SE528337C2 - Sammansättning innefattande mjölksyra och laktoferrin, eller ett peptidfragment därav, och användning av denna sammansättning för behandling av tillstånd i urogenitalsystemet - Google Patents

Description

25 30 35 (ia hä CJ 2 och/eller epitelialceller diskuteras fortfarande (se genomgång av Pybus och Onderdonk 1999).

En gynnsam miljö för mikrobiotan finns i allmänhet närvarande, och resulterar i ett pH av ca 4 i slemhinnans sekret. Miljön kan emellertid störas av faktorer sàsom variationer i östrogenkoncentrationen under vissa perio- der av menstruationscykeln och under menopaus, och också av en ökad förekomst av sekret av olika slag, till exem- pel fràn utdragna menstruationsblödningar, premenstruella blodiga flytningar, blödningar mitt i cykeln och ejaku- lat. Främmande element i vaginan, till exempel spiraler, pessar och sàdana som införs, till exempel, i samband med antibiotikabehandling och vid tvätt kan också leda till en störning av den friska mikrobiotan som är sådan att pH stiger. När pH stiger över 4,5 finns det en ökad tendens mot tillväxt av anaeroba bakterier.

Störningar av mikrobiotan i vaginan utan inflammato- riska reaktioner i slemhinnan benämns BV och leder till aggressiva flytningar och pH över 4,5, men de betraktas i allmänhet inte som en faktisk rubbning. BV är emellertid en indikation pà att försvaret mot infektion, som delvis ges av ett lågt pH, har försvagats och under ogynnsamma omständigheter leder detta till en faktisk infektion.

Förändring av mikrobiotan förknippas med förändring- ar av vaginalt pH (Caillouette JC et al 1997). Under BV stiger vaginalt pH och en förändring från att vara mjölk- syrabakteriedominerad till en biota i vilken Gardnerella vaginalis och anaeroba bakterier dominerar observeras.

Förekomsten av anaeroba bakterier ger upphov till aggres- siva flytningar och flyktiga aminer vid förhöjt pH (över 4,5).

Den lukt som produceras genom ett ökat pH i vaginal- vätskan vid BV beror pá förekomsten av aminer. Flytningen vid BV innehåller en ökad koncentration av flera aminer som produceras av anaerob bakteriell dekarboxylering.

Aminer blir flyktiga och således illaluktande när de fö- religger i oprotonerad form (fri bas). Efter tillsats av 10 15 20 25 30 35 LH ßâ CG Q! CJ “Q 3 en stark syra omvandlas emellertid aminerna till protone- rad form (salt) och är inte flyktiga. Mjölksyra är en stark syra och således lämplig för att minska illaluktan- de flytningar.

Genom att sänka vaginans pH med mjölksyra skulle det bli lättare för mjölksyrabakteriespecies att àterkoloni- sera vaginan och därigenom återställa den naturliga resi- stensen mot alltför omfattande tillväxt av bakterier som är förknippade med BV. Man har visat att laktat (dvs salt av mjölksyra) som ges i en gel innehållande tillväxtsub- strat (glykogen) för mjölksyrabakterier är effektivt mot förhöjt pH och dålig lukt vid BV. (se EP o 257 007) Laktatgelen tillhandahåller en sur mjölksyrakräm in- nehållande glykogen utan konserveringsmedel. Glykogen finns i överskott i de vaginala epitelialcellerna hos fertila kvinnor och är ett viktigt näringssubstrat för mjölksyrabakterierna.

Jämfört med krämer som endast innehåller mjölksyra eller sura krämer med konserveringsmedel har man visat att laktatgelen in vitro har en effekt som är två gånger sä gynnsam för överlevnaden av mjölksyrabakterier. Den kan därför användas för att återställa en normal miljö när det gäller BV.

Man har också visat att laktatgelen har viss anti- bakteriell effekt mot visa BV-förknippade bakteriespecies på grund av dess låga pH. (Se Andersch B et al; ment of Bacterial Vaginosis with an Acid Cream: A Compa- rison between the Effect of Lactate-Gel och Metronidazo- le”, Gynecol obstet Invest 21: 19-25 (1986)). Inga effek- ter har emellertid observerats mot jäst, cans och C. krusei.

“Treat- sàsom C. albi- Konventionella förfaranden för att behandla svampin- fektioner i vaginan innefattar vanligen administration av antibiotika, t ex imidazolderivat. Det finns naturligtvis många incitament för att reducera användningen av antibi- otika, t ex på grund av resistensutveckling. 10 15 20 25 30 35 (H B) CJ 4 Vidare är det svårt att diagnostisera huruvida en patient lider av BV eller en svampinfektion. Detta leder till förskrivning av antibiotika för säkerhets skull, vilket resulterar i onödig överdriven administration av antibiotika.

Det skulle naturligtvis vara användbart att uppnå en behandling utan antibiotika som, förutom att den har ovannämnda egenskaper att den sänker vaginalt pH och minskar dålig lukt, också är effektiv för att behandla eller förebygga BV och/eller svampinfektioner, i synner- het jästinfektioner. Idealiskt skulle behandlingen vara effektiv oavsett huruvida en patient lider av, eller lö- per risk att drabbas av, BV eller svampinfektion. Tills nu har inte någon sådan möjlighet åstadkommits.

Sammanfattning av uppfinningen Ett syfte med föreliggande uppfinning är att åstad- komma en effektivare sammansättning för behandling av urogenitala tillstånd, som sänker pH och är effektiv mot dålig lukt, och som också är effektiv för att behandla bekteriell vaginos och svampinfektioner, i synnerhet svampinfektioner som orsakas av jästspecies.

Detta syfte uppnås genom en sammansättning innefat- tande mjölksyra, (LF) Införlivningen av LF, eller ett peptidfragment där- förbättrar sammansättningens antimikrobiella aktivi- tet och den kan sàledes användas i syfte att inhibera tillväxten av och/eller att döda oönskade bakterier och svampar i urogenitalsystemet, i synnerhet vaginan.

Koncentrationen av LF kan vara i omrâdet av 0,001 till 10 mg/ml, i synnerhet 0,01 till 5 mg/ml, och nämnda LF kan vara rekombinant humant LF, som kännetecknas av att den innefattar laktoferrin eller ett peptidfragment därav. av, Koncentrationen av mjölksyra kan vara i området av 0,1 till 10% (dvs 1 till 100 mg/ml).

Sammansättningen kan vidare innefatta en neutralise- rande substans, och innehållet av mjölksyra och neutrali- 10 15 20 25 30 35 528 337 5 serande substans är företrädesvis sådant att pH ligger inom omrâdet av 3,5 till 4,5.

Sammansättningen kan vidare innefatta ett tillväxt- substrat för mjölksyrabakterier, och viktförhållandet mellan mjölksyra och tillvâxtsubstrat är företrädesvis i omrâdet av 20:1 till 500:1, närmare bestämt ca 50:l.

Sammansättningen kan vidare innefatta en inert vehi- kel och/eller ett konsistensmedel.

Sammansättningen kan till exempel föreligga i form av en kräm, en gel, ett vaginalt suppositorium, en ta- blett eller en spray.

Vidare avser uppfinningen användningen av en samman- sättning enligt ovan för framställning av ett läkemedel för profylax och/eller behandling av tillstànd i urogeni- talsystemet. Läkemedlet har en antimikrobiell aktivitet.

De tillstànd som skall behandlas och/eller förebyg- gas innefattar ett förhöjt pH och/eller en störd mikrobi- ota i urogenitalsystemet. En störd vaginal mikrobiota kännetecknas av onormalt höga nivåer av BV-förknippade bakterier, anaeroba gramnegativa bakterier, anaeroba grampositiva kocker, stafylokocker streptokocker, E. coli och/eller Candida, i kombination med onormalt låga nivàer av mjölksyrabakterier.

Uppfinningen hänför sig också till ett förfarande för profylax och/eller behandling av ovannämnda till- stånd.

Det finns flera fördelar med sammansättningen enligt föreliggande uppfinning: I Sammansättningen är mycket mild mot mjölksyrabakte- rier.

I Kombinationen av mjölksyra och LF i en enda samman- sättning ger upphov till oväntade synergieffekter eftersom den sänker pH, minskar dälig lukt och inhi- berar tillväxt av BV-förknippade bakterier och jäst. 0 Sammansättningen är effektiv oavsett om en patient lider av BV eller Candida-infektion, vilket natur- ligtvis är en fördel om en tillförlitlig diagnos 10 15 20 25 30 35 ~ 528 337 6 inte kan ställas, i synnerhet när det gäller egen- värd. 0 Användningen av antibiotika kan reduceras.

Kort beskrivning av figurerna Fig 1 visar den antifungösa aktiviteten av LF mot C. albicans i närvaro av laktat (a) och väteklorid (b). LF inkuberades tillsammans med olika koncentrationer av lak- tat utspätt i 0,2% baktopepton och C. albicans under 2 h.

Därefter analyserades varje lösning med avseende pà antal livsdugliga enheter (”viable counts”). Synergieffekter erhölls för alla LF-koncentrationer utom för 1/5- utspådningen av laktat (1%) med användning av 0,5 mg LF per ml (a). LF reducerade jästcellerna med 99,9% i lak- 0,04% och 0% laktat. 1% laktat I närvaro av LF avdödades emellertid 92 respektive 98,2% av inokulatat med 2 re- spektive 5 mg/ml. I b) ersattes laktat med HCl som ger ett motsvarande pH (1,2% HCl). Som kan ses reducerades avdödningseffekten av HCl för den outspädda lösningen. tatkoncentrationerna 0,2%, reducerade Candida med 65%.

Fig 2 visar effekterna av LF (2 mg/ml) på tvà mjölk- syrabakteriestammar som vanligen finns i den vaginala mikrobiotan. Bakterierna inkuberades under 3 h i olika koncentrationer av laktat utspätt i 0,34% BHI och inkube- rades i C02. L. gasseri överlevde bättre i analyssystemet än L. jensenii. Outspätt laktat (5%) bakteriernas överlevnad. påverkade mjölksyra- I 1% laktat överlevde inte L.

Jensenii, medan 18% av LF-behandlade L. Gasseri överlev- de.

Fig 3 visar den antibakteriella aktiviteten hos LF och laktat pà L. gasseri och E. coli som testats vid sam- ma betingelser (O,34 % BHI, C02, 2 h inkubation).

Fig 4 visar tillväxtinhibitionen av G. vaginalis (Gv 14) och två P. bivia-stammar (Pb 57, Pb 62) i närvaro av olika koncentrationer av LF. Bakterierna inkuberades i 0,34% BHI vid anaeroba betingelser under 20 h. Tillväx- tinhibitionen analyserades spektrofotometriskt. 10 15 20 25 30 35 528 337 7 Fig 5 visar den mikrobicida aktiviteten av LF och rHLF pà C. albicans och E. coli i närvaro av laktat (kon- centrationer 5 och 1%, utspätt i O,2% baktopepton). Lös- ningarna inkuberades under 2 h och analyserades därefter med avseende på antal livsdugliga enheter.

Fig 6 visar den fungicida aktiviteten av LF och rHLF på C. albicans i närvaro av laktat (koncentration l och 0,2% i O,2% baktopepton). Lösningarna inkuberades under 2 och 20 h och analyserades med avseende på antal livsdug- liga enheter.

Fig 7 visar den baktericida aktiviteten av LF (2 mg/ml) och rHLF (2 mg/ml) i närvaro av laktat (5, 1 och 0,2 % utspädd i 0,2% baktopepton). Lösningarna inkubera- des under 2 h och analyserades med avseende pà antal livsdugliga enheter.

Fig 8 visar den fungicida aktiviteten av LF-peptiden HL2 (250 ug/ml) i närvaro av olika koncentrationer av laktat (5, l, 0,2 och 0,04% utspätt i 0,2% baktopepton).

Lösningarna inkuberades under 2 h och analyserades med avseende på antal livsdugliga enheter. Den procentandel som anges ovanför staplarna representerar överlevnads- fraktion i inokulum.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Laktoferrin (LF), ellt medel, och ett immunregulatoriskt protein, är ett enkedjigt som beskrivs som ett antibakteri- en modulator för det inflammatoriska svaret järnbindande glykoprotein. LF finns i kolostrum och mogen mjölk i nivåer av 2-7 g/1. I kolostrum utgör LF 43% av det totala proteininnehållet. Andra exokrina utsöndring- ar, såsom saliv, tårar, bronkialmucus och cervikovaginal- vätska innehåller också LF (tabell 1).

Det är anmärkningsvärt resistent mot proteolytisk nedbrytning av trypsin och trypsinliknande enzymer. Pep- sinnedbrytning ger emellertid upphov till ett peptidfrag- ment, laktoferricin, som är starkt baktericidiskt mot ett 10 15 20 25 30 35 40 8 brett spektrum av bakterier in vitro. Både LF och lakto- ferricin är baktericida och fungicida in vitro.

Tabell 1 LF-nivåer i vissa sekret mg/ml Humanmjölk kolostrum 5-7 mogen mjölk 1-3 Humansekret: tårar 0,4-2.2 luftvâgarna nasal utsöndring 0.1 saliv 0,005-0,01 bronkialslemhinna 0,03-0,04 urogenitalsystemet vaginal slemhinna 0.004-0,2 Ber NS Eroteín uterinutsöndringar 0,3-1 seminalplasma 0,4-2 Det är mycket viktigt att bibehålla balansen mellan mikroorganismerna i vaginan. Vid behandling av BV (ag- gressiva flytningar som orsakas av obalans i den vaginala biotan utan inflammation) är det viktigt att återställa den mjölksyrabakteriedominerade biotan.

Under det forskningsarbete som lett fram till före- liggande uppfinning fann man att överraskande goda syner- gieffekter kunder erhållas genom att kombinera känt lak- tat, som beskrivs ovan, med LF.

Således tillhandahåller föreliggande uppfinning en sur mjölksyrasammansättning innehållande LF. Sammansätt- ningen enligt föreliggande uppfinning förstärker de na- turliga skyddsmekanismerna i den vaginala slemhinnan ge- nom att hjälpa till att återställa den produktiva miljön för mjölksyrabakterier, sänka pH och också genom att ut- öva en antimikrobiell aktivitet på ett antal mikrober, t ex C. albicans, E. coli, S. aureus, G. vaginalis och Pre- votella-species. 10 15 20 25 30 35 528 33? 9 LF för användning enligt föreliggande uppfinning kan rekombinant humant LF (rHLF), bovint LF eller peptidfragment av LF.

Med humant LF menast LF renat fràn människor, t ex vara humant LF, fràn humanmjölk.

Med rekombinant humant LF menas LF som producerats i pro- eller eukaryota celler (bakterier, svampceller, väx- ter eller djur) med hybrid-DNA-teknik.

Med peptidfragment av LF menas peptider av olika storleker, baserade pä den antimikrobiella regionen i LF- molekylen från den N-terminala änden. Peptidfragmentsek- vensen baseras pà den sekvens som utgörs av aminosyrorna (aa) 12-40 i humant LF räknat från den N-terminala änden.

Syntetiska såväl som rekombinanta peptider kan användas.

Ett exempel på en LF-peptid är laktoferricin. En annan skulle kunna vara den 25 eller 23 aminosyror långa peptid som börjar från aa-aminosyra i position 16 respektive 18, från den N-terminala änden. LF-peptider som är lämpliga för användning i föreliggande uppfinning beskrivs i den internationella ansökan som har publiceringsnummer WO OO/01730.

Koncentrationen av LF kan vara i området av 0,001 till 10 eller 0,01 till s mg/ml.

Koncentrationen av mjölksyra kan vara i området av 1 till 100 mg/ml eller 10 till 100 mg/ml.

Vidare kan laktat, dvs salt av mjölksyra, användas i föreliggande uppfinning.

Sammansättningen kan innefatta en neutraliserande substans för att buffra mjölksyrans pH. Exempel på neut- raliserande substanser är natriumhydroxid och ammoniak.

Innehållet av mjölksyra och neutraliserande substans kan vara sådant att pH ligger inom omrâdet från 3,5 till 4,5, företrädesvis nära 3,8. pH är företrädesvis inte så lägt att syran irriterar vävnaderna eller försämrar mil- jön för mjölksyrabakterierna som kräver en måttligt sur miljö. Ett pH av 3,7-3,9 har visat sig vara speciellt fördelaktigt. 10 15 20 25 30 35 10 Sammansättningen kan vidare innefatta ett tillväxt- substrat för mjölksyrabakterier. Tillväxtsubstratet är företrädesvis a(l-4)-glukaner innehållande a(l-6)-för- greningar.

Ett exempel på ett lämpligt tillväxtsubstrat är gly- kogen, som àterfinns i överskott i de vaginala epitelial- cellerna hos fertila kvinnor och är ett viktigt närings- substrat för mjölksyrabakterier. Glykogen används som tillväxtsubstrat för mjölksyrabakterierna så att behand- lingen inte bara resulterar i justering av pH-nivàn till en lägre siffra genom att tillföra mjölksyra, utan också i àterställning av en gynnsam miljö för tillväxt av mjölksyrabakterier för att regenerera de naturliga be- tingelserna. Andra exempel på tillväxtsubstrat är laktos, dextros, glukos och amylopektin.

Mjölksyra införlivas i en avsevärt större viktandel än tillväxtsubstratet, till exempel i viktförhàllanden av 20:l till 500:1, i synnerhet 50:l.

Sammansättningen enligt uppfinningen kan föreligga i form av en kräm, en gel, en spray, en tablett eller ett vaginalt suppositorium. Sammansättningen enligt förelig- gande uppfinning har följaktligen en kräm- eller gelkon- sistens, en tablettkonsistens, en konsistens som är lämp- lig för sprayadministration, eller ges i form av ett va- ginalt suppositorium eller en tablett.

Sammansättningen enligt uppfinningen kan administre- ras vaginalt, peroralt eller transdermalt.

En vehikel för de aktiva beståndsdelarna i samman- sättningen kan tillsättas för att bilda en användbar far- maceutisk produkt. Sammansättningen enligt föreliggande uppfinning kan innehålla vehiklar som är av en typ som är inert i detta avseende, och som ger kräm- eller gellik- nande konsistens, eller en konsistens som är lämplig för sprayadministration. Alternativt är den inerta vehikeln en substans som smälter vid kroppstemperatur och i kroppsvâtska. 10 15 20 25 30 35 LH Få CQ ll Om ett vaginalt suppositorium skall framställas krävs en vehikel som gör det möjligt att bilda en artikel som är relativt fast vid rumstemperatur och i torr miljö, men som smälter vid kroppstemperatur och i kontakt med kroppsvätska. I detta avseende kan polyetylenglykol, PEG, användas, som gradvis smälter i den vaginala miljön.

En lämplig vehikel för en kräm är propylenglykøl. men andra substanser av inert beskaffenhet är också kända för användning som vehiklar i detta avseende, t ex trig- lycerider.

Sammansättningen enligt föreliggande uppfinning kan vidare innefatta ett konsistensmedel, såsom, när det gäller krämer och geler, metylhydroxipropyleter av cellu- losa. Som ett exempel på en kommersiell produkt som kan nämnas är Hypromellosum® 90 HG 4000. Ett annat exempel på ett konsistensmedel är majsstärkelse.

Med ett ”tillstànd i urogenitalsystemet” menas vil- ken som helst störning eller rubbning i urinvägarna eller i de genitala organen. I synnerhet är uppfinningen lämp- lig för behandling av tillstànd i vaginan.

Ett tillstànd som skall behandlas enligt uppfinning- en kan omfatta ett förhöjt pH och/eller en störd mikrobi- ota i urogenitalsystemet.

Med ett ”förhöjt pH” menas ett pH över 4,5.

Med en ”störd mikrobiota” menas en biota som har onormalt höga nivåer av BV-förknippade bakterier, såsom G. vaginalis, anaeroba gramnegativa bakterier (Prevotel- la-, Bacteroides- och Fusobacterium-species), anaeroba grampositiva kocker, Mbbiluncus-species och/eller onor- malt höga nivåer av E. coli, stafylokocker (S. aureus) och streptokocker, alla i kombination med onormalt lága nivåer av mjölksyrabakterier. Även höga nivåer av Candi- da, som kan resultera i vaginit, anses vara en störd va- ginal mikrobiota.

Med en ”onormalt hög nivå” menas en nivà som är 100- till 1000-faldigt högre än nivàn hos en frisk person. lO l5 20 25 30 35 12 Med en ”onormalt låg nivå” menas icke-dominerande, dvs inte förekommande eller mindre än en mjölksyrabakte- riemorfotyp per mikroskopiskt immersionsfält, eller mind- re än eller lika med andra morfotyper per immersionsfält.

(Utvärdering enligt ”Nugent scoring system", som används internationellt för att beskriva bakteriell obalans i va- ginalsekret. Se Nugent RP et al 1991, J Clin Microbiol 29:297-301.) Med en “antimikrobiell aktivitet” menas en bakteri- ostatisk, fungistatisk, baktericid och/eller fungicid ak- tivitet, dvs förmågan att minska tillväxten av och att avdöda vissa bakterier respektive svampar.

Med “profylax och/eller behandling av ett tillstànd” menas vilken som helst behandling för att bota eller lindra ett tillstànd enligt ovan, eller att förhindra ut- vecklingen av ett sàdant tillstànd.

Exempel pà tillstànd som skall behandlas med samman- sättningen enligt uppfinningen är bakteriell vaginos, in- termediär vaginal mikrobiota och jästinfektioner, t ex Candida-infektioner.

Vidare kan sammansättningen enligt uppfinningen an- vändas för behandling av klamydia, genital mykoplasma, trikomonasinfektion, urinvägsinfektion och pelvisk in- flammatorisk sjukdom. Dessutom kan vilken som helst kom- bination av ovannämnda tillstànd behandlas med samman- sättningen enligt uppfinningen.

Sammansättningen enligt uppfinningen kan också an- vändas t ex vid behandling av svampeksem, sàriga bröst- vàrtor, som profylax mot sexuellt överförbara sjukdomar, eller som glidmedel.

Med en ”farmaceutiskt effektiv mängd” menas en mängd av sammansättningen enligt uppfinningen som kommer att leda till den önskade farmakologiska och/eller terapeu- tiska effekten. Den önskade farmakologiska och/eller te- rapeutiska effekten är, att bota eller lindra och/eller förhindra utvecklingen av tillstånd i urogenitalsystemet.

SOm angeS OVan, lO 15 20 13 Med en ”patient” menas vilket som helst humandägg- djur eller icke-humandäggdjur som är i behov av att bli behandlad med sammansättningen och/eller förfarandet en- ligt uppfinningen.

Sammansättningen enligt uppfinningen kan vidare in- nefatta andra substanser, såsom hjälpämnen, bärare, kon- serveringsmedel, vitaminer, mineraler, östrogen etc, som är välkända för fackmän pà området.

Vidare är det möjligt att kombinera sammansättningen enligt uppfinningen med andra konventionella farmakolo- giska behandlingar av tillstànd i urogenitalsystemet, t ex behandling med imidazolberedningar.

Sammansättningen kan föreligga i form av ett kon- centrat som är avsett att spädas av användaren före an- vändning. Ett sådant koncentrat späds lämpligen med t ex rent vatten, vattenhaltiga lösningar eller saltlösning.

Specifika exempel på en komposition enligt förelig- gande uppfinning framgàr av följande belysande samman- sättningar. ä Mjölksyra 5 , 0 g NaOH ad pH 3,9 Glykogen 0,1 g Propylenglykol (85%, återstod H20) 15,0 g Metylhydroxipropyleter av cellulosa t ex Hypromellosum@ 90 HG Ad 100 9 4000 (2,5%, återstod H50) rhLF 0,2 9 10 15 20 25 528 537 14 Kräm Mjölksyra 510 9 Nam wm) 4'19 Glykogen 0,1 9 Propylenglykol (85%, återstod H20) 15-0 9 Metylhydroxipropyleter av cellulosa, t ex Hyprome1losurn® 90 ad 100,0 HG 4000 (2,S%, återstod I-I;O) 9 rnLF 0.2 9 Exempel Material och metoder Bakterie- och svampstammar Bakteriestammarna S. aureus 1800 (CCUG 1800), E. coli O6 och jästen C. albicans (ATCC 64549) har använts i mikroplattanalysen. Alla mikroorganismer odlades i hjärn- hjärt-infusionsmedium (BHI) på en skakare över natten vid 37°C. En volym av odlingen överfördes till ett nytt rör med BHI och inkuberades under ytterligare tvà h pà skaka- ren. Bakterierna skördades i logfasen, tvättades en gång och suspenderades sedan i den buljong som användes för mikroplattanalysen. Suspensionen justerades spektrofoto- metriskt och späddes till en koncentration av ca 4 x 106 celler per ml vid 650 nm.

L. gasseri och L. jensenii odlades på chokladagarp- lattor under 24 h i 5%/C02/95% luft. Därefter skördades de och sattes till BHI (O,34%). Efter tvätt justerades bak- terielösningarna spektrofotometriskt och späddes till 8xl0° bakterier/ml.

G. vaginalis och P. bivia odlades på choklad-GL- plattor under 48 h i anaerob miljö. Bakterierna skördades och suspenderades i BHI för ytterligare inkubation (4 timmar vid 37°C). Bakterierna tvättades två gånger i bak- topepton (BP, 0,2 %). Koncentrationen justerades spektro- fotometriskt och späddes till 1 x 107 bakterier per ml. 10 15 20 25 30 35 15 LF och peptid LF från humanmjölk införskaffades från Sigma (Saint Louis, USA). Rekombinant humant LF erhölls fràn Agennix.

Ett peptidfragment bestående av 23 aminosyror, baserat på den antimikrobiella regionen i humant LF, syntetiserades med fmoc-strategin.

Minimala mikrobicida och inhibitoriska koncentrationer, MMC.

Tvättade celler suspenderades i 0,2% BP (pH 7,0) el- ler BHI~medium spätt 1/10 (0,34%, pH 6,7-6,9) (Difco, USA). Koncentrationen av bakterie- eller svampceller ju- sterades spektrofotometriskt. LF eller peptid, seriellt utspädda i BHIü¿ eller BP i dubbla steg (såvida inte nå- got annat anges), sattes i tre exemplar till brunnarna på en mikrotiterplatta (200 ul per brunn). Bakterie- eller jästcellösningarna tillsattes i 10 ul volymer för att ge en slutlig koncentration av ca 2 x 105 celler per ml.

Stamlösningarnas koncentration kontrollerades alltid med antal livsdugliga enheter. Mikroplattan inkuberades vid 37°C i en fuktkammare under 2 h, såvida inte något annat anges. Fem ul togs fràn varje brunn och tillsattes som droppar på en blodagarplatta och inkuberades över natten vid 37°C. I vissa experiment utfördes mer omsorgsfull räk- ning av antal livsdugliga enheter och avdödningen ut- trycktes som återstående kolonibildande enheter i rela- tion till inokulum. Den nedre gränsen för detektion av mikroorganismer var 200 CFU/ml.

Förfarandet för den mikrobicida analysen med avseende pà G. vaginalis och P. bivia var som beskrivs ovan förutom att mikroplattan inkuberades vid anaeroba be- tingelser (2 h). Därefter analyserades små droppar av lösningarna med avseende på livsdugliga bakterier på blodagarplattor efter 48 h av anaerob inkubation vid 37°C. 10 15 20 25 30 35 528 337 16 Exempel 1 Antimikrobiell aktivitet av laktat och LF Den antimikrobiella aktiviteten av humant LF analyse- rades med den mikrobicida analys som beskrivs ovan. Olika mikrober, såsom C. albicans, E. coli och S. aureus, analy- serades med avseende pá deras överlevnad i laktat (som inte innehöll den inerta gelbasen, som gör gelen olämplig för mikrobicid analys) innehållande LF. Våra resultat vi- sade att LF förbättrade den antimikrobiella effekten av laktat mot C. albicans när laktat späddes femfaldigt el- ler mer (5 1 %) för alla LF-koncentrationer utom 0,5 mg (fig la). I outspätt laktat ob- serverades en antifungös aktivitet. Ersättning av laktat vid spädningen 1% laktat med HCl som ger samma pH som laktat resulterade i reduce- rad Candidacid aktivitet när den var outspädd (fig lb).

Dessa experiment visade också att inte endast ett lågt pH utan även laktat i sig självt var viktigt för den anti- fungösa aktiviteten (vid outspädd laktatlösning).

Den antibakteriella effekten av laktat mot E. och S. aureus var bra både i frånvaro eller närvaro av LF (tabell 2 och 3).

Effekterna av LF och laktat analyserades också med två mjölksyrabakteriestammar (L. gasseri och L. jensenii) coli som frekvent förekommer i vaginan (fig 2). En stam var känslig för laktat och överlevde inte i närvaro av det.

L. gasseri var känslig för LF, särskilt i frånvaro av laktat. Således var den antibakteriella effekten av LF (2 mg/ml) i närvaro av 1 % laktat måttlig (18% mot 38% över- levde jämfört med 46% obehandlade bakterier).

I nästa experiment gjordes en jämförelse mellan E. coli och L. gasseri för att utfinna om olika inkubations- betingelser (0,34% BHI, C02-inkubator) skulle förändra ef- fekterna av LF. Således behandlades E. coli på samma sätt som L. gasseri.

Liksom man tidigare funnit var E. coli känslig för laktat och L. gasseri var mer resistent än E. coli i lak- tat med eller utan LF (fig 3). 10 15 20 25 30 528 337 17 Tabell 2 Avdödningsaktivitet av LF i olika laktatkoncentrationer, analyserat med mikrobicid droppmikroplattanalys. Figurerna representerar pro- centandel bakterier som återstår i relation till inokulum. +++ bety- der att antalet kolonibildande enheter som inbegrips i 5 ul av en droppe bildade ett jämnt bakterieskikt, ++ betyder att en ”krusad” yta ses, och slutligen betyder 0 att inga bakterier återfanns i tre- dubbla prover om 5 ul (> 99.95 avdödning i inokulum).

Ecolí-avdödning HLF,ughfl Inkubations- laktat- 500 2000 5000 0 tid koncentration 2 h 5 % 0 0 0 0 1 % ++ (+++) (+++) (+++) 0,2 % ++ (+++) ++ ++ inget laktal +++ ++ ++ +++ Sh 596 0 0 0 0 1 % 5 9 16 6 0,2 % 4 5 0,4 5 inget laktal +++ 3 2 +++ 10 15 20 25 30 35 40 i 528 337 18 Tabell 3 Avdödningsaktivitet av LF i olika laktatkoncentrationer, analyserat med mikrobicid droppmikroplattanalys. Figurerna representerar pro- centandel bakterier som kvarblir i relation till inokulum. +++ = an- talet kolonibildande enheter som inbegrips i 5 ul av en droppe bil- dade ett jämnt bakterieskikt. (parentes = en tendes mot en krusad yta jämfört med kontrollen). 0 = inga bakterier återfanns i tredubb- la prover om 5 ul (> 99.95 avdödning i inokulum).

S. aureus-avdödning HlF4ghm Inkubafions-lakan Tid 500 t0 2h 596 0 0 1% 0 0 0296 0 0 inget laktal (+++) H* Sh 596 0 0 196 0 0 0296 0 0 inget Iaktal 0,3 +i+ Experimentet påvisade att L. gasseri var mer resis- tent än E. coli mot effekterna av laktat och LF i kombi- nation, trots den svaga överlevnaden av L.gasseri i LF utan laktat.

Den antimikrobiella aktiviteten av LF pà G. vagina- lis och P. bivia analyserades också. I detta experiment överlevde inte bakteriestammarna i våra testsystem, trots de anaeroba betingelserna. (Se exempel 2 nedan för ytter- ligare experiment) Sammanfattningsvis förbättrade LF den antimikrobiel- la aktiviteten av laktat mot (Lalbicans och E.coli. (även lO 15 20 25 30 35 528 537 19 om aktivitetens storleksordning var nägot beroende av LF- sàväl som laktatkoncentrationer beträffande C. albicans).

Vid den outspädda laktatkoncentrationen var den an- timikrobiella aktiviteten fullständig utan LF när den analyserades mot C. albicans, S. aureus och E. coli. Man kan också dra slutsatsen att det inte enbart är pH som är viktigt för den antimikrobiella aktiviteten, utan också den typ av molekyl som ger upphov till lågt pH. Således är a-hydroxipropionsyra, laktat, mer aktiv i närvaro av LF än HCl (fig 1).

Det verkar som om LF i kombination med laktat skulle kunna vara gynnsamt för värden både mot obehaglig lukt och antimikrobiell obalans.

Exempel 2 Antimikrobiell aktivitet av LF på G.vagina1is och P.bivia.

Den mikrobicida analysen modifierades för att erhål- la överlevnadsbetingelser för G. vaginalis och P. bivia.

Istället för O,2% BP användes 0,34% BHI. Bakteriestammar- na analyserades med enbart LF tillsatt i olika koncentra- tioner till brunnarna (inget laktat närvarande). Plattor- na inkuberades under 20 timmar.

Tillväxtinhibition av LP sågs för alla de testade stammarna (fig 4).

I en andra experimentserie mättes den minimala bak- tericida koncentrationen (MBC) vid 99% avdödning för sju G. vaginalis~stammar (tabell 4). Av dessa uppvisade en- dast en samma tillväxt när den inkuberades med 2,5 mg LF.

Således bekräftades en antimikrobiell aktivitet av LF pà P.bivia och även G. vaginalis. 10 15 20 25 CW bb OS CH Qü *J 20 Tabell 4 Baktericid aktivitet av LF. LF späddes med femfaldiga seriella steg.

Den koncentration vid vilken en 99% avdödning erhölls definierades som MBC”.

Bakteriestam NBC” ug/ml G. vaginalis, stamkod: 17 >250O 90 4 23 1000 12 500 96 100-500 54 20 51 100 De koncentrationer som användes var 2500, 500, 100, 20, 4 ug/ml Exempel 3 Antimikrobiell aktivitet av laktat och rHLF Syftet var att testa huruvida rHLF skulle förbättra de antimikrobiella effekterna av laktat i samma utsträck- ning som LF renat fràn humanmjölk (Sigma).

Den antimikrobiella aktiviteten av laktat (som inte innefattade gelbas) innehållande rHLF analyserades med mikroplattanalys. Mikroorganismerna C. albicans, E. coli och S. aureus analyserades.

I vårt första experiment jämfördes rHLF och LF vid betingelser utan laktat (visas inte). Analys med mikro- plattanalysen visade att báda LF-beredningarna var lika i sin mikrobicida aktivitet mot E.coli, medan LF var nágot mer aktivt mot S. aureus och C. albicans vid koncentra- tioner av 0,25 och 0,125 mg/ml (2 h inkubation).

I närvaro av laktat erhölls de starkaste aktivite- terna mot C. albicans med outspätt laktat (5%), eftersom inga jästceller överlevde (fig 5a). Vid en laktatkoncen- tration av 1% nådde emellertid rHLF (0,5-1,0 mg/ml) näs- 10 15 20 25 30 35 21 tan 99% avdödning av inokulatet. Vid en koncentration av O,2% laktat th nàdde 1 mg av vilken som helst av LF- beredningarna nästan 99% avdödning. Vad beträffar avdöd- ning av E.coli överlevde inga bakterier vid outspätt lak- tat (5%), medan bàda LF-beredningarna förbättrade avdöd- ning vid en laktatkoncentration av 1% (fig 5b). rHLF vid 1 mg/ml var mest effektiv av de två LF vid laktatkoncen- trationen 0,2% och i laktatfri lösning.

I följande experiment studerades högre koncentratio- ner av LF med avseende på fungicid effekt pà C. albicans (fig 6). Återigen erhölls en starkare effekt med rHLF jämfört med LF vid laktatkoncentrationen 1%. Vid 0,2% laktat observerades den starkare effekten av rHLF endast efter en längre inkubationstid (20 h, fig 6) Baserat pä de resultat som erhållits med 2 mg rHLF (se fig 6) analyserades LF-beredningarna med avseende pà deras effekter pä de två mjölksyrabakteriestammarna fràn den vaginala mikrobiotan, L. gasseri och L. jensenii (fig 7). Vid 2 h inkubationstid hade rHLF inga ytterligare ef- fekter pà L. Gasseri-överlevnad än den som utövades genom närvaro av laktat (fig 7a), medan bäda LF-beredningarna förbättrade avdödning av L. jensenii. Således var L. Jen- senii mer mottaglig för effekterna av LF-beredningarna i synnerhet vid 1% laktat (fig 7b).

Sammanfattningsvis erhölls synergieffekter genom att sätta rHLF till laktat. rHLF framträdde något svagare i sin antimikrobiella aktivitet jämfört med LF när det tes- tades i ett svagt BHI-medium (O,34%). I motsats därtill var rHLF något starkare än LF i närvaro av laktat (1 el- ler 0,2%), förutom vid användning av mjölksyrabakterier.

Denna motsatta effekt på mjölksyrabakterier är gynnsam för värden, eftersom mjölksyrabakterier hör till den friska normala mikrobiotan. Resultaten påvisar att 2 mg/ml rHLF skulle kunna vara en lämplig koncentration i laktat. 10 15 20 25 30 35 Cfi FO Ci: Cd LM *J 22 Exempel 4 Antimikrobiell aktivitet av laktat och en LF-peptid, HL2 Ett peptidfragment baserat på den antimikrobiella regionen i LF-molekylen innehållande 23 aa analyserades med avseende på dess fungicida aktivitet i närvaro av laktat. Som ses i fig 8 reducerade tillsats av HL2 jäst- celllivsdugligheten vid alla laktatkoncentrationer, sàväl som när inget laktat tillsattes. Vid den outspädda lak- tatkoncentrationen (5%) var emellertid effekten av laktat fullständig även i frånvaro av HL2.

Således tillfogar ett kort LF-peptidfragement anti- fungös aktivitet till laktatlösningarna.

Sammanfattning För att sammanfatta exemplen förbättrade tillsats av LF till laktat den antimikrobiella effekten därav.

En synergieffekt erhölls när laktat kombinerades med LF/rHLF med avseende på bakterier som E. coli (fig 5b).

Vad beträffar den antifungösa aktiviteten av laktat pä Candida uppvisade också tillsatsen av i synnerhet rHLF till laktat synergistiska effekter (fig 5a och fig 6).

Denna synergieffekt var oväntad eftersom tillsats av negativt laddade molekyler (laktat) skulle förväntas kon- kurrera med de negativt laddade grupperna pá bakterieytan för interaktionen med katjoniskt LF. Allmänt anses att elektrostatisk interaktion med negativt laddade ytor pà mikroorganismer är det första steget i den mikrobicida aktiviteten hos LF. Till exempel har man visat att ökande koncentrationer av fosfat och bikarbonat kan minska den fungicida aktiviteten av humant LF (Soukka et al, 1992, FEMS Microbiology letters 90:223-228).

Det bör också understrykas att mjölksyrabakterier som L.gasseri oväntat överlevde lika bra i laktat oavsett om rHFL hade tillsats(fig 7a) eller inte.

Claims (27)

10 15 20 25 30 35 23 PATENTKRAV

1. Sammansättning innefattande mjölksyra, eller ett salt därav, och laktoferrin, eller ett peptidfragment därav, vilket peptidfragment är baserat pà den antimikro- biella regionen i laktoferrinmolekylen fràn den N~ terminala änden, för behandling och/eller profylax av tillstànd i urogenitalsystemet, kännetecknad av att kon- centrationen av mjölksyra är i området av 1 till 100 mg/ml.

2. Sammansättning enligt krav 1, varvid nämnda pep- tidfragment är baserat på den sekvens som utgörs av ami- nosyrorna 12-40 i humant laktoferrin räknat fràn den N- terminala änden, eller nämnda peptidfragment är laktofer- ricin.

3. Sammansättning enligt krav 1 eller 2, varvid nämnda peptidfragment är den 25 aminosyror långa peptid som börjar från aminosyran i position 16 från den N- terminala änden.

4. Sammansättning enligt krav 1 eller 2, varvid nämnda peptidfragment är den 23 aminosyror långa peptid som börjar från aminosyran i position 18 från den N- terminala änden.

5. Sammansättning enligt något av föregående krav, varvid koncentrationen av laktoferrin, eller ett peptid- fragment därav, är i området av 0,001 till 10 mg/ml.

6. Sammansättning enligt något av föregående krav, varvid nämnda laktoferrin är rekombinant humant laktofer- rin.

7. Sammansättning enligt något av föregående krav, vidare innefattande en neutraliserande substans.

8. Sammansättning enligt krav 7, varvid innehållet av mjölksyra och neutraliserande substans är så att pH ligger inom området av 3,5 till 4,5.

9. Sammansättning enligt krav 7 eller 8, varvid nämnda neutraliserande substans är natriumhydroxid. 10 15 20 25 30 35 01 bi CG LN C& \J 24

10. Sammansättning enligt något av föregående krav, vidare innefattande ett tillväxtsubstrat för mjölksyra- bakteriespecies.

11. Sammansättning enligt krav 10, varvid viktför- hàllandet mellan mjölksyra och tillväxtsubstrat är i om- rådet av 20:1 to 500:1.

12. Sammansättning enligt krav 11, varvid viktför- hàllandet mellan mjölksyra och tillväxtsubstrat är 50:1.

13. Sammansättning enligt något av kraven 10 till 12, varvid nämnda tillväxtsubstrat är a(l-4)~glukaner in- nehållande a(1-6)-förgreningar.

14. Sammansättning enligt krav 13, varvid tillväxt- substratet väljs ur gruppen bestående av glykogen, amylo- pektin, glukos, dextros och laktos.

15. Sammansättning enligt något av föregående krav, vidare innefattande en inert vehikel.

16. Sammansättning enligt krav 15, varvid nämnda inerta vehikel är propylenglykol eller polyetylenglykol.

17. Sammansättning enligt något av föregående krav, vidare innefattande ett konsistensmedel.

18. Sammansättning enligt krav 17, varvid nämnda konsistensmedel är metylhydroxipropyleter av cellulosa.

19. Sammansättning enligt något av föregående krav, i form av en kräm, en gel, ett vaginalt suppositorium, en tablett eller en spray.

20. Användning av en sammansättning innefattande mjölksyra, eller ett salt därav, och laktoferrin, eller ett peptidfragment därav, vilket peptidfragment är base- rat på den antimikrobiella regionen i laktoferrinmoleky- len från den N-terminala änden, för framställning av ett läkemedel för profylax och/eller behandling av ett till- stånd i urogenitalsystemet.

21. Användning enligt krav 20, varvid nämnda peptid- fragment är baserat på den sekvens som utgörs av aminosy- rorna 12-40 i humant laktoferrin räknat från den N- terminala änden, eller nämnda peptidfragment är laktofer- ricin. 10 15 20 25 528 ššïi 25

22. Användning enligt krav 20 eller 21, varvid nämn- da peptidfragment är den 25 aminosyror långa peptid som börjar från aminosyran i position 16 från den N-terminala änden.

23. Användning enligt krav 20 eller 21, varvid nämn- da peptidfragment är den 23 aminosyror långa peptid som börjar fràn aminosyran i position 18 från den N-terminala änden.

24. Användning enligt något av kraven 20 till 23, varvid nämnda läkemedel har en antimikrobiell aktivitet.

25. Användning enligt något av kraven 20 till 24, varvid nämnda tillstànd innefattar ett förhöjt pH och/eller en störd mikrobiota i urogenitalsystemet.

26. Användning enligt krav 25, varvid nämnda störda mikrobiota kännetecknas av onormalt höga nivåer av BV- förknippade bakterier, anaeroba gramnegativa bakterier, anaeroba grampositiva kocker, stafylokocker streptokock- er, E. coli och/eller Candide, i kombination med onormalt làga nivåer av mjölksyrabakterier.

27. Användning enligt något av kraven 20 till 26, varvid nämnda tillstànd väljs ur gruppen bestående av bakteriell vaginos, intermediär vaginal mikrobiota och jästinfektioner.