KR910006600B1 - 조직 플라스미노겐 액티베이터의 정제방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

조직 플라스미노겐 액티베이터의 정제방법
본 발명은 인간 조직 플라스미노겐 액티베이터(이후 tPA로 약칭한다)의 정제방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 tPA 및 기타 불필요한 단백질을 함유한 조 tPA제제를 양이온 교환수지와 접촉시킴으로써 약 70,000달톤의 분자량을 갖는 tPA를 단리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
tPA는 약 70,000달톤의 분자량을 가지며 고등동물의 조직에서 생산되는 단백질이며, 피부린에 특이적인 단백질분해 효소인 플라스민의 전구 체인 플라스미노겐을 활성화시킨다.
약학용 tPA를 제조하기 위해, 불필요한 복합 항원성 단백질을 충분히 제거하는 것이 필요하다. tPA가 이런 불필요한 단백질로 오염된다면 이들 단백질은 인간체내에서 항원성을 나태내어 투여시 아나필락틱 쇼크와 같은 부작용을 일으키게 된다.
제조과정에서 오염물질로서 배합되는 불필요한 복합향원성 단백질의 종류는 세포의 배양 방법 및 사용된 정제 공장에 따라 변화한다. tPA를 생산할 수 있는 세포 배양방법을 포함하는 생산공장에서, 생성된 배양액중에 배지 용액의 성분으로서 및 세포의 배설물로서 대량의 불필요한 복합 항원성 단백질이 포함된다.
대표적인 배양방법은 태내 송아지 혈청을 함유한 배지 및 무혈청 배지를 사용하는 것이다.
태내 송아지 혈청을 배양에 사용하는 경우, 태내 송아지 혈청은 인간에게 항원성을 나태내는 불필요한 복합향원성 단백질군을 포함한다. 태내 송아지 혈청으로부터 유래된 단백질은 대부분이 4∼6의pl(등전점)을 갖는다.
더욱이, 무혈청 배지를 사용하는 경우, 사용된 세포에 따라 배양에 필요한 물질을 배지에 가해야 한다.
배양에 필요한 물질중에서, 단백질로서는 인슐린과 같은 호르몬 및 트랜스퍼린이 흔히 사용된다. 인슐린 및 트랜스퍼린의 p1값은 약5∼6의 범위이다.
tPA는 2개의 분자형, 즉 단일사슬 tPA 및 이중사슬 tPA를 갖는 것으로 공지되어 있다. 특히, 단일사슬 tPA의 제조장법에 있어서, tPA의 제조를 위한 세포배양 동안 아프로타닌과 같은 프로테아제 억제제를 배지에 가한다는 공지이다.
사용된 프로테아제 억제제도 또한 불필요한 복합 항원성 단백질이다.
아프로티닌의 pH는 10∼10.5의 범위이다.
더욱이, 하술하는 방법에 의해 상기의 배양액을 부분정제함으로써 수득된 tPA 함유액도 또한 불필요한 담백질을 포함한다.
tPA의 정제를 위한 각종 친화 크로마토그래피가 사용되고 있다.
공지의 예로는 콘카나발린 A-세파로즈(Rijken, D.C and Collen, D. (1981) J. Biol. Chem. 259, 7035∼7041), 에리트리나 트립신 인히비퍼(ETI)-세파로즈(Heussen, C., et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 11635∼11638), 항-tPA 항체 - 세파로즈(Ranby, M., et al. (1982)FEBS Lett 146, 289∼292) 및 피부린-세파로즈(미합중국 특허 제4,505,893)가 있다. 이들 고정화 단백질의 유출이 소량인 경우에도 공정에서 관찰된다. 또한, 이러한 단백질들은 불필요한 복합 항원성 단백질이다. 이들 단백질의 pI범위는 콘카나발린의 경우 4.4∼5.5, ETI의 경우 4.5∼5.5, 면역 글로불린 G의 경우 5.8∼7.3 및 피부리노겐의 경우 5.5∼5.8이다.
tPA의 제조방법에 있어, 본 발명자들은 이들 역가있는 복합 항원성 단백질을 제거하기 위한 방법에 대해 광범위하게 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양이온 교환지수를 사용하는 방법이 특히 유리하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
tPA의 정제를 위해 양이온 교환기를 사용하는 것이 일본국 특허공개 제174727/1985호에 공지되어 있으나, 이 경우는 양이온 교환기를 부분정제를 위한 tPA분획의 회수에 사용한 것이며 본 발명에서 양이온 교환기를 사용한 것과는 상이하다.
양이온 교환기를 사용하는 tPA의 정제 방법에 대한 광범위한 연구과정에서, 본 발명자들은 tPA와 다른 불필요한 단백질이 흡착된 양이온 교환기로부터 불필요한 단백질의 선택적 용출을 위한 용출과정을 2단계로 분리하고, 1단계에서는 tPA와 같거나 더 낮은 pI 값을 갖는 불필요한 단백질을 용출시키고, 2단계에서는 tPA와 같거나 더 높은 pI값을 갖는 불필요한 단백질을 용출시키므로써 다른 불필요한 단백질로부터의 tPA의 신뢰할 수 있고 효과적인 분리가 수행할 수 있다는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 용출을 위한 적당한 범위의 pH가 2단계에 사용된다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 예를 들면 tPA-생산 세포를 배양하므로써 수득된 wh tPA제제로부터, 약제로 사용할 때 부작용을 일으킬 수 있는 것을 포함한 불필요한 단백질을 안전하고 효과적으로 제거할 수 있는 양이온 교환지수를 사용하여 tPA를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 불필요한 물질, 특히 피로겐과 같은 부작용을 일으킬 수 있는 단백질 및 기타 불필요한 단백질로부터 tPA를 안전하고 효과적으로 분리할 수 있다.
더욱이, 불필요한 단백질로부터 분리된 tPA는 양이온 교환지수로부터 농축된 형태로 용출되기 때문에 농축 또는 탈염단계를 거치지 않고 그대로 약제를 사용할 수 있다.
더욱이, tPA는 고수율로 수득된다.
본 발명에 따른 tPA의 정제방법은 (a)tPA 및 불필요한 단백질을 함유한 조tPA제제를 양이온 교환기와 접촉시켜 상기tPA 및 불필요한 단백질을 상기 양이온 교환기에 흡착시키고, (b)상기 양이온 교환기를 pH5.2∼6.5의 용리액으로 처리하여 상기 tPA와 같거나 그 이하의 pI값을 갖는 불필요한 단백질을 용출시키고, (c) 상기 (b) 단계를 거친 양이온 교환기를 pH2.8∼3.5의 용리액으로 처리하여 상기 tPA와 같거나 그 이상의 pI 값을 갖는 불필요한 단백질을 용출시키고, (d) 상기 (b) 및 (c) 단계를 거친 양이온 교환기로부터 tPA를 용출시키는 단계를 포함한다.
단계(a)에서 양이온 교환기가 접촉시키는 조 tPA 제제의 예로는 tPA-생산세포(제조합세포 포함)를 배양함으로써 수득된 배양 상층액으로부터 상술한 각종 정제방법에 의해 수득된 부분정제된 분획, 배양 세포로부터의 추출물 및 고등동물의 조직으로부터의 추출물이 있다. 이들 모든 조 제제는 상술한 바와 같은 tPA 이외의 각종 불필요한 단백질을 함유하거나 함유할 수 있다.
본 발명에 따라 정제되는 tPA는 분자량이 약 70,000달톤이고, pI값이 6∼8이다.
단계(a)에 사용되는 양이온 교환기(cation - exchanger)의 예로는 양이온 교환기(cation - exchangegroup)로서 카르복시 메틸기 및 수불용성 담체로서 폴리사카라이드 또는 아크릴아미드를 함유하는 것이 있다.
단계(a)에서 양이온 교환기에 조 제제를 넣는 것은 조 제제에 포함된 tPA가 양이온 교환기에 흡착되는 조건하에 수행될 수 있다.
예를 들면 양이온 교환기에의 흡착은 약산성, 바람직하게는 pH4.5∼5.0인 조tPA 용액을 양이온 교환기에 통과시킴으로써 수행될 수 있다.
단계(b)는 양이온 교환기를 tPA와 같거나 그 이하의 pI 값을 갖는 불필요한 단백질이 제거되는 범위의 pH의 용리액으로 세척함으로써 수행될 수 있다.
단계(b)에서, 용출을 위한 온도 및 염 농도를 포함한 다른 조건들은 양이온 교환기에 흡착된 대량의 tPA가 용출되지 않도록 적당히 선택한다.
단계(c)는 tPA와 같거나 그 이상의 pI값을 갖는 불필요한 단백질을 양이온 교환기의 pKa 값 이하의 pH를 갖는 용리액으로 세척함으로써 수행될 수 있다. 이러한 용출을 위해 pH2.8∼3.5의 용액이 사용된다.
단계(c)에서, 용출을 위한 온도 및 염농도를 포함한 다른 조건들은 양이온 교환기에 흡착된 tPA가 대량으로 용출되지 않도록 적당히 선택한다.
단계(d)는 양이온 교환기를 양이온 교환기에 흡착된 tPA를 효과적으로 용출할 수 있는 tPA가 안정한 pH의 용액에 통과시킴으로써 수행될 수 있다.
사용되는 용액의 예로는 2∼10의 pH 및 필요한 염 농도를 갖는 것이 있으며, 그중에도 2∼3의 pH를 갖는 용액이 저염 농도의 조건하에 농축된 tPA를 용출 및 수득하는데 바람직하게 사용될 수 있다.
tPA의 용출에 필요한 염 농도는 사용된 양이온 교환기의 담체종류에 따라 다르기 때문에, 각각의 양이온 교환기에 적당하도록 선택한다.
예를 들어, NaCl을 사용할 때, 하기와 같이 상이한 pH범위를 갖는 용리액에 하기의 최소염농도가 필요하다.
Figure kpo00001
예를 들면, CM-트리스아크릴M(IBF Biotechnics, France)를 사용하는 경우, 상기에 기재된 최소염 농도와 같거나 또는 이상의 적당한 염농도가 사용될 수 있으며, CM-세파로즈가 사용되는 경우, 상기에 기재된 최소염 농도의 약 1.5∼3배가 사용된다.
용리액에서 최대염 농도는 염의 포화점일 수 있다.
본 발명에 따른 정제방법에서 예를 들면 하기의 특징적 현상이 확인된다.
양이온 교환기에 흡착된 단백질이 하강하는 pH 순서로 용출될 때 tPA 보다 높은 pI 값을 갖는 단백질이 tPA 이후에 용출되는 것이 기대되지만 용출순서가 역전된다. 예를 들면 pI가 10∼15인 아프로티닌은 tPA보다 먼저 용출된다.
이러한 결과는 tPA가 단백질 중에서 양이온 교환기에 가장 강하게 흡착되는 단백질 중의 하나이어야 한다는 것을 확인시킨다.
이것은 이온 환경 뿐만 아니라 수지(수-불용성 담체)에 대한 tPA의 친화성이 기인한 것이다. 이러한 사실은 불필요한 단백질의 제거를 위해 카르복시 메틸기의 pk보다 낮은 pH와 같은 더 극한 조건을 사용해야 한다는 것을 알려준다.
더욱이, tPA보다 낮은 pI를 갖는 단백질이 단계 (b)에서 tPA로부터 분리되리라고 예상되지만, ETI 및 항-tPA 항체는 예를 들면 양이온 교환기에 흡착된다면 중성 근처의 pH에서 tPA에 결합하기 때문에 tPA로부터 분리될 수 없다.
그러나, 단계(b) 이후의 단계 (c)에 사용된 pH범위에서, ETI 및 항-tPA 항체 tPA는 tPA로부터 해리되어, 용리시키면 tPA로부터 쉽게 분리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 예는 다음과 같다.
[실시예 1]
보베스(Bowes) 흑색종 세포(ATCC CRL 1424 G361)을 10% 가열-비활성화된(56℃에서 30분) 태내송아지 혈청이 보충된 RPMI-1640 조직 배양 배지에서 배양하고, 생성된 배양액을 한번 세척한다.
40KIU(칼리크레인 억제제 단위)/ml의 아프로타닌이 보충된 무혈청의 상기와 동일한 배지에서 24시간 더 배양을 계속한다. 배양 상층액을 수거하고, 회수액으로 사용한다.
양이온 교한지수에 넣기 위해 사용된 시료는 다음과 같이 제조한다.
회수액에 NaCl을 가하여 최종 온도 1M을 얻고, 생성된 액체를 1M NaCl을 함유한 50mM 인산염 완충액(pH7.5)로 평형된 항-인간 tPA항체-세파로즈 컬럼(10mg 항체/ml수지)에 넣는다.
컬럼을 평형 완충용액으로 세척하고, tPA 분획을 2M 암모늄 티오 시아네이트를 함유한 글로신-HCL 완충용액(pH3.5)로 용출시킨다.
용출액에서 tPA의 활성은 컬럼에 넣은 활성의 88%이다.
황산 암모늄을 용출액에 300g/ℓ 농도로 용해시키고, 용액을 4℃에서 밤새 교반한 후, 원심 분리하여 침전물을 회수한다.
침전물을 0.05M 인산 2 수소 나트륨 용액(pH4.5)에 용해시키고, 같은 완충 용액에 대해 투석시킨다.
생성된 투석용액을 시료로 사용한다.
이 시료는 tPA 뿐만 아니라 배양액으로부터 유래된 불필요한 단백질 및 항-인가 tPA 항체를 함유한다.
배양액으로부터 유래된 불필요한 단백질의 양을 기준으로 태내송아지 혈청 유래의 단백질 및 아프로타닌을 사용하여 이들 단백질에 대한 항체와의 효소 면역 분석법(EIA)에 의해 결정한다. 태내송아지 혈청으로부터 유래된 단백질 및 아프로타닌은 각각 45㎍ 및 70ng이었다.
항-인간 tPA 항체는 450㎍이었다.
시료를 0.05M 인산2 수소 나트륨 용액(pH4.5)로 평형된 CM-트리스 아크릴 M 컬럼(IBM)(5ml)에 통과시킨다. 통과된 분획을 수거하여 플라스미노겐-의존성 섬유소 용해 활성을 측정한다. 활성은 전혀 검출되지 않는다.
이어서, 컬럼을 먼저 100ml의 0.05M 인산염 완충용액(pH5.8)로 세척하여 tPA와 같거나 그 이하의 pI값을 갖는 불필요한 단백질을 제거하고, 이어서 100ml의 0.05M 글리신-HCL 완충용액(pH3.2)로 세척하여 tPA와 같거나 그 이상의 pI값을 갖는 불필요한 단백질을 제거한다. 용출액에서 tPA 활성은 컬럼에 넣은 활성의 약 5%이다.
최종적으로, 50ml의 0.1M 인산2 수소나트륨-인산 완충용액(pH2.5)로 tPA를 용출시킨다. 용출액에서 tPA활성은 컬럼에 넣은 활성의 약 90%이다.
용출된 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하고, 염색하면 약 70,000달톤의 분자량에 상응하는 단일밴드가 나타난다. tPA 1mg 당 불필요한 단백질의 양은 태내 송아지 혈청으로부터 유래된 것의 경우 약 20mg, 아프로타닌의 경우 약 5mg 및 항-인간 tPA 항체의 경우 약 20mg이다.
[실시예 2]
양이온 교환수지에 도입할 시료를 하기의 공정에 의해 제조한다.
인간 tPA유전자로 형질 전환된 생쥐 섬유 아세포(생쥐 C127I ATCC CRL 1616)을 인슐린, 트랜스퍼린 및 40KIU/ml의 아프로타닌을 함유한 RPMI-1640 조직 배양배지에서 배양함으로써 수득된 배양 상층액 2ℓ를 0.15M NaCl을 함유한 0.05M 인산염 완충용액(pH7.5)으로 평형된 피부린세파로즈 컬럼(20mg 피부린/ml수지)에 넣는다.
단백질이 흡착된 컬럼을 1M NaCl을 함유한 400ml의 0.05M 인산염 완충용액(pH7.5)로 세척한다.
이어서, 단백질을 0.5M 리신을 함유한 0.05M 인산수소2 나트륨-NaOH 용액(pH10.0) 200ml로 용출시킨다.
용출액의 플라스미노겐-의존성 피부린 활성을 측정하면, 컬럼에 넣은 활성의 약 90%가 회수됨을 알수 있다. 용출액 분획을 50ml의 인산2 수소나트륨 용액(pH4.5)에 대해 투석하고, 생성된 용액을 시료로서 50mM 인산2 수소나트륨 용액(pH4.5)으로 평형된 20ml의 CM-트리스아크릴 M 컬럼에 넣는다, 단백질이 흡착된 수지를 먼저 400ml의 25mM 인산염 완충용액(pH6.0)으로 세척하여, tPA와 같거나 그 이하의 pI값을 갖는 불필요한 단백질을 제거하고 이어서 400ml의 0.05M 글리신-HCL완충용액(pH3.2)로 세척하여 tPA와 같거나 그 이상의 pI값을 불필요한 단백질을 제거한다. 최종적으로 tPA를 50mM NaCl을 함유한 100ml의 50mM 인산2 수소나트륨-인산완충 용액(pH2.5)로 용출시킨다.
tPA의 회수율은 약 90%이며, tPA 분획을 SDS폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 후 염색하면 약 70,000달톤의 분자량을 갖는 단일 밴드가 나타난다. 항-인슐린 항체, 항-트랜스퍼린 항체, 항-피부리노겐 항체 및 항-아프로티닌 항체를 사용한 효소면역 분석에 의해 나머지 항원성 물질을 검출할 때, tPA 1mg당의 나머지 단백질의 양은 인슐린의 경우 5ng 이하, 트랜스퍼린의 경우 10ng 이하, 피부리노겐의 경우 약 30ng 및 아프로티닌의 경우 약 2ng이 나타난다.
[실시예 3]
인간 태아 폐세포(ATCC MRC 5 CCL171)를 10% 가열 비활성화(56℃에서30분) 태내송아지 혈청 및 20KIU/ml의 아프로티닌을 함유한 RPMI-1640 조직배양 배지에서 배양함으로써 수득된 배양 상층액 10ℓ를 에리트리나 트립신 인히비터(ETI)가 고정화된(50mg ETI/ml수지)ETI-세파로즈 컬럼 10ml에 넣는다.
컬럼을 2M NaCl을 함유한 0.05M 인산염 완충용액(pH7.5)200ml로 세척한 후, 0.05M NaCl을 함유한 50ml의 시트르산 완충용액(pH4.7)로 단백질을 용출시킨다.
용출액을 시료로서 50mM NaCl을 함유한 0.05M 시트르산 완충용액(pH4.7)으로 평형된 10ml의 CM-세파로즈 컬럼에 넣는다.
단백질이 흡착된 컬럼을 먼저 50mM NaCl을 함유한 200ml의 0.05M 인산염 완충용액(pH6.0)으로 세척하여 tPA와 같거나 그 이하의 pI 값을 갖는 불필요한 단백질을 제거하고, 이어서 50mM NaCl을 함유한 200ml의 0.05M 시트르산 완충용액(pH2.8)으로 세척하여 tPA와 같거나 그 이상의 pI 값을 갖는 불필요한 단백질을 제거한다.
이어서 tPA를 50mM NaCl을 함유한 50ml의 0.05M 인산2 수소나트륨-인산완충용액(pH2.0)으로 용출시킨다.
tPA활성의 회수율은 컬럼에 넣은 활성의 약 90%이다.
SDS폴리아크릴아미드 겔 전기 영동후 염색하면 약70,000달톤의 분자량에 상응하는 단일밴드가 확인된다.
항-태내송아지 혈청 항체, 항-ETI 항체 및 항-아프로티닌 항체를 사용한 효소 면역분석에 의해 나머지 항원성 물질을 검출할 때 tPA 1mg당 나머지 단백질의 양은 태내 송아지 혈청의 경우 약 30ng, ETI의 경우 약 5ng 및 아프로티닌의 경우 1ng이하이다.

Claims (2)

  1. (a)tPA 및 불필요한 단백질을 함유한 조 tPA제제를 양이온 교환기와 접촉시켜 tPA 및 불필요한 단백질을 양이온 교환기에 흡착시키고, (b)상기 양이온 교환기를 pH5.2∼6.2의 용리액으로 처리하여 tPA와 같거나 그 이하의 pI 값을 갖는 불필요한 단백질을 용출시키고, (c) (b) 단계를 거친 양이온 교환기를 pH2.8∼3.5의 용리액으로 처리하여 tPA와 같거나 그 이상의 pI 값을 갖는 불필요한 단백질을 용출시키고 (d) (b) 및 (c) 단계를 거친 양이온 교환기로부터 tPA를 용출시키는 단계를 특징으로 하는 tPA의 정제방법.
  2. 제1항에 있어서 양이온 교환기(cation-exchanger)가 양이온 교환기(cation-exchange group)로서 카르복시메틸기를 갖는 tPA의 정제방법.
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