109, e α fração fosfolipídica extraída do poractant alfa, que é rica em fosfolipídios insaturados, fornece resultados capazes de se sobrepor àqueles do poractant alfa no que diz respeito a volumes correntes e volumes gasosos pulmonares.

[0015]. Assim, seria altamente vantajoso prover surfactantes reconstituídos compreendendo misturas de fosfolipídios capazes de ajudar a melhorar as propriedades em termos de complacência pulmonar.

[0016]. Em WO 2004/105726, revelou-se o uso de uma mistura de lipídios compreendendo fosfolipídios poli-insaturados com o objetivo de reduzir a viscosidade de surfactantes sintéticos.

[0017]. Foi descoberto agora, sendo este o objeto da presente invenção, que uma fração derivada naturalmente e rica em fosfolipídios poli-insaturados pode ser vantajosamente combinada com análogos específicos da proteína nativa SP-C e com análogos específicos da proteína nativa SP-B a fim de prover preparados de surfactantes reconstituídos com propriedades, em termos de volumes correntes e volumes gasosos pulmonares, que não são inferiores àquelas de surfactantes naturais modificados tais como o poractant alfa.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0018]. A presente invenção é direcionada a um surfactante reconstituído compreendendo um veículo lipídico e uma combinação de um análogo polipeptídico específico da proteína surfactante nativa SP-C com um análogo polipeptídico específico da proteína surfactante nativa SP-B.

[0019]. Especificamente, a invenção é direcionada a um surfactante reconstituído que compreende: • uma mistura de fosfolipídios; • um análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-B; e • um análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-C representado pela fórmula geral: • IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLQpGpLp (I) nα quαl: • Q é um aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por M ou M oxidada no átomo de enxofre, I, L e nL; • p é 0 ou 1; • a referida mistura de fosfolipídios consistindo em: • uma quantidade de 50% em peso de DPPC; • uma quantidade de 10% em peso de POPG; e • uma quantidade de 40% em peso de uma fração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados e consistindo essencialmente em: • de 30 a 50% de POPC, de 10 a 20% de PLPC, de 4 a 10% de P(: 1 )OPC, de 5 a 8% de SLPC, de 5 a 8% de DOPC, de 1 a 3% de SAPC, de 5 a 15% de SOPC, de 1 a 2% de PAPC, de 1 a 3% de PDPC, de 0 a 3,5% de SOPE, de 0 a 8% de SAPE, de 0 a 4% de SLPE, de 0 a 2,5% de PLPE, de 0 a 3,5% de POPE; de 0 a 2,0% de LAPE, de 0 a 2,0% de LLPE, de 0 a 10% de PSM; • sendo todas as quantidades em i), ii) e iii) calculadas sobre o peso total da mistura de fosfolipídios.

[0020]. A presente invenção também provê composições farmacêuticas compreendendo o surfactante reconstituído reivindicado, isoladamente ou em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0021]. A presente invenção também provê o uso do surfactante reconstituído reivindicado como medicamento.

[0022]. Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso do surfactante reconstituído reivindicado para a profilaxia e/ou o tratamento de síndrome da angústia respiratória (RDS) e de outros transtornos respiratórios.

[0023]. Além do mais, a invenção provê o uso do surfactante reconstituído reivindicado na produção de um medicamento para a profilaxia e/ou o tratamento de síndrome da angústia respiratória (RDS) e de outros transtornos respiratórios.

[0024]. A invenção também provê um método para a profilaxia e/ou o tratamento de síndrome da angústia respiratória (RDS) e de outros transtornos respiratórios, o referido método compreendendo administrar a um paciente com necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz do surfacfante reconstituído citado acima.

[0025]. A invenção é também direcionada a um kit, compreendendo: a) o surfacfante reconstituído da invenção em forma de pó em uma primeira forma farmacêutica unitária; b) um veículo farmaceuticamente aceitável em uma segunda forma farmacêutica unitária; e c) recipientes como meio para conter as referidas primeira e segunda formas farmacêuticas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026]. A Figura 1 mostra os resultados em termos de volumes correntes (ml/kg), em função do tempo/pressão, de um surfacfante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC de fígado 40% versus Curosurf™ e controles.

[0027]. A Figura 2 mostra os resultados em termos de volumes gasosos pulmonares (ml/kg) de um surfacfante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC de fígado 40% versus Curosurf™ e controles.

[0028]. A Figura 3 mostra os resultados em termos de volumes correntes (ml/kg), em função do tempo/pressão de um surfacfante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC não purificada de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

[0029]. A Figura 4 mostra os resultados em termos de volumes gasosos pulmonares (ml/kg) de um surfacfante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC não purificada de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

[0030]. A Figura 5 mostra os resultados em termos de volumes correntes (ml/kg), em função do tempo/pressão, de um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

[0031]. A Figura 6 mostra os resultados em termos de volumes gasosos pulmonares (ml/kg) de um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

[0032]. A Figura 7 mostra os resultados em termos de volumes correntes (ml/kg), em função do tempo/pressão, de um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B27 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

[0033]. A Figura 8 mostra os resultados em termos de volumes gasosos pulmonares (ml/kg) de um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B27 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

[0034]. A Figura 9 mostra os resultados em termos de volumes correntes (ml/kg), no experimento realizado em volume corrente constante, de surfactantes reconstituídos preparados com ox Mini-B(Leu) 2% ou ox Mini- B27 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

[0035]. A Figura 10 mostra os resultados em termos de volumes gasosos pulmonares (ml/kg), no experimento realizado em volume corrente constante, de surfactantes reconstituídos preparados com ox Mini-B(Leu) ou ox Mini-B27 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40% versus Curosurf™ e controles.

DEFINIÇÕES

[0036]. No presente pedido de patente, o termo “surfactante reconstituído” significa um veículo lipídico ao qual foram adicionados análogos polipeptídicos das proteínas surfactantes, criado por qualquer meio incluindo tecnologia recombinante ou métodos sintéticos.

[0037]. O termo “análogos polipeptídicos da proteína surfactante nativa SP-C”, inclui polipeptídeos com uma sequência de aminoácidos na qual, quando comparada às proteínas nativas, um ou mais aminoácidos estão ausentes ou foram substituídos por outros aminoácidos, desde que os polipeptídeos exibam, em uma mistura com um veículo lipídico, tal como, por exemplo, uma mistura de fosfolipídios, atividade como surfactante pulmonar.

[0038]. O termo “análogos polipeptídicos da proteína surfactante nativa SP-B", inclui peptídeos com uma sequência de aminoácidos na qual, quando comparada às proteínas nativas, um ou mais aminoácidos estão ausentes ou foram substituídos por outros aminoácidos, desde que os polipeptídeos exibam, em uma mistura com um veículo lipídico, tal como, por exemplo, uma mistura de fosfolipídios, atividade como surfactante pulmonar.

[0039]. O termo “mini-B" significa um polipeptídeo de 34 resíduos com base nos resíduos 8-25 no N-terminal e resíduos 63-78 no C-terminal da proteína nativa SP-B cuja estrutura foi revelada genericamente pela primeira vez em uma apresentação extraída do site na Internet do California NanoSystems Institute. Sua sequência completa foi subsequentemente revelada no banco de dados RCSB Protein Data Bank.

[0040]. Em Waring AJ et a/. J Peptide Res 2005, 66, 364-374, foram relatadas mais informações acerca de sua estrutura e atividade.

[0041]. O termo “variante” significa análogos polipeptídicos do peptídeo Mini-B com uma sequência de aminoácidos na qual um ou mais aminoácidos foram substituídos por outros aminoácidos, desde que os peptídeos, em uma mistura com um veículo lipídico, retenham a atividade de Mini-B.

[0042]. Todos os resíduos de aminoácidos identificados neste relatório descritivo estão na configuração L natural, e as sequências aqui identificadas são relatadas de acordo com as abreviações padrão para resíduos de aminoácidos conforme mostradas na Tabela 1 a seguir.TABELA 1 DE AMINOÁCIDOS

[0043]. No texto deste relatório descritivo, o termo “fosfolipídio" refere-se a uma classe de lipídios constituídos por glicerol, um grupo fosfato, uma porção neutral ou zwitteriônica como a parte caracterizadora; uma exceção a essa regra é a esfingomielina, que é derivada da esfingosina em vez do glicerol. A porção glicerol ou o resíduo esfingosina pode ser esterificado com ácidos graxos de cadeia longa (C14-C22), os quais, por sua vez, podem ser saturados (por exemplo, ácido mirístico, palmítico e esteárico), monoinsaturado (por exemplo, ácido oleico) ou poli-insaturado (por exemplo, ácido linoleico e araquidônico).

[0044]. As classes e espécies de fosfolipídios citados no presente pedido de patente estão listadas na Tabela 2 a seguir, juntamente com as abreviações usadas.TABELA 2 DE FOSFOLIPÍDIOS • fosfolipídios : PLs; • fosfatidilcolina : PC; • fosfatidiletanolamina : PE; • fosfatidilglicerol : PG; • fosfatidilinositol : PI; • fosfatidilserina : PS; • esfingomielina : SM; • 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como dipalmitoil-fosfatidilcolina : DPPC; • l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina : POPC; • l-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como palmitoil-linoleoil-fosfatidilcolina : PLPC; • l-palmitoleoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como palmitoleoil-oleoil-fosfatidilcolina : P(:1)OPC • l-estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como estearoil-oleoil-fosfatidilcolina : SOPC; • l-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como estearoil-linoleoil-fosfatidilcolina : SLPC; • l-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como estearoil-araquidonoil-fosfocolina : SAPC; 1 -palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como palmitoil-araquidonoil-fosfocolina : PAPC; • 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, geralmente conhecido como dioleoilfosfatidilcolina : DOPC; • 1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina geralmente conhecido como palmitoil-docosahexaenoil-fosfatidilcolina : PDPC; • 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como dipalmitoil-fosfatidiletanolamina : DPPE; • 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como palmitoil-linoleoil fosfatidiletanolamina : PLPE; • l-estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como estearoil-oleoil fosfatidiletanolamina : SOPE; • 1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como estearoil-linoleoil fosfatidiletanolamina : SLPE; • 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como estearoil-araquidonoil-fosfatidiletanolamina : SAPE; • 1-linoleoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como linoleoil-araquidonoil-fosfatidiletanolamina : LAPE; • 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como dilinoleoil-fosfatidiletanolamina : DLPE; • l,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, geralmente conhecido como dioleoil-fosfatidiletanolamina : DOPE; • l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, geralmente conhecido como palmitoil-oleoil-fosfatidilglicerol ; POPG; • l,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, geralmente conhecido como dioleoil-fosfatidilglicerol : DOPG; • 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina, geralmente conhecido como dipalmitoil-fosfatidilserina : DPPS; • l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, geralmente conhecido como dipαlmitoil-fosfαtidilglicerol : DPPG; • N-pαlmitoil-D-esfingosilfosforilcolinα : PSM

[0045]. A expressão “consistindo essencialmente em" significa que a fração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados pode compreender componentes adicionais, cada um destes em quantidade muito baixa (inferior a 0,1% p/p) e que não afeta substancialmente a atividade e as propriedades da referida fração.

[0046]. “Atividade como surfacfante” de um preparado de surfacfante é definida como a capacidade para reduzir a tensão superficial.

[0047]. A eficácia in vitro de preparados de surfactantes exógenos é comumente testada aferindo a sua capacidade de reduzir a tensão superficial utilizando um aparelho adequado como a Balança de Wilhelmy e o Surfactômetro de Bolha Cativa.

[0048]. A eficácia in vivo de preparados de surfactantes exógenos é comumente testada aferindo os parâmetros seguintes: i.o volume corrente que é um índice da complacência pulmonar; ii.o volume gasoso pulmonar que é um índice da expansão aérea ou permeabilidade alveolar no final da expiração e, consequentemente, da capacidade de formar uma película fosfolipidíca estável nos alvéolos ao final da expiração; iii.a densidade de volume alveolar é a porcentagem de total volume dos alvéolos no pulmão. A porcentagem é calculada considerando o volume total dos alvéolos, dividido pelo volume total do pulmão (alvéolos + tecido, excluindo, por exemplo, bronquíolos, vasos) de acordo com o método revelado no parágrafo 2.2.2 de Berggren P et al. Respiration Physiology, 1999, 115, 45-33. O valor é semelhante ao volume gasoso pulmonar que é medido para o pulmão inteiro, enquanto a densidade de volume alveolar é medida de cortes histológicos.

[0049]. “Quantidade terapeuticamente eficaz”, neste relatório descritivo, refere-se α umα quantidade de surfactante reconstituído capaz de prevenir, evitar, reduzir ou eliminar a doença ou transtornos respiratórios associados com a falta ou disfunção de surfactante endógeno.

[0050]. “Recombinante” quando empregado com referência a, por exemplo, uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vetor indica que a célula, o ácido nucleico, a proteína ou o vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou pela alteração de um ácido nucleico ou de uma proteína nativa.

[0051]. Neste relatório descritivo, o termo “aproximadamente" aplicado a um valor pontual, indica uma variabilidade de ±5%.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0052]. A presente invenção é direcionada a um surfactante reconstituído compreendendo um análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-C da Fórmula (I), um análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-B da Fórmula (II) ou (III) e uma mistura de fosfolipídios compreendendo uma fração derivada naturalmente rica em fosfolipídios insaturados.

[0053]. Foi de fato constatado que os referidos preparados de surfactantes reconstituídos possuem propriedades em termos de volumes correntes e volumes gasosos pulmonares que não são inferiores àquelas de surfactantes naturais modificados, tais como o poractant alfa.

[0054]. Especificamente, foi constatado que, além dos componentes proteicos, a composição de fosfolipídios é também muito importante para estabilizar os alvéolos no final da expiração em animais ventilados sem pressão expiratória final positiva (PEEP).

[0055]. Além disso, foi constatado que, usando a mistura de fosfolipídios reivindicada, é possível prover composições com baixa viscosidade, mesmo se análogos de SP-B da Fórmula (III) forem utilizados, que são mais curtos do que os análogos da Fórmula (II), mas que dão origem a preparados viscosos quando misturadas com uma mistura simples de fosfolipídios contendo DPPC e POPG.

[0056]. Vantajosamente, o análogo polipeptídico da proteína SP-C é representado pela Fórmula geral (I): IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLQpGpLp (I) Em que: • Q é um aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por M ou M oxidado no átomo de enxofre, I, L e nl_, de preferência L (norLeucina) • p é 0 ou 1.

[0057], Exemplos de polipeptídeos da Fórmula (I) são relatados abaixo: • IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (la) • IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLIGL (lb) • IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (lc) • IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLnLGL (Id) • IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL (le) • IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLL (If)

[0058]. O polipeptídeo (la) foi também referido na técnica anterior como SP-C33.

[0059]. Em uma modalidade preferida da invenção, o polipeptídeo da Fórmula geral (I) é o polipeptídeo (lc), designado na técnica como SP- C33(Leu).

[0060]. O análogo da proteína SP-B poderia ser selecionado a partir de diferentes polipeptídeos correspondentes a porções da proteína nativa ou de suas variantes.

[0061]. Em uma modalidade da invenção, o análogo da proteína nativa SP-B é um polipeptídeo representado pela seguinte Fórmula geral (II): (FPθPLPY)fCΔLCRALIKRIQAQPKGGRQLPQLVCRLVLΦCS (II) em que: • θ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por L, I e C, de preterêncio C; e • Δ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por W, I e L, de preferência W; • Q é um resíduo de aminoácido selecionado independentemente a partir do grupo constituído por M, I, L e nL, de preferência L; • Φ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por R e T, de preferência R; e • f é 0 ou 1.

[0062]. Polipeptídeos de acordo com a Fórmula geral (II) nos quais f é 0 são relatados abaixo: • CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (lia) • CLLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (llb) • CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (llc) • CLLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (lld)

[0063]. De preferência, os polipeptídeos (lia), (llb), (llc) e (lld) podem estar na forma de molécula ligada por dissulfeto, em que a ligação dissulfeto intramolecular é entre dos dois resíduos C nas posições 1 e 33 e/ou entre os dois resíduos C nas posições 4 e 27.

[0064]. O polipeptídeo ligado por dissulfeto (lia) foi designado na técnica como Mini-B e sua forma ligada por dissulfeto como Mini-B oxidado (ox Mini-B) - vide Waring AJ et al. J Peptide Res 2005, 66, 364-374.

[0065]. O polipeptídeo (llc), que é especialmente preferido, foi designado em WO 2008/044109 como Mini-B(Leu) e sua forma ligada por dissulfeto como ox Mini-B (Leu).

[0066]. Polipeptídeos de acordo com a Fórmula geral (II) nos quais f é 1 são relatados abaixo: • FPCPLPYCWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (lie) • FPIPLPYCWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (llf) • FPCPLPYCWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (Hg) • PIPLPYCWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (llh)

[0067]. De preferência, os referidos polipeptídeos podem estar na forma de molécula cíclica, em que a ligação é entre os resíduos C nas posições 8 e 40 e/ou entre os resíduos C nas posições 11 e 34.

[0068]. Em outra modalidade da invenção, o análogo da proteína nativa SP-B é um polipeptídeo representado pela Fórmula geral (III) seguinte: XΔLQRALIKRFNRYLTPQLVQRLVLRΦ∑q (III) em que: • X é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por C, A e G, L e I, de preferência C; • Δ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por W, L, nL (norLeucina) e I, de preferência W ou L; • Φ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por C, A e G, L e I, de preferência C; • Zé um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por S, G e A; • Q é um aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por C, L e I, de preferência C e • q é 0 ou 1.

[0069]. Vantajosamente, os referidos polipeptídeos podem estar na forma de molécula cíclica, em que a ligação entre os resíduos C nas posições 1 e 27 e/ou entre os resíduos C nas posições 4 e 21.

[0070]. Polipeptídeos abrangidos pela Fórmula geral (III) são, por exemplo, relatados abaixo: • CLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (llla) • CWLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (lllb) • ALLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRAA (lllc) • GLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRGG (llld)

[0071]. O polipeptídeo preferido é aquele da Fórmula (lllb) em sua forma ligada por dissulfeto, a seguir, designado como ox Mini-B27.

[0072]. Os polipeptídeos das Fórmulas gerais (I), (II) e (III) podem ser preparados de acordo com métodos sintéticos ou técnicas recombinantes bem conhecidos pelo técnico no assunto.

[0073]. Um excelente resumo das muitas técnicas disponíveis pode ser encontrado em J.M. Steward and J.D. Young, “Solid Phase Peptide Synthesis”, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, e J. Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptides”, Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983, para síntese de peptídeos em tase sólida, e em E. Schroder and K. Kubke, “The Peptides”, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para síntese clássica em solução. Os polipeptídeos da invenção podem também ser preparados utilizando a técnica sintética em fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, em J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Outras técnicas para a síntese de polipeptídeos podem ser encontradas, por exemplo, em M. Bodanszky et a/., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2s Ed., (1976), bem como em outros trabalhos de referência conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0074]. Grupos protetores apropriados para o uso em tais sínteses serão encontrados nos textos acima, bem como em J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973).

[0075]. Por exemplo, os polipeptídeos da Fórmula geral (I) podem ser preparados de acordo com o método revelado em WO 00/47623.

[0076]. Os polipeptídeos da Fórmula geral (II) em que f é 0 podem ser preparados de acordo com os métodos relatados em Waring AJ et a/. J Peptide Res 2005, 66, 364-374 ou em WO 2008/044109, enquanto os polipeptídeos da Fórmula geral (II) em que f é 1 podem ser preparados de acordo com o ensinamento de WO 2008/011559.

[0077]. Os polipeptídeos da Fórmula geral (III) podem ser preparados de acordo com os métodos revelados em WO 2009/018908.

[0078]. A invenção também inclui os sais farmaceuticamente aceitáveis dos polipeptídeos das Fórmulas gerais (I), (II) e (III) e seus derivados bloqueados na terminação N- e/ou C-, por exemplo, via acetilação e amidação.

[0079]. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, os sais do ácido clorídrico, ácido acético e do ácido trifluoroacético.

[0080]. O fosfolipídio POPG pode vantajosamente estar presente na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, como sal de sódio (POPG Na).

[0081]. De preferência, os polipeptídeos da Fórmula geral (I) e os polipeptídeos da Fórmula geral (II) ou (III) estão presentes nos surfactantes reconstituídos da invenção em uma quantidade e razão quantitativa fixa como uma combinação fixa.

[0082]. A proporção dos polipeptídeos das Fórmulas gerais (I) e (II) ou (III) em relação ao surfactante reconstituído pode variar. Vantajosamente, cada polipeptídeo pode estar presente em uma quantidade compreendida entre 0,5 e 10% com base no peso do surfactante (p/p), de preferência entre 1 e 5%, mais preferivelmente entre 1 e 3%.

[0083]. A mistura de fosfolipídios consiste em i) uma quantidade de 50% em peso de DPPC; ii) uma quantidade de 10% em peso de POPG; e iii) uma quantidade de 40% em peso de uma fração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados, sendo todas as quantidades i), ii) e iii) calculadas sobre o peso total da mistura de fosfolipídios.

[0084]. Por sua vez, a fração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados consiste essencialmente em de 30 a 50% de POPC, de 10 a 20% de PLPC, de 4 a 10% de P(:1)OPC, de 5 a 8% de SLPC, de 5 a 8% de DOPC, de 1 a 3% de SAPC, de 5 a 15% de SOPC, de 1 a 2% de PAPC, de 1 a 3% de PDPC, de 0 a 3,5% de SOPE, de 0 a 8% de SAPE, de 0 a 4% de SLPE, de 0 a 2,5% de PLPE, de 0 a 3,5% de POPE; de 0 a 2,0% de LAPE, de 0 a 2,0% de LLPE, deOa 10% de PSM.

[0085]. A soma das quantidades relativas dos diferentes componentes que constituem a referida fração deve ser 100%. A sua quantidade absoluta no peso total da mistura de tosfolipídios poderia ser calculada multiplicando cada valor por 0,4.

[0086]. Uma composição típica da tração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados pode ser constituída por aproximadamente 45% de POPC, aproximadamente 20% de PLPC, aproximadamente 6% de P(:l JOPC, aproximadamente 6% de SLPC, aproximadamente 6% de DOPC, aproximadamente 3% de SAPC, aproximadamente 10% de SOPC, aproximadamente 2% de PAPC, aproximadamente 2% de PDPC, com base no peso do extrato de L-a-fosfatidilcolina.

[0087]. Outra composição típica da referida fração pode ser constituída por aproximadamente 35% de POPC, aproximadamente 20% de PLPC, aproximadamente 5% de P(:1)OPC, aproximadamente 5% de SLPC, aproximadamente 5% de DOPC, aproximadamente 1% de SAPC, aproximadamente 7% de SOPC, aproximadamente 1% de PAPC, aproximadamente 1% de PDPC, aproximadamente 2% de SOPE, aproximadamente 7% de SAPE, aproximadamente 3% de SLPE, aproximadamente 2% de PLPE, aproximadamente 2% de POPE; aproximadamente 2% de LAPE, aproximadamente 1% de LLPE, aproximadamente 1% < de PSM, com base no peso do extrato de L-a- fosfatidilcolina.

[0088]. Em uma modalidade da invenção, como fonte da fração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados, podem ser utilizadas L-a- fosfatidilcolinas derivadas de gema de ovo com diferentes purezas (Sigma Aldrich Co, St. Louis, MO, EUA).

[0089]. Por exemplo, L-a-fosfatidilcolina derivada de gema de ovo com pureza superior a 99% p/p pode ser vantajosamente utilizada. Sua composição é essencialmente formada por: de 40 a 50% de POPC, de 15 a 20% de PLPC, de 5 a 7% de P(:1)OPC, de 6 a 7% de SLPC, de 6 a 7% de DOPC, de 2 a 3% de SAPC, de 10 a 15% de SOPC, de 1 a 2% de PAPC, de 1 a 2% de PDPC, com base no peso do extrato de L-a-fosfatidilcolina.

[0090]. Caso contrário, pode-se utilizar L-a-fosfatidilcolina derivada de gema de ovo com pureza de aproximadamente 40% p/p e que possui a seguinte composição: de 30 a 40% de POPC, de 13 a 18% de PLPC, de 3 a 4% de P(:I)OPC, de 5 a 6% de SLPC, de 5 a 6% de DOPC, de 1 a 2% de SAPC, de 6 a 8% de SOPC, de 1 a 2% de PAPC, de 1 a 2% de PDPC, de 3 a 3,5% de SOPE, de 7 a 8% de SAPE, de 3,5 a 4,5% de SLPE, de 2 a 2,5% de PLPE, de 3 a 3,5% de POPE; de 1,5 a 2,0% de LAPE, de 1 a 2% de LLPE, de 0,5 a 1 % de PSM, com base no peso do extrato de L-a-fosfatidilcolina.

[0091]. Como fonte da fração de fosfolipídios insaturados, L-a- fosfatidilcolina derivada de fígado bovino com pureza superior a 99% p/p poderia também ser utilizada. Alternativamente, a referida fração pode ser isolada de outras fontes, tais como de fígado de coelho por cromatografia de acordo com métodos conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0092]. Teoricamente, a fração de fosfolipídios insaturados pode também ser preparada pelo técnico no assunto misturando cada componente em uma quantidade adequada.

[0093]. As quantidades relativas de fosfolipídios podem ser determinadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por LC-MS de acordo com o método relatado em Miroslav L et a/. J Chromatog A 2011, 1218, 5146-5156.

[0094]. Em modalidades específicas da invenção, o surfactante reconstituído pode compreender componentes adicionais, por exemplo, lipídios neutros como triacilgliceróis, ácidos graxos livres, colesterol e/ou outros fosfolipídios como lisofosfatidilcolinas, lisofosfatidiletanolaminas, DPPS e DPPG e DOPE.

[0095]. Vantajosamente, o surfactante reconstituído de acordo com a invenção compreende de 90 a 99% em peso da mistura de fosfolipídios, de preferência 92 a 98%, mais preferivelmente de 94 a 96%, e de 1 a 10% em peso da soma de um peptídeo da Fórmula (I) e um peptídeo da Fórmula (II), (III) ou (IV), de preferência 2 a 8%, mais preferivelmente 4 a 6%.

[0096]. Em umα dαs modalidades da invenção, o surfactante reconstituído compreende 96% em peso da mistura de fosfolipídios, 2% em peso de um polipeptídeo da Fórmula geral (I) e 2% em peso de um polipeptídeo da Fórmula geral (II).

[0097]. Em outra modalidade, o surfactante reconstituído compreende 96% em peso da mistura de fosfolipídios, 2% em peso de um polipeptídeo da Fórmula geral (I) e 2% em peso de um polipeptídeo da Fórmula geral (III).

[0098]. As doses eficazes do surfactante reconstituído da invenção para o tratamento de uma doença como RDS, conforme aqui descrito, variam dependendo de muitos fatore diferentes, inclusive o tipo da doença, o meio de administração, o peso e o estado fisiológico do paciente e se o tratamento é profilático ou terapêutico.

[0099]. Em geral, a dose está compreendida entre 0,01 mg e 10 g por kg de peso corporal, de preferência entre 0,1 e 1 g por kg de peso corporal e a frequência de administração pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Tipicamente, uma dose de aproximadamente 50 mg/kg, 100 mg/kg ou 200 mg/kg é administrada em uma dose. Para uso em recém-nascidos, uma ou duas administrações são geralmente suficientes.

[00100]. Embora as necessidades possam variar, dependendo da gravidade da doença respiratória e/ou de outras variáveis, a determinação das faixas ótimas para doses eficazes está ao alcance do conhecimento do técnico no assunto.

[00101]. A presente invenção também diz respeito a formulações farmacêuticas compreendendo o surfactante reconstituído da invenção.

[00102]. As referidas formulações são administradas vantajosamente na forma de uma solução, dispersão, suspensão ou pó seco. De preferência, as referidas composições compreendem o surfactante reconstituído dissolvido ou suspenso em um solvente adequado fisiologicαmente tolerável ou veículo de ressuspensão, tal como água ou uma solução aquosa salina fisiológica (NaCI 0,9% p/v).

[00103]. As formulações da presente invenção estão de preferência em forma de suspensão em uma solução aquosa, mais preferivelmente estéril, e que podem compreender opcionalmente agentes de tamponamento do pH, diluentes e outros aditivos adequados.

[00104]. Vantajosamente, a viscosidade das referidas formulações é inferior a 20 centiPoise (cP), de preferência inferior a 15 cP, quando da determinação com um viscosímetro comum disponível no mercado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00105]. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, amplas e frascos fechados com vedação, ou podem ser armazenados em condição congelada ou congelada-seca (liofilizada) com necessidade somente da adição do veículo líquido estéril imediatamente antes do uso.

[00106]. De preferência, o surfactante reconstituído da invenção é fornecido como suspensão estéril em uma solução aquosa salina fisiológica tamponado em frascos de vidro de uso único.

[00107]. As formulações farmacêuticas podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de misturar os polipeptídeos e os fosfolipídios na presença de um solvente orgânico. O solvente é depois removido por diálise ou evaporação sob nitrogênio e/ou exposição ao vácuo ou por outras técnicas apropriadas bem conhecidas pelo técnico no assunto, tais como liofilização e secagem por aspersão.

[00108]. O pó obtido é depois levado de modo uniforme e íntimo à associação com veículos líquidos ou com veículos sólidos finamente divididos, ou ambos.

[00109]. A mistura de polipeptídeos com fosfolipídios pode ser esterilizada antes de remover o solvente, por exemplo, por esterilização estéril. Em certas outras modalidades, a composição do surfactante reconstituído é esterilizada no final de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

[00110]. A administração do surfactante reconstituído da invenção é realizada de maneira conhecida pelo técnico no assunto, por exemplo, por instilação intratraqueal (infusão ou bolus ou através de um cateter), administração em spray ou por nebulização.

[00111]. Conforme revelado neste relatório descritivo, a invenção contempla o uso de formulações concentradas e diluídas do surfactante, dependendo do uso em particular, conforme descrito mais detalhadamente no presente. Composições concentradas do surfactante são tipicamente usadas para administrações tipo “bolus”, ao passo que composições diluídas do surfactante são tipicamente usadas para administrações tipo “lavagem”.

[00112]. Vantajosamente, para administrações tipo “bolus”, a concentração do surfactante reconstituído em termos de peso por ml de solução ou suspensão (após a adição de um veículo líquido) está na faixa de 5 a 100 mg/ml, de preferência entre 20 e 80 mg/ml.

[00113]. Em uma modalidade preferida da invenção, quando o surfactante reconstituído é administrado por instalação intratraqueal como uma suspensão em solução salina fisiológica (cloreto de sódio 0,9% p/v em água), a concentração é de aproximadamente 80 mg/ml.

[00114]. Quando usado para administração por lavagem, uma concentração típica do surfactante é de aproximadamente 0,1 a 20 mg/ml e, mais preferivelmente, de aproximadamente 0,5 a 10 mg/ml (em termos de mg de surfactante por ml de solução ou suspensão).

[00115]. Por depender da concentração, a viscosidade de formulações diluídas seria ainda mais baixa.

[00116]. Quando usadas como tratamento farmacêutico, as formulações compreendendo o surfactante reconstituído da presente invenção podem ser administradas isoladamente ou, opcionalmente, em conjunto com outros compostos ou composições que são empregados no tratamento de doenças ou transtornos respiratórios. Por exemplo, se um indivíduo está sendo tratado para um transtorno respiratório causado por uma intecção bacteriana, então o surfactante reconstituído da presente invenção pode ser administrado em conjunto com outro composto empregado para tratar a infecção bacteriana, tal como um antibiótico.

[00117]. Caso contrário, em certos casos, por exemplo, para prevenir complicações tais como displasia broncopulmonar, o surfactante reconstituído da presente invenção pode ser administrado em conjunto com corticosteroides tais como budesonida e dipropionato de beclometasona.

[00118]. Em certas modalidades, o surfactante reconstituído da invenção e o veículo da ressuspensão podem ser embalados separadamente ao mesmo tempo por meio de um recipiente adequado. Tal embalagem separada dos componentes por meio de um recipiente adequado é também descrita como kit.

[00119]. Portanto, esta invenção é também direcionada a um kit, compreendendo: a) o surfactante reconstituído da invenção em forma de pó em uma primeira forma farmacêutica unitária; b) um veículo farmaceuticamente aceitável em uma segunda forma farmacêutica unitária; e c) recipientes como meio para conter as referidas primeira e segunda formas farmacêuticas.

[00120]. De preferência, o veículo farmaceuticamente aceitável é uma solução aquosa salina fisiológica, mais preferivelmente estéril.

[00121]. Conforme revelado neste relatório descritivo, há uma variedade de métodos disponíveis para administrar o surfactante reconstituído e suas formulações da presente invenção e que são bem conhecidos pelo técnico no assunto.

[00122]. Dependendo do tipo da doença, por exemplo, um lactente ou um adulto com a síndrome da angústia respiratória, podem ser apropriados métodos de tratamento diferentes.

[00123]. Tipicamente, o surfactante é administrado por instilação endotraqueal aos pacientes (por exemplo, lactentes pré-termo) mantidos sob ventilação com pressão positiva (IPPV) contínua ou intermitente.

[00124]. Alternativamente, o surfactante pode ser administrado pelo uso de um cateter fino posicionado na traqueia e a respiração do paciente sustentada com dispositivos nasais especialmente projetados, tais como máscaras, prongas ou tubos de acordo com a metodologia conhecida como Pressão Positiva Contínua nas Vias Aéreas nasais (nCPAP).

[00125]. A última abordagem seria possível somente com um surfactante cuja viscosidade fosse baixa, pois se alta, a viscosidade dificultaria a passagem do surfactante através do cateter fino.

[00126]. Em casos nos quais o paciente sofre de uma condição de angústia respiratória associada com inflamação pulmonar, infecção pulmonar ou contusão pulmonar, modalidades especiais de tratamento podem ser recomendadas. Em um de tais métodos terapêuticos, a lavagem dos pulmões do paciente com uma composição contendo o surfactante da presente invenção é realizada como tratamento único ou múltiplo.

[00127]. O surfactante reconstituído da invenção é adequado para prevenir, retardar, aliviar, sustar ou inibir o desenvolvimento dos sintomas ou condições associados com uma doença respiratória.

[00128]. Especificamente, é útil para a profilaxia e/ou o tratamento de síndrome da angústia respiratória (RDS) em crianças nascidas prematuramente ou de outras doenças relacionadas a uma deficiência ou disfunção de surfactante incluindo lesão pulmonar aguda (ALI), RDS em adultos (ARDS), síndrome da aspiração de mecônio (MAS) e displasia broncopulmonar (BPD).

[00129]. Pode também ser útil para a profilaxia e/ou o tratamento de outros transtornos respiratórios tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, infecção respiratória (por exemplo, pneumonia, por Pneumocystis carinii, fibrose cística e pelo vírus sincicial respiratório) bem como para o tratamento de otite média serosa (catarro no ouvido).

[00130]. Os exemplos a seguir ilustram a invenção mais detalhadamente.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Preparo dos surfactantes reconstituídos Materiais

[00131]. Os fosfolipídios 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1 -palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPG), L-a-fosfatidilcolinas derivadas de gema de ovo com purezas superiores a 99% em uma gema (a seguir PC pura de gema de ovo) e de aproximadamente 40% (a seguir PC não purificada de gema de ovo), foram adquiridos. A fração de fosfatidilcolina derivada de fígado de coelho (a seguir PC de fígado) foi isolada por cromatografia em Lipidex-5000 conforme relatado em Curstedt T. Analysis of molecular species of ether analogues of phosphatidylcholines from biological samples. Biochim Biophys Acta 1977;489:79-88.

[00132]. Os polipeptídeos SP-C33(Leu) e ox-Mini-B(Leu) foram preparados como revelado em WO 2008/044109, enquanto o polipeptídeo ox Mini-B27 foi preparado como revelado em WO 2009/018908.

Preparo dos surfactantes reconstituídos

[00133]. Os fosfolipídios, dissolvidos em clorofórmio/metanol 98:2 (v/v), foram misturados nas proporções DPPC:POPG: PC de gema de ovo (PC de fígado) 50:10:40 em peso.

[00134]. Preparados do surfactante reconstituído correspondente (surfactante A e B) foram criados adicionando cada polipeptídeo em uma quantidade de 2% em peso. Os surfactantes obtidos foram evaporados sob nitrogênio e ressuspensos em solução aquosa de NaCI 0,9% p/p a uma concentração de 80 mg/ml.

Exemplo 2 - Experimento in vivo com um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PL de fígado 40%

[00135]. Coelhos recém-nascidos imaturos (idade gestacional: 27 dias) foram tratados ao nascerem com 200 mg/kg do preparado de surfactante reconstituído (80 mg/ml). Animais recebendo a mesma dose de poractant alfa (Curosurf™) serviram como controles positivos e parceiros da ninhada não tratados como negativos. Os coelhos recém-nascidos foram ventilados em paralelo com uma sequência padronizada de picos de pressão de insuflação. Para abrir os pulmões, a pressão foi definida primeiramente em 35 cm de H2O por 1 minuto. Depois dessa manobra de recrutamento, a pressão foi diminuída para 25 cm de H2O por 15 minutos e em seguida para 20 e 15 cm de H2O. Finalmente, a pressão foi elevada de novo para 25 cm de H2O por 5 minutos, depois dos quais, os pulmões foram ventilados por 5 minutos adicionais com nitrogênio e então removidos por excisão para aferições do volume gasoso. Os experimentos foram realizados sem PEEP. Os volumes correntes e os volumes gasosos pulmonares são fornecidos em valores da mediana.

[00136]. Os pulmões foram fixados por imersão em formalina neutra 4%, desidratados e inseridos em parafina. Cortes transversos foram corados com hematoxilina e eosina. A densidade do volume alveolar foi medida com um analisador de imagem auxiliado por computador, utilizando o parênquima total como volume de referência.

[00137]. Os resultados indicam que um surfactante reconstituído, compreendendo uma mistura de fosfolipídios com base em PL de fígado e DPPC e POPG como fosfolipídios sintéticos, 2% cada de SP-C33Leu e ox Mini- B(Leu), forneceu volumes correntes (Figura 1) e volumes gasosos pulmonares (Figura 2) semelhantes aos de Curosurf™. Além disso, a partir da Tabela 3, pode-se reconhecer que o referido surfactante reconstituído forneceu uma densidade do volume alveolar semelhante à do Curosurf™ e significativamente mais alta do que a mistura de fosfolipídios somente. Tabela 3: Densidade do volume alveolar (%) em coelhos pré-termo

**p < 0,002-0,0002 versus todos os grupos exceto Curosurf™ #p < 0,02 - 0,0002 versus todos os grupos exceto o surfactante reconstituído

Exemplo 3 - Experimento in vivo com um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC não purificada de gema de ovo 40%

[00138]. O experimento foi realizado como descrito no Exemplo 2.

[00139]. Os volumes correntes e os volumes gasosos pulmonares são relatados na Figura 3 e 4 em valores da mediana.

[00140]. Os resultados indicam que um surfactante reconstituído, compreendendo uma mistura de fosfolipídios contendo DPPC 50%, PC de gema de ovo 40% e POPG 10%, também obteve volumes correntes e volumes gasosos pulmonares semelhantes aos obtidos por Curosurf™.

Exemplo 4 - Experimento in vivo com um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B(Leu) 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40%

[00141]. O experimento foi realizado como descrito no Exemplo 2.

[00142]. Os volumes correntes e os volumes gasosos pulmonares são relatados na Figura 5 e 6 em valores da mediana.

[00143]. Os resultados indicam que ainda que PC pura de gema de ovo seja usada, o surfactante reconstituído correspondente apresentou volumes gasosos pulmonares semelhantes aos de Curosurf™, porém, volumes correntes um pouco, mas não significativamente menores.

Exemplo 5 - Experimento in vivo com um surfactante reconstituído preparado com ox Mini-B27 2% + SP-C33(Leu) 2% + DPPC 50% + POPG 10% + PC pura de gema de ovo 40%

[00144]. O experimento foi realizado como descrito no Exemplo 2. Contudo, usou-se um análogo de SP-B, o polipeptídeo citado como ox Mini- B27 em vez de ox Mini-B(Leu).

[00145]. Este é um análogo mais curto de ox Mini-B(Leu), mas os referidos polipeptídeos dão origem a um preparado viscoso quando misturados com uma mistura de fosfolipídios constituída por DPPC:POPG 7:3 (P/P).

[00146]. Os volumes correntes e volumes gasosos pulmonares obtidos são relatados na Figura 7 e 8 em valores da mediana.

[00147]. O referido surfactante reconstituído deu origem a volumes correntes um pouco menores do que Curosurf™, porém, os volumes gasosos pulmonares foram semelhantes. Além disso, a formulação correspondente em forma de suspensão aquosa a 80 mg/ml exibia baixa viscosidade.

Exemplo 6 - Experimento in vivo com volumes correntes constantes

[00148]. Coelhos recém-nascidos imaturos (idade gestacional: 27 dias) foram tratados ao nascerem com 200 mg/kg de preparados diferentes de surfactante (80 mg/ml). Animais recebendo a mesma dose de Curosurf™ serviram como controles positivos e parceiros da ninhada não tratados como negativos. Os coelhos recém-nascidos foram ventilados em paralelo com pressões individuais a fim de serem obtidos volumes correntes padronizados. Um volume corrente constante de 6 ml/kg foi utilizado.

[00149]. Para abrir os pulmões, a pressão foi primeiramente definida em 35 cm de H2O por 1 minuto. Depois dessa manobra de recrutamento, a pressão foi diminuída para manter os volumes correntes por 30 minutos entre 6-8 ml/kg. Os experimentos foram realizados sem PEEP. As amostras a seguir foram testadas: 1. DPPC 50% + PC de gema de ovo 40% + POPG 10% + SP-C33Leu 2% + Mini-B27 2% 2. DPPC 50% + PC de gema de ovo 40% + POPG 10% + SP-C33Leu 2% + Mini-BLeu 2% 3. Curosurf™ 4. Controles não tratados

[00150]. Os volumes correntes e os volumes gasosos pulmonares são relatados em valores da mediana nas Figuras 9 e 10.

[00151]. Aparentemente, os preparados do surfactante reconstituído contendo Mini-B27 ou Mini-BLeu apresentaram volumes gasosos pulmonares semelhantes aos de animais tratados com Curosurf™ em experimentos quando os animais eram ventilados com volumes correntes fisiológicos (aproximadamente 6 ml/kg) sem PEEP.

Claims

1. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO caracterizado pelo fato de compreender: uma mistura de fosfolipídios; um análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-B; e um análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-C representado pela fórmula geral: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLQpGpLp (I) na qual: Q é um aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por M ou M oxidado no átomo de enxofre, I, L e nL (norLeucina); p é 0 ou 1; em que a referida mistura de fosfolipídios consiste em: i) uma quantidade de 50% em peso de DPPC; ii) uma quantidade de 10% em peso de POPG; e iii) uma quantidade de 40% em peso de uma fração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados consistindo essencialmente em: de 30 a 50% de POPC, de 10 a 20% de PLPC, de 4 a 10% de P(:l)OPC, de 5 a 8% de SLPC, de 5 a 8% de DOPC, de 1 a 3% de SAPC, de 5 a 15% de SOPC, de 1 a 2% de PAPC, de 1 a 3% de PDPC, de 0 a 3,5% de SOPE, de 0 a 8% de SAPE, de 0 a 4% de SLPE, de 0 a 2,5% de PLPE, de 0 a 3,5% de POPE; de 0 a 2,0% de LAPE, de 0 a 2,% de LLPE, de 0 a 10% de PSM; sendo todas as quantidades em i), ii) e iii) calculadas sobre o peso total da mistura de fosfolipídios, em que análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-B é representado pela Fórmula geral (II): (FPθPLPY)fCΔLCRALIKRIQAQPKGGRQLPQLVCRLVLΦCS (II) em que: θ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por L, I e C, de preferência C; e Δ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por W, I e L, de preferência W; Q é um resíduo de aminoácido selecionado independentemente a partir do grupo constituído por M, I, L e nL, de preferência L; Φ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por R e T, de preferência R; e f é um número inteiro com valor igual a 0 ou 1; ou análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-B é representado pela Fórmula geral (III): XΔLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRΦ∑q (III) em que: X é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por C, A e G, de preferência C; Δ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por W, L, nL e I, de preferência W ou L; Φ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por C, A e G, de preferência C; ∑ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo constituído por S, G e A; e q é 0 ou 1.

2. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o análogo polipeptídico da proteína surfactante nativa SP-C consiste na sequência representada pela fórmula: IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (Ic)

3. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o análogo polipeptídico da Fórmula (II) na qual f é 0 a partir do grupo de sequências representadas pelas “fórmulas”: CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (IIa) CLLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (IIb) CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (IIc) CLLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (IId)

4. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da Fórmula (II) na qual f é 1 é selecionado a partir do grupo de sequências representadas pelas “fórmulas”: FPCPLPYCWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (IIe) FPIPLPYCWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (Ilf) FPCPLPYCWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (Ilg) FPIPLPYCWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (Ilh)

5. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da fórmula (III) é selecionado a partir do grupo de sequências representadas pelas “fórmulas”: CLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (IIIa) CWLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (Illb) ALLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRAA (IIIc) GLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRGG (IIId)

6. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a fração derivada naturalmente de fosfolipídios insaturados é uma L-α-fosfatidilcolina derivada de gema de ovo.

7. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de compreender um surfactante reconstituído conforme definido por uma das reivindicações 1 a 8, em que a referida formulação está na forma de solução, dispersão ou de pó seco, opcionalmente, em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

8. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida formulação está na forma de suspensão aquosa.

9. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o surfactante reconstituído está a uma concentração compreendida entre 5 e 100 mg/ml da suspensão aquosa.

10. KIT, caracterizado pelo fato de compreender: a) um surfactante reconstituído de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em forma de pó em uma primeira forma farmacêutica unitária; b) um veículo farmaceuticamente aceitável em uma segunda forma farmacêutica unitária; e c) recipientes como meio para conter as referidas primeira e segunda formas farmacêuticas.

11. Surfactante reconstituído conforme definido por uma das reivindicações de 1 a 6.

12. USO DE SURFACTANTE RECONSTITUÍDO conforme definido por uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de síndrome da angústia respiratória (RDS) em crianças nascidas prematuramente ou para o tratamento ou a profilaxia de outras doenças relacionadas a uma deficiência ou disfunção de surfactante.

13. USO de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a doença inclui síndrome da angústia respiratória (RDS) em adultos (ARDS), síndrome da aspiração de mecônio (MAS) e displasia broncopulmonar (BDP).