WO1988001294A1

WO1988001294A1 - Process for separating single-strand tpa and double-strand tpa from each other

Info

Publication number: WO1988001294A1
Application number: PCT/JP1987/000598
Authority: WO
Inventors: Mitsuyoshi Morii; Masaharu Ohoka; Toshihiko Suzuki; Katsuyuki Suzuki; Nobuhiro Kawashima; Noriko Morii; Kunizo Mori
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals, Inc.
Priority date: 1986-08-11
Filing date: 1987-08-10
Publication date: 1988-02-25
Also published as: DK196288D0; US4978620A; AU594186B2; FI881653A0; JPS6463378A; JPH0556951B2; AU7756587A; NO881454L; FI881653A; EP0276328B1; DK196288A; EP0276328A4; NO881454D0; EP0276328A1; DE3784688D1

Description

明細書

一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを分離する方法

技術分野

本発明は、一本鎖組織プラスミノーゲンァクチべ一タ一（以下、 tPA と言う）、または一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を含有する水性媒体から一本鎖 tPA を選択的に回収する新規方法に関するものである。

より詳細には、一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を含有する水性媒体からエリスリナ卜リブシンインヒビターを担持した担体を用い、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA を分離する方法に関する。

すなわち、「エリスリナラテイシマ（Erythrina .iatissima)および他のェリスリナ種の種子中に生成し、かつ卜リブシン、プラスミンおよび tPA の阻害剤であるが、ゥロキナーゼには作用しない固定化クニツッ型阻害剤」（F. J. Joubert et al, Hoppe Seyler ' s Z. Physiol. Chem. , 362, 531 〜 538, 1981) であるエリスリナ卜リブシンインヒビタ一（以下、 ETI と略する）を使用して、一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を含有する水性媒体から一本鎖 tPA を高純度で分離精製し、それぞれの tPA 'を分離する方法に関する。

背景技術

ETI を tPA の精製に使用する例としては、次のようなことが知られている。すなわち、 tPA 生産細胞として、ヒ卜メラノーマ細胞を用い、血清を含まない培地で tPA を生産させ、これを収穫し、収穫液を ΕΤΓ カラムに通し、 tPA を吸着させ、 ETI に吸着した tPA を約

1一 3 Mの力リゥムチオシァネート水溶液を用いて溶離する精製方法である（特開昭 59-118717)。しかし、この精製方法は、 tPA を精製する方法であって、一本

lit-PA と二本鎖 tPA を分離精製する方法に関するものではない。

本発明者らは、すでに、牛胎児血清を含む培養培地中に生成する抗ヒ卜 tPA 抗体に反応する分子量 11万士

2万ダルトンのものを分離、除去する方法、ならびに遺伝子組換え技法を用い.て t P A 遺.伝子を組み込んだ-細胞を培養し、その宿主細胞由来の tPA とヒ卜細胞由来 ― tPA を分離する方法等について開発した（特開昭 60- 168601) 。

この tPA 活性を有する物質には一本鎖と二本鎖とがあり、これらはともに約 7万ダルトンの分子量を有するが、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とは、プラスミノ一ゲン活性化能およびフイブリンへの親和性が異なることが明らかにされてきた。すなわち、二本鎖 tPA はブラスミノ一ゲン活性化能が一本鎖 tPA にくらベて約 10倍ほど高く（特開昭 59-118717)、一方、一本鎖 tPA はフィブリンへの親和性が二本鎖 tPA にくらベて大きく、フイブリンに吸着すると非常に速く二本鎖 tPA に転化されることが明らかになった。従って、凝血部分で最大限の所望の活性を得るには一本鎖 tPA が好ましい (D. C. Rijken et al, J. Biol. Chem.257, 2920— 2925,

1982) 。

一本鎖 tPA を取得する公知の方法としては、細胞培養する際に蛋白質分解酵素阻害剤を添加し、一本鎖 tPA から二本鎖 tPA への移行を阻止する方法が知られてレ、る（D. C. Rijken et al, J, Biol. Chem.250, 7035~ 7041, 1981 ) , しかし、この方法では、細胞の種類、細胞培養の方法および培養周などさまざまに異なる条件下での二本鎖 tPA への移行を完に抑えることが非常に難しい。すなわ ½、 ~般に、細胞培養培地に含ま' れる蛋白分解酵素の種類やその量は異なり、これら蛋白分解酵素の作用を制御しょうとするのは非常に困難である。一方、蛋白分解酵素の阻止剤はその種類が多く、細胞の増殖に抑制的に影響を与えるものもあつて、細胞培養に使用できる蛋白質分解酵素阻害の種類は限られてしまう。また、蛋白質分解酵素阻害は、その種類によって高価なものもあり、大量培養するには実用的ではない。

また、一本鎖 tPA を精製して取得する手段としては、これを特異的に吸着する固定化モノクローナル抗体を使用する方法が知られている（Biopool社力タログ (Sweden)。しかしながら、この方法は固定化モノク口一ナル抗体に対する吸着能力、およびこの抗体カラムの使用時の安定性に問題がある。

発明の開示

このような状況のなかで、本発明者らは、一本鎖

tPA および二本鎖 tPA を含有する水性媒体から一本鎖

tPA を分離精製する方法を鋭意検討し、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA は ETI に対して親和性が異なり、溶離液の

pHを変化させると効果的に分離できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、一本鎖 tPA および二本鎖 tPA

を含有する水性媒体を、一旦、. ETI を担持している担体に接.触させてこれら' tPA を吸着させ、次い.で、不純蛋白質を洗浄除去した後'、特異的に一本鎖 tPA を溶離 · する pH領域の溶出液で一本鎖 tPA を溶離し、次いで、 —本鎖 tPA および二本鎖 tPA のいずれをも溶離する

領域の溶出液で一本鎖 tPA と二本鎖 tPA または二本鎖 t?k を溶離させる方法であって、一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を含有する水性媒体から ETI を使用して一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを分離する方法である。

この本髡明の方法は、 tPA を産生する細胞の種類にに関係なく適用可能である。すなわち、本発明の方法によれば、メラノ一マ細胞、ヒ卜正常細胞および遺伝子組み換え技法を用いてヒ卜 .tPA 遺伝子を組み込んだ細胞等を用いて産生した tPA のいずれからも一本鎖 tPA 、二本鎖 tPA を分離し精製することが可能である。その上、培養培地の組成にかかわらず、つまり血清添加培地からも血清無添加培地と同様に一本鎖 tPA と二本鎖 tPA の分離精製が可能となる。

このようなカラムを用いて一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを分離し、かつ各々を単離できるのは、全く新規に見出された方法である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の方法で使用する一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を含む水性媒体とは、 tPA を産生する細胞の種類に限定されることなく、すなわち、例えば、メラノ一マ細胞、ヒ卜正常細胞、および遺伝子組み換え技法を用いてヒ卜 tPA 遺伝子を組み込んだ細胞等を各種の細胞を用いて産生された、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを含有する水性媒体である。

また、これら tPA を含む液として、産生された tPA を含む上記細胞の培養液を部分精製した液も、また一本鎖 tPA および二本鎖 tPA の分離精製が必要とされる各種工程で調製される一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を含む溶液であってもよい。

なお、上記の tPA 遺伝子を組み込んだ細胞、すなわち、形質転換された宿主細胞内において、活性型ヒ卜 tPA をコードしている DNA 配列を発現することができる、複製可能な発現ベクターで形質転換された細胞としては、例えばチャイニーズ八ムス夕卵母細胞、マウス線維芽細胞、マウスミエロマ一細胞、ヒ卜胎児羊膜細 JS、 Hela細胞、酵母細胞等が挙げられる。

本発明の方法で使用する ETI を担持した担体とは、

ETI 、すなわち、エリスリナ · ラテイシマ（豆科植物

Erythrina lat issima 、広葉エリスリナ）および他のェ - スリナ種の種子の中に生成し、かつトリプシン、プラスミンおよび tPA の阻害剤であるが、ゥロキナーゼには作用しない形の固定化クニッッ型阻害剤を担体に固体化したものである。

ETI を固定化する担体の種類としては、不溶性ァガロース-、デキストラン、セル口ニス、ポリアクリルア - ミ 'ド-、リエチレングリコールグリシジルメタクリ - レー卜ポリマー、ガラスビーズまたはこれらを 2種以上組合せたもの等を使用できる。

ETI を担体に固定化する方法としてはつぎのような方法が適用される。例えば、 a)臭化シアン活性化ァガロースを用いた固定化、 b)水溶性カルボジィミドを用いたカップリング、 c)前もってアミノアルキル形に転ィヒしたァガロース ΝΗ₂ 基を結合させるグルタルァルデヒドカヅプリング、 d) Ν-ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ァガローズへのカップリング、 e)ェポキシ活性化ァガローズによるカップリング、 T)アルデヒド官能基を生成し、次に ETI のァミンと反応してシツフ塩基を形成し、次いでナ卜リウムボロ Λィドライドによって還元する過ヨウ素酸活性化ァガローズ、 g)ブ口モアセチルアルキルアミンァガローズを用いた力ップリング、 h)ジァゾニゥム誘導体を用いたカップリング、等の方法があげられ、また、担体については、 i )セルロースはヒドラジド誘導体に転化させて、 Par ikh等の方法（Methods in enzymlogy 34, 77 ~ 102, editors, W. B. Jakobi and M. Wi 1 check Academie Press, N. Y. ) に従って使用してもよく、 j)ポリアクリルアミドは、直接グルタルアルデヒド法または P-アミノベンズアミド誘導体もしくはヒドラジド誘導体のジ，ァゾ化によって結合させて使用してもよく、さらに、 k)ガラスビーズは、 H. H.Weetall & A.M. Filbert 等の方法 (Metheds in enzymlogy 34, 59·~ 72 , editors, W. Β . Jakobi and M. Wi lcheck Academie Press, N. Y. ) に従って使用してもよい。

本発明の方法では、以上のような ETI を担持した担体に、前記の一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを含有する水性媒体を接触させる。

この水性媒体と担体とを接触させる操作は、とくに限定されず、通常の方法、例えば、バッチ法やカラム：法で接触させる操作が適用できる。

カラム法の場合、液の流れは上昇流でも下'降流でもよい。カラムとしては、通常は円筒形のものが多用されるが、カラムの径と高さの比はとくに限定されることなく決定できる。

操作温度は、 tPA が安定である温度範囲であり、好ましくは水性媒体が凍結しない温度から室温の範囲である。

以.上の水性媒体と担体との接触操作によって、水性媒; #τ中に含有される一本鎖 tPA と二本鎖 tPA は ETI

を担持した担体に吸着される。

この吸着操作の後、必要に応じて、 tPA を溶離しない条件、例えば、中性ないし弱塩基性の pH範囲で高濃度の塩溶液を用い、カラムを洗浄し、担体上に非特異的に作用した各種 φ不純蛋白質を除去する。、 ' ' ' ついで、本発明の方法では、一本鎖 tPA と二本鎖 - tPA を吸着した ETI 担体を、先ず、特異的に一本鎖

tPA を溶離する ρίί領域の溶離液で処理し、一本鎖 tPA

を ETI 担体から溶離して一本鎖 tPA を取得し、次いで、残余の一本鎖 tPA を含むこともある二本鎖 tPA を吸着した ETI 担体を、一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を溶離する pH領域の溶離液で処理して、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA を含有する tPA または二本鎖 tPA を溶離させる。 ^

特異的に一本鎖 tPA を溶離する pH領域、ならびに次いで実施する一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を溶離する

P H領域は以下に示す溶離液に使用する各種の要因によつて変動する。しかし、各種要因の組合せにおいて、適切な条件を選択して適用することによって一本鎖 tPA と二本鎖 t PA をそれぞれ溶離し、目的の一本鎖 tPA を取得することができる。

溶離液に使用される、上記 PH領域に影響を与える要因として、つぎのようなものが挙げられる。

(1) 緩衝液の種類：グリシン一塩酸緩衝液、クェン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、コ八ク酸锾衝液、フタル酸緩衝液、ベロナール緩衝液等、（2) 塩の種類：チ'オシアン酸塩、過塩素酸塩等のカオ卜口ピックイオンを含む塩や、食塩、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシゥム、硫安等、' （3) 緩衝液および塩の濃度、（4) 添加剤： A)アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸およびオルチニン、 ε — アミノカプロン酸等の塩基性ァミノ酸類似物質、 Β)ベンズアミジン等の卜リブシン様酵素に対する拮抗阻害剤、 C)アミン類、アルコール類等の求核試薬、 D)尿素、塩酸グァニジン等の蛋白変性剤、 E) Tween80, Triton X-100 等の界面活性剤、等である。

これらは単独でも、 2種以上の混合物としても使用できる。 '

—本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを吸着した ETI 担体から一本鎖 tPA を特異的に溶離する pH領域は、とくに限定されるものではない。溶離液に使用する緩衝液、塩の種類やそれらの濃度、必要に応じて添加する添加剤の種類や濃度により溶離効果が変動し、その上、 ETI を担持させる担体の種類、担持方法によっても溶離効果は変動するので、最適の PH領域も変動する。通常、一

本鎖 tPA を特異的に溶離する pH領域の下限は、約 4から約 5付近にあり、一本鎖 tPA を特異的に溶離するには、これ以上の領域の pHの溶離液が使用すればよい。

また、一本鎖 tPA を溶離後、さらに ETI 担体から一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を溶離する pH領域も、同様に限定されない。一般には、一本鎖. tPA を特異的に溶雛させた'後、未だ ΕΤΊ 担体に吸'着したままの一本鎖 tPA ' ' と二本鎖 tPA を溶離させるので、一本鎖 tPA も溶離 ― し、更に二本鎖 tPA を溶離させるに充分な pH領域であればよく、通常、約 4から約 5付近から、それ以下の pH領域であれば一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを溶離させることができる。

上記した各種添加剤のうち、アルギニン、ベンズァミジン、尿素または塩酸グァニジン等を添加すると、 —本鎖 tPA と二本鎖 tPA との分離効果は一段と向上する。これらの添加剤を添加した場"^、さらに添加剤の添加によって一本鎖 tPA を特異的に溶離する pH領域は変動し、最適の PH領域は限定的ではないが、通常、約

Η 4.5から pfi 6の範囲であって、 pH 4.5より低い pHの液によって一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを溶離させることができる。

一本鎖 tPA を溶離させるためのアルギニン、ベンズアミジン、尿素または塩酸グァニジン等の使用濃度は 1 mMからそれらの溶解限界濃度までが使用できる。例えば、 pH 4. 5から pH 6.0の範囲において、アルギニンまた:はベンズアミジンの濃度は PH 4.5に近づく程低い濃度が使用でき、 PH 6に近づく程高い濃度が必要となる。

ここで使用するアルギニン、ベンズアミジン、尿素または塩酸グァニジンが、セリンプロテア一ゼの活性中心に拮抗的に結合し.複合体を解離させることは知られているが、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA の分離に効果を示すことは全く知られていない新規な効果である。

使用する溶離液は、上記の緩衝液、塩等から目的に合わせて選択した種類および濃度とし、必要に応じて添加剤を加え、選択された PH領域のものを調製する。

本発明の方法において、 ETI 担体に吸着した一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とをそれぞれ溶離させる操作はバヅチ法またはカラム法等が適用できる。

バッチ法の場合、一本鎖 tPA を特異的に溶離するように設定した pH領域に調製された溶離液と、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを吸着した ETI 担体とを攪拌混合し静置する。この操作により一本鎖 tPA は ETI 担体から溶離され、上澄液中に移行する。この上澄液を回収して一本鎖 tPA を高純度で得ることができる。一方、もし溶離されないで残つた一本鎖 tPA が存在するならこの一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを吸着した ETI 担体は、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを溶離するような pH領域に調整して調製された溶離液と攪拌混合し静置する。この操作により一本鎖 tPA を含むこともある二本鎖 tPA が ETI 担体から溶離され、上澄液中に移行する。この上澄液を回収して一本鎖 tPA を含むこともある二本鎖 tPA を得ることができる。一本鎖 tPA を含む主として二本鎖 tPA 'らなる' tPA は、必要に応じて適当な方法で一本鎖 t と二本鎖 tPA とを、さらに分離' すればよい。

カラム法の場合、同じく一本鎖 tPA を特異的に溶離するように設定した pH領域に調製された溶離液を、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを吸着した ETI 担体を充塡したカラムに流し、一本鎖 tPA を ETI 担体から溶離させ、溶離液中に溶解させて一本鎖 tPA を高純度で得ることができる。つづいて、一本鎖 tPA と二本鎖 tPA と溶離する pH領域の溶離液を流す。これにより ETI 担体に吸着されたまま残っていることもある一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを溶離させ、溶離液中に溶解させて一本鎖 tPA を含むこともある二本鎖 tPA を得ることができる。一本鎖 tPA を含む主として二本鎖 tPA からなるセ PA は、必要に応じて適当な方法で一本鎖 tPA と二本鎖 tPA とを、さらに分離すればよい。

これらの方法において、カラムへの溶離液の流れは、上昇流でも下降流のいずれでもよく、また、流速に左右されずに t PA を溶離できる。しかし、流速が速くなると tPA 溶出がブロードになる傾向となるので好ましくない。

tPA の溶離は、 tPA が安定である温度範囲、好ましくは溶離液が凍結しない温度から室温の範囲で実施する。

発明を実施するた ·めの最良の形態

以下、本発明の^法を実施例によって具体的に説明する。

実施例 1

親和試薬（ ETI 試剤）の調製：

本発明で用いる ETI 試剤は、以下のようにしてセファローズカラムに調製して用いた。エリスリナラティシマ種子をジョ一ベール（Joubert) らの方法（F. J. Joubert et a 1 , Hoppe-Sey 1 er* s Z. Physiol. Chem.， 362, 531〜 538, 1981 )にしたがって採集し加工した。種子を擦り潰し、脱脂し、 0.5 M/ ^食塩水溶液により 10°Cで一夜抽出した。

抽出液を遠心分離し、残渣を除去し、得られた上澄液を硫酸アンモニゥム沈殿し沈殿物を回収し、続いてセファデヅクス G-50， DEAE-セルロースおよび DEAE- セファロースのクロマトグラフィーにかけた。

こうして得られた精製物は、 0.1%ドデシル硫酸ナ卜リウム（SDS) を含有する 15% ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付した場合、見掛けの分子量 22, 000ダル卜ンの単一バンドとして移動した。

上記の精製物を臭化シアン活性化ァガロースに通常方法で結合させた。これを使用し、次のようにして一

本鎖 tP および二本鎖 tPA を精製した。

ボウズ（Bowes) メラノ一マ細胞（ATCC CRL 1424 G

3⁶ )培養液熱不活性化 56'°C, 30 分閘）胎児牛 ' 血清およびァプロチニン（2-0ΚΙϋ/πΐ·β ) を含む] 2 を - Tween 80 (0.02%) および食塩（1-M / ）で安定化後、

ETI-セファローズ（25mgETI/5 m£樹脂）カラムに適用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フイブリン溶解活性を測定した。カラムに適用された活性の約 10%

が認められた。

この画分は SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のザィモグラフィー調べると、プラスミノ一ゲンァクチベータ一として 11万 ± 2万ダルトンおよび約 7万ダルトンの二種類のバンドが認められた。

この後、 ETI-セルローズカラムを、 20倍カラム容量の 0.2%Tween 80を含む 2M食塩水でカラムを洗った。この方法により、カラムに適用された活性の約 5%が検出され、ザィモグラフ上で 11万 ± 2万および約 7万ダル卜ンのバンドがプラスミノーゲンァクチべ一ターとして認められた。

吸着した蛋白質は、 0.2Mベンズアミジンと 0.15M 食塩を含む 0.2f ベロナール緩衝液を用い、 pH6.5 から pH3.0 までのリニアグラジェン卜法で溶出した。

この方法により pH 6.0から pH 4.5の範囲で一つのピークが得られ、また pH 4.5から 11 3.5の範囲でもう一つのピークが得られた。この二つの画分をあわせると . カラムに適用した活性の.80〜85¾ を示した。

メルカプトエタノールで還元した試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べた結果、 pH 6.0から pH 4.5の範囲で溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく約 7 万ダルトンを示したが、 pH 4.5から卩[^ 3.5の範囲で溶出されるものは還元すると大部分の約 7万ダルトンのバンドは消失し、 3万から 4万ダルトン付近にバンドが出現した。

この結果から pH6 から pH 4.5の範囲で溶出される tPA は一本鎖 tPA であり、 pH 4.5から卩^^ 3.5の範囲で溶出される tPA はほとんど二本鎖 tPA と認められた。なお、カラム操作は室温で行った。実施例 2

ボウズ（Bowes) メラノ一マ細胞（ATCC CRL 1424 G - 361)を 10% 熱不活性化（56 °C, 30 分間）胎児牛血清を - 補充した RPMI-1640 組織培養媒体中で培養後、培養物を一度洗い血清を含まない媒体中で 24時間培養後、媒体を集め、収穫液とした。収穫液 50 に最終濃度 1Mになるように食塩を加えた。

この液を 1.0M食塩を含む 0.05M リン酸緩衝液 PH7.5 でカラムを洗った。カラムの通過液及び洗浄液を合わ

10 せ、プラスミノーゲン依存フイブリン溶解活性を測定

したところ、カラムにかけた全活性の約 10% が検出さ

- ' れた。 SDS ボリァクリルァミドゲル電気泳動後のザィ

モグラフィニ上で分子量 11方 ± 2万ダルトンのバンド - が確認された。カラムに吸着した蛋白は 0.5 チオシァ

15 ン酸アンモニゥムを含む 0.05M NaH₂P0₄-NaOH溶液（pH

5.0)で溶出した。この方法によりカラムにかけた活性の約 50% が溶出液中に回収され、 SDS ポリアクリルァミドゲル電気泳動後の銀染色で分子量 7万ダルトンの単一バンドが確認され、メルカプトエタノールによる

20 還元でも低分子量のバンドは検出されなかった。

このことにより、この画分に二本鎖 tPA が含まれていないことが確認された。一方、残りの吸着蛋白は

0.5M食塩を含む 0.1Mグリシン一塩酸緩衝液 pH 3.5で溶離した。この方法によりカラムにかけた活性の約 40% が溶出液中に確認され、 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で分子量 7万ダル卜ンおよび約 3 万ダルトンのバンドが確認され、メルカプ卜ェタノ一ルによる還元後の試料で約 7万ダルトンのバンドはほとんど消失し、新たに分子量約 3〜 4万ダルトンの範囲でバンドが確認された。このことより、この画分はほとんど二本鎖 t P A であることが確認された。なお、カラム操作は室温で行った。

実施例 3

人胎児包皮細胞（Flaw 7000: 大日本製薬社品）培養液 [ 1Q% 、熱不活性化（56 °C , 30 分間）' 胎児牛血清およびァプロチニン（20KIU/m ）を含む ] 2 £ を Tween 80 ( 0. 02%) および 1 M食塩で安定化後、 ETI を臭化シアン活性化ァガローズに固定化した ET I セファローズカラム（25mg ETI/5m 樹脂）に適用した。

流出液を集め、プラスミノ一ゲン依存フイブン溶解活性を測定したところカラムに適用された活性の約 45% が認められた。

この画分を SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のザィモグラフィ一で調べたところ、プラスミノ一ゲンァクチべ一ターとして 10万ダルトン付近に 2〜 3 本、 5〜 7万ダルトン付近に 2〜 3本、 3万 5千ダルトン付近に 1 本のバンドが認められた。

tPA を吸着した ETトセファローズカラムの洗浄に 2.0M食塩を含む 20倍力ラム容量の 0.1M Na₂HP0₄-NaOH 緩衝液（pH 9.5)でカラムを洗った。

この方法によりカラムに適用された活性の約 5%が検出され、ザィモグラフで上記と同じンドが認められた。

溶離緩衝液は、 0.3Mリジンと 0.15M 食塩を含む 0. 1M リン酸緩衝液（pH5.5) と 0.15M 食塩を含む 0.2Mクェン酸緩衝液（PH3. 0) を使用した。

分離された pHの異なる 2種の画分をあわせるとカラムに適用された活性の 40〜 50% を示した。

メルカプトエタノールで還元した試料をポリアクリルアミド'ゲル電気永動後の..銀染色で調べると、 Η5.5 で溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく約 - 7万ダルトンを示したが、 ρΗ3.0 で溶出されるものは還元すると約 7万ダルトンのバンドはほとんど消失し

3万から 4万付近にバンドが出現した。

この結果から ΡΗ5.5 で溶出される tPA は一本鎖 tPA であり、 pH3. G で溶出される tP A は二本鎖の tPA であると認めた。なお、カラム操作は室温で行った。

実施例 4

ヒ卜 tPA 遺伝子（特閧昭 60-264918)を組み込んだマウス繊維芽細胞（Mouse C1271 ATCC CRL 1616) の培養液 [ 2%、熱不活性化（56 °C , 30 分間）胎児牛血清およびァプロチニン（20ΚΙΙ]/πι£ ) を含む] 2 ·gを l M食塩で安定化後、 ETI を臭化シアン活性化ァガロースに固定化した ETI-セファローズ（25mgETI/5 m 樹脂）に適用した。

流出液を集め、プラスミノーゲン依存フイブリン溶解活性を測定したところカラムに適用された活性の約 10% が認められた。

この画分を SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のザィモグラフィ一で調べると、プラスミノーゲンァクチべ一ターとして 11万土 2万ダル卜ンおよび約 7万ダルトンの二種類が認められた。

全溶液を ETI-セファローズカラムに通過させた後、20倍カラム容'皇の 2· 0M食塩水でカラムを洗った。この方法により、カラムに適用された活性の約 5¾が検出され、ザィモグラフ上で 11万 ± 2万および約 7万ダルトンのバンドがプラスミノーゲンァクチべ一ターとして認められた。

ETI-セファローズ力ラムに吸着されている蛋白質は、 0.15M 食塩を含む 0.1Mクェン酸緩衝液（pH4.7) と 0.15M 食塩を含む 0.1Mクェン酸緩衝液（pH3.0) を用いて溶出された。この 2 つの画分をあわせるとカラムに適用された活性の約 80% を示した。

メルカプ卜エタノールで還元した試料をポリァクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べると、 pH 4.7 で溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく、約 7万ダルトンのものは約 7万ダルトンを示したが、 pH 3.0で溶出されるものは還元すると大部分の約 7万ダルトンのバンドは消失し 3万から 4万ダル卜ン付近にバンドが認められるようになった。

この結果から pH4.7 で溶出される tPA は一本鎖 tPA であり、 pH 3.0で溶出される tPA は大部分二本鎖 tPA であると認められた。なお、カラム操作上、吸着した tPA は吸着させたときには、逆方向の流れで溶離し、また温度は 4 °Cで行った。

実施例 5

ヒ卜 tPA 遺伝子（特開昭 60-264918)を組み込んだマウス繊維芽細胞（Mouse C1271 ATCC C L 1616) 'の培養液 '[ 2¾、熱不活性化（56 °C, 30 分間）胎児牛血清およ - びァプロチニン（20Κΐυ/ηι£ ) を含む] 10 を 1 M食塩で安定化後、 ΕΤΙ を ΑΗ- ァガローズ（Pharmacia) に固定化した ETI-セファローズカラム（25mgETI/5 樹脂）を加え、 4 °Cで 30分間攪拌後、ガラスフィルタ一で濾過し、樹脂を集め、その後、 20倍カラム容量の

20M 食塩水でこの樹脂を洗浄する。 tPA 吸着した樹脂に、初めに尿素を含む 0.1Mリン酸ソーダ緩衝液

(pH 6.0)、その後、 0.15M 食塩を含む 0.1Mクェン酸緩衝液（PH3.0) を用いて tPA を溶離した。この 2つの分画をあわせるとカラムに適用された活性の約 80% を示した。メルカプトエタノールで還元した試料をポリァクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べると、 ΡΗ6· 0 で溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく、約 7万ダルトンを示したが、 ΡΗ3.0 で溶出されるものは還元すると約 7万ダルトンのバンドは大半は消失し 3 万から 4 万付近にノ、 'ンドが認められるようになつた。

この結果から ΡΗ6.0 で溶出される tPA は一本鎖 tPA とであり、 pH3.0 で溶出される tPA はほとんど二本鎖の tPA であると認めた。

実施例 6 ' , ヒ卜 t P A 遺伝子を組み込んだチヤ 'ィニーズ八ムス夕一卵母細胞（CH0)' 細胞（ATCC CRL61 cel ls)培養液 [10°ん熱不活性化（56 °C , 30 分間）胎児牛血清および 40KIU/ m£ ァプロチニンを含む ] 2 £ に終濃度で 1M の食塩を加え、この液を 1.0M食塩を含む 0.05M リン酸緩衝液（pH 7. 5) で平衡化した ETI-セファローズ (25mgETI/5 m 樹脂）に通した後、 2.0M食塩および 1 OmMアルギニンを含む 0.05M Na ₂ H P 0₄ -NaO H溶液（p H 9.5)で洗浄した。

この方法でカラムに通した活性の約 10% が流出し、ザィモグラフ上で分子量 11万 ± 2万および約 7万ダイトンのバンドが確認された。

吸着されている蛋白は、 0.01M アルギニンおよび 0. 1M食塩を含む 0.05M iiaH₂P0₄-NaOH溶液（pH 4.4)で溶離した。

溶出液の活性は力ラムにかけた活性の約 65¾ を示した。

残りの吸着蛋白は 0. 1M食塩を含む 0. 1Mクェン酸緩衝

(pH3. 0) で溶解したところ、カラムにかけた活性の糸 ¾"25% を示した。

メルカプトエタノールで還元した試料をポリアクリルァミドゲル電気泳動後の銀染色で調べると、 PH 4.4 で溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく約

7万ダルトンを示したが、 PH 3. 0で溶出されるものは還.元すると約 7万ダルトン.のバンドの大半は消失し、

3万から 4万ダルトン付近にバンドが出現した。 - この結果から pH4.4 で溶出される tPA は一本鎖 tPA であり、 pH 3. 0で溶出された tP^ はほとんど二本鎖 tPA であると認めた。

実施例 7

ヒ卜 t P A 遺伝子を組み込んだチャイニーズノ\ムスター卵母細胞（CH0) 細胞（ATCC CCし 61)培養液 [ 10% 、熱不活性化（56 °C , 30 分間）胎児牛血清および 40

KIU/ ァプロチニンを含む： I 50 ·βに終濃度で 1Mの食 - 塩を加え、この液を 1. 0Μ食塩を含む 0. 05Μ リン酸緩衝液（ΡΗ7. 5) で平衡化した ΕΤΙ-セファローズカラム

(25 mg ETI/5 m_G樹脂）を加え、 4 °Cで 30分間攪拌後 5

- 23 - ガラスフィルターで濾過し、樹脂を集め、その後、

2.0Mを含む 0.05M Na₂HP0₄ 溶液（pH9..5) で洗浄した。

tPA 吸着した樹脂をカラムに詰めた後、吸着されている蛋白は、 2%エタノールおよび 0.1M食塩を含む 0.05M 乳酸緩衝液（PH4.8) で溶離した。

溶出液の活性はカラムにかけた活性の約 60¾ を示した。

残りの吸着蛋白は 0. 1M食塩を含む 0. 1M乳酸緩衝液

(pH3.0) で溶離したところ、カラムにかけた活性の約

25% を示した。

メルカプトエタノールで還元した試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べると、 pH 4.8 で溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく約 - 7万ダルトンを示したが、 pH 3.0で溶出されたものは還元すると約 7万ダルトンのバンドの大部分消失し、

3万から 4万ダルトン付近にバンドが出現した。

この結果から PH4.5 で溶出される tPA は一本鎖 tPA であり、 pH 3.0で溶出された tPA は大部分二本鎖 tPA であると認めた。

実施例 8

ヒ卜 tPA 発現プロモータとしてヒ卜サイ卜メガロウィルス（HCMV)を用い、ヒ卜遺伝子を組み込んだ胎旧

ノし羊膜細胞（FL. ATCC CCL-62)培養液 [ 2%、熱不活性化

(56 °C , 30 分間）胎児牛血清および 20KIU/ m ·β ァプロチニンを含む ] 2 に終濃度で 1Mの食塩を加えた後、 ETI を臭化シァン活性化ァガロースに固定化した ETI セファロ一ズ（25mgETI/5 mJZ樹脂 ) に適用した。

流出液を集め、プラスミノ一ゲン依存フイブリン溶解活性を測定したところカラムに適用された活性の約 10¾ が認められた。

この画分は SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のザィモグラフィ一で調べると、プラスミノーゲンァクチベータ一として 11万 ± 2万ダルトンおよび-約 Ί万ダルトンの二種類が認められた。

全溶液を ETI-セファローズカラムに通過させた後、 20倍力ラム容量の 2.0M食塩水でカラムを洗つた。この方法により、カラムに適用された活性の約 ·5%が検出さ' れ、ザィモグラフ上で 11万 ± 2万および約 7万ダルトンのバンドがプラスミノ一ゲンァクチべ一夕一とレて認められた。

ΕΤΙ-セファローズ力ラムに吸着されている蛋白質は、 0.3Μアルギンと 0.15食塩を含む 0.1Mクェン酸緩衝液（ρΗ4.7) と、 0. 15M 食塩を含む 0. 1 Μ酢酸緩衝液 (ρΗ3.0) を用いて溶出された。この 2つの画分をあわせるとカラムに適用された活性の約 80% を示した。

メルカプトエタノールで還元した試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べると、 5.5 で溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく、約 7万ダルトンを示したが、 PH 3. 0で溶出されるものは還元すると大部分の約 7万ダルトンのバンドは大部分消失し 3万から 4万付近にバンドが認められるようになった。

この結果から pH5.5 で溶出される tPA は一本鎖 tPA であり、 pH 3. Qで溶出される tPA は大部分二本鎖 tPA であると認めた。

実施例 9

ヒ卜遺伝子を組み込んで形質転換された宿主酵母 (Saccharorayces cerevis iae)を、公知の方？； S (Pr i nc i - ies and Practice o f Recombinant D A Reserch with Yeast" in The Molecular Biology o f Yeast Saccharomyces： Metabol ism and Gene Expression, p 603- 636, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982) )に記載の方法で増殖させた。

細胞はガラスビーズを後いて破砕し、 tPA を 1M食塩および 0. 02% Tween 80を含む 0. 05M リン酸緩衝液 (pH 7.5)で抽出し、抽出液を濾過して濾液を得た。

この液 1 を ETI-セファローズカラム（25mETI/5m£ セファローズ）に通した。その後、 20倍カラム容量の 0. 02%Tween8Qを含む 2.0M食塩水で洗浄する。吸着した tPA は、初めに 0. 02%Tween80および 0. 5M硫安を含む 0. 1Mクェン酸緩衝液（pH3.0) を用いて溶出した。メルカプ卜エタノールで還元した試料をポリァクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べた結果、 pH5.0 から溶出されるものは還元しても分子量に変化はなく約 7万ダルトンを示したが、 pH 3.0で溶出されるものは還元すると大部分の約 7万ダルトンのバンドは大部分消失し 3万から 4万付近にバンドが出現した。この結果から PH5.0 で溶出される tPA は一本鎖 tPA であり、 pH 3.0で溶出される tPA はほとんど二本鎖 tPA であると認められた。

Claims

請求の範囲

1. 一本鎖 tPA と二本鎖 tPA を含む水性媒体を、一旦、 ETI を担持した担体と接触させてこれら tPA を吸着させ、その後、特異的に一本鎖 tPA を溶離する pH領域で一本鎖 tPA を溶離し、次いで、一本鎖 tPA および二本鎖 tPA を溶離する pH領域で一本鎖 tPA と二本.鎖: tPA または二本鎖 tPA を溶離することを特徴とする一本鎖 tPA と二本鎖 tPA を分離する方法。