WO1993013132A1 - Novel megakaryocyte amplifier - Google Patents

Novel megakaryocyte amplifier Download PDF

Info

Publication number
WO1993013132A1
WO1993013132A1 PCT/JP1992/001689 JP9201689W WO9313132A1 WO 1993013132 A1 WO1993013132 A1 WO 1993013132A1 JP 9201689 W JP9201689 W JP 9201689W WO 9313132 A1 WO9313132 A1 WO 9313132A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
megakaryocyte
meg
pot
amino acid
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP1992/001689
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nozomi Yamaguchi
Masayoshi Oh-Eda
Kunihiro Hattori
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to CA002126680A priority Critical patent/CA2126680C/en
Priority to EP93900384A priority patent/EP0621285B1/en
Priority to KR1019940702233A priority patent/KR100233701B1/ko
Priority to AT93900384T priority patent/ATE221084T1/de
Priority to US08/256,133 priority patent/US5498698A/en
Priority to AU31721/93A priority patent/AU658040B2/en
Priority to DE69232698T priority patent/DE69232698T2/de
Publication of WO1993013132A1 publication Critical patent/WO1993013132A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a megakaryocyte colony-forming cell (“Megakaryocte Coony-Forming Unit,“ CFli-MegJ) that is differentiated from pluripotent blood stem cells, 3) A human that promotes the maturation of megakaryocytes in the presence of an active substance such as megakaryocyte colony stimulating factor (Meg-CSF).
  • Megakaryocyte colony stimulating factor Meg-CSF
  • Meg-POT Megakaryocyte Potentiator
  • Platelets are one of the blood-forming components that have important significance in hemostasis and thrombus formation in living organisms. Platelets become megakaryoblasts from hematopoietic stem cells in the bone marrow via megakaryocyte precursor cells, and are released into the blood from mature megakaryocytes.
  • IL-3 In humans, IL-3 (Teramura. M et al. “Exp. Hematol. J 16, 843 (1988))” and granulocyte 'macrophores have Meg-CSF activity.
  • Zykroney stimulating factor (Teramura, M et al. ⁇ . Hema to 1. J! ⁇ , 1011 (1989)) and the like are known.
  • Humans having Meg-POT activity include interleukin 6 (Teramura, M and Mizoguchi, ⁇ flnt. J. Cell Cloning J _8_, 245 (1990)) and interleukin 11 (Teramura, Met et al.). al.
  • the present invention provides a novel isolated megakaryocyte amplification factor derived from human.
  • the present inventors have developed a cell line derived from human knee cancer cell line “HPC—Y5j
  • a megakaryocyte amplification factor having Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu is provided.
  • FIG. 1 shows the results of reversed-phase HPLC (III) of Step 17 in Example 3.
  • FIG. 2 shows the results of the molecular weight measurement of Example 4 by SDS-PAGE of Meg-POT.
  • FIG. 3 shows a concentration-response curve of the Meg-POT activity of megakaryocyte amplification factor in Example 7. Each point is the average of two measurements.
  • the Meg-POT activity on the vertical axis was represented by the difference in the number of megakaryocyte colonies when the test sample was added and when it was not added (recombinant mouse IL-13 alone). The number of megakaryocyte colonies when no test sample was added was 22 and 25, with an average of 23.5.
  • the megakaryocyte amplifying factor of the present invention can be isolated and purified, for example, from the culture supernatant of a cell line “HPC-Y5” derived from human liver cancer tumor cells as follows. First, the cell line “HPC- # 5” is cultured as described in detail in Example 2 below, and the culture supernatant is collected. Then, the culture supernatant is purified and isolated by the procedure described in detail in Example 3.
  • the megakaryocyte amplification factor of the present invention was isolated and purified as shown in the Examples, but once isolated and purified and its properties were clarified, protein isolation was performed using those properties as indicators. It is clear that the megakaryocyte amplification factor of the present invention can be isolated and purified using any conventional method used for purification.
  • the megakaryocyte amplification factor of the present invention can be produced by genetic engineering means.
  • mRNA can be isolated from the above-described cell line “HPC-Y5 j according to a conventional method, and a cDNA library can be prepared based on the mRNA according to a conventional method.
  • the DNA probe of the present invention can be designed, for example, based on the partial amino acid sequence of the megakaryocyte amplification factor disclosed by the present invention, or by enzymatically or chemically cleaving the megakaryocyte amplification factor of the present invention, After determining the amino acid sequence of the fragment, a DNA probe can be designed based on the amino acid sequence.
  • the host is transformed with this expression vector, and the transformant is cultured to obtain the present invention.
  • the megakaryocyte amplification factor of the invention can be produced.
  • Conventional hosts such as prokaryotic cells such as Escherichia coli, lower eukaryotic cells such as yeast, and higher eukaryotic cells such as mammalian cells can be used.
  • the properties of the giant sphere of the present invention are shown below.
  • the megakaryocyte amplification factor of the present invention has a single band with a molecular weight of about 32000 (31000 to 33000) as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the megakaryocyte amplifying factor of the present invention is obtained by reverse phase chromatography (column: Vydac Protein C4, 4.6 ⁇ 250 mm, particle size 5 m, manufactured by Vydac) with 0.1% acetonitrile concentration in TFA of 40%. Megakaryocyte amplification factor activity is observed in ⁇ 45% of the fractions.
  • the megakaryocyte amplification factor activity was measured by the following method.
  • the method is performed by monolayer soft agar culture using mouse bone marrow cells.
  • Femoral bone marrow cells 0.1 ml (2 x 10 5 nucleated cells), recombinant mouse IL-3, 5 ng / ml, Iscove's Modified Dulbecco's
  • IMDM culture medium
  • McCoy's 5A culture medium containing 0.75% of agar
  • test sample diluted with IMDM containing 10% poma serum
  • the Meg-POT activity was determined by adding megakaryocyte colonies generated by adding the test sample and adding the test sample without adding the test sample (only IMDM containing 10% serum was added as a solvent). 13 The difference from the megakaryocyte colony number generated alone is used as an index.
  • the megakaryocyte-amplified spores of the present invention are glycoproteins, it is conceivable that deglycosylated medicaments obtained by a conventional method also have megakaryocyte-amplifying factor activity, so that the present invention is limited to the present invention. It is clear.
  • Tumors obtained from the liver node of a Teng Leukin patient were cultured in a carbon dioxide incubator (carbon dioxide concentration 5%, humidity 100%) using ⁇ 1640 medium containing 10% fetal serum (FBS). Established by doing. This cell line was adapted to 1% FBS Ham's F10 medium with FBS, and the PBS concentration was gradually decreased until the cells were finally grown in Ham's F10 medium without protein. This cell line grew in a monolayer on a plastic dish, and the doubling time was about 33 hours. (See Nozomi Yamaguchi et.al “CANCEB RESEARCH” 7008 (1990))
  • Example 2 UPC— ⁇ cultivation and mass production by roller bottle
  • the subculture of HPC—Y5 cells described in Example 1 was performed as follows. Burasuti click culture flasks (150 cm 2, co manufactured by-learning, Ltd.) have use a, 10- 8 M selenite Sanna Application Benefits um, 100 U / ml Bae Nishiri emission G force re U arm and 100 tf gZml sulfate kanamycin
  • the HPC-Y5 cells were cultured in 50 ml of a Ham's Nutrient Mixture F12 culture medium containing, and the culture medium was replaced every four days.
  • the culture solution was removed at the time of cell passage, and Ca, Mg buffered Dulbeco's PBS solution containing 0.125% trypsin (GIBC0) and 0.01% EDTA (Wako Pure Chemical Industries) preheated to 37'C was used. In addition, it was heated at 37 37 for 5 minutes.
  • the cells were separated by a pitting operation, transferred to a plastic centrifuge tube having a capacity of 15 ml, and collected by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes.
  • the cells were suspended in the above culture medium and subcultured to 4 to 5 new flasks. After standing still, the culture medium was removed together with the non-adherent cells, and the culture medium was newly added to continue the culture. Thereafter, the culture solution was changed every four days.
  • Tween 20 was added to the culture supernatant (27.3 liters) of the cells obtained according to the method described in Example 2 (2-7 liters) to a final concentration of 0.01%.
  • the concentrate was centrifuged overnight in a 10 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 0.01% Tween 20 at 4 ° C.
  • the operation (10000 Xg , 60 minutes) was performed to remove insolubles, and the supernatant was used for the following purification.
  • Step 1 S-Sepharose ion-exchange chromatography The above centrifuged supernatant was diluted with 20% acetate buffer (pH 5.0) containing 0.01% Tween 20. Was added to the column (5 X10 cm) equilibrated with S—Sepharose Fast Flow (Pharmacia). After washing the column with the same buffer, the concentration of NaCl in the same buffer was sequentially increased to 0.15M, 0.3M and 1.0M to elute the adsorbed protein. As a result of measuring the activity of the flow-through fraction, the washed fraction and the elution area at each salt concentration according to the method described above, Meg-POT activity was observed in the 0.15M-NaCI elution fraction.
  • Step-2 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography P-matography
  • the active fraction obtained in Step 1 was treated with lOmM Tris monohydrochloride buffer containing 0.01% Tween 20 (pH 7 overnight at 4'C).
  • the permeated solution was added to a DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) column (2.2 ⁇ 13 cm) equilibrated with the same buffer, and the column was washed with the same buffer.
  • the adsorbed protein was eluted by sequentially increasing the concentration to 0.15 M, 0.3 M, and 1.0 M.
  • the active fraction obtained in Step 2 was adjusted to about 2 by adding 5% trifluoroacetic acid (TFA) to the active fraction, and the reverse was equilibrated with 5% acetate nitrile containing 0.1% TFA.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the solution was added to a HPLC column (Vydac Protein C4, 10 ⁇ 250 mm, particle size 5 ⁇ m, manufactured by Vydac) at a flow rate of 1.0 ml / min.
  • the adsorbed protein was eluted with a linear concentration gradient of acetonitrile (5% ⁇ 65%, 120 minutes, 0.5% acetonitrile) at a flow rate of 1 mlZ.
  • the active fraction obtained in step 13 was diluted 2-fold with 0.1% TFA, and reverse-phase HPLC column (Vydac Protein C4, 4.6 x 250 mm) equilibrated with 35% acetonitrile containing 0.1% TFA , Particle size 5 m, manufactured by Vydac) at a flow rate of 1.0 ml / min.
  • the adsorbed protein was eluted at a flow rate of 1 ml / min using a linear gradient of acetonitrile (35% ⁇ 50%, 75 min, 0.2% acetonitril / min).
  • the eluted protein was detected by following the absorbance at 220 nm and 280 nm, and fractionated in 1 ml portions.
  • Meg-POT activity was observed in the fraction having an acetonitril concentration of 40 to 45%.
  • the active fraction obtained in step 15 was combined with a TSKgel G3000SW column (21.5 ⁇ 600 ntn manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (PH7.4) containing 0.01% Tween 20 and 0.15 M NaCl. , A guard column 21.5 x 75 nm) at a flow rate of 3 ml / min, and the eluted protein was detected at 220 nm. The activity of each fraction fractionated by 3 ml was measured. As a result, Meg-POT activity was observed in the fraction at an elution time of 49 to 54 minutes, and the fraction was collected. (Step 1 7) Reversed phase HPLC (III)
  • the pH of the active fraction obtained in Step 6 was adjusted to about 2 by adding 5% TFA, and chromatography was carried out under the same conditions as in reversed phase HPLC (II) in Step 1-4.
  • Meg-POT activity was observed in the main peak (acetonitrile concentration 40% -45%).
  • Figure 11 shows the results.
  • the peak fraction indicated by the horizontal bar in Fig. 1 was collected as purified Meg-POT.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the molecular weight markers were low molecular weight markers manufactured by Biorad (Phospho-rylase b (92.5 kd), Bovine serum albumin (6b.2 kd), Ovalbumin (45.Okd), Carbonic anhydrase (31.Okd), Soybean trypsin inhi-bitor (21.5 kd) and Lysozyme (14.4 kd)].
  • the megakaryocyte amplifying factor (Meg-POT) of the present study had a single band with a molecular weight of about 32000 (31000 to 33000).
  • Example 5 Amino acid composition of megakaryocyte amplification factor (Meg-P0T)
  • the purified Meg-POT sample obtained in Example 3 was hydrolyzed with 6 N HC1 containing 1% ethanol under reduced pressure at 110'C for 24 hours. To the liberated amino acid was added fuoriuisothiosyanate, and reacted at room temperature for 25 minutes. It was a thiol-thiol-rubamoyl (PTC) derivative. The resulting PTC derivative was quantified using a Pico-Tag amino acid automatic separation system (Waters). Table 1 shows the quantification results and the amino acid composition when 24 Ala or 29 Glx were used.
  • the purified Meg-P0T sample obtained in Example 3 was Edman degradation was performed using a sensor type (Applied Biosystems Inc.), and the obtained PTH-amino acids were identified using a PTH Analyzer-1120 (Applied Biosystems Inc.). did. As a result, the following three amino acid sequences (sequences 1 to 3) near the N-terminus were observed.
  • the purified Meg-POT sample obtained in Example 3 was digested with V8 protease, and the amino acid sequence identified by the same treatment using a peptide fragment isolated by reversed-phase HPLC was sequenced.
  • Xaa represents an unidentified amino acid residue.
  • the megakaryocyte amplifying factor of the present invention has a dose-dependently increasing effect on the proliferation of megakaryocyte colonies in the presence of IL-13, and is therefore useful as a therapeutic agent for diseases associated with, for example, thrombocytopenia or decreased platelet function. There is expected.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Amplifiers (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書 新規な巨核球増幅因子 技術分野
本発明は、 '多能性血液幹細胞より分化し巨核球コ ロニー形成細胞 (Megakaryoc te Co 1 ony- Form i ng Unit, 「CFli - Meg J ) こ作用し ィ ンタ一ロイ キ ン 3 (IL— 3 ) 等の巨核球コ ロニー剌激因子 （Megaka ryocyte Co 1 ony- S t i mu 1 a t i ng Factor: Meg-CSF と略記する） 活性 を有する物質の存在下に巨核球の成熟を促進する ヒ ト由来の巨核球 増幅因子（Megakaryocyte Potentiator 「以下 Meg— POT と略記する ことあり 」 ） に関する。 背景技術
血小板は、 生体の止血、 血栓形成に重要な意義を持つ血液有形成 分の一つである。 血小板は、 骨髄中の造血幹細胞から巨核球系前躯 細胞を経て巨核芽球となり、 さらに成熟した巨核球から血液中に放 出される。
骨髄細胞から巨核球コロニーを形成させるには、 2種類の異なつ た作用を持つ因子が必要であると考えられている （Williams, N et al. [J. Cell Physiol.J HO. 101 (1982)) 。 すなわち、 単独で巨核 球コロニーを形成する Meg— CSF および、 それだけでは巨核球コロ ニーを形成させる活性はないが、 Meg— CSF とともに加えると巨核 球コロニー数を増加したり、 その成熟を促進する作用を示す Meg— POT である。
ヒ トでは Meg— CSF 活性を有するものとして IL— 3 (Teramura.M et al. 「Exp.Hematol. j 16, 843 (1988)) や顆粒球 ' マク ロ フ ァ ー ジコ ロニー刺激因子（Teramura, M et al. ΓΕχρ . Hema to 1. J !±, 1011 (1989)) 等が知られている。 また、 ヒ トで Meg— POT 活性を有する ものとしては、 イ ンターロイ キン 6 (Teramura, M and Mizoguchi , Η flnt.J.Cell CloningJ _8_, 245 (1990)) 、 ィ ンターロイキン 11 (Teramura, M et al. ("Blood J 79, 327 (1992)) 、 エリ ス口ポェチ ン （Bruno, E et al. Blood j 671 (1989)) 等が知られている。 しかし、 これらのものは巨核球♦ 血小板系に特異的な因子でばな く、 むしろ他の血球系や血球系以外の細胞にも作用を有しているこ とが知られている。 従って、 これらのものを医薬品として巨核球 ' 血小板系への作用を期待して投与した場合、 それとは別の作用をも 発現してしまう ことが危惧される。 このようなことから、 巨核球 ' 血小板系に特異的に作用し、 医薬品としての有用性の高い生理活性 物質が望まれている。 発明の開示
従って本発明は、 ヒ ト由来の単離された新規な巨核球増幅因子を 提供するものである。
本発明者はヒ ト膝臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞 「 HPC— Y5j
(Nozomi Yaraaguchi et.al CANCER RESEARCH 50, 7008 ( 1990) (1991 年 12月 27日工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研条寄第 3703号 (FERM BP— 3703) としてブダぺス ト条約に基づき国際寄託） を培養 し、 その培養上清より巨核球増幅因子（Meg— POT)を単離 ·精製する ことに成功し、 その物性を解明し、 本発明を完成した。 即ち本発明 は、 つぎの性質；
( 1 ) in vitroにおいて、 IL— 3の存在下で用量依存的に巨核球コ ロニーを増殖させる ；
( 2 ) SDS—ポリアク リルァミ ドゲル電気泳動による測定で分子量 約 32000 に単一バン ドを有する ；
( 3 ) 逆相高速液体ク ロマ トグラフ ィ ー（HPLC) (カ ラム ： Vydac Protein C4, 4.6 X 250mm,粒子サイ ズ 5 / m , Vydac 社製） におい て 0.1% ト リ フルォ口酢酸（TFA) 中ァセ トニ ト リ ル濃度 40〜 45%の 画分に溶出する ； および
( ) 分子中に下記ァ ミノ酸配列
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu を有する巨核球増幅因子を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は実施例 3におけるステップ一 7 の逆相 HPLC (III)の結果を 示す。
図 2 は実施例 4における Meg— POT の SDS— PAGEによる分子量測 定の結果を示す。
図 3 は実施例 7における巨核球増幅因子の Meg— POT 活性の濃度 一反応曲線を示す。 各点とも 2画の測定の平均値である。 なお、 縦 軸の Meg— POT 活性は、 被検検体添加時と非添加時 （組換え型マウ ス IL一 3単独） の巨核球コロニー数の差で示した。 被検検体非添加 時の巨核球コロニー数は 22および 25、 平均 23.5であつた。 発明を実施するための最良の形態
製造方法
本発明の巨核球増幅因子は、 例えばヒ ト滕臓癌腫瘍細胞由来の株 化細胞 「 HPC— Y5」 の培養上清から、 次のようにして単離 ' 精製す ることができる。 先ず、 株化細胞 「 HPC— Υ5」 を後出実施例 2 に詳 細に示すとおり培養して培養上清を回収する。 次いでこの培養上清 より実施例 3 に詳細に示す手順により精製し単離する。 本発明の巨核球増幅因子ば実施例に示す如く して単離 · 精製され たが、 一旦単離 ' 精製され、 その性質が解明された後は、 それらの 性質を指標として蛋白質の単離 · 精製に用いられる任意の常法を用 いて本発明の巨核球増幅因子を単離 · 精製することができることは 明らかである。
さらに、 本発明の巨核球増幅因子を遺伝子工学的手段により製造 することも可能である。 例えば上記株化細胞 「 HPC— Y5 j から常法 に従つて mRNAを単離し、 その mRNAに基づき常法に従つて cDNAラィブ ラリーを作製することができる。 この cDNAライブラリーをスク リー ユングするための DNAプローブは、 例えば本発明によって明らかに された巨核球増幅因子の部分ァミノ酸配列に基づいて設計すること ができる。 あるいは本発明の巨核球増幅因子を酵素的にまたは化学 的に切断し、 その断片のアミノ酸配列を決定したのち、 そのアミノ 酸配列に基づいて DNAプローブを設計することもできる。
次に、 こう して得られた巨梭球増幅因子をコ一ドする cDNAを適当 なべクターに挿入したのち、 この発現ベクターにより宿主を形質転 換し、 この形質転換体を培養することにより本発明の巨核球増幅因 子を製造することができる。 このための宿主としては、 大腸菌のご とき原核細胞、 酵母のごとき下等真核細胞、 哺乳動物細胞のごとき 高等真核細胞等、 常用の宿主を用いることができる。
本発明の巨梭球增幅园子の性質を以下に示す。
( 1 ) 分子量
本発明の巨核球増幅因子は SDS—ポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳 動による測定で分子量約 32000 (31000〜33000)に単一バン ドを有す る。
( 2 ) 都分ァミノ酸配列
本発明の巨核球増幅因子、 あるいは本因子をプロテアーゼで消化 した後、 逆相 HPLCにより得られたぺプチ ド断片を気相式プロティ ン シークェ ンサ一 470A型（ABI社製） を用いてヱ ドマン （Edoman) 分解 し、 得られた PTH—ア ミノ酸を PTH—アナライザー 120型（ABI社製） にて同定した場合、 分子中に次のア ミ ノ酸配列 （配列番号 ： 1 ) ； Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leuを有 する。 この配列は PIR蛋白質データベースおよび Swiss Prot蛋白質 データベースで検索した結果、 同一の配列は見いだされなかった。
( 3 ) 巨核球増幅因子活性
本発明の巨核球増幅因子は、 逆相ク ロマ トグラフ ィー （カ ラム ： Vydac Protein C4, 4.6 X 250mm ,粒子サイ ズ 5 m , Vydac 社製） において 0.1% TFA中ァセ トニ ト リル濃度 40〜45%の画分に巨核球 増幅因子活性が認められる。
なお、 巨核球増幅因子活性は次記の方法で測定した。
巨核球増幅因子活性の測定方法
マウス骨髄細胞を用い、 単層軟寒天培養法により行う。
即ち、 ゥ.マ血清 （56'C 30分処理、 Biocell社製） 0.2ml、 マウス
(C57BLZ 6 N系雄性、 6〜12週齢） 大腿骨骨髄細胞 0. lml ( 2 X 105 有核細胞） 、 組換え型マウス IL— 3を 5 ng/mlを舍む Iscove's Modified Dulbecco' s 培養液（IMDM) 0.2ml、 寒天を 0.75%舍む改変 McCoy's 5A培養液 0.4mlおよび被検検体 （10%ゥマ血清を舍む IMDM で希釈したもの） 0.1mlを混合して、 直径 35mmの組 ί培養プラスティ ックディ ッシュに入れて固まらせたのち、 37て， 5 %炭酸ガス /95 %空気、 100%湿度の条件で培養を行う。 培養 6 日目に寒天層ごと スライ ドガラス上に取出し乾燥させ、 フィルム状標本としたものを 5 %グルタルアルデヒ ドで固定し、 Nakeff らの方法 (Pros . Soc . Exp . Biol. Med. 151, 587 (1976年））により、 アセチルコ リ ンエステラー ゼ染色および巨核球コ ロニー数の算定を行う。 この際、 ァセチルコ リ ンエステラーゼ染色陽性細胞 4個以上舍む集塊を巨核球コ ロニ 一とする。 検鏡の倍率は 200倍である。 なお、 Meg— POT 活性は、 被検検体を添加して生じた巨核球コ ロニー数と被検検体を添加せず に （10%ゥマ血清を舍む IMDMのみ溶媒として添加） 組換え型 IL一 3 単独で生じた巨核球コ ロニー数との差を指標とする。
なお、 本発明の巨核球増幅 S子は糖蛋白質であるが、 常法で得ら れる脱糖鎮体も巨核球増幅因子活性を有することが考えられること から、 本発明に舍まれることは明確である。
以下に実施例によって本発明を詳細に説明するが、 この実施例に よって本発明が限定されるものではない。
実施例 1. Meg— POT 産生細胞株 HPC— Y5の樹立
滕臓瘙患者のリ ンバ節より得られた腫瘍を 10%ゥシ胎児血清（FBS) を舍む βΡΜΙ1640培地を用い、 炭酸ガスイ ンキュベータ一 （炭酸ガス 濃度 5 %、 湿度 100%) 中にて培養することにより樹立した。 この 細胞株を 1 % FBS舍有 Ham's F10培地に順化させ、 さらに PBS濃度 を徐々に低下させ、 最終的に蛋白不舍の Ham's F10培地中にても增 殖し得るまで順化させた。 本細胞株はプラスティ ックディ ッシュ上 で単層状に増殖し、 倍化時間は約 33時間であった。 （Nozomi Yamagu- chi et.al 「CANCEB RESEARCH 」 7008 (1990 ) 参照）
例 2. — UPC— ^の維代培養およびローラーボ トルによる大量 実施例 1で述べた HPC— Y5細胞の継代培養は以下に示す如く行つ た。 ブラスティ ック培養フラスコ （150cm2、 コ一ニング社製） を用 い、 10— 8M亜セレン酸ナ ト リ ウム、 100 U /mlぺニシリ ン G力 リ ウ ムおよび 100 tf gZml硫酸カナマイ シンを含む Ham's Nutrient Mixture F12 培養液 50ml中で HPC— Y5細胞を培養し、 4 日毎に培養 液を交換した。 細胞継代時に培養液を除去し、 あらかじめ 37'Cに加温した 0.125 % ト リプシン（GIBC0社製） 、 0.01%EDTA (和光純薬社製） を舍む Ca, Mg不舍 Dulbeco's PBS溶液を加え 37 ΐで 5分間加温した。 ピぺッテ ィ ング操作により細胞を剝離し、 15ml容量のプラスティ ック製遠心 管に細胞を移し、 1500回転/分、 5分間の遠心により細胞を回収し た。 細胞を上記培養液に懸濁し、 新しいフラスコ 4〜 5本に継代し た。 一晚静置後、 培養液を非付着性細胞と共に除去し、 新たに上記 培養液を加えて培養を継続した。 以後 4 日毎に培養液を交換した。
また、 実施例 3で述べる Meg— POT の精製に供するための HPC— Y5細胞の口一ラーボ トルによる大量培養を以下の如く実施した。
上記の如く継代された HPC— Y5細胞が完全に密に増殖した 150c のプラスティ ック培養フラスコより上記の如く ト リ プシン一 EDT Aを 用いて細胞を回収し、 これを 0.2%ゥ シ胎児血清（Hyclone社製） を 舍有する上記培養液 250mlに浮遊させ、 1700cm2のプラスティ ック 製ローラーボ トル （コーユング社製） に移し、 0.5回転/分の速度 で面転培養を行った。 7 日後に培養液を血清を舍まない上記培養液 に交換し、 以後 4 日毎に上記無血清培養液の交換を行う こ とにより、 精製用無血清培養上清を回収した。
実施例 3. HPC— Y5株培養上清からの Meg— POT の精製
実施例 2で述べた方法に従って得た (：—¥5細胞の培養上清（27.3 リ ッ トル） に Tween 20を終濃度 0.01%となるように加えた後、 人工 腎臓 PAN 1200 (旭メディ力社製） を用いて、 約 200倍に濃縮した。 濃縮液を 0.01%Tween 20を舍む 10mM酢酸緩衝液（pH5.0) に対し、 4 てで一晩透折した。 透析内液に遠心操作（10000 X g , 60分） を施し 不溶物を除去し上清を以下の精製に用いた。
(ステップ一 1 ) S -Sepharose イオ ン交換ク ロマ トグラ フ ィ ー 上述の遠心上清を 0.01%Tween 20を舍む 20mM酢酸緩衝液（pH5.0) で平衡化した S — Sepharose Fast Flow (フア ルマシア社製） カ ラム ( 5 XlOcm) に添加した。 同緩衝液でカ ラムを洗浄した後、 同緩衝 液中、 NaClの濃度を 0.I5M, 0.3M及び 1.0Mと順次上げて吸着蛋 白を溶出した。 素通り画分、 洗淨画分および各塩濃度における溶出 面分について先に述べた方法に従って活性を測定した結果、 0.15M 一 NaCI溶出画分に Meg— POT 活性が認められた。
(ステップ— 2 ) DEAE-Sepharose イオン交換ク Pマ 卜グラフィ ステツブー 1で得た活性画分を 0.01%Tween 20を舍む lOmMト リス 一塩酸緩衝液（PH7. に対し 4 'Cで一晩透折した。 透圻内液を同緩 衝液で平衡化した DEAE— Sepharose Fast Flow (フア ルマシア社製） カラム（2.2X13cm) に添加し、 同緩衝液でカラムを洗浄した。 同緩 衝液中 NaCIの濃度を 0.15M, 0.3Mおよび 1.0Mと順次上げて吸着 蛋白を溶出した。 素通り面分、 洗浄画分および各塩濃度における溶 出面分について先に述べた方法に従って活性を測定した結果、 0.15 M— NaCI溶出面分に Meg— POT 活性が認められた。
(ステップ一 3 ) 逆相 HPLC ( I )
ステツブー 2で得た活性画分に 5 %ト リ フルォ口酢酸（TFA) を加 えて PHを約 2に調整し、 0.1% TFAを舍む 5 %ァセ トニ ト リ ルで平 衡化した逆栢 HPLCカ ラム （Vydac Protein C4, 10 X 250mm,粒子サイ ズ 5 μ m, Vydac 社製） に流速 1.0ml /分で添加した。 吸着蛋白は ァセ トニトリルの直線濃度勾配 （ 5 %→65%, 120分、 0.5%ァセ トニ ト リルノ分） により流速 1 mlZ分で溶出した。 溶出蛋白の検出 は 220nmおよび 280nmにおける吸光度を追跡することにより行い、 l ralずつ分面した。 各画分について活性測定を行った結果、 ァセ ト 二 ト リル濃度 40— 45%の面分に Meg— POT 活性が認められた。 (ステッ プ一 4 ) 逆相 HPLC ( I I)
ステップ一 3で得た活性画分を 0.1% TFAで 2倍希釈し、 0.1% TFAを舍む 35%ァセ トニ ト リ ルで平衡化した逆相 HPLC力 ラム (Vydac Protein C4, 4.6 X 250mm,粒子サイ ズ 5 m , Vydac 社製） に流速 1.0ml/分で添加した。 吸着蛋白はァセ トニ ト リルの直線濃度勾配 (35%→50%, 75分、 0.2%ァセ トニ ト リ ル/分） により流速 1 ml ノ分で溶出した。 溶出蛋白の検出は 220nmおよび 280nmにおける吸 光度を追跡するこ とにより行い、 1 mlずつ分画した。 各画分につい て活性測定を行った結果、 ァセ トニ ト リル濃度 40— 45%の画分に Meg— POT 活性が認められた。
(ステップ一 5 ) DEAE . ィ ォン交換 HPLC
ステップ— 4 で得た活性画分を凍結乾燥した後、 0.01%Tween 20 を舍む lOniMト リ スー塩酸緩衝液（PH8.0) に溶解し、 同緩衝液で平衡 化した Protein Pak G— DEAEカラム （Waters社製、 8.2X75mm) に 流速 0.7ml/分で添加した。 吸着蛋白は NaClの直線濃度勾配（0.0M → 0.2M, 40分、 5 mM NaCl/分） により流速 0.7mlZ分で溶出し た。 溶出蛋白は 220nmで検出し、 0.7mlずつ分画した。 各画分につ いて活性を測定した結果、 NaCl濃度 75mM以下の画分に Meg— POT 活 性が認められた。
(ステップ一 6 ) TSKgel G3000SWゲル濾過
ステップ一 5で得た活性画分を、 0.01%Tween 20及び 0.15M NaCl を舍む 50mMト リス—塩酸緩衝液（PH7.4)で平衡化した TSKgel G3000SW カラム （東ソ一社製 21.5 X 600ntn, ガー ドカラム 21.5 X 75nm) に 流速 3 ml/分で流出させ、 そして溶出蛋白は 220nmで検出した。 3 mlずつ分画した各画分について、 活性測定した結果、 Meg— POT 活 性は溶出時間 49〜54分の画分に認められたので、 その画分を回収し た。 (ステップ一 7 ) 逆相 HPLC (III)
ステツブー 6で得た活性画分を 5 % TFAを加えて pHを約 2に調整 し、 ステップ一 4の逆相 HPLC (II) と同一条件下にクロマ トグラフ ィーを行った。 各画分について活性を測定した結果、 主ピーク （ァ セ トニ ト リル濃度 40%— 45%) に Meg— POT 活性が認められた。 こ の結果を図一 1 に示す。 図— 1において横棒で示すピーク画分を精 製 Meg— POT として回収した。
実施例 4. 巨核球増幅因子（Meg— POT)の分子量
実施例 3で精製した巨核球増幅因子の分子量を ドデシル硫酸ナ ト リウムーボリアクリルァミ ドゲル電気泳動（SDS— PAGE) により測定 した。 分離ゲル濃度ば 12%、 濃縮ゲル濃度ば 4 %とした。 これらの 試料を遠心濃縮器 （ ト ミー精ェ社製） を用いて乾燥し、 5 % 2 - メルカプトエタノ一ルおよび 2 % SDSを舍む試料用緩衝液（pH6.8) に溶解し、 3分間煮沸した。 泳動は 100 Vで 30分、 140 Vで 1時間 行い、 ゲルはメタノール ：酢酸： 水 = 3 ： 1 ： 6で固定し、 銀染色 試薬 （第一化学薬品社製） により蛋白質を染色した。
分子量マーカーはバイオラ ッ ド社製低分子量マーカー 〔Phospho- rylase b (92.5kd) , Bovine serum albumin (6b.2kd) , Ovalbumin (45. Okd) , Carbonic anhydrase (31. Okd) , Soybean trypsin inhi - bitor (21.5kd) , Lysozyme (14.4kd) 〕 を用いた。
この結果を図 2に示す。 図 2から明らかなとおり、 本究明の巨核 球増幅因子（Meg— POT)は分子量約 32000 (31000 〜33000)に単一バン ド した。
実施例 5. 巨核球増幅因子（Meg— P0T)のァミノ酸組成
実施例 3で得た精製 Meg— POT 試料を 1 %フヱノ一ルを舍む 6 N HC1で、 110'C, 24時間、 減圧下加水分解した。 遊離したアミノ酸 にフユ二ルイ ソチオシァネートを加え、 室温で 25分間反応させ、 フ ュ ニルチオ力ルバモイ ル（PTC) 誘導体とした。 得られた PTC誘導体 を Pico— Tag ア ミノ酸自動分圻システム （ウ ォーターズ社製） を用 いて定量した。 定量結果及び Alaを 24個あるいは Glxを 29個とした 時のア ミノ酸組成を表 1 に示す。
M L
Dmole Ala =24 Glx = 29
542 4 1 R 2 1 R 0
] 29 3 29 Q
Q W 17 4 17
Ω 1 ν u OR}Q · Q o 1 Q 1 1 P Q
H 1 1
(Ό) fin? on ?
TV, r (τ) 9Q 0 7 7 A
A 1 a 717 3 24 0
Pro (P) 589.4 19.7 19.5
Tyr (Y) 34.5 1.2 1.1
Val (V) 329.4 11.0 10.9
Met (M) 35.1 1.2 1.2
Cys (C) N.D. *
He (I) 100.5 3.4 3.3
Leu a) 957.9 32.1 31.7
Phe (F) 172.6 5.8 5.7
Trp (W) N.D. *
Lys ( ) 89.6 3.0 3.0
* N.D. 定量せず
実施例 6. 巨核球増幅因子（Meg— POT)のァミノ酸配列
実施例 3で得た精製 Meg— P0T 試料を気相式プロティ ンシークェ ンサー 型 （アプライ ドバイ オ システムズ ' ィ ンク社製） を用い てエ ドマン分解を行い、 得られた PTH—アミノ酸を PTHアナライザ 一 120型 （アプライ ドバイオシステムズ ' ィ ンク社製） を用いて同 定した。 その結果、 N末端近傍のァミノ酸配列 （配列一 1〜 3 ) は 以下に示す 3種が認められた。 また、 実施例 3で得た精製 Meg— POT 試料を V 8プロテアーゼで消化し、 逆相 HPLCで単離したぺプチ ド断 片を用い、 同様の処理操作によって同定されたァ ミノ酸配列を配列
4 として示す。 なお Xaaは未同定のアミノ酸残基を示す。
1 5 10 15
酉 ！ I— 1 Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val
1 5 10
画— 2 Ala Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val
1 5 10
嗣ー 3 Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val
1 5
剛ー 4 Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val
剛— 1 Leu 号： 5 )
15
画一 2 Leu Ala (酉爾号： 4 )
15
剛— 3 Leu Ala Asn ,J 号： 3)
10 15 20
l^!l一 4 Leu Ala Asn Pro Pro Xaa lie Ser Ser Leu Xaa Pro Arg Gin Leu
25
Leu Gly Phe Pro 翻潘号： 2 )
(配列の上に示す数字はェ ドマン分解時のサイクル数である） 上記の配列 1〜 3のァミノ酸配列において以下のァミノ酸配列が 共通していることが認められた。
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu
(配列番号 ： 1 ) 実施例 7. 巨核球増幅因子（Meg— POT )の巨核球増幅図孑活性 実施例 3 で精製した巨核球増幅因子のマウス骨髄細胞に対する巨 核球増幅因子活性を先に述べた方法に従って測定した。 即ち、 精製 Me g— POT を 10 %ゥマ血清を含む I MD Mで 10倍希釈した。 これをさら にゥマ血清を舍む上記 I MDMで 2 > 4 , 8 , 16 , 32および 64倍に希釈 したものを調製し、 これらを被検検体として活性の測定を行った結 果、 図 3 に示すような濃度一反応曲線が得られた。 産業上の利用可能性
本発明の巨核球増幅因子は、 I L一 3 の存在下、 用量依存的に巨核 球コロニーを増殖させる作用を有することから、 例えば血小板減少 あるいは血小板の機能低下を伴う疾患に対する治療剤としての有用 性が期待される。 規則第 13規則の 2の寄託された微生物への言及
寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号
寄託番号及び寄託した日付 ：
1. 微ェ研条寄第 3703号 1991年 12月 27日
配 列 表
配列番号： 1
配列の長さ ： 14
配列の型： アミノ酸
トボロジ一 ： 直線状
配列の種類： ぺプチド
配列
Gl Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 1 5 10 配列番号： 2
配列の長さ ： 26
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直線状
配列の種類： ぺプチド
配列
Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Xaa lie Ser 1 5 10 15
Ser Leu Xaa Pro Arg Gin Leu Leu Gly Phe Pro
20 25
配列番号： 3
配列の長さ ： 16
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直線状
配列の種類： ぺプチ ド
配列
Gly Glu Thr Glv Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala 1 5 10 15
Asn 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 16
配列の型 ： ア ミノ酸
トポ口ジ一 ： 直線状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Ala Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 16
配列の型 ： ア ミノ酸
トポ口ジー ： 直線状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val
1 5 10 15
Leu

Claims

請 求 の 範 囲
1. 次の性質；
( 1 ) in vitroにおいて、 IL一 3の存在下で巨核球コロニーを用量 依存的に増殖させる ；
( 2 ) SDS—ボ アク リルァミ ドゲル電気泳動による測定で分子量 約 32000 に単一バン ドを有する ；
( 3 ) 逆相高速液体ク ロマ トグラフィー （カラム ： Vydac Protein C4,
4.6 X250 ，粒子サイズ 5 m, Vydac 社製） において 0.1% トリフルォ口酢酸中ァセ トニ ト リル濃度 40〜45%の画分に溶出する ； および
( ) 分子中に下記ァミノ酸配列
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu を有する巨核球増幅因子。
PCT/JP1992/001689 1991-12-27 1992-12-24 Novel megakaryocyte amplifier WO1993013132A1 (en)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002126680A CA2126680C (en) 1991-12-27 1992-12-24 Novel megakaryocyte potentiator
EP93900384A EP0621285B1 (en) 1991-12-27 1992-12-24 Novel megakaryocyte potentiator
KR1019940702233A KR100233701B1 (ko) 1991-12-27 1992-12-24 신규 거핵구 증폭인자
AT93900384T ATE221084T1 (de) 1991-12-27 1992-12-24 Neuer megakaryocyten-verstärker
US08/256,133 US5498698A (en) 1991-12-27 1992-12-24 Megakaryocyte potentiator
AU31721/93A AU658040B2 (en) 1991-12-27 1992-12-24 Novel megakaryocyte amplifier
DE69232698T DE69232698T2 (de) 1991-12-27 1992-12-24 Neuer megakaryocyten-verstärker

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP36152291 1991-12-27
JP3/361522 1991-12-27
JP4/122518 1992-03-31
JP12251892 1992-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1993013132A1 true WO1993013132A1 (en) 1993-07-08

Family

ID=26459624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1992/001689 WO1993013132A1 (en) 1991-12-27 1992-12-24 Novel megakaryocyte amplifier

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5498698A (ja)
EP (1) EP0621285B1 (ja)
JP (1) JP3328341B2 (ja)
KR (1) KR100233701B1 (ja)
CN (1) CN1075148A (ja)
AT (1) ATE221084T1 (ja)
AU (1) AU658040B2 (ja)
CA (1) CA2126680C (ja)
DE (1) DE69232698T2 (ja)
ES (1) ES2180542T3 (ja)
TW (1) TW224975B (ja)
WO (1) WO1993013132A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994010312A1 (en) * 1992-10-23 1994-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gene coding for megakaryocyte potentiator
US5766581A (en) * 1994-03-31 1998-06-16 Amgen Inc. Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
US8137908B2 (en) 2002-07-12 2012-03-20 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
US11285197B2 (en) 2002-07-12 2022-03-29 Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7375183B1 (en) 1996-01-05 2008-05-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mesothelin, immunogenic peptides derived therefrom, and compositions comprising mesothelin, or immunogenic peptides thereof
JP2000505787A (ja) * 1996-01-05 2000-05-16 アメリカ合衆国 中皮抗原及びそれを標的化するための方法及びキット
US6809184B1 (en) * 1997-12-01 2004-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
WO2000057891A1 (en) 1999-03-30 2000-10-05 Trustees Of Boston University Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes
WO2000073346A1 (en) 1999-05-27 2000-12-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immunoconjugates having high binding affinity
US20040180387A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-16 Fujirebio Diagnostics, Inc. Detection of urinary mesothelin-/megakaryocyte potentiating factor-related peptides for assessment of ovarian cancer
CA2700860C (en) 2007-10-01 2016-07-19 Jonathan A. Terrett Human antibodies that bind mesothelin, and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04295500A (ja) * 1991-03-26 1992-10-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な巨核球増幅因子とその製法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0517925A4 (en) * 1990-12-28 1994-08-24 Asahi Chemical Ind Novel megakaryocyte amplifier and production thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04295500A (ja) * 1991-03-26 1992-10-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な巨核球増幅因子とその製法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blood Cells, Vol. 15, No. 1 (1989), M.W. LONG, "Signal transduction events in vitro megakaryocytopoiesis", p. 205-229. *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994010312A1 (en) * 1992-10-23 1994-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gene coding for megakaryocyte potentiator
US5766581A (en) * 1994-03-31 1998-06-16 Amgen Inc. Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
US8137908B2 (en) 2002-07-12 2012-03-20 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
US9296784B2 (en) 2002-07-12 2016-03-29 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
US10350282B2 (en) 2002-07-12 2019-07-16 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
US11285197B2 (en) 2002-07-12 2022-03-29 Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems

Also Published As

Publication number Publication date
ES2180542T3 (es) 2003-02-16
DE69232698D1 (de) 2002-08-29
US5498698A (en) 1996-03-12
DE69232698T2 (de) 2003-03-20
AU658040B2 (en) 1995-03-30
ATE221084T1 (de) 2002-08-15
JP3328341B2 (ja) 2002-09-24
KR100233701B1 (ko) 1999-12-01
KR940703858A (ko) 1994-12-12
EP0621285A1 (en) 1994-10-26
EP0621285B1 (en) 2002-07-24
AU3172193A (en) 1993-07-28
CN1075148A (zh) 1993-08-11
EP0621285A4 (en) 1995-05-24
JPH05331200A (ja) 1993-12-14
CA2126680A1 (en) 1993-07-08
TW224975B (ja) 1994-06-11
CA2126680C (en) 2002-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110845603B (zh) 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途
JP3205578B2 (ja) キメラ繊維芽細胞成長因子
CA2017379C (en) Purification and characterization of a glioma-derived growth factor
WO1993013132A1 (en) Novel megakaryocyte amplifier
JPS63267292A (ja) 新規ポリペプチド
AU673870B2 (en) Hirudin mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, and production of product from said microorganism
CN113683679A (zh) 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l6t及其制备方法和用途
CN113637068A (zh) 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l5t及其制备方法和用途
JPS61124392A (ja) 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法
CA1341015C (en) Outer membrane protein f of pseudomonas aeruginosa
CN113735966A (zh) 一种抗肿瘤重组胶原蛋白及其制备方法和应用
EP0251730A2 (en) Production of human lysozyme
JPH06220091A (ja) 修飾された血小板第４因子
JPS5841849A (ja) ヒト白血球インタフエロン
JP3106191B1 (ja) Ｆｇｆ−５の生理的機能制御ペプチド及び該ペプチドを含有する医薬組成物
KR20080026085A (ko) 곤충세포에서 제조한 재조합 ｅ-셀렉틴
CN113683678B (zh) 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途
JPS61291598A (ja) 魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法
JP2000502258A (ja) 抗微生物タンパク質
JPH0220296A (ja) 変異ヒト腫傷壊死因子
CN104650188B (zh) 多肽及其应用
JPH01231891A (ja) 変異ヒト腫瘍壊死因子
JPH09503646A (ja) アンチトロンビンポリペプチド類似体及びその製造法
JPH07196688A (ja) 新規な生理活性ポリペプチド、その製造方法及び用途
JPH04258294A (ja) 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BB BG BR CA CS FI HU KR LK MG MN MW NO NZ PL RO RU SD UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN ML MR SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
EX32 Extension under rule 32 effected after completion of technical preparation for international publication
LE32 Later election for international application filed prior to expiration of 19th month from priority date or according to rule 32.2 (b)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2126680

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1019940702233

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08256133

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1993900384

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1993900384

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1993900384

Country of ref document: EP