WO1990006127A1 - STABILIZED COMPOSITION OF INTERLEUKIN-1$g(b) - Google Patents

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WO1990006127A1
WO1990006127A1 PCT/JP1989/001212 JP8901212W WO9006127A1 WO 1990006127 A1 WO1990006127 A1 WO 1990006127A1 JP 8901212 W JP8901212 W JP 8901212W WO 9006127 A1 WO9006127 A1 WO 9006127A1
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PCT/JP1989/001212
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Yuji Sugahara
Hirotsugu Kaise
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Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to new stabilized compositions of interleukin-lyS (IL-1yS) actives.
  • IL-1yS interleukin-lyS
  • IL-1yg is produced not only by macrophages and monocytes but also by many cells and has various biological activities. (Metabolism, Vol.23, extra edition, immunity 86, p97-1 04 (1986); Medical Immunology. Vol. 12, No. 6, P 753-760 (1986), etc.). Based on the above activity, the IL-1 / 3 is expected to be applied as a pharmaceutical, and the present applicant has also previously shown that IL-1 ⁇ 3 and its derivatives are effective for various pharmaceutical uses. [Refer to Patent Publication No. EP 0 237 967 A2].
  • the IL-15 active substance is used in very small amounts with strong pharmacological activity, but has adsorptivity to the container wall. The lower the content as an active ingredient, the more this adsorptivity becomes a problem. It is necessary to prevent it. IL-11 actives are also unstable, and this instability tends to increase as the active ingredient content decreases.
  • the present invention solves the above-mentioned problems, provides a stable composition of IL-118 active substance which is particularly suitable for application as a pharmaceutical, and provides the above-mentioned IL-11 ⁇ -active substance having isotonicity. It is intended to provide a stabilized composition of the present invention.
  • IL-1 ⁇ active substance
  • a stabilized composition of IL-1 ⁇ comprising a human serum albumin and / or a saccharide and a surfactant together with an IL-11 active substance.
  • the IL-11yS active substance used as an active ingredient includes IL-11 and its derivatives. More specifically, such active ingredients are described in European Patent Publication by the present applicant (EP 0237 967 A).
  • polypeptides described in 2) and their equivalents can be exemplified.
  • the polypeptide has the following formula (A)
  • At least one amino acid residue selected from Tyr at position 1 and Ser at position 153 is deleted or substituted with another amino acid residue.
  • Amino acid sequence from ⁇ at position 1 to Thr at position 9 or at least one amino acid residue in the amino acid sequence has been deleted (provided that Ala described in a) above) , except that at least one amino acid residue selected from the group consisting of Val at position 3, Arg at position 4, Ser at position 5 and Cys at position 8 is deleted),
  • the IL-11 derivative contains an amino acid sequence that satisfies one or two or more of the above requirements a) to IL11; 5 in the amino acid sequence represented by the formula (A). It is a polypeptide that Preferred derivatives are those having an amino acid sequence that satisfies at least one of the above requirements a) to e) and at least one of the requirements a) to c) and the requirement of d) at the same time. It has an amino acid sequence.
  • polypeptide which is an IL-1 derivative are as follows.
  • Amino acid sequence from A la at position 1 to Val at position 3, amino acid sequence from A la at position 1 to Leu at position 6, or amino acid sequence from A la at position 1 to Thr at position 9 A polypeptide in which the sequence is at least deleted.
  • amino acid sequence from Asp to Ser at position 153 amino acid sequence from Gin to Ser at position 153
  • an amino acid sequence represented by formula (B) 1 1 2 'Amino sequence from A la to 1 16' Asp, 77 'position Met 1 1 Amino sequence from 6 'position Asp to amino acid sequence 71 1' amino acid sequence from Met to 116 'position Asp amino acid sequence from 32' position Met to 1 16 'position Ser
  • the above IL-1 derivative comprises an amino acid sequence in which a specific amino acid residue at a specific position in the amino acid sequence of IL-1 yS is replaced with another amino acid residue, and a specific position.
  • polypeptides having an amino acid sequence with an amino acid residue added to the amino acid residue include polypeptides having an amino acid sequence with an amino acid residue added to the amino acid residue, but the amino acid residue capable of this substitution and addition constitutes a human protein —amino Any acid residue may be used, and a neutral amino acid residue is preferred.
  • Cys may form an intramolecular or intermolecular disulfide bond based on its SH group, and taking this into consideration, the amino acid residue may be replaced with the above amino acid group other than Cys. It is preferred that Particularly preferred are, for example, Gly, Lys, Gin or Asp for position 4 A, Ser or Ala for position 8 Cys, and G 1 for position 11 Arg.
  • n 30 for Tyr for His, 71 for Cys, Ser, A la or Val, 93 for Lys, Leu or Asp, 98 for Arg In the case of Leu, Gin in the case of Lys at position 103, Arg in the case of Trp in position 130, Gin in the case of Tyr in position 121, and addition of N-terminal In this case, Met, Leu, Arg or Asp can be indicated.
  • Such IL-1 1 ⁇ induction ⁇ and IL-1; 3 are, for example,
  • LAF activity tumor saturating growth inhibitory activity (GIF activity), that is, active suppression of tumor cell growth, Colony stimulating factor (CSF), interferon (IFN), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), etc.
  • GIF activity tumor saturating growth inhibitory activity
  • CSF Colony stimulating factor
  • IFN interferon
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-3 interleukin-3
  • Production promoting activity of various kinds of ytokines that is, for example, the activity of acting on human cells to remarkably promote the production of those cytokines, anti-inflammatory activity, particularly, for example, administration to arthritis model animals.
  • Activity that effectively suppresses the progression of arthritis prevents radiation damage, that is, irradiation of whole body radiation during bone marrow transplantation, radiation irradiation during cancer treatment, etc., biological damage or serious side effects during a radiation accident, etc.
  • the IL-1 / 3 derivative described above is superior in at least one of the above activities, or in that it is less toxic and has fewer side effects. Accordingly, the above-mentioned IL-11 ⁇ derivative and IL-1 / 3 are used as an immune system stimulant, for example, for enhancing the production of antibody ⁇ wagutin, and an antitumor agent, for example, for a cytochrome such as CSF, IL-12, IL-13. It is useful as a pharmaceutical product such as a protein production accelerator, an anti-inflammatory agent, or an antiradiation agent.
  • IL-11 and its induction ⁇ have a significant effect on inflammation such as arthritis indicates that IL-i
  • the IL-11; 3 derivative is superior in at least one of the above activities, or (and) is superior in lower toxicity and fewer side effects.
  • the above-mentioned IL-11; 5 and its derivatives are effective as CSF production promoters, and when administered to humans, may cause risks such as viral infection and antigen-antibody reaction. Without cancer chemotherapy or radiation therapy can effectively recover granulocytopenia due to bone marrow hypoplasia (a therapeutic agent for granulocytopenia).
  • the above-mentioned CSF production promoter can also be effectively used as an agent for preventing and treating various diseases based on the action of CSF due to its original CSF production promotion action.
  • CSF has an effect of promoting the function of granulocyte-macrophage [Lopez, A.F. et al., J. Iinniunol., 131,
  • IL-1 ⁇ derivative is also useful as a prophylactic and therapeutic agent for such opportunistic infections, especially when administering anticancer drugs where such opportunistic infections are frequently observed, i.e., in chemotherapy for acute leukemia or bone marrow transplantation ⁇ .
  • IL-11 ⁇ and its derivatives are extremely effective, for example, in the production of various useful cytokines in vitro from cell lines, based on their activity to promote cytokine production. Can be used for The production of natural type cytokines from such cell lines has attracted attention, especially for glycoproteins, and it is possible to obtain useful cytokines efficiently and in large quantities.
  • IL-1 L ⁇ derivative, at least the Cys at position 71 is substituted or deleted, and in particular, the above Cys is substituted with another amino acid residue such as Ser, Ala. Val and the like. The substituted one shows high activity.
  • an IL-1 derivative in which at least Arg at position 4, Lys at position 93, and Cys at position 8 have been substituted or deleted, and at least one amino acid residue after position 103 has been deleted. All the derivatives were prostaglandin E
  • PGE has a weak production promoting effect and therefore has less side effects such as exothermic effect and less toxicity, and furthermore, induction by substitution or deletion of at least Arg at position 4 or L's at position 93 is not possible.
  • GIF and LA F they have stronger stimulating activity and anti-inflammatory activity.
  • those in which at least a specific amino acid residue or polypeptide is added to the N-terminus of the formula (A) are those which promote CSF production as compared with GIF activity and LAF activity. It is more effective when it is used as a medicament, especially as an oral or suppository, in terms of its enhanced action and anti-inflammatory action, low toxicity and long-lasting action.
  • the above derivatives particularly those obtained by substitution or deletion of at least Cys and Z at position 8 or Cys at position 71, in particular, the above Cys is replaced with another amino acid residue such as Ser, Ala, V Those substituted with al and the like are excellent in binding to the IL-11 receptor under various conditions.
  • the above-mentioned specific polypeptide that is, IL-11 and its derivatives can be produced by, for example, a genetic engineering technique. That is, it is produced by utilizing a gene encoding the specific polypeptide, incorporating the gene into a vector of a microorganism, and replicating, copying, and translating in the symptomatic cell. be able to.
  • the gene used in the above method is totally synthesized by chemical synthesis of nucleic acid according to a conventional method such as the phosphite triester method (Nature, 310, 105 (184)) if it is fresh. It can be conveniently synthesized using a gene encoding IL-1; 5 or a precursor thereof.
  • the gene can be synthesized from the gene according to a conventional method including the above-mentioned chemical synthesis means. It can be easily produced by modifying a specific amino acid sequence into a nucleic acid sequence encoding it.
  • nucleic acid (base) sequence may be performed according to a known method, and is carried out in accordance with the amino acid sequence of the desired polypeptide.
  • Genetic engineering techniques include, for example, Molecular Cloning, Col. d Spring Harbor Laboratory (1992).
  • restriction enzymes DNA ligase, polynucleotide kinase, etc.
  • Conventional methods such as treatment with various enzymes such as enzyme and DNA polymerase can be employed, and these enzymes can be easily obtained as commercial products.
  • Isolation and purification of the gene or nucleus in each operation may be performed according to a conventional method, for example, agarose electrophoresis.
  • the replication of the obtained gene may be performed according to a method using an ordinary vector, as described in part below.
  • a DNA fragment or a synthetic linker encoding a desired amino acid sequence can be easily produced by the above-described chemical synthesis.
  • the codon corresponding to the desired amino acid is known per se and may be selected arbitrarily, for example, according to a conventional method in consideration of the codon usage frequency of the host to be used. (Nucl.
  • codon modification of these nucleic acid sequences may be performed, for example, in the usual manner using a cytochrome primer using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification of about 15 to 30 mer.
  • Site-Specific Mutagenesis Proc. Natl. Acad. Sci .. 81, 5662
  • Leotide method [Messing, J. and Vieira, J .. Gene. 1, 269-276 (1 982)], etc., can be used to determine and confirm its nucleotide sequence. Any of the various known methods can be employed.
  • target gene a gene encoding the above-mentioned polypeptide having the specific amino acid sequence is provided (hereinafter, this gene is referred to as “target gene”).
  • the specific polypeptide can be produced using the above-mentioned target gene according to a known general gene recombination technique. More specifically, a recombinant DNA capable of expressing the target gene in a host cell may be prepared, introduced into a host cell, transformed, and the transformant may be cultured.
  • the eukaryotic cells include cells such as vertebrates and yeast.
  • the vertebrate cells include Cos cells, which are monkey cells [Y. Gluznian, Cell, 23, 175-182] (1 981)] and Chinese * Hamster ovary cells lacking dihydrofolate reductase [Url aub and LAChasin. Proc. Natl. Acad. Sci .. USA. 77, 42 16—422 0 (1980)] Etc. are often used, but are not limited thereto.
  • As a vector for the expression of spinal cord cells it is located upstream of the gene to be normally expressed.
  • a promoter having a promoter to be placed, a splice site of RNA, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like can be used, and may further have a replication origin, if necessary.
  • An example of such an expression vector is pSV2dhfr CS.Subraiani.R. Mulligan and P. Berg, Mol. Cell. Biol., 1_ (9), 854-864], which has the early promoter of SV40. Yes, but not limited to.
  • Yeast is generally used as a eukaryotic microorganism, and among them, yeast belonging to the genus Saccharomyces can be advantageously used.
  • yeast belonging to the genus Saccharomyces can be advantageously used.
  • expression vectors for eukaryotic microorganisms such as yeast include pAM82 CA. Miyanohara et a, which has a promoter for the acid phosphatase gene, and Proe. Natl. Acad. Sci .. USA, 8Q, 1-5 (1983)]. Etc. can be used favorably.
  • Escherichia coli and Bacillus subtilis are commonly used as prokaryotic hosts.
  • a plasmid vector that can be replicated in the host microorganism is used, and upstream of the gene is used so that the gene of interest can be expressed in this vector.
  • an expression plasmid in which a promoter and an SD (Shin and Dalgarno) base sequence and an ATG necessary for the initiation of protein synthesis are added to the DNA can be used.
  • Escherichia coli K12 strain etc. are frequently used.
  • pBR322 is often used as a vector, but is not limited thereto, and any of various known strains and vectors can be used. Is a promoter of all, for example, tryptophan promoter, P L promoter, l ac promoter, can be used l pp promoter, capable of expressing a gene of interest in each case.
  • the vector pTM1 having the tryptophan promoter overnight and the SD sequence as an expression vector [Now man, Metabolism, Vol. , 289 (19985), and a gene encoding a desired polypeptide to which ATG has been added, if necessary, to the restriction enzyme Clal site downstream of the SD sequence. What is necessary is just to connect.
  • a method for introducing the thus obtained expression vector into a host cell and transforming the same with a host cell generally used methods, for example, by collecting cells mainly in the logarithmic growth phase, It can be used to search for a method to incorporate a vector by processing the CS 2 into a state that makes it easy to naturally take in the DNA.
  • the transformation is carried out as generally known.
  • Mg Cg 2 or: b CS in the medium.
  • a method in which the host cells are converted into spheroblasts or protoplasts to transform the host cells into cells can be employed.
  • the desired transformant thus obtained can be cultured in a conventional manner, and the culture produces and accumulates the desired polypeptide.
  • the medium used for the culture may be any of various types of medium commonly used for ordinary cell culture. Specific examples thereof include, for example, L medium, E medium, M9 medium and the like. Examples of such a medium include various known carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins, and the like.
  • cultivation can be carried out using, for example, an M9 minimal medium to which casamino acid is added in order to make the promoter work.
  • An agent for enhancing the action of the tryptophan promoter such as indoleacrylic acid, can be added to the medium at an appropriate time during the culture.
  • Purification and purification of the target polypeptide from the culture containing the active substance thus obtained, that is, the specific polypeptide can be carried out in a conventional manner.
  • antagonizing the polypeptide from the host for example, it is better to adopt a benign cow such as an osmotic shock method in order to maintain the higher order structure. I prefer it.
  • the above-mentioned purification and isolation can be carried out, for example, according to various processing operations using the physical and chemical properties of the polypeptide [for example, “Biochemical Data Book I” pp. 1175-: 1259, 1st edition, 1st print, June 23, 1980, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.).
  • Examples of the method include, for example, treatment with an ordinary protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), liquid chromatography, centrifugation, electrophoresis, Affinity chromatography, dialysis, or a combination of these methods can be used.
  • the above operation can be performed, for example, as follows. That is, first, the target polypeptide is partially purified from the culture supernatant in advance. This partial purification is carried out using organic solvents such as acetate, methanol, ethanol, propanol, dimethylformamide (DMF), and acids such as acetic acid, perchloric acid (PCA), and trichloroacetic acid (TCA).
  • organic solvents such as acetate, methanol, ethanol, propanol, dimethylformamide (DMF), and acids such as acetic acid, perchloric acid (PCA), and trichloroacetic acid (TCA).
  • a treatment with a salting-out agent such as ammonium sulfate, sodium sulfate, or phosphorus sodium
  • a treatment using Z or transparent membrane, a completely nuclear membrane, or a hollow shell It can be performed by an ultrafiltration treatment using a film or the like.
  • the operations and conditions of each of these processes can be the same as those of normal cows.
  • the crude product obtained above is subjected to gel filtration to obtain a fraction in which the activity of the target substance is recognized.
  • the gel-permeating agent used here is not particularly limited, and for example, any of dextran gel, polyacrylamide gel, agarose gel, polyacrylamide dogarose gel, cellulose and the like can be used. Specific examples of these include Sephadex G type, LH type, Sepharose type, Sephacryl type (above, Pharmacia), Cell mouth fin (Chisso II), Biogel P type, and Biogel P type (Biorad). Co., Ltd.), Ultrogel (LKB), TSK-G type (Toso).
  • the desired polypeptide is obtained by subjecting the active fraction obtained by the above gel filtration to ion exchange column chromatography such as affinity chromatography using a hydroxyapatite column, DEAE method, CM method, SP method, etc. It can be further purified by filtration, chromatofocusing, reversed-phase high-performance liquid chromatography, etc., or by a combination of these operations, which makes it difficult to obtain a homogeneous substance.
  • ion exchange column chromatography such as affinity chromatography using a hydroxyapatite column, DEAE method, CM method, SP method, etc. It can be further purified by filtration, chromatofocusing, reversed-phase high-performance liquid chromatography, etc., or by a combination of these operations, which makes it difficult to obtain a homogeneous substance.
  • CI matrix focusing can be carried out by various known methods.
  • PBE 9 4 As a column, PBE 9 4 (F As a starting buffer, for example, imidazo mono-l-hydrochloric acid, etc., and as an eluate, for example, a poly-buffer 74 (manufactured by Pharmacia), pH 4.0 (pH 4.0) ) Etc. can be used.
  • the reverse-phase high-performance liquid outlet Ma Togurafi scratch for example using a C 4 Haipoa reverse phase HPLC column (Baiora de Inc. (Bi o- Rad Laboratori es)) or the like, ⁇ Seto two preparative Li Le as a transfer agent , Trifluoroacetic acid (TFA), water and the like, and a mixed solvent thereof.
  • the composition of the present invention contains a saccharide and a surfactant, together with the above-mentioned IL-1 ⁇ active substance such as IL-1 yS or a derivative thereof.
  • the composition of the present invention contains human serum albumin together with an IL-1 ⁇ active substance such as IL-11; 5 or a derivative thereof.
  • the composition of the present invention contains human serum albumin and a saccharide, together with the above-mentioned IL-11 and an IL-1 active substance such as one derived therefrom.
  • the composition of the present invention comprises the above-mentioned IL-1 ⁇ , a derivative thereof, etc. It contains saccharides, surfactants, and human serum albumin, as well as other substances.
  • the sugar is not particularly limited.
  • monosaccharides such as glucose, mannose, galactose, and fruit
  • sugar alcohols such as mannitol, inositol, and xylitol
  • disaccharides such as sucrose, maltose, and lactose
  • polysaccharides such as dextran and hydroxypropyl starch.
  • sucrose, maltose, mannitol, inositol, dextran and the like are particularly preferred.
  • the surfactant is not particularly limited, and any of ionic and nonionic surfactants can be used. Among them, polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester-based, polyoxetylenealkyl ether-based, and sosolebitanmon Surfactants such as noacyl esters and fatty acid dalycerides can be preferably used.
  • the amount of the above saccharides to be added is about 0.1 ing or more per gram of IL-1 ⁇ active substance, preferably about 1 to about: LOO nig.
  • the amount of addition should be about 0.001 ling or more per 1 / ig of IL-11 active substance, and preferably about 0.01 to 0.1 ling.
  • the addition amount of e also human serum albumin is ⁇ is IL — 1; 5 It is appropriate that the amount is about 0.001Dg or more, preferably about 0.01-1Oing per gram of the active waste.
  • composition of the present invention requires the above-mentioned specific components to be blended, and can be otherwise the same as ordinary pharmaceutical compositions of this kind.
  • the composition thus obtained may be used in various medical applications such as those described above, for example, immunostimulants for the production of antibodies, enhancement of vaccine effects and treatment of immunodeficiency, and antitumors.
  • a sulfur-containing reducing agent is added to the composition of the present invention in order to further increase the stability of the 11 ⁇ -1 ⁇ active.
  • the sulfur-containing reducing agent may be a conventional one, and specific examples thereof include cystine, N-acetyl homocystine, thioctic acid, thioglycolic acid and salts thereof, thioethanolamine, and the like.
  • Preferable examples include relatively mild reducing agents such as thioglycerol, sodium thiosulfate, thiodrum, dithiothreitol, and glutathione, which can be used alone or in combination. You can get tired of it.
  • Addition The amount is not particularly limited, but is about 0.001 ling or more per 1 ng of IL-11 active substance, preferably about 0.01 to 10 (when two or more kinds are used in combination, the total amount thereof is ) Is appropriate.
  • composition of the present invention is isotonicized with a buffer to obtain an isotonic preparation.
  • buffer used here examples include, for example, typically sodium citrate monosodium, sodium citrate monophosphate, sodium acetate monoacetate, borosilicate monosodium.
  • buffer solutions having a pH of about 4 to 8 and preferably a pH of 5 to 6 can be exemplified.
  • the composition of the present invention is prepared, for example, usually in the form of a pharmaceutical composition by mixing a pharmacologically effective amount of an IL-1 active substance and the above-mentioned specific components with a suitable pharmaceutical carrier.
  • a suitable pharmaceutical carrier any excipient or diluent such as a filler, a bulking agent, a binder, a humectant, a disintegrant and the like which are commonly used for preparing a preparation according to the use form can be used.
  • the form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it effectively contains the active ingredient IL-1 / 3 active substance, and may be a solid preparation such as a tablet, a powder, a pill, a pill and the like.
  • compositions can be prepared according to a conventional method.
  • the obtained pharmaceutical preparation is administered by an appropriate administration route according to the form of the pharmaceutical composition, for example, an injection-form pharmaceutical preparation is administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration or the like.
  • Pharmaceutical formulations in form can be administered orally or enterally.
  • the amount of the active ingredient in the pharmaceutical preparation and the dosage of the preparation are appropriately selected according to the method of administration of the preparation, administration form, purpose of use, symptoms of the patient to which the preparation is applied, etc., and are not fixed.
  • the preparation is prepared in the form of a preparation containing about 0.000 0.001 to about 80% by weight of the active ingredient, and the amount of the active ingredient contained in the preparation is about 0.00 per adult per day. 0 1 g ⁇
  • the administration need not be once a day, but can be divided into three to four times.
  • a stabilized composition of IL-1) S active substance which is attracting attention and expected as a pharmaceutical
  • the composition of the present invention provides a stable composition of IL-15 active substance, which is a key component It has excellent properties in terms of properties, and is stable for a long period of time even under the desired preparation as a usual pharmaceutical form such as freeze treatment or freeze-drying and under the usual storage conditions of such a medicine. It is very useful in this field.
  • FIGS. 1 to 3 are graphs showing the results of a test of the promoting effect of polypeptide I on CSF production.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of an anti-arthritis test for polypeptide I.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a CSF production promotion test of an IL-1 ⁇ derivative.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of an anti-inflammatory test of an IL-11S derivative.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of a radiation damage prevention effect test of an IL-1 ⁇ derivative.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of an opportunistic infection prevention effect test of an IL-11yS derivative.
  • the IL-11 ⁇ active substance (IL-1 ⁇ derivative) used as an active ingredient is indicated by the abbreviations shown in Table 1 below, and among them, polypeptides I to XXXX Are those described in Japanese Patent Application No. 63-152,398, and the polypeptides XXXXK to XXXXVI are obtained by the following production reference examples according to the above. is there.
  • the measurement of IL-11 activity and GIF activity of the present inventors follow the method described in the publication.
  • I L- ⁇ (1-1140) polypeptide (IL-liS with deletion from position 141 onwards)
  • I L- ⁇ - (7-153) polypeptide (IL-liS from which the amino acid sequence from Ala to Leu at position 1 has been deleted)
  • I I L- ⁇ - (10-153) polypeptide (I L-l ⁇ S from which the amino acid sequence from Ala to 9th Thr has been deleted)
  • XXXXVE des-Ser 153 -I Ll (IL deleted from Ser at position 153
  • This example is an example in which an IL-1 / 3 derivative (polypeptides XXXXXnr to xxxxxvi) having various amino acid residues added to the N-terminal of IL-11yS was produced.
  • the above 5779 bp fragment DNA was further digested with MspI to obtain a 543 bp fragment DNA having an MspI site at the 5 ′ end and a BamHI site at the 3 ′ end.
  • linker DNA having the following sequence was synthesized, and its 5 ′ end was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
  • the resulting plasmid was transformed into Escherichia coli HB101, and the resulting clone was subjected to DNA sequencing.As a result, it was confirmed that the gene was an IL-11-expressing gene having a Bgin site as intended. .
  • the amino group to be added includes a 5-amino sequence (Aia-Tyr-Va1-H Hs-Asp; AYVHD), acidic amino acids (Asp; D), neutral amino acids (Leu; L) and basic amino acids (Arg; R) were each selected.
  • AYVHD 5-amino sequence
  • Asp; D acidic amino acids
  • Leu; L neutral amino acids
  • Arg; R basic amino acids
  • IL-1 expression plasmid p trp IL-1, H2 was digested with Clal and Bgin to obtain a 4.9 kbp fragment DNA.
  • linkers (1) to (4) were synthesized, and their 5 'ends were phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
  • Each of the obtained 5′-terminal phosphorylated synthetic linkers was ligated to the above 4.9 kbp fragment DNA using T4 DNA ligase, and the four kinds of IL-1 ⁇ were ligated.
  • An N-terminal addition mutant protein expression plasmid was constructed.
  • Each of the plus plasmids was transformed into Escherichia coli HB101, and the resulting clone was subjected to a DNA sequence to confirm the intended DNA sequence.
  • the cells collected by centrifugation are treated with 1 M sodium hydrogen phosphate at 4 and then 5 mM Tris-HCl buffer
  • Pharmacological test example 1 Effect of polypeptide I on CSF production
  • the concentration should be 10% fetal serum-added hamster. 12K culture ⁇ [Ham, BG, Proc. Natl. Acd. Sci., 53,
  • FIG. 2 shows the obtained results in the same manner as in FIG. As shown in Fig. 2, polypeptide I with a GIF activity of 1 unit ⁇ or more is added to fibroblasts derived from normal human skin.
  • mice normal mice to (BAL BZC mice, purchased from Shizuoka experimental animal cooperatives), polypeptide de I (GIF activity and to 1 0 3 to that obtained in Reference Examples of various amounts: L 0 5 units / Was administered intravenously.
  • BAL BZC mice purchased from Shizuoka experimental animal cooperatives
  • polypeptide de I GEF activity and to 1 0 3 to that obtained in Reference Examples of various amounts: L 0 5 units / was administered intravenously.
  • blood was collected from each experimental animal, and the CSF concentration in the serum was measured using mouse bone.
  • Figure 3 shows the result.
  • ⁇ indicates various concentrations
  • the time (hr) after administration of the polypeptide I (in GIF unit Z individuals) and the abscissa axis indicate the CSF activity (unit Zma serum).
  • (1) shows the group administered with 100,000 GIF plants of polypeptide I Z individuals, (2) Z group with 10,000 GIF units, and (3) 1,000 GIF unit with I.
  • (4) shows the control group (HSA 10 g individual group).
  • the abscissa indicates the number of days (days) after adjuvant administration, and the ordinate indicates paw volume (X 0 0 ⁇ ⁇ ).
  • (1) shows 100,000 G IF units of polypeptide I ⁇ individual administration group, and (2) shows the same:! 10,000 GIF unit individual administration group, (3) 1,000 GIF unit ⁇ individual administration group, (4) 100 GIF unit individual administration group,
  • (5) shows a control group (saline administration group), and (6) shows a normal rat group.
  • Pharmacological test ⁇ 3 Efficacy of IL-1 ⁇ 5 'induction ⁇ to promote CSF production ⁇ soo U— 37 3 MG [ATCCCHTB17,
  • the Cell so that ⁇ concentration of 2 X 1 0 5 cells / ⁇ , (manufactured by G1BC0 companies) 1 0% FCS, MEM non-essential amino acids (F low Co.) and MEM pyruvate isocyanatomethyl Li um
  • the cells were suspended in Eagle's MEM medium (manufactured by Nissui) supplemented with (Flow), test substances were added at various concentrations, and the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 for 24 hours.
  • Each culture supernatant was collected, and the amount of CSF produced and accumulated in the culture supernatant was measured using mouse bone marrow cells.
  • the horizontal axis represents the concentration of the test substance (ng / ⁇ ), and the vertical axis represents the CSF activity ( ⁇ ).
  • the curves (1) to (7) in the figure show the results when the following polypeptides were used as test substances.
  • mice Male rats (Sprague Davley strain, Nippon Charles River Co., Ltd.) of 6 to 8 weeks of age were used in groups of 6 to 8 animals per group based on body weight on the day before the experiment.
  • a suspension of 1% strength lagenin (Marine Colloid) as a pro-inflammatory agent in physiological saline 0.1 ⁇ subcutaneous injection into the right hind leg of the rat to induce paw edema.
  • the right hind limb paw volume was measured using a plethysmometer (plethysiDoineter, Ugo-Vasile) at certain times before and after injection of the proinflammatory drug.
  • test substance was Dulbecco's phosphate buffered saline.
  • 3 ⁇ 4 indicates the time (hr) after administration of the proinflammatory drug, Indicates the edema rate ().
  • curve (1) shows the control group
  • curve (2) shows the group administered with 0.1 ixg of polypeptide VI
  • curve (3) shows the group treated with 1 ⁇ of polypeptide VI.
  • ⁇ (4) shows the group administered with 10 / ig of polypeptide VI, respectively.
  • mice Twenty-two hours before the lethal dose of X-rays was applied to BALB / c mice (9 weeks old), 1 gZ or 0.3 gZ mice of polypeptide VI were injected intraperitoneally. Using an X-ray irradiator (MBR-1505R, Hitachi Medical), the above mice were whole-body irradiated with 850 Lentogen X-rays, and their survival was confirmed every day thereafter. In addition, a PBS administration group was set as a control.
  • the horizontal axis represents the number of days (days) after X-ray irradiation
  • the vertical axis represents the survival rate (%) of the test animals
  • the curve (1) represents the group administered with 1 ag of the polypeptide VI.
  • curve (3) shows the control group.
  • the control group died midway on the 18th day after X-irradiation, while the polypeptide VI administration group The effect of preventing radiation damage was observed depending on the dose, and it was confirmed that about 80% of the 1 ⁇ g dose group was prevented from death due to radiation damage and survived.
  • mice ICR male mice (6 weeks old) were used as test animals (7 mice per group), and on the first day, 10-OmgZkg of 5-fluorouracil (5-Fu, manufactured by Kyowa Hakko Co., Ltd.) was intravenously administered. .
  • 5-fluorouracil 5-Fu, manufactured by Kyowa Hakko Co., Ltd.
  • a 1a mouse of polypeptide VI was administered subcutaneously, and on day 7, a prescribed amount of Pseudonionas aeruginosa E-2 was administered.
  • the number of surviving test animals was counted to determine the survival rate (%).
  • Fig. 8 (1) shows the results of the above experimental group, (2) shows the results of the control group not administered with polypeptide VI (only 5-Fu was administered), and (3) shows the results of the control group. The results of the control group to which neither 5-Fu nor polypeptide VI was administered are shown.
  • Fig. 8 ⁇ vertical axis indicates survival rate (%), and horizontal axis indicates groups A to ⁇ , each of which showed the following doses of peritoneal bacteria.
  • Group A 1 9000 bacteria / mouse administration group
  • Group B 3800 bacteria count Z mouse administration group
  • Group C 7 50 bacteria count Z mouse administration group
  • Group D 1 group with 50 bacteria
  • Group E 30 bacteria count Mouse administration group
  • Group F 6 bacteria count Z mouse administration group
  • U-373MG cells are cultured to confluence in RPMI-164 medium supplemented with 10% FCS, and with or without 2 OngZmfi polypeptide XXXI (Control) Incubated for 18 hours in medium.
  • RNA was extracted by the guanidinium munocesium chloride method, and oligo (dT) —cell opening—poly (A) + RNA (m) by chromatographic analysis. NA) was obtained.
  • Northern Pro Tti ing method according (Northern Blotting), with the port Li (A) ⁇ RNA 1 0 g to Agarosugeru (1.2 2%) electrophoresis After fractionation, it was transferred to a nitrocellulose ⁇ filter. Baked at 80 ° C under coagulation and 20 mM Tris:
  • the IL-11 activator used to induce production is structurally stable under these conditions and may bind to the IL-11 receptor on the cell surface. Required. In other words, it is important that the 11 ⁇ -1 ⁇ active substance binds to the 11 ⁇ -11 receptor and transmits the signal necessary for the production of cytokines into cells. Therefore, the following test was performed for binding to the IL-11 receptor on fibroblasts.
  • the cells are solubilized with Na0H, and the radioactivity (packed radioactivity) in the lysate and the lysate after washing the wells is determined. It was measured at the center.
  • the stopping power in the table was obtained by the following equation.
  • Such an index represents the anchoring force of the coexisting polypeptide I on IL-11 acceptance.
  • polypeptide I ie, IL-1 It was found that the body became ⁇ -binding to the IL-1 receptor over time and under the conditions of site-kind induction.
  • GIF activity [In the method described above, the A375S1 strain (Zenken No. 967 ⁇ ) was used as the human lanoma cell and measured.] 0 Polypeptide VI with a ⁇ (approx. 1; g protein content: about 3), Zween 80 (Polysolvate 80: manufactured by Nippon Surfactant, Inc.) 0.0 lfflgZmS and maltose 15mgZina in each amount were added to 0.01M sodium hydroxide solution (pH 6.0) and mixed, and the mixture was filtered.
  • the syrup was aseptically dispensed into vials at 1-ma portions and freeze-dried to prepare the composition of the present invention in the form of a preparation for injection.
  • the preparation is used, it is used by dissolving it in physiological saline 1 ⁇ .
  • composition of the present invention in the form of an injectable preparation containing polypeptide (2) or polypeptide (XXV) as an active ingredient was prepared.
  • IL-11yS active substances can be prepared in substantially the same manner as injectable preparations.
  • the above lyophilized preparation was stored in a glass bottle (airtight, light-shielded) container at room temperature or at room temperature, respectively.
  • the stability was evaluated after 1, 2, 3, and 6 months, respectively, based on the following criteria.
  • Osmotic pressure ratio When the initial value is 100%, 95 to
  • Table 8 shows the measured data (average value) after storage for 6 months in the above test.
  • Table 9 shows the results of Test ⁇ in the same manner as Table 8, and Table 9
  • the freeze-dried preparation was stored at 4 ° C. or room temperature in a glass bottle (airtight, light-shielded) container.
  • the stability was evaluated after storage for 1, 2 and 4 weeks based on the following criteria.
  • compositions of the present invention were prepared in the form of injectable preparations in the same manner as in (1) of Example 1 except that the ingredients were changed to the following (i) to (e).
  • Oi gZnis containing the composition of the present invention having the following composition in a glass vial, a silicone-coated glass vial, or a polypropylene container. And polystyrene containers to prepare the composition of the present invention.
  • compositions of the present invention prepared in (1) above were subjected to the following adsorption prevention test. That is, each composition sample was left at 4 for 2 days and 4 days, respectively, and the remaining amount of the IL-1 active was measured by the following Enzymimnoassay.
  • Tonicity agent (glycine) 2 1 mg Mannitol 5 ig
  • each sample of the present invention prepared in (1) above was examined by the following test. That is, each freeze-dried sample was placed in a glass vial (airtight, light-shielded), 25, 50. Stored at C or 70 ° C for 1, 2 or 4 weeks, respectively (except at 70 ° C for only 1 week).
  • the residual amount of IL-1 ⁇ active was measured by the following mouth chromatography (HPLC: HPLC system manufactured by Toso Corporation).

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Description

明 細 書
イ ンターロイキン一 1 ^5の安定化組成物
技 術 分 野
本発明はィ ンターロイキン— l yS ( I L - 1 yS ) 活性 物の新しい安定化された組成物に関する。
背 技
I L一 1 ygは、 マクロファージ ·単球のみならず多く の細胞から産生され、 多様な生物活性を示すことが知ら れている 〔代謝、 Vol.23, 臨時増刊号、 免疫 86, p 97 - 1 04 (1986) ； Medical Immunology. Vol . 1 2, No.6, P 7 53 - 760 (1986) 等参照〕 。 上記活性より該 I L一 1 /3は医薬品としての応用が期 待されており、 本出願人もまた先に I L一 1 ^3及びその 誘導体が種々の医薬用途に有効であることを明らかにし た 〔ョ一口ッパ特許公開番号 ： E P 0 2 37 967 A 2 参照〕 。
一方、 医薬品としての応用に際しては、 その有効成分 が通常の医薬形態及び保存条件下において、 経時変化す ることなく安定であることが要求されることは勿論であ り、 上記 I L - 1. ;5の場合も当然に上記性能が要求され る。 殊に、 臨床応用を可能とするまでに高度に精製され た均質標品においては、 安定性上その扱いにより充分な 配慮が要求され、 その活性を保持するには適常種々の制 限を受ける。 しかして、 凍結処理や凍結乾燥処理また温 度、 時間等の種々の保存条件下において、 より安定に保 つことのできる I L一 1 ^の安定化された製剤組成物の 開発、 改良が斯界で望まれている。
I L - 1 5活性物は薬理活性が強ぐ極めて微量で使用 される一方、 容器壁への吸着性を有しており、 有効成分 としての含量が低下すればするほどこの吸着性が問題と なり、 その防止が必要となる。 また I L一 1 活性物は 不安定で、 この不安定さは有効成分の含量が低下すれば するほど増加する傾向がある。
発明の開示
本発明は、 上記問題点を解決して、 医薬品としての応 用面で特に好適な I L一 1 8活性物の安定な組成物を提 供し、 また等張性を有する上記 I L一 1 ^活性物の安定 化された組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは上記目的より鋭意研究を重ねた結果、 I L - 1 ^活性物に人血清アルブミ ン及び Z又は糖類と 界面活性剤とを配合する時には、 之等が吸着防止 ¾杲及 び安定化勃杲を奏し、 I L一 1 性物の活性が著しく 安定化されることを見出し、 ここに本癸明を完成するに つ τ: 本発明によれば I L一 1 活性物と共に人血清アルブ ミ ン及びノ又は糖類と界面活性剤とを配合してなる I L - 1 βの安定化組成物が提供される。
本発明組成物において、 有効成分として利用する I L 一 1 yS活性物には I L一 1 及びその誘導体が包含され る。 之等有効成分としては、 より具体的には、 本出願人 の先のョーロッパ特許公開公報 （E P 0237 96 7 A
2) に記載のポリペプチ ド及びその均等物を例示できる。 該ポリぺプチ ドは、 下式 （A)
Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg- Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly- Pro-Tyr-G 1 u—し eu—し ys— A 1 a—し eu— His—し eu— G 1 n-G 1 y- G 1 n - Asp - Met - G 1 u-G 1 n-G ln-Val -Va 1 - Phe - Ser - Met - Ser-Phe-Val-Gln-Gly-Glu-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys- 11 e-Pro-Val-Ala-Leu-Gly-Leu-Lys-Glu-Lys-Asn-
Leu-Tyr-Leu-Ser-Cys-Val-Leu-Lys-Asp-Asp-Lys- Pro-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ser-Val-Asp-Pro-Lys- Asn— Tyr— Pro— Lys— Lys—し ys— Met— Gl u—し ys— Arg— Phe— Val-Piie-Asn-Lys-11 e-Glu-11 e-Asn-Asn-L s-Leu- Gl u-Phe-G 1 u - Ser - A 1 a-G 1 n-Phe-Pro-Asn-Trp-T r-
I i e-Ser-Tfar-Ser-Gl n-Al a-G i u-Asn-Met-Pro-Val- Phe-Leu-G 1 y-G 1 -Thr-Lys-G 1 -G 1 y-G 1 n - Asp - 11 e- .
4
Thr-Asp-Phe-Thr-Ket-Gln-Phe-?al-Ser-Ser
で表わされる I L— 1 ^のア ミノ漦配列において、 a) l位 A la、 3位 Val、 4位 Arg、 5位 S er、 8位 Cys、
1 1位 Arg、 3 0位 His、 7 1位 C ys、 9 3位 L ys、 9 7^Lys、 98位 ^、 9 9位 P he、 1 0 3位 L ys、 1 20位 Τ ΓΡ、 1 2 1位 Tyr及び 1 53位 S erから選 ばれた少なく とも 1つのア ミ ノ酸残基が欠失されてい るか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されていること、 1)) 1位の ^から 9位の Thrに至るァミ ノ酸配列又はそ の中の少なく とも 1つのア ミ ノ酸残基が欠失されてい ること （但し上記 a)に記載の 1位 Ala、 3位 Val、 4 位 A rg、 5位 S er及び 8位 C ysからなる群から選ばれ たアミ ノ酸残基の少なく とも 1つが欠失されている場 合を除く） 、
c) 1 0 3位の L ysから 1 5 3位の S erに至るァ ミ ノ酸配 列又はその中の少なく とも 1つのアミ ノ酸残基が欠失 されていること （但し上記 a)に記載の 1 0 3位 L ys、 1 2 0位丁 、 1 2 1位 Tyr及び 1 5 3位 S erからな る群から選ばれたァ ミ ノ苣残基の少なく とも 1つが欠 失されている場会を除く） 、
d)上記式 （A) の Nま端にア ミ ノ苣残基又は下式 （B) で示される 1 ' 位 Metから 1 1 6' 位 Aspに至るア ミ ノ馥配列もしく はその C末端側の一部ァ ミ ノ酸配列が 付加されていること、
式 （B)
Met - A 1 a-G 1 u - Va卜 Pro - G 1 u-Leu-A 1 a-Ser-G 1 u - Met - Met-Ala-Tyr-Tyr-Ser-G 1 -Asn-G 1 u - Asp - Asp - Leu -
Phe - Phe - G 1 u-A 1 a-Asp-G 1 -Pro-Lys-G 1 n-Met-Lys- Cys - Ser - Phe - Gln_Asp -し eu - Asp - Leu - Cys - Pro - Leu - Asp - Gly - Gly - 1 le - Gin - Leu - Arg - 11 e - Ser - Asp - His - His-Tyr-Ser-Lys-Gly-Phe-Arg-Gln-Ala-Ala-Ser- Val-Val-Val-Ala-Met-Asp-Lys-Leu-Arg-Lys-Met- Leu-Val - Pro - Cys - Pro - G 1 n - Thr - Phe - G 1 n-G 1 u - Asn - Asp - Leu - Ser - Thr - Phe - Phe - Pro - Phe - 1 le - Phe - Glu - Glu-Gl u - Pro - 11 e - Phe - Phe - Asp - Thr - Trp - Asp - Asn - Glu-Ala-Tyr-Val-His-Asp
という a)〜 の条件の少なく とも 1つを充足することの あるア ミ ノ酸配列を有することにより特徴付けられる。
上記及び以下の本明細書におけるァ ミ ノ酸及びポリぺ プチ ドの表示は、 I U P A C及び I U A C— I U Bによ る命名法又は規則における略号乃至当該分野で慣用され ている略号による表示法に徒う ものとする。 また塩基配 列における核葭の表示も同様とする。 ア ミ ノ苣の数又は 位置は、 欠落及び付加がある場合であつても、 全て I L 一 1 ;3のア ミ ノ酸配列即ち前記式 （A ) の配列に従い表 示する。 但しアミ ノ漦の位置を示す数値の内ダッ シュを 付したものは式 （B ) のア ミ ノ漦配列に従う。
以下、 上記ポリペプチ ド （ I L一 1 S及びその誘導体） にっき詳述する。
上記 I L一 1 誘導体は、 I L一 1 ;5の前記式 （A ) に示されるアミノ酸配列において、 上記 a)〜 の要件の 1つ又は 2つ以上を組み合わせて充足するァミ ノ酸配列 を含有するポリペプチ ドである。 好ま しい誘導体は前記 要件 a)〜e)の少なく とも 1つを充足するァミ ノ酸配列を 有するもの及び a)〜c)の少なく とも 1つの要件と d)の要 件と.を同時に満足するァミ ノ酸配列を有するものである。
I L - 1 誘導体であるポリペプチ ドの好ま しい具体 例を挙げると次の通りである。
1)少なく とも 1位 A l aが欠失されているか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリぺプチ ド。
2)少なく とも 3位 V a lが欠失されているか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリぺプチ ド。
3)少なく とも 4位 A rgが欠失されているか又は他のァミ ノ漦残基で置換されているポリペプチ ド。
4)少なく とも 5位 S erが欠失されているか又は泡のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリべプチ ド。 5〉少なく とも 8位 C ysが欠失されているか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されているポ リベプチ ド。
6)少なく とも 1 1位 A rgが欠失されているか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリベプチ ド。
7)少なく とも 3 0位 H i sが欠失されているか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリベプチ ド。
8)少なく とも 7 1位 C ysが欠失されているか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリベプチ ド。
9)少なく とも 9 3位 L ysが欠失されているか又は他のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリベプチ ド。
10) 少なく とも 9 7位 L ysが欠失されているか又は他の ァミ ノ酸残基で置換されているポリベプチ ド。
11) 少なく とも 9 8位 A rgが欠失されているか又は他の ァ ミ ノ酸残基で置換されているポリペプチ ド。
12) 少なく とも 9 9位 P heが欠失されているか又は他の ァ ミ ノ酸残基で置換されているポリぺプチ ド.。
13) 少なく とも 1 0 3位 L ysが欠失されているか又は他 のァ ミ ノ酸残基で置換されているポリペプチ ド。
14) 少なく とも 1 2 0位 Τ Γ Ρが欠失されているか又は他 のア ミ ノ酸残基で置換されているポリぺプチ ド。
15) 少なく とも 1 2 1位丁 yrが欠失されているか又は^ のァ ミ ノ酸残基で置換されているポ リぺプチ ド。 ) 少なく とも 1 53位 S erが欠失されているか又は他 のァミ ノ漦残基で置換されているポリぺプチ ド。
) 1位の A laから 3位の Valに至るアミ ノ漦配列、 1 位の A laから 6位の Leuに至るァミ ノ酸配列又は 1位 の A laから 9位の Thrに至るァミノ漦配列.が少なく と も欠失されているポリペプチ ド。
) 1 5 1位 Valから 1 53位 S erに至るァ ミ ノ酸配列， 149位 Ginから 1 53位 Serに至るァ ミ ノ酸配列、
145位 Aspから 1 53位 Serに至るァ ミ ノ酸配列、 141位 G inから 1 53位 S erに至るァミ ノ酸配列、
1 21位 Tyrから 1 53位 S erに至るァ ミ ノ酸配列又 は 1 03位 Lysから 1 53位 Serに至るァミ ノ酸配列 が少なく とも欠失されているポリべプチ ド。
) 式 （A) の N末端に、 ァミ ノ酸残基を少なく とも有 するポリぺプチ ド。
) 式 （A) の N末端に、 式 （B) で表わされるァミ ノ 酸配列 1 1 2' 位 A laから 1 16' 位 Aspに至るア ミ ノ駿配列、 77' 位 Metから 1 1 6' 位 Aspに至るァ ミ ノ駿配列、 7 1 ' 位 Metから 1 1 6 ' 位 Aspに至る アミ ノ苣配列、 32' 位 Metから 1 1 6' 位 S erに至 るア ミ ノ ¾配列又は 1 ' & ^から 1 1 6' 位 A に 至るァ ミ ノ ¾配列を少なく とも有するポリぺプチ ド。 上記 I L— 1 誘導体は、 I L— 1 ySのア ミ ノ酸配列 の特定位置の特定ァ ミ ノ漦残基が他のァ ミ ノ酸残基で置 換されたア ミ ノ漦配列及び特定位置にァ ミ ノ漦残基の付 加されたア ミ ノ酸配列を有するポリベプチ ドを包含する が、 この置換及び付加を行ない得るア ミ ノ酸残基は、 人 体蛋白質を構成する —アミ ノ酸の残基であればいずれ でもよく 、 中性ア ミ ノ酸残基であるのが好適である。 但 し、 C ysはその S H基に基づいて分子内又は分子間ジス ルフイ ド結合を形成することがあり、 これを考慮すれば 該アミ ノ酸残基は Cys以外の上記ァ ミ ノ酸^基であるの が好ま しい。 特に好ま しいものと して例えば 4位 A の 場合は G ly、 L ys、 G in又は Aspを、 8位 C ysの場合は S er又は A laを、 1 1位 A rgの場合は G 1 nを、 3 0位 Hisの場合は Tyrを、 7 1位 C ysの場合は S er、 A la又 は Valを、 9 3位 L ysの場合は L eu又は Aspを、 9 8位 A rgの場合は L euを、 1 0 3位 L ysの場合は G inを、 1 2 0位 Trpの場合は Argを、 1 2 1位 Tyrの場合は G inを、 また N末端への付加の場合は、 Met、 L eu、 Arg又は Aspをそれぞれ洌示できる。
かかる I L一 1 ^誘導^及び I L— 1 ；3は、 例えば
L A F活性、 腫震 S飽増殖抑 活性 (G I F活性） 、 即 ち腫瘍 ¾胞に対して特異的にその増殖を抑制する活惶、 コロニー剌激因子 （Colony stimulating factor： C S F ) 、 イ ンタ一フエロン （interferon： I F N) 、 インタ一ロイキン 2 (interleukin 一 2 : I L— 2) 、 イ ンターロイキン 3 (interleukin - 3 ： I L - 3 ) 等 の種々のサイ ト力イン （ ytokine) 類の産生促進活性、 即ち例えばヒ ト細胞に作用してそれらサイ トカイン類の 産生を著しく促進させる活性、 抗炎症活性、 特に例えば 関節炎モデル動物に投与することによつて関節炎の進行 を効果的に抑制する活性、 放射線障害防止作用、 即ち骨 髄移植時の放射線全身照射、 癌治療等における放射線照 射、 放射線事故時における生体障害乃至は重篤な副作用 等を予防する.作用乃至防止する作用等を有している。 前 記した I L一 1 /3誘導体は上記各活性のいずれか少なく とも一つの点で優れている力、、 或いは （及び） より毒性 が低く副作用が少ない点で優れている。 従って上記 I L 一 1 ^誘導体並びに I L一 1 /3は、 例えば抗体産生促進 ゃワグチンの効果増強等の免疫系刺激剤、 抗腫瘍剤、 例 えば C S F、 I L一 2、 I L一 3等のサイ トカイ ン産生 促進剤、 抗炎症剤、 ¾射籙障害防止剤等の医薬品として 有用である。
殊に上記 I L一 1 及びその誘導^が関節炎等の炎症 に著効を示すという新たな知見は、 I L - iが炎症をメ ディエー ト しその惹起に関与するとされてきた事実によ れば、 驚くべきことである。 また上記 I L一 1 ;3誘導体 は上記各活性のいずれか少なく とも一つの点で優れてい るか又は （及び） より毒性が低く副作用が少ない点で優 れている。
とりわけ、 上記 I L一 1 ;5及びその誘導体は、 C S F 産生促進剤と して有効であり、 これをヒ トに投与すると きには、 ウィ ルス感染や抗原抗体反応等の危険性を生じ ることなく 、 癌化学療法や放射線療法後の骨髄低形成に よる顆粒球減少を有効に回復できる （顆粒球減少治療剤） 。 上記 C S F産生促進剤はまたその本来の C S F産生促 進作用により、 C S Fの作用に基づく各種疾病の予防及 び治療剤と しても有効に利用できる。 例えば、 C S Fは 顆粒球ゃマクロファージの機能を促進させる作用がある 〔口ペッツら （ Lopez, A.F. et al . , J. Iinniunol ., 1 3 1 ,
2 983 ( 1 83) 、 ハンダムら (Handam, E. et al. , 同 1 22 , 1 1 34 ( 1 97 9) 及びバダスら
(Vadas.M.A.et al . , 同 1 3 0 , 7 9 5 ( 1 83) 〕 ので、 種々の感染症の予防及び治療剤と して臨床応用が 期待されており、 上記 C S F産生促進剤も同様に臨床応 ^が期待される。
殊に、 近年生体防御能が ^下乃至障害された個^ (coinproniised host) に、 それまで無害であった病原体 が病原性を発揮して惹起される、 所謂日和見感染症
(opportunistic infection 或いは terminal
infection) は、 臨床的に問題となる病原体 （起炎菌） 、シユー r七ナス ( P seudomonas) 、 セラティ ア
(S erratia)等のグラム陰性桿菌、 ヘルぺス （Herpes simplex, H S V) 、 ノくリセラーゾ一スタ （ V aricel la zoster, V Z V) 、 サイ トメガロウィルス
(Cytomegalovirus, CM V) 等のウィルス、 キャ ンデ イ ダ ( C andida albicans ) 、 アスペスレギノレス フ ミ ゲ イツス （Aspergillus fumigatus) 、 ノカノレディ ア ァ ステロイデア ( Nocardia asteroidea) 等の真菌、 カ リ 二原虫 (Pneumocystis carinii) トキソプラズマ ゴ ンディ （Toxoplasma gondii) 等の原虫等であり、 現用 の抗生物質は、 之等の病原菌に対して充分な効果を奏し 難く、 該日和見感染症に対する新しい薬剤の研究開発が 切望されている。 I L一 1 ^誘導体は、 かかる日和見感 染症の予防及び治療剤としても有用であり、 特にかかる 日和見感染症が高頻度に見られる抗癌剤投与時、 即ち急 性白血病の化学療法や骨髄移植^における各種の感染症. 例えばガンジダ症、 ク リ プ ト コ ッ クス症、 ァスぺルギル ス症、 接合菌症、 黒色真菌感染症、 ウ ィ ルス感染症、 サ ィ トメガロウイ ルス肺炎、 之等の合併症等の予防及び治 療剤と して有用なものである。
更に I L一 1 ^及びその誘導体は、 上記医薬^途以外 に、 そのサイ トカイン産生促進活性に基づき、 例えば細 胞株からの各種有用サイ ト力イ ンのイ ンビトロ （in vitro ) 製造に際して極めて有効に使用し得る。 かかる 細胞株からの天然型サイ トカイ ンの製造は、 殊に糖蛋白 質であるサイ トカイ ンにおいて着目されており、 効率的 に且つ大量に有用サイ トカイ ンを収得できる。
上記した I L一 ： L ^誘導体中、 少なく とも 7 1位 C ys を置換乃至は欠失させたもの、 特に上記 Cysを他のア ミ ノ酸残基、 例えば S er、 A la. Val等で置換したものは 高活性を示す。
また、 少なく とも 4位 Arg、 93位 Lys、 8位 Cysを 置換乃至は欠失させた I L— 1 誘導体、 及び少なく と も 1 03位以降の少なく とも一つのア ミ ノ酸残基を欠失 させた誘導体は、 いずれもプロスタグラ ンジン E
(P G E ) 産生促進作用が弱く 、 従って発熱作用等の副 作用並びに毒性がより少ない特徵を有し、 更に少なく と も 4位 A rg又は 93位 L 'sを置換乃至は欠失きせた誘導 は、 G I F びに L A F¾¾に比し、 じ 5 苣生{^進 活性及び抗炎症活性がより強い特徵を有している。 更に、 上記誘導体中、 式 （A ) の N末端に少なく とも 特定のァ ミ ノ酸残基もしく はポリぺプチ ドが付加したも のは、 G I F活性及び L A F活性に比して C S F産生促 進作用及び抗炎症作用がより高い特徵を有し、 しかも毒 性が低く且つ作用の持続性の点で医薬品と して、 殊に経 口剤乃至は坐剤として利用する場合により有効である。
更に上記誘導体、 殊に少なく とも 8位 C ys及び Z又は 7 1位 C ysを置換乃至欠失させたもの、 特に上記 C ysを 他のア ミ ノ酸残基例えば S er、 A l a、 V al等で置換した ものは、 種々の条件下における I L一 1受容体への結合 性において優れている。
尚、 上記誘導体の内で I L一 1 iSに比しその分子中に C ysをより少なく含むか又は含まないものは、 C ysの S H基に基づく分子内もしく は分子間結合の不要な形成 を考慮すればより好ましい。
上記した特定のポリペプチ ド、 即ち I L一 1 及びそ の誘導体は、 例えば遺伝子工学的手法により製造するこ とができる。 即ち、 前記特定のポリぺプチ ドをコ一 ドす る遺伝子を利用し、 これを微生物のベクターに組込んで 該徴生物 胞内で、 複製、 耘写、 翻訳させることによつ て製造することができる。 この方法は、 特に大量生産が 可能である点より有利である = 上記方法において用いられる遺伝子は、 通常の方法、 冽えばホスフアイ ト ト リエステル法 〔ネイチヤー (Nature ) , 3 1 0 , 1 0 5 ( 1 84) 〕 等の常法 に従い、 核酸の化学合成により全合成することもできる が、 I L— 1 ;5も しく はその前駆体をコー ドする遺伝子 を利用して合成するのが簡便であり、 例えば該遺伝子よ り上記化学合成手段を含む常法に従い、 前記特定のア ミ ノ酸配列をコー ドする核酸配列に改変すること等により 容易に製造できる。
I L - 1 yS又はその前駆体をコ一 ドする遺伝子は公知 であり.、 本出願人の先の出願 （特願昭 6 0— 1 3828 1号、 特開昭 6 2 - 1 74 0 2 2号公報） に記載したよ うに、 I L一 1 ^をコー ドする遺伝子を得、 これを用い て遺伝子工学的手法で I L一 1 を収得するに成功して いる。
上記核酸 （塩基） 配列の改変操作も公知方法に従えば よく 、 目的とするポリペプチ ドのア ミ ノ酸配列に応じて 実施される 〔遺伝子工学的手法と しては、 例えば、 Molecular Cloning 、 Col d Spring Harbor Laboratory ( 1 9 82) が参照される〕 。
例えば、 D N Aの切新、 結合、 リ ン鼓化等を目的とす る制限酵素、 D N A リガ一ゼ、 ポリ ヌ ク レオチ ドキナー ゼ、 D N Aポリメラーゼ等の各種の酵素処理等の常套手 段等が採用でき、 それら酵素は市販品として容易に入手 できる。 之等各操作における遺伝子乃至核箧の単離、 精 製も常法、 例えばァガロース電気泳動法等に従えばよい。 また得られる遺伝子の複製は、 一部後述するように通常 のベクターを利用する方法に従えばよい。 また、 所望の ァミ ノ酸配列をコ一 ドする D N A断片や合成リ ンカ一は 上記した化学合成により容易に製造できる。 尚、 上記に おいて所望のァ ミ ノ酸に対応するコ ドンは自体公知であ りまたその選択は任意でよく、 例えば利用する宿主のコ ドン使用頻度等を考慮した常法に従えばよい 〔Nucl.
Acids. Res.. _, 43 - 74 (1 981 ) 〕 。 またこれ らの核酸配列のコ ドンの一部改変には、 例えば常法通り、 1 5〜30マー程度の、 所望の改変をコー ドする合成ォ リ ゴヌク レオチ ドからなるプライマーを用いたサイ トー スぺシフィ ック ミ ュータジェ不シス （Site— Specif ic Mutagenesis) Proc. Natl .Acad. Sci ..81 , 5662
- 5666 ( 1 984) 〕 等の方法を採用できる。
上記方法により得られる所望の遺伝子は、 例えばマキ サム一ギルバー トの化学修飾法 CKaxam-Gilbert. Met . Enzyi,, 6 5 , 49 9— 560 ( 1 980 ) 〕 や M 1 3 ファージを ¾いるジデォキシヌク レオチ ド鎮终锆法 [Messing， J . and Vieira ,J.. Gene. 1 , 269 - 27 6 ( 1 982) 〕 等により、 その塩基配列の決定及 び確認を行ない得るが、 之等に限定されず当業界におい て周知の各種方法のいずれをも採用できる。
かく して、 前記した特定のァミ ノ酸配列を有するポリ ペプチ ドをコー ドする遺伝子が提供される （以下この遺 伝子を 「目的遺伝子」 という） 。
前記特定のポリぺプチ ドは、 上記目的遺伝子を利用し て公知の一般的な遺伝子組換え技術に従い製造できる。 より詳細には、 上記目的遺伝子が宿主細胞中で発現でき るような組換え D NAを作成し、 これを宿主細胞に導入 して形質転換し、 該形質転換体を培養すればよい。
ここで宿主細胞としては、 真核生物及び原核生物のい ずれをも用い得る。 該真核生物の細胞には、 脊椎動物、 酵母等の細胞が含まれ、 脊椎動物細胞としては、 例えば サルの細胞である C os細胞 〔Y.Gluznian, Cell, 23, 1 7 5 - 1 82 ( 1 981 ) ] やチャイニーズ *ハムス ター卵巣細胞のジヒ ドロ葉酸レダクターゼ欠損株 〔 Url aub and L. A.Chasin. Proc.Natl .Acad.Sci .. USA. 77 , 42 1 6— 42 2 0 ( 1 980 ) 〕 等がよく用い られるが之等に限定されない。 脊樘勣物钿胞の癸現べク タ一としては、 ¾常発現しょうとする遺伝子の上流に位 置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、 ポリア デニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使 ¾ でき、 これは更に必要により複製起源を保有していても よい。 該発現べクタ一の例としては S V40の初期プロ モーターを保有する pSV2dhfr CS.Subraiani.R. Mulligan and P. Berg, Mol. Cell. Biol., 1_ (9) , 854— 864〕 等を例示できるが、 これに限定されない。
また真核微生物としては酵母が一般によく用いられ、 その中でもサッカロ ミセス属酵母が有利に利用できる。 該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、 例えば 酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを持つ pAM82 CA.Miyanohara et aし， Proe. Natl .Acad. Sci .. USA, 8 Q , 1— 5 ( 1983) 〕 等を好ま しく利用で きる。
原核生物の宿主としては大腸菌や枯草菌が一般によく 用いられ、 例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミ ドべ クタ一を用い、 このベクター中に目的遺伝子が発現でき るように、 該遺伝子の上流にプロモーター及び S D (シ ャイ ン · アン ド · ダルガーノ） 塩基配列、 更に蛋白合成 H始に必要な A T Gを付与した発現プラス ミ ドが使 ¾で きる- 上記宿主菌としての大腸菌としては、 ェシエリ ヒ ァ * コ リ （Escherichia coli) K 1 2株等がよく用い られ、 ベクターと しては一般に p B R 3 2 2がよく用い られるが、 これに限定されず、 公知の各種の菌株及びべ クタ一がいずれも利用できる。 プロモータ一と しては、 例えばト リプトファンプロモーター、 P L プロモーター、 l ac プロモーター、 l pp プロモーター等を使用すること ができ、 いずれの場合にも目的遺伝子を発現させ得る。
ト リブトファンプロモーターを用いる場合を例にとり 詳述すれば、 発現べクターと して ト リブトファンプロモ 一夕一及び S D配列を持つベクター p T M 1 〔今本文男、 代謝、 Vol . 2 2 , 2 8 9 ( 1 9 8 5 ) を使用し、 S D 配列の下流に存在する制限酵素 C l a l部位に、 必要に応 じて A T Gを付与した所望のポリぺプチ ドをコ一 ドする 遺伝子を連結させればよい。
尚、 直接発現系に限らず、 例えば —ガラク ト シダー ゼゃ β -ラクタマ一ゼ等を利用する融合蛋白質発現系に よることもできる。
かく して得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及 びこれによる形質転換の方法と しては、 一般に用いられ ている方法、 例えば主と して対数増殖期にある細胞を集 め、 C £ C S 2 処理して自然に D N Αを取り込みやすい 抆態にして、 ベクターを取込ませる方 £等を探用できる。 上記方法においては、 通常知られているように形質転換 の効率を一層向上させるために M g C g 2 や： b C S を 培地に更に共存させることも可能である。 また、 宿主細 胞をスフエロブラス ト又はプロ トプラス ト化して力、ら形 質転換させる方法をも採用できる。
かく して得られる所望の形質転換株は、 常法に従い培 養でき、 該培養により、 所望のポリペプチ ドが生産、 蓄 積される。 該培養に用いられる培地としては、 通常の細 胞培養に慣用される各種の培地のいずれでもよく、 その 具体例としては、 例えば L培地、 E培地、 M 9培地等及 び之等に通常知られている各種の炭素源、 窒素源、 無機 塩、 ビタ ミ ン類等を添加した培地を例示できる。 尚、 上 記ト リブトファンプロモーターを用いた場合には、 一般 にプロモーターが働く ようにするためにカザミ ノ酸を添 加した、 例えば M 9最小培地を用いて培養することがで き、 該培地中には培養の適当な時期にィ ン ドールァク リ ル酸等の ト リプトフアンプロモーターの働きを強めるた めの薬剤を添加することもできる。
かく して得られる活性物を含有する培養物からの目的 ポリペプチ ド、 即ち前記特定のポリベプチ ドの精製、 阜 難は常法に徒い行ない得る。 尚、 該ポリペプチ ドを宿主 から拮 するに当っては、 例えば浸透圧ショック法等の 温和な条 ί牛を採用するのがその高次 ¾造保持の面からよ り好ま しい。
上記精製、 単離は、 例えば当該ポリペプチ ドの物理、 化学的倥質を利用した各種の処理操作に従い実施するこ とができる 〔例えば 「生化学データ一ブック Π」 p p 1 1 75〜： 1259、 第 1版第 1刷、 1 980年 6月 23日、 株式会社東京化学同人発行参照〕 。 該方法とし ては、 具体的には例えば通常の蛋白沈殺剤による処理、 限外沪過、 分子ふるいク ロマ ト グラフィー （ゲル沪過） 、 液体ク口マ トグラフィー、 遠心分離、 電気泳動、 ァフィ 二ティク ロマ トグラフィー、 透析法、 之等の組合せ等を 採用できる。
より具体的には、 上記操作は例えば以下の如く して実 施できる。 即ちまず培養上清より予め目的とするポリべ プチドを部分精製する。 この部分精製は、 例えばァセ ト ン、 メ タノール、 エタノール、 プロパノール、 ジメ チル ホルムアミ ド （DMF) 等の有機溶媒や酢酸、 過塩素酸 (P C A) 、 ト リ クロ口酢酸 （T C A) 等の酸を蛋白沈 澱剤と して用いる処理、 硫酸ァンモニゥム、 硫酸ナ ト リ ゥム、 リ ン漦ナ ト リ ウム等の塩析剤を用いる処理及び Z 又は透折腠、 乎核膜、 中空籙 ^膜等を用いる限外沪過処 理等により行ない得る。 之等の各 理の操作及び条 ί牛は、 通常のそれらと同様とすればよい。 次いで上記で得られた粗精製物を、 ゲル沪過に付すこ とにより目的物質の活性が認められる画分を収得する。 ここで用いられるゲル沪過剤としては、 特に限定はなく 例えばデキス トランゲル、 ポリアク リルアミ ドゲル、 ァ ガロースゲル、 ポリアク リルアミ ドーァガロースゲル、 セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。 之等の具体例としては、 セフアデックス Gタイプ、 同 L Hタイプ、 セファロ一スタイプ、 セフアク リ ルタイプ (以上、 フアルマシア社） 、 セル口ファイ ン （チッソ㈱） 、 バイオゲル Pタイプ、 同 Aタイプ （バイオーラ ド社） 、 ウルトロゲル （ L K B社） 、 T S K— Gタイプ （トーソ 一社） 等を例示できる。
目的とするポリぺプチ ドは、 上記ゲル沪過により得ら れる活性画分を、 例えばハイ ドロキシァパタイ トカラム を用いたァフィ二ティ ークロマ トグラフィー、 D E A E 法、 C M法、 S P法等のイオン交換カラムクロマ トグラ フィ一、 クロマ トフォーカシング法、 逆相高速液体ク口 マ トグラフィ 一等に付すことにより、 又は之等各操作の 組合せにより更に精製でき、 均質な物質として単難でき る。
上記ク CIマ トフォーカ シング¾は、 公知の各種方法に より実施できる。 カラムと しては钶えば P B E 9 4 (フ アルマシァ社製） 等を、 開始緩衝液と しては例えばィ ミ ダゾ一ルー塩酸等を、 溶出液と しては例えばポリバッフ ァー 7 4 (フアルマシア社製） 一塩馥 ( p H 4 . 0 ) 等 を使用できる。
上記逆相高速液体ク口マ トグラフィ一は、 例えば C 4 ハイポァー逆相 H P L Cカラム （バイオーラ ド社 （Bi o- Rad Laboratori es) ) 等を用いて、 移動剤と してァセ ト 二 ト リ ル、 ト リフルォロ酢酸 （T F A ) 、 水等及び之等 の混合溶媒を用いて実施できる。
かく して I L一 ： L )δ及びその誘導体と しての前記特定 のポリペプチ ドを単離、 収得できる。
本発明の一実施態様において、 本発明組成物は、 上記 の I L— 1 yS、 その誘導体等の I L— 1 ^活性物と共に、 糖類と界面活性剤とを含有する。
本発明の他の一つの実施態様において、 本発明組成物 は、 上記の I L 一 1 ;5、 その誘導体等の I L — 1 ^活性 物と共に、 人血清アルブミ ンを含有する。
本発明の他の一つの実施態様において、 本発明組成物 は、 上記の I L 一 1 、 その誘導 ί本等の I L— 1 活性 物と共に、 人血清アルブミ ンと糖類とを含有する。
本癸明の他の一つの実旌態様において、 本癸明組成物 は、 上記の I L — 1 ^、 その誘導体等の I L — 1 活惶 物と共に、 糖類、 界面活倥剤及び人血清アルブミ ンを含 する。
上記において糖としては特に限定はなく、 例えばグル コース、 マンノース、 ガラク トース、 果耱等の単糖類、 マンニトール、 イノ シトール、 キシリ トール等の糖アル コール類、 ショ糖、 マルトース、 乳糖等の二糖類、 デキ ス トラン、 ヒ ドロキシプロピルスターチ等の多糖類等を 使用でき、 之等は一種単独でも二種以上混合しても用い 得る。 之等の中で特にショ糖、 マルトース、 マンニトー ル、 ィノ シ トール、 デキス トラン等は好ま しい。
界面活性剤としても特に限定はな 、 イオン性及び非 イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、 就中、 ポリオ キシエチレングリ コールソルビタンアルキルエステル系、 ポ リォキシェチレンァルキルエーテル系、 ソソレビタ ンモ ノアシルエステル系、 脂肪酸ダリセリ ド系等の界面活性 剤を好ま しく利用できる。
上記糖類の添加量は、 I L— 1 ^活性物 1 g当たり 約 0 . 1 ing程度以上、 好ま しく は約 1〜： L O O nig程度の 範園とするのが這当であり、 界面活性剤の添 ¾量は、 I L 一 1 活性物 1 /i g当たり約 0 . 0 0 0 l ing程度以 上、 好ましぐは約 0 . 0 0 1〜 0 . l ing程度 ø範固とす るのが這当である e また人血清アルブミ ンの添加量は I L — 1 ;5活控物 1 g当たり約 0 . O O l iDg程度以上、 好ま しく は約 0 . 0 1 〜 1 O ing程度の範囲とするのが適 当である。
本発明組成物は、 上記特定の成分の配合を必須要件と して、 他は通常のこの種医薬組成物と同様のものとする ことができ、 他の薬理的有効成分や製剤上の慣用成分等 を任意に配合してもよく、 かく して得られる組成物は、 前述した各種の医薬用途、 例えば抗体産生やワクチン効 果の增強並びに免疫不全症の治療等の免疫刺激剤、 抗腫 瘍剤、 サイ トカイ ン類の産生促進剤、 抗炎症剤、 放射線 障害防止剤、 日和見感染症治療剤等に有効に適用するこ とができる。
本発明の好ま しい一実施態様において、 1 1^ ー 1 ^活 性物の安定性を更に増加させるために、 本発明組成物に 含硫還元剤を加える。
該含硫還元剤と しては、 通常のものでよく 、 具体的に はシスティ ン、 N —ァセチルホモシスティ ン、 チォク ト 酸、 チォグリ コール酸及び之等の塩類、 チォエタノール ァ ミ ン、 チォグリセロール、 チォ硫羧ナ ト リ ウム、 チォ 乳鼓、 ジチオスレイ ト一ル、 グルタチオン等の比較的温 和な還元剤等を好ま しく 例示でき、 之等は一種単 ¾でも 利用でき、 2種以上辟用すること もできる。 之等の添加 量は特に制限されないが、 I L 一 1 活性物 1 n g当た り約 0 . 0 0 l ing程度以上、 好ましく は 0 . 0 1〜 1 0 程度 （2種以上を併用する場合はそれらの合計量） と するのが適当である。
本発明の更に好ましい一実施態様において、 上記本癸 明組成物を緩衝液で等張化して、 等張化製剤とする。
ここで用いられる緩衝液としては、 例えば代表的には, クェン酸一クェン酸ナト リ ウム、 クェン酸一リ ン酸ナ ト リ ゥム、 酢酸一酢酸ナ ト リ ゥム、 クェン酸一ホウ砂等の P H 4〜 8程度、 好ま しく は p H 5〜 6の各種緩衝液を 例示できる。
本発明組成物は、 えば通常薬理有効量の I L - 1 活性物及び前記特定の配^成分と共に、 適当な医薬製剤 担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。 該製剤 担体と しては使用形態に応じた製剤の調製に通常慣用さ れる充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤等の賦形 剤乃至希釈剤をいずれも使用できる。 製剤組成物の形態 は、 これが有効成分である I L 一 1 /3活性物を効果的に 含有する状態であれば特に限定はなく 、 錠剤、 粉末剤、 穎拉剤、 丸剤等の固剤であってもよく、 液剤、 懸濁剤、 乳剤等の注射剤形態であってもよい。 またこれは使^莂 に這当な担体の添加により液拔となし得る乾燥品とする こともできる。 之等の製剤組成物はいずれも常法に従い 調製され得る。
得られる医薬製剤は、 該製剤組成物の形態に応じた適 当な投与経路、 例えば注射剤形態の医薬製剤は、 静脈内 筋肉内、 皮下、 皮内、 腹腔内投与等により投与され、 固 剤形態の医薬製剤は、 経口乃至は経腸投与され得る。 医 薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量は、 該製剤 の投与方法、 投与形態、 使用目的、 之を適用される患者 の症状等に応じて適宜選択され、 一定ではないが、 通常 有効成分を約 0 . 0 0 0 0 0 0 1〜 8 0重量％程度含有 する製剤形態に調製して、 この製剤をこれに含有される 有効成分量が一日成人一人当り約 0 . 0 0 1 g〜
1 0 0 ^ g程度となる範囲で投与するのが望ま しい。 該 投与は、 一日 1回である必要はなく 3〜 4回に分けるこ ともできる。
本発明によれば、 医薬品として注目され、 期待されて いる I L 一 1 )S活性物の安定化された組成物が提供され 本発明組成物は、 搆成成分の I L - 1 5活性物の安定 性の面で優れた特性を有し、 例えば凍結処理や凍結乾燥 ^理等の通常の医薬形態と しての所望の調製及びそれら 医薬品の通常の保存条件下においても長期間安定であり . かかる分野において極めて有 ¾である。
図面の簡草な説明
第 1図乃至第 3図はポリぺプチド Iの C S F産生に対 する促進効果試験結果を示すグラフである。
第 4図はポリペプチ ド Iの抗関節炎試験結果を示すグ ラフである。
第 5図は I L - 1 ^誘導体の C S F産生促進試験結果 を示すグラフである。
第 6図は I L一 1 S誘導体の抗炎症試験結果を示すグ ラフである。
第 7図は I L - 1 ^誘導体の放射線障害防止作用試験 の結果を示すグラフである。
第 8図は I L一 1 yS誘導体の日和見感染症防止作用試 験の結果を示すグラフである。
実 施 例
以下実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明する。
各実施例において有効成分と して用いられる I L一 1 ^活性物 （ I L ー 1 ^誘導体） の表示は、 下記第 1表 に示す略号にて行なう ものとし、 このうちポリぺプチ ド I 〜X X X X は特請昭 6 3 - 1 5 2 3 9 8号公報記載 のものであり、 ポ リぺプチ ド X X X X K〜： X X X X VI は上記に準じて以下の製造参考例により得られるもので ある。 また之等の I L一 1活性及び G I F活倥の測定は 同公開公報記載の方法に従う。
号 I L 一 1 ^ 誘 導 体
I IL— l^S自侔
Π [Gly4 ] I L-l^S (4位 Argを Glyに置換した
Figure imgf000032_0001
π [Gin11] I L-Ιβ (11位 Argを Ginに置換し た I L一 1^3)
IV [Ser8 ] I -Ιβ (8位 Cysを Serに置換した
IL-l^)
ν [Ser8 Ser71] I L-Ιβ (8位 Cys及び 71位
Cysを 8位 Ser及び 71.位 Serに置換した I L一 1 β
VI [Ser71] IL-liS (71位 Cysを Serに置換し た I L-liS)
W [Gin103 ] I L— l S (103位 Lysを Ginに置 換した IL一 liS)
I L-Ιβ (1一 140) ポリペプチド （141位 以降を欠失させた I L— liS)
K [Gin121 ] I L-Ιβ (121位1^を0111に置 換した I L— l S)
X Met- I -Ιβ (N末端に Metを fflnした I L一 liS)
XI des-Ala1 - I L-l^S (1位 Alaを欠失させた I
L-l^)
χπ [Leu98] I -Ιβ (98位 Argを Leuに置換し
Til L-Ιβ)
ΧΠΙ [Gly4 Gln1:LLeu98j I L-l ,3 (4位 Arg、 1 |
1位 Arg及び 98位 Argを 4位 Gly、 11位 GinSj び 9 S位 Leuに置換した I L -l ) ；
o 略 号 I L 1 誘 導 体
XIV [Gly4 Gin11] I -Ιβ (4位 Arg及び 11位
Argを 4位 Gly及び 11位 Ginに置換した I L— 1
XV [Gly4 Leu98] I L-Ιβ (4位 Arg及び 98位
Argを 4位 Gly及び 98位 Leuに置換した I L— 1
XVI [Gin11 Leu98] I L-Ιβ (11位 Arg及び 98 位 Argを 11位 &111¾び98位 Leuに置換した I L 一 ）
χνπ des-Arg4 - I L-Ιβ (4位 Argを欠失させた0 I L一 ）
xm des-Arg11- I L-l^S (11位 Argを欠失させた
Figure imgf000033_0001
ΧΊΚ des-Arg98- I L-l (98位 Argを欠失させた XX [Ala8 ] I L-l^ (8位 Cysを Alaに置換した
I -Ιβ)
5 XX I des-Cys8 - I L-Ιβ (8位 Cysを欠失させた
Figure imgf000033_0002
χχπ [Ala71] I L-l ^ (71位 Cysを Alaに置換し た I L一 l S)
xxm [Val71] I L-Ιβ (71位 Cysを Valに置換し た I L— 1 ）
XXYJ des-Cys71- I L-Ιβ (71位 Cysを欠失させた
I -Ιβ)
XXV [Leu93] I L - 15 (93位 Lysを Leuに置換し ； r I L- 1 ) 略 号 I L 1 jS 誘 導 体
XXVI I L-l^- (1-144) ポリペプチド （145 位以降を欠失させた I L-l S)
xx I L-l^S- (1-148) ポリペプチド （149 降を欠失させた I L— 1 jS)
XX CArg120 ] I L-l^ (120位 Trpを Argに置 換した I L一 l^)
χχκ [Tyr30] IL-Ιβ (30位 Hisを Tyrに置換し た I L一 1)8)
XXX I L-l S- (1- 31 202) ポリペプチド （103 位以降を欠失させた I L一 1 )3)
XXXI (77' -116' ) -I L-l^ (N端に式 (B) で表わされる 77' — 116' 位のアミノ酸配列を 働 Πした I L一 liS)
XXX π (71' —116' ) -I L-Ιβ (N端に式 (B) で表わされる 7 — 116' 位のアミノ酸配列を した I L一 ）
xxn (32' 一 116' ) -IL-Ιβ (Νδ に式（Β) で表わされる 32' -116' 位のアミノ酸配列を fflQした I L一 1^3)
XXXIV (1' -116' ) -I L-Ιβ (N端に式 （B) で表わされる: L' 一 116' 位のアミノ酸配列を付 力 Πした I L一 15)
XXXV I -Ιβ- (1-120) ボリペプチド （121 降を欠失させた I L— 1 ）
X XVI [Ala8 S er71] I -Ιβ (8位 Cys及び 71位
Cysを S位- Ma¾び 71位 S erに置換した I L— 1 略 号 I L — 1 5 誘 導 体
XXX [Ala8 Ala71] I L-Ιβ (8位 Cys及び 71位
Cysを 8位 Ala¾び 71位 Alaに置換した I L一 1
XXXVI [Ala。 Val71] I h-ΐβ (8位 Cys及び 71位
Cysを 8位 Ala及び 71位 Valに置換した I L一 1 β
χχχκ I -Ιβ- (4-153) ポリペプチド （1位
Alaから 3位 Valに至るアミノ酸配列を欠失させた I L-l^)
I L-Ιβ- (7-153) ポリペプチド（1位 Alaから 6位 Leuに至るァミノ酸配列を欠失させた I L-liS)
I I L-Ιβ- (10-153) ポリペプチド (1位 Alaから 9位 Thrに至るァミノ酸配列を欠失させた I L-l^S)
χχχχπ des-Val3 - I L - 1 ^ (3位 Valを欠失させた
I L-1J5)
xxxxnr des-Ser5 - I L-Ιβ (5位 Serを欠失させた
I -Ιβ)
XXXXIV des-Lys97- I L-Ιβ (97位 Lysを欠失させた
I L-l
χχχχν des-Phe"l L-Ιβ (99位 Pheを欠失させた
I L-10)
X XXXVI I L-Ιβ- (1-150) ポリペプチド （151 fe^l降を欠失さ 二 I L-l S)
XXXXVE des-Ser153 - I L-l ( 153位 S erを欠失さ | せた I L— 1 ） 略 号 ι L - 1 β m ^ xxxx Met— [Gly4 ] I L— l^S (N端に Metを有し 且つ 4位 Argを Glyで置換した I L一 1 ;3) χχχχκ [Lys4 ] I L-Ιβ (4位 Argを L ysで置換し た I L一 l^)
χχχχχ [Gin4 ] I -Ιβ (4位 Argを Ginに置換し た IL一 ljS)
ΧΧΧΧΙ [Asp4 ] I -Ιβ (4位 Argを Aspに置換し た IL-liS)
χχχχχπ [Asp93] I L-l^ (93位 Lysを Aspに置換 した I L一 l S)
ΧΧΧΧΧΠΓ (112' -116' ) -IL-Ιβ (雜こ式
(B)で表わされる 112' -116' 位のァミ ノ酸配歹 |』を¾口した I
XXXXXW Asp- I L-l jS (N に Aspを付加した I L — ）
χχχχχν Leu- I L-Ιβ (N末端に Leuを¾nした I L 一 1β)
XXXXXVI Arg- I L-l^ (N末端に Argを付加した I L
-1)8)
製造参考洌 1
① 特開昭 6 3— 1 5 2 3 98号公報記載の製造例 1一 ①に準じて、 プラス ミ ド p trp G I F - aを利用したサ ィ ト ースぺシフィ ック ミ ュー夕ジエネシスにより、 下記 2表に示す各ポリペプチ ド （ I L— 1 /S誘導体） を得た, 尚、 各ポリべプチ ドの発現、 G I F活性の測定及び精 製は、 上記公開公報記載の方法に従う ものであり、 S D S— P A G E も同様にその参考例 2— （4 ) に示す方法 に準じた。 以下の各例でも特筆 1しない限り同様である。
第
ポリぺプチ ド プ ラ イ マ ー
X X X XIX 5' -CTCCTGTAAAATCTCTGA- 3'
X X X X X 5' -CTCCTGTACAATCTCTGA- CD 3"
X X X X X I 5' -GTCCTGTAGATTCTCTGA- 3'
X X X X X Π 5* -ACCCAAAGGATAAGATGG- 3·
ポリぺプチ ド 構築プラスミ ド 宿 主
(E.coli)
X X X X 3X ptrpGIF-α -4Κ HB101
A X -Λ. PtrpGIF - G: - 4Q 腿 01
.X X X X I PtrpGIF - a -4D 11 丄 "丄
X X X X X π
Figure imgf000037_0001
ポリペプチ ド GIF活性 （単位ノ M. W.
ma培養液） (kd)
XXXXE 7.4Χ 105 17.5
XX X 2.1 105 17.5
XX XXX I 1.1X 103 17.5
XXXXX Π 3.5 103 17.5 製造参考例 2
この例は、 I L一 1 ySの N末端に種々のア ミ ノ酸残基 を付加した I L一 1 /3誘導体 （ポリペプチ ド XXXXX nr〜xxxxxvi) を製造した例である。
上記 N末端領域付近には、 蛋白質合成の開始コ ドン A T Gの 5塩基上流に C lal部位が存在するが、 それより 下流には 1 1番目の Argのところに Msp I部位が存在す るだけであり、 この 2つの部位間にリ ンカ一 D N Aを揷 入しょうとすると、 該リ ンカーが長く なりすぎるため、 まず之等の制限酵素部位間のもつと N末端に近いァ ミ ノ 酸のところで適当な制限酵素部位の作成を検討し、 その 結杲、 4番目の Argのコ ドンを C G Tから A G Aに代え て、 次の S erとの間に A G A T C Tの B gill制限 ¾素部 位を作成し、 この作或された Bginと上記 C lar部 &間 に、 予め合成された変異領域を含む各種合成リ ンカ一を 入替えて所望の遺伝子を構築し、 これを大腸菌で発現さ せて、 目的のポリペプチ ドを得た。 以下、 その方法を詳 述 9' o
( 1 ) 制限酵素 B gin部位を持つ I L— 1 5発現プラス ミ ドの作成
trp プロモーターを用いた p trp G I F - a ：
4 9 2 1 bp) を、 制限酵素 C la l及び B amH Iで消化し て、 5 7 9 bpと 4 34 2 bpの 2つのフラグメ ン ト D N A を得た。
上記 5 7 9 bpフラグメ ン ト D N Aを更に Msp Iで消化 して、 5 ' 末端に Msp l部位を、 3 ' 末端に B amH I部 位を持つ 54 3 bpのフラグメ ン ト D N Aを得た。
次に、 以下の配列のリ ンカー D N Aを合成し、 T 4ポ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼを用いてその 5 ' 末端をリ ン酸 化した。
C la I B gl Π
5'-ϊ C G A T A A T G G C T C C T G T A A!G A δ ' T A T T A C C G A G G A C A T T ( 亍—
Msp I
T C T C T G A A C T G C A C T C T C 一 3'
A G|A G A C T T G A C G T G A G A G G C ;-5 ' の リ ン酸化リ ンカーと、 上記 54 3 bpのフラグメ ン トとを、 T4 D N Aリガーゼを用いて連結して、 5' 末 端に C lal部位、 Φ間に Bgin、 Mspl部位及び 3' 末 端に BamH I部位を持つ D N Aフラグメ ン ト （ 579 bp) を得た。
最後に、 上記で得た 579 bpのフラグメ ン トと、 先の 4342bpのフラグメ ン ト とを、 T 4 DN Aリガーゼを 用いて連結することにより、 新たに BglE部位を持つ
I L - 1 β発現プラスミ ド （p trp I L - 1 ^ , H 2 ： 492 1 bp) を得た。
得られたプラスミ ドをェシエリ ヒア · コ リ H B 1 0 1 に トラ ンスフォームし、 得られるクローンを D NAシー クエンス した結果、 目的通り Bgin部位を有する I L一 1 発現遺伝子であることが確認された。
(2) 合成 D N Aリ ンカ一による I L一 1 ^の N末端付 加変異蛋白質の製造
上記 （ 1 ) で得たプラス ミ ド p trp I L - 1 β , Η 2 の C la I — B gin制限酵素部位間で、 合成 D N Aリ ンカ 一とべクタ一 D N Aとを置換させることにより、 I L— i の N末端に所望のァ ミ ノ馥を付加した変異蛋白質を 作成した：：
上記 加するァ ミ ノ苣と しては I L一 1 前駆 fee来 の 5ァ ミ ノ該配列 （ A i a— T y r— V a 1— H ί s— A s p； A Y V H D) 、 酸性ァミ ノ酸 （Asp ; D) 、 中性ァミ ノ 酸 （Leu； L) 及び塩基性ァミ ノ酸 （Arg； R) のそれ ぞれ 1つずつを選んだ。 之等の変位蛋白質をそれぞれ
[AY V HD] - I L一 1 、 [D] - I - 1 β ,
[L] 一 I L一 ； l S及び [R] — I L一 1 と略記する, 各合成リ ンカ一 D N A配列は次の通りである。
① A YVH Dを付加するためのリ ンカー
C la I
I A la Tyr Val His
5'-j C GA TAA T G G CjA TA T G T G C A C
3'- TA T TA C C G T A]T A C A C G T G
Nde I
Asp A la P ro V al B gi n
GA T G C T C C T G TAA | -3
C TA C G A G GA C A T T C~T~A~G~nj -5
② Dを付加するためのリ ンカー
C la I
Asp A la Pro Val
5'-i C G A T A A T G GA T G C T C C T G T A
3'- j T A T T A C C T A C G A G G A C A T B gin
A -3*
Figure imgf000042_0001
T G~"| -5 '
I
i
③ Lを付加するためのリ ンカ一 C lal
J L eu Ala P ro V al
5'-i C GATA ATGT TA G C T C C T G TA 3'- ] TA TTA C AAT C GA G GA C AT
BgiH
A -3
T C T A G i-5
④ Rを付加するためのリ ンカー
C lal
A rg A la P ro V al
5 W C GATAAT G C GT G C T C C T G TA
"1
8'- • TAT TA C G C A C GA G G A C A T
BglE
A -3
T C T A G -5 まず I L一 発現プラス ミ ド p trp I L— 1 ， H 2 を C lal及び Bginで消化して、 4. 9 kbp のフラグメ ン ト D N Aを得た。 次いで上記①〜④の各リ ンカ一を合成し、 T4ポリ ヌ ク レオチ ドキナーゼを用いてそれらの 5' 末端をリ ン酸 化した。
得られた 5' 末端をリ ン酸化した合成リ ンカ一のそれ ぞれと、 上記 4. 9 kbp のフラグメ ン ト D N Aとを T 4 D N Aリガーゼを用いて連結させ、 4種類の I L一 1 ^ N末端付加変異蛋白質発現プラス ミ ドを構築した。
之等プラス ミ ドのそれぞれをェシエ リ ヒア · コ リ H B 1 0 1に トラ ンスフ ォーム し、 得られるク ローンを D N Aシークェンス して、 目的 D N Aシークェンスを確認し た。
(3) I L一 1 ^ N末端付加変異蛋白質の発現及び精製 上記 （2) で得た各発現プラス ミ ドで トラ ンスフ ォー ムされた H B 1 0 1株 （K 1 2株） を M 9培地中、 37 で振盪培養した。
遠心分離して集めた菌体を 1 Mリ ン酸水素ニナ ト リ ウ ムで 4でにて処理した後、 5 mMト リ ス塩酸緩衝液
(p H 8. 0) に対して透析し、 浸透圧ショ ッ クにて破
•^SZ し フ 。
透析液を^馥にて P H約 4に謁整した後、 生じた沈銎 を遠心分難により除去し、 上清液を陽イオン交換高速液 体ク ロマ トグラフ ィ ー （H P L C：、 トーソ一社製、 S P 一 5 PWカラム使用） にかけ、 メイ ンピークを再クロマ トグラフィ 一にかけて更に精製した。 上記陽イオン交換 H P L Cを 2度行なう ことにより得られる各 I L一 l S 変異蛋白質は、 S D S - P A G E電気泳動でほぼ単一の バン ドに精製された。
更に、 アミ コン YM— 5メ ンブランにょる限外泸過を 行ない、 溶媒を酢酸緩衝液 （p H 5. 5) から水におき カヽえた o
得られた各変異蛋白質の諸性質を下記第 3表にまとめ て示す。
第
Figure imgf000044_0001
1 - 1 β (ポリペプチ ド I ) 及びその誘導^につ 以下の活性試験を行なった。
尚、 前記したポリぺプチ ド I に対する抗 清を ¾い R I A法により測定したポリペプチ ド I換算蛋白量 （nig) 当りの L A F活性 （U) は、 下記第 4表に示す通りであ る。
4
ポリペプチ ド L A F活性 (UZing)
ポリぺフチ ド I 4. 5 X 1 0 6
ポリペプチ ド Π 1. 6 X 1 0 5
ポリペプチ ド IE 6. 2 X 1 0 8
ポリぺプチ ド IV 2. 6 X 1 0 5
ポリぺプチ ド V 2. 1 X 1 0 5
ポリぺプチ ド VI 1. 3 X 1 0 7
ポリペプチ ド珊 8. 0 X 1 0 3
薬理試験例 1 ： ポリぺプチ ド Iの C S F産生促進効果
①ヒ ト肺細胞の C S F産生に対する促進効果試験
C S F産生株と して、 ヒ ト肺細胞由来株 H F L— 1 (Human Embryonic lung Fibroblasts, A T C C登録钿 胞株 No. C C L - 1 53 ) を用い、 以下の試験を行なつ まず、 上記 H F L— 1 ¾胞を 2 x l 05 mymQ
濃度となるように、 1 0 %ゥシ胎児血清加ハム スタ一 1 2 K培養^ [Ham, B. G. ,Proc. Natl. Acd.Sci., 53 ,
288 (1 96 5) 〕 に浮遊させた。 次いで上記钿胞懸 蜀液中に、 種々の濃度に調製した前記参考例で得たポリ ペプチ ド Iを加え、 炭酸ガス培養器内で 37 °Cで 24時 間、 48時間及び 72時間各々培養し、 各培養上清を集 め、 之等培養上清中に産生蓄積された C S F量を、 マウ ス骨髄細胞を使用して測定した CLevis.I. et al.,J. Imiunol. , 1 28， 168 (1 982) 〕 。 ポリぺプ チド Iを用いて得られた各培養時間（hr)での結果を第 1 図に示す。 図において、 横軸はポリペプチ ド Iの濃度 (G I F単位 Ζπώ) を、 縦軸は C S F活性 （単位 ma) を示す。'
. 上記結果より、 .ポリペプチ ド Iの添加によれば、 H F L一 1細胞株の C S F産生量は、 該ポリべプチ ドの無添 加に比べて実に数百倍にも亢進されることが明らかであ る Ο
②ヒ ト皮膚由来細胞の C S F産生に対するポリペプチ ド Iの促進効果試験
ヒ ト正常皮膚由来 ¾胞株と して C R L— 1445 (A T C C. No.) を Sいて以下の試験を行なった。 即 ち、 上記 ¾飽を 2 X 1 0= 僵 Ζΐπδの 胞濃度となるよう に 1 0 %ゥシ脍児血清 Snダルべッ コ M E M培養液 - ο [Dulbeco.R.and Freeman， G .， Virology. 396 ( 1 9 59 ) 〕 に浮遊させた。 上記细胞浮遊液に、 種々 の濃度の参考例で得たポリペプチ ド Iを加え、 炭酸ガス 培養器内で 37 で 24、 48及び 72時間培養した後 培養上清を集め、 産生された C S F量をマウス骨髓細胞 を使用して上記試験①と同様にして測定した。
得られた結果を第 1図と同様にして、 第 2図に示す。 第 2図より、 G I F活性と して 1単位 Ζιπδ以上のポリ ペプチ ド Iをヒ ト正常皮膚由来の原線維芽細胞に加える
10 ことにより、 該細胞の C S F産生能は著しく促進される ことが明らかである。
③生体内での C S F産生に対する促進効果試験
ポリべプチ ド Iを生体内に投与した場合、 生体内での C S F産生亢進作用が発現されることを以下の動物実験
15 により試験した。
即ち、 正常マウス （B A L BZC系マウス、 静岡県実 験動物協同組合より購入） に、 種々の量の参考例で得た ポリペプチ ド I (G I F活性と して 1 03 〜： L 05 単位 /個体） を静脈内投与した。 上記投与後 2、 4、 8、 1 2及び 24時間目に各実験動 ¾より採血し、 血清中の C S F澧度をマウス骨 ¾¾¾を^いて測定した。
結杲を第 3図に示す。 図において撗 は各種濃度 (G I F単位 Z個体） のポリペプチド Iの投与後時間 (hr) を、 鈸軸は C S F活性 （単位 Zma血清） を各々示 す。 また図中 （ 1 ) はポリペプチド Iの 1 0万 G I F草 位 Z個体投与群を、 （2) は同 1万 G I F単位 Z個 ^投 与群を、 （3) は同 1 000 G I F単位 Ζ個体投与群を， また （4) は対照群 （H S A 1 0 g 個体投与群） を 示す。
第 3図より、 ポリペプチ ド Iを動物に与えた場合、 動 物血.清中の C S F濃度は著しく高く なつていることが判 明した。 即ち、 ポリぺプチ ド Iは注射された量に比例し て生体内での C S F産生を著しく亢進させる作用のある ことが認められた。
薬理試験例 2 ： ポリベプチ ド Iの抗関節炎試験
① ノヽ0ース ン CPearson.C.M. , Proc.Soc.Exp. Biol.
Med. , 1 , 5 (1 9 56) 〕 及びワー ドとジヨー ン ズ CVard, J.R. , Jones . R. S. » Arthritis Rheumatism , 5 , 5 57 ( 1 962) 〕 の方法に準じて、 アジュバン ト関 節炎ラ ッ トを作製した。 即ち、 雌性 S. D. 系ラ ッ トの 尾接部皮内にミ コバクテリ ウム · ブチリ力厶
(M ycobacteriui butvricum) 死菌を流 ノ、。ラフィ ンに S¾させたアジ二パン ドを 0. 0 5 注射した。 14曰 目に足腫脹に基づいて群分けし （η = 6 ) 、 その翌日よ り 5日間に亘つて、 ポリペプチ ド I又はその溶媒 （生理 食塩水 ； 対照群） を、 皮内投与した。 経日的に足容積を 測定することにより、 関節炎に対する影響を評価した。
結果を第 4図に示す。 図において横軸はアジュバン ト 投与後日数 （日） を、 縱軸は足体積 （X 0. Ο Ι Πώ) を 各々示す。 また図中 （ 1 ) はポリペプチ ド Iの 1 0万 G I F単位 Ζ個体投与群を、 （2) は同：！万 G I F単位 個体投与群を、 （3) は同 1 000 G I F単位 Ζ個体 投与群を、 （4) は同 1 00 G I F単位 個体投与群を、
( 5) は対照群 （生理食塩水投与群） を、 また （6) は 正常ラッ ト群を示す。
第 4図より、 対照群 （グラフ （5) ) の足腫脹は 23 日目まで增悪したのに対し、 ポリペプチ ド Iの投与群
(グラフ （ 1 ) 〜 （4) ) においては、 その投与の 4日 目 （アジュバン ド投与後 1 8日目） より、 足腫脹の抑制 作用が認められ、 最終投与 4日後 （アジュバン ド投与後 23日目） においても関節炎の進行を阻止できることが ι¾ »、され 7 0
薬理試験^ 3 ： I L - 1 ^5 '誘導^の C S F産生促進効臬 细跑洙 U— 3 7 3 M G 〔 A T C C H T B 1 7、
G 1 io lastonia. A strocyionia, H unianj を用いて、 以下 の試験を行なった。
上記细胞を、 2 X 1 05 個/ ϋΐδの銪胞濃度となるよう に、 1 0 %F C S (G1BC0 社製） 、 MEM非必須アミ ノ 酸 （F low 社製） 及び MEMピルビン酸ナト リ ウム
(F low 社製） を添加したイーグル MEM培地 （日水社 製） に浮遊させ、 種々の濃度となるように被験物質を加 えて、 炭酸ガス培養器内で 37でで 24時間培養した。
各培養上清を集め、 之等培養上清中に産生蓄積された C S F量を、 マウス骨髄細胞を使用して測定した
[Levis. I.C. et al .. J - Immunol ..1 28, 1 68
(1 982) ] o
結果を第 5図に示す。 図において横軸は被験物質の濃 度 （ngノ ΐηδ) を、 縦軸は C S F活性 （υζιπβ) を示す。 また図中曲線 （ 1 ) 〜 （7) は以下のポリペプチドを被 験物質とした時の锆果を示す。
曲線 （ 1 ) ポリぺプチ ド VI
曲線 （2) ポリペプチ ド E
曲鎳 （3) ポリぺプチ ド^！
曲線 （4) ポリぺプチ ド V
曲線 (5) ポリぺプチド W
( 6 ) ポリぺプ r
mm. (7) …ボリペプチ ド xxx 薬理試験例 ·4 ： I L - 1 5誘導体の抗炎症試験
ウィ ンター（Winter ) らの方法 CProc.Soc. Exptl . Biol. Med.. I l l , 544— 54 7 ( 1 962) 〕 に準 じてこの試験を行なった。
即ち、 6〜 8週齢の雄ラッ ト （S prague Davley 系. 日本チヤ一ルスリバ一社） を、 実験前日に体重に基づい て 1群 6〜 8匹の各群に分けて用いた。 起炎剤と して力 ラゲニン （Marine Colloid社製） を、 生理食塩水に 1 %となるように懸濁させたものを使用し、 ラッ トの右後 肢足踱皮下に 0. 1 πΐδ注射して足浮腫を惹起させた。 足 浮腫を評価するため、 起炎剤注射の前後の一定時間に、 右後肢足踱容積を、 プレシモメーター （plethysiDoineter, Ugo- Vasile 社製） を用いて測定した。 前値に対する 起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率 （swelling^) と し て表わした。
被験物質は、 ダルベッ コのリ ン酸塩緩衝食塩水
(Dulbeco's phosphate buffered saline) に溶解希釈 し、 ラ ッ トの背部皮内に 0. 1 πιδ宛、 起炎剤注射の 1時 間前に注射した。 尚、 対照群と して、 溶媒投与群を作成 し、 同一実験に俟した。
結杲を第 6図に示す。
図において撗 ¾は、 起炎剤投与後時間 （hr) を、 縱拿 は浮腫率 （ ） を示す。 また、 図中、 曲籙 （1 ) は対照 群を、 曲線 （2) はポリペプチ ド VIの 0. l ixg 投与群 を、 曲線 （3) はポリべプチ ド VIの 1 μ 投与群を、 曲 籙 （4) はポリぺプチ ド VIの 1 0 /ig 投与群をそれぞれ 示す。
薬理試験例 5 ·. I L - 1 誘導体の放射線障害防止作用
B A L B/ c系マウス （9週齢） に致死量の X線を照 射する 20時間前に、 ポリペプチ ド VIの 1 gZマウス 又は 0. 3 gZマウスを腹腔内注射した。 X線照射装 置 （MB R- 1 50 5 R、 日立メディ コ社） を使用し、 850レン トゲンの X線、を、 上記マウスに全身照射し、 以後、 毎日その生存を確認した。 尚、 コ ン トロールと し て P B S投与群をおいた。
結果を第 7図に示す。 図において横軸は X線照射後の 日数 （日） を、 縦輸は供試動物の生存率 （％) を示し、 曲線 （ 1 ) はポリぺプチ ド VIの 1 a g投与群を、 曲線
(2) はポリペプチ ド VIの 0. 3 g投与群を、 また曲 鎳 （3) はコ ン ト ロール群をそれぞれ示す。
第 7図より、 コン ドロール群では X籙照射後 18日目 に全珂死亡したのに文 し、 ボリぺプチ ド VI投与群では、 その投与量に依存して、 放射線障害の防止作用が認めら れ、 1 ^ g投与群では、 約 8割が放射線障害による死亡 から回避され、 生存することが確認された。
薬理試験例 6 ： I L - 1 5誘導体の日和見感染防御効果 試験
易感染モデルマウスを用いて、 以下の試験を実施した。 I C R系雄性マウス （6週齢） を供試動物 （1群 7匹） と し、 第 1日目に 5—フルォロウラシル （5— F u、 協 和醱酵社製） 10 OmgZkgを静脈内投与した。 第 2日目、 第 4日目及び第 6日目にポリべプチ ド VIの 1 a マウ スを皮下投与し、 第 7日目に、 綠臈菌 （ P seudonionas aeruginosa E - 2 ) の所定量を腹腔内投与して感染さ' せた。 第 1 0日目に供試動物の生存数を計数して、 生存 率 （％) を求めた。
結果を第 8図 （1 ) 〜 （3) に示す。
第 8図 （1 ) は上記実験群の結果を、 同 （2) はポリ ぺプチ ド VIを投与しなかった （ 5— Fu のみを投与した） 対照群の結果を、 また同 （3) は 5— F u及びポリぺプ チ ド VIのいずれも投与しなかつた対照群の結杲をそれぞ れ示す。
第 8図 Φ、 縦軸は生存率 （％) を、 横軸は下記各綠腹 菌投与量を採^した群 A〜Εを各々示す。 A群… 1 9000菌数/マウス投与群
B群… 3800菌数 Zマウス投与群
C群… 7 50菌数 Zマウス投与群
D群… 1 50菌数ノマウス投与群
E群… 30菌数 マウス投与群
F群… 6菌数 Zマウス投与群
<動物細胞からのサイ トカインの製造方法〉
① 種々の濃度のポリペプチド XXXVK及び
0. 0 1 % P H A - P存在下に、 H B S— 2 C 5 B 2細 胞 CJ. Immunol., 13 1, 1682 - 1 689
( 1 985) } を、 2 X 1 05 細胞ノウエルにて培養し た。 培養 24時間後の上清を採取し、 その I L— 2活性 を、 ス ミ ス （K.A.Sinith ) らの方法に従い、 I L一 2依 存性マウス T細胞 （C-T L L 2) を用いて測定した 〔J. Iniiunol., 120, 2027 ( 1 978) 〕 。
結果を下記第 5表に示す。
5
ポ リペプチ ド X X X π I L - 2活性 （cpni x の濃度 （ngノ πώ) 1 0一3) 平均（π=5)
0 0. 2
0. 0 0 0 5 0. 3
0. 0 0 5 1 , 3
0. 0 5 3. 9
0. 5 3. 1
5 4. 1
5 0 4. 2
5 0 0 4. 9
② U— 3 7 3 MG細胞を、 1 0 % F C S加 R P M I - 1 64 0培地で集密的まで培養し、 更に 2 O ngZmfiのポ リペプチ ド X X X Iを含む又は含まない （コ ン ト ロール） 上記培地中で 1 8時間イ ンキュベー ト した。
培地を除去した後、 グァニジニゥムノセシウムクロラ ィ ド法により R N Aを抽出し、 オリ ゴ（dT) —セル口 —ス ク ロマ ト グラフ ィ ーによ り、 ポ リ （ A ) + R N A ( m N A ) を収得した。 ノザン · プロ ッティ ング法 (Northern blotting) に従い、 上記ポ リ ( A) ÷ R N A 1 0 gをァガロースゲル （ 1. 2 % ) 電気泳動に付 し分画後、 ニ トロセルロース ♦ フィ ルターに転写した。 凝圧下 80°Cでべ一キングし、 20 mMト リス:
(p H 8. 0) 中で 1 00て下に、 5分間処理後、 50 %フオルムア ミ ド、 5 X s s c、 50mMソジゥムフ ォ スフェー ト （p H 6. 5 ) 、 4 xデンハー ド液
(D enhardfs solution) 及び 200 g πώの変性サ ルモン スペラム D Ν Α中で 42。C下にプリハイブリダ ィゼ一ショ ンを行なつた。 5時間後、 ニック トランスレ ーショ ンで放射能標識した GM— C S F c D N A
[Science, 228, 81 0 ( 1 985) ] の Pst l —
Nco I D N A断片又は B S F— 2 c D N A [Nature.
324, 73 (1 986) ] の — B aniH I D N A 断片と、 42 °C下に 20時間ハイブリダイゼーショ ンを 行なつた。 フィ ルタ一を 0. 1 % S D S加 2 x s s cで 室温下に 1 5分間、 更に 0. 1 % S D S加 0. I X s s cで 50。C下に 1時間洗浄した。 ォー ドラジォグラ ムは、 增感紙を用いて、 一 70 °C下に一夜行なつた。
その結果、 GM— C S Fの D N A断片を用いた場合も. B S F— 2の D N A断片を用いた場合も、 I L— 1 誘 導^の利 Sにより、 動物篛胞からの天然サイ トカイ ン類 の生厓が効率よく行ない得ることが判つた。
また、 I L一 1 誘導体の、 かかる方法への逼用に際 しては、'極めて微量、 逼常 1 0 ngZniS程度の使用で十分 であり、 誘導されたサイ トカイ ン類の精製過程をも容易 に 9'な 0
③ 動物細胞よりサイ トカイ ンを生産する場合、 産生誘 引に使用する I L一 1 活性物がその条件下において構 造的に安定であり、 細胞表面上の I L一 1受容体に結合 することが必須である。 即ち、 1 1^ー 1 ^活性物が 1 1^ 一 1受容体に結合し、 サイ トカイ ン産生に必要なシグナ ルを細胞内に伝えることが重要である。 そこで、 線維芽 細胞上の I L一 1受容体への結合に関して、 以下の試験 を行なった。 即ち、 6—ゥヱルプレー ト上で、 一面にほ ぼ均一にまで増殖した B alb Z3 T 3細胞 （クローン A 31 ： A T C C , C C L一 163、 1 X 1 08 細胞 Zゥ エルに、 125 Iで標識したポリペプチ ド I ( I L - l 3) の 50000 epic ノウェル及び事前に 1 0% F C S加 D — MEM中で 37。C下にィ ンキュベー ト した 20 ng/πΐδ のポリペプチ ド Iを加え、 4°Cで反応させた。 反応液を ノ、。スツールピペッ トで除き、 10 % F C S加 D— M E M の 1 ιπδを加えて静かに法い上清を捨てた。 この 操作 を 2回綠返した後、 l m2の 1 % S D S、 0. 2 N
N a 0 Hで ¾胞を可溶化し、 可溶化液及び更にゥエルを 洗'净した可溶化液中の放射能 （詰合放射能） をァ -カウ ンターにて測定した。
尚、 上記 125 1標議ポリぺプチ ド I は、 ボルト ンとノヽ ン夕一 （Bol ton Hanter)の方法 CBiochem . J . , 1 3 3 5 2 9 ( 1 9 7 3 ) 〕 に従い製造精製した （比活性 ； 2 5 0 C i ^ g蛋白以上） o 得られた結果を下記第 6表に示す。
第 6 表
Figure imgf000058_0001
尚、 表中阻止能は次式により求めた
A - C
阻止能 （％) = X 1 0 0
A - B
A ： 未標識ポリぺプチ ド Iが存在しない時の結合した 放射能
B ·. プレー トに非特異的に吸着した放射能 C ： 結合した放射能の実測直
かかる指標は、 共存させたポリべプチ ド Iの I L 一 1 受容^への詰台力を表わす。
上記第 6表より、 ポリペプチ ド I、 即ち I L— 1 自 体は、 サイ トカイ ン誘導条件下において、 時間の経過と 兵に、 I L— 1受容体への結合力が β下してしま う こと が明らかとなつた。
そこで、 上記において、 24時間の事前のイ ンキュべ ーシヨ ンを行ったポリペプチ ド I、 ポリペプチ ド VI又は ポリべプチ ド XX XWを用いた同試験を行なった。
結果を第 6表と同様にして第 7表に示す。
第 7 表
Figure imgf000059_0001
上記結果より、 動物細胞からのサイ トカイ ン類の製造 に際しては、 I L— 1 ；5誘導体の採用がより好ま しいこ とが判る。
実施例 1
① G I F活性 [前記した方法において、 ヒ トメ ラノ一 マ細胞と して A 37 5 S 1株 （徵ェ研菌寄第 9 67 ◦号） を^いて測定した.] と して 4 5 0 0 0阜位ノ πώ (約 1 ； g蛋白量ノ ΙΠ3 ) のポリペプチ ド VI、 ッウィ ー ン 80 (ポ リ ソルべ一 ト 80 ： 日本サ一フ ァ ク タ ン .ト社製 0. 0 lfflgZmS及びマルト一ス 15mgZinaとなる量の各 戒分を、 0. 01Mクェン漦ークェン駿ナト リ ウム缓衝 液 （p H 6. 0) に加えて混合し、 混合物を泸過
(0. 22 ίίπιメ ンブラーフィ ルター使用） 後、 戸液を 無菌的に 1 maずつバイアル瓶に分注し、 凍結乾煖して、 注射用製剤形態の本発明組成物を調製した。 該製剤は、 これを用時、 生理食塩水 1 ιπδに溶解して利用される。
② 上記①と同様にして、 ポリペプチ ド Π又はポリぺプ チ ド XXVを有効成分として含有する注射用製剤形態の 本発明組成物を調製した。
他の I L一 1 yS活性物も略同様にして、 注射用製剤形 態に調製できる。
③ 安定性試験
上記①で得られた製剤を用いて、 その安定性を下記方 法により試験した。
( I ) 方法 I ：
凍結乾燥した上記製剤を、 ガラス瓶 （気密、 遮光） 容 器中、 4て又は室温下にそれぞれ保存した。 安定性の判 定は、 下記判定基準に基づいて 1、 2、 3及び 6ヶ月間 それぞれ 存後に評衞した。
<判定基準〉
性 伏 ： （外観） 試験閱½時と同じく、 白色の垸である 時 「変化なし」 と判定した。
(溶状） 生理食塩水 1 m5に溶かした溶液が、 無色 透明である時に 「変化なし」 と判定した。 水素イオン濃度： 開始時の p H値 （ 5. 6 5 ) の士
0. 2の範囲を 「変化なし」 と判定した。 浸透圧比： 開始時の値を 1 00 %とした時、 9 5〜
1 0 5%の範囲内にある時を 「変化なし」 と判定 した。
尚、 上記判定は、 1サンプルにっき 3バイアルの結果 の平均をもつて評価した。
(Π) 結 果 ：
全ての保存温度及び全ての保存期間において、 本発明 の製剤はいずれも上記基準により 「変化なし」 と判定さ れた。 上記試験における 6ヶ月の保存後の測定データー (平均値） を第 8表に示す。
第 8 表
Figure imgf000061_0001
水素ィォン濃度 ； 5. 61 1 5. 5 Q 浸透圧比 (%) ； 99. 2 ！ 99. 2 (Π) 方法 H ：
凉結乾煖した上記製剤を、 生理食塩水 1 ϋώに溶かした 後、 3日間、 4で又は室温下に保存し、 その溶伏及び水 素イオン濃度を、 上記方法 Iに準じて測定評価した。
(IV) 結果：
上記試験 Πの結果を第 8表と同様にして第 9表に示す, 第 9 表
Figure imgf000062_0001
上記試験の結果 （第 8表及び第 9表） より、 本発明組 成物は、 極めて安定であることが判る。
(V) 方法 m：
凍結乾燥した上記製剤を、 ガラス瓶 （気密、 遮光） 容 器中、 4 °C又は室温下にそれぞれ保存した。 安定性の判 定は、 下記判定基準に基づいて、 1、 2及び 4週間保存 後に評価した。
く半定基準〉
含量 （％) ：試験開始後の I L一 1 活性 ¾の含量を
1 0 0 %とした時、 95〜： L 0 5 %O¾gF¾にあ る時を 「変化なし」 と判定した。 尚、 I L - 1 ；6活性物の含量は、 下記条件の高速液体 ク ロマ ト グラフ ィ ー （H P L C : ト一ソ一社製 H P L C システム） によって剷定した。
力 ム ： T S K O D S - 1 2 0 T (4. 60 1 50 mm： トーソ一社製）
溶 媒 ： A液 = 0. 1 %T F A -水
B液 = 0. 1 %T F A—ァセ トニ ト リ ル グ ジェン トプログラム
時間 （分） B _ %
0 32
5 3 5
3 5 38
4 5 6 0
5 0 6 0
5 2 3 2
68 3 2
検 出 ： 紫外線吸収 （2 2 Ο ηιπ)
(VI) 結果 ：
全ての保存温度及び期間において、 いずれも 「変化な し」 と判定きれた。 尚、 4逼間保存後の測定データ一 (平均） を下記第 1 0表に示す。 0
Figure imgf000064_0001
実施例 2
① 実施例 1の①において 、 その配合成分を下記ィ〜ホ とする以外は同様にして、 それぞれ注射用製剤形態の本 発明組成物を調製した。
ィ. ポリぺプチ ド VI 1 0 u g viQ
ッウイ 一ン 80 0. 01 fflg/πιΰ デキス トラ ン 40 15 mg/πΐδ
システィ ン 0. 1 mg/ιπδ
H S A 1 mg uQ
(同一緩衝液使用）
口. ポ リぺプチ ド VI 1 0 S /ΐπΰ
ッウイ ーン 80 o . oi fflg/πι ショ糖 1 5 ing/iiiO
システィ ン 0. 1
(同一緩衝液使
ハ， ポ リぺプチ ド I 1 0 g /ιηδ
ッ ウイ ーン 80 0. 0 1 mg/πΐ
マ ンニ トール 1 5 nig/ πιδ システィ ン 0. 1 fflg/ιπΰ
Figure imgf000065_0001
(同一緩衝液使用）
二. ポリぺプチ ド VI 1 0 ^ g /ma
ッウィ ー ン 80 o . o i fflg/ιηδ
イ ノ シ トール 1 5 fflgZmS
システィ ン o. l mg Kid
H S A 1 mgZrnfi
(同一緩衝液使用）
ホ. ポリぺプチ ド VI 1 0 u s Zmfi
ッウイ ー ン 80 0. 0 1 ingZmG
マル トース 1 5 ing Ίπδ
システィ ン 0. 1 fflg/mS
(0. 0 1 Mクェン酸—クェン酸ナ ト リ ウム緩衝液 (p H 5. 0 ) 使用）
② 上記①で調製した各製剤の安定性を下記方法により 験した o
( I ) 方法 ：
上記製剤を、 ガラス羝 （気密、 遮光） 容器中、 4 °C又 は 2 5で下にそれぞれ保存し、 1、 2及び 4週間保存後 に、 萷記③安定注試験に示した判定基準に従い、 各製剤 の性状 （外観及び溶^) びに含量 (?6) を評 ®し安定 性を調べた。
( Π ) 結果 ：
全ての製剤 （上記ィ〜ホ） において、 全ての保存条件 下で 「変化なし」 と判定された。 尚、 4週間保存後の測 定データ一 （平均） を下記第 1 1表に示す。
Figure imgf000066_0001
以上の各試験結吴より、 本癸明組成 ¾は、 I L一 1 .5 活性物の安定化に極めて優れたものであることが判る。 実施例 3
① I L— 1 活控物 [ポリペプチ ド VI] 0. 1 g / ma又は o. o i gZnisを含む下記組成の本発明組成物 をガラスバイアル瓶、 シ リ コ ンコー トガラスバイアル瓶、 ポ リ プロ ピレン容器及びポ リ スチレン容器の各々に入れ て本発明組成物を調製した。
〈配合組成〉
I L - 1 ^活性物 0.1又は 0.01 β s
0. 0 1 Mクェン酸緩衝液 （p H 6. 0 )
シ ョ糖 5 nig
システィ ン 0. 1 nig
人血清アルブミ ン 0.01 lOfflgZinfi
② 上記①で調製した本発明組成物のそれぞれにっき、 以下の吸着防止試験を行なった。 即ち、 各組成物試料を、 2日間及び 4日間それぞれ 4でに放置後、 I L— 1活性 物の残存量を以下のェンザィムィムノア ッセィ によ り測 定した。
く ェンザィムィムノア ッセィ >
,9 6穴マイクロプレー ト にマウス抗 I L一 1 活性物 モノ ク ローナル抗体 1 0 0 2 ウニルを加え、 4でで —夜放置する。 洗'净後、 1 %ゥ シ血清アルブミ ン 4 0 0 β を加え、 室温で 3 0分間放置し、 ブロッキングを行 なわせる。 净後、 試料の段階希釈液 1 0 o sを加え、 4でで一夜放置後、 ' 浄する。 ゥサギ抗 I L一 1 ^抗痒 CClinica Chiiica Acta, vol .1 6 6 , p 2 3 7—
24 6 ( 1 9 87 ) 及び Europ丄 1画 nolog. , vol .1 7 , 1 5 2 7 - 1 5 3 0 ( 1 9 8 7 ) 参照〕 の 1 0 0 S を 加え、 3 7 Cで 2時間放置する。 洗浄した後、 パ一ォキ シダーゼ標識抗体ゥサギグロブリ ン （バイオラッ ド社製） 溶液 を加えて 3 7でで 2時間放置する。 法浄 後、 基質溶液 1 0 0 d を加えて室温で 2〜 1 5分間放 置する。 2 N硫酸で反応を停止させ、 4 9 2 ηπιの吸光度 を測定する。 別に、 I L 一 1 ^活性物の既知濃度の溶液 で検量線を作成し、 この検量線より試料の I L一 1 活 性物の濃度を求める。
得られた結果を第 1 2表に示す。
但し第 1 2表中、 容器の種類 χ の項における 1はガラ スバイァル瓶を、 2はシリ コンコー トガラスバィァル瓶 を、 3はポリプロピレン容器を、 また 4はポリスチレン 容器をそれぞれ示す。
この第 1 2表より、 本癸明組成物試料はいずれも容器 への I L — 1 5の吸着が認められないことが明らかであ ο 2
Figure imgf000069_0001
残 存 量 (ng/ΐπδ) の※
¾ g 初 期 値 2 曰 後 4 日 後
1 3.2± 1.0 1.9土 1.3
0 2 丄 ϋ，δ υ· 0 0 1.1± 1.8
3 0.1± 0.2 0 4 0 0.2士 0.3
1 9.9土 1.4 11.3土 0.5
0. 0 1 2 lU .8 U， / 11.2± 1.2 11.4土 0.2
3 9.1土 1.2 9.3± 1.9 4 9, 4土 2.7 10.3土 0.9
1 11.0± 1.1 11.7土 0.9
0. 1 2 丄 Ι ΐェ υ. ο 10.3土 0.5 9.3土 0.5
3 10.1士 1.0 9.9± 1.2 4 9.2± S.O 10.1士 1.7
1 10.3± 1.7 10.5± 0.7
1. 0 2 in - η 7 10.1士 0.9 11.4+ 0.1
3 10.2土 1.2 10.6土 1.5 4 10.7土 3.8 10.6土 2.2
1 9.8± 0.7 10.8土 1.0
1 0 2 11.1± 0.3 9.9± 1.8 11.1± 0.2
3 11.3± 2.6 9.8± 0.9
ί 10.2 ± Ι.δ 11.3= 1.6 実施例 4
① I L一 1 ^活性物 （ポリべプチ ド I) 1 gに人血 清アルブミ ン 0. l mg、 0. 0 1 Mクェン酸一クェン馥 ナ ト リ ウム緩衝液 （p H 6. 0) 及び下記第 1 3表に示 す各成分を加えて混合し、 混合物を泸過 （0. 22 m メ ンブラ ンフィルター使用） 後、 沪液を無菌的に 1 Π13ず つガラスバイアル瓶に分注し、 凍結乾燥して、 注射用製 剤形態の本発明組成物を調製した。 第 1 3 表
試料 No. 添 加 成 分 添加量
へ システィ ン 0. 1 Dig
ショ糖 5 g チ ショ糖 5 g
システィ ン 0. 1 mg マンニ トール
リ 5 mg
システィ ン 0. 1 g ショ糖 5 mg ヌ システィ ン 0. 1 mg
等張化剤 （食塩） 8. 6 mg シ 3糖 5 mg ル システィ ン 0. 1 mg
等張化剤 （グリ シン） 2 1 mg マンニ トール 5 ig
ヲ システィ ン 0. ling
等張化剤 （食塩） 8， 2 mg
ショ糖 5 mg
つ システィ ン 0， 1 mg
等張化剤 （クェン酸） 1. 5 mg
(クェン酸ナ ト リ ウム） 24， 7 mg
② 上記①で調製した各本発明試料の安定性を以下の試験 により調べた。 即ち、 凍結乾燥した各試料をガラスバイァ ル瓶 （気密、 遮光） 中、 2 5で、 5 0。C又は 7 0 °C下に各 々 1、 2又は 4週間保存した （但し 7 0て下では 1週間の み保存した） 。
I L - 1 ^活性物の残存量は、 下記ク口マ トグラフィ ー (H P L C ： トーソ一社製 H P L Cシステム） により測定 した。
カラム ： T S K C 10- N P R (4. 6 ø X
3 5 ト一ソ一社製）
溶媒： A液 = 0. 1 % T F A -水
B液 = Q . 1 % T F A—ァセ トニ ト リ ル グラジェン トプロクラム 時間 （分） B %
0 0
0 3 6
3 5 0
4 3 0 検出 ： 紫外線吸収 （2 1 Ο ηπι) 所定時間経過後の残存量
残存率（％) = X 1 0 0
初 期 量 得られた結果を第 1 4表に示す
1 4
Figure imgf000074_0001
上記第 14表に示す通り、 4週間、 25 Cの保存では全 ての本発明組成物試料において変化が見られず、 4週間、
50ての保存では本発明組成物試料 No.チ及びヮにおいて 変化は認められず、 1週間、 7 0ての保存では本発明組成 物試料 No.ヮのみ変化が認められなかった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . インタ一ロイキン一 1 活性物と共に、 人血清アル ブミ ン及び Z又は糖類と界面活性剤とを含有することを 特徵とするイ ンターロイキン一 1 の安定化組成物。
2 . イ ンターロイキン一 1 ;5活性物と共に、 人血清アル ブミ ン及び糖類を含有する請求項 1に記載の組成物。
3 . イ ンタ一ロイキン一 1 /3活性物と共に、 糖類と界面 活性剤とを含有する請求項 1に記載の組成物。
4 . イ ンターロイキン一 1 yS活性物と共に、 人血清アル ブミ ンを含有する請求項 1に記載の組成物。
5 . イ ンターロイキン一 1 活性物と共に、 人血清アル ブミ ン、 糖類及び界面活性剤を含有する請求項 1に記載 の組成物。
6 . 更に含硫還元剤を含有する請求項 1乃至 5のいずれ かに記載の組成物。
7 . 緩衝液で等張化した請求項 1乃至 6のいずれかに記 載の組成物。
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