UA78014C2 - Macrocyclic peptides active against hepatitis c virus - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до сполук, способів їхнього синтезу, до композицій та способів лікування 2 інфекції, яка викликається вірусом гепатиту С (НСМ). Зокрема, представлений винахід відноситься до нових пептидних аналогів, фармацевтичних композицій, які містять такі аналоги, та до способів застосування цих аналогів для лікування інфекції, яка викликається НСУ.

Вірус гепатиту С (НСМ) є основним збудником гепатиту, який не відноситься до А- та В-гепатиту, який передається при переливанні крові й вражає людей у всьому світі. Встановлено, що понад 200 мільйонів людей у 70 світі уражено вірусом. Великий відсоток носіїв стає хронічно інфікованим та у багатьох пацієнтів це приводить до хронічного захворювання печінки, так званого хронічного гепатиту С. У свою Чергу, ця група хворих має високий ризик захворювання такою серйозною хворобою печінки, як цироз печінки, печінково-клітинний рак та остання стадія хвороби печінки, яка приводить до смерті.

Механізм, за допомогою якого відбувається збереження вірусу НСМ в організмі та який обумовлює високий коефіцієнт захворюваності хронічною хворобою печінки, поки недостатньо вивчений. Невідомо, як НСМ взаємодіє з імунною системою хазяїна та переборює її дію. Крім того, ще не виявлені також ролі клітинних та гуморальних імунних відповідей у захисті від НСМ-інфекції та при захворюванні гепатитом. Є дані про те, що для профілактики пов'язаного з переливанням крові вірусного гепатиту можна застосовувати імуноглобуліни, однак

Центр по контролю захворюваності в цей час не рекомендує для цієї мети застосовувати лікування з використанням імуноглобулінів. Відсутність ефективної захисної імунної відповіді ускладнює розробку вакцини або адекватних профілактичних заходів після контакту, тому найближчим часом надії в основному покладають на антивірусні засоби.

З метою виявлення фармацевтичних агентів, які володіють ефективністю відносно лікування НСУ-інфекції, були проведені різні клінічні дослідження за участю пацієнтів, які страждають хронічним гепатитом С. У цих с дослідженнях застосовували інтерферон-альфа індивідуально або у поєднанні з іншими антивірусними агентами. (3

Ці дослідження дозволили встановити, що у основної більшості учасників експерименту не було виявлено реакції на такі схеми лікування, а з тих учасників, які виявилися чутливими до лікування, у більшої частини після закінчення лікування відбувався рецидив.

Таким чином, до останнього часу терапія з використанням інтерферону (ІЕМ) залишалася єдиним доступним З методом лікування пацієнтів, які страждають хронічним гепатитом С, яка мала доведену в клінічних умовах «- ефективність. Однак ефективність такого лікування зберігається протягом нетривалого періоду часу, і, крім того, лікування інтерфероном викликає серйозні побічні дії (тобто ретинопатію, тиреоїдит, гострий панкреатит, о депресію), що знижує якість життя пацієнтів, яких піддають лікуванню. У цей час інтерферон у поєднанні з с рібавірином запропонований для лікування пацієнтів, які нечутливі до ІЕМ при його індивідуальному 325 застосуванні. Однак побічні дії, які викликаються ІЕМ, не зменшуються при такій спільній терапії. -

Встановлено, що пегільовані форми інтерферонів, такі як РЕС-ІпігопФ та Редазузе), можуть частково знижувати зазначені шкідливі побічні дії, однак антивірусні лікарські препарати все ще залишаються основним засобом для орального лікування НСУ. «

Таким чином, існує необхідність у розробці ефективних антивірусних агентів для лікування НСУ-інфекції, 740 які були б позбавлені недоліків існуючих методів лікування, заснованих на застосуванні фармацевтичних засобів. З с НОМ являє собою укладений в оболонку позитивний ланцюг РНК-ового вірусу сімейства Ріамімігідае. Геном

І» НСМУ, представлений одноланцюговою РНК, складається приблизно з 9500 нуклеотидів та має одну відкриту рамку зчитування (ВРЗ), яка кодує один великий поліпротеїн, який складається приблизно з 3000 амінокислот. У заражених клітинах цей поліпротеїн розщеплюється в багатьох сайтах клітинними та вірусними протеазами з утворенням структурних та неструктурних (М5) протеїнів. У випадку НСМ під дією двох вірусних протеаз і утворюються зрілі неструктурні протеїни (М52, М5З, М54А, М54В, М5О5БА та М558). Перша із зазначених протеаз,

Ге | яка поки ще недостатньо охарактеризована, розщеплює зв'язок М52-М53З (далі в контексті даного опису позначена як М5З2/3-протеаза); друга являє собою серинову протеазу, яка міститься в М-кінцевій області ММЗ (далі о позначена як М5З3З-протеаза), та вона опосередковує всі наступні розщеплення, які відбуваються по ходу -к 70 транскрипції М53З, як у цис-орієнтації у сайті розщеплення М53-М54А, так й у транс-орієнтації в інших сайтах

МЗ4АА-М54В, М548-МББА, МЗБА-М55В. Протеїн МЗАА, імовірно, має множинні функції, та діє в якості кофактора

Т» для МЗЗ-протеази та можливо сприяє мембранній локалізації МОЗ та інших компонентів вірусних репліказ.

Утворення комплексу протеази МЗЗ з М5ЗА4А, імовірно, необхідно для процесування, посилення протеолітичної ефективності у всіх сайтах. Протеїн МЗЗ володіє також нуклеозидтрифосфатазною активністю та РНК-геліказною 22 активністю. МО5В являє собою РНК-залежну РНК-полімеразу, яка приймає участь у реплікації НСМ.

ГФ) Загальна стратегія розробки антивірусних агентів передбачає інактивацію ферментів, які кодуються вірусом, які відіграють основну роль у реплікації вірусу. о Нижче наведений перелік заявок на патенти, які були опубліковані протягом останніх декількох років, у яких описані пептидні аналоги, які є інгібіторами М5З-протеази НСУ, які за будовою відрізняються від сполук, 60 запропонованих у даному винаході: б5

СВ 2339262; ПВ 10298151; ЛЮ 126961; ЛЮ ІрОаВО: ГР: ФО БО3983;

ЦЕ бІ5ОУ5И; НЕ ІВАН: МО МІ: УС ЗВЕЛИ ЛИ юдезщоб;

ЧО. ВЕМЕБОТ: ЩО: ОВЛЯЕЄУО; КО ФОНИ; Ж. сОМЄдЯя; ЯКО. ООКАЯь б. зубна; Зб. ЮРІЯ: Чо ПбОбУЮЕ; ЗО ФОН жо пофбаю

ЯКО: по/5о929; ЩО ОбЗІІІ9; ЗМО" ІАНЕЯ; КО ФІАХАЮТЬ ОО ЩМТВУхл; ча ЛОБІ; РО ЛЯДІВ; чН О1АЯЯЯ; ХК о1Баєте о бій о ВИКЯ; ЛО білюіаав; КО Ос1я?; о овАМІУЕ; о ОмОВх то ЧУСОвАКові ЩО ВАВ; СІЛИ; ЧИС ОАЛВ та СХ ОгІТЯХЗЯ;

Сполуки, запропоновані в даному винаході, відрізняються за своєю хімічною будовою та при створенні винаходу раптово було встановлено, що вони специфічно інгібують МЗЗ-протеазу НСМ та мають при цьому незначну інгібувальну активність по відношенню до інших серинових протеаз. Крім того, сполуки мають активність на культурі клітин та раптово володіють гарним фармакокінетичним профілем іп мімо.

Винахід відноситься до сполук формули (1):

ІК,

І чне М

Не й - о Е; 7 ов В

Н- о Мерте з фі В Те я сч

ЩЕ ЩЕ ЧИ з Ї. і9) ти 1 : 1А 1А : : М у якій Кк позначає гідрокси або МНБЗО»МВ", де К позначає С.-Сдвалкіл, Сз3-С7циклоалкіл або

С.-Свалкіл-С3-С,циклоалкіл, які всі необов'язково заміщені 1-3 замісниками, обраними з ряду, який включає -- галоген, ціано, нітро, ОС4-Свалкіл, амідо, аміно або феніл, або ВА позначає Св- або С.рарил, необов'язково ав! заміщений 1-3 замісниками, обраними з ряду, який включає галоген, ціано, нітро, С 1-Свалкіл, ОС.-Свалкіл, амідо, аміно або феніл; БК? позначає Св-Свциклоалкіл та КЗ позначає циклопентил; або до їх фармацевтично со прийнятних солей. ї-

Винахід відноситься також до фармацевтичної композиції, яка містить ефективну відносно вірусу гепатиту С кількість сполуки формули (І) або її терапевтично прийнятної солі в суміші з фармацевтично прийнятним середовищем носія або допоміжною речовиною. «

Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована у даному винаході, додатково містить інтерферон (пегільований або непегільований) або рібавірин, або один або кілька - с інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСУ, або їхню будь-яку комбінацію.

Ще одним важливим об'єктом винаходу є спосіб лікування інфекції, яка викликається вірусом гепатиту С у )» ссавця, який полягає в тому, що ссавцеві вводять ефективну відносно вірусу гепатиту С кількість сполуки формули (І) або її терапевтично прийнятній солі або описаної вище композиції, індивідуально або у поєднанні з одним або декількома наступними компонентами: інтерферон (пегільований або непегільований) або рібавірин, -| або один або кілька інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСУ, які у кожному випадку бо вводять спільно або роздільно.

Наступним важливим об'єктом винаходу є спосіб попередження інфекції, яка викликається вірусом гепатиту С (ав) у ссавця, який полягає в тому, що ссавцеві вводять ефективну відносно вірусу гепатиту С кількість сполуки ши 20 формули І або її терапевтично прийнятної солі або описаної вище композиції, індивідуально або у поєднанні з одним або декількома наступними компонентами: інтерферон (пегільований або непегільований) або рібавірин, їз» або один або кілька інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСМУ, які вводять спільно або роздільно.

Даний винахід відноситься також до застосування описаної вище сполуки формули (І) для приготування лікувального засобу, призначеного для лікування або попередження інфекції, яка викликається вірусом гепатиту с. о Якщо не зазначене інше, то в контексті даного опису поняття, які використовуються, мають наступні значення: іме) У тих випадках, коли для позначення абсолютної конфігурації асиметричного центра використають дескриптори (К) або (5), то позначення відноситься до всієї сполуки, а не тільки до замісника. 60 Позначення "РІ, Р2 та РЗ" у контексті даного опису відноситься до положення амінокислотних залишків, починаючи із С-кінця пептидних аналогів та продовжуючись до М-кінця (тобто Р1 позначає положення 1 щодо

С-кінця, Р2 позначає положення 2 щодо С-кінця та т.д. |див. Вегдег А. та Зспеспіег І., Тгапвасіопзе ої (пе

Коуаї Зосівїу І опдоп зегіез, В257, 1970, сс.249-264).

У контексті даного опису поняття "1, 25)-вініл-АЦКК" відноситься до сполуки формули: б5 пев «гій:

КИ в й а саме, до (1К, 25)-1-аміно-2-етенілциклопропілкарбонової кислоти. 70 Поняття "галоген' у контексті даного опису значає галогеновий замісник, обраний із групи, яка включає бром, хлор, фтор або йод.

Поняття "С 1-Свалкіл" або "(низч.) алкіл" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим замісником, позначає ациклічні алкільні замісники із прямим або розгалуженим ланцюгом, які містять від 1 до 6 атомів вуглецю, та включає, наприклад, метил, етил, пропіл, бутил, гексил, 1-метилетил, 1-метилпропіл, 75 2-метилпропіл, 1,1-диметилетил.

Поняття "С 1-Свалкіл" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим замісником, позначає ациклічні алкільні замісники із прямим або розгалуженим ланцюгом, які містять від 1 до 8 атомів вуглецю, та включає, наприклад, метил, етил, 2,2-диметилбутил, гексил, 1-метилгексил, гептил та октил.

Поняття "С 3-СУциклоалкіл" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим замісником, позначає циклоалкільний замісник, який містить від З до 7 атомів вуглецю, та включає циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклогексил та циклогептил.

Поняття "С 4-Свалкіл-Сз-СУциклоалкіл" у контексті даного опису позначає циклоалкільний радикал, який містить від З до 7 атомів вуглецю, який безпосередньо пов'язаний з алкіленовим радикалом, який містить від 1 до 6 атомів вуглецю; наприклад, циклопропілметил, циклопентилетил, циклогексилметил, циклогексилетил та «М циклогептилпропіл. Наприклад, коли КА позначає С.-Свалкіл-С3-Суциклоалкіл, то ця група пов'язана з о

ЗО, -трупою через С.4-Свалкіл (тобто алкіленовий фрагмент).

Поняття "ОС 3-Свалкіл" у контексті даного опису, індивідуально або у поєднанні з іншим замісником, позначає замісник -0ОС.-Свалкіл, у якому алкіл, як зазначено вище, містить до 6 атомів вуглецю. ОС --Свалкіл позначає метокси, етокси, пропокси, 1-метилетокси, бутокси та 1,1-диметилетокси. Останній замісник звичайно - позначають як трет-бутокси. «-

Поняття "фармацевтично прийнятна сіль" позначає сіль сполуки формули І, яку з медичної точки зору можна використовувати в контакті із тканинами людини та нижчих тварин без ознак підвищеної токсичності, о подразнення, алергійної реакції та т.п., яка відповідає прийнятному співвідношенню користь/ризик й, як со правило, може розчинятися або диспергуватися у воді або олії та має ефективність при цільовому використанні.

Поняття включає фармацевтично прийнятні кислотно-адитивні солі та фармацевтично прийнятні солі приєднання ї- основ. Перелік прийнятних солей наведений, наприклад, у |З.М. Вігдре та ін., У. РНагт. Зсі., 66, 1977, сс.1-19), публікація повністю включена в даний опис як посилання.

Поняття "фармацевтично прийнятна кислотно-адитивна сіль" позначає солі, які зберігають свою біологічну « ефективність та властивості вільних основ та які не є небажаними з позицій біології або з інших причин, утворені з неорганічними кислотами, такими як соляна кислота, бромистоводнева кислота, йодистоводнева З с кислота, сірчана кислота, сульфамінова кислота, азотна кислота, фосфорна кислота та т.п., та з органічними

І» кислотами, такими як оцтова кислота, трихлороцтова кислота, трифтороцтова кислота, адипінова кислота, альгінова кислота, аскорбінова кислота, аспарагінова кислота, бензолсульфонова кислота, бензойна кислота, 2-ацетоксибензойна кислота, масляна кислота, камфорна кислота, камфорсульфонова кислота, корична кислота, лимонна кислота, диглюконова кислота, етансульфонова кислота, глутамінова кислота, гліколева кислота, - гліцерофосфорна кислота, напівсірчана кислота, енантова кислота, капронова кислота, мурашина кислота,

Го! фумарова кислота, 2-гідроксіетансульфонова кислота (ізетіонова кислота), молочна кислота, малеїнова кислота, гідроксималеїнова кислота, яблучна кислота, малонова кислота, мигдальна кислота, мезитиленсульфонова о кислота, метансульфонова кислота, нафталінсульфонова кислота, нікотинова кислота, 2-нафталінсульфонова -ьк 70 кислота, щавлева кислота, памова кислота, пектинова кислота, фенілоцтова кислота, З-фенілпропіонова кислота, пікринова кислота, півалінова кислота, пропіонова кислота, піровиноградна кислота, саліцилова кислота, ї» стеаринова кислота, бурштинова кислота, сульфанілова кислота, винна кислота, пара-толуолсульфонова кислота, ундеканова кислота та т.п.

Поняття "фармацевтично прийнятна сіль приєднання основи" позначає солі, які зберігають свою біологічну 22 ефективність та властивості вільних кислот та які не є небажаними з позицій біології або з інших причин,

Ф! утворені з неорганічними основами, такими як аміак або гідроксид, карбонат або бікарбонат амонію, або катіонами металу, такого як натрій, калій, літій, кальцій, магній, залізо, цинк, мідь, марганець, алюміній та де т.п. Найбільш кращими є солі амонію, калію, натрію, кальцію та магнію. Солі, отримані з фармацевтично прийнятних органічних нетоксичних основ, включають солі первинних, вторинних та третинних амінів, 60 четвертинних амінових сполук, заміщених амінів, включаючи заміщені аміни, які зустрічаються в природних умовах, циклічні аміни та основні іонообмінні смоли, такі як метиламін, диметиламін, триметиламін, етиламін, діетиламін, триетиламін, ізопропіламін, трипропіламін, діетаноламін, етаноламін, діетаноламін, 2-диметиламіноетанол, 2-діетиламіноетанол, дициклогексиламін, лізин, аргінін, гістидін, кофеїн, гідрабамін, холін, бетаїн, етилендіамін, глюкозамін, метилглюкамін, теобромін, пурини, піперазин, піперидин, бо М-етилпіперидин, похідні тетраметиламонію, похідні тетраетиламонію, піридин, М,М-диметиланілін,

М-метилпіперидин, М-метилморфолін, дициклогексиламін, дибензиламін, М,М-дибензилфенетиламін, 1-ефенамін,

М,М'-дибензилетилендіамін, поліамінові смоли та т.п. Найбільш кращими органічними нетоксичними основами є ізопропіламін, діетиламін, етаноламін, триметиламін, дициклогексиламін, холін та кофеїн.

Поняття "антивірусний агент" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації вірусу в організмі ссавця. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, необхідні для утворення та/або реплікації вірусу в організмі ссавця. Антивірусні агенти включають, наприклад, рібавірин, амантадин, МХ-497 (меримеподіб, фірма Мепех РНагптасеціїсаів), МХ-498 (фірма Мепех 7/0 РПаптасецііса!в), левовірин, вірамідин, цеплен (максамін), ХТІ--001 та ХТІ-002 (фірма ХТІ. Віорпаптасецііса!в).

Поняття "інший агент, який володіє активністю по відношенню до НСУ" у контексті даного опису позначає агенти, ефективні відносно зниження або попередження розвитку пов'язаних з гепатитом С симптомів хвороби.

Такі агенти вибирають із: імуномодуляторів, інгібіторів М53- протеази НСМ, інгібіторів полімерази НСМ або інгібіторів іншої мішені в життєвому циклі НСУ.

Поняття "імуномодулятор" у контексті даного опису позначає агенти (хімічні сполуки або біологічні агенти), які мають ефективність відносно підвищення або потенціювання реакції імунної системи у ссавця.

Імуномодулятори включають, наприклад, інтерферони класу І (такі як А-, В-, В- та 5-інтерферони, «-інтерферони, консенсусні інтерферони та азіало-інтерферони), інтерферони класу ІІ (такі як у-інтерферони) та пегільовані інтерферони.

Поняття "інгібітор МЗЗ-протеази НСМ" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування функції МЗЗ-протеази НСМ у ссавця.

Інгібітори МЗЗ3-протеази НСМ включають, наприклад, сполуки, описані у (МО 99/07733, УМО 99/07734, МО 00/09558,

МО 00/09543, УМО 00/59929 або МО 02/060926), перспективну сполуку, розроблену фірмою Военгіпдег ІпдеІНеїт, позначену як ВІЇ М 2061, яка є вивченою в клінічному дослідженні, та перспективні сполуки, розроблені фірмою Ге

Мепех/Еїї ПІу, позначені як МХ-950 або І У-570310, які ще не остаточно досліджені. Зокрема, сполуки Мо2, З, 5,6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, о 120, 122, 123, 124, 125, 126 та 127, представлені в |габлиці на стор.224-226 УУО 02/060926), можна застосовувати у поєднанні зі сполуками, запропонованими у даному винаході.

Поняття "інгібітор полімерази НСМ" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або ч;Е біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування функції полімерази НСМ у ссавця. Воно відноситься, наприклад, до інгібіторів МЗ5В-полімерази НСМ. Інгібітори полімерази НСМ включають сполуки, які -- не відносяться до нуклеозидів, наприклад, описані у: ав) - |заявці на патент США Мо.10/198680, який відповідає РСТ/САО2/01127, обидва документи подані 18 липня 2002р. (фірма Военгіпдег ІпдеіНеїіт), 09 - заявці на патент США Мо.10/198384, який відповідає РСТ/САО2/01128, обидва документи подані 18 липня че 2002р. (фірма Военгіпдег ІпдеіНеїіт), - заявці на патент США Мо.10/198259, яка відповідає РСТ/САО2/01129, обидва документи подані 18 липня 2002р. (фірма Военгіпдег ІпдеіНеїіт), « - ШО 02/100846 А1 та УУО 02/100851 А? (обидві на ім'я фірми 5Піге), - МО 01/85172 А1 та УУО 02/098424 А!1 (обидві на ім'я фірми О5К), - с - ШО 00/06529 та УМО 02/06246 А! (обидві на ім'я фірми МегскК), - ЩО 01/47883 та УМО 03/000254 (обидві на ім'я фірми дарап Тобассо) і і» - ЕР 1 256 628 А? (на ім'я фірми Адоигоп))|.

Крім того, інші інгібітори полімерази НСМ включають також нуклеозидні аналоги, наприклад, сполуки, описані у: - МО 01/90121 А? (фірма Ідепіх), - І - МО 02/069903 А2 (Віосгуві Рпаптасеціїса!з Іпс.) і - ШО 02/057287 А? та УМО 02/057425 А? (обидві на ім'я фірми Мегек/Ізів)|.

Со Конкретними прикладами інгібіторів полімерази НСМ є )ТК-002, УТК-003 та ОТК-109 (фірма дарап Тобассо). (ав) Поняття "інгібітор іншої мішені в життєвому циклі НСМ" у контексті даного опису позначає агент (хімічну шу 50 сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації НСМ у ссавця, яка відрізняється від інгібування функції МЗЗ-протеази НСУ. Вони включають агенти, «г» які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом НСМ механізми, необхідні для утворення та/або реплікації НСМ в організмі ссавця. Інгібітори іншої мішені в життєвому циклі НСМ включають, наприклад, агенти, які інгібують мішень, обрану з ряду, який включає геліказу, МЗ2/3-протеазу НСМ та внутрішній сайт входу в рибосому (ІКЕ5). Конкретним прикладом інгібіторів іншої мішені в життєвому циклі НСМ є І5БІЗ-14803 (ІБІ5 Ріпаптасеціїса!5). о Поняття "інгібітор ВІЛ" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), ко який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації ВІЛ в організмі ссавця. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, необхідні для утворення 60 та/або реплікації ВІЛ в організмі ссавця. Інгібітори ВІЛ включають, наприклад, нуклеозидні інгібітори, ненуклеозидні інгібітори, інгібітори протеаз, інгібітори злиття та інгібітори інтегрази.

Поняття "інгібітор НАМ (вірус гепатиту А)" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації НАМ в організмі ссавця. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, 65 необхідні для утворення та/або реплікації НАМ в організмі ссавця. Інгібітори НАМ включають вакцини, які містять вірус гепатиту А, наприклад, Намгіхе (фірма СіахозптіййКіїпе), МАОТАФ (фірма МегскК) та Амахіте (фірма

Аумепіїз Равзіеинг).

Поняття "інгібітор НВМ (вірус гепатиту В)" у контексті даного опису позначає агент (хімічну сполуку або біологічний агент), який має ефективність по відношенню до інгібування утворення та/або реплікації НВ в організмі ссавця. Воно включає агенти, які впливають на пов'язані або з хазяїном, або з вірусом механізми, необхідні для утворення та/або реплікації НВ в організмі ссавця. Інгібітори НВМ включають, наприклад, агенти, які інгібують ДНК-полімеразу вірусу НВМ або вакцини на основі НВУ. Конкретними прикладами інгібіторів НВМ є ламівудин (Ерімі-НВМФ), адефовірдипівоксил, ентекавір, ЕТС (Сомігасікю), бАРО (ОХ), І-РМАИ (СіемцаіпеФф),

АМЗ65 (амрад), І 4ї (телбівудин), моновалентний-і а (валторцитабін), АСН-126,443 (І -г44С) (ахілліон), МСС478 7/0 (Фірма Еїї Шу), рацивір (СМ), фтор-І- та -О-нуклеозиди, робустафлавон, ІСМ 2001-3 (ІСМ), Ват 205 (Момеов), ХТІ-001 (ХТІ), іміноцукри (МопуІ-ЮОМО) (фірма Зупегду), НерВгуте; імуномодулятори, такі як: інтерферон альфа 26, НЕ2000 (фірма Ногїїїз-Едеп), Тнегадідт (епімун), ЕНТВ899 (фірма Епго Віоспет), тімозин альфа-1 (7адахіпФ)), вакцину на основі ДНК НВМ (фірма Рожаегесі), вакцину на основі ДНК НВМ (фірма деПегоп

Сепіег), антиген НВМ (фірма ОгасСеп), ВауНер ВО (фірма Вауег), Марі-НВО (фірма Мабі) та антитіла до вірусу /5 Гепатиту В (фірма Саподепе); та вакцини на основі НВУ, такі, наприклад, як: Епдегіх В, Кесотрімах НВ, бепНемас

В, Нерасаге, Віо-Нер В, ТміпкКіх, Сотмах, Нехамас.

Поняття "Інтерферон класу І" у контексті даного опису позначає інтерферон, обраний із групи інтерферонів, які всі зв'язуються з рецептором типу І. Воно включає як такі, що зустрічаються в природних умовах, так й отримані синтетичним шляхом інтерферони класу І. Приклади інтерферонів класу | включають А-,

В-, о-інтерферони, «-інтерферони, консенсусні інтерферони, азіало-інтерферони.

Поняття "інтерферон класу І" у контексті даного опису позначає інтерферон, обраний із групи інтерферонів, які всі зв'язуються з рецептором типу ІЇ. Приклади інтерферонів класу ІЇ включають у-інтерферони.

Фармацевтичні композиції, запропоновані у винаході, можуть містити одну або кілька додаткових діючих речовин, наприклад, обраних з антивірусних агентів, імуномодуляторів, інших інгібіторів М5З-протеази НСУ, Ге інгібіторів полімерази НСМУ, інгібіторів іншої мішені в життєвому циклі НСМ, інгібіторів ВІЛ, інгібіторів НАМ (5) та інгібіторів НВУ. Приклади таких агентів наведені вище в розділі "Визначення".

Нижче представлені конкретні кращі приклади деяких таких агентів: - антивірусні агенти: рібавірин та амантадин; - імуномодулятори: інтерферони класу І, інтерферони класу І! та пегільовані інтерферони; «І - інгібітор іншої мішені в життєвому циклі НСМ, мішенню такого інгібітору є: М5З-геліказа, МЗ2/3-протеаза -

НСМ або внутрішній сайт входу в рибосому (ІКЕ5); - інгібітори ВІЛ: нуклеозидні інгібітори, ненуклеозидні інгібітори, інгібітори протеаз, інгібітори злиття (ав) та інгібітори інтеграз; або со - інгібітори НВУ: агенти, які інгібують вірусну ДНК-полімеразу НВУ, або вакцина на основі НВУ.

Як зазначено вище, спільна терапія передбачає спільне введення сполуки формули (І) або її фармацевтично їх» прийнятної солі щонайменше з одним додатковим агентом, обраним з наступного ряду: антивірусний агент, імуномодулятор, інший інгібітор М5З-протеази НСМ, інгібітор полімерази НСМ, інгібітор іншої мішені в життєвому циклі НСМ, інгібітор ВІЛ, інгібітор НАМ та інгібітор НВМ. Приклади таких агентів наведені вище в « розділі "Визначення". Зазначені додаткові агенти можна поєднувати зі сполуками, запропонованими у винаході, одержуючи лікарський засіб, який містить однократну фармацевтичну дозу. В іншому варіанті зазначені додаткові - с агенти можна вводити пацієнтові індивідуально у вигляді складової частини багатокомпонентного лікарського засобу, наприклад, з використанням набору. Зазначені додаткові агенти можна вводити пацієнтові до, одночасно )» або після введення сполуки формули (І) або його фармацевтично прийнятної солі.

У контексті даного опису поняття "лікування" позначає введення сполуки або композиції, запропонованих у даному винаході, для полегшення або усунення симптомів гепатиту С та/або зниження вірусного титру у пацієнта. -і У контексті даного опису поняття "попередження" позначає введення сполуки або композиції, запропонованих со у даному винаході, після контакту індивідуума з вірусом, але до прояву симптомів хвороби та/або до виявлення вірусу в крові. о Краща сполука формули (І) позначає сполуку, як вона визначена вище, у якій Б / позначає гідрокси або - 20 МНБОВ'М, де ВА позначає С.-Свалкіл, Сз-Суциклоалкіл або С.і-Свалкіл-Сз-Суциклоалкіл, які всі

І» необов'язково заміщені 1-3 замісниками, обраними з ряду, який включає галоген, нітро або ОС 1-Свалкіл, або феніл, необов'язково заміщений 1-3 замісниками, обраними з ряду, який включає галоген, нітро, Сі-Свалкіл. або

ОС .1-Свалкіл.

Більш краще, коли сполука формули (І) позначає сполуку, як вона визначена вище, у якій Б / позначає гідрокси або МНіО»В я, де ВА позначає метил, етил, циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклопропілметил, (Ф, циклогексилетил, ССіз, СЕз, феніл, 2-фторфеніл або 4-метилфеніл. ко Найбільш краще, коли сполука формули (І) позначає сполуку, як вона визначена вище, у якій Б! позначає гідрокси або Мне», де В'Х позначає метил, циклопропіл, СЕз або феніл, та в цьому випадку найбільше 60 переважно ВА позначає циклопропіл.

Найбільш переважно В позначає гідрокси.

Найбільш переважно В? позначає циклопентил.

Кращими варіантами здійснення винаходу є всі сполуки формули (І), які наведені в таблиці 1.

Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному бо винаході, може додатково містити інший агент, який володіє активністю по відношенню до НСУ. Приклади інших агентів, які володіють активністю по відношенню до НСУ, включають, о- (альфа), В- (бета), 5- (дельта), у- (гама) або о- (омега) інтерферон, рібавірин та амантадин.

Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може додатково містити інший інгібітор М53З-протеази НСУ.

Згідно ще одного варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може додатково містити інгібітор полімерази НСМ. Відповідно до наступного варіанта здійснення винаходу фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може додатково містити інгібітор інших мішеней життєвого циклу НСУ, включаючи (але не обмежуючись ними) геліказу, М52/3-протеазу або внутрішній сайт входу 70 у рибосому (ІКЕ5).

Фармацевтичну композицію, запропоновану в даному винаході, можна вводити орально, парентерально або за допомогою пристрою для імплантації. Кращим є оральне введення або введення за допомогою ін'єкції.

Фармацевтична композиція, запропонована в даному винаході, може містити будь-які загальноприйняті нетоксичні фармацевтично прийнятні носії, допоміжні речовини або наповнювачі. У деяких випадках значення рН композиції 75 можна регулювати за допомогою фармацевтично прийнятних кислот, основ або буферів з метою підвищення стабільності сполуки, включеної в композицію або у форму для її введення. У контексті даного опису поняття "парентеральний" включає підшкірний, внутрішньошкірний, внутрішньовенний, внутрішньом'язевий, внутрішньосуглобний, інтрасиновіальний, інтрастернальний, інтратекальний шлях введення, введення за допомогою ін'єкції або інфузії, а також введення у область ушкодження.

Фармацевтична композиція може мати форму стерильного препарату для ін'єкції, наприклад, стерильної водної або жиророзчинної суспензії, яку ін'єкують. Цю суспензію можна одержувати за допомогою добре відомих методів з використанням диспергувальних або змочувальних агентів (таких, наприклад, як Твін 80) та суспендувальних агентів.

Фармацевтичну композицію, запропоновану в даному винаході, можна вводити орально у вигляді будь-якої с прийнятної форми лікарського засобу, призначеної для орального введення, включаючи (але не обмежуючись ними) капсули, таблетки та водні суспензії та розчини. У випадку таблеток для орального введення носії, які о, звичайно застосовують, являють собою лактозу та кукурудзяний крохмаль. Як правило, додають також змащувальні агенти, такі як стеарат магнію. Для орального введення у формі капсул прийнятні розріджувачі являють собою лактозу та безводний кукурудзяний крохмаль. Коли оральним шляхом вводять водні суспензії, чу діючу речовину поєднують із емульгувальними та суспендувальними агентами. При необхідності можна додавати певні речовини, підсолоджувачі, та/або коригенти та/або барвники. --

Інші придатні наповнювачі або носії для зазначених вище препаративних форм та композицій наведені у ав) звичайних фармацевтичних довідниках, наприклад, у | Кетіпдіоп'є РпагтасеціїсаІ! Зсіепсев", Те Зсіепсе апа

Ргасіїсе ої Рпаптасу, 19-е вид. Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еавіоп, Репп., (1995). 09

Для монотерапії з метою попередження та лікування опосередкованої НСМ хвороби можна застосовувати дози їч- в діапазоні від приблизно 0,01 до приблизно 1ООмг/кг ваги тіла на день, переважно від приблизно 0,1 до приблизно Б5Омг/кг ваги тіла на день запропонованої сполуки, яка є інгібітором протеази. Як правило, фармацевтичну композицію, запропоновану у винаході, можна вводити від приблизно 1 до приблизно 5 разів на « день або в іншому варіанті шляхом безперервної інфузії. Таке введення можна застосовувати як для тривалого, 70 так та для екстреного лікування. Кількість діючої речовини, яку можна поєднувати з носіями для одержання - с однократної дози лікарського засобу, повинна варіюватися залежно від хазяїна, який підлягає лікуванню, та конкретного шляху введення. Звичайна композиція може містити від приблизно 5 до приблизно 95905 діючої і» речовини (мас. 95). Переважно такі композиції містять від приблизно 2095 до приблизно 8095 діючої речовини.

Як повинно бути очевидно фахівцеві в даній галузі, можна застосовувати й більш низькі або більш високі дози в порівнянні із зазначеними вище. Конкретні дози та схеми лікування будь-якого конкретного пацієнта - І можуть залежати від різних факторів, включаючи активність конкретної сполуки, яку застосовують, віку, ваги со тіла, загального стану здоров'я, статі, раціону, часу введення, швидкості виведення, поєднання лікарських засобів, серйозності та особливостей розвитку хвороби, схильності пацієнта до інфекції, та їх визначає лікар. о Як правило, лікування починають із невеликих доз, істотно більш низьких, чим оптимальна доза пептиду. Потім шу бо дозу підвищують невеликими порціями до досягнення оптимальної дії в конкретних умовах. Як правило, найбільш переважно вводити сполуку в такому діапазоні концентрацій, які в цілому забезпечують антивірусну активність, «г» але не мають якої-небудь шкідливої або небезпечної побічної дії.

Коли композицію, запропоновану в даному винаході, включають у комбінацію, яка містить сполуку формули та один або кілька додаткових терапевтичних або профілактичних агентів, то сполука та додатковий агент повинні бути присутніми у дозі, яка становить приблизно від 10 до 10095 та більш переважно приблизно від 10 до 8095 від дози, яку звичайно застосовують у режимі монотерапії. о Коли ці сполуки або їх фармацевтично прийнятні солі поєднують у препаративній формі з фармацевтично ко прийнятним носієм, то отриману композицію можна вводити іп мімо ссавцеві, такому як людина, для інгібування

М5З-протеази НСМ або для лікування або попередження інфекції, яка викликається вірусом НСМ. Таке лікування 60 можна здійснювати також при використанні сполуки, запропонованої у винаході, у поєднанні з агентами, які включають (але не обмежуючись ними): с-, Ве бе Фет або у інтерферон, рібавірин, амантадин; інші інгібітори

МЗЗ-протеази НСУ; інгібітори полімерази НСУ; інгібітори інших мішеней життєвого циклу НСУ, які включають (але не обмежуючись ними) геліказу, М52/3-протеазу або внутрішній сайт входу у рибосому (ІКЕ5); або їхні комбінації. Зі сполуками, запропонованими в даному винаході, можна поєднувати інші агенти, одержуючи 65 однократну дозу лікувального засобу.

В іншому варіанті ці додаткові агенти можна вводити ссавцеві окремо у вигляді складової частини багатокомпонентного лікувального засобу.

Якщо фармацевтична композиція містить як діючу речовину тільки сполуку, яка запропонована в даному винаході, то такий спосіб може додатково передбачати введення зазначеному ссавцеві агента, обраного з ряду, який включає імуномодулятор, антивірусний агент, інгібітор МЗЗ-протеази НСУ, інгібітор полімерази НСМ або інгібітор інших мішеней життєвого циклу НСУ, таких як геліказа, МЗ2/3-протеаза або ІКЕ5. Такий додатковий агент можна вводити ссавцеві до, одночасно або після введення композиції, запропонованої в даному винаході.

Сполуку формули І, яка запропонована в даному винаході, можна застосовувати також як лабораторний реагент. Сполуку, яка запропонована в даному винаході, можна застосовувати також для усунення або 7/0 попередження вірусного забруднення матеріалів, та тим самим вона знижує ризик зараження вірусом персоналу лабораторій або медичних установ або пацієнтів, які мають контакт із такими матеріалами (наприклад, кров'ю, тканинами, хірургічними інструментами та предметами одягу, лабораторними інструментами та предметами одягу, приладами та матеріалами для збору крові).

Сполуку формули І, яка запропонована в даному винаході, можна застосовувати також як реагент для 7/5 досліджень. Сполуку формули | можна використовувати як позитивний контроль для обгрунтування модельних аналізів на клітинах або аналізів іп міїго або іп мімо реплікації вірусів.

Нижче винахід проілюстрований на прикладах, які не обмежують його об'єм, який заявляється в наведеній нижче формулі винаходу.

У цілому, сполуку формули | та її проміжні продукти одержують відомими методами, з використанням реакційних умов, які, як відомо, є прийнятними для реактантів. Деякі такі методи описані у УМО 00/09543 та УМО 00/09558.

На наведеній нижче схемі проілюстрований придатний заснований на застосуванні відомих методів процес одержання основного проміжного продукту формули ба з ациклічних проміжних продуктів:

Схема 1 сч «м св. М о са НАШ ШИН ЯК

Соски ни я : й т Я що зо ; « чв. ч в | «- вк о Ж. в: ке. ей гу ча й Й й

Яни Я ре мбі не бан: Вік. о рч- ; ши: Ше вав Ва

М 4

І 4. - с ї . що бару ух о, о 4

Схема І: - Стадії А, В, Г. У цілому метод полягає в наступному: фрагменти РІ, Р2 та РЗ можна зв'язувати за допомогою ї» відомих методів пептидного сполучення, які описані у УМО 00/09543 та УУ/О 00/09558.

Стадія Б: Ця стадія включає інверсію конфігурації 4-гідрокси-замісника. Є кілька шляхів здійснення цього процесу, як це повинно бути добре відомо фахівцям у даній галузі. Одним із прикладів придатного методу є добре відома реакція Мітсунобу |Міївипори, Зупіпезів, січень 1981, с.1-28; Капо та ін. Теї. Гей. 36, 1994, с.3779-3792; Кгеснпак та ін. Теї. І ейї, 36, 1995, с.6193-61961. іФ, Стадія Д: Одержання макроциклу можна здійснювати за допомогою реакції обміну олефіну, з використанням ка каталізатора на основі Ки, наприклад, описаний у |МіШег 5.9У.; Віаскмеї! Н.Е.; Сгиррз К.Н. У. Ат. Спет. ос. 118, 1996, с. 9606-9614 (а); Кіпозбигу 9.5.; Натйу 9.Р.А.; Вопіаерив Р.);; Номеуда АН. У. Ат. Спет. во Зос., 121, 1999, с.791-799 (б) та Ниапд .; Зіемепе Е.О.; Моїап 5.Р.; Рейегвеп 9.1.5 9). Ат. Спет. Зос., 121, 1999, с.2674-2678 (в) або у МУО 00/59929)|. Варто мати на увазі також те, що для цієї реакції можна використовувати каталізатори на основі інших перехідних металів, таких як Мо. б5 я ЕНН ОК що й -2 Ясні й БЖ ся сне Й ДН, ін си со ше ду ї ве дев; їн 70 ! й ще щи що т- ші ота тТОу авадІАТОр -ЯхЯ ткеикй сні

Наступне перетворення основного проміжного продукту формули ба на сполуки формули (І), запропоновані в даному винаході, докладно описано нижче у прикладах. щі Представлені в описі сполуки формули (І), у яких В! позначає МНЗО»В У, одержують сполученням відповідної кислоти формули І (тобто БК! позначає гідрокси) з відповідним сульфонамідом формули Б'Я502МН»о у присутності зв'язувального агента в стандартних умовах. Хоча можна застосовувати кілька загальноприйнятих зв'язувальних агентів, кращими для практики є ТБТУ та ГАТУ. Сульфонаміди надходять у продаж або їх можна 2о одержувати відомими методами.

Приклади

Даний винахід проілюстрований більш докладно за допомогою прикладів, які не обмежують його об'єм. Інші конкретні шляхи синтезу або розділення описані у (МО 00/09543; МО 00/09558 та УУО 00/59929).

Температури наведені у градусах Цельсія. Відсотки для розчинів являють собою 905 (мас/об.), а с співвідношення в розчинах являють собою співвідношення об'ємів, якщо не зазначено інше. Спектри ядерного магнітного резонансу (ЯМР) реєстрували за допомогою спектрометра фірми ВгисКег при частоті 40ОМГЦц, хімічні о); зсуви (5) виражені в част./млн. та віднесені до внутрішнього дейтерієвого розчинника, якщо не зазначено інше.

ЯМР-спектри всіх кінцевих сполук (інгібіторів) реєстрували у ДМСО-д5, якщо не зазначено інше.

Експрес-хроматографію на колонці проводили на силікагелі (Зі) відповідно до методу експрес-хроматографії «Кг Стілла (МУ.С. ЗІ та ін., У. Огу. Спет., 43, 1978, с.29231.

У прикладах використовували наступні скорочення: Вос: трет-бутилоксикарбоніл «(МезСОоС(О)); БСА: бичачий -- сироватковий альбумін; ХАПС: 3-((З-холамідопропіл)удиметиламоній)-1-пропан сульфонат; СНоСІ2-ДХМ: (3 метиленхлорид; ДЕАД: діетилазодикарбоксилат; ДІАД: діїзопропілазодикарбоксилат; ДІПЕА: діізопропілетиламін;

ДМАП: диметиламінопіридин; ДМФ: М,М-диметилформамід; ДМСО: диметилсульфоксид; (5,5)-ЕЕООРНОЗ КИ со (СОБ)ОТТ трифторметансульфонат (ж)-1,2-біс(25,55)-2,5-діетилфосфолано)бензол(циклооктадієн) родію (1); ча

ЕН: етанол; ЕЮАс: етилацетат; Е5-МС: мас-спектрометрія з іонізацією електронним пучком; ГАТУ:

Ігексафторфосфат О-7-азабензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію!; РХВД: рідинна хроматографія високого дозволу; МС: мас-спектрометрія; МАГ 0І-ТОЕ: Маїйгіх Авзвзівіей І азег Оівзогріоп Іопігайоп-Тіте ої Рідні, РАВ: бомбардування швидкими атомами; Ме: метил; МеонН: метанол; К.Т.: кімнатна температура (18-22 2); ТБТУ: « тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію; ТФК: трифтороцтова кислота; ТГФ: ЩО с тетрагідрофуран; ТШХ: тонкошарова хроматографія; Тріс/НсІ: гідрохлорид тріс(гідроксиметил)амінометану.

Приклад 1 )» Синтез дипептиду 1с зн". ї ен.

ОА ек ДщИй! НА І ! со "| Ж ней Жов, бо вв о Я че; 16 - 70 Суміш, яка містить Вос-гідроксипролін Та (50,0г, 21бммолей), гідрохлорид (1К,25)-вініл-АЦКК 16 (42,25г,

Т» 238ммолей), ТБТУ (76,36г, 23в8ммолей) та ДІПЕА (11Змл, 649ммолей) у ДМФ (800мл), перемішували при К. Т. у атмосфері азоту. Через З3,5год. розчинник випарювали та залишок екстрагували ЕЮАс та промивали соляною кислотою (1095), насиченим розчином бікарбонату натрію та соляним розчином. Потім органічну фазу сушили над сульфатом магнію, фільтрували та упарювали, одержуючи олію. Після сушіння олії протягом ночі (18год.) у 59 глибокому вакуумі одержували дипептид 1с у вигляді піни жовтого кольору (72,0г, 9495, чистота 29595 за даними гФ) РХВД). т Приклад 2

Синтез дипептиду 2а 60 б5 ве - нд. т м я з Се сш й е ї ще Би: з ; 70 Дипептид 1с (72,0г, 20З3ммоля), трифенілфосфін (63,94г, 243,вммоля, 1,2екв.) та 4-нітробензойну кислоту (41,08г, 245,в8ммоля, 1,2екв.) розчиняли в безводному ТГФ (1,4л) та розчин при перемішуванні охолоджували до 09 у атмосфері азоту. Потім по краплях протягом 45хв. додавали ДЕАД (38,4мл, 244ммоля, 1,2екв.) та реакційної суміші давали нагрітися до К.Т. Через 4год. розчинник випарювали та залишок розділяли на 4 порції. Кожну з них хроматографували на силікагелі (зернистість 10-40мкм, діаметр колонки 12см, довжина колонки 1бсм), 75 використовуючи градієнт від 2:11 гексан/!Е(ОАс до 1:11 гексан/Б(ОАс та до чистого (10095) ЕЮАс. Після випарювання розчинників та сушіння в глибокому вакуумі при 702 протягом год. одержували складний ефір 2а у вигляді аморфної твердої речовини білого кольору (108,1г, кількісний вихід).

Приклад З

Синтез спиртового дипептиду За:

Я зле: ой. й . Не сце ж З К В Теінннінінінннінімю Ж. ЖЕ і -щ До ве ше Те і; я я теле й й т ? і Її й. х кує с

Вт І ' р й УНй / вк Бк СИ чад їх Ж со о й за

Складний нітробензоїловий ефір 2а (108,1г, 203,1ммоля) розчиняли у ТГФ (1,Ол) та розчин, який утворився, охолоджували до 02. Потім швидко додавали розчин моногідрату гідроксиду літію (10,66бг, 253,0ммоля) у воді ч;Е (225мл) та реакційну суміш перемішували при 09 протягом ЗОхв., після чого основу, яка залишилася, - нейтралізували соляною кислотою (ін., 50,8мл). Повільно вносили додаткову порцію кислоти до зникнення жовтого забарвлення (7мл). Потім суміш, яка утворилася, упарювали та залишок екстрагували ЕЮАс (З х150мл). о

Екстракт промивали насиченим розчином бікарбонату натрію (150мл) та соляним розчином (15О0мл). Органічну со фазу сушили над сульфатом магнію - деревним вугіллям, фільтрували через діатомову землю та упарювали.

Зо Після сушіння залишку в глибокому вакуумі одержували спирт За у вигляді безбарвної піни (70,1г, 9896, - чистота 29995 за даними РХВД).

Приклад 4

Синтез (2,5)-М-Вос-амінонон-8-енової кислоти (49) « - Б ННАЄ до0юдює УННАЄ

І» як МБ,

ШК щен нижня со чу Півд Я шо о єрнд. ще просте пз д/ ово

Ге: Щ - вір я

Стадія А. До розчину діетил-2-ацетамідомалонату 4а, який поступає у продаж, (100г, 0,4бмолей) у діоксані (500мл) додавали по краплях протягом 30-45хв. водний розчин гідроксиду натрію (1М, Текв., 46О0мл). Суміш, яка

Ф; утворилася, витримували при перемішуванні протягом 16,5год., потім діоксан випарювали у вакуумі. Отриманий ка водний розчин екстрагували З порціями по ЗООмл Е(ОАс та підкисляли до рН1 концентрованою НС1. Цей розчин залишали для кристалізації в бані лід-вода. Після появи декількох кристалів суміш обробляли ультразвуком, бор Після чого утворювалася велика кількість осаду. Після фільтрації та сушіння у вакуумі одержували сполуку 46, (62,52г, вихід 7290) у вигляді твердої речовини білого кольору.

Стадія Б. До емульсії 7-октен-1,2-діолу 4с, яка надходить у продаж, яку перемішували за допомогою магнітної мішалки (25г, 0,17Змолей ) та НьО (100Омл) у 1-літровій круглодонній колбі додавали протягом 20хв. водний розчин перйодату натрію (40,7г, О,190молей, 1 Текв., у 475мл Н2С) (слабка екзотермічна реакція). Суміш, б5 яка утворилася, перемішували при кімнатній температурі протягом ще год. (завершення реакції підтверджували за допомогою ТШХ). Потім суміш зливали в ділильну лійку та водний шар відокремлювали від органічного шару.

Водний розчин насичували Масі, зливали та ще раз відокремлювали від органічної фракції. Дві органічні фракції поєднували, сушили над сульфатом натрію та фільтрували через ватну пробку (у Пастерівскій піпетці), одержуючи сполуку 44 (15,135г, безбарвна олія, вихід 7895). Водний розчин екстрагували СН »СІ?, сушили над безводним

Мао) та концентрували у вакуумі (без нагрівання, т.к. Є уд б-гептеналу 15322), з одержанням додаткової кількості сполуки 44 (1,957г, безбарвна олія, вихід 1095). Загальний вихід 8895.

Стадія В. До твердого етил-2-ацетамідомалонату 465 (7,57г, 40ммолей) додавали протягом хв. б-гептенал 4а (4,48г, 40ммолей) у розчині піридину (32мл, 1ТОекв.). Розчин, який утворився, охолоджували до 10 го у бані.

Додавали протягом 4хв. оцтовий ангідрид (мл, 3,2екв.). Отриманий розчин помаранчевого кольору перемішували 70 протягом Згод. при К. Т. та додавали іншу порцію етил-2-ацетамідомалонату 45 (2,27г). Суміш, яка утворилася, перемішували при кімнатній температурі ще 11год. Потім додавали лід (бОмл) та розчин перемішували протягом 1,5год., потім суміш розбавляли 250мл води та екстрагували двома порціями діетилового ефіру. Ефірний розчин промивали Ін. НСІ, насиченим розчином МансСоО»з, сушили над Ма»5О), концентрували та очищали за допомогою експрес-хроматографії (ЕЮОАс 409в/гексан), одержуючи сполуку 4е (4,8г, вихід 5095) у вигляді олії 75 світло-жовтого кольору.

Стадія Г. До дегазованого (барботирування аргоном протягом ЗОхв.) розчину 7-етил-2-ацетамідо-2,8-нонадіеноату 4е (8,38г, ЗБммолей) у безводному етанолі (7/Омл) додавали (555)-ЕЕООРНОВ КЦСОСОЮТІ (51мг, співвідношення субстрату/каталізатора -496). Суміш поміщали під тиск водню З0 фунтів/кв. дюйм (після 4 циклів Н.»-вакуумування) та перемішували у шейкері Парра протягом 2год.

Суміш, яка утворилася, упарювали досуха, одержуючи неочищену сполуку 4ї, яку застосовували на наступній стадії без додаткового очищення.

Стадія Д. До розчину неочищеного (5)-етил 2-ацетамідо-8-ноненоату 4 (7,3г, 30,Зммоля) у ТГФ (100мл) додавали ВосьО (13,2г, 2екв.) та ДМАП (74Омг, 0,2екв.). Реакційну суміш витримували при температурі дефлегмації протягом 2,5год. Потім більшу частину розчинника ТГФ випарювали, неочищену суміш розбавляли Ге

СН»осСі» та промивали Ін. НСІ для видалення ДМАП. Органічний шар додатково екстрагували насиченим водним о розчином МансСоОз, сушили над безводним Ма»5О) та концентрували у вакуумі. Потім неочищений продукт розбавляли ТГФ (5О0мл) та водою (ЗОмл). Додавали ОН хНЬО (2,54г, 2екв.) та суміш, яка утворилася, перемішували при К.Т. протягом 25год. (завершення гідролізу підтверджували за допомогою ТШХ). Реакційну суміш концентрували у вакуумі для видалення більшої частини розчинника ТГФ та розбавляли СН Сі». Розчин, « який утворився, промивали Ін. НСІ, сушили над безводним Ма»5О,) та концентрували у вакуумі. Для видалення «-- мінорних домішок та надлишку Вос»О неочищений продукт очищали за допомогою експрес-хроматографії (у якості елюєнта використовували градієнт розчинника від 10095 гексану до 10096 ЕОАс). Одержували зазначену в. заголовку сполуку 49 у вигляді високоочищеної олії світло-жовтого кольору (5,82г, вихід 7195). "Н ЯМР (ДМСО, Ге) 400МГц): 8 7,01 (а, 9 -8Гц, тн), 5,79 (аа, Є -6,Игц, Уа -17,0, 102ГЦ, 1Н), 5,00 (та, да -17,ОГц, МН),

Зо 4,93 (та, да -10,2ГцЦ, 1), 3,83 (т, 1Н), 2,00 (д, У -6,9ГЦ, 2Н), 1,65-1,5 (т, 2Н), 1,38 (в, 9Н), 1,35-1,21 (т, 6Н). т

Приклад 5

Синтез трипептиду 5Б5 ; - « | Хр жк й Й ще м но

Пан. жі ов, В -І ОЇ т ; х тя. віоїу о. (Фе) --- па: зв ки о вкрав - 50

Стадія 1: Розчин хлористого водню в діоксані (4н.) додавали до Вос-Р2-Р1-фрагмента За (5,32г, «з» 15,0ммолей), одержуючи безбарвний розчин. Після перемішування при кімнатній температурі розчинник випарювали та залишок поміщали в глибокий вакуум на Згод., одержуючи гідрохлорид сполуки ба у вигляді аморфної твердої речовини, яку використовували без додаткового очищення.

Стадія 2: Додавали ДІПЕА (2,бмл, 15ммолей) до суміші вищевказаного гідрохлориду Р1-Р2 (15ммолей) у безводному ДХМ (100мл), одержуючи гомогенний розчин. Окремо при перемішуванні додавали ТБТУ (5,30Гг, іФ) 16,5ммоля, 1,1екв.) до розчину СО-лінкера 49 (4,07г, 15,0ммолей) у безводному ДХМ (13Омл), що приводило до ко часткового розчинення реагенту. Додавали ДІПЕА (2,бмл, 15ммолей), одержуючи через 10Охв. практично гомогенний розчин. Потім до цього розчину додавали розчин Р1-Р2 та ДІПЕА до збільшення лужності реакційної 60 суміші (рнН»8, визначення за допомогою вологого лакмусового паперу). Після перемішування у атмосфері азоту протягом год. розчинник випарювали та залишок екстрагували Е(ОАс (2 х250мл) та промивали розведеною соляною кислотою (0,05н., 400мл), водою (40О0мл) та насиченим розчином бікарбонату натрію (40Омл). Потім об'єднані органічні фази сушили над сульфатом магнію, фільтрували та упарювали, одержуючи сироп жовтого кольору. Неочищений продукт хроматографували на силікагелі, використовуючи в якості елюента градієнт від 6:1 65 ЕЮАс/гексан до 10095 ЕАс, після чого одержували необхідний трипептидний діен 50 у вигляді піни білого кольору (5,88г, 82905, чистота 29595 за даними РХВД).

Приклад 6

Синтез макроциклічного проміжного продукту ба: «дн 9 їх З -. Й і; т ще о и С я і С Ї. т й а: й й х Ка.

Розчин діену 5Ь (4,0г, 7,8вммоля) у безводному ДХМ (800мл) дезоксигенували, шляхом барботування Аг /5 протягом 2год. Потім додавали каталізатор Ховейда (Номеуда) (262мг, 0,434ммоля, 5,5мол. 95) у вигляді твердої речовини та реакційну суміш кип'ятили зі зворотним холодильником у атмосфері Аг, який надходив з балона.

Через 28год. розчин червоно-помаранчевого кольору упарювали до одержання аморфної твердої речовини та потім очищали за допомогою експрес-хроматографії на силікагелі. Початкова система розчинників являла собою 1096 ЕАс у СНоОСІ». Після елюювання каталізатора з колонки розчинник заміняли на чистий ЕЇАс. Про гор елюювання каталізатора з колонки судили по забарвленню. Виділяли макроциклічний продукт ба у вигляді безбарвної піни, яку повторно розчиняли в суміші СН »оСіо/гексан (-1:2). Після випарювання розчинника одержували порошок білого кольору (3,362г, вихід 8990). "ЯН ЯМР (СОСІз, 400МГЦ): 5 1,20-1,50 (т, 6Н), 1,43 (в, 9Н), 1,53 (49, 9 -9,5 та 5,41Н), 1,61-1,70 (т, 1Н), 1,76-1,90 (т, 2Н), 2,05-2,26 (т, 4Н), 2,45 (а, 9-14,3, 1Н), 3,67 (в, ЗН), 3,71 (а, 0-11, 1н), 3,90 Д 6ТєМ (44, 90-11,1 та 4,3, 1Н), 4,43-4,53 (т, 2Н), 4,76 (а, 9-8,6, 1Н), 4,86 (ра, 9.-9,8, 1Н), 5,20-5,223 (т, 2Н), о 5,57 (а, 9-7,0 та 9,8, 1Н), 7,32 (в, 1Н).

Приклад 7

Одержання тіосечовин 7

Синтез тіосечовини 7а: чІ й » "а со і -

До розчину трет-бутилізотіоціанту (5,О0мл; 39,4ммоля) у ДХМ (200мл) додавали циклопентиламін (4,67мл; 47,Зммоля), а потім додавали ДІЕА (діїзопропілетиламін) та реакційну суміш перемішували при К.Т. протягом 2год. Суміш розбавляли ЕАс, промивали 1095-вим водним розчином лимонної кислоти (2 х), насиченим МансСоО»з (2х), НО (2х) та соляним розчином (1 х). Органічний шар сушили над безводним М950О), фільтрували та « упарювали, одержуючи М-трет-бутил-М'-дциклопентилтіосечовину у вигляді твердої речовини білого кольору (3,70г; - с вихід 4790). М-трет-бутил-М'-циклопентилтіосечовину (3,70г) розчиняли в концентрованій НСІ (46мл). Розчин темно-жовтого кольору обережно кип'ятили зі зворотним холодильником. Через 40хв. реакційній суміші давали і» остудитися до К.Т. та потім охолоджували на льоді та збільшували лужність до рНеО,5 за допомогою твердого

Мансо» та насиченого водного розчину МансСОз. Продукт екстрагували ЕЮАс (Зх), об'єднані ЕЮАс-екстракти промивали НоО (2х) та соляним розчином (1х). Органічний шар сушили (МоЗО)), фільтрували та концентрували, - одержуючи тверду речовину бежевого кольору (2,46г, неочищений продукт). Після розтирання неочищеного о продукту в гексані/Е(ОАс (95/5) з наступною фільтрацією одержували М-циклопентилтіосечовину 7а у вигляді твердої речовини білого кольору (2,38г; вихід 9090). о ТН яЯМР (400МГц, ДМСО-йв): 5 7,58 (рев, 1Н), 7,19 (рв, 1Н), 6,76 (рев, 1Н), 4,34 (рв, 1Н) , 1,92-1,79 (т, - 70 2Н), 1,66-1,55 (т, 2Н), 1,55-1,30 (т, 4Н). МС; ев" 144,9 (МАН) ев": 142,8 (М-Н)-

І» Одержання тіосечовини 75

За допомогою описаного вище процесу та з використанням циклогексиламіну, який поступає у продаж (замість циклопентиламіну), одержували тіосечовину 75

І о ВД я У 7 бо Приклад 8

Синтез сполуки 101: б5

Ян. ен КЕ ах ін й й , сОЗАА -О . да: де АЙ, Я щока с дя ря ся - : жк, ій я. піс ней 7 7 " У Н то ча вв в. упра щу х А г р в І: Оки т бе ДОК са ОО м-е ОМ й. дО се й С ДЕ ж (з т 7вшй ще. ; й й. й зе

Би, (в-к дну Гек о 3о ск в с- ДІ ян. ДОЩ

Але я Я -

В, яко НЕ С дк: НИЙ Сон ав!

Ге їні ЕТ (в)

Стадія А. До розчину, який містить макроциклічний проміжний продукт ба (13,05г, 27, 2ммоля, 1,О0екв.), РИ ЗР - (14,28г, 54,4ммоля, 2,Оекв.) та 2-карбоксиметокси-4-гідрокси-7-метоксихінолін (МО 00/09543; МУО 00/09558 та УМО 00/59929) (6,67г, 28,бммоля, 1,05екв.) у ТГФ (45Омл), при 02 по краплях протягом 15хв. додавали ДІАД (10,75мл, 54,бммоля, 2,0екв.). Потім крижану баню видаляли та реакційну суміш перемішували при К.Т. протягом Згод. «

Після завершення перетворення вихідного продукту на необхідні речовини розчинник випарювали у вакуумі, суміш, яка залишилася, розбавляли Е(Ас, промивали насиченим Мансо з (2х) та соляним розчином (1 хх), но с органічний шар сушили над безводним Маое5зО), фільтрували та упарювали досуха. Після колоночної у» експрес-хроматографії одержували чисту сполуку 7а; колонку елюювали спочатку гексаном/Е(Ас (50:50), потім

СНОСЇІЗ/ЕЮАс (95:5) для видалення побічних продуктів РП ЗРО та ДІАД та елюювання домішок оцінювали за допомогою ТШХ. Нарешті, з колонки елюювали необхідний продукт ва за допомогою СНСІЗ/ЕАс (70:30). Як правило, стадію хроматографії було потрібно повторювати 2-3 рази доти поки сполуку ва можна було виділяти у - вигляді високоочищеного твердого продукту білого кольору, загальний вихід якого становив 6895 (12,8г, чистота о 99,595 за даними РХВД).

Стадія Б. До розчину захищеного за допомогою Вос проміжного продукту 8а (1,567г) в СНЬСІ» (15мл) додавали о 4н. НСЇ у діоксані (12мл). Реакційну суміш перемішували при К.Т. протягом год. (У випадку, коли в середині -ьщ 70 реакційного періоду утворювався густий гель, додатково вносили 1Омл СН 25СІ5)|. Після завершення стадії видалення захисної групи розчинники випарювали досуха, одержуючи тверду речовину жовтого кольору та

Т» пастоподібний продукт. Суміш повторно розчиняли приблизно у 590 МеоН в СН »Сі» та повторно упарювали досуха у вакуумі, одержуючи сполуку 85 у вигляді твердої речовини жовтого кольору, яку використовували на наступній стадії без якого-небудь очищення. 29 Стадія В. До розчину циклопентанолу (614мкл, 6,7/бммоля) у ТГФ (15мл) додавали по краплях розчин фосгену

ГФ) в толуолі (1,93М, 5,9бмл, 11,502ммоля) та суміш перемішували при К.Т. протягом 2год., одержуючи циклопентилхлорформіатний реагент (7). Після цього приблизно половину розчинника видаляли, випарюючи у о вакуумі. Розчин, який залишився, світло-жовтого кольору розбавляли, додаючи СН Сі» (5мл), та концентрували до половини його первісного об'єму для гарантії видалення всього надлишкового фосгену. Потім вищевказаний 60 розчин циклопентилхлорформіатного реагенту додатково розбавляли ТГФ (15мл) та додавали дигідрохлорид аміну 85. Суміш охолоджували до бе у крижаній бані, значення рН доводили до -8,5-9, додаючи ЕБМ (по краплях) та реакційну суміш перемішували при 02 протягом год. Потім суміш розбавляли Е(ОАс, промивали водою (1 »х), насиченим Мансо» (2х), НО (2х) та соляним розчином (1 х). Органічний шар сушили над безводним Ма5О», фільтрували та упарювали у вакуумі, одержуючи піну жовто-бурштинового кольору. Після очищення за допомогою бо колоночної експрес-хроматографії (використовуючи в якості елюенту градієнт розчинників від 30905 гексану до 2090 гексану у ЕЮАс) одержували складний диметиловий ефір 8с у вигляді піни жовтого кольору, вихід 8095 (1,27г) та чистота 293905.

Стадія Г. Складний диметиловий ефір 8с (1,17г) розчиняли в суміші ТГФ/МеОН/Н 20 (20мл, співвідношення 2:1:1) та додавали водний розчин Маон (1,вмл, 1н., Текв.). Реакційну суміш перемішували при К.Т. протягом 1год., а потім упарювали досуха, одержуючи натрієву сіль 8а у вигляді твердої речовини білого кольору (-1,66бммоля). Сполуку 8а використовували на наступній стадії без додаткового очищення.

Стадія Д. Неочищену натрієву сіль ва (1,6бммоля) розчиняли у ТГФ (17мл), додавали Еї зМ та суміш охолоджували до 02 у крижаній бані. Додавали по краплях ізобутилхлорформіат (322мкл, 2,5ммоля) та суміш 70 перемішували при 02 протягом 75хв. Потім додавали діазометан (15мл) та перемішування продовжували при 02 протягом ЗОхв., а далі при К.Т. протягом ще год. Більшу частину розчинника упарювали досуха у вакуумі, суміш, яка залишилася, розбавляли ЕЇ(Ас, промивали насиченим Мансо з (2х), Н2О (2х) та соляним розчином (1х), сушили над безводним Мо5О), фільтрували та упарювали досуха, одержуючи сполуку ве у вигляді світло-жовтої піни (1,2г, «71,6бммоля). Проміжний продукт, який представляє собою діазокетон, ве 715 використовували на наступній стадії без додаткового очищення.

Стадія Е. Розчин діазокетону 8е (1,2г, 1,6бммоля), розчинений у ТГФ (17мл), охолоджували до 02 у крижаній бані. Додавали по краплях розчин водної НВг (4895, 1,24мл) та реакційну суміш перемішували при 02 протягом год. Потім суміш розбавляли Е(Ас, промивали насиченим Мансо)» (2х), Н2О (2х) та соляним розчином (1 »х).

Органічний шар сушили над безводним М950,, фільтрували та упарювали досуха, одержуючи проміжний продукт, 720 який представляє собою у-бромкетон 8ї у вигляді піни світло-жовтого кольору (-1,657ммоля).

Стадія Ж. До розчину бромкетону 87 (2,51г, 3,27ммоля) у ізопропанолі (105мл), додавали циклопентилтіосечовину 7а (565мг, З3,92ммоля) та реакційну суміш поміщали у попередньо нагріту масляну баню з температурою 702 та перемішували протягом 1,5год. Потім ізопропанол видаляли у вакуумі та продукт розчиняли сч в У ЕЮАс. Розчин промивали насиченим МансСоО»з, водою та соляним розчином, органічний шар сушили над безводним М950О05, фільтрували та випарювали, одержуючи неочищений продукт 89 (1,35г) у вигляді твердої (о) речовини світло-жовтого кольору. Неочищений продукт очищали за допомогою експрес-хроматографії на силікагелі (гексан/Е(ОАс, 11), і одержували 2,12мг білуватої твердої речовини (вихід 8090).

Стадія 3. Складний метиловий ефір 89 (1,82г, 2,2ммоля) розчиняли у розчині ТГФ/УМеОН/Н2»О (38/20/18мл) та «т зо Омиляли за допомогою ПОН хнНоО (935мг, 22,3ммоля). Здійснювали реакцію гідролізу протягом 18год. при К.Т.

Потім розчин упарювали досуха, одержуючи білувату пасту. Пасту розбавляли Е(Ас та соляним розчином. --

Значення рН суміші доводили до 6 за допомогою Ін. НСІ. ЕЮДАс-шар відокремлювали та водний шар екстрагували су двічі ЕОАс. Об'єднані Е(ОАс-екстракти промивали деїіонізованою водою (2х) та соляним розчином (1х), сушили (М950,) та упарювали, одержуючи циклічну трипептидну сполуку 101 у вигляді твердої речовини жовтого кольору со (1,76г; вихід 9990). -

Перетворення на Ма-сіль:

Сполуку 8П (106бмг; 0,132ммоля) розчиняли у Меон (20мл) та додавали 0,01н. розчин Маон (13,2мл). Прозорий розчин жовтого кольору розбавляли водою, заморожували та ліофілізували, одержуючи натрієву сіль сполуки 80 у вигляді аморфної твердої речовини жовто-білого кольору (106бмг; вихід 9790). «

М.С. (електроспрей): 799,3 (М-Н)- 801,4 (М.Н), гомогенність за даними РХВД з оберненою фазою (0,0695 ФК; (-

Ган СНЗСМ: Н2О) 9995. "Н ЯМР (400МГц, ДМСО-йв): 5 8,02 (д, 9-9,2Ггц, 1Н), 7,90 (а, 9-6,4ГЦ, 1Н), 7,76 (в, 1Н), 7,44 (вв, 2Н), )» 7,27 (а, о0-1,9гу, їн), 7,11 (а, о-7,0гу, 1Н), 7,03 (а, 9-9,2Гц, 1Н), 5,8 (да, 9-18,4, 9,9ГцЦ, 1Н), 5,43 (вв, 1), 5,15 (б о-17,8, 7,63ГЦ, 1Н), 4,70 (р5, 1Н), 4,49-4,34 (т, 2Н), 4,34-4,25 (т, 1Н), 4,13-4,03 (т, 1Н), 3,99-3,86 (т, 1Н), 3,90 (в, ЗН), 2,58-2,44 (т, 1Н), 2,42-2,32 (т, 1Н), 2,15-1,93 (т, 4Н), 1,83-1,14 (т, 24Н), -і 1,14-1,12 (т, 1Н). со Приклад 9

Використовуючи процес, описаний у прикладі 8, але застосовуючи на стадії Ж М-циклогексилтіосечовину 76, (ав) одержували натрієву сіль сполуки 102. - 50 со. їз» с-г ке й ІЩЕ: а де їй : 7 ЩЕ 1 НИ .И . бо й Сиолука 105

ТН яЯМР (400МГц, ДМСО-йв): 5 8,02 (а, 9-9,2Гц, 1Н), 7,86 (р5, 1Н), 7,78 (й, 9-7,3Гц, 1Н), 7,43 (в, 2Н), 7,27 (а, юо-2,2Гц, 1Нн), 7,12 (а, о-6,9Гц, їн), 7,03 (да, ю0-9,2, 1,9ГЦ, 1Н), 5,57-5,40 (т, 1Н), 5,40 (в, 1Н), 5,26-5,17 (т, 71Н), 4,70 (рев, 1Н), 4,52-4,35 (т, 2Н), 4,29-4,23 (т, 1Н), 4,18-4,00 (т, 1Н), 3,90 (в, ЗН), 65 3,87-3,65 (т, 1Н), 2,42-2,32 (т, 1Н), 2,19-2,10 (т, 1Н), 2,07-1,96 (т, ЗН), 1,82-0,95 (т, 28Н). МС; ев" 815,4 (МАН), ев": 813,4 (М-Н).

Приклад 10

Аналіз М53-М54А-протеази

Ферментативний аналіз, який застосовували для оцінки сполук, запропонованих у даному винаході, описаний у

ЇМО 00/09543 та УУО 00/59929).

Приклад 11

Аналіз реплікації РНК НСМУ на культурі клітин

Культура клітин:

Клітини лінії Ний7, стабільно підтримуючі субгеномний реплікон НСМ, створювали відповідно до описаного /о раніше методу (Гоптап та ін., Зсіепсе 285, 1999, стор.110-113) та позначали їх як клітинна лінія 522.3 МУО 02/052015). Клітини лінії 522.3 підтримували в модифікованому відповідно до методу Дульбеко середовищі Ігла (ОМЕМ), доповненого 10956 ФБС та мг/мл неоміцина (стандартне середовище). У процесі аналізу використовували середовище ЮОМЕМ, доповнене 1095 ФБС, яке містить 0,595 ДМСО та не містить неоміцин (середовище для аналізу). За 16бгод. до внесення сполуки клітини лінії 522.3 обробляли трипсином та розбавляли 7/5 до 50000 клітин/мл стандартним середовищем. По 200мкл (10000 клітин) вносили в кожну лунку 96-лункового планшета. Потім планшет інкубували при 372 у атмосфері з 595 СО» до наступного дня.

Реагенти та матеріали: о сч 2 о й 30 1Омкл сполуки, яку тестують, (у 100960 ДМСО) додавали до 2мл середовища для аналізу до кінцевої - концентрації ДМСО 0,595 та розчин обробляли ультразвуком протягом 15хв. та фільтрували через фільтр типу

Міййроге з розміром отворів 0,22мкм. У0Омкл вносили у ряд А титраційного планшета з поліпропілену із (ав) глибокими лунками. Ряди Б-3 містили аліквоти по 400мкм середовища для аналізу (яке містить 0,590 ДМСО) та їх со застосовували для приготування серійних розведень (1/2) шляхом переносу по 40Омкл із ряду в ряд (у ряд З не 35 вносили ніякої сполуки). -

Середовище для культури клітин аспірирували з 9б-лункового планшета, який містить клітини лінії 522.3. По 175мкл середовища для аналізу з відповідним чином розведеною сполукою, яку тестують, переносили з кожної лунки планшета, який містить сполуки, у відповідну лунку планшета, який містить культуру клітин (ряд З « застосовували в якості "контролю без інгібітору"). Планшет з культурою клітин інкубували при 372 у атмосфері з 40 59; СО» протягом 72год. З с Після 72-годинного періоду інкубації екстрагували загальну клітинну РНК із клітин лінії 522.3, які у» знаходяться у 96-лунковому планшеті, з використанням набору типу КМеазу 96 |ОіадепФ, КМеазу Напарсок. 1999). В цілому, метод полягає в наступному: середовище для аналізу повністю видаляли із клітин та у кожну лунку 96-лункового планшета з культурою клітин додавали по 10Омкл КІ Т-буфера (ОіадепФф)), який містить 143ММ 45 В-меркаптоетанолу. Мікропланшет обережно струшували протягом 20с. Потім у кожну лунку мікропланшета і додавали по 100мкл 70956-вого етанолу та перемішували піпетуванням. Лізат видаляли та вносили в лунки о планшета, який містить КМеазу 96 (ОіадепФ), який поміщали у верхню частину блоку із квадратними лунками (Сіадеп? Здапцаге-УУе!! Віоск). Планшет з КМеазу 96 запечатували скотчем та пристрій Здацаге-УУеї! ВіосК з о планшетом, який містить КМеазу 96, поміщали у тримач та вносили у роторний резервуар центрифуги 4К15С. -щ 20 Зразок центрифугували при 600боб./хв. (75600х9) протягом 4хв. при кімнатній температурі. Скотч видаляли із планшета та у кожну лунку планшета з КМеазу 96 вносили по 0,вмл КУУ1-буфера |ОіадепФ набір КМеазу 961.

Т» Планшет, який містить КМеазу 96, запечатували новим шматком скотча та центрифугували при 6бОО0Ооб./хв. протягом 4хв. при кімнатній температурі. Планшет, який містить КМеазу 96, поміщали у верхню частину іншого чистого блоку із квадратними лунками (типу Здиаге-УмМеї! Віоск), скотч видаляли та у кожну лунку планшета, який містить ЕМеазу 96, вносили по 0,8мл ЕРЕ-буфера |Оіадеп? набір ЕМеазу 96). Планшет, який містить ЕМеазу 96,

ГФ) запечатували новим шматком скотча та центрифугували при 6б000об./хв. протягом 4хв. при кімнатній температурі.

Скотч видаляли та у кожну лунку планшета, який містить КМеазу 96, вносили ще по 0,вмл КРЕ-буфера |ОіадепО де набір Кпеазу). Планшет, який містить КМеазу 96, запечатували новим шматком скотча та центрифугували при бООбоб./хв. протягом 1Охв. при кімнатній температурі. Скотч видаляли, планшет, який містить КМеазу 96, 60 поміщали у верхню частину адаптера, який містить призначені для збору зразків мікроцентрифужні пробірки об'ємом 1,2мл. РНК елюювали, з додаванням в кожну лунку по 5Омкл вільної від РНК-ази води, та запечатували планшет новим шматком скотча та інкубували протягом їхв. при кімнатній температурі. Планшет потім центрифугували при 6б000об./хв. протягом 4хв. при кімнатній температурі. Стадію елюювання повторювали, використовуючи другий об'єм рівний 5Омкл вільної від РНК-ази води. Мікроцентрифужні пробірки із загальною бо клітинною РНК зберігали при -709.

РНК оцінювали кількісно за допомогою системи ЗТОКМФ (Моїіесшаг ОСупатісвФф)), з використанням набору для кількісної оцінки РНК типу КіроСгеепте (МоїІесшаг Ргобевзбт). У цілому, метод полягає в наступному: реагент

КіробСгееп розбавляли у 200 разів ТЕ (10мМ Трис-НСІ рН-7,5, 1мММ ЕДТК). Як правило, 5Омкл реагенту розбавляли 10мл ТЕ. Зразки рибосомальної РНК для побудови стандартної кривої розбавляли в ТЕ до 2мкл/мл та потім попередньо певні кількості (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 та Омкл) розчину рибосомальної РНК переносили в новий 96б-лунковий планшет (СОЗТАК Мо3997) та об'єм доводили до 10О0мкл за допомогою ТЕ. Як правило, колонку 1 96-лункового планшета використовували для побудови стандартної кривої, а інші лунки використовували для кількісної оцінки зразків РНК. По 1Омкл кожного зразка РНК, який підлягає кількісній оцінці, переносили у 7/о Відповідну лунку 96-лункового планшета та додавали по 9ЗОмкл ТЕ. У кожну лунку 96-лункового планшета вносили по одному об'єму (100мкл) розведеного реагенту Кіробгееп та інкубували протягом 2-бхв. при кімнатній температурі, захищаючи від світла (1Омкл зразка РНК у 20Омкл кінцевого об'єму, тобто 20-кратне розведення).

Інтенсивність флуоресценції кожної лунки оцінювали за допомогою системи ЗТОКМФ (Моїіесшаг ЮупатісвФб).

Стандартні криві одержували на основі відомих кількостей рибосомальної РНК та відповідної їм інтенсивності 7/5 флуоресценції. Концентрацію РНК в експериментальних зразках визначали, виходячи зі стандартної кривої, та корегували з урахуванням 20-кратного розведення.

Реагенти та матеріали: 2 сч зв о

ОТ-ПЛР у реальному часі здійснювали за допомогою системи для аналізу послідовності АВІ Ргізт 7700 з « зо Використанням набору ТадМап Е7 К.Т.-РСК (фірми Регкіп-ЕІтег Арріїеа ВіозувіетеФ). ОТ-ПЛР оптимізували для кількісної оцінки 5-ІВЕЗ РНК НСМ за допомогою технології Тадтап (фірма Коспе Моіесціаг Оіадповіїсв бЗувіетв), (ї7 яка аналогічна методу, описаному раніше у |Мапеїй та ін. 9. Сііп. МісгобріоІЇ. 37, 1999, стор.327-3321). о

Система заснована на 5-53 нуклеолітичній активності ДНК-полімерази АтріїТад. У цілому, метод полягає в наступному: для його здійснення використовували фторогенний зонд, який гібридизується, із подвійною міткою со (РОТе-зонд), який специфічно ренатурує матрицю між ПЛР-праймерами (праймери 8125 та 7028). 5-кінецьзонда містить флуоресцентний репортер (б-карбоксифлуоресцин |(БАМІ), а 3'-кінець містить гаситель флуоресценції (б-карбокситетраметилродамін |(ТАМКАЇ). Спектр випромінювання репортера ГАМ заглушували гасителем на неушкодженому зонді, який гібридизується. Розщеплення зонда, який гібридизується, вивільняє репортер, що призводило до підвищення випромінювання флуоресценції. За допомогою аналізатора послідовності типу АВІ « 0 Рііївт 7700 безупинно здійснювали визначення підвищення випромінювання флуоресценції в процесі ше с ПЛР-ампліфікації, при цьому кількість ампліфікованого продукту прямо пропорційна сигналу. Залежність ампліфікації від часу аналізували на ранній стадії реакції, у момент часу, який відповідає логарифмічній фазі )» накопичення продукту. Точку, яка представляє собою певний поріг виявлення підвищення сигналу флуоресценції, пов'язаного з експонентним збільшенням кількості ПЛР-продукта для аналізатора послідовності, позначали як

Поріг циклу (С). Значення С є обернено пропорційним кількості введеної РНК НСМ; тобто при однакових умовах -І ПЛР чим більше вихідна концентрація РНК НСУ, тим нижче значення С. Стандартну криву будували автоматично за допомогою системи виявлення АВІ Ргізт 7700 шляхом побудови графіка залежності Со У від кожного со стандартного розведення з відомою концентрацією РНК НСУ. ав! У кожен планшет для здійснення ОТ-ПЛР вносили еталонні зразки для стандартної кривої. РНК реплікону НСМ цу синтезували (за допомогою транскрипції Т7) іп міо, очищали та кількісно оцінювали за величиною ОГово. З урахуванням того, що в мкг цієї РНК міститься 2,15 х10!! копій РНК, здійснювали такі розведення, щоб ї» одержувати 109, 107, 106, 105, 107, 103 або 102 копій геномної РНК/5мкл. У кожне розведення включали також загальну клітинну РНК лінії Ний-7 (5Онг/бмкл). 5бмкл кожного еталонного зразка (РНК реплікону -РНК Ний-7) поєднували з 45мкл реагенту Міх та застосовували у проведеній у реальному часі ОТ-ПЛР. 22 Проведену в реальному часі ОТ-ПЛР здійснювали також з використанням експериментальних зразків, які о очищали в 96 лунках планшета, який містить КМеазу, поєднуючи 5мкл кожного зразка загальної клітинної РНК із 45мкл реагенту Міх. де Реагенти та матеріали: во 65 Сполука для приготування реагенту Міх:

(мкл) "мертвий" об'єм) концентрація

Вілвавденкавяда 00065057 й Ммчодеівимму 16111181 ю

Прямий праймерсомму 01980010 ом

Свворотий праймерссмм) 01019800000000000омо (2,Бод./мкл)

Затльнийобем 01114611

Послідовність "прямого" праймера (ЗЕО) ІЮ. 1): 5 - АСО САС ААА СО ТСТ АОС САТ СОС ОТ АСТ - 3

Послідовність "зворотного" праймера (ЗЕО ІО МО. 2): 5 - ТС Со БОС АСТ СОС ААО САС ССТ АТС АОО - 3!

Примітка: Ці праймери забезпечують ампліфікацію області, яка складається з 256 нуклеотидів, яка є присутньою в 5'-четрансльованій області НСУ.

Послідовність РОТ К-зонда (ЗЕО ІО МО. 3): ЄЕАМ - ТО ТСТ СО БАА ССО сто АСТ АСА СС - ТАМКА

Контролі, які не містять матриці (КНМ): На кожному планшеті по 4 лунки використовували в якості "КНМ". сч

Для одержання таких контролів у кожну лунку замість РНК вносили 5мкл води.

Умови проведення реакції у термокомірці: (о,

ЗО 2 хв.

Що - зо С 30) хв. - 9370 5хв. о с » 9590 15 хв. |; ш 2 цикла 602 1 хв. 909 15 хв. їх 2 40 циклів т, с б02С 1 хв. )» Після завершення ОТ-ПЛР для аналізу даних необхідно визначати поріг виявлення сигналу флуоресценції для

ПЛР-планшета і для цього одержували стандартну криву шляхом побудови графіка залежності значення С, від

Кількості копій РНК, які застосовують у кожній еталонній реакції. Значення С у, отримані для зразків, які -І аналізували, використовували для визначення шляхом інтерполяції кількості копій РНК на основі стандартної кривої. со І, нарешті, кількість копій РНК стандартизували (на основі кількісної оцінки РНК, яку екстрагували з ав! лунки із клітинною культурою, за допомогою набору Кіробгееп КМА) та виражали у вигляді геномних цу еквівалентів/мкг загальної РНК (г.е./мкгі.

Кількість копій РНК (г.е./мкг| для кожної лунки планшета з культурою клітин приймали за міру кількості

Чл» РНК НСМ, яка реплікується, у присутності різних концентрацій інгібітору. Інгібування у 95 розраховували за допомогою наступного рівняння: 100 - Кг.е /мкг інг)Хг.е./мкг контр)х 100).

Для обробки даних залежності інгібування від концентрації застосовували засновану на моделі Хіла апроксимацію нелінійної кривої, та значення концентрації, яка забезпечує 5095-ву ефективність (5095-ве о інгібування) (ЕСво) розраховували за допомогою програмного забезпечення 5А5 (Зіайівіїса! Зоїмаге Зузіет; ЗАЗ іме) Іпзійше, Іпс. Кері, шт. Північна Кароліна).

Приклад 12 60 Аналізи специфічності

Аналізи специфічності, які використовуються для оцінки вибірковості дії зазначеної сполуки, відповідають описаним у (МО 00/09543).

Приклад 13

Фармакокінетичні властивості 65 Сполуки, запропоновані в даному винаході, мають також задовільні фармакокінетичні властивості, такі як значні рівні в плазмі пацюків через 1 та 2год. після орального введення дози 5мг/кг.

Більш конкретно, для оцінки рівнів у плазмі пацюків сполук, які тестують, після орального введення застосовували наступний аналіз, заснований на оцінці іп мімо абсорбції після орального введення:

Матеріали та методи: 1. Метод, який застосовували для угрупування сполук (відбір за допомогою "касет"):

Відбір сполук, призначених для об'єднання в "касету, був заснований на їхній структурній подібності та фізико-хімічних властивостях. Був розроблений метод твердофазної екстракції, який є застосовним для всіх відібраних сполук. Дані початкового тестування, при якому кожну сполуку вводили в плазму пацюків та за допомогою РХВД або РХВД-МС аналізували кожну сполуку, взяту в концентрації О,5мкм, з визначенням часу /о Утримання, іонної маси та можливості розділення сполук за допомогою РХВД та/або РХВД/МС, використовували для об'єднання 3-4 сполук в одну "касету". 2. Підготовка носія та сполуки для орального введення:

Кожна "касета" містила 3-4 сполуки, кожна в концентрації 5 або 4мг/кг. Касету приготовляли у вигляді суспензії для орального введення, яка містить 0,595 водної метилцелюлози та 0,395 поліоксіетилен(20)сорбітанмоноолеату (Твін-80).

Об'єм дози, яка вводиться, становив 1Омл/кг і її вводили через оральний шлунковий зонд. 3. Дози, які застосовували, та відбір зразків плазми:

Самців пацюків 5ргадце ЮОамлеу утримували в індивідуальних клітках протягом ночі, та тварини мали доступ до водної 1095-вої декстрози. Кожну "касету" вводили 2 пацюкам. Зразки плазми («Тмл) одержували через 1 та ?год. після обробки в кожного із двох пацюків та поєднували для екстракції та аналізу. 4. Екстракція та аналіз сполук:

Для кожної "касети" зразки плазми, отримані через 1 та 2год., зразки контрольної плазми, зразки контрольної плазми, у яку вводили всі сполуки, кожну в концентрації О,5мкм, екстрагували за допомогою методу твердофазної екстракції. Для порівняння зразки аналізували за допомогою РХВД та РХВД/МС. Концентрації в сч об плазмі визначали на основі однієї концентрації стандарту, яка становить 0,5мкм. ій хи -.- . ; Те (ав) ее а, у і р. ї- 0 вк ЗОН 0 Гпнклоагджиш |цнжнбпантня ІЗ З і»

При оцінці сполук, запропонованих у даному винаході, за допомогою описаних вище ферментативних аналізів та аналізів клітинних культур, виявлена їхня висока активність. Більш конкретно, встановлено, що значення ІС во

Не - сполук становили менше 0,01мкМ при аналізі М53-М54А-протеази, а значення ЕСсо становили менше 0,01мкМ при аналізі реплікації РНК НСМУ на культурі клітин. (ее) При аналізі специфічності сполук встановлено, що сполуки формули | мають вибіркову дію, тобто вони не о володіють вираженою інгібувальною активністю по відношенню до еластази людських лейкоцитів та катепсина В.

При здійсненні фармакокінетичного аналізу на пацюках раптово було встановлено, що при використанні дози -о 70 5мг/кг у метоцелі: Твін 209 (0,590:0,395) одержували високі концентрації в плазмі. Для сполук 101 та 102 величина

ГТ» площі під кривою (АС) становила 16 та 18мкМ-год. відповідно, у той час як для їхніх найближчих аналогів величина АОС становила 0,8-4,5мкМ-год. Це несподіване та важливе підвищення проникнення сполук у плазму пацюків робить ці сполуки дуже перспективними в якості можливих лікувальних засобів, які можна вводити оральним шляхом. о

Claims (15)

Формула винаходу іме)

1. Сполука формули (1): 60 б5

Мео що | Ше я М 70 шо М М щ о х а во н о й М 2о о х о в 5-х й н к- о сч у якій В ! означає гідрокси або МНОЗО»В'М, де В'ЯА означає С.-Свалкіл, Сз-Стциклоалкіл або (3

С.-Салкіл-С3-С,циклоалкіл, які всі необов'язково заміщені 1-3 замісниками, вибраними з ряду, який включає галоген, ціано, нітро, ОС.--Свалкіл, амідо, аміно або феніл, або ВА означає Св- або С.ірарил, необов'язково заміщений 1-3 замісниками, вибраними з ряду, який включає галоген, ціано, нітро, С 1-Свалкіл, ОС.-Свалкіл, «г амідо, аміно або феніл; В2 означає Сб5-Свциклоалкіл та ВЗ означає циклопентил; або її фармацевтично прийнятна сіль. --

2. Сполука за п. 1, яка відрізняється тим, що В! означає гідрокси або МНЗО»В М, де КА означає Сі-Свалкіл,) «З С3-Сциклоалкіл або С.-Свалкіл-С3-Сциклоалкіл, які всі необов'язково заміщені 1-3 замісниками, вибраними з со ряду, який включає галоген, нітро або ОС 3-Свалкіл, або феніл, необов'язково заміщений 1-3 замісниками, вибраними з ряду, який включає галоген, нітро, С4і-Свалкіл або ОС.-Свалкіл. -

3. Сполука за п. 2, яка відрізняється тим, що БК! означає МНЗО»В'М, де КА означає метил, етил, циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклопропілметил, циклогексилетил, ССіІз, СЕз, феніл, 2-фторфеніл або 4-метилфеніл. «

4. Сполука за п. 3, яка відрізняється тим, що ВА означає циклопропіл. З

5. Сполука за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що В! означає гідрокси.

с

6. Сполука за будь-яким одним з пп. 1-5, яка відрізняється тим, що В2 означає циклопентил. 1»

7. Сполука за п. 1, яка відрізняється тим, що має формулу 101: -І (ее) (ав) - 50 ГТ» (Ф) ко бо б5

Ме (101). | ох ще Н МІ М МІ ї Зв, ін хв о Н

М М. о ан о У о з М о Н с о

8. Сполука за п. 1, яка відрізняється тим, що має формулу 102: Ме (102). « | не «- «в) Н -4 М М М со що | г - о ХМ в г. « о но - М М І» з, о ан - 7 о щ- о з М (ее) Н о о - 50 чз»

9. Сполука за п. 1, яка відрізняється тим, що має формулу 103: Ф) іме) 60 б5

Ме (105) | Ш- ще М ц ш п Х Н

М М. мо; о в; з М с іо)

10. Фармацевтична композиція, яка містить ефективну відносно вірусу гепатиту С кількість сполуки формули (І) за будь-яким одним з пп. 1-9 або її фармацевтично прийнятної солі у суміші з фФармацевтично прийнятним середовищем носія або допоміжною речовиною.

11. Фармацевтична композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що додатково містить терапевтично ефективну З кількість одного або декількох інших агентів, які мають активність по відношенню до НСУ. «--

12. Фармацевтична композиція за п. 11, яка відрізняється тим, що інший агент, який є активним по о відношенню до НСУ, вибирають з: -і або пегильованого - . д Д р со. - інтерферону а- інтерферону со

13. Фармацевтична композиція за п. 11 або 12, яка відрізняється тим, що інший агент, який є активним по відношенню до НСУ, являє собою рибавірин. -

14. Фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 11, 12 або 13, яка відрізняється тим, що інший агент, який має активність по відношенню до НСМ, вибирають з інгібіторів: гелікази, Н5З2/3З-протеази та внутрішнього сайту входу в рибосому (ІКЕ5). «

15. Фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 11, 12 або 13, яка відрізняється тим, що інший агент, який має активність по відношенню до НСУ, являє собою інгібітор НСМ-полімерази. - с І» -І (ее) («в) - 50 с» Ф) іме) бо б5