WO1993014640A1

WO1993014640A1 - Antibacterial agent and treatment of article therewith

Info

Publication number: WO1993014640A1
Application number: PCT/JP1992/001563
Authority: WO
Inventors: Mamoru Tomita; Seiichi Shimamura; Kozo Kawase; Yasuo Fukuwatari; Mitsunori Takase; Wayne Robert Bellamy; Koji Yamauchi; Hiroyuki Wakabayashi; Yukiko Tokita
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
Priority date: 1992-01-23
Filing date: 1992-11-30
Publication date: 1993-08-05
Also published as: AU665381B2; US5656591A; AU2956492A; DE69220679T2; CA2128612A1; DE69220679D1; EP0629347A4; CA2128612C; EP0629347B1; DK0629347T3; EP0629347A1

Description

明細書抗菌剤とこの抗菌剤を用いて物品を処理する方法技術分野

この発明は、抗菌剤とこの抗菌剤を用いて物品を処理する方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、広範な微生物に対して優れた抗菌作用を有する新しい抗菌剤と、この抗菌剤を用いて食品や医薬品等の物品を安全に抗菌処理する方法に関するものである。

背景技術

ラクトフリンは、生体内では、涙、唾液、末梢血、乳汁等に含まれている天然の鉄結合蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジゥ厶菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている〔ジャーナル

• ォブ · ぺディァトリクス (Journal of Pediatrics)、第 9 4 巻、 1 頁： 1 9 7 9 年〕。また、ブドウ球菌および腸球菌に対して、 0.5 〜 3 0 mg/ の濃度で抗菌作用' を有することが知られている〔ノネッケとスミス；ジャーナル · ォブ · デァリ一 · サイエンス（Nonnecke, B. J. & Smi th， K丄； Journal of Dairy Science) 6 7 巻、〔 6

0 6 頁： 1 9 8 4 年〕。

-4

一方、従来より種々の微生物に対して抗菌作用を有するペプチドについては多数の発明が知られている。例えばグラム陽性菌ぉよびグラム陰性菌に有効なホスホノトリペプチド（特開昭 5 7 — 1 0 6 6 8 9号公報）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭 5 8 - 1 3 5 9 4号公報 ) 、環状べプチド誘導体（特開昭 5 8 — 2 1 3 7 4 4号公報）、抗菌及び抗ウィルス作用を示すペプチド（特開昭 5 9 — 5 1 2 4 7号公報）、酵母に有効なポリべプチド（特開昭 6 0 - 1 3 0 5 9 9号公報）、グラム陽性菌に有効な糖べプチド誘導体（特開昭 6 0 — 1 7 2 9 9 8 号公報、特開昭 6 1 — 2 5 1 6 9 9号公報、特開昭 6 3 一 4 4 5 9 8号公報）、グラム陽性菌に有効なオリゴぺプチド（特開昭 6 2 - 2 2 7 9 8号公報）、ペプチド系抗生物質（特開昭 6 2 — 5 1 6 9 7号公報、特開昭 6 3 - 1 7 8 9 7号公報）その他北米産カブトガ二の血球から抽出した抗菌性ペプチド（特開平 2 — 5 3 7 9 9号公報）、蜜蜂の血リンパから単離した抗菌性ペプチド（特表平 2 — 5 0 0 0 8 4号公報）等である。

この発明の発明者等は、望ましくない副作用等（例えば、抗原性等）がなく、耐熱性があり . かつ強い抗菌作用を有する物質を自然界から安価に単離することを企図し、哺乳類のラクトフエリン、アポラクトフエリンおよび Zまたは金属飽和ラクトフ二リン（以下、これらをラク卜フェリン類と記載することがある）を酸または酵素により加水分解した分解物が未分解のラクトフェリン類よりも強い耐熱性および抗菌性を有することを見出し、すでに特許出願を行った（特願平 3 — 1 7 1 7 3 6 号）更にこの発明の発明者等は、望ましくない副作用等（例えば、抗原性等）がなく、耐熱性があり、かつ強い抗菌作用を有するラクトフエリン関連抗菌性ペプチドとして、アミノ酸残基が 2 0 残基である抗菌性ペプチド（特願平 3 — 1 8 6 2 6 0 号）、アミノ酸残基が 1 1 残基である抗菌性ペプチド（特願平 3 — 4 8 1 9 6 号）、アミノ酸残基が 6 残基である抗菌性ペプチド（特願平 3 — 9 4 4 9 2 号）、アミノ酸残基が 5 残基である抗菌性ぺプチド（特願平 3 — 9 4 4 9 3 号）、ァミノ酸残基が 3 〜 6 残基である抗菌性ペプチド（特願平 3 — 9 4 4 9 4 号 ) を発明し、すでに特許出願を行なった。

なお、従来からラクトフ二リンの抗菌性を増強する研究が種々行われてきており、そのような生理活性増強補助剤としてはリゾチーム、 I g Αおよびグリコぺプチドが知られている。例えば、ラクトフエリンとリゾチ一厶との共存により相乗的に抗菌作用を増強する方法〔特開昭 6 2 — 2 4 9 9 3 1 号公報〕、ラクトフヱリンと分泌型 I g A との共存により相乗的に抗菌作用を増強する方法〔ステフエンス等；ィ厶ノロジ一（Stephens, S. , et al； Immunology)； 4 1 巻、 5 9 7 頁： 1 9 8 0 年〕等が報告されている。更に、スピック等は〔エー ' エフ ' ゥィリアムスおよびジエー · ディ一 · バウム（ A. F. W i 11 i a ms も J. D. Baum)IS、「ヒューマン ' ミノレクノ、ンキング」 (Human Milk Banking) 、ネッスル ' ヌートリシヨン · ヮ一クショップ ' シリーズ、第 5巻、（Nestle Nutriti on Workshop Series Volume 5 ) 、 1 3 3頁、レ一ベン • プレス · ブック社（Raven Press Books, Ltd. )、 1 9 8 4年〕に、ラクトフエリンには細菌が粘膜表面に付着するのを防止する作用があり、この作用はリゾチームまたはグリコぺプチドの存在で強化されることを報告している。

また、ラクトフエリンと抗生物質との併用効果についても従来から研究が行われており、ラクトフエリンとの併用によって抗菌活性を増強させる抗生物質としては、セフエム系抗生物質〔宮崎修一等；ケモセラピー（chem 0 therapy) ；第 3 9巻：第 8 2 9ページ、 1 9 9 1 年〕およびべ一タラクタム系抗生物質（特公平 1 一 3 1 9 4 6 3号公報）等が知られている。

しかしながら、上記ラクトフヱリン類の分解物ゃラクトフ二リン関連抗菌性べプチドと特定の化合物および Z または抗生物質との併用効果については従来全く研究されておらず、従ってそれらを有効成分とする抗菌剤も存在しなかった。また、そのような抗菌剤を用いて食品や医薬品等の物品を抗菌処理しょうとする試みも全くなされていなかった。

発明の開示

この発明は、上記の通りの課題を解決するためになされたものであって、この発明の発明者等が既に発明した上記ラクトフエリン類の分解物および Zまたはラクトフ

X リン関連抗菌性べプチドと、特定の化合物および Zまたは抗生物質とを併用することにより、抗菌性がさらに増強された抗菌剤を提供することを目的としている。

この発明は、以上の目的を実現するものとして、（ A ) ラクトフュリン類の分解物、ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（ B ) 金属をキレートする蛋白質、トコフヱロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコール類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコノレビン酸、ァスコノレビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物とを有効成分とする抗菌剤を提供する。

またこの発明は、（ A ) ラクトフエリン類の分解物、ラクトフ二リン関連抗菌性べプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（ C ) 抗生物質とを有効成分とする抗菌剤、および（A ) ラクトフ二リン類の分解物、ラクトフェリン関連抗菌性ぺプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（ C ) 抗生物質と、（ B ) 金属をキレ — トする蛋白質、リゾチーム、カゼイン分解物、トコフヱロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸ェステル類、アルコール類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物とを有効成分とする抗菌剤を提供する。

さらにこの発明は、上記のいずれかの抗菌剤を用いて物品を処理する方法をも提供する。

発明を実現するための最良の形態

この発明においてラクトフヱリン類とは、市販のラクトフ二リン、哺乳類（例えば人、牛、羊、山羊、馬等）の初乳、移行乳、常乳、. 末期乳等、またはこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホェ一等から常法（例えば、ィォン交換クロマトグラフィー）により分離したラク卜フエリン、それらを塩酸、クェン酸等により脱鉄したアポラクトフヱリン、アポラクトフヱリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレ一トさせた金属飽和または部分飽和ラクトフエリンであり、市販品あるいは公知の方法により製造した調製品を使用することができる。

この発明において使用するラクトフヱリンの分解物は上記のラクトフュリン類を酸または酵素で加水分解して得られ、たとえば特願平 3 — 1 7 1 7 3 6 号に記載された方法によって得ることができる。すなわち酸により加水分解を行う場合は、ラクトフエリン類を水に溶解し、これに無機酸または有機酸を添加し、 '所定温度に所定時間加熱して加水分解する。酵素により加水分解を行う場合は、ラクトフエリン類の水溶液を、使用する酵素の至適 p H に調整し、これにペプシン、トリプシン等の酵素を加え、所定温度に所定時間保持して加水分解したのち常法により酵素を失活させる。酸または酵素による加水分解で得られた分解物は、種々の分子量を有する抗菌性ペプチドの混合物である。上記加水分解による分解度は 6 〜 2 0 %の範囲が望ましい。なお、この分解度は、ケルダール法により試料の全窒素を、またホルモール滴定法により試料のホルモール態窒素をそれぞれ測定し、これらの値から次式により算出した。

分解度二（ホルモール態窒素量 Z全窒素量） X 1 0 0 また、以下の説明における上記分解度以外の百分率は重量による値である。

上記のとおりに酸または酵素によって加水分解して得られた反応液（ラクトフ二リン類分解物の溶液）は、常法により冷却し、必要に応じて常法により中和、脱塩、脱色し、更に必要に応じて常法により分画し、得られた溶液をそのまま、または濃縮した液状で、あるいは濃縮後乾燥した粉末状で、後述する特定の化合物および Zまたは抗生物質と混合する。

この発明において使用するラクトフエリン関連抗菌性ペプチドは、ラクトフヱリン類の分解物から分離手段によって得られる抗菌性を有するペプチド、ラクトフリン類の分解物から分離手段によって得られる抗菌性を有するぺプチドと同一または相同の化学構造（ァミノ酸配列）を有するペプチド、ラクトフエリン類の分解物から分離手段によって得られる抗菌性を有するぺプチドと同一または相同の化学構造（アミノ酸配列）を有するぺプチドの誘導体、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物である。これらのラクトフエリン関連抗菌性べプチドは、例えば、特願平 3 — 1 8 6 2 6

0 、特願平 3 - 4 8 1 9 6号、特願平 3 - 9 4 4 9 2号. 特願平 3 - 9 4 4 9 3号、および特願平 3 — 9 4 4 9 4 号の各発明に記載された方法によって得ることができる _c すなわち、ラクトフエリン類を酸または酵素を用いて加水分解し、得られたぺプチド混合物から液体クロマトグラフィ一等の分離手段によって抗菌性を有するぺプチドを含む画分を得る方法、あるいは上記のようにして得た抗菌性を有するペプチドのアミノ酸配列を公知の方法（例えば、気相シークヱンサ一を用いる方法等）によって決定し、それらのアミノ酸配列を有するペプチドを公知の方法（例えば、ペプチド自動合成装置を用いる方法）によって各々合成して目的とするぺプチドを得る方法等によって調製することができる。これらのラクトフエリン関連抗菌性べプチドは、例えば下記のァミノ酸配列を有する以下のペプチドである。：配列番号 1 、 2 、および 2 7 のァミノ酸配列を有する抗菌性べプチドまたはその誘導体（特願平 3 - 4 8 1 9 6号発明）；配列番号 3 4 、 5 および 6 のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドまたはその誘導体（特願平 3 — 9 4 4 9 2号発明）；配列番号 7 、 8 、 9 および 3 1 のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドまたはその誘導体（特願平 3 — 9 4 4 9 3 号発明）；配列番号 1 0 、 1 1 、 1 2 、 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 、 1 7 、 1 8 、 1 9 、 2 0 および 2 1 のァミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドまたはその誘導体（特願平 3 _ 9 4 4 9 4号発明）；および、配列番号 2 2 、 2 3 、 2 4 、 2 5 、 2 6 、 2 8 、 2 9 および 3 0 のァミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドまたはその誘導体（特願平 3 — 1 8 6 2 6 0号発明）。

これらの抗菌性ペプチドは、溶液をそのまま、または濃縮した液状で、あるいは濃縮後乾燥した粉末状で、下記の特定の化合物および Zまたは抗生物質と混合する。この発明の抗菌剤において、上記ラクトフヱリン類の分解物および Zまたはラク卜フエリン関連抗菌性べプチドと混合する特定の化合物は、金属をキレートする蛋白質、トコフヱロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコール類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸塩、クェン酸、クニン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物である。

これらの特定の化合物は、市販品を使用することができ、或いは公知の方法によって調製し使用してもよい。例えば、金属をキレートする蛋白質は、金属イオンと配位して化合物を生成させ得る蛋白質で、例えばラクトフエリン類、トランスフェリン、コンアルブミン、カゼィンホスホペプチド等を例示することができる。シクロデキストリン類としては、ーシクロデキストリン、 β — シクロデキストリン、アーシクロデキストリン、 δ — シクロデキストリン、或いはこれらのアルキル誘導体（分枝シクロデキストリン）を例示することができる。グリセリン脂肪酸エステル類は、脂肪酸とグリセリンまたはポリグリセリンのエステルおよびその誘導体であって、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等を例示することができる。アルコール類は脂肪族の 1 価、 2 価、 3 価或いは多価アルコールであって、ェチノレアノレコーノレ、プロピレングリコーノレ、グリセロール等を例示することができる。

ラクトフヱリン類の分解物、ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、またはこれらの任意の混合物の中の何れと、金属をキレートする蛋白質、トコフエロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコール類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸またはこれらの任意の混合物の中の何れとを組み合わせるかは、使用目的によって適宜選択することができる。また、それらの混合割合は、各々の成分の種類や使用目的によって適宜選択することができる。上記の混合は、前記のように液状で、または粉末状で混合することができ、この場合適宜公知の希釈剤、賦形剤を添加することもできる。

また、この発明の別の抗菌剤において、上記ラクトフェリン類の分解物および/またはラクトフェリン関連杭菌性ぺプチドと混合する抗生物質は、ベニシリン、半合成ペニシリン、セフヱム系抗生物質、カルバぺネム系抗生物質、モノパクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ぺプタイド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフヱニコール、マクロライド系抗生物質、リファマイシン、ノくンコマイシン、ホスホマイシン、化学合成抗菌剤、抗真菌剤、抗結核剤、またはポリミキシン Bを例示することができる。これらの抗生物質は、市販品あるいは公知の方法によって調製したものを使用することができる。

この発明のさらに別の抗菌剤において、上記のラクトフエリン類の分解物および Zまたはラクトフェリン関連抗菌性べプチドと上記の抗生物質との混合物に混合する特定の化合物は、金属をキレートする蛋白質、リゾチ一ム、カゼイン分解物、トコフヱロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコール類、

E D T A、 E D T A塩、ァスコノレビン酸、ァスコルビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物である。

なお、これらの化合物は、リゾチームおよびカゼイン分解物を除き、前述のラタトフエリン類の分解物および zまたはラクトフエリン関連抗菌性ペプチドとの混合に使用する化合物と同一であり、リゾチームおよびカゼィン分解物についても、市販品もしくは公知の方法によつて調製したものを使用することができる。たとえば、力ゼィン分解物は、常法により牛乳等のカゼィンを蛋白質分解酵素、酸またはアルカリによって加水分解した分解物の混合物、或いは分解物から特定の成分を分画した物である。特に、数平均分子量が 3 8 0 程度で分子量分布が 7 5 以上、約 1 0 0 0 0 以下のペプチド（およびアミノ酸）の混合物の使用が好ましい。

ラクトフヱリン類の分解物、ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、またはこれらの任意の混合物のいずれと、上記抗生物質のいずれとを組み合わせるか、あるいはそれらの任意の組み合わせのいずれと金属をキレートする蛋白質、リゾチーム、カゼイン分解物、トコフヱロールシクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコール類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコルビン酸ァスコルビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸ポリリン酸塩、キトサン、システィンあるいはコール酸のいずれとを組み合わせるかは、使用目的によって適宜選択することができる。また、それらの混合割合は、各々の成分の種類や、使用目的等によって適宜選択することができる。それらの成分を液状または粉末状で混合することができ、適宜公知の希釈剤、賦形剤を添加してもよい。

この発明の抗菌剤は、各種の細菌、酵母、カビに対して強い抗菌性を有し、医薬品としてのみならず、食品や医薬部外品等のように人または動物の体内に取り入れられ、あるいは体表面に適用される製品、その他一般に細菌の増殖を防止または抑制することが望まれるあらゆる製品に配合して使用することができ、またこの発明の抗菌剤でそれらの製品あるいは原料素材を処理することができる。すなわちこの発明の抗菌剤は、そのまま人または動物に投与することができ、あるいは医薬品（例えば目薬、乳房炎治療剤、下痢防止剤、水虫薬等）、医薬部外品（例えば、口中洗浄剤、制汗剤、養毛剤等）、各種化粧品（例えば、整髪料、クリーム、乳液等）、各種歯磨用品（例えば、歯磨粉、歯ブラシ等）、各種生理用口各種べビー用品（例えば、ォムッ等）、各種高齢者用品 (例えば、入れ歯固定剤、ォムッ等）、各種洗剤（例えば、石鹼、薬用石驗、シャンプー、リンス、洗濯用洗剤キッチン用洗剤、住宅用洗剤等）、各種除菌用品（例えば、キッチン用除菌ペーパー、トイレット用除菌ぺ一パ一等）、飼料（例えば、家畜用飼料、ぺットフ一ド等）それらの原料となる素材、その他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧付着、被覆、含浸等を行なってもよく、またその他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品の処理に用いることができる。

さらに特記すべきことは、試験例から明らかなようにこの発明の抗菌剤は、種々の抗生物質に耐性を有する微生物に対しても顕著な抗菌性を示すことである。すなわち、ほとんどの抗生物質が効かず院内感染の原因となつている微生物、例えばメチシリン耐性スタフイロコッカス · ァウレウス等に対して、抗生物質単独では効果を示さない場合でも、ラクトフヱリン類の分解物、ラクトフエリン関連抗菌性ペプチド、またはこれらの任意の混合物と、特定の抗生物質、または特定の抗生物質および化合物とを有効成分とするこの発明の抗菌剤は顕著な抗菌効果を示すのである。

以下、試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。

( I ) ラクトフエリン類の分解物および Zまたはラクトフリン関連抗菌性べプチドと、特定の化合物とを有効成分とする抗菌剤に関する試験例。

まず、ここでの各試験例に共通する試料の調製、および試験方法についてまとめて記載する。

1 . 試料の調製

(1) ラクトフエリン分解物（粉末）

① 実施例 1 記載の方法により調製したラクトフエリン分解物 1 を使用した。

② 実施例 2 記載の方法により調製したラクトフリン分解物 2 を使用した。

(2) 抗菌性ペプチド（粉末） ① 実施例 3記載の方法により調製したペプチド (配列番号 2 6 ) を使用した。

② 実施例 4記載の方法により調製したペプチド (配列番号 2 7 ) を使用した。

(3) ラクトフヱリン：市販の牛のラクトフヱリン（シグマ社製）を使用した。

(4) カゼインホスホペプチド：公知の方法（特開昭 5 9 一 1 5 9 7 9 2号の方法）により調製して使用した。

(5) トコフエロール：市販品（和光純薬工業社製）を使用した。

(6) β - シクロデキストリン：市販品（日本食品化工社製）を使用した。

(7) 1 一モノカプリロイゾレー r a c —グリセ口一ゾレ：市販品（シグマ社製）を使用した。

(8) エチルアルコール：市販品の 9 9 . 5 %ェチルァルコール（ナカライ.テスク社製）を使用した。

(9) グリセロール：市販品（ナカライテスク社製）を使用した。

(10) プロピレングリコール：市販品（和光純薬工業社製）を使用した。

(11) E D T A · ニナトリウム：市販品（和光純薬工業社製）を使用した。 (12) ァスコルビン酸：市販品（関東化学社製）を使用した。

(13) クェン酸：市販品（ナカライテスク社製）を使用した。

(14) ポリリン酸：市販品（メルク社製）を使用した。

(15) キトサン：市販品（ナカライテスク社製）を使用した。酢酸の稀薄溶液に溶解した。

(16) L — システィン：市販品（シグマ社製）を使用した。水溶液を滅菌フィル夕一で除菌した。

(17) ポリエチレングリコール # 2 0 0 0 ：市販品（ナ力ライテスク社製）を使用した。

(18) グリセリン脂肪酸エステル類

① 1 — モノラウロイノレ一 r a c — グリセ口一ノレ：巿販品（シグマ社製）を使用した。

② 1 — モノミリストイノレ一 r a c — グリセロール：市販品（シグマ社製）を使用した。

③ 1 — モノステアロイノレ一 r a c — グリセ口一ノレ：市販品（シグマ社製）を使用した。

いずれも水懸濁液として使用した。

(19) コール酸：市販品（和光純薬工業社製）を水懸濁液として使用した。

. 試験方法

(1 ) ブドウ球菌の前培養液の調製ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus JCM-2151 ) の保存スラン卜から 1 白金耳を採取し、標準寒天培地 (栄研化学社製）に塗沫して 3 7 °Cで 1 6時間培養し、標準寒天培地の表面に育成したコロニーを白金耳でかき取り、 1 %ペプトン（ディフコ社製）培地に 3 7 °Cで数時間培養し、 3 X 1 0 ⁸ の菌濃度に増殖した対数期の菌液を前培養液とした。

(2) 基本培地（牛乳培地）の調製

市販の牛乳に、上記試料を加え、精製水で牛乳の濃度を 1 Z 2 に希釈し、 1 1 5 °Cで 1 5分間滅菌し、基本培地とした。

(3) 試験培地および対照培地の調製

( 3 - 1 ) 試験培地の調製

前記 1記載の試料の調製の（1) または（2) で調製したラクトフヱリン分解物、または抗菌性べプチドの水溶液、および（3) 、（4) 、 (6) 、（11)、 (1 2)、（13)または（16)の化合物の水溶液を滅菌フィルター（アドバンテック社製）で除菌し、基本培地に添加してそれぞれ規定した最終濃度に調整し試験培地を調製した。

(5)、 (7) 、 (8) 、 (9) 、（10)、（14)、（15)、 (1 7)、（18)、（19)は、化合物の水溶液（（5) 、 (7) の場合は水懸濁液）の滅菌フィルターによる除菌は省略し、他は（ 3 ) 等と同様にして試験培地を調製した。

( 3 - 2 ) 対照培地 1 の調製

市販の牛乳を精製水で 2 倍に希釈し、 1 1 5 °Cで 1 5 分間滅菌して、対照培地 1 とした。

( 3 - 3 ) 対照培地 2 の調製

前記 1 記載の試料の調製の（3) 、（4) 、 (6) 、 (1 1 )、（12)、（13)または（16)の化合物の水溶液を滅菌フィルター（アドバンテック社製）で除菌し、のち基本培地に添加して試験培地の濃度と同じに調整し、対照培地 2 を調製した。

(5) 、 (7) 、 (8) 、 (9) 、（10)、（14)、（15)、 (1 7)、（18)、（19)は、化合物の水溶液（（5) 、 (7) の場合は水懸濁液）の滅菌フィルターによる除菌は省略し、他は（3) 等と同様にして対照培地 2 を調製した。

) 生存率試験

上記（ 1 ) で調製したブドウ球菌の前培養液 2 0 £ を、上記（ 3 — 1 ) で調製した試験培地 2 に添加し、 3 7 °Cで 1 時間培養し、培養液から 2 0 0 を採取し、 1 %ペプトン水溶液で 1 0 ^π 倍に希釈した後、普通寒天培地プレート上に 1 1 0 // 塗布し、 3 7 °Cで 2 4 時間培養して菌数（試験菌数）を測定した。

別に対照 1 として、上記（ 1 ) で調製したブドウ球菌の前培養液 2 0 を、上記（ 3 — 2 ) で調製した対照培地 1 の 2 ？に添加し、上記試験菌数の測定の場合と同様にして菌数（対照菌数 1 ) を測定した。更に対照 2 として、上記（ 1 ) で調製したブドウ球菌の前培養液 2 0 ^を、上記（ 3 一 3 ) で調製した対照培地 2のこ添加し、上記試験菌数の測定の場合と同様にして菌数（対照菌数 2 ) を測定した。

生存率は次式で計算した。

生存率 1 = (試験菌数 Ζ対照菌数 1 ) X 1 0 0 生存率 2 = (対照菌数 2 試験菌数 1 ) X 1 0 0 (注：後記の各表において、生存率 2 は抗菌性ぺプチドまたはラクトフヱリン分解物の濃度が 0の行に表示される）

試験例 1

前記、試料の調製の（ 2 ) ー①記載の抗菌性べプチド (配列番号 2 6 ) の最終濃度を 1 当たり 0 、 0 . 5 g、 1 mgおよび 2 mgに、（ 3 ) 記載のラクトフヱリンの最終濃度を 1 771^当たり 0 mg、 0 . 1 mg . 1 および 1 0 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

試験結果は表 1 に示すとおりである。表 1 から明らかなように、ラクトフエリンが抗菌性べプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、ラクトフエリンを添加し、抗菌性べプチドを添加しなかった場合、殺菌効果は全く認められな力、つた。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性ぺプチドとラクトフリンとの相乗効果 0"、あるしとは明らかである。なお、上記の抗菌性ぺプチド以外の抗菌性ぺプチド、およびラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合もラクトフエリンにより殺菌効果が増強されることが認められた。

1

試験例 2

前記、試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 5 mg、 1 mgおよび 2 に、（ 4 ) 記載のカゼインホスホペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 、 1 mg、 1 0 mgおよび 2 0 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 2 に示すとおりである。表 2から明らかなように、カゼインホスホペプチドが抗菌性ぺプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、力ゼインホスホペプチドを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかった場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性ペプチドと力ゼィンホスホぺプチドとの相乗効果であることは明らかである。なお、上記の抗菌性ペプチド以外の抗菌性ぺプチド、およびラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合もカゼインホスホペプチドにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 2

試験例 3

前記、試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 ^当たり 0 m_g、 0 . 5 mg、 1 _mgおよび 2 mgに、（ 5 ) 記載のトコフエロールの最終濃度を当たり 0 mg、 0 . 1 mg、 0 . 5 mgおよび 1 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験結果は表 3 に示すとおりである。表 3 から明らかなように、トコフヱロールが抗菌性ペプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、トコフ口一ルを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかつた場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性ペプチドとトコフヱロールとの相乗効果であることは明らかである。なお、上記の抗菌性ペプチド以外の抗菌性ペプチド、およびラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合もトコフヱロールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 3

=ίフエ D — -ル生存率

濃抗菌性べプチド濃度（mg/ ) 〔、 ID P mf,ノ 0 0.5 1 2

0 100 77 35 12

0. 1 101 33 15 5. 2

0.5 113 14 6.3 2. 4

1 112 7.9 3.5 0. 9 試験例 4

前記、試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 5 、 1 および 2 に、（ 6 ) 記載の β — シク iデキストリンの最終濃度を 1 当たり 0 、 0 . 1 mg、 1 および 2 . 5 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験結果は表 4 に示すとおりである。表 4から明らかなように、 ^ーシクロデキストリンが抗菌性ぺプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、 /5 — シクロデキストリンを添加し、抗菌性べプチドを添加しなかった場合、殺菌効果は殆ど認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドと一シクロデキストリンとの相乗効果であることは明らかである。なお、上記の抗菌性べプチド以外の抗菌性べプチド、およびラクトフエリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合も 3 — シクロデキストリンにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 4 β ーシクロデキ生存率

ストリン濃度抗菌性べプチド濃度（mgZ ) i g/ τη£) 0 0.5 1 2

0 100 45 17 8. 9

0. 1 100 38 22 6. 4

1 109 11 3.6 1. 4

2.5 88 2.5 1. 1 0. 2 試験例 5

前記、試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり. 0 mg、 0 . 5 mg、 1 mgおよび 2 mgに、（ 7 ) 記載のモノカプリロイルグリセロールの最終濃度 1 当たり 0 m_g、 0 . 5 mg、 1 mgおよび 2 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

試験結果は表 5 に示すとおりである。表 5 から明らかなように、モノカプリロイルグリセロールが抗菌性ぺプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、モノカプリロイルグリセロールを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかつた場合、 1 mgZ の濃度までは殺菌効果は全く認められなかった。モノカプリロイルグリセ口一ルの濃度が 2

の場合も抗菌性べプチドと併用すると、モノカプリロイルグリセロール単独使用（濃度 2 nig /mi) 、或いは抗菌性ペプチド単独使用（各濃度）のときと比較して格段に殺菌効果が増強されるので、抗菌性ぺプチドとモノカプリロイルグリセロールとが相乗効果を有することは明らかである。なお、上記の抗菌性ぺプチド以外の抗菌性べプチド、およびラクトフェリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合もモノカプリロイルグリセロールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 5 生存 ∑

モノカプリロイ

ノレグリセ口一ノレ抗菌性べプチド濃度 ( / id ) 濃度

( rag/ rd ) 0 0.5 1 2

0 100 79 38 9.5

0.5 103 81 40 7.3

1 115 18 6. 0 1.5

2 35 0. 1 0. 03 0.01 試験例 6

前記試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 、 0 . 5 mg、 1 mgおよび 2 mg に、（ 8 ) 記載のエチルアルコールの最終濃度を 1 ^当たり 0 mg、 1 、 1 0 mgおよび 2 0 m_gに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験結果は表 6 に示すとおりである。表 6 から明らかなように、低濃度のエチルアルコールが抗菌性べプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、ェチルアルコールを添加し、抗菌性べプチドを添加しなかつた場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがつて、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドとェチルァルコールとの相乗効果であることは明らかである。なお上記の抗菌性べプチド以外の抗菌性べプチド、およびラクトフユリン分解物についても同様の試験を行なったがこの場合もエチルアルコールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 6

試験例 7

前記、試料の調製の（ 2 ) ー①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 mg 0 . 5 mg 1 mgおよび 2 mgに、（ 9 ) 記載のグリセロールの最終濃度を 1 当たり β mg 1 mg 1 0 mgおよび 2 0 mgに、それぞれ調整し生存率試験を行つた。

この試験結果は表 Ί に示すとおりである。表 7から明らカ、なように、グリセ口ールが抗菌性べプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、グリセロールを添加し、抗菌性べプチドを添加しなかった場合、殺菌効果は全く認められなかつた。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドとグリセロールとの相乗効果であることは明らかである。なお、上記の抗菌性べプチド以外の抗菌性べプチド、およびラクトフェリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合もグリセロールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

7 生存中

グリセローノレ

濃度抗菌性べプチド濃度 ( mg/ 7i )

( mg/m £ )

0 0. 5 1 2

0 100 85 35 7. 2

1 100 9. 1 1. 6 0. 7

10 116 4. 5 2. 5 0. 9

20 123 5. 2 1. 7 1. 1

試験例 8

前記、試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 5 mg . 1 m_gおよび 2 mgに、（10)記載のプロピレングリコールの最終濃度を 1 当たり 0 mg、 1 mg . 1 0 mgおよび 2 0 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行つた。

試験結果は表 8 に示すとおりである。表 8 から明らかなように、プロピレングリコールが抗菌性ペプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、プロピレングリコールを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかつた場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性ペプチドとプロピレングリコールとの相乗効果であることは明らかである。なお上記の抗菌性ペプチド以外の抗菌性ペプチド、およびラクトフェリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合もプロピレングリコールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 8 プロピレングリ生存率

コール濃度抗菌性べプチド濃度（ mg, mi) mg/ mi 0 0.5 1 2

0 100 61 35 20

1 82 23 5.5 3. 2

10 118 9.8 7.5 1. 5

20 118 5.6 5.2 1. 8

試験例 9

前記、試料の調製の（ 1 ) ー①記載のラクトフリン分解物 1 の最終濃度を 1 7ι£当たり 0 mg、 1 0 mg、 2 0 mg および 4 0 mgに、（11 )記載の E D T A · ニナトリウムの最終濃度 1 7 ^当たり 0 mg、 0 . 1 mg, 1 mgおよび 5 にそれぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 9 に示すとおりである。表 9 から明らかなように、 E D T A · ニナトリウムがラクトフエリン分解物の殺菌効果を増強することが確認された。また、 E D T A * ニナトリウムを添加し、ラクトフヱリン分解物 1 を添加しなかった場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強はラクトフヱリン分解物 1 と E D T A · ニナトリウムとの相乗効果であることは明らかである。なお、ラクトフヱリン分解物 1 に代えて抗菌性べプチドについても同様の試験を行なったが、この場合も E D T A · ニナトリウムにより殺菌効果が増強されることが認められた。

Π

y 生存；率

E D T A ·一

ナトリウムラク卜フェリン分解物濃度 mgz 7id ) 濃度

( mg, m ) 0 1 0 20 40

0 100 90 1 1 3. 7

0. 1 122 48 5. 2 1. 8

1 1 15 19 0. 4 0. 3

5 10 1 4. 5 0. 2 0. 1

試験例 1 0

前記、試料の調製の（ 1 ) ー①記載のラクトフニリン分解物 1 の最終濃度を 1？ ^当たり 0 mg、 1 0 mg、 2 0 mg および 4 0 に、（ 12 )記載のァスコルビン酸の最終濃度 1 当たり 0 mg、 0 . 1 mg、 0 . 5 mgおよび 1 に、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 1 0 に示すとおりである。表 1 0 から明らかなように、ァスコルビン酸がラクトフェリン分解物 1 の殺菌効果を増強することが確認された。またァスコゾレビン酸を添加し、ラクトフヱリン分解物 1 を添加しなかった場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強はラクトフヱリン分解物 1 とァスコルビン酸との相乗効果であることは明らかである。なお、ラクトフヱリン分解物 1 に代えて抗菌性べプチドについても同様の試験を行なつたが、この場合もァスコルビン酸により殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 0 ァスコノレビン酸生存 -率

濃度ラク卜フェリン分解物濃度 mg/ mi )

( mg/ mi ) 0 10 20 40

0 100 85 12 5.5

0. 1 122 41 11 2.6

0.5 115 15 2.5 0.8

1 132 17 0.8 0.2 試験例 1 1

前記、試料の調製の（ 1 ) ー①記載のラクトフエリン分解物 1 の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 1 0 mg. 2 0 mg および 4 0 mgに、（13)記載のクェン酸の最終濃度を 1 ^ 当たり 0 mg、 0 . 1 mg、 1 mgおよび 5 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行つた。

この試験の結果は表 1 1 に示すとおりである。表 1 1 から明らかなように、クェン酸がラクトフヱリン分解物 1 の殺菌効果を増強することが確認された。また、クェン酸を添加し、ラクトフヱリン分解物 1 を添加しなかつた場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがって上記の殺菌効果の増強はラクトフヱリン分解物 1 とクェン酸との相乗効果であることは明らかである。なお、ラクトフヱリン分解物 1 に代えて抗菌性ペプチドについても同様の試験を行なったが、この場合もクェン酸により殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 1

試験例 1 2

前記、試料の調製の（ 1 ) ー①記載のラクトフ二リン分解物 1 の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 1 0 mg、 2 0 mg および 4 0 mgに、（1 4 )記載のポリリン酸の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 1 mg , 1 および 5 に、それぞれ ― し、生存率試験を行つた。この試験の結果は表 1 2 に示すとおりである。表 1 2 から明らかなように、ポリリン酸がラクトフェリン分解物 1 の殺菌効果を増強することが確認された。また、ポリリン酸を添加し、ラクトフェリン分解物 1 を添加しなかった場合、殺菌効果は全く認められなかつた。したがつて、上記の殺菌効果の増強はラクトフヱリン分解物 1 とポリリン酸との相乗効果であることは明らかである。なお、ラクトフヱリン分解物 1 に代えて抗菌性べプチドについても同様の試験を行なったが、この場合もポリリン酸により殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 2 ポリリン酸生存 -率

濃度ラク卜フェリン分解物濃度 mg/ id )

( mg/ τπ& ) 0 10 20 40

0 100 74 8. 2 2. 2

0. 1 140 20 1. 1 0. 9

1 124 15 0. 3 1. 3

5 111 3. 5 0. 4 0. 3 試験例 1 3

前記、試料の調製の（ 2 ) —②記載の抗菌性ペプチド (配列番号 2 7 ) の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 5 m_g 、 l ingおよび 2 mgに、（ 1 5 )記載のキトサンの最終濃度を 1 ^当たり 0 、 0 . 0 0 4 mg , 0 . 0 2 mgおよび 0 . l mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 1 3 に示すとおりである。表 1 3 から明らかなように、キトサンが抗菌性ペプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、キトサンを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかった場合、殺菌効果は低かった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドとキトサンとの相乗効果であることは明らかである。なお、抗菌性ペプチドに代えてラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合もキトサンにより殺菌効果が増強されることが認められた < 表 1 3

試験例 1 4

前記、試料の調製の（ 2 ) ー②記載の抗菌性べプチドの最終濃度を 1 ^当たり 0 mg 0 · 3 mg 1 mgおよび 2 gに、（ 16 )記載の L 一システィンの最終濃度を 1 idヽナこり 0 mg 1 mg 5 mgおよび 1 0 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行つた。

この試験の結果は表 1 4 に示すとおりである。表 1 4 から明らかなように、 L 一システィンが抗菌性ペプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、 L 一システィンを添加し、抗菌性ぺプチドを添加しなかつた場合、殺菌効果は低かった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドと L 一システィンとの相乗効果であることは明らかである。なお、抗菌性べプチドに代えてラクトフヱリン分解物についても同様 Cの試験を行なつたが、この場合も L — システィンにより殺菌効果が増強されることが認められた

1 4

L 中

— システィン生存

濃 . 度抗菌性べプチド濃度 ( mg/ mi ) ( mg/ mi ) 0 0. 5 1 2

0 100 78 25 15

1 37 12 2. 3 0. 7

5 4. 5 2. 1 0. 09 0. 03

10 0. 3 0. 06 0. 試験例 1 5

前記、試料の調製の（ 1 ) ー②記載のラクトフエリン分解物 2 の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 1 0 mg , 2 0 mg および 4 0 mgに、（ Π )記載のポリエチレングリコール # 2 0 0 0 の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 1 mg , 1 0 mgおよび 2 O mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 1 5 に示すとおりである。表 1 5 力、ら明らかなように、ポリエチレングリコール # 2 0 0 0がラクトフエリン分解物 2の殺菌効果を増強することが確認された。また、ポリェチレングリコ一ル# 2 0 0 0 を添加し、ラクトフエリン分解物 2を添加しなかつた場合、殺菌効果はほとんど認められなかった。したがつて、上記の殺菌効果の増強はラクトフエリン分解物 2 とポリエチレングリコール # 2 0 0 0 との相乗効果であることは明らかである。なお、ラクトフヱリン分解物 2 に代えて抗菌性べプチドについても同様の試験を行なったが、この場合もポリエチレングリコール # 2 0 0 0 により殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 5 生存率）ポリエチレング

リコール #2000 ラク卜フ X りン分角军物濃度 { g/ id) 濃度

mg/ wl ) 0 10 20 40

0 100 42 26 11

1 69 39 20 9.4

10 69 34 54 5.5

20 62 8. 1 2.3 0.4

試験例 1 6

前記、試料の調製の（ 1 ) ー①記載のラクトフヱリン分解物 1 の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 1 0 mg. 2 0 mg および 4 0 mgに、（19)記載のコール酸の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 1 mg. 1 0 mgおよび 2 0 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行つた。

この試験の結果は表 1 6 に示すとおりである。表 1 6 から明らかなように、コ一ル酸がラクトフヱリン分解物 1 の殺菌効果を増強することが確認された。また、コ一ル酸を添加し、ラクトフェリン分解物 1 を添加しなかつた場合、殺菌効果は低かつた。したがって、上記の殺菌効果の増強はラクトフェリン分解物 1 とコール酸との相乗効果であることは明らかである。なお、ラクトフエリン分解物 1 に代えて抗菌性べプチドについても同様の試験を行なつたが、この場合もコ一ル酸により殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 6 生存率）コール酸濃度

ラク卜フ二リン分解物濃度 ( mg / τιι£ )

( mg ^ )

0 10 20 40

0 100 13 1. 0 0. 8

1 100 8. 1 0. 4 0. 2

10 17 0. 9 0. 03 0. 01

20 18 0. 8 0. 03 0. 006

試験例 1 7

前記、試料の調製の（ 2 ) ー①記載の抗菌性べプチド (配列番号 2 6 ) の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 5

、 1 mgおよび 2 mgに、（ 18 )記載の 1 —モノラウロイル一 r a c —グリセ口ールの最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 5 mg、 1 および 2 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行つた。

この試験の結果は表 1 7 に示すとおりである。表 1 7 から明らかなように、 1 —モノラウロイノレ一 r a c —グリセロールが抗菌性べプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、 1 — モノラウロイルー r a c — グリセロールを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかつた場合、殺菌効果はほとんど認められなかった。したがつて、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドと 1 一モノラウロイノレ一 r a c ーグリセロールとの相乗効果であることは明らかである。なお、抗菌性ペプチドに代えてラクトフエリン分解物についても同様の試験を行なったがこの場合も 1 —モノラウロイノレ一 r a c ーグリセロールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 7

1 一モノラウ口生存中干、 ( %) ィノレ一 r a c —

グリセ口一ノレ抗菌性べプチド濃度 (mg/ ? ) 濃度

{mg/ mi) 0 0.5 1 2

0 100 102 92 41

0.5 104 94 77 25

1 88 73 46 12

2 50 20 2. 3 0.8

試験例 1 8

前記、試料の調製の（ 2 ) ー①記載の抗菌性べプチドの最終濃度を 1 当たり 0 m_g 、 0 . 5 mg , 1 mgおよび 2 mgに、（18)記載の 1 一モノミリストイル一 r a c — グリセロールの最終濃度を 1 7 ^当たり 0 _mg、 0 . 5 mg . I mg および 2 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 1 8 に示すとおりである。表 1 8 カヽら明らかなように、 1 一モノミリストィル一 r a c - グリセロールが抗菌性ぺプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、 1 一モノミリストイルー r a c ーグリセロールを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかつた場合、殺菌効果は低かった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドと 1 一モノミリストイル一 r a c —グリセロールとの相乗効果であることは明らかである。なお、抗菌性べプチに代えてラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合も 1 —モノミリストイノレ一 r a c —グリセロールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 8

1 一モノミリス生存率

トイノレ一 r a c

— ク" リセ π —ノレ抗菌性ぺプチド濃度 V in 6 / 7ιί ノ濃度

nig/ ml ) 0 0.5 1 2

0 100 85 56 23

0.5 129 41 11 5.3

1 93 13 3. 1 1.2

2 7 0.3 0. 04 0.005

試験例 1 9

前記、試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 5 mg 1 mgおよび 2 mgに、（18)記載の 1 —モノステアロイルー r a c — グリセロールの最終濃度を 1 当たり 0 _mg、 0 . 5 mg、 1 mg および 2 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った - この試験の結果は表 1 9 に示すとおりである。表 1 9 から明らかなように、 1 ーモノステアロイルー r a c — グリセロールが抗菌性べプチドの殺菌効果を増強することが確認された。また、 1 —モノステアロイルー r a c — グリセロールを添加し、抗菌性ペプチドを添加しなかつた場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがつて、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドと 1 一モノステアロイルー r a c — グリセロールとの相乗効果であることは明らかである。なお、抗菌性ペプチドに代えてラクトフエリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合も 1 —モノステアロイルー r a c ーグリセロールにより殺菌効果が増強されることが認められた。

表 1 9

1 ーモノステア生存率

ロイゾレー r a c

ーグリセ口一ル抗菌性べプチド濃度 ( / id ) 辰

( mg/ mi ) 0 0. 5 1 2

0 100 69 43 21

0. 5 1 16 74 53 18

1 133 48 19 5. 5

2 98 25 5. 3 1. 7

試験例 2 0

前記、試料の調製の（ 2 ) ー②記載の抗菌性べプチドの最終濃度を 1 ^当たり 0 m_gおよび 1 mgに、（18 )記載の 1 一モノラウロイルー r a c ーグリセロールの最終濃度を 1 当たり 0 および 0 . 5 呢に、さらに試料の調製の（ 3 ) 記載の牛ラクトフエリンの最終濃度を当たり ◦ mgおよび 1 に、それぞれ調整し、生存率試験を行つた。この試験の結果は表 2 0 に示すとおりである。表 2 0 カヽら明らかなように、 1 一モノラウロイノレ一 r a c ーグリセロールおよび牛ラクトフヱリンが抗菌性べプチドの殺菌効果をより一層増強することが確認された。なお、抗菌性べプチドに代えてラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なつたが、この場合も殺菌効果が増強されることが認められた。

表 2 0

試験例 2 1

前記、試料の調製の（ 2 ) —①記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 mgおよび 1 mgに、（1 8 )記載の 1 一モノラウロイルー r a c ーグリセ口一ルの最終濃度を 1 当たり 0 および 0 . 5 に、さらに（ 1 5 )記載のキトサンの最終濃度を 1 当たり 0 gおよび 0 . 0 1 mg に、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 2 1 に示すとおりである。表 2 1 カヽら明ら力、なように、 1 一モノラウロイルー r a c —グリセロールおよびキトサンが抗菌性ペプチドの殺菌効果をより一層増強することが確認された。なお、抗菌性べプチドに代えてラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合も殺菌効果が増強されることが認められた。

表 2 1

試験例 2 2

前記、試料の調製の（ 2 ) ー①記載の抗菌性べプチドの最終濃度を 1 ^当たり 0 および 1 mgに、（1 8 )記載の 1 一モノラウロイノレ一 r a c — グリセロールの最終濃度を 1 当たり 0 mgおよび 0 . 5 mgに、さらに（1 9 )記載のコール酸の最終濃度を 1 当たり 0 _mgおよび 1 mgに、それぞれ調整し、生存率試験を行った。

この試験の結果は表 2 2 に示すとおりである。表 2 2 力、ら明らかなように、 1 —モノラウロイノレ _ r a c ーグリセロールおよびコール酸が抗菌性べプチドの殺菌効果をより一層増強することが確認された。なお、抗菌性べプチドに代えてラクトフヱリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合も殺菌効果が増強されることが認められた。

表 2 2

( Π ) ラクトフエリン類の分解物およびノまたはラク卜フェリン関連抗菌性ペプチドと、抗生物質または抗生物質および特定の化合物を有効成分とする抗菌剤に関する試験例。

まず以下の各試験例に共通する試料の調製、および試験方法についてまとめて記載する。 . 試料の調製

(1) ラクトフエリン分解物（粉末）

実施例 1 記載の方法により調製して使用した。

(2) 抗菌性ペプチド（粉末）

実施例 4 記載の方法により調製して使用した。

(3) 抗生物質

表 2 3 および表 2 7 に記載の 1 2 種類の抗生物質

(市販品）を使用した。

(4) ラクトフヱリン：市販の牛のラクトフヱリン（シグマ社製）を使用した。

(5) リゾチーム：市販の卵白リゾチーム（生化学工業社製）を使用した。

(6) 1 — モノカプリロイノレ一 r a c — グリセロール：市販品（シグマ社製）を使用した。

. 試験方法

(1) 供試菌の前培養液の調製

凍結保存した供試菌懸濁液から 1 白金耳を採取し、トリプチケース · ソィ寒天培地（ B B L社製) に塗沫して 3 7 °Cで 1 6 時間培養し、トリプチケース · ソィ寒天培地の表面に育成したコロニーを白金耳でカヽき取り、 2 . 1 % ミユウラー · ヒントン · ブロス (ディフコ社製）に 3 7 °Cで数時間培養し、 3 X 1 0 ⁸ Ζ τ^の菌濃度に増殖した対数期の菌液を前培養液とした。

(2) 試験培地の調製

前記 1記載の試料の調製の（ 1 ) または（ 2 ) で調製したラクトフヱリン分解物または抗菌性べプチドの水溶液、および（ 3 ) 抗生物質の水溶液を滅菌フィルター（アドバンテック社製）で除菌し、最終濃度 2 . 1 %になるように調製した基本培地（ミユウラー，ヒントン · ブロス）に添加してそれぞれ規定した濃度に調整し、試験培地を調製した。

(3) 抗菌効果試験

上記（ 1 ) で調製した供試菌の前培養液を 2 . 1 % ミユウラ — · ヒントン · ブロスで 2 X 1 0 ⁶ / miの割合に希釈した 1 0 0 / ·βを、上記（ 2 ) で調製した試験培地 1 0 0 ^ _g に添加し、 3 7 °Cで 1 6時間培養し、培地の濁りの有無より抗菌効果を調べた。

(4) 生存率試験

上記（ 1 ) で調製した供試菌の前培養液 2 O ^を上記（ 2 ) で調製した試験培地 2 に添加し、 3 7 でで 1 時間培養し、培養液から 2 0 0 を採取し

1 %ペプトン水溶液で 1 0 ⁿ 倍に希釈した後、普通寒天培地プレート上に 1 1 0 z 塗布し、 3 7でで

2 4時間培養して菌数（試験菌数）を測定した。別に対照として、上記（ 1 ) で調製した供試菌の前培養液 2 0 ^ ^ を、 2 . 1 % ミユウラー · ヒントン • ブロス 2 に添加し、上記試験菌数の測定の場合と同様にして菌数（対照菌数）を測定した。

次式により生存率を算出した。

生存率 = (試験菌数/対照菌数） X 1 0 0 試験例 2 3

前記、試料の調製の（ 1 ) 記載のラクトフエリン分解物の最終濃度を 1 当たり 0 mg、 0 . 4 mg、 1 . 6 mgおよび 6 . 4 mgあるいは、試料の調製の（ 2 ) 記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 当たり 0 〃 g、 1 6 z g、 6 4 / 、ぉょび 2 5 6 〃に、（ 3 ) 記載の抗生物質の最終濃度を当たり 0 〃 g、 0 . 0 I μ. g , 0 . 1 β g . 1 gおよび 1 0 〃 g にそれぞれ調整し、ェシェリキア · コリ 0 — 1 1 1 およびスタフイロコッカス ' ァウレウス（ J C M 2 1 5 1 ) に対する抗菌効果を調べ、各濃度の抗菌べプチドを共存させた場合の抗生物質の発育阻止濃度を求めた。

試験結果は表 2 3 —表 2 6 に示したとおりである。表 2 3 _表 2 6 から明らかなように、ラクトフエリン分解物または抗菌性べプチドが抗生物質の抗菌効果を増強することが確認された。また、ラクトフエリン分解物または抗菌性ペプチドを添加し、抗生物質を添加しなかった場合、殺菌効果はみとめられなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強はラクトフ二リン分解物または抗菌性べプチドと抗生物質との相乗効果であることは明らかである。なお、上記の抗菌性ペプチド以外の抗菌性ぺプチドについても同様の試験を行なったが、この場合も抗生物質の抗菌効果を増強させることが認められた。

2 3

供試菌ェシリキア · コリ 1 1 1 抗生物止濃度

抗生物質名ラクトフエリン分解物濃度

( g/ M )

0 0.4 1.6 6.4 ぺニシリン >1 1 0. 1

J >1 1 n n 1 つマ π手ン >1 >1 0.01 エリスロマイシン >1 1 0. 1 力 +マイシソ >1 >1 0.1 スタフシリン >1 >1 >1 0. 1 ストレプトマイシン >1 >1 0.01 ホスタサイクリン 1 1 0. 1 ゲン夕マイシン 1 1 0.1 0.1 ポリミキシン B . >1 >1 ' 0.1 0.01 クロラムフエニコ一 >1 >1 >1 0.1 ル

表 2 4

供試菌

ス夕フイロコッカス * ァウレウス J C M 2 1 5 1

表 2 5

供試菌ェシヱリキア · コリ 1 1 1

杭 Uし牛 Γ . 物阻止濃度

抗生物質名抗 ¾ 性べプチド濃度

( H g/ml )

O r p

U 1 b b4 ぺニシリン >1 >1 1 0.1 アンピシリン >1 1 1 0.1 セファロチン >1 >1 1 0.01 エリス、

口フィンノ > 1 1 1 0.01 カナマイシン >1 >1 1 0.01 スタフシリン >1 >1 1 0.01 ストレプトマイシン >1 >1 1 0.01 ホス夕サイクリン 1 1 1 0.1 ゲンタマイシン 1 1 0.1 0.1 ポリミキシン Β >1 >1 0.1 0.1 クロラムフエニコ一ノレ >1 >1 1 0.1

表 2 6

供試菌

スタフイロコッカス，ァウレウス J C M 2 1 5 1

試験例 2 4

前記、試料の調製の（2) 記載の抗菌性べプチドの最終濃度を 1 ^当たり 0 g、 1 0 z g、 1 0 0 〃 g、および 1 0 0 0 g に、（3 ) 記載の抗生物質の最終濃度を 1 当たり 0 g ^ 1 および 5 0 / g に、それぞれ調整し、抗生物質耐性を有する微生物〔メチシリン耐性スタフイロコッカス . ァウレウス（野性株）〕の生存率試験を行った。

この試験の結果は表 2 7 に示したとおりである。表 2 7 から明らかなように、抗菌性ペプチドが抗生物質の殺菌効果を増強することが確認された。また、抗菌性ぺプチドを添加し、抗生物質を添加しなかった場合、殺菌効果は全く認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドと抗生物質との相乗効果であることは明らかである。なお、上記の抗菌性ペプチド以外の抗菌性べプチド、およびラクトフエリン分解物についても同様の試験を行なったが、この場合も抗生物質の殺菌効果を増強させることが認められた。

2 7 ミノマイシン生存率 { % ) 濃度抗菌性べプチド濃度 ( g/id )

( 1 i ) 0 10 100 1000

0 100 69 60 3.6

10 32 21 21 0.01

50 5.2 4.8 2. 4 <0.002 試験例 2 5

前記、試料の調製の（2) 記載の抗菌性ペプチドの最終濃度を 1 7^当たり ◦ 〃 g、 1 0 g、あるいは抗菌性ぺプチドと試料の調製の（4) 、 (5) 、 (6) 記載のラクトフエリン、リゾチームまたは 1 一モノカプリロイルー r a c ーグリセロールの最終濃度を当たり 1 0 〃 gとそれぞれ 1 Q Q z gに、（3) 記載の抗生物質の最終濃度を 1 ^当たり O i gおよび l // gに、それぞれ調整し、スタフイロコッカス . ァゥレウス（JCM- 2151) の生存率試験を行つた。

この試験の結果は表 2 8 に示したとおりである。表 2 8から明らかなように、抗菌性ペプチドとラクトフヱリン、リゾチームまたは 1 一モノカプリロイルー r a c — グリセ口ールが抗生物質の殺菌効果を増強することが確認された。また、抗菌性ペプチドとラクトフヱリン、リゾチームまたは 1 一モノカプリロイノレ一 r a c — グリセロールを添加し、抗生物質を添加しなかった場合、殺菌効果はほとんど認められなかった。したがって、上記の殺菌効果の増強は抗菌性べプチドとラクトフェリン、 . リゾチームまたは 1 —モノカプリロイルー r a c ーグリセロールと抗生物質との相乗効果であることは明らかである。なお、上記の抗菌性ペプチド以外の抗菌性ペプチドおよびラク卜フリン分解物と金属をキレ一卜する蛋白質、カゼイン分解物、トコフヱロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコール類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコルビン酸、ァスコノレビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、あるいはコール酸と抗生物質とについても同様の試験を行なったが、この場合も抗生物質の殺菌効果を増強させることが認められた。

2 8

以上、試験例によって詳しく説明したとおり、この発明によって、広範囲の微生物に対して優れた抗菌作用を有し、食品や医薬品等に使用しても極めて安全な抗菌剤が提供される。この抗菌剤は少量で抗菌効果を呈するので、食品等の物品の処理に使用した場合にも風味への影響がほとんどない。

また、有効成分として特定の抗生物質を含有するこの発明の抗菌剤は、その抗生物質の抗菌作用が著しく増強されるため、その使用量を大幅に低減することができるしかも、そのような抗菌剤は、ある種の抗生物質に耐性を有する微生物にも顕著な抗菌効果を示す。

次に実施例を示してこの発明を更に具体的かつ詳細に説明するが、この発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例 1

牛乳から分離したままの市販のラクトフエリン（ベルギ一のォレオフイナ社製） 5 0 gを精製水 9 5 0 g に溶解し、得られた溶液に 1 規定の塩酸を添加して p Hを 2 に調製し、 1 2 0 °Cで 1 5 分間加熱し、冷却して、ラクトフエリン分解物溶液（ラクトフエリン分解物濃度： 5 % ) 約 1 0 0 0 gを得た。このラクトフヱリン分解物の分解度は 9 %であった。

上記のラクトフエリン分解物溶液を減圧濃縮し、凍結乾燥し、ラクトフ二リン分解物の粉末約 4 9 gを得た。このラクトフヱリン分解物粉末 1 0 g に E D T A · ニナトリウム（和光純薬社製） 1 gを均一混合し、抗菌剤を： siした。実施例 2

牛乳から分離したままの市販のラクトフエリン（ベルギ一のォレオフイナ社製） 1 kgを精製水 9 kgに溶解し、

2 モル濃度のクェン酸を添加して p Hを 2.5 に調製し、市販の豚ペプシン（ 1 : 1 0， 0 0 0。和光純薬工業社製） 3 0 gを添加して均一に混合し、 3 7 °Cに 1 8 0分間保持し、 8 5 °Cで 1 0分間加熱して酵素を失活させ、のち冷却し、ラクトフエリン分解物溶液（ラタトフエリン分解物濃度： 1 0 %) 約 1 0 kgを得た。このラクトフヱリン分解物の分解度は 11.3%であった。

上記のラクトフユリン分解物溶液を減圧濃縮し、凍結乾燥して、ラクトフリン分解物の粉末約 9 6 0 gを得た。このラクトフヱリン分解物粉末 1 0 0 gにクェン酸

(ナカライテスク社製） 3 0 gを均一混合して、抗菌剤を調製した。

実施例 3

市販の牛ラタトフエリン（シグマ社製） 5 0 mgを精製水 0.9 に溶解し、 0 . 1規定の塩酸で p Hを 2 . 5 に調製し、のち市販の豚ペプシン（シグマ社製） I mgを添加し、 3 7 °Cで 6 時間加水分解した。次いで 0.1 規定の水酸化ナトリウムで P Hを 7 . 0 に調整し、 8 0 °Cで 1 0分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、 1 5， 0 0 0 r p mで 3 0分間遠心分離し、透明上清を得た, この上清 1 0 0 ^ を T S Kゲル O D S — 1 2 0 T (東ソ一社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ 0 . 8 Z分の流速で試料注入後 1 0 分間 0 . 0 5 % T F A ( トリフルォロ酢酸）を含む 2 0 %ァセトニトリルで溶出し、のち 3 0 分間 0.05% T F Aを含む 2 0 〜 6 0 %のァセトニトリルのグラジェントで溶出し、 2 4 〜 2 5 分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を 2 % (WZV) の濃度で精製水に溶解し、再度 T S Kゲル O D S — 1 2 0 T (東ソ一社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、 0 . 8 Z分の流速で試料注入後 1 0 分間 0 . 0 5 % T F Aを含む 2 4 %ァセトニトリルで溶出し、のち 3 0 分間 0 . 0 5 % T F Aを含む 2 4 〜 3 2 %のァセトニトリルのグラジェントで溶出し、 3 3 . 5 〜 3 5 . 5 分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を 2 5 回反復し、真空乾燥し、抗菌性べプチド約 1.5 mgを得た。

上記の抗菌性ペプチド^ 6 N塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した ( 同一の試料を気相シークヱンサー（アプライド * バイオシステムズ社製）を用いて 2 5 回のエドマン分解を行ない、 2 5 個のアミノ酸残基の配列を決定した。また D T N B ( 5 ， 5 — ジチオービス（ 2 —ニトロべンゾイツク • アンド））を用いたジスルフィド結合分析法〔アナリティ力ノレ · ノィオケミス卜リ― (Analytical Biochemis try). 第 6 7巻、第 4 9 3頁、 1 9 7 5年〕によりジスルフィド結合が存在することを確認した。

その結果、このペプチドは、 2 5個のアミノ酸残基からなり、 3番目と 2 0番目のシスティン残基がジスルフイド結合し、 3番目のシスティン残基から N—末端側に 2個のアミノ酸残基が、 2 0番目のシスティン残基から C一末端側に 5個のアミノ酸が、それぞれ結合した、配列番号 2 6のアミノ酸配列を有していることが確認された。

上記の抗菌性ペプチド粉末 1 0 0 に牛ラクトフヱリン（シグマ社製） 1 gを均一混合して、抗菌剤を調製した。

実施例 4

ペプチド自動合成装置（ファルマンァ L K Bバイオテクノロジ一社製。 L K B Bioynx 4 1 了 0 ) を用い、シェパード等〔ジャーナル · ォブ · ケミカル · ソサイエティ一 · ノヽ。一キン I (Journal of Chemical Society Perkin

I ) 、第 5 3 8頁、 1 9 8 1年〕による固相ペプチド合成法に基づいて抗菌性べプチドを次のようにして合成した。

ァミン官能基を 9 一フルォレニルメトキシカルボニル基で保護したアミノ酸に、 N， N— ジシクロへキシルカルポジィミドを添加して所望のァミノ酸の無水物を生成させ、この F m o c —アミノ酸無水物を合成に用いた。ぺプチド鎖を製造するために C 一末端のリジン残基に相当する F m o c — リジン無水物を、そのカルボキシル基を介し、ジメチルァミノピリジンを触媒としてウノレトロシン A樹脂（ファルマンァ L K B ノくィォテクノロジ一社製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメチルホルムアミドで洗浄し、 C 一末端アミノ酸のアミン官能基の保護基を除去する。のちアミノ酸配列の C 一末端から 2 番目に相当する F m 0 c 一リジン無水物を前記 C 一末端ァミノ酸残基を介して樹脂に固定されたリジンの脱保護アミン官能基にカップリングさせた。以下同様にして順次メチォニン、アルギニン、トリブトフアン . グルタミン、トリプトファン、アルギニン、アルギニンスレオニン、およびリジンを固定した。全部のアミノ酸の力ップリングが終了し、所望のァミノ酸配列のぺプチド鎖が形成された後、 9 4 % T F A 、 5 %フヱノール、および 1 %エタンジオールからなる溶媒でァセトアミドメチル以外の保護基の除去およびべプチドの脱離を行ない、高速液体クロマトグラフィーによりペプチドを精製し、この溶液を濃縮し、乾燥して、ペプチド粉末を得た ₍ ここに得られたぺプチドについてアミノ酸分析計を甩いて常法によりアミノ酸組成を分析し、配列番号 2 7 のアミノ酸配列を有することを確認した。

上記の合成によって調製した抗菌性ペプチド粉末 1 0 0 mgにカゼインホスホペプチド（試験例 3 で用いたと同じものを用いた） 2 gを均一混合し、抗菌剤を調製した実施例 5

実施例 1 と同一の方法により調製したラクトフエリン分解物粉末 4 O gにストレプトマイシン 2 を均一に混合し、抗菌剤を調製した。

実施例 6

実施例 2 と同一の方法により調製したラクトフエリン分解物粉末 1 0 0 gにポリミキシン B 1 gを均一に混合して、抗菌剤を調製した。

実施例 7

実施例 2 と同一の方法により調製したラクトフエリン分解物粉末 5 0 0 g にォキシテトラサイクリン 0 . l g を均一混合して、抗菌剤を調製した。

実施例 8

実施例 3 と同一の方法により調製した抗菌性ペプチド粉末 1 0 O mgにテトラサイクリン系抗生物質ミノサイクリン 1 m_gを均一に混合して、抗菌剤を調製した。

実施例 9

実施例 3 と同一の方法により調製した抗菌性べプチド粉末 1 0 0 にペニシリン G 1 mgを均一混合して、抗菌剤を調製した。

実施例 1 0

実施例 3 と同一の方法により調製した抗菌性べプチド粉末 1 0 mgにリゾチーム 1 0 0 mgとペニシリン G 1 nigを均一混合して、抗菌剤を調製した。

実施例 1 1

実施例 4 と同一の方法により調製した抗菌性べプチド粉末 1 0 0 mgにゲンタマイシン 0 . 5 mgを均一に混合し、抗菌剤を調製した。

実施例 1 2

常法により次の組成の点眼薬（水溶液）を製造した。

ホウ酸 1 . 6 0 ( % ) 実施例 4 の抗菌剤 0 . 1 5 メチルセルロース 0 . 5 0 実施例 1 3

常法により次の組成のチューィンガムを製造した。

ガムべ一ス 2 5 . 0 0 ( % ). 炭酸カルシウム 2 . 0 0 香料 1 . 0 0 実施例 2 の抗菌剤 0 . 0 2 ソゾレビトール粉末 7 1 . 9 8 実施例 1 4

常法により次の組成の歯磨を製造した。第二リン酸カルシウム · 2水和物 3 6. 9 3 (%) ソノレビト一ノレ 4 5， 0 0 グリセリン 1 5. 0 0 カノレボォキシメチルセルロース · ナトリウム

1 . 5 0 ソルビタン脂肪酸エステル 0. 5 0 サッカリンナトリウム 1 . 0 0 実施例 1 の抗菌剤 0. 0 7 実施例 1 5

常法により次の組成の皮膚洗浄液を製造した。この皮膚洗浄液は、使用時には水で 5 0倍に希釈して使用する。

塩化ナトリウム 8. 0 ( % ) 実施例 3 の抗菌剤 Q . 8

精製水 9 1 . 2

実施例 1 6

常法により次の組成の外用剤（軟膏）を製造した。

パラォキシ安息香酸ェチル 0. 1 0 (%) パラォキシ安息香酸ブチル 0. 1 0 ラウロマクロゴーノレ 0. 5 0 セタノ一ゾレ 1 8. 0 0 白色ワセリン 4 0. 0 0 精製水 4 0. 8 5 配列番号 2 7 のペプチド 0. 1 5 1 _モノミリストイノレ 0. 3 0 一 r a c — グリセローノレ

実施例 1 7

常法により次の組成のハンドローションを製造した。

カーボワックス 1 5 0 0 8. 0 0 {.%) ァノレコール 5. 0 0 プロピレングリコール 5 2. 0 0 精製水 3 3. 9 0 香料 0. 3 0 配列番号 2 6 のペプチド 0. 2 0

1 一モノラウロイル 0. 2 0

一 r a c — ク、 ' リセローノレ

コール酸 0. 4 0 実施例 1 8

常法により次の組成の点眼薬（水溶液）を製造した。

ホウ酸 Γ . 6 0 (%) 実施例 5 の抗菌剤 0. 1 5 メチルセルロース 0. 5 0 実施例 1 9

常法により次の組成の皮膚外用剤を製造した。

パラォキシ安息香酸ェチル 0. 1 (%) パラォキシ安息香酸ブチル 0. 1

ラウロマクロゴーノレ 0. 5 セタノ一ル 2 0. 0 白色ワセリン 4 0. 0 水 2 9. 3 実施例 6 の抗菌剤 1 Q . 0 実施例 2 0

常法により次の組成の動物用飼料を製造した。

魚粉 3 0. 0 (% 大豆かす 3 9. 9 小麦 3 0. 0 実施例 7の抗菌剤 0. 1 実施例 2 1

常法により次の組成の皮膚外用剤を製造した。

パラォキシ安息香酸ェチル 0. 1 (%) パラォキシ安息香酸ブチル 0. 1 ラウロマクロゴーノレ 0. 5 セタノール 2 0. 0 白色ワセリン 4 0. 0 水 2 9. 3 実施例 8 の抗菌剤 1 0. 0 実施例 2 2

常法により次の組成の乳房炎治療薬を製造した。

1 ， 2 — ヒドロキシステアリン 1. 0 (%) グルセルモノステアレート 0. 5 ブチル化ヒドロキシァ二ソ一ル 0， 0 2 落花生油 9 3. 4 8 実施例 9 の抗菌剤 5. 0 実施例 2 3

常法により次の組成の皮膚外用剤を製造した。

パラォキシ安息香酸ェチル 0. 1 0/

( 70 ) パラォキシ安息香酸ブチル 0. 1 ラウロマクロゴ一ノレ 0. 5 セタノール 2 0. 0 白色ワセリン 4 0. 0 水 2 9. 3 実施例 1 0 の抗菌剤 1 0. 0 実施例 2 4

常法により次の組成の抗生物質製剤を製造した。

実施例 1 1 の抗菌剤 1 0 0. 0 ( % ) 産業上の利用可能性

この発明の抗菌剤は、各種の細菌、酵母、カビ等に対して強い抗菌作用を有する医薬品として利用できる。とくに、広範な抗生物質に耐性を有する微生物に対する予防および治療薬に利用できる。また、この発明の抗菌剤は、食品や医薬品等の各種物品を安全に効率よく抗菌処理するために利用できる。配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 11

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徵このペプチド、およびこのペプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Ly s Xaa Xa a Xa a Xa a Gin Xaa Xaa Me t Ly s Ly s

1 5 10

(上記配列において、 Xaa は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 2

配列の長さ： 11

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ペプチド

配列の特徵このペプチド、およびこのペプチドをフラグメントとして含むぺプチド配列：

Ly s Xa a Xa a Xa a Xa a Gin Xa a Xa a Met Arg Ly s

1 5 10

(上記配列において、 Xaa は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）

配列番号： 3

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徴このペプチド、およびこのペプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Ar Xa a Xa a Xa a Xa a Arg

1 5

(上記配列において、 Xaa は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 4

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徴このべプチド、およびこのペプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Ly s Xa a Xa a Xa a Xa a A r g

1 5

(上記配列において、 Xaa は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 5

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徴このべプチド、およびこのべプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Ly s Xaa Xaa Xaa Xaa Ly s

1 5

(上記配列において、 Xaa は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 6

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Ar Xaa Xaa Xaa Xaa L s

1 5

(上記配列において、 X は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 7

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Ar g Xaa Xaa Xaa A r

1 5

(上記配列において、 Xaa は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 8

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Ly s Xaa Xa a Xa a Ar g

1 5

(上記配列において、 Xaa は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 9

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジ一直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Arg Xaa Xaa Xaa Ly s

1 5

(上記配列において、 Xu は Cys を除く任意のアミノ酸残基を示す）配列番号： 1 0

配列の長さ： 6 配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徴このペプチド、およびこのペプチドをフグメントとして含むぺプチド

配列：

Phe Gin Trp Gin Arg Asn

1 5 配列番号： 11

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Phe Gin Trp Gin Arg

1 5 配列番号： 12

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸トポロジ一直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徴このぺプチド、およびこのべプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

G I n Trp G I n Ar g

1

配列番号： 13

配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸

トポ口ジ一直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Trp Gin Arg

1 配列番号： 14

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状配列の種類：ぺプチド

配列：

Ar g A r g Trp Gin Trp

配列番号： 15

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Arg Ar g Trp Gin

1 配列番号： 16

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド配列の特徴：このべプチド、およびこのべプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Trp Gin Trp Ar

1 配列番号： 17

配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Gin Trp Ar g

1 配列番号： 18

配列の長さ： 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Leu Arg Trp Gin Asn As

1 5 配列番号： 19

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Leu Ar Trp Gin Asn

1 5 配列番号： 20

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジ一直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徵このペプチド、およびこのペプチドをフグメントとして含むぺプチド配列：

Leu Ar g Trp Gin

1 配列番号： 2 1

配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Arg Trp iri n

1 配列番号： 22

配列の長さ： 20

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎮状

配列の種類ぺプチド

下記配列において、 2番の Cysと 1 9番の Cysがジスルフィド結合している。

配列：

Ly s Cys A r g A r g Trp Gin i r p Arg Me t Ly s Ly s Leu G 1 y Ala Pro 1 5 10 15

Se r 11 e Thr Cys Va 1

20

配列番号： 2 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：アミノ酸

トポロジ一直鎖状

配列の種類ぺプチド

下記配列において Cys*は、ジスルフィド結合の形成を防止するため、チオール基を化学的に修飾したシスティンを示す。

配列

Ly s Cys* Arg Ar Trp Gin Trp Arg Met Ly s Ly s Leu G 1 y Ala Pro 1 5 10 15

Ser lie Thr Cys* Va 1

20 配列番号： 24

配列の長さ： 2 0

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鑌状

配列の種類ぺプチド

下記配列において、 2番の Cysと 19番の〔がジスルフィド結合している。

配列：

Lys Cys Phe Gin Trp Gin Arg Asn Met Arg Lys Yal Arg Gly Pro 1 5 10 15

Pro Val Ser Cys He

20 配列番号： 25

配列の長さ： 20

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列：

Ly s Cy s* Ph e Gin T r p Gin A r g As n Met Ar g Lys Va I Arg G I y Pro 1 5 10 15

Pro Va 1 Ser Cys* lie

20 配列番号： 26

配列の長さ： 25

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

下記配列において、 3番の Cysと 2 0番の Cysがジスルフィド結合している。

配列：

Ph e Lys Cys Arg Ar T r Gin Trp Arg Met Lys Lys Leu G 1 y Ala 1 5 10 15

Pro Ser 11 e Th r Cys Va 1 Arg Ar A I a Phe

20 25 配列番号： 27

配列の長さ： 11

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列の特徴：このぺプチド、およびこのべプチドをフラグメントとして含むぺプチド

配列：

Lys T r Ar g Arg T rp Gin Trp Ar g Me t Ly s Ly s

1 5 10 配列番号： 28

配列の長さ： 38

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

下記配列において、 16番の（；と 33番の Cys とがジスルフィド結合している。配列：

Ly s Asn Va 1 Arg Trp Cy s Thr lie S e r Gin Pro G 1 u Trp Phe Ly s 1 5 10 15

Cy s Arg Ar Trp Gin Trp Arg Met Ly s Ly s Leu G 1 y Ala Pro S e r

20 25 30 lie Thr Cys Va 1 Arg Arg Ala Phe

35 配列番号： 2 9

配列の長さ： 32

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

下記配列において、 1 0番の Cysと 27番の Cys とがジスルフィド結台している。

配列：

Thr He Ser Gin Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gin Trp 1 5 10 15

Arg Me t Lys Lys Leu G 1 y A I a Pro Ser 11 e Thr Cys Va 1 Arg Ar

20 25 30

Ala Phe 配列番号： 3 0

配列の長さ： 47

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

下記配列において、配列の長さ 36であって 9番、 26番、及び 35番に Cysを有するぺプチドの、 9番の Cysと 26番の C"とがジスルフィド結合し、上記配列の長さ 36のぺプチドの 3 5番の C が、配列の長さ 1 1であって 1 0番に Cysを有するペプチドの 10番の Cysとがジスルフィド結合している。

配列

Val Ser Gin Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gin Trp Gin Arg Asn

1 5 10 15

Me t Arg Lys Val Arg G 1 y Pro Pro Val Sei Cys 11 e Lys Arg Asp

20 25 30 Ser Pro 〖le Gin Cys lie

35

G Arg Ar Ar Arg Ser Va 1 G I n Trp Cys Ala

1 5 10 配列番号： 31

配列の長さ： 5

配列の型：アミノ酸

トポロジー直鎖状

配列の種類ぺプチド

配列の特徴このペプチド、およびこのペプチドをフラグメントとして含むペプチド

配列：

Ly s Xaa Xaa Xaa Ly s

1 5

(上記配列において、 Xaaは Cysを除く任意のアミノ酸残基を示す）

Claims

請求の範囲

1 . ( A ) ラクトフヱリン類の分解物、ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（B ) 金属をキレートする蛋白質、トコフヱロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコ一ル類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物とを有効成分とする抗菌剤。

2 . 金属をキレートする蛋白質がラクトフヱリン類、トランスフェリン、コンアルブミン、カゼインホスホぺプチドである請求項 1 の抗菌剤。

3 . ( A ) ラクトフヱリン類の分解物、 .ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（C ) 抗生物質とを有効成分とする抗菌剤。

4 . ( C ) 抗生物質がペニシリン、半合成ペニシリン、セフニム系抗生物質、力ルバぺネム系抗生物質、モノバク夕厶系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ぺプタイド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフヱニコ一ル、マクロライド系抗生物質、リファマイシン、ノくンコマイシン、ホスホマイシン、化学合成抗菌剤、抗真菌剤、抗結核剤、ポリミキシン Bである請求項 3 の抗菌剤。

5 . ( A ) ラクトフヱリン類の分解物、ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（C ) 抗生物質と、（B ) 金属をキレートする蛋白質、リゾチーム、カゼイン分解物、トコフエロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコール類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコノレビン酸、ァスコルビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物とを有効成分とする抗菌剤 ,

6 . ( C ) 抗生物質がベニシリン、半合成べニシリン、セフム系抗生物質、力ルバぺネム系抗.生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ぺプタイド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフヱニコール、マクロライド系抗生物質、リファマイシン、バンコマイシン、ホスホマイシン、化学合成抗菌剤、抗真菌剤、抗結核剤、ポリミキシン Bである請求項 5 の抗菌剤。

7. 金属をキレートする蛋白質がラクトフヱリン類、トランスフェリン、コンァノレブミン、カゼインホスホぺプチドであ請求項 5 の抗菌剤。

8 . (A) ラクトフヱリン類の分解物、ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と ,、 (B) 金属をキレートする蛋白質、トコフヱロール、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコ一ル類、 E D T A、 E D T A塩、ァスコノレビン酸、ァスコノレビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物とを有効成分とする抗菌剤を用いて物品を処理する方法。

9 . 金属をキレ一トする蛋白質がラクトフヱリン類、トランスフェリン、コンアルブミン、カゼインホスホぺプチドである請求項 8 の抗菌剤を用いて物品を処理する方法。

1 0 . (A) ラクトフエリン類の分解物、ラクトフヱリン関連抗菌性ペプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（C) 抗生物質とを有効成分とする抗菌剤を用いて物品を処理する方法。

1 1 . (C) 抗生物質がペニシリン、半合成ペニシリンセフエム系抗生物質、力ルバぺネム系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ぺプタィド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ク口ラムフエニコーノレ、マクロラィド系抗生物質、リファマイシン、ノくンコマイシン、ホスホマイシン、化学合成抗菌剤、抗真菌剤、抗結核剤、ポリミキシン Bである請.求項 1 0 の抗菌剤を用いて物 □を処理する方法。

1 2 . ( A ) ラクトフヱリン類の分解物、ラクトフエリン関連抗菌性ペプチド、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、（C ) 抗生物質と、（B ) 金属をキレー卜する蛋白質、リゾチーム、カゼイン分解物、トコフエ口一ノレ、シクロデキストリン類、グリセリン脂肪酸エステル類、アルコ —ル類、 E D T A 、 E D T A塩、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸塩、クェン酸、クェン酸塩、ポリリン酸、ポリリン酸塩、キトサン、システィン、コール酸、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物とを有効成分とする抗菌剤を用いて物品を処理する方法 o

1 3 . ( C ) 抗生物質がベニシリン、半合成ペニシリン、セフエム系抗生物質、力ルバベネム系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ぺプタイド系抗生物質、テトラサィクリン系抗生物質、ク口ラムフエニコーノレ、マクロラィド系抗生物質、リファマイシン、バンコマイシン、ホスホマイシン、化学合成抗菌剤、抗真菌剤、抗結核剤、ポリミキシン Bである請求項 1 2 の抗菌剤を用いて物品を処理する方法。

1 4 . 金属をキレ一卜する蛋白質がラクトフヱリン類、トランスフヱリン、コンアルブミン、カゼインホスホペプチドである請求項 1 2の抗菌剤を用いて物品を処理する方法。