UA75064C2 - Modified porcine factor viii and its therapeutic use - Google Patents

Description

Опис винаходу

Згортання крові починається, коли тромбоцити прилипають до розрізаної стінки пораненої кров'яної судини 2 ва ділянці ураження. Далі, у каскаді регульованих ферментами реакцій, розчинні молекули фібриногену перетворюються ферментом тромбіном у нерозчинні волокна фібрину, що тримають тромбоцити разом у тромбі.

На кожному етапі у каскаді білююовий попередник перетворюється у протеазу, що розщеплює наступний білковий попередник у серії. Кофактори потрібні на більшості етапів.

Фактор МІ! циркулює у крові як неактивний попередник, контактно та нековалентно зв'язаний з фактором вон 70 Віллебранда. Фактор МІ протеолітично активується тромбіном або фактором Ха, який відщеплює його від фактору вон Віллебранда та активує його прокоагуляційну функцію у каскаді. У своїй активній формі білковий фактор МІШа є кофактором, що збільшує величину каталітичної ефективності фактору ІХа стосовно активації фактору Х на кілька порядків.

Люди з нестачею фактору МІІЇ або антитілами проти фактору МІ, яких не лікують фактором МІЇЇ, потерпають 12 від неконтрольованої внутрішньої кровотечі, що може викликати ряд серйозних симптомів, від запальних реакцій у суглобах до ранньої загибелі. Суворі гемофілії, число яких складає приблизно 10000 у Сполучених штатах, можна лікувати вливанням фактору МІ людині, що відновлюватиме здатність до нормального згортання крові при уведенні з достатньою частотою та у достатній концентрації. Класичне визначення фактору МІ! фактично полягає в тому, що присутня у нормальній плазмі крові речовина, що нейтралізує нестачу згортання у плазмі, походить від осіб з гемофілією А.

Утворення антитіл ("інгібіторів" або "інгібувальних антитіл"), що інгібують активність фактору МІ є серйозним ускладненням у допомозі пацієнтам з гемофілією. Автоантитіла розвиваються у приблизно 2090 пацієнтів з гемофілією А у відповідь на терапевтичні вливання фактору МІ. У нелікованих перед тим пацієнтів з гемофілією А, у кого розвиваються інгібітори, інгібітор звичайно розвивається в межах одного року с лікування. Крім того, автоантитіла, які інактивують фактор МІ, іноді розвиваються у осіб з нормальними Ге) перед тим рівнями фактору МІ. Якщо титр інгібітору є достатньо низьким, пацієнтам можна надавати допомогу збільшенням дози фактору МІІЇ. Однак, часто титр інгібітору є таким високим, що його не можна придушити фактором МІ. Альтернативна стратегія полягає в обході необхідності фактору МІ при нормальному гемостазі, використовуючи комплексні препарати фактору ІХ (наприклад, КОМУМЕ", Ргоріех") або рекомбінантний фактор З

Ма людини. Крім того, оскільки фактор МІ свині звичайно має суттєво меншу реактивність стосовно («о інгібіторів, ніж фактор МІІЇ людини, використано частково очищений препарат фактору МІ! свині (НМАТЕ:СУ).

Багатьох пацієнтів, які мають розвинені інгібувальні антитіла стосовно фактору МІ людини, успішно о вилікували фактором МІЇЇ свині, Її вони залишилися толерантними стосовно такого лікування протягом довгого ою періоду часу. Однак, застосування фактору МІ свині не є повним вирішенням проблеми, оскільки щодо фактору

МІ свині після одного чи більше вливань у деяких пацієнтів можуть розвиватися інгібітори. в

Кілька препаратів похідного з плазми людини фактору МІ різного ступеню чистоти є комерційно доступними для лікування гемофілії А. Вони включають частково очищений фактор МІ, похідний з поєднаної крові багатьох донорів, що оброблено теплом та детергентами проти вірусів, але містять значний рівень антигенних білків; « очищений моноклональними антитілами фактор МІЇЇ, що має нижчі рівні антигенних забруднень та зараження З 50 вірусами; та рекомбінантний фактор МІ! людини, клінічні дослідження якого проводять. На жаль, фактор МІЇ с людини є нестабільним при фізіологічних концентраціях та рН і присутній у крові у надзвичайно низький

Із» концентрації (0,2мкг/мл плазми) та має низьку специфічну активність щодо згортання. Вимоги здоров'я людей стосовно ризику вірусних або інших присутніх у крові забруднень обмежують придатність фактору МІЇЇ свині, очищеного від крові свині.

Гемофіліки для попередження кровотечі та утвореної деформуючої гемофільної арторопатії потребують це. поновлення фактору МІ кожної доби. Однак, поновлення виявилося недостатнім, а проблеми терапевтичного 4! використання мають місце внаслідок труднощів виділення та очистки, імуногенності та необхідності позбавлення від ризику інфекції СНІДу та гепатиту. Використання рекомбінантного фактору МІЇЇ людини або частково о очищеного фактору МІ! свині не розв'яже усіх цих проблем.

Ге»! 20 Проблеми, пов'язані зі звичайно використовуваним, комерційно доступним похідним з плазми фактором МІЇЇ стимулювали значний інтерес стосовно розробки кращого продукту фактору МІ. Існує необхідність у потужнішій

Т» молекулі фактору МІ, щоб на кожну молекулу можна було забезпечити більше елементів активності згортання; молекулі фактору МІ, що є стабільною при вибраних рН та фізіологічній концентрації; молекулі фактору МІП, що є менш здатна для виклику продукування інгібувальних антитіл; та молекулі фактору МІ, що уникає імунного 22 впізнавання у пацієнтів, які вже мають набуті антитіла до фактору МІЇЇ людини.

ГФ) В основу винаходу поставлена задача розробити фактор МІ, що коректує гемофілію у пацієнту з нестачею фактору МІ або з наявністю інгібіторів стосовно фактору МІЇЇ людини. о Ще одна задача - розробити способи лікування гемофілії.

Ще одна задача - розробити фактор МІІІ, що є стабільним при вибраних рнН та фізіологічній концентрації. 60 Ще одна задача - розробити фактор МІ, що має більшу активність стосовно коагуляції, ніж фактор МІ людини.

Ще одна задача - розробити фактор МІІІ, проти якого продукується менше антитіл.

Крім, того задачею винаходу є розробити спосіб створення рекомбінантного фактору МІ! свині, а особливо, модифікованого фактору МІ! свині. бо Визначення повної послідовності ДНК, що кодує фактор МІЇЇ свині, наведене тут, дало змогу, по-перше,

синтезувати фактор МІЇЇ свині повної довжини експресією ДНК, що кодує фактор МІ свині у придатній клітині хазяїна. Згідно з ще одним аспектом представленого винаходу запропоновано очищений рекомбінантний фактор

МІ свині. ДНК, що кодує кожний домен фактору МІ свині, а також будь-який її певний фрагмент, можна експресувати подібно. Більш того, МІ (фактор МІ) свині, в якому видалений увесь домен В (МІ свині без домену В) чи його частина, зроблений доступним як частина представленого винаходу, експресією ДНК, що кодує МІЇЇ свині, в якому видалено один чи більше кодонів домену В.

Також запропоновано фармацевтичні композиції та способи лікування пацієнтів з нестачею фактору МІ, що включають застосування рекомбінантного фактору МІ свині або модифікованого рекомбінантного фактору МИ 7/о вині, зокрема, фактору МІЇЇ свині без домену В.

ФігЛА-1Н разом представляють порівняння суміщених послідовностей кислот факторів МІ людини, свині та миші.

Визначення вжитих термінів.

Якщо не визначено чи показано інше, "фактор МІ!" позначає будь-яку функціональну молекулу білку фактору

МІ від будь-якого ссавця.

Якщо не визначено інше "фактор МІ ссавця" включає фактор МІІІ з амінокислотною послідовністю, похідною від будь-якого ссавця окрім людини. "Тварина" стосується свині та інших ссавців окрім людини. "Конденсований білок" або "конденсований фактор МІ або його фрагмент" - це продукт гібридного гена, в якому кодуюча послідовність для одного білку є зміненою, наприклад, об'єднанням її частини з кодуючою 2о послідовністю для другого білку з відмінного гена у належному регістрі рамки зчитування так, щоб могли відбуватися нерозірвані транскрипція та трансляція об'єднаних сегментів для утворення гібридного гена, що кодує конденсований білок. "Відповідна" нуклеїнова кислота або амінокислота або послідовність будь-якої з них - це те, що представлено на сайті у молекулі фактору МІ! або її фрагменті, що має таку ж структуру та/або функцію, як сч сайт у молекулі фактору МНІ іншого виду, хоча число нуклеїнових кислот або амінокислот може не бути ідентичним. Послідовність ДНК "що відповідає" іншій послідовності фактору МІ, по суті стосується такої (8) послідовності, та гібридизується з послідовністю призначеної ЗЕО ІЮ МО в жорстких умовах. Послідовність ДНК "що відповідає" послідовності іншого фактору МІ, також включає послідовність, що призводить до експресії фактору МІП або його фрагменту і яку можна було б гібридизувати з призначеною 5ЕО ІЮ МО, але для «Е зо надлишковості генетичного коду. "Неповторювані" амінокислотний залишок або послідовність стосується амінокислотної послідовності або со залишку у молекулі фактору МІ! одного виду, що відрізняються від гомологічного залишку або послідовності у о молекулі фактору МІЇЇ іншого виду. "Специфічна активність" стосується активності, що коректуватиме дефект стосовно коагуляції плазми о

Зб людини з нестачею фактору МІ. Специфічну активність вимірюють у одиницях активності стосовно згортання на ї- міліграм загального білку фактору МІ у стандартному дослідженні, в якому час згортання плазми людини з нестачею фактору МІІЇ порівнюють з часом для плазми нормальної людини. Одна одиниця активності фактору

МІ є активністю, представленою у одному мілілітрі плазми нормальної людини. У дослідженні скорочення часу утворення тромбу вказує на більшу активність аналізованого фактору МІ. Фактор МІЇЇ свині має активність « стосовно коагуляції у дослідженні фактору МІЇЇ людини. з с "Експресія" стосується суми процесів, що відбуваються при використанні генетичної інформації для утворення продукту. ДНК, яка кодує амінокислотну послідовність фактору МІ! свині., може "експресуватися" у ;» клітині ссавця-хазяїна для утворення білку фактору Міп свині. Матеріали, генетичні структури, клітини хазяїна та умови, що дозволяють відбуватися експресії даної послідовності ДНК, добре відомі в рівні техніки, і ними

Можна маніпулювати для впливу на час та інтенсивність експресії, а також внутрішньо- або зовнішньо-клітинну -І локалізацію експресованого білку. Наприклад, включенням ДНК, що кодує сигнальний пептид на 5' закінченні

ДНК, що кодує фактор МІ свині (5 закінчення за домовленістю означає закінчення, що кодує МН »-закінчення о білку), експресований білок починає переходити зсередини клітини хазяїна у культиваційне середовище. о Забезпечення кодуючої сигнальний пептид ДНК у комбінації з фактором МІ! свині надає кодуючій ДНК перевагу, 5ор оскільки експресований фактор МІ переходить у культиваційне середовище, що спрощує процес очистки.

Ме, Кращим сигнальним пептидом є сигнальний пептид фактору МІЇЇ ссавця. ї» Нуклеотидні та передбачувані амінокислотні послідовності КДНК фактору МІ людини показані у БЕО ІЮО МО: 1 та 2, відповідно. Фактор МІ синтезується як білок розміром приблизно ЗО00кДа з одиничним ланцюгом з внутрішньосистемною гомологією послідовності, що позначає послідовність "домену" дво МН2о-АТ-А2-В-АЗ-С1-С2-СООН. У молекулі фактору МІЇЇ, "домен" - це безперервна послідовність амінокислот, що визначається ідентичністю внутрішньої амінокислотної послідовності та сайтами протеолітичного розщеплення

Ф) тромбіном. Якщо не визначено інше, домени фактору МІЇЇ включають наступні амінокислотні залишки, коли ка послідовності суміщають з амінокислотною послідовністю людини (5ЕО ІЮ МО:2): АЇІ, залишки АїІаІ-Ага372; Аг, залишки бег373-Аг9740; В, залишки Зег/41-Аго1648; АЗ, залишки бег1690-Пе2032; СІ, залишки Ага2033-Азп2172; во С2, залишки Зег2173-Туг2332. Послідовність АЗ-С1-С2 включає залишки Зег1690-Туг2332. Залишковий сегмент, залишки СІш1649-Аго1689, звичайно позначають як невеликий ланцюг активаційного пептиду фактору МІ. Фактор

МІ протеолітично активується тромбіном або фактором Ха, який відщеплює його від фактору вон Віллебранда, утворюючи фактор МПа, який має прокоагуляційну функцію. Біологічна функція фактору МПа полягає у збільшенні каталітичної ефективності фактору ІХа стосовно інтенсивності активації фактору Х на кілька 65 порядків. Активований тромбіном фактор МПа є гетеротримером розміром 160кДа АТ/А2/АЗ3-С1-С2, що утворює комплекс з фактором ІЇХа та фактором Х на поверхні тромбоцитів або моноцитів. "Частковий домен" - це безперервна послідовність амінокислот, що утворює частину домену. "Субелементи" фактору МІ людини або тварини - великі та невеликі ланцюги білку. Великий ланцюг фактору

МІ містить три домени, А1, А2, та В. Невеликий ланцюг фактору МІЇ! також містить три домени, АЗ, СІ, та С2.

Терміни "епітоп, "антигенний сайт" та "антигенний детермінант" використовуються як синоніми та означають, яка частина фактору МІ людини або тварини або його фрагменту специфічно розпізнається антитілом. Він може складатися з будь-якого числа амінокислотних залишків та може бути залежним від первинної, вторинної, або третинної структури білку.

Термін "імуногенний сайт" означає регіон фактору МІ людини або тварини чи його фрагменту, що 7/0 бпецифічно викликає продукування антитіла до фактору МІП, або фрагменту у людини або тварини, як виміряно такими звичайними способами, як імунодослідження, наприклад, ЕГІ5А (ферментний іїмуносорбентний аналіз), або описаний тут аналіз Бетезда. Він може складатися з будь-якого числа амінокислотних залишків та може бути залежним від первинної, вторинної, або третинної структури білку. У деяких втіленнях гібридний фактор МІЇЇ або гібридні еквіваленти фактору МІІЇ або його фрагменту є неімуногенними або менш імуногенними у тварин або /5 ЛЮДИНИ, ніж фактор МІЇІЇ людини або свині. "Нестача фактору МИ" означає нестачу активності стосовно згортання, викликану продукуванням дефективного фактору МІ, неадекватним продукуванням фактору МІ чи відсутністю продукування, або частковим чи повним інгібуванням фактору МІ! інгібіторами. Гемофілія А є типом нестачі фактору МІ в результаті дефекту у Х-зв'язаному гені та відсутності або нестачі білку фактору МІ, що він кодує. "Діагностичні дослідження" включають дослідження, що деяким чином використовують взаємодію антиген-антитіло для визначення та/або вимірювання кількості певного антитіла, що представляє тест-зразок, для допомоги у виборі лікувальної терапії. Багато таких досліджень відомо фахівцям. ДНК фактору МІ людини, свині або модифікованого фактору МІ свині або їх фрагменту та білок, експресований з неї, повні або неповні, може замінювати відповідні реагенти у інших відомих дослідженнях, отже, можна використовувати сч Модифіковані дослідження для визначення та/або вимірювання антитіл до фактору МІ. Використання цих реагентів, ДНК фактору МІ або його фрагменту чи білку, експресованого з неї, дозволяє модифікацію відомих і) досліджень для визначення антитіла до фактору МІ людини або тварини. Такі дослідження включають, але без обмеження, ЕГІ5А, дослідження імунодифузії та імуноблотування. Придатні способи здійснення на практиці будь-яких з цих досліджень відомі фахівцям. Фактор МІ або його фрагмент, що включає щонайменше один «г зо епітоп білку, можна використовувати як діагностичний реагент. Приклади інших досліджень, в яких можна використовувати фактор МІ людини, свині або модифікований фактор МІЇЇ свині або їх фрагмент, включають ісе) дослідження Бетезда та антикоагуляційні дослідження. о

Термін "ДНК, що кодує такий білок, як фактор МІЇЇ свині" означає полідезоксинуклеїнову кислоту, чия нуклеотидна послідовність заключає в собі кодуючу інформацію для клітини-хазяїна стосовно амінокислотної о послідовності білку, наприклад фактору МІЇЇ свині, згідно з відомими залежностями генетичного коду. ї- "Продукт експресії" ДНК, що кодує фактор МІ людини або тварини або модифікований фактор МІ є продуктом, отриманим експресією згаданої ДНК у придатній клітині хазяїна, включаючи наступні особливості до- або після-трансляційної модифікації білку, кодованого згаданою ДНК, що включають, але без обмеження, глікозилування, протеолітичне розщеплення тощо. В рівні техніки відомо, що такі модифікації можуть « відбуватися і можуть дещо відрізнятися залежно від типу клітини-хазяїна та інших факторів, і вони можуть з с давати молекулярні ізоформи продукту зі збереженням прокоагуляційної активності. Дивися, наприклад, І іпа, Р. . еїа!., Еаг. 9. Віоспет. 232:1927 (1995), що надано тут як довідку. и?» "Вектор експресії" є елементом ДНК, часто циклічної структури, що здатний до автономної реплікації у потрібній клітині хазяїна або до інтеграції у геном клітини-хазяїна, а також володіючий деякими добре відомими особливостями, які дозволяють експресію кодуючої ДНК, вставленої у вектор послідовності у -І належному сайті та у належній орієнтації. Такі особливості можуть включати, але без обмеження, одну чи більше послідовностей промотеру для керування ініціюванням транскрипції кодуючої ДНК та таких інших елементів ДНК, о як енхансери, сайти поліаденілування тощо, які усі добре відомі в рівні техніки. Термін "вектор експресії" о використовують як для позначення вектору, що має кодуючу послідовність ДНК, що має бути ексресована, Ввставлену в його послідовність, так і вектор, що має потрібні елементи керування експресією, щоб розташувати

Ме, з огляду на сайт вставки, які можуть слугувати для експресії будь-якої кодуючої ДНК, вставленої у сайт, які ї» усі добре відомі в рівні техніки. Отже, наприклад, вектор, що втратив промотер, може стати вектором експресії шляхом вставки промотеру у комбінації з кодуючою ДНК.

Загальний опис способів

Патент США Мо5364771 описує відкриття гібридної молекули фактору МІЇЇ людини/свині, що має активність стосовно коагуляції, в цій молекулі елементи молекули фактору МІ людини або свині заміщують відповідні

Ф) елементи молекули фактору МІ іншого виду. Патент США Мо5663060 описує прокоагуляційні гібридні молекули ка людини/тварини та гібридні еквівалентні фактору МІ молекули, в яких елементи молекули фактору МІЇЇ одного виду заміщують відповідні елементи молекули фактору МІ іншого виду. во Оскільки сучасна інформація свідчить, що домен В не має інгібувального епітопу та має невідомий вплив на функцію фактору МІ, у деяких втіленнях домен В є повністю або частково видаленим у активній гібридній молекулі або гібридній еквівалентній фактору МІ! молекулі або її фрагменті ("В(-) фактор МІ") виготовлених будь-яким зі способів, описаних тут.

Ген фактору МІЇ людини виділяли та експресували у клітинах ссавця, як описано Тооіе, .).). еї а. (1984) 65 Майте 112: 342-347 (Сепепіїсв Іпвійше); сії8спіег, У. еї аІ(1984) Майте 312: 326-330 (Сепепіесі); УУоса,

МУ. еї а. (1984) Майте 312: 330-337 (Сепепіесп); Мепаг, С.А. еї аїЇ. (1984) Майте 312: 337-342

(Сепепіесп); МО 87/04187; МО 88/08035; МО 88/03558; Патент США Мо4757006, а амінокислотну послідовність встановлено за кКДНК. Патент США Мо4965199, що належить Сароп еї аі., розкриває спосіб виготовлення фактору МІ з рекомбінантною ДНК у клітинах ссавця-хазяїна та очистку фактору МІ людини. Показано експресію фактору МІЇЇ людини у клітинах СНО (яєчнику китайського хом'яка) та клітинах ВНКС (нирок дитинчати хом'яка). Фактор МІЇЇ людини модифіковано для видалення частини або усіх доменів В |Патент США Мо48681121, і здійснена спроба заміщення домену В фактору МІЇЇ людини доменом В фактору М людини (Патент США

Мо50048031. Послідовність КДНК, що кодує фактор МІІЇ людини, та передбачувана амінокислотна послідовність показані у ЗЕО ІЮ МО:1 та 2, відповідно. У ЗЕО ІЮО МО, кодуючий регіон починається на нуклеотидній позиції 7/0 208, триплеті ССС, що є кодоном амінокислоти під номером 1 (Ага) розвиненого білку, який представлено послідовністю ЗЕО ІЮ МО:2.

Фактор МІ свині виділено з плазми |Разз, О.М. еї аїЇ. (1982) Віоо4 59:594|. Часткова амінокислотна послідовність фактору МІ свині, відповідна частинам М-кінцевої послідовності невеликого ланцюга, що гомологічні церулоплазміну, та фактор коагуляції М були описані Спигсп еї аї. (1984) Ргос. Май). Асай. збі. 7/5 ЗА. 81:6934. Тооіе, 9У.). еї аі. (1984) Майте 312:342-347 описали часткове секвенсування М-кінцевого закінчення чотирьох амінокислотних фрагментів фактору МІ свині, але не охарактеризували фрагменти, які у молекулі фактору МІ розташовані далі. Амінокислотні послідовності домену В та частини А2 домену фактору

МІ свині описані Тооіе, 9.3. еї аі. (1986) Ргос. Май. Асай. 5сі, ОБА 83:5939-5942. Послідовність КДНК, що кодує повний домен А2 фактору МІ свині та передбачувану амінокислотну послідовність і гібридний фактор МІЇЇ людини/свині, що має заміщення усіх доменів, усі субелементи та специфічні амінокислотні послідовності, були розкриті у Патенті США Мо5364771 під назвою "Нубгіїй Нитап/Рогсіпе Тасіог МІ" (Гібридний фактор МИ людини/свині), отриманий 15 листопада 1994, та у УМО 93/20093 опублікований 14 жовтня 1993. Послідовність

КДНК, що кодує домен А2 фактору МІ свині, відповідний залишкам 373-740 у розвиненому факторі МІЇЇ людини, який показано у ЗЕО ІЮ МО:1, та передбачувана амінокислотна послідовність показані у ЗЕО ІЮО МО: З та 4, с відповідно. Пізніше, нуклеотидні та відповідні амінокислотні послідовності частини домену Ат, що втратив першу 198 амінокислоту та домену А2 фактору МІ свині описані у УУО 94/11503, опублікованому 26 травня 1994. і)

Повну нуклеотидну послідовність, що кодує фактор МІЇЇ свині, включаючи повний домен АТ, активаційний пептид, домени АЗ, С1 та С2, а також кодовану амінокислотну послідовність, під кінець отримав ГоїІаг, як це розкрито у Патенті США Мо5859204, отриманому 12 січня 1999, та у УМО 97/49725, опублікованій 31 грудня 1997, що надані « зо тут як довідка.

Фактор МІ свині та фактор МІ людини виділяють з плазми як два субелементні білки. Субелементи, відомі со як великий ланцюг та невеликий ланцюг, утримуються разом нековалентним зв'язком, що потребує іонів кальцію (у або іонів іншого двовалентного металу. Великий ланцюг фактору МІЇЇ містить три домени, АТ, А2 та В, які зв'язані ковалентно. Невеликий ланцюг фактору МІ! також містить три домени, позначені як АЗ, С1 та С2. Домен о

В має невідому біологічну функцію і його можна видалити, або частково видалити з молекули протеолітично або ї- способами з використанням рекомбінантної ДНК без значної зміни у будь-якому вимірюваному параметрі фактору МІЇЇ. Рекомбінантний фактор МІ людини має структуру та функцію, подібну до похідного з плазми фактору МІ, хоча він не глікозилований, якщо не експресований у клітинах ссавця.

Активований фактор МІ свині та фактор МІ людини ("фактор МіМПа") має три субелементи внаслідок « розщеплення великого ланцюга між доменами А1 та А2. Ця структура позначена як АТ/А2/АЗ-С1-С2. Фактор Ма п) с людини є нестабільним в умовах, що стабілізують фактор МПа свині, ймовірно внаслідок слабшого зв'язку субелементу А? фактору Мійа людини. Дисоціація субелементу А2 фактору МіМПа свині та людини пов'язана з ;» втратою активності молекули фактору Мійа. мМакпузем, А. еї аї. (1997) Віоса, 90: Биррі. 1, реферат Мо126, описали зв'язування домену А2 білком, спорідненим з рецептором ліпопротеїну низької густини, підказуючи, що поглинання клітиною А2, опосередковане таким зв'язуванням, призводить до понижувальної регуляції активності -І фактору МІ.

Експресію "фактору МІЇ без домену В" посилюють включенням частини домену В. Включення цих частин о домену В, позначених як "ЗО" (па, Р. еї аїЇ. (1995) вище), призводить, як описано, до кращої експресії. о Констракти "500" не мають усіх доменів В людини за винятком 5 амінокислот М-закінчення домену В та 9 амінокислот С-закінчення домену В.

Ме, Очищений гібридний фактор МІ або його фрагмент можна досліджувати на імунореактивність та активність ї» стосовно коагуляції стандартними дослідженнями, включаючи, наприклад, дослідження з вільним від плазми фактором МІ, одноетапне дослідження згортання, та імуносорбентне дослідження зі зв'язаним ферментом, використовуючи очищений рекомбінантний фактор МІІЇ людини як стандарт.

Інші вектори, включаючи плазмідні та евкаріотні вірусні вектори, можна використовувати для експресії рекомбінантного генного констракту у евкаріотні клітини залежно від рішення та розсуду фахівця в цій області (Ф) дивися, наприклад, ЗатбгооК еї а!., Спаріеєг 16). Інші вектори та експресійні системи, включаючи клітинні ка системи бактерій, дріжджів та комах, використовувати можна, але гірше внаслідок відмінностей у глікозилуванні або його відсутності. во Рекомбінантний білок фактору МІ! можна експресувати у різноманітних клітинах, звичайно використовуваних для культивації та експресії рекомбінантного білку ссавця. Зокрема, виявлено, що ряд ліній клітин гризунів є особливо корисними хазяями для експресії великих білків. Кращі лінії клітин, доступні з Американської колекції типових культур (АТСС, КосКкмПШе, МО), включають клітини нирок дитинчати хом'яка та клітини яєчнику китайського хом'яка (СНО), які культивують, використовуючи звичайні способи та середовища. 65 Базисом для більшої активності стосовно коагуляції фактору МІ свині є більш швидка спонтанна дисоціація субелементу А? людини з фактору Мійа людини у порівнянні з субелементом А2 свині з фактору Ма свині.

Дисоціація субелементу А? призводить до втрати активності, (оМаг, Р. еї аї. (1990) у. ВіоЇ Спет. 265:1688-1692; І оПаг, Р. еї аїЇ. (1992) 9. Віої. Спет. 267:23652-23657; Рау, РУ. еї аї. (1992) 9. Віої. Спет. 267:13246-132501.

Молекули фактору МІ зі зменшеною імунореактивністю

Епітопи, що є імунореактивними стосовно антитіл, що інгібують активність стосовно коагуляції фактору МІЇЇ

Сінгібітори" або "Інгібувальні антитіла") охарактеризовано на базі відомих взаємовідношень структура-функція у факторі МІ. Ймовірно, інгібітори могли б діяти руйнуванням будь-якої з макромолекулярних взаємодій, пов'язаних зі структурою домену фактору МІ або їх зв'язуванням з фактором вон Віллебранда, тромбіном, 7/0 фактором Ха, фактором ІХа, або фактором Х. Однак, більшість інгібувальних антитіл до фактору МІ людини діє зв'язуванням з епітопами, розташованими у домені фактору МІ А2 розміром 40кДа або домені С2 розміром 20кДа, руйнуючи специфічні функції, пов'язані з цими доменами, як описано Еціспег еї аіІ. (1985) Ргос. Маї).

Асад. 5сі ОБА 82:7728-7732; та Зсапаейа еї а. (1988) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 85:6152-6156. На додаток до епітопів А2 та С2, у домені АЗ або С1 невеликого ланцюга фактору МІЇЇ може бути третій епітоп, згідно з /5 ЗсапдейМа еї аї. (1993) Вісой 52:1767-1775. Значення цього гаданого третього епітопу невідомо, але він, здається, має значення для другорядної частки реактивності епітопу у фактор МІ.

Анти-А2-антитіла блокують активацію фактору Х, як показано ІоПаг еї а). (1994) 3. Сііп. Іпмеві. 92:2497-2504. Попередні картувальні дослідження делеційним мутагенезом, описані У/аге еї аї. (1992) Віоса

Соади!. Рібгіпоїувів 3:703-716, показали розташування епітопу А2 в межах 20кДа регіону МН »-кінцевого 2о закінчення домену А2 розміром 40кДа. Конкурентні імунорадіометричні дослідження показали, що інгібітори А? розпізнають спільний епітоп або обмежено згруповані епітопи, які описано Зсапаейа еї аїЇ. (1992) Тигот.

Наетовіаз 47:665-611, та які описані у Патенті США Мо5859204.

Молекули фактору МІ! тварини або модифікованого фактору МІ тварини можна досліджувати на людях на їх зменшені антигенність та/або імуногенність у клінічних дослідженнях. У одному типі дослідження, призначеному сч ов для визначення, чи є фактор МІЇЇ імунореактивним з інгібувальними антитілами, фактор МІ! застосовують переважно внутрішньовенними вливаннями приблизно 25 пацієнтам, що мають нестачу фактору МІ! і мають і) антитіла, які інгібують активність стосовно коагуляції терапевтичного фактору МІ людини. Доза фактору МИ! тварини або модифікованого фактору МІ! тварини знаходиться переважно у межах між 5 та 5бодиниць/кг маси тіла, переважно 10-5бодиниць/кг, а найкраще - 40одиниць/кг маси тіла. Приблизно через 1 годину після кожного «г зо уведення відновлення фактору МІЇ! зі зразків крові вимірюють у одно-етапному дослідженні коагуляції. Зразки беруть знов приблизно через 5 годин після вливання та вимірюють відновлення. Загальне відновлення та ікс, швидкість зникнення фактору МІ зі зразків є прогнозувальними стосовно титру антитіла та інгібувальної о активності. Якщо титр антитіла є високим, відновлення фактору МІІЇ звичайно не можна вимірювати. Результати відновлення порівнюють з результатами відновлення у пацієнтів, лікованих фактором МІ, похідним з плазми о

Зв ЛЮДИНИ, рекомбінантним фактором МІІЇ людини, фактором МІЇЇ, похідним з плазми свині, та іншими звичайно ї- використовуваними терапевтичними формами фактору МІ! або замісниками фактору МІП.

Після ідентифікації клінічно значущих епітопів можна експресувати рекомбінантні молекули фактору МІ, що мають меншу чи однакову крос-реактивність порівняно з фактором МІ, похідним з плазми свині при дослідженні іп мйго широкого кола інгібувальних плазм. Додатковий мутагенез у регіонах епітопу можна зробити, щоб «

Зменшити крос-реактивність. Зменшена крос-реактивність, хоча і потрібна, не є необхідною для виготовлення в с продукту, що може мати переваги над існуючим фактором МІ, похідним з концентрату плазми свині, який може продукувати побічну дію внаслідок забруднення білками свині або забруднення такими інфекційними агентами, ;» як віруси або пріони. Молекули рекомбінантного фактору МІ свині або модифікованого фактору МІ свині не містять чужинних білків свині

Діагностичні дослідження. -І КДНК фактору МІ та/або білок, експресований з неї, повний чи неповний, можна використовувати у дослідженнях як діагностичні реагенти для визначення інгібувальних антитіл до фактору МІ людини або тварини о або, модифікованого фактору МІ тварини у субстратах, включаючи, наприклад, зразки сироватки та рідини з о тіла людини у пацієнтів з нестачею фактору МІ. Ці дослідження антитіл включають такі дослідження, як дослідження ЕЇГІЗА, імуноблотування, радіоїмунодослідження, імунодифузійні дослідження та дослідження

Ме, біологічної активності фактору МІ! (наприклад, дослідженням коагуляції) Способи виготовлення цих реагентів ї» та способи їх використання відомі фахівцям. Наприклад, імунодослідження для визначення інгібувальних антитіл у зразку сироватки пацієнта може включати реакцію тест-зразку з достатньою кількістю досліджуваного фактору

МІ, при цьому у зразку досліджуваного фактору МІІЇ може утворюватися виявлюваний комплекс з інгібувальними в антитілами, що є показником його антигенності..

Зонди нуклеїнових кислот та амінокислот можна виготовити на основі послідовності КДНК гібридного фактору

Ф) МІ або молекул його білку або фрагментів. У деяких втіленнях їх можна мітити, використовуючи барвники або ка ферментні, флуоресцентні, хемілюмінесцентні, або радіоактивні мітки, що є комерційно доступними.

Амінокислотні зонди можна використовувати, наприклад, для скринінгу сироваток або інших рідин з тіла, де є бо припустимою присутність інгібіторів до фактору МІ людини чи тварини або гібридного фактору МІЇЇ людини/тварини. Рівні інгібіторів у пацієнтів можна вимірювати та порівнювати з контрольними зразками від здорових людей, їх можна використовувати, наприклад, для визначення, чи можна пацієнта з нестачею фактору

МШП лікувати фактором МІ тварини або модифікованим фактором МІ тварини. Зонди кДНК можна використовувати, наприклад, для мети дослідження при скринінгу бібліотек ДНК. 65 Фармацевтичні композиції.

Фармацевтичні композиції, що містять рекомбінантний фактор МІ свині або модифікований фактор МІ свині, поодинці або у комбінації з прийнятними фармацевтичними стабілізаційними сполуками, середовищами для доставки та/або носіями, виготовляють відомими способами, як описав Е.МУ. Магіп у Кетіпдіоп'з

РІПаптасеціїса| Зсіепсев.

Згідно з одним втіленням винаходу запропоновано кращі носії або середовища для доставки внутрішньовенним вливанням, якими є фізіологічний розчин або буферований фосфатом фізіологічний розчин.

Згідно з іншим втіленням винаходу придатні стабілізаційні сполуки, середовища для доставки та носії включають, але без обмеження інші білки людини або тварини, як-то альбумін.

Фосфоліпідні середовища або суспензії ліпосом є також кращими як фармацевтично прийнятні носії або 7/0 Середовища для доставки. Їх можна виготовити способами, що відомі фахівцям, вони можуть містити, наприклад, фосфотидилсерин/фосфотидилхолін, або інші композиції фосфоліпідів або детергентів, що разом надають поверхні негативного заряду, оскільки фактор МІ приєднується до негативно заряджених фосфоліпідних мембран. Ліпосоми можна виготовити розчиненням прийнятного ліпіду(ів) (як-то стеароїлфосфоти-дилетаноламін, стеароїлфосфотидилхолін, арахадоїлфосфотидилхолін та холестерин) У 7/5 неорганічному розчиннику, що далі випарюють, отримуючи після цього тонку плівку висушеного ліпіду на поверхні посудини. Далі у посудину уводять водний розчин гібридного фактору МІ. Посудину далі збовтують вручну для вивільнення ліпідного матеріалу зі стінок посудини та для диспергування ліпідних агрегатів, утворюючи тим самим суспензію ліпосом.

Рекомбінантний фактор МІ свині або модифікований фактор МІ свині можна комбінувати з іншими 2о придатними стабілізаційними сполуками, середовищами для доставки та/або носіями, включаючи залежні від вітаміну К фактори згортання, тканинний фактор та фактор вон Віллебранда (УМ) або фрагмент УУмМІ, що містить сайти зв'язування фактору МІІІ, та полісахариди, як-то сахароза.

Рекомбінантний фактор МІ свині або модифікований фактор МІЇЇ свині можна також доставляти генною терапією таким чином, щоб доставляти фактор МІ людини, використовуючи такі засоби доставки, як сч ов ретровірусні вектори. Цей спосіб складається з уведення потрібного констракту КДНК фактору МІ у клітини людини, які трансплантують безпосередньо у пацієнта з нестачею фактору МІ або які розміщають у придатному і) для імплантації засобі, проникному для молекул фактору МІЇЇ, але непроникному для клітин, який далі трансплантують. Кращий спосіб полягає у опосередкованому ретровірусом генному переносі. За цим способом екзогенний ген (наприклад, кКДНК фактору МІ) клонують у геном модифікованого ретровірусу. Ген вставляють у «г зо Геном клітини хазяїна за допомогою вірусу, де він буде експресуватися клітиною. Ретровірусний вектор модифікують так, щоб він не продукував вірус, попереджуючи вірусну інфекцію хазяїна. Загальні принципи цього ісе) типу терапії відомі фахівцям та описані у літературі |наприклад, Копп, О.В. ега!. (1989) Тгапвійивіоп 29:812-820). о

Фактор МІ свині або модифікований фактор МІ! свині можна зберігати зв'язаним з УМ для збільшення часу напіввиведення та власного часу існування гібридної молекули. Крім того, ліофілізація фактору МІ може о збільшити вихід активних молекул у присутності МУМ/ї. Сучасні способи збереження фактору МІ людини та ї- тварини, використовувані комерційними постачальниками, можна застосовувати для збереження рекомбінантного фактору МІ. Ці способи включають: (1) ліофілізацію фактору МІЇЇ у частково очищеному стані (як "концентрат" фактору МІ, що інфундують без подальшої очистки); (2) імуноафінну очистку фактору МІЇ способом Зиммерманна та ліофілізацію у присутності альбуміну, який стабілізує фактор МІ; (3) ліофілізацію « рекомбінантного фактору МІ! у присутності альбуміну. з с Крім того, фактор МІ свині або модифікований фактор МІ свині, як виявлено, є необмежено стабільним при 42С у 0,6М Масі, 20ММ МЕ, та 5мМ Сасі» при рН 6,0, а також його можна зберігати замороженим у цих ;» буферах та розтоплювати з мінімальною втратою активності.

Способи лікування.

Рекомбінантний фактор МІ свині або модифікований фактор МІ свині використовують для лікування -і неконтрольованої кровотечі внаслідок нестачі фактору МІ! (наприклад, внутрішньосуглобова, внутрішньочерепна, або шлунково-кишкова кровотеча) при гемофілії з інгібувальними антитілами та без них, а іні також у пацієнтів з набутою нестачею фактору МІ внаслідок розвинення інгібувальних антитіл. Активні о матеріали застосовують переважно внутрішньовенно.

Крім того, рекомбінантний фактор МІ свині або модифікований фактор МІЇЇ свині можна застосовувати б трансплантуванням генетично змінених клітин для виготовлення білку імплантуванням засобу, що містить такі

Та» клітини, які описано вище.

Згідно з кращим втіленням винаходу фармацевтичні композиції рекомбінантного фактору МІ! свині або модифікованого фактору МІ! свині поодинці або у комбінації зі стабілізаторами, середовищами для доставки, талабо носіями інфундують у пацієнтів внутрішньовенно таким же способом, що використовують для вливання фактору МІ людини або тварини. іФ) Лікувальні дози композиції рекомбінантного фактору МІ свині або модифікованого фактору МІЇ! свині, яку ко слід застосовувати стосовно пацієнту, якому необхідне таке лікування, варіюватимуть залежно від суворості нестачі фактору МІ. Взагалі, рівні доз підбирають за частотою, тривалістю та кількістю одиниць у згоді з бо суворістю та тривалістю кожного випадку кровотечі у пацієнта. Відповідно, фактор МІ включено у фармацевтично прийнятний носій, середовище для доставки, або стабілізатор у кількості, достатній для доставки пацієнту терапевтично ефективної кількості білку для зупинки кровотечі, яку виміряно стандартними дослідженнями згортання.

Фактор МІЇ класично визначено як присутню у нормальній плазмі кров речовину, що коректує дефект б5 згортання у плазмі, похідній від осіб з гемофілією А. Активність стосовно коагуляції іп міо очищених та частково очищених форм фактору МІ використовують для розрахунку дози фактору МІЇЇ для вливань у людей-пацієнтів, вона є надійним індикатором активності, отриманої з плазми пацієнта, та корекції дефекту кровотечі іп мімо. Не описані відхилення між стандартним дослідженням нових молекул фактору МІЇЇ іп міго та їх поведінкою у моделі вливання собакам або у людей-пацієнтів, згідно з І озПег, У).М. ек аіІ. Мем Епаї. У. Мед. 328:453-459; Рійтап, О.О. еї аїЇ. (1992) Віоосд 79:389-397; та Вгіпкпоиз еї а). (1985) Ргос. Май. Асай. 5сі. 82:8:752-8755.

Звичайно, потрібний рівень активності фактору МІЇЇ плазми, що досягають у пацієнта застосуванням рекомбінантного фактору МІ свині або модифікованого фактору МІЇЇ свині, знаходиться у межах 30-100905 від нормального. За кращим способом застосування терапевтичного фактору МІ, композицію уводять 7/0 Внутрішньовенно у кращій дозі у межах приблизно від 5 до Б5бодиниць/кг маси тіла, переважно у межах 10-5Ббодиниць/кг маси тіла, а найкраще у дозі 20-4бодиниць/кг маси тіла; інтервал частоти знаходиться у межах приблизно від 8 до 24 годин (у випадку суворої гемофілії); а тривалість лікування у добах знаходиться у межах від 1 до 10 діб або доки не втихомириться кровотеча. Дивися, наприклад, Кобегіз, Н.К., апа М.К допев, "Неторпіїйа апа Кеїаїей Сопайіопв - Сопдепіа! Оеїісіепсіев ої РгоїйготрНі (Расіог ІІ, Расіог М, апй4 Расіоге 75. МІ ХІЇ), (Гемофілія та споріднені стани - уроджена нестача протромбіну (Фактор ІІ, Фактор М, та Фактори

МІ -ХІ)), Сп. 153, 1453-1474,1460, у Нетайопому. МУйШіатве, МУ. Х, еї аї., ей. (1990). Пацієнти з інгібіторами можуть потребувати відмінної кількості рекомбінантного фактору МІ свині або модифікованого фактору МИ свині, ніж їх попередня форма фактору МІ. Наприклад, пацієнти можуть потребувати менше рекомбінантного фактору МІ свині або модифікованого фактору МІ свині внаслідок його вищої специфічної активності у порівнянні з фактором МІІЇ людини та зменшеною реактивністю стосовно антитіл. Як при лікуванні фактором МІЇ! людини або фактором МІЇЇ, похідним з плазми свині, кількість інфундованого терапевтичного фактору МІЇЇ визначають одно-етапним дослідженням коагуляції фактору МІ, а у вибраних випадках відновлення іп мімо визначають виміром фактору МІ у плазмі пацієнта після вливання. Слід розуміти, що для будь-якої певної особи конкретні дозові режими слід підбирати протягом часу, зважаючи на особу та професійний розсуд сч г персони, що надає допомогу, або контролюючи застосування композицій, та на те, що представлені тут межі концентрацій є тільки прикладами і не обмежують рамок та практичного використання заявленої композиції. і)

Лікування може мати форму одиничного внутрішньовенного уведення композиції або періодичного або безперервного уведення протягом тривалого періоду часу, за потребою. Альтернативно, терапевтичний фактор

МШП можна застосовувати підшкірно або перорально з ліпосомами одною або кількома дозами при різних «г зо інтервалах часу.

Рекомбінантний фактор МІЇЇ свині або модифікований фактор МІ свині можна також використовувати для ісе) лікування неконтрольованої кровотечі внаслідок нестачі фактору МІІЇ при гемофіліях з наявністю розвинених о антитіл до фактору МІ людини. У цьому випадку активність стосовно коагуляції, що є віщою у порівнянні з активністю фактору МІЇ людини або тварини поодинці не є необхідною. Активність стосовно коагуляції, що є о зв НИЖЧОЮ У порівнянні з активністю фактору МІ людини (тобто менше З0О0бодиниць/мг) буде корисною, якщо її не ї- нейтралізують антитіла у плазмі пацієнта.

Тут продемонстровано, що рекомбінантний фактор МІ свині та модифіковані фактори МІІЇ свині можуть відрізнятися за специфічною активністю від фактору МІ людини. Білки фактору МІ, що мають більшу прокоагуляційну активність у порівняні з фактором МІІЇ людини, є корисними при лікуванні гемофілії, оскільки « для корекції нестачі фактору МІ у пацієнта будуть потрібними нижчі дози. Фактори МІЇЇ, що мають нижчу з с прокоагуляційну активність у порівняні з фактором МІ людини є також придатними для терапевтичного використання за умови, що вони мають щонайменше 195 специфічної активності порівняно з нормальним ;» фактором МІ людини. Фактор МІ представленого винаходу, що має прокоагуляційну активність, є тому визначено як такий, що має щонайменше 195 специфічної активності фактору МІЇЇ людини.

Молекула рекомбінантного фактору МІ свині або модифікованого фактору МІ свині та способи її -І виділення, аналізу, створення та використання, що взагалі описані вище, далі будуть зрозумілими з посилання на наступні необмежувальні приклади. о Приклад 1: Дослідження фактору МІ! свині та гібридного фактору МІІЇ людини/свині. о Фактор МіМйа свині має більшу активність стосовно коагуляції у порівнянні з фактором МІЇЇ людини на 5р основі специфічної активності молекули. Цей висновок базується на використанні прийнятних стандартних

Ме, кривих, що дозволяють достатньо надійно порівнювати фактор МІ людини з фактором свині. Дослідження ї» коагуляції базуються на здатності фактору МІ скорочувати час згортання плазми, похідної від пацієнта з гемофілією А. Застосовуваними типами досліджень були: одно-етапне та дво-етапне дослідження.

У одно-етапному дослідженні О,їмл плазми пацієнта з гемофілією А |Сеогде Кіпд Віотедаісаї, Іпс. інкубували з 0,1мл активованого часткового тромбопластинового реагенту (АРТТ) (Огдапоп ТекКпіка) та О,01мл зразку або стандарту, що складаються з доповненої цитратом плазми нормальної людини, протягом 5 хвилин

Ф) при 372С на водяній бані. Інкубування проводили з додаванням 0,їмл 20мМ сСасі 2, а час розвитку фібринового ко тромбу визначали візуально.

Одиницю інтенсивності фактору МІІЇ визначають як кількість, присутню у їмл доповненої цитратом плазми бо нормальної людини. З плазмою людини як стандартом активність фактору МІ свині та фактору МІЇЇ людини порівнювали безпосередньо. Розбавлення плазми стандартним або очищеним білками здійснювали у 0,15М масі, 0,02М ГЕПЕС, рН 7,4. Стандартну криву створювали на основі З або 4 розбавлень плазми, найвище розбавлення складало 1/50, та на залежності Іод.4о часу згортання від І0сд4о концентрації плазми, що призводить до лінійної залежності. Число одиниць фактору МІ у невідомому зразку визначали інтерполяцією за б5 стандартною кривою.

Одно-етапне дослідження основане на ендогенній активації фактору МІІЇ активаторами, утвореними у плазмі пацієнта з гемофілією А, в той час як у дво-етапному дослідженні вимірюють прокоагуляційну активність попередньо активованого фактору МІ. У дво-етапному дослідженні, зразки, що містять фактор МІ, що прореагував з тромбіном, додавали до суміші активованого часткового тромбопластину та плазми людини-пацієнта з гемофілією А, яку попередньо інкубовано протягом 5 хвилин при 37 «С. Одержані часи згортання перетворювали далі у число одиниць/мл, базуючись на вищенаведеній стандартній кривій для людини. Відносна активність у дво-етапному дослідженні була вищою, ніж у одно-етапному дослідженні, оскільки фактор МІ був попередньо активованим.

Приклад 2: Визначення параметрів функціональної відмінності між фактором МІ свині людини та. 70 Виділення похідних з плазми фактору МІЇЇ свині і фактору МІ людини та рекомбінантного фактору МИ людини описано у літературі РиЇспег, С. А. еї а). (1982) Ргос. МаїЇ. Асад сі. ОБА 79:1648-1652; ТоокК еї аї. (1984) Маїшге 312:342-347 (Сепеїйісв Іпвійше); сй8зспіег еї аЇ. (1984) Майте 312:326-330 (Сепепіесі); Муосй еї а). (1984) Маїшцге 312:330-337 (Сепепіесп); Мепйаг еї а). 312 Майте 312:337-342 (Сепепіесп); Разв еї аї. (1982) Віоод 59:594; ТооІе еї аї. (1986) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 83:5939-5942. Цього можна досягти 7/5 Кількома шляхами. Усі ці препарати є подібними за складом субелементу, хоча існують функціональні відмінності у стабільності між фактором МІІЇ людини та фактором МІЇ свині.

Для порівняння рекомбінантного фактору МІЇЇ людини та фактору МІ свині препарати високоочищеного рекомбінантного фактору МІЇ людини (Сийег І арогайогіез, Вегкеіеу, СА) та фактору МІ! свині (муноочищений як описано Равгз еї аї. (1982) Віоод 59:594| піддавали високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) на аніоно-обмінній колонці Мопо Отм (Рпагтасіа-І КВ, Різсагамжау, МУ) (Рпагтасіа, Іпс.). Метою етапу ВЕРХ

Мопо Отм була оцінка наявності незначних забруднень обміну фактору МІ людини та фактору МІ! свині у спільному буфері з метою порівняння. Склянки, що містили 1000-200бодиниць фактору МІ! відтворювали додаванням бмл Н 20. Гепес (2М при рН 7,4) далі додавали до кінцевої концентрації О0,02М. Фактор МИ вносили у колонку Мопо Сум, НК 5/5, урівноважену у 0,15М Масі, 0,02М Гепес, 5мМ Сасі», при рН 7,4 (БуферА ДЦ см плюс 0,15М Масі); промивали 10мл буферу А «ж 0,15М Масі; та елюювали 2Омл з лінійним градієнтом від 0,15М (5) до 0,90М Масі у буфері А при швидкості потоку Тмл/хвилин.

Для порівняння похідного з плазми фактору МІЇЇ людини (очищений за допомогою ВЕРХ Мопо С) тм) та імуноафінно очищеного фактору МІ! свині, фактор МІП, похідні з плазми свині розбавляли 1:4 0,04М Гепес, 5мМ

Сасі», 0,0195 Твін-80, при рН 7,4, та піддавали ВЕРХ Мопо См в таких же умовах, як описані у попередньому « розділі для фактору МШа людини. Ці способи виділення фактору МІ людини та фактору МІ свині є со стандартними для фахівців.

Фракції з колонки досліджували на активність фактору МІІЇ одно-етапним дослідженням коагуляції. Середні о результати досліджень, виражені у одиницях активності на А ово матеріалу, надано у Таблиці ІЇ показано, що ю фактор МІЇЇ свині має щонайменше у шість разів більшу активність, ніж фактор МІїЇ людини при використанні

Зо одно-етапного дослідження. о «

МІ людини та фактору МІЇ! свині и 000 он одянянлоюо з с . що

Приклад 3: Порівняння стабільності фактору МІ людини та фактору МІ свині Результати одно-етапного - дослідження фактору МІ відображають активацію фактору МІ до фактору МПа у зразку та можливу втрату утвореної фактором МіІа активності. Здійснювали пряме порівняння стабільності фактору МІ людини та фактору і-й МІ свині. Зразки з ВЕРХ Мопо Отм |Рнагтасіа, Іпс., Різсагаууау, М.) розбавляли до такої ж концентрації та (ав) складу буферу і піддавали дії тромбіну. В різні часи зразки видаляли для дво-етапного дослідження коагуляції.

Звичайно пік активності (через 2 хвилини) був у 10 разів більшим для фактору МіМа свині, ніж фактору МІШа

Ф людини, а активності фактору МПа свині та фактору МІйа людини далі зменшувалися при більш швидкому «з» зниженні активності фактору Ма людини.

Взагалі, спроби виділити стабільний фактор Ма людини є безуспішними навіть коли використовують умови, що продукують стабільний фактор Міа свині. Для демонстрації цього очищений за допомогою ВЕРХ Мопо Отм фактор МІІЇ людини активували тромбіном та піддавали дії катіоно-обмінної ВЕРХ Мопо Зм (Рпагтасіа, Іпс.) в о умовах, що продукують стабільний фактор МіІа свині, як описано І оІаг еї а!. (1989) Віоспетівігу 28:666.

Фактор МІЇ людини, 4Змг/мл (0,2мкМУ у 0,2М Масі, 0,01М Гепес, 2,5мМ Сасіг2) при рН 7,4, у загальному іме) об'ємі 10мл, реагував з тромбіном (0,03бмкМ) протягом 10 хвилин, протягом якого часу додавали ЕРК-СН 5сСІ

О-феніл-проліл-аргініл-хлорметилкетон до концентрації 0,2мкМ для необоротної інактивації тромбіну. Суміш далі бо розбавляли 1:11 40мМ 2-(М-морфоліно)етансульфоновою кислотою (МЕ5), 5ММ Сасі о, при рН 6,0, та завантажували при швидкості 2мл/хвилини у колонку Мопо бтм НЕК 5/5 ВЕРХ (РНагтасіа, Іпс.), урівноважену у 5ММ МЕ5, 5мМ Сасі», при рН 6,0 (Буфер В) плюс 0. 1М Масі. Фактор МіПа елюювали без промивки колонки 20мл з градієнтом від О,1М Масі до 0,9М Масі у буфері В при швидкості Тмл/хвилину.

Фракцію з активністю стосовно коагуляції у дво-етапному дослідженні елюювали як одиничний пік в цих бо умовах. Специфічна активність пікової фракції була приблизно 7500 одиниць/Аово. Електрофорез на гелі з додецилсульфатом натрію-поліакриламідом (ЗО5-РАСЕ) Мопо тм піку фактору МіІШа, з наступним проявленням білку сріблом, виявив дві смуги, відповідні гетеродимерному (АЗ-С1-С2/А1) похідному фактору МІ.

Хоча фрагмент А? не було ідентифіковано проявленням сріблом в цих умовах внаслідок його низької концентрації, його було ідентифіковано як слідову складову міченням 725-І|,

За контрастом до результатів з фактором МІІЇ людини фактор МіІа свині, виділений за допомогою ВЕРХ Мопо

Зтм в таких же умовах мав специфічну активність 1,6х109 одиниць/Аово, Аналіз фактору Мійа свині за допомогою ЗО5-РАСЕ виявив З фрагменти, відповідні субелементам А1, А2, та АЗ-С1-С2, демонструючи, що фактор МіМа свині має три субелементи.

Результати ВЕРХ Мопо 5тм препаратів активованого тромбіном фактору МІІЇ людини при рН 6,0 свідчать, що 70 фактор Мійа людини є лабільним в умовах, що дають стабільний фактор МіМа свині. Однак, хоча у піковій фракції було ідентифіковано слідові кількості фрагменту А2, визначення, чи була неможливою при використанні цього способу поодинці активність стосовно коагуляції, що є результатом невеликої кількості гетеротримерного фактору МПа або від гетеродимерного фактору МіМа, що має низьку специфічну активність.

Спосіб виділення фактору Мійа людини перед втратою ним його субелементу А2 є потрібним для розв'язання 75 цього питання. Щоб покінчити з цим, виділення досягали способом, що включає зменшення рН буферів Мопо 5 тм до рН 5. Мопо Отм-очищений фактор МІ людини (0,5мг) розбавляли водою для одержання кінцевої композиції з 0,25мг/мл (Імкм) фактору МІ у 0,25М Масі, 0,01М Гепес, 2,5мМ Сасі», 0,00595 Твін-80, при рН 7,4 (загальний об'єм 7,О0мл). Тромбін додавали до кінцевої концентрації 0,072мкм та давали реагувати протягом З хвилин.

Тромбін далі інактивували ЕРК-СНЬСІ (0,2мкм). Суміш далі розбавляли 1:1 40мММ ацетату натрію, 5мМ Сасі», 0,01965 Твін-8О, при рН 5,0, та завантажували при швидкості 2мл/хвилин у колонку Мопо бтм НЕ 5/5 ВЕРХ, урівноважену у 0,01М ацетаті натрію, 5мМ Сасі», 0,0195 Твін-ВО, при рН 5,0, плюс 0,1М Масі. Фактор МіМа елюювали без промивки колонки 2Омл з градієнтом від 0,1М Масі до 1,0М Масі у такому ж буфері при швидкості 1мл/хвилину. Це призводить до відновлення активності стосовно коагуляції у піці, що містить виявлювані кількості фрагменту А2, як показано за допомогою 50О5-РАСЕ та проявлення сріблом. Специфічна активність с 29 пікової фракції була у десять разів більшою, ніж отримана при рН 6,0 (75000одиниць/А ово проти (9 750бодиниць/А»ово). Однак, за контрастом до фактору МіМа свині, виділеному при рН 6,0, який є необмежено стабільним при 42С, активність фактору Мійа людини зменшувалася постійно протягом кількох годин після елюювання з Мопо Зм, Крім того, специфічна активність фактору МПа очищеного при рН 5,0 та дослідженого негайно, складає тільки 595 від активності фактору Міа свині, вказуючи, що перед дослідженням відбувалася З суттєва дисоціація. (Се)

Ці результати демонструють, що фактор МіПа людини та фактор МіІПа свині складаються з трьох субелементів (АТ, А2, та АЗ-С1-С2). Відщеплення субелементу А? є відповідальним за втрату активності фактору МПа людини о та фактору Мійа свині в деяких умовах, як-то фізіологічні іонна сила, рН, та концентрація. Відносна юю стабільність фактору МіІа свині в деяких умовах відбувається внаслідок сильнішого зв'язування субелементу А2.

Зо Приклад 4: Виділення та секвенсування ДНК, що кодує домен А2 фактору МІЇ свині. -

Тільки нуклеотидна послідовність, що кодує домен В та частину домену А2 фактору МІЇЇ свині секвенсовано раніше |Гооіе еї аі. (1986) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 83:5939-59421. Тут розкриті КДНК та передбачувані амінокислотні послідовності (ЗЕО ІЮ МО: З та 4, відповідно) для повного домену А2 фактору МІ! свині. «

Домен А? фактору МІ свині клонували зворотною транскрипцією загальної РНК селезінки свині та 7 70 РСК-ампліфікацією; використовували вироджені праймери на основі відомої послідовності КДНК фактору МІ с людини та належний праймер свині на основі частини послідовності фактору МІ свині. Продукт РОК розміром 1 з ко виділяли та ампліфікували вставкою у фагемідний (рпадетіа) вектор Віпезсгірітм (Зігаїадепе).

Домен А2 свині було повністю секвенсовано дидезоксисеквенсуванням. кКДНК та передбачувані амінокислотні послідовності описані ЗЕО ІЮО МО: З та 4, відповідно. й й й - Приклад 5: Повна послідовність ДНК, що кодує фактор МІ свині.

Кленовий фрагмент, фосфориловані лінкери Сіаї, лінкери Мої, лігазу Т4, та ДНК-полімеразу Тад отримували 1 від Рготеда (Мадізоп, МУізсопзіп). Полінуклеотидну кіназу отримували від ійе Тесппоіодіев, Іпс., о Саїйпегзриго, Магуїапа. у?Р-АТР (Кедімце, »5000Кі/ммоль) отримували від АтегеПпат. рВіцевзсгірі І кК5-, а клітини Е. сої Ерісогеап Хі! 1-Віде отримували від бігабїадепе (а доМа, Саїйогпіа) Синтетичні (2) олігонуклеотиди отримували від ІМе Тесппоодіез, Іпс. або Сгоаспет, Іпс. 5'-фосфориловані праймери

Їх» використовували, коли РОСК-продукти виготовляли з метою клонування. Нуклеотидна (нк) нумерація олігонуклеотидів, використовуваних як праймери для полімеразної ланцюгової реакції ампліфікації (РСК) кДдДНК або геномної ДНК МІ свині, використовує КДНК М/ІІЇ людини як посилання (Умооа еї аї!. (1984) вище).

Загальну РНК селезінки свині виділяли кислотною екстракцією з тіоціанатом гуанідінію-фенолом-хлороформом |Спотсгупгкі еї а!. (1987) Апа!. Віоспет. 162:156-159). кДНК свині виготовляли (Ф) з загальної РНК селезінки, використовуючи зворотну транскриптазу (КТ) вірусу Молоні мишачої лейкемії та

ГІ випадкові гексамери для праймування реакції (комплект Рігзі-Зігапа сОМА Зупіпезіз Кії, Рпагтасіа Віогесн) якщо не показано інше. Реакційні суміші КТ містили по 45мМ Трис-СІ, рН 8,3, б68мм КСІ, 15мМ ОТ, 9мММ Масі», во 0,Овмг/мл альбуміну коров'ячої сироватки та 1,98мММ трифосфату дезоксинуклеотиду (аМТР). Геномну ДНК свині виділяли з селезінки, використовуючи стандартний спосіб (Зігацез, М.М. (1995) Ситепі Ргоїосоїв іп МоїЇІесшаг

Віоїюсду (Сучасні протоколи у молекулярній біології), М. А!Єзибреї! еї аіЇ., видавн., ЧУойп МУйеу 85 Бопв, стор. 2,2,1-2,2,3). Виділення ДНК з агарозних гелів здійснювали, використовуючи комплект Сепесієап І! (Віо 101) чи

Оціех ІІ сеї! Ехігасійоп (Оіадеп). 65 Реакції РСК здійснювали, використовуючи термоциклер Нубаїд ОтпіСепе. Для реакцій РСК із застосуванням

ДНК-полімерази Тад, реакційні суміші включали 0,бМмМ Масі», 0,2ММ різних аМТР, 0,5мкМ олігонуклеотидних праймерів, 5бодиниць/мл полімерази та 0,1 об'єму реакційної суміші першого ланцюга кКДНК. Якщо не показано інше, РСК-продукти очищали на гелі, притуплювали закінчення кленовим фрагментом, осаджували з етанолу та зшивали з сайтом ЕсокМ дефосфорилованого рВішйезсгірі І К5- або зшивали з фосфорилованими лінкерами

Сіам, використовуючи лігазу Т4, розщеплювали за допомогою Сіаї, очищали за допомогою хроматографії

Зерпасгу! 5400, та зшивали за допомогою СіаІ-сції, дефосфорилованим рВінезстгірі Ії К5-. Зшивання здійснювали, використовуючи лігазу ДНК Т4 (комплект Каріа ДНК Іідайоп Кії, Воейгіпдег Мапппеїіт), якщо не показано інше.

Плазміди з вмістом вставки рВіцезсгірі І К5- використовували для трансформації клітин Е. соїї Епісигеап

ХИ-Віне. 70 Секвенсування плазмідної ДНК здійснювали, використовуючи секвенсор Арріїед Віозувіетз 373а ашотаїйеа

ОМА та комплект РКІЗМ дуе (егтіпайог Кії, або вручну, використовуючи комплект Зедпцепазвзе у. 2.0 зедцепсіпа Кії (Атегепат Согрогайоп). Пряме секвенсування РСВ-продуктів, включаючи мічені на кінці ЗР. олігонуклеотиди, здійснювали, використовуючи протокол циклічного секвенсування (а50ОМА Сусіе Зедцепсіпд Зузіет, І йе

Тесппоіодіев).

Виділення клонів КДНК РІЇ свині, що містять 5 ТК послідовність, сигнальний пептид та колони домену А1.

КДНК І свині, розташовану 5 стосовно домену А2, ампліфікували за допомогою ущільненої КТ-РСК загальної РНК селезінки самиці свині, використовуючи протокол 5--швидкої ампліфікації кінців кКДНК (5-КАСЕ) (Магаїйоп сОМА Аптріїйісайоп, Сіопіесі, Мегвіоп РК55453). Це включало синтез першого ланцюга кДНК, використовуючи зістиковуваний жмутом праймер оліго (47) (Вогзоп, М.О. еї аЇ. (1992) РСК Меїййподз Аррі. 2:144-148), синтез другого ланцюга кКДНК, використовуючи полімеразу І ДНК БЕ. соїї, та зшивку з 5 продовженим дволанцюговим адаптером, ЗЕО ІЮ МО:5 5-СТА АТА СбБА СТС АСТ АТА 0600 СТО САС соб ССО ССС обо САС ОТ-3 р 3-ПОМ-СССОСТОССА-РО.-5" с чий короткий ланцюг було блоковано на закінченні З аміногрупою для зменшення неспецифічного і)

РСК-праймування, і який був комплементарним стосовно 8 нуклеотидів на закінченні З' (Зіерегі, Р.О., еї а). (1995) МисіІеіс. Асід5. Кев. 23:1087-1088) Перший раунд РСК здійснювали, використовуючи адаптер-специфічний олігонуклеотид, БЗЕО ІЮ МО:6б 5-ССА ТОСС ТАА ТАС САС ТСА СТА ТАС ОС-3 (позначені «ф

АРІ) як сенсовий праймер, та специфічний стосовно домену А2 МІ! свині олігонуклеотид БЕО ІЮ МО:7 5-ССА

ТТОо АСА ТОА АСА ССО ТТ СтТОо-3' (нк 2081-2104) як антисенсовий праймер. Другий раунд РСК здійснювали, ке, використовуючи ущільнений, адаптер-специфічний олігонуклеотид, ЗЕО ІЮ МО:8 5-АСТ САС ТАТАСО СТ СвА о все осб-3 (позначений АР2) як сенсів праймер, та ущільнений, специфічний стосовно домену А2 свині олігонуклеотид ЗЕС ІЮ МО:9 5-00 ТОС АДА СО СТО АСА ТСА ОТО-3! (нк 1497-1520) як антисенсовий юю праймер. РСК проводили, використовуючи комерційний комплект (Адмапіаде СОМА РСК соге Кі), який має - протокол опосередкованого антитілом гарячого запуску (КеЇодо, О.Е. еї аїЇ. (1994) ВіоТесппіднев 16:1134-1137)Ї. Умови РСК включали денатурацію при 942 протягом бос, далі ЗО циклів (перша РСК) або 25 циклів (друга РОК) денатурації протягом ЗОс при 942С, гібридизація протягом ЗОс при 6092С та продовження « протягом 4 хвилин при 682С, використовуючи регулювання температури туби. Цей спосіб дав відомий продукт розміром приблизно 1,6 ко, який був узгодженим з ампліфікацією фрагменту протяжністю приблизно 150 по у 5' т с ТК. РСК-продукт клонували у рВіцйезсгірі, використовуючи лінкери СМ. Вставки чотирьох клонів було "» секвенсовано у обох напрямках. " Послідовність цих клонів включала регіони, відповідні 137 по 5 ТК, сигнальному пептиду, домену А1 та частині домену А2. Узгодження досягли щонайменше у З з 4 сайтів. Однак, клони містили середнє число явних РСЕК-генерованих мутацій 4, ймовірно внаслідок множинності раундів РОК, потрібних для створення здатного до і клонування продукту. Отже, ми використовували послідовність, отриману з регіону сигнального пептиду для сл створення сенсового РСК-праймеру з фосфорилованим ланцюгом, ЗЕО ІЮ МО:10 5-ССТ СТО ЗАС ССА ССА

ТТ СА ССС АСС АТО САС СТА БАС СТО ТОСС АСС ТО-3, позначеного як КЕМЕОРІСБР, для синтезу іншого о РСЕК-продукту для підтвердження послідовності та для клонування у вектор експресії. Послідовність, що

ФО 20 підкреслена, представляє старт-кодон. Послідовність 5 стосовно цього представляє послідовність, ідентичну послідовності 5' сайту вставки у векторі експресії КеМео ссавця, використовуваному для експресії АЛІ (Гибіп їз» еї аІ. (1994) вище). Цей сайт включає сайт розщеплення Хпої! (підкреслений). КЕМЕОРІСБР, а олігонуклеотид з нк 1497-1520 використовували для праймування опосередкованої полімеразою ДНК Тад РСК-реакції, використовуючи кДНК селезінки самиці свині як темплат. ДНК-полімерази від кількох інших виробників були 22 непридатними для отримання виявлюваного продукту. Умови РСК включали денатурацію при 94 С протягом 4

Ф! хвилин, далі 35 циклів денатурації протягом 1 хвилини при 942С, гібридизацію протягом 2 хвилин при 552 та продовження протягом 2 хвилин при 72 2С, а далі кінцевий етап продовження протягом 5 хвилин при 72 2С. о РСК-продукт клонували у рВінпезстгірі, використовуючи лінкери Сіа!. Вставки двох цих клонів було секвенсовано у обох напрямках та сполучено з узагальнюючою типовою послідовністю. бо Виділення клонів кДНК МІЇЇ свині, що містять колони АЗ, СІ та 5 половину домену С2.

Спочатку клонували два КТ-РСК-продукти з селезінки свині, відповідні фрагменту домену В-АЗ (нк 4519-5571) та фрагменту домену С1-С2 (нк 6405-6990). 3' закінчення домену С2 було отримано розташованим у регіоні екзону 26, який є кінцевим екзоном у Г/ТІІ. Продукт В-АЗ створювали, використовуючи специфічний стосовно домену В свині праймер, ЗЕО ІЮО МО: 11 5 СОС Со СС Со САТ СТО ОСА ААС СТО АСТ Т 3, де бо підкреслений регіон стосується регіону у МІ свині, що суміщений з нк 4519-4530 у МІ людини. 5' регіон олігонуклеотиду включає сайт Мої, що був спочатку призначений для клонування. Антисенсовий праймер, використовуваний при створенні продукту В-АЗ, ЗЕО ІЮ МО: 12 5-САА АТА АОС ССА БОС ТТ ОСА ТС КАА-3 базувалися на зворотному комплементі послідовності КДНК М/П людини на нк 5545-5571. РСК-реакційна суміш містила 5ОмММ КСІ, 10мМ Трис-СІ, рН 9,0, 0,195 Тритон Х-100,1,5мМ Масі», 2,5мМ суміші аМТР, 20мкМ праймерів, 25одиниць/мл полімерази ДНК Та та 1/20 об'єму реакційної суміші КТ. Умови РОК такі: денатурація при 942С протягом З хвилин, далі ЗО циклів денатурації протягом 1 хвилини при 942С, гібридизація протягом 2 хвилин при 502С та продовження протягом 2 хвилин при 7220. РСК-продукти фосфорилували, використовуючи кіназу ДНК

ТА та додавали лінкери Мої. Після культивування з МоїїЇ РСК-фрагменти клонували у сайт Мої! Віоезсгірі Н К5- 70 та трансформували у клітини ХГ І-ВіІше.

Продукт С1-С2 створювали, використовуючи відому послідовність КДНК людини для синтезу сенсових та антисенсових праймерів, ЗЕО ЕЮО МО:13 5-АСО ААА ТС САС ТО ААС СТ М-3 (нк 6405-6426) та 5ЕО І

МО:14 5-СТОо оо То ААТ ТО ААо СТА Со М-3 (зворотний комплемент з нк 6966-6990), відповідно. Умови

РСК були ідентичними використовуваним для створення продукту В-А2 Утворений фрагмент зшивали з 75 вектором клонування РМОТ, використовуючи праймову систему Ргіте РСК Сіопег Сіопіпд Зувіет (5 Ргіте-3

Ргіте, Іпс., Воцідег, Соогадо) та вирощували у клітинах /М109.

Плазміди В-АЗ та С1-С2 було частково секвенсовано для створення специфічних стосовно свині сенсових та антисенсових олігонуклеотидів, «БО ІЮ МО: 15 9-САС ТС АТО обо ААС АСС ТО ТО-3 (нк 4551-4573) та БЕО

І МО:16 5-АСА СС САТ САА СТО САТ обо АдОо-3 (нк 6541-6564), відповідно. Ці олігонуклеотиди використовували як праймери для створення КТ-РСК-продукту розміром 2013 по, використовуючи комплект

Сіопіеспи Адуапіаде СсОМА РОС Кії. Цей продукт, який стосується нк 4551-6564 людини, включає регіон, відповідний активаційному пептиду з невеликим ланцюгом (нк 5002-5124), домен АЗ (нк 5125-6114) та більшу частину домену СІ (нк 6115-6573). Послідовністю клону С1-С2 було встановлено, що кКДНК людини та свині від нк 6565 до 3" закінчення домену СІ були ідентичні. РСК-продукт клонували у сайт ЕсокМ рВінцезстгірі ІІ К5-. Чотири Ге клони було повністю секвенсовано у обох напрямках. Узгодженості було досягнуто щонайменше у З з 4 сайтів. о

Виділення клонів кДНК РІЇ свині, що містять З' частину кодонів домену С2.

Домен С2 людини МІ! (нуклеотиди 6574-7053) міститься всередині екзонів 24-26 |Сіївспіег 3. еї аї. (1984) Майшге 312:326-330). Екзон людини 26 містить 1958 по, відповідних нуклеотидам 6901-8858. Він включає 1478 по 3' нетрансльованої послідовності. Спроби клонування кДНК екзону 26, відповідного З3' закінченню домену чІ

С2, та ЗОТК, 3 КАСЕ |Зіерегі еї аІ. (1995) вище), зворотною РСК |Осптап, Н. еї аї. (1990) ВіоїесппоЇоду (МУ). 8:759-760), РСК, сайт-обмеженою (|Загкаг, с. еї аі. (1993) РСОКМеїйй. Аррі. 2:318-322), "непередбачувано ї-о праймованою" РОК |Оотіподце?, О. еї аі. (1994) Мисівїс. Асідз Кев. 22:3247-3248) та скринінгом бібліотеки КДНК «3 печінки свині були невдалим. Було спробувано 3 КАСЕ, використовуючи таку ж адаптер-зшиту бібліотеку дволанцюгової КДНК, що використовували для успішного використання для клонування 5' закінчення кКДНК РІ о свині. Отже, невдача цього способу відбувалася не внаслідок відсутності КДНК, відповідної екзону 26. ч-

Спосіб цільової РСК з блукаючим геном (РагКег, У.О. еї аї. (1991) Мисієвїс. Асідв. Кев. 19:3055-3060) використовували для клонування 3' частини домену С2. Специфічний стосовно свині сенсовий праймер, ЗЕО ІЮ

МО17 5-ТСАСООССААТСАОССАСТОСС-3 (нк 6904-6924) синтезували на основі вихідної послідовності домену С2 « та використовували у РСК-реакції з неспецифічними "бСлукаючими" праймерами, вибраними з доступних у 70 лабораторії олігонуклеотидів. РОК-продукти далі таргетували аналізом подовження праймерами (РагкКег еї аї. - с (1991) ВіоТесппідчев 10:94-101)Ї, використовуючи мічену на кінці ЗР специфічну стосовно внутрішнього м праймеру свині БЗЕО ІЮ МО:18 5-СССТООСТОААСОСТСТООСАСОС-3" (нк 6932-6952). Цікаво, що з 40 досліджень я неспецифічних праймерів, тільки два дали позитивні продукти при аналізі подовження праймерами, і ці два продукти відповідали точній та виродженій послідовності людини на Зі закінченні домену С2: 5ЕО ІЮ МО: 19 5-ЗТАСАосТоСТОоТоСссСТоОосСАОсСо-3 (нк 7030-7053) та ЗЕ ІО МО:20 - 5-СТАСАОЗТЗСТОКОССТСОКСАКССТУАО-3, (нк 7027-7053). Ці праймери спочатку призначили для отримання с продукту звичайною КТ-РСК, але вони були невдалими для отримання достатньої кількості продукту, яку можна було б візуалізувати зв'язуванням барвнику броміду етидіуму. Однак, РСК-продукт можна було б ідентифікувати о чутливішим способом подовження праймерами. Цей продукт було очищено на гелі та безпосередньо б 20 секвенсовано. Ці подовжувало 3" послідовність МІ свині до нк 7026.

Додаткову послідовність отримували аналізом подовження праймерами ущільненого РОСК-продукту,

Т» створеного, використовуючи бібліотеку зшитої з адаптером дволанцюгової кКДНК, використовуваної у протоколі 5-КАСЕ, описаному перед тим. У першому раунді реакції використовували точний праймер свині ЗЕО ІЮ МО:21 5-СТТСОСАТОСАСТТОАТОСОСТОТ-3 (нк 6541-6564) та праймер АРІ. У другому раунді реакції 259 використовували ЗЕО ІЮ МО:22 5-ААТСАССАСТОСТОСАСССССО-3" (нк 6913-6934) та праймер АР2. Пряме

Ф! РСЕК-секвенсування подовжувало послідовність З' до закінчення домену С2 (нк 7053). Послідовність домену С2 була унікальною окрім позиції нк 7045 поблизу 3' закінчення домену С2. Аналіз повторюваних реакцій РСК дав о зчитування А, С або подвійне зчитування А/5 на цьому сайті.

Секвенсування продовжували у З' ТК, використовуючи два додаткові праймери, ЗЕО ІЮ МО:23 5-ОА ТОС 60 АСС ССА СОА ОСТ О-3' (нк 6977-6996) та ЗЕО ІЮ МО:24 5-СОС ССТ СА ОСТ СА ОСТ ТСТ АСО-3 (НК 7008-7031). Отримували приблизно 15 по послідовності ЗІ ТЕ, хоча послідовні на кількох сайтах були неясними. Кілька антисенсових праймерів далі синтезували на основі найкращих оцінок 3 нетрансльованої послідовності. Ці праймери включали зворотний комплемент стоп-кодо ну ТОА на їх 3 закінченнях.

РСЮК-продукти отримували з геномної ДНК селезінки свині та кДНК селезінки свині, що візуалізували бо електрофорезом на агарозному гелі та проявленням бромідом етидіуму, використовуючи специфічний сенсовий праймер ЗЕО ІЮО МО: 25 5У-ААТ САС БАС ТОоС ТСС АСС ССС о-3 (нк 6913-6934) та антисенсовий праймер 3

ТК, ЗЕО ІЮ МО:26 У-ССТТОСАССААТТСОАТТСА-3. Для отримання достатньої кількості матеріалу з метою клонування, здійснювали другий раунд РСК, використовуючи ущільнений сенсовий праймер, ЗЕО ІЮ МО:27 5-ССОСТОСТОААСОСТСТОСАСС-3" (нк 6932-6952) та той же антисенсовий праймер. РСОК-продукт розміром 141 по клонували у ЕсокМ-сицї рВішпевстірі І К5-. Послідовність трьох клонів, похідних від геномної ДНК, та трьох клонів, похідних від КДНК, отримували у обох напрямках. Послідовність була безсумнівною окрім позиції нк 7045, де геномна ДНК була завжди А, а кКДНК була завжди 0.

Багатократне суміщення послідовностей ДНК людини, свині, та миші РМ (Фіг. ТА-1Н) 70 Суміщення регіонів АТ, А2, АЗ, С1 та С2 сигнального пептиду здійснювали, використовуючи програму

СГОБТАЇ ММ (Протрзоп, У.О. еї а). (1994) Мисіеїс. Асіав. Кев. 22:4673-680). Очки гепу відкриття та гепу подовження складали 10 та 0,05, відповідно. Суміщення доменів В людини, миші та свині описано перед тим

ІЕІдег еї аїЇ. (1993) вище). Послідовність А2 людини стосується амінокислот 373-740 у БЕО ІЮ МО:2.

Амінокислотну послідовність А2 свині представляє ЗБЕО ІЮ МО:4, а амінокислотну послідовність домену А2 миші /5 представляє ЗЕО ІЮ МО:28, амінокислоти 392-759.

Приклад 6: Експресія активного рекомбінантного фактору МІ! свині без домену В (РВ)

Матеріали

Доповнену цитратом плазму людини з гемофілією А та нормальну поєднану плазму людини отримували від

Сеогде Кіпд ВіотеадісаІ, пс. Сироватку зародка теляти, генетицин, пеніцилін, стрептоміцин, середовище ОМЕМ/Е12 та середовище АІМ-М отримували від Ге Тесппоіодіев, пс. Полімеразу ДНК Тад отримували від

Рготеда. Полімеразу ДНК Мепі отримували від Мем Епдіапа Віоїаб5. Полімеразу РІ та фагемід рВісезстгірі ІІ

КВ- отримували від Зігаїадепе. Синтетичні олігонуклеотиди отримували від І бе ТесппоЇодіез або Стоаспет, Іпс.

Кезігісіоп. Ферменти отримували від Мем Епдіапа Віоїарз або Рготеда. 5'-фосфориловані праймери використовували, коли РСК-продукти виготовляли з метою клонування. Нумерація олігонуклеотидів, Га використовуваних як праймери для полімераз-ної ланцюгової реакції ампліфікації (РСК) кКДНК або геномної ДНК

ТМ свині, використовує КДНК МИ людини як посилання (МУоой еї аїЇ. (1984) Майте 312:330-337). Вектор і9) експресії МІ, позначений як НВ" /КемМео, отримували від Віодеп, Іпс. НВ'/КеМео містить гени резистентності до ампіциліну та генетицину, а кКДНК Р/ПІ людини, що втратила повний домен В, позначена як відщеплений фрагмент Зег/41-Аг91648, продукований тромбіном. Для спрощення мутагенезу домену С2 кКДНК РІ, який Й знаходиться на 3" закінченні вставки М/П у КемМео, у сайт Мої! уводили дві основи 3' для стоп-кодону НВТ /кКеМео «со мутагенезом сплайсингом-ч-астковим перекриванням продовження (5ОЕ) (Ногіоп, К.М. еї аї. (1993) Меййоаз

Епгутої. 217:270-2791. Цей констракт позначено як НВ'/КемМео /Мої!. о

Загальну РНК виділяли кислотною екстракцією з тіоціанатом гуанідінію-фенолом-хлороформом |ІСпотсгупв ю

М, Р. еї аїЇ. (1987) АпаІВіоспет. 4, 8: 156-159). кКДНК синтезували з мРНК, використовуючи зворотну

Зо транскриптазу (ВТ) вірусу Молоні мишачої лейкемії та випадкові гексамери згідно з інструкціями виробника ї- (Рігві-5ігапа соМА Зупіпевзіз Кії, Рпагтасіа Віоїесп). Плазмідну ДНК очищали, використовуючи комплект Оіадеп

Ріазтій Махі Кії (Оіадеп, Іпс.). Реакції РСК здійснювали, використовуючи термоциклер Нураїй ОтпісСепе, використовуючи полімерази ДНК Тад, Мепі, або Ріїї РСК-продукти очищали на гелі, осаджували з етанолу, та « вшивали у плазмідну ДНК, використовуючи лігазу ДНК ТА (комплект Каріа ОМА Іїдайоп Кії, Военгіпдег МаппПеїіт). Плазміди з вмістом вставки використовували для трансформації клітин Е. соїї ЕрісигеапХ! І-Віце. Усі нові З с послідовності ДНК, створені, використовуючи РСК, підтверджували дидезокси-секвенсуванням, використовуючи "» секвенсор Аррііей Віозувіетвз 373 а ашотаїйей ОМА та комплект РКІЗМ дауе (егтіпайг Кії. " Створення гібридного вектору експресії М/П. НР20, що містить домен С2 свині.

КДНК І свині, що відповідає З закінченню домену С1 та усьому домену С2 клонували у рВішевзстірі за допомогою ВТ-РСВ з загальної РНК селезінки, використовуючи праймери на основі відомої послідовності КДНК і ТМ свині ІНеаїеу, 9.Р. еї аїЇ. (1996) Віооса 88:4209-4214). Цей констракт та НВ'/КеМео використовували як ос темплати для створення конденсованрго продукту С1 людини - С2 свині у рВісезсгірі мутагенезом ЗОБЕ.

Фрагмент С1-С2 у цій плазміді видаляли за допомогою Араї! та Мої! та вшивали у АраїМоїІ-сцї НВ /КеМео/Мої! («в) для виготовлення НР20О/КеМео/Мої!. (о) 20 Створення гібридного МІЇ людини/свині без домену В, що містить невеликий ланцюг свині (НР18М)-

ГТ» Невеликий ланцюг МІ людини складається з амінокислотних залишків Азр1649-Туг2332. Відповідні залишки у «ДНК Р/Ш свині були заміщеними для цього регіону НВ 7 для виготовлення гібридної молекули МІ людини/свині, позначеної як НР 18. Це здійснювали заміною РСК-продуктом відповідного регіону А2, домену АЗ, вв домену С1 та частини домену С2 свині відповідного регіону у НР20. Для полегшення створювання синонімічний сайт Ам'тїЇ уводили у позицію нк 2273 на місці з'єднання доменів А2 та АЗ НР20 мутагенезом ЗОЕ. (Ф; Створення гібридного МІ людини/свині без домену В, що містить сигнальний пептид, домен А1 та домен А?

ГІ свині (НР22)-

Сигнальний пептид МІ людини, домен А! та домен А? складаються з амінокислотних залишків во Мек-19)-Аг9740. Відповідними залишками у КДНК РІЇ свині був заміщений цей регіон НВ' для виготовлення молекули, позначеної як НР22. Крім того, синонімічний сайт АмгіЇ уводили у позицію нк 2273 на місці з'єднання доменів А? та АЗ НР22 мутагенезом ЗОБЕ. НР22 створювали конденсацією сигнального пептиду свині-А1-ч-асткового фрагменту А2 у рВішезстгірі ІНеаїу еї аї. (1996) вище) з гібридним МП людини/свині без домену В, що містить домен А2 свині, позначений як НР ЦІ обіп еї а! (1994) вище). 65 Створення домену свині без домену В МІ «(РВ

Фрагмент Зреї/Мої! НРІ18/85 (ЖАмгіЇ)Й розщеплювали за допомогою АмпІ/МоїїЇ та вшивали у розщеплений

АмУпіИМмой НР22/В5 (КАмгії) для виготовлення констракту РВ /В5 (ЖАмгіЇ), який складається з М/П! свині без повного домену В. РВ' клонували у КеМео вшивкою фрагменту Хбра/Моїїз РВ'/В5 (- Ам) у

НР22/КеМео/Мої(тАмгіЇ).

Експресія рекомбінантних молекул РІЇ

РВ'/КеМео/Мой (ЖАмгії) та НР22/КеМео/Моїй! (їАмгіЇ)Й тимчасово трансфектували у клітини СО5 та експресували, як описано перед тим ЦІ ибіп, І.М. еї аї. (1994) 9. Віої. Спет. 269:8639-8641)|. НВ ' /КеМео/Мої без

ДНК (підроблений) трансфектували як контроль.

Активність МІ РВ", НР22, та НВ" вимірювали хромогенічним нижченаведеним дослідженням. Зразки МІ у надосадковій рідині культури клітин СО активували 40НМ тромбіном у середовищах 0,15М Масі, 20ММ ГЕПЕС, 5Мм сАС12, 0,0195 Твін-80, рН 7,4 у присутності ЛОНМ фактору ІХа, 425нМ фактору Х, та 5О0мкМ уніламелярного фосфатидилсерин-Іфосфатидихоліну (25/75 за масою). Через 5 хвилин реакцію зупиняли за допомогою 0,05М

ЕОТА та Т00нМ рекомбінантного десульфатогірудину та утворений фактор Ха вимірювали хромогенічним дослідженням субстрату. У хромогенічному дослідженні субстрату додавали О0,4мММ спектрозиму (Зресігогуте) 19 Хата вимірювали швидкість вивільнення пара-нітроанілід виміром поглинання розчину при 405нм.

Результати надосадкової рідини незалежно трансфектованих дубльованих культур клітин (поглинання при 4о5нм на хвилину)

НВ 13,9

РВ": 139 2 НР22: 100 підробка: «0,2

Ці результати свідчать, що МІ свині без домену В та МП без домену В, що складаються з субелементів

А1 та А2 свині є активними та свідчать, що вони мають вищу активність стосовно МІ людини без домену В. сч

РВ' частково очищали та концентрували з середовища для вирощування гепарин-сефарозною хроматографією. Гепарин-сефарозу (1Омл) урівноважували з 0,075М Масі, 10ММ ГЕПЕС, 2,5мМ Сасі», 0,00590 і)

Твін-80, 0,0295 азидом натрію, рН 7,40. Середовище (100-200мл) від експресуючих клітин застосовували до гепарин-сефарози, яку далі промивали ЗОмл урівноважувального буферу без азиду натрію. РВ' елюювали 0,65М

Масі, 20ММ ГЕПЕС, 5мМ Сасі», 0,01905 Твін-80, рН 7,40 та зберігали при -80еС. Отримана активність стосовно /«ф коагуляції М/П була звичайно 50-75965. со

Стабільна експресія МІ свині без домену В (РВ)

Трансфектовані лінії клітин утримували у середовищі-Е12 Дульбекко, модифікованому середовищі Ігла, що «2 містить 10965 сироватки зародка теляти, 5бодиниць/мл пеніциліну, 5Омкг/мл стрептоміцину. Сироватку зародка ою теляти інактивували теплом при 50 9С протягом одної години перед використанням. НВ /КеМео та

Зо РВ'/ВБемео/Мої! (ї Амгії) стабільно трансфектували у клітини ВНК та селектували на резистентність стосовно - генетицину, використовуючи загальний протокол, що описаний раніше (І ибБріпеї аї. (1994 Віої. Спет. 269:8639-8641|, окрім того, що експресуючі клітини утримували у середовищі для вирощування, що містить бООмкг/мл генетицину. Клітини з колб Согпіпд Т-75, вирощені до конфлюєнтності, переносили у потроєні колби «

Мипс у середовище, що містить бООмкг/мл генетицину, та вирощували до конфлюєнтності. Середовище видаляли та замінювали позбавленим сироватки середовищем АЇМ-М (І їе Тесппоіодієв, Іпс.) без генетицину. не) с Експресію фактор МІ контролювали одно-етапним дослідженням активності стосовно коагуляції фактору МІЇЇ "» (дивися вище) та збирали 100-150мл середовища раз на добу протягом чотирьох-п'яти діб. Максимальні рівні " експресії у середовищі для НВ' та РВ' складали 102 одиниці на мл та 10-12 одиниць на мл активності стосовно коагуляції фактору МІП, відповідно. -1 що Очистка РВ'

РВ' осаджували з надосадкової рідини культури, використовуючи 6095 насичений сульфат амонію та далі 1 очищали імуноафінною хроматографією МУЗ3-3 та високоефективною рідинною хроматографією Мопо С), як о описано раніше для очистки фактору МІЇЇ, похідного з плазми свині (І оПаг ес аїЇ. (1993) Фактор МП/фактор

УШа. Меїйодз Епгутої. 222:128-143). Специфічну активність стосовно коагуляції РВ" вимірювали одно-етапним ме) дослідженням активності стосовно коагуляцій| оІМаг еї аі. (1993) вище), вона була подібною до активності

Т» стосовно коагуляції фактору МІЇЇ, похідного з плазми свині.

При аналізі електрофорезом на 5О5-поліакриламідному гелі препарат РВ' містив три смуги з безсумнівними молекулярними масами 1бОкДа, 82кДа, та 7/бкДа. Смуги 82кДа та 7/бкДа описано раніше як гетеродимер, що 5Б Містить домени А1-А?2 та ар-АЗ-С1-С2 (де ар стосується активаційного пептиду) |(Тоосіе еї аї. (1984) Майшге 312:342-347Ї. Смугу 160кДа переносили у полівініліденфлуоридну мембрану та піддавали МЕОС-кінцевому іФ) секвенсуванню, яке дало послідовність Аго-Пе-Хх-Хх-Туг (де Хх представляє невизначекі групи), яка є ко МН»-кінцевою послідовністю одиничного ланцюга фактору МІЇ! |(Тооіе еї аї. (1984) вище). Отже, РВ' є частково перетвореним розщепленням між доменами А2 та АЗ так, що він складається з двох форм, одиничного ланцюга бо білку А1-А2-ар-АЗ-С1-С2 та гетероди-меру А1-А2/ар-АЗ-С1-С2. Подібне перетворення рекомбінантного НВ 7 описано | іпа еї аі. (1995) Ет. 9. Віоспет. 232:19-27).

Визначення параметрів фактору МІЇЇ свині

Нами визначено послідовність КДНК М/П свині, що відповідає 137 по 5 ТК, кодуючому регіону сигнального пептиду (57 по) та доменів АТ (1119 по), АЗ (990 по), С1 (456 по) та С2 (483 по). В описаному раніше 65 опубліковано послідовність домену В та регіонів активаційного пептиду з невеликим ланцюгом (Тооіе еї аї. (1986) вище) та домен А? ЦІ цбріп еї аї. (1994) вище), описана тут послідовність завершує визначення кКДНК МІЇЇ свині, відповідної трансльованому продукту. Фрагмент, що включає регіон Бі МТК, сигнальний пептид та домен

А1 кДНК, клонували, використовуючи протокол 5-КАСЕ КТ-РСК. Праймер на основі послідовності С2 людини був успішним у продукуванні КТ-РСК-продукту, що призвело до клонування АЗ, СІ та 5'-половини домену С2

КДНК, що відповідає З'--половині домену С2, а КДНК 3 ТК виявляла труднощі для клонування. Залишки домену

С2 в кінцевому рахунку клонували способом РОК крокуючого цільового гену ГРагкег еї аї. (1991) вище).

Послідовність, описана тут як ЗЕС ІО МО:29, була недвозначною окрім позиції на нк 7045 поблизу З! закінчення домену С2, яким є А або С як описано тут вище. Відповідним кодоном є САС (Авр) або ААС (Азвп).

Колонами людини та миші є САС та САС (іп), відповідно. Представляє це поліморфізм або відтворений РОК 70 артефакт невідомо. Рекомбінантний гібридний МІ людини/свині без кКДНК домену В, що містить заміщення домену С2 свині, відповідні обом кодонам САС та ААС, стабільно експресовані без виявлюваної відмінності у прокоагуляційній активності. Це свідчить, що функціональної відмінності між цими двома варіантами домену С2 нема.

Суміщення передбачуваної амінокислотної послідовності ЯМІ свині повної довжини ЗЕСО ІЮ МО:30 з 75 опублікованої послідовності людини (МУосой еї аї. (1984) вище) та миші (ЕїІдег еї аі. (1993) вище) показано у

ФігЛА-1Н разом з сайтами для пост-трансляційної модифікації, протеолітичного розщеплення та розпізнавання іншими макромолекулами. Ступінь ідентичності суміщених послідовностей показано у Таблиці МІЇ. Як описано раніше, домени В цих видів є більш розбіжними ніж домени А або С. Це узгоджується зі спостереженням, що домен В має невідому функцію, незважаючи на його великий розмір (ЕІдег еї аі. (1993) вище; Тооїе еї аї. (1986) вище). Результати представленого винаходу підтверджують, що домен В МІ свині не є необхідним для активності. На основі даних для послідовностей, представлених тут, МІ свині, що має видаленим увесь домен

В або його частину, можна синтезувати експресією кодуючої ДНК МІ свині, з якої видалено увесь домен В свині або його частину. Є також більше відхилення послідовностей, відповідних пептиду домену А1 відщеплюваному АРС/фактором ІХа (залишки 337-372) та активаційному пептиду з невеликим ланцюгом су (Таблиця МІ). Сайта розщеплення тромбіном у позиці 336 для створення пептиду 337-372 є ймовірно втраченими у миші оскільки цей залишок є глутаміном замість аргініну (ЕІдег еї аї. (1993) вище). Відносно і9) швидке відхилення відщдщеплюваних тромбіном пептидів (або у МІ миші можливо остаточного активаційного пептиду 337-372) описано раніше для фібринопептидів |Стеіїдйпіоп, Т. Е. (1993) Ргоїеіпв: Зігисіцгев апа

Моїіесшціаг Ргорегпіез (Білки: структури та молекулярні властивості), МУ.Н. Ргеетап, Мем МогКк, стор. 105-138). «І Втрату біологічної функції цих раніше розщеплених пептидів згадано як можливу причину швидкого відхилення.

Аг9562 у МІ людини запропоновано як більш важливий сайт розщеплення активованого білку С протягом о інактивації Р/ПШІ та 7/Ша (Рау, Ру. ей аї. (1991)7. Віої. Спет. 266:20139-20145). Цей сайт є збережениму Фо

ТМ людини, свині та миші.

Потенційні М-приєднані сайти глікозилування (МХ5/Т, де Х не є проліном) можна бачити у Фіг1ЛА-1Н. Це є о

Вісім збережених М-зв'язаних сайтів глікозилування: один у домені Ат, один у домені А2, чотири у домені В, - один у домені АЗ та один у домені С1. Цистеїни доменів 19 А та С є збереженими, при тому, що є відхилення цистеїнів домену В. Шість з семи дисульфідних зв'язків у МІ знайдені у гомологічних сайтах у факторі М та церулоплазміні, а обидва дисульфідні зв'язки домену С знайдені у факторі М /МсеМиїйеп, В.А. еї аї. (1995) «

Ргоївіп Зсі. 4:740-7461|. МІ людини містить сульфовані тирозини у позиціях 346, 718, 719, 723, 1664 та 1680 (Рійтап, 0.0. ег а). (1992) Віохімі21:3315-3325; Місппіск, О.А. ей а (1994) у. Віої Сет. 8 с 269:20095-201021. Ці залишки є збереженими у МІ миші та МІ свині (Фіг.1), хоча програма СІ О5ТАЇ МУ була ц невдалою для суміщення тирозину миші, відповідного Туг346 у /ІЇ людини. "» Плазма миші та свині може коректувати дефект клонування у плазмі людини-пацієнта з гемофілією А, що узгоджується з рівнем збереження залишків у доменах А та С цих видів. Прокоагуляційна активні МІ свині є

Чудовою у порівнянні з І людини (Гоїаг, Р. еї а. (1992) У. Віої. Спет. 267:23652-23657)|. Рекомбінантний -І фактор МІ! свині (з видаленим В доменом), експресований та очищений, як тут описано, також виявляє більшу специфічну активність стосовно коагуляції, ніж МІ людини, порівняно з М/П, похідним з плазми свині. Це і-й може бути внаслідок зменшеного спонтанного відщеплення субелементу А2 від активного гетеротримеру "Ша ав! АЛ/А2/АЗ-С1-С2. Чи відбиває ця відміна у прокоагуляційній активності еволюційну зміну у функції як приклад видів адаптації (Регші, М.Р. (1996) Айм. Ргоївій Спет. 36:213-244) невідомо. Зараз через те, що

Фо послідовність КДНК МІ свині, відповідна трансльованому продукту, є повною, мутагенез скануванням гомологів

Чл» ІСиппіпойат, В.С., ей а). (1989) Зсіепсе 243:1330-1336| може забезпечити шлях ідентифікації структурних відмінностей між МІ людини та свині, що відповідають за кращу активність останньої.

ТМ свині є звичайно менш реактивним стосовно інгібувальних антитіл, що з'являються у гемофіліків, яким вливали МИ або з'являються як автоантитіла у звичайній популяції. Це є базисом для використання концентрату Р/Ш свині при лікуванні пацієнтів з інгібувальними антитілами (Нау та Іогіег (1995) вище).

Ф, Більшість інгібіторів спрямована проти епітопів, що знаходяться у домені А2 або домені С2 |(Еціспег, С.А. еї ко а. (1985) Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 82:7728-7732; ЗсапаейМйа, О. еї а). (1988) Ргос. Маї. Асад. Зсі. ОБА 8:6152-6156; ЗсапаеМа, О. ей аї. (1989) Віоса, 74:1618-1626). Крім того, ідентифіковано епітоп невідомого бо значення, що є у домені АЗ або домені С1 |ЗсапаеїМа еї аІ. (1989) вище; ЗсапаейМа, О. еї аї. (1993) Віоса 82:1767-1775; Макаї, Н. еї аЇ. (1994) Віоод 84:224а)|. Епітоп А2 картовано до залишків 484-508 мутагенезом сканування гомологів ІНеаїеу еї а). (1995) вище). У цьому сегменті з 25 залишків є відносно низька пропорція ідентичної послідовності (16/25 або 6495). Цікаво, що цей регіон, як виявлено, є функціонально важливим на основі того факту, що антитіла до нього є інгібувальними, ймовірно підданими впливу відносно більш швидкого 65 генетичного дрейфу. Суміщення доменів А2 та АЗ свині свідчить, що епітоп А? не приймає участі у виявлюваній гомології з відповідним регіоном у домені АЗ.

Епітоп С2 інгібітору МІ людини, як показано, розташовано за допомогою делеційного картування серед залишків 2248-2312 |Зсапаейа, О. еф аїЇ. (1995) Віоодй 86:1811-1819). Я/ПЇ людини та свині є на 8390 ідентичними у цьому сегменті з 65 залишків. Однак, мутагенезом скануванням гомологів цього регіону для визначення параметрів епітопу С2 виявлено, що головний детермінант епітопу С2 був неочікувано виявленим у регіоні, відповідному амінокислотам людини 2181-2243 (5ЕО ІЮО МО:2) та з Фіг Н.

Створювали гібридні білки фактору МІ людини-свині, в яких різні частини домену С2 фактору МІ людини замінювали відповідними частинами фактору МІ свині, використовуючи описану тут стратегію. (Приклад 5)

Синтезу різних С2-гібридних факторів МІ досягали створенням гібридної кодуючої ДНК, використовуючи 7/0 нуклеотидну послідовність, що кодує регіон С2 свині, представлений у ЗЕО ІЮ МО:30. Кожну гібридну ДНК експресували у трансфектованих клітинах так, щоб гібридні фактори МІ можна було б частково очистити від середовища для вирощування. Активність у відсутність будь-якого інгібітору вимірювали одно-етапним дослідженням згортання.

Сукупність п'яти інгібіторів людини використовували для дослідження кожного гібридного фактору МІП.

Інгібітор плазми, що містить антитіло проти фактору МІЇЇ, як описано раніше, показаний як спрямований проти домену С2 людини на основі здатності рекомбінантного домену С2 людини нейтралізувати інгібування. В усіх досліджених зразках плазми титр інгібітору нейтралізували більше, ніж на 7995 доменом С2 або невеликим ланцюгом, але меншим за 1095 від рекомбінантного домену А? людини. На додаток, С2-гібридні фактори МІЇЇ досліджували проти моноклонального антитіла миші, яке зв'язує домен С2 та подібно інгібіторним антитілам С2 людини, воно інгібувало зв'язування фактору МІ з фосфоліпідом та фактором вон Віллебранда.

Порівнянням титрів антитіла-інгібітору проти С2-гібридних факторів МІ було показано, що головний детермінант епітопу С2 інгібітору людини є регіоном залишків 2181-2243 (5ЕО ІЮ МО:2, дивися також Фіг.1Н).

Антитіла проти С2, спрямовані до залишку 2253 СООН-кінцевого регіону, не були ідентифіковані у чотирьох з п'яти сироваток пацієнтів. При порівнянні гібридів, що мають послідовність свині, відповідну амінокислотним сч ов залишкам людини під номерами 2181-2199 та 2207-2243, виявляється ймовірним, що обидва регіони сприяють зв'язуванню антитіл. Амінокислотна послідовність свині, відповідна залишкам 2181-2243 людини, має (8) амінокислоти під номерами 1982-2044 у БЕО ІЮ МО:30. Послідовність ДНК свині, що кодує амінокислоти свині під номерами 1982-2044 є нуклеотидами під номерами 5944-6132 у ЗЕО ІЮ МО:29.

Звертаючись до Фіг1Н, можна бачити, що у регіоні 2181-2243, є 16 амінокислотних відмінностей між «г зо послідовностями людини та свині. Відмінності знайдені на залишках 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 та 2243. Амінокислотні заміщення на одному чи більше залишках під цими со номерами можна проводити для створення модифікованого фактору МІЇЇ людини, не реактивного стосовно о інгібіторного антитіла проти С2 людини. Мутагенез скануванням аланіну забезпечує зручний спосіб заміщення аланіном природно існуючих залишків, як описано раніше. Амінокислоти, що не є аланіном, можуть також бути о заміщеними, як описано тут. Заміщення аланіном окремих амінокислот, особливо тих, які є неїдентичними між ї- амінокислотами людини/свині або людини/миші, або які є найбільш підхожими для сприяння зв'язуванню антитіл, може дати модифікований фактор МІ! зі зменшеною реактивністю стосовно інгібувальних антитіл.

ФігЛА-1Н, узята разом представляє порівняння суміщених послідовностей кислот фактору МІЇІЇ людини, свині та миші. ФіглтА порівнює регіони сигнального пептиду (людини, ЗЕО ІЮ МО:31; свині, ЗЕО ІЮ /МО:30, « амінокислоти 1-19; миші, ЕС 10 МО:28, амінокислоти 1-19). Зауважимо, що амінокислоти у Фіг1А-1нН з с пронумеровані по першому аланіну повного білку як номеру 71, з амінокислотами сигнального пептиду . позначеними негативними номерами. Послідовність МІ людини у 5ЕО ІЮ МО:2 також починається першим и?» аланіном повного білку як амінокислота номер 1. У амінокислотних послідовностях МІ миші (ЗЕ ІЮ МО:28) та

ТМ свині (ЗЕО ІЮ МО:30), перша амінокислота (аланін) повної послідовності є амінокислотою номер 20.

Фіг1А-1Н показує суміщення відповідних послідовностей МІ людини, миші та свині так, щоб регіони -І найбільшої амінокислотної ідентичності були накладеними. Амінокислотні номери у Фіг1А-1Н стосуються тільки

ТМ людини. Фіг.18 представляє амінокислотні послідовності домену АТ людини (5ЕО ІЮ МО:2, амінокислоти о 1-372), свині (ЗЕО ІЮ МО:30, амінокислоти 20-391) та миші (ЗЕО ІЮО МО:28, амінокислоти 20-391). Фіг1С о представляє амінокислотні послідовності доменів А2 фактору МІЇЇ від людини (ЗЕО ІЮО МО:2, амінокислоти 313-740), свині (ЗЕО ІЮ МО:30, амінокислоти 392-759) та миші (ЗЕО ІЮ МО:28, амінокислоти 392-759). Фіг1О ме) представляє амінокислотні послідовності доменів В фактору МІїЇ людини (ЗЕО ІЮ МО:2, амінокислоти 741-1648), ї» свині (ЗЕО ЕО МО:30, амінокислоти 760-1449) та миші (ЗЕО ІЮ МО:28, амінокислоти 760-1640). Фіг1Е порівнює амінокислотні послідовності активаційного пептиду фактору МІЇЇ з невеликим ланцюгом людини, свині та миші (5ЕО ІЮ МО:2, амінокислоти 1649-1689; 5ЕО ІЮ МО:30, амінокислоти 1450-1490; та 5ЕО ІЮ МО:28, амінокислоти 1641-1678, відповідно). Фіг1Е представляє порівняння послідовностей доменів АЗ фактору МІЇЇ людини, свині та миші (ЗЕО ІЮ МО:2, амінокислоти 1690-2019; 5ЕО ІЮО МО:30, амінокислоти 1491-1820; та 5ЕО ІЮ МО:28, (Ф) амінокислоти 1679-2006, відповідно. Фіг.155 представляє амінокислотні послідовності фактору МІ доменів С1 ка людини, свині та миші (ЗЕО ІО МО:2, амінокислоти 2020-2172; ЗЕО ІЮ МО:30, амінокислоти 1821-1973; та БЕО ІЮ

МО:28, амінокислоти 2007-2159, відповідно). Фіг/Н представляє дані послідовностей доменів С2 фактору МІЇ бо людини, свині та миші (ЗЕО ІО МО:2, амінокислоти 2173-2332; 5ЕО ІЮ МО:30, амінокислоти 1974-2133; та БЕО ІЮ

МО:28, амінокислоти 2160-2319, відповідно).

Ромби показують сайти сульфатування тирозину, припустимі сайти зв'язування фактору ІХа, фосфоліпід та білок С двічі підкреслено, а регіони, включені у зв'язування інгібу- вальних антитіл проти А? та проти С2 виділені курсивом. Зірочки позначають амінокислотні послідовності, які є збереженими. Дивися також ЗЕО ЕО 65 МО:29 (КДНК фактору МІ! свині) та ЗЕО ІЮ МО:З30 (встановлена амінокислотна послідовність фактору МІЇЇ свині).

Систему нумерування людини використовують як посилальну |(МУоса еї аї. (1984) вище). Домени Ат, А2 та В визначають сайтами розщеплення тромбіном у позиціях 372 та 740, а невідомі сайти розщеплення протеазою у позиції 1648 як залишки 1-372, 373-740 та 741-1648, відповідно (Еаіоп, Ю.Ї. еї аії. (1986) Віоспетівігу 25: 8343-8347). Домени АЗ, С1 та С2 визначають як залишки 1690-2019, 2020-2172 та 2173-2332, відповідно (Мепаг еї а), (1984) вище). Сайти розщеплення для тромбіну (фактор Іа), фактору ІХа, фактору Ха та АРС (Рау еї а). (1991) вище; ЕЕайп, 0. ей аЇ. (1986) Віоспетівігу 25:505-512; Іатрпеаг, В.). ей аїЇ. (1992) Віоса 80:3120-3128) показані розміщенням позначки ферменту над реактивним аргініном. Кислотний пептид відщеплюють від невеликого ланцюга МИ тромбіном або фактором Ха у позиці 1689. Припустимі сайти зв'язування фактору ІХа |Рау, Р. 9. еї аїЇ. (1994) 9. Віої. Спет. 269:20522,20527; І епііпд, Р.). еї аї. (1994) 7/0. Віої. Спет. 269:7150-7155), фосфоліпіду (Розіег, Р.А. еї аї. (1990) Віоса 15:1999-2004) та білку С(уУмаїКег,

ЕУ. еї аї. (1990) 9. Віої. Спет. 265:1484-1489| подвійно підкреслено. Регіони, залучені у зв'язування анти-А?2 (Сибіп еї аї. (1994) вшце, Неаїеу еї а). (1995) вище); та описані раніше припустимі інгібувальні антитіла для анти-С2 виділено курсивом. Епітоп інгібітору С2, ідентифікований як тут описано (амінокислоти людини 2181-2243), показано одиничним підкресленням у Фіг1Н. Сайти сульфатування тирозину |Рійтап еї аї. (1992) /5 вище; Міснпіск еї а. (1994) вище) показані ромбом.

Приклад 7: Створення РОЇ 1212 та експресія у клітинах нирок дитинчати хом'яка.

РОЇ 1212 є частковим фактором МІ свині без домену В, в якому домен В видалено, окрім того, що залишені 12 амінокислот МН»-закінчення домену В та 12 амінокислоти СООН-закінчення.

КДНК, що кодує послідовності доменів АТ, А2, ар-АЗ-С1 та С2 МІ свині отримували як описано у прикладі 5. Нуклеотидна послідовність ДНК та похідна амінокислотна послідовність фактору МІЇЇ свині представлені як

ЗЕО ІЮО МО:29 та БЕО ІО МО:З0, відповідно. Ампліфіковані фрагменти окремо клонували у плазміді рВінезстірі Н

К5Тт (рв).

РОЇ 1212 стосується КДНК, що кодує МІ свині, втратив більшу частину домену В, але містить послідовність

ДНК, що кодує лінкер з 24 амінокислот між доменами А?2 та ар. РОЇ 1212 створювали у векторі експресії ссавця, сч ов Кемео, який отримували від Віодеп. КеМео може реплікуватися у бактеріях, реплікуватися як епісома у клітинах

Со для тимчасової експресії фактору МІЇ, або його можна стабільно інтегрувати у більшість клітин ссавця. і)

Він складається з 1) послідовностей, похідних з плазміди рВК322, що включають початок реплікації та ген резистентності до ампіциліну, 2) ген резистентності до неоміцину, експресія якого знаходиться під контролем промотеру/енхансеру 5М40, невеликого Гінтрону 5М40 та регуляторних елементів сигналу поліаденілування «г зо ЗМ40, 3) сайту для вставки МИ та його сигнального пептиду, експресія яких знаходиться під контролем енхансеру 5М40, головного останнього промотеру аденовірусу типу 2 та тричастинної лідерної послідовності ісе) аденовірусу типу 2. Будь-який вектор, що має подібні функціональні компоненти можна використовувати замість о вектору КеМео.

РОЇ 1212/КемМео виготовляли у кілька етапів. Спершу, кДНК, що кодує великий ланцюг МІ свині (А1-А2), та о

КДНК, що кодує невеликий ланцюг МІ свині (ар-АЗ-С1-С2), окремо уводили у рВ5. З цих констрактів ДНК, що ї- кодує МІ свині без домену В, уводили у рВ5 (РВ'У/рВ5). Ця форма ГИ свині втрачає повний домен В, позначений як відповідні амінокислотним залишкам 741-1648 у МІ людини (нуклеотиди людини 2278-5001).

Далі, ДНК, що кодує А2 свині, було заміщено домен А? людини у векторі експресії КеМео МІ людини без « домену В (НВ'/КеМео). ДНК, що кодує залишок великого ланцюга свині, та ДНК, що кодує невеликий ланцюг свині було заміщено домени людини у двох додаткових етапах, використовуючи великий ланцюг свині/рВ5 і - с констракти РВ7рВ5, створені раніше. Фрагмент домену В людини, що кодує 5 С-кінцевих та 9 М-кінцевих а амінокислот було вставлено між доменами А?2 та АЗ, що продукують констракт під назвою РЗО/КемМео |Неаїеу еї "» а. (1998) 92:3701-3709). Залишки (1І02181-МаІ2243 містили головний детермінант інгібувального епітопу у домені С2 фактору МІ людини). Цей констракт використовували як темплат для створення фрагменту домену свині В, що кодує 12 С-кінцевих та 12 М-кінцевих амінокислот. Цей фрагмент було вставлено між доменами А?2 та -і АЗ, отримавши кінцевий констракт, РОЇ 1212/КеМео. сл Лінкер РОЇ 1212 з 24 амінокислот складається з перших 12 та останніх 12 залишків домену В І свині.

Лінкер РОЇ 1212 має таку послідовність: («в) ЗЕАОМЗАРРЗАЗАРКРРМІ ККЕНОК. (ЗЕО ІЮ МО:32) б 50 Нуклеотидна послідовність, що відповідає лінкеру 1212 та оточуючим амінокислотам така:

Ії» СТ АТ БААССТ АБС АБС ОСССАЄ ЛАТ ТА АбАСОСОСТАСТ Осо (ОТО КОг3 95 У її БЕ я 98 ЕжЕ й б мМ я м В Р 8 Ах ю ОС ОССстесА АС ССТ СОТ СТО СОС САТСАСАСОСАСАтТа

І зе ше ше не м ж пише Си з ох п я В У "7" дес сттсостАст

Іще еще Ше

Лінкер РОЇ 1212 синтезували мутагенезом сплайсингом з частковим перекриванням подовження (ЗОЕ) таким бе ЧИНОМ:

Реакції РСК, використовувані для створення продуктів ЗОЕ були такими:

Реакція Мо1

Зовнішній праймер: Кем 4, який є праймером А2 свині, нуклеотиди 1742-1761. (ЗЕО ІЮО МО:29) Послідовність така: 5-«САССААААССАСАТОАТОТСА-3 (ЗЕО І МО:34)

Внутрішній праймер: 01 12, який є зворотним праймером свині, що покриває перші (5) 15 амінокислот ОЇ 1212 та останні (3) 5 амінокислот А2 свині. Послідовність така: 5-СТТТОСАОСОСТСОСАСТАСККККЗТСТТОААТТСТОООСАААОСТССТАООСТТСААТ ОАС-3 (5ЕБО ІЮ МО:35)

Темплат: РЕСУКеМео

Продукт: ДНК свині від нуклеотиду 1742 у домені А2 до 2322 у ОЇ 1212, 580 по 70 Реакція Мо2

Зовнішній праймер: Р2949 є зворотним праймером АЗ свині, нуклеотиди 2998-3021 з 5ЕО І МО:29.

Послідовність така: 5-ССТСАСТТОТСТАССОТОАССАСС-3 (дивися ЗЕО ІЮ МО:29)

Внутрішній праймер: 0112, праймер свині, що покриває останні (3) 16 амінокислот 01 1212 та перші (5) 6 амінокислот активаційного пептиду, нуклеотиди 2302-2367 з 5ЕО 10 МО:29. Послідовність така: /75 З-ССТАСТОСОАССОСТОСАААВССТоСООТССТОСОАСООСАТСАСАСОСАСАТА АОССТТССТАСТ-3 (ЗЕ 10

МО:З36)

Темплат: РЕСУКеМео

Продукт: свині від нуклеотиду 2302 у ОЇ 1212 до нуклеотиду 3021 у домені АЗ, 719 по

Реакція БОЕ

Праймери: Кем 4, Р2949-

Темплати: Фрагмент з гхпя (по) та низько плавкий фрагмент з гхпЯ2 (по)

Продукт: ДНК свині від нуклеотиду 1742 у домені А? до нуклеотиду 3021 у домені АЗ (ЗЕО ІРО МО:29), включаючи 01 1212, 1279 по. Продукт реакції осаджували етанолом.

Лінкер 1212 вставляли у РЗО/У/КеМео розрізанням продукту 5ОЕ (вставка) та РІО/КемМео (вектор) за с об допомогою ВзаВ І. Вектор та вставку зшивали, використовуючи лігазу Т4, а продукт використовували для трансформації клітин Е. соїї ХІІ-Віле. Плазмідну ДНК виготовляли з кількох колоній та послідовність лінкеру і) 1212 та іншу РСОК-створену послідовність підтверджували аналізом послідовності ДНК.

Культура клітин нирок дитинчати хом'яка (ВНК) СКІ -1632

Лінію клітин ВНК отримували у АТСС (Американська колекція типових культур), каталог ідентифікації «г зо СКІ-1632 та зберігали замороженими при -202С до наступного використання. Клітини розморожували при 372 та поміщали у ТОмл повного середовища, позначеного як ОМЕМ/Е12, 5бодиниць/мл пеніциліну, 5Омкг/мл о стрептоміцину плюс 1095 сироватки зародка теляти (ЕВ5). ЕВЗ отримували від Нусіопе, І одап (Лан. Клітини о центрифугували протягом 2 хвилин при ЗО0боб/хвил. Середовище відсмоктували та клітини знов суспендували у двох мл повного середовища у колбі Т-75, що містила 20мл повного середовища. о

РОЇ 1212 експресовано у клітинах нирок дитинчати хом'яка (ВНК) та клітинах яєчнику китайського хом'яка ї- (СНО). Використовували дві лінії ВНК, лінію СКІ -1632 від АТСС та іншу лінію ВНК, отриману від К. МсаойЇмгау,

Опімегейу ої Вгйіївп Соіштбіа, (РопК, еї аїЇ. (1990) Віоспетівігу 29:1654-1660). Останню субкультивували без селекції у лабораторії винахіднику та позначали як ВНК 1632 (Етогу). Лінією клітин СНО була СНО-КІ1, надходження у АТСС СС -61. Експресія звичайного клону з лінії клітин Етогу та з клітин СНО-КІ1 була трохи « 720 Вищою, ніж з клітин СКІ--1632, як оцінено за активністю у хромогенічному дослідженні. шщ с Клітини, вирощені у колбі Т-75, утворювали конфлюєнтний моношар. Виготовляли бОмл культури клітин Е. й соїї ХГ І-ВіІсе у І В/амфіциліні (5Омг/мл), що несуть плазміду РОЇ 1212/КемМео. «» Трансфекція клітин СКІ -1632 ВНК З РОЇ 1212/КеМео

ДНК з вирощуваної протягом ночі культури клітин РОЇ 1212/КеМео ХІІ-Віце виготовляли, використовуючи

Комплект Оіадеп, Маіепсії, СА Зріп Міпіргер КЕ. Одну колбу з клітинами СКІ-1632 розділяли у колбу для -і резерву з О0,2мл та колбу для трансфекції з О,Змл від 2мл загальних. Іншу колбу завантажували свіжим середовищем. Середовище було ОМЕМ/Е12 ж- 1095 Нусіопе ЕВ5 ж- 5бодиниць/мл пеніциліну, 5Омкг/мл іні стрептоміцину. Клітини СКІ-1632 розподіляли на б-коміркові планшети, призначені для 50-9095 конфлюєнтності о для трансфекції (О,Змл клітин з колби Т-75 у 2мл 1:5000 Мегзепе (Ме Тесппоіодіев, Сайпегвзриго, МОЇ у

Кожній комірці), використовуючи свіже ОМЕМ/Е12 ж 10956 Нусіопе ЕВ5 ж 5бодиниць/мл пеніциліну, 5Омкг/мл

Фо стрептоміцину. Наступні розчини виготовляли у стерильних тест-тубах на 1-2мл:

Та» А) 48мкл (1Омкг) мініпрепарату ДНК РОЇ 1212/КеМео плюс мкл середовища без сироватки (ОМЕМ/Е12) плюс 1Омкл ліпофектину (І іІрогГесііптм, | Ме Тесппоіодієв, Сайпетезриго, МО).

В) 10мкл ліпофектину плюс 190мкл середовищ (підроблена трансфекція) обережно перемішували та ДНК з ліпофектином давали реагувати протягом 15 хвилин, перемішуючи при кімнатній температурі. Протягом цього часу клітини двічі промивали 2мл ЮОМЕМ/Е12. До клітин далі додавали 1,я9мл ОМЕМ/Е12. Комплекс о ДНК/ліпофектин додавали краплями до клітин та обережно перемішували. Клітини залишали в інкубаторі ко протягом ночі. Видаляли ДНК/ліпофектин та додавали до клітини Змл середовища з сироваткою. Інкубували клітини 30-48 годин. Генетицин отримували від Ійе Тесппоіодіев, Сайпегезриго, МО. Культури клітин 60о розподіляли 1:20, 1:50 та 1:100, 1:250, 1:500 на чашки розміром їОсм у ТОмл середовища з сироваткою, що містило 5ЗБ5мкг/мл генетицину. Протягом наступних кількох діб клітини, що не отримували плазміду

РОЇ 1212/КеМео, вмирали внаслідок присутності генетицину. Залишкові клітини продовжували реплікува-тися у генетицині, утворюючи видимі моношарові колонії на чашках.

Експресія та дослідження РОЇ 1212 з клітин ВНК СКІ -1632 65 Невеликі пластикові циліндричні кільця розміщали навкруги колоній. Колонії відсмоктували окремо, використовуючи повне середовище, та переносили у тест-туби. Ці колонії позначено як кільцеві клоновані колонії. Кільцеві клоновані колонії розміщали окремо на 24-коміркові планшети та вирощували у повному середовищі.

Дослідження хромогенічного субстрату стосовно експреси фактору МІ трансфектованими клітинами

СтІ-1632

Зразки РОЇ 1212 з надосадкової рідини культури клітин змішували з ХОНМ очищеного фактору ІХа свині та середовищ 0,05мМ фосфотидилхоліну/фосфотидилсерину (РСР) у 015М Масі, 20мММ ГЕПЕС, 5мМ Сасі», 0,0195 Твін 80, рН 7,4. Як контроль використовували культиваційне середовище клітин з підроблено-трансфектованими клітинами. 70 Тромбін та фактор Х додавали одночасно до кінцевої концентрації 40 та 425нНМ, відповідно, тромбін активує фактор МІП, який далі разом з РСР5 виявляє себе як кофактор для фактору ІХа протягом активації фактору Х.

Через 5 хвилин активацію фактору Х фактором Ка/фактор МНіа/"РСР5 зупиняли додаванням ЕДТА до кінцевої концентрації ХОММ. В той ж час активацію фактору МІ тромбіном зупиняли додаванням інгібітору тромбіну, рекомбінантного десульфатогірудину, до кінцевої концентрації 1О0ОнНМ. Зразок реакційної суміші об'ємом 25мкл переносили у мікротитрувальну комірку, до якої додавали 74мкл бресігогуте Ха (Атегіса

Оіадповіїса, Сгеепжіст, СТ), який є хромогенічним субстратом для фактору Ха. Кінцева концентрація

Зресігогуте Ха була 0,б6мМ. Поглинання при 405нм внаслідок розщеплення Зресігогуте Ха фактором Ха відстежували безперервно протягом 5 хвилин за допомогою зчитувача Мтах Кіпеїйїс Ріаїе Кеадег (Моіесшаг

Оемісез, Іпс., Мепіо рагк, СА). Результати виражено у термінах Адов/хвилину.

Хромогенічне дослідження фактору МІЇЇ десяти кільцевих клонованих колоній: сч о 611760 « зо нс ЕЕ о в 18 о ою

Ці результати свідчать, що усі десять колоній, що були вибрані, експресували активність фактору МІ, яка ч- щонайменше у десять разів більша, ніж фон.

Активність середовищ колонії 8, яка була найвищою експресуючою колонією, далі досліджували одно-етапним дослідженням фактору МІ згортанням. У цьому дослідженні 5Омл плазми з нестачею фактору МІЇЇ « (Сеогде Кіпд Віотедісаї! Омепапа Рагк, КА), бБмл зразку або стандарту та 5Омл активованого реагенту тромбопластину з частковим часом (Огдапоп Текпіка, Оигпат, МС) інкубували З хвилини при 372С Зразки ей с включають середовище колонії 8, розбавлене 0,15М Масі, мм ГЕПЕС, рН 7,4 (НВ5) або, як контролем, повним а середовищем. Згортання ініціювали додаванням 50мл 20мМ Сасі». Час згортання вимірювали, використовуючи "» пристрій 5714 ВІО Соадшайоп Іпзігитепі (Оіадповіїса біадо, Рагзіррапу, МУ). Стандартні криві отримували розбавленням поєднаної, обробленої цитратом плазми нормальної людини, партія 0641 (Сеогде Кіпо Віотеаісаї,

Омепапа РагкКк, КА). Концентрація фактору МІ! стандарту була 0,9 одиниці на мл. -і Стандартна крива:

Лінійна регресія часів згортання залежно від логарифму концентрації стандарту дала коефіцієнт кореляції і-й 0,997. («в)

Розбавлення одиниць/мл Час утворення тромбу

Ме, 1) Нерозбавлене 0,96 452

ГТ» 23. 1/3 (НВ) 0,32 53,7 3) 1711 (НВ5) 0,087 62,5 4) 01/21 (НВ8) 0,046 68,9

Тест-речовини дали такі часи згортання, які перетворювали на одиниці/мл, використовуючи стандартну (Ф, криву: іме)

Зразок Час утв. тромбу (сек) одиниць/мл 60 1) Колонія 8 (24 години), 110 у НВЗ 40,6 1,74Х10-17 4 2) Колонія 8 (24 години), 1/110 у НВ5 411 1,63х10-16,3 3) Колонія 8 (24 години), 1/20 у НВЗ АТ 0,69х20-13,8 4) Колонія 8 (24 години), 1/20 у НВ5 472 0,73х20-14,6 5) Повне середовище 82,9 0,007 65 6) Повне середовище 83,3 0,006

Ці результати свідчать, що активність згортання колонії 8 приблизно у 2000 разів вища за активність контрольного зразку.

Послідовність ДНК, що кодує РОЇ1212 представлена як 5ЕО ІЮО МО:37. Кодована амінокислотна послідовність РОЇ 1212 представлена як 5ЕБЕО ІЮ МО:38. Подальшу очистку РОЇ 1212 можна проводити, використовуючи різні відомі способи, як-то імуноочисну хроматографію та ВЕРХ хроматографію - дивися приклади 2 та 3.

Загальні висновки

Слід розуміти, що невеликі варіації амінокислотної послідовності або послідовності ДНК, яка кодує таку 7/0 послідовність, що стосується РОІ.1212, молена уводити без появи суттєвих атрибутивних функцій. Наприклад, довжину послідовності домену В, залишену як лінкер між доменом А? та активаційним пептидом, можна збільшувати або зменшувати у відомих в рівні техніки межах. У регіон лінкеру можна уводити варіанти послідовностей, залишаючи еквівалентні функціональні параметри РОЇ 1212, які виявлено тут, та фактору МИ! свині без домену В, які виявлено тут та які відомі в рівні техніки. На основі порівнянь відомих /5 амінокислотних послідовностей фактору МІ, що мають активність стосовно коагуляції у крові людини, варіанти послідовностей, як-то заміщення окремих амінокислот або заміщення сегментів пептиду відомими функціональними варіантами, можна створювати у базовій амінокислотній послідовності РОЇ 1212, залишаючи еквівалентні їй функціональні параметри. Наступні типи варіацій не є вичерпувальними, а просто прикладами модифікацій послідовностей, що могли б бути створеними звичайними фахівцями в даній області, без суттєвої

Модифікації функціональних параметрів білку. Усі так варіанти та модифікації включено до рамок винаходу як заявлені або як їх еквіваленти.

Перелік послідовностей ІЮ:

ЗЕО ІО МО: Ідентифікація сч 1 КДНК фактору МИ! людини. Кодування амінокислоти номер 1 повного білку починається на нуклеотиді номер 208. 2 Амінокислотна послідовність фактору людини о 3 КДНК домену А2 фактору МІЇ! свині

А Амінокислотна послідовність домену А2 фактору МИ! 5-27 Олігонуклеотидний праймер посл. (Приклад 5) «І 28 Амінокислотна послідовність фактору МІ! миші 29 КДНК фактору МІЇ! свині со

Зо Амінокислотна послідовність фактору МІЇЇ свині о 31 Амінокислотна послідовність сигнального пептиду фактору МИ! людини 32-36 Олігонуклеотидний праймер (Приклад 7) юю 37 Кодуюча РОЇ. 1212 ДНК ч- 38 Амінокислотна послідовність РОЇ 1212

Claims (12)

1. Формула винаходу ч -

   с 1. ДНК, що кодує амінокислотну послідовність модифікованого фактора МІ свині (РОЇ 1212), яку :з» представлено у 5ЕО ІЮО МО:З8.
2. 2. Вектор експресії, що містить ДНК за п. 1.
3. З. ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що має нуклеотидну послідовність БЗЕО ІЮ МО:37.
4. - 4. Вектор експресії, що містить ДНК за п. 3.
5. 5. Модифікований фактор МІ! свині, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:З8.
6. 1 6. Терапевтична композиція, що містить модифікований фактор МІ свині за п. 5 та фізіологічно прийнятний о носій.
7. 7. Спосіб виготовлення білка модифікованого фактора МІ! свині, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ б» МО 38, який включає введення вектора за п. 2 або п. 4 у клітину-хазяїн ссавця та експресію у клітині-хазяїні Т» ссавця ДНК, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:З8.
8. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що ДНК, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕСО Ю МО:38, додатково містить послідовність ДНК, яка кодує сигнальний пептид, внаслідок чого з клітин-хазяїнів ссавця виділяється білок модифікованого фактора МІ! свині.
9. 9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що сигнальний пептид має амінокислотну послідовність з (Ф) амінокислот 1-19 БЕО ІЮ МО:З0. ГІ
10. 10. Клітина-хазяїн ссавця, що включає та реплікує вектор експресії, який містить ДНК, яка кодує амінокислотну послідовність РОЇ 1212, представлену ЗЕО ІЮ МО:З8. во
11. 11. Клітина-хазяїн ссавця за п. 10, яка відрізняється тим, що вектор-експресії, який містить ДНК, містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:37.
12. 12. Клітина-хазяїн за п. 11, яка відрізняється тим, що клітиною-хазяїном є ВНК СКІ -1632. б5