ME00601B

ME00601B - Modified factor viii

Info

Publication number: ME00601B
Application number: MEP-2009-82A
Authority: ME
Inventors: John S Lollar
Original assignee: Univ Emory
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2011-12-20
Also published as: NO20024296L; EP1280540B1; BRPI0109131B1; RU2002124123A; IL151371A0; AU3841601A; PT1280540E; WO2001068109A1; MEP8209A; JP4044337B2; BR0109131A; US6458563B1; CA2400295A1; BR122013026957A8; EP1280540A1; DE60133541T2; CY2016011I1; CZ298250B6; PL359672A1; CY2016011I2

Abstract

Pronalazak se odnosi na modifikovani, lišen B-domena, svinjskifaktor VIII, na DNK za kodiranje istog, i na njegovu upotrebu za lečenje hemofilije.

Description

POZIV NA SRODNE PATENTNE PRIJAVE

Ova patentna prijava ima pravo prvenstva na osnovu Patentne prijave U.S. br. 09/037 ,60 l, podnete l O. martal998.godine, koja predstavlja proširenje u delu Patentne prijave U.S. br. 08/670707, podnete 26.juna 1996, koja je prihvaćena kao U.S. patent br. 5,859,204, kao i na osnovu Međunarodne patentne prijave br. PCT/US97/11155, podne te 26. juna 1997.godine.

IZJAVA O FEDERALNOJ PODRŠCI ISTRAŽIVANJU

Vlada polaže prava na ovaj pronalazak po osnovu sredstava koje je, za potrebe delimičnog finansiranja istraživanja koje je dovelo do ovog pronalaska , odlukom br. HL46215, odobrila asocijacija Nacionalnih zdravstvenih instituta.

POZADINA PRONALASKA

Zgrušavanje krvi počinje kad trombociti prionu za oštećeni zid povređenog krvnog suda na mestu lezije. Nakon toga, u nizu enzimski regulisanih reakcija, mole kuli rastvorljivog fibrinogena, pod dejstvom enzima trombina, prelaze u nerastvorljive niti fibrina, koji trombocite povezuje u tromb. Na svakom koraku tog niza reakcija, prekursor proteina se konvertuje u proteazu, koja cepa sledeći proteinski prekursor u nizu. U većini koraka je neophodno učešće kofaktora.

Faktor VIII cirkuliše u krvi, čvrsto i nekovalentno vezan za fon Vilebrandov fak tor, kao neaktivni prekursor. Faktor VIII proteolitički aktivira trombin ili faktor Xa , koji ga odvaja od fon Vilebrandovog faktora i aktivira njegovu prokoagulantnu funkciju u nizu reakcija. U aktivnom obliku proteinski faktor VIII predstavlja ko-faktor, koji više struko povećava katalitičku efikasnost faktora IXa u aktivaciji faktora X.

Ljudi sa manjkom faktora VIII ili antitelima na faktor VIII, koji u terapiji ne dobi jaju faktor VIII, pate od nekontrolisanih unutrašnjih krvarenja, koja mogu da izazovu či tav niz simptoma, od zapaljenskih reakcija na zglobovima do prevremene smrti. Paci jenti sa teškom hemofilijom, kojih u SAD ima oko l O 000, mogu da se leče infuzijom hu manog faktora VIII, koji će ponovo uspostaviti normalnu sposobnost koagulacije krvi ako se primenjuje dovoljno često i u dovoljnoj koncentraciji. Klasična definicija faktora VIII je da je to supstancija prisutna u zdravoj krvnoj plazmi, koja koriguje defekt koagu lacije u plazmi osoba sa hemofilijom A.

Stvaranje antitela ("inhibitora" ili "inhibitornih antitela"), koja inhibišu aktivnost faktora VIII, predstavlja ozbiljnu komplikaciju i lečenju pacijenata sa hemofilijom. Kod oko 20% pacijenata sa hemofilijom tipa A, kao reakcija na terapijske infuzije faktora VIII, dolazi do stvaranja antitela. Kod pacijenata sa hemofilijom tipa A, koji prethodno nisu primali terapiju, kod kojih su se stvorili inhibitori, do stvaranja inhibitora dolazi u roku od godinu dana po uvođenju terapije. Pored toga, ponekad se i kod osoba sa prethodno normalnim nivoom faktora VIII stvaraju antitela koja inaktivišu faktor VIII. Ukoliko je titar inhibitora dovoljno nizak, kod takvih pacijenata se lečenje može uspe šno nastaviti povećavanjem doze faktora VIII. Često je, međutim, titar inhibitora toliko visok da ga je nemoguće savladati faktorom VIII. Alternativna terapijska strategija sa stoji se u zaobilaženju potrebe za faktorom VIII tokom normalne hemostaze, prime nom preparata kompleksa faktora IX (npr. KONYNE®, Proplex, ili rekombinantnog humanog faktora VIla. Osim toga, s obzirom na to da je reaktivnost svinjskog faktora VIII sa inhibitorima obično znatno manja od reaktivnosti humanog faktora VIII, korišćen je delimično prečišćen preparat svinjskog faktora VIII (HYATE:C. Svinjskim faktorom VIII uspešno su lečeni mnogi pacijenti kod kojih su se stvarala inhibitorna antitela na humani faktor VIII,a takvu terapiju su dugo dobro podnosili. Ipak, ni primena svinjskog faktora VIII ne predstavlja potpuno rešenje, jer kod nekih pacijenata može doći do stvaranja inhibitornih antitela na svinjski faktor VIII posle jedne ili dve primljene infuzije.

Na tržištu je, za lečenje hemofilije, nekoliko preparata faktora VIII dobijenog iz humane plazme, različitog stepena prečišćenosti. Među tim preparatima je i

delimično prečišćeni faktor VIII iz krvi prikupljene od velikog broja davalaca, koja je termički i hemijski obrađena na viruse, ali sadrži značajan nivo antigenskih proteina; faktor VIII prečišćen monoklonalnim antitelima, sa niskim nivoom antigenskih nečis toća i virusne kontaminacije, kao i rekombinantni humani faktor VIII, za koji su klinička ispitivanja u toku. Na žalost, pri fiziološkim koncentracijama i pH, humani faktor VIII je nestabilan, prisutan je u krvi u izuzetno niskim koncentracijama (0, 2 flg/ ml plazme) , a specifična aktivnost koagulacije mu je niska. Briga zdravstva zbog rizika prenošenja virusa ili drugih kontaminanata putem krvi, ograničila je i korišćenje svinjskog faktora VIII prečišćenog iz svinjske krvi.

Hemofiličarima je neophodna svakodnevna supstitucija faktora VIII da bi se sprečila krvarenja i posledična, degenerativna hemofilična artropatija. Ponuda je, me đutim, nedovoljna, a problemi terapijske primene nastaju kao posledica problema izo lovanja i prečišćavanja, imunogenosti, kao i potrebe za eliminisanjem rizika od AIDS-a i hepatitisa. Korišćenje rekombinantnog humanog faktora VIII ili delimično prečiš ćenog svinjskog faktora VIII neće rešiti sve probleme.

Problemi koji prate primenu najčešće korišćenog, komercijalnog faktora VIII, dobijenog iz plazme, podstakli su značajno interesovanje za formulisanjem boljeg proizvoda faktora VIII. Potreban je snažniji moleku!faktora VIII, koji bi omogućio oslo bađanje više jedinica koagulacione aktivnosti po molekulu , moleku! faktora VIII sta bilan pri odabranim vrednostima pH i fiziološkoj koncentraciji, moleku!faktora VIII sa manje izraženom sklonošću ka stvaranju inhibitornih antitela odnosno moleku!faktora VIII koji, kod pacijenata koji su već stekli antitela na humani faktor VIII, imunološki si stem neće otkriti.

Jedan od ciljeva ovog pronalaska je, stoga, da obezbedi faktor VIII koji koriguje hemofiliju kod pacijenata sa manjkom faktora VIII ili onih kod kojih su stvorena inhi bitorna antitela na humani faktor VIII.

Dalji cilj ovog pronalaska je da ponudi metode za lečenje hemofiličara.

Još jedan od ciljeva ovog pronalaska je da da faktor VIII koji je stabilan pri oda

branim vrednostima pH i u fiziološkoj koncentraciji.

Među ciljevima ovog pronalaska je i obezbeđivanje faktora VIII sa koagulan

tnim dejstvom jačim od dejstva humanog faktora VIII.

Osim toga, cilj ovog pronalaska je da ponudi faktor VIII na koji će se stvarati manje antitela.

A dalji cilj ovog pronalaska je da obezbedi metod za dobijanje rekombinantnog svinjskog faktora VIII i specifično modifikovanog svinjskog faktora VIII.

REZIME PRONALASKA

Ovde izloženo određivanje celokupne sekvence DNK kojim se kodira svinjski faktor VIII, prvi put je omogućilo sintezu kompletnog svinjskog faktora VIII, ekspresi jom DNK kojom se kodira svinjski faktor VIII u pogodnu ćeliju domaćina. DNK kojom se kodira svaki od domena svinjskog faktora VIII, kao i svaki njegov specifični frag ment, može da se eksprimira na sličan način. Osim toga, svinjski faktor VIII kod kojeg je izbrisan deo ili ceo domen B (svinjski faktor VIII lišen B-domena), postao je dostu pan kao deo ovog pronalaska, ekspresijom kodirajuće DNK svinjskog faktora VIII kod koje je izbrisan jedan ili više kodona B-domena.

Prezentovane su, osim toga, i farmaceutske formulacije, kao i metodi za lečenje pacijenata sa deficijencijom faktora VIII, koji podrazumevaju primenu rekombinantnog svinjskog faktora VIII, ili modifikovanog rekombinantnog svinjskog faktora VIII, a kon kretno svinjskog faktora VIII lišenog B-domena.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slike lA - IH zajedno omogućavaju paralelno poređenje aminokiselinskih sekvenci humanog, svinjskog i mišjeg faktora VIII.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ukoliko nije drukčije određeno ili napomenuto,"faktor VIII", u smislu u kojem se ovde koristi, označava svaki funkcionalni proteinski molekul faktora VIII, bilo kojeg sisara.

U smislu u kojem se ovde koristi, "faktor VIII sisara" obuhvata faktor VIII sa ami nokiselinskom sekvencom dobijenom od bilo kojeg, ne-humanog sisara, pod uslovom da nije drukčije određeno. U smislu u kojem se ovde koristi, "životinjski" se odnosi na svinju i druge ne-humane sisare.

"Fuzioni protein" ili "fuzioni faktor VIII ili njegov fragment", u smislu u kojem se ovde koristi, predstavlja proizvod hibridnog gena u kojem je kodna sekvenca nekog proteina izmenjena, npr. povezivanjem jednog njegovog dela za kodnu sekvencu drugog proteina iz nekog drugog gena, u nizu koji se pravilno čita, tako da može da se vrši neometana transkripcija i translacija spojenih segmenata i dobije hibridni gen koji kodira fuzioni protein.

"Odgovarajuća" nukleinska ili amino kiselina ili sekvenca neke od njih, u smislu u kojem se ovde koristi, predstavlja (kiselinu) prisutnu na mestu u molekulu faktora VIII ili njegovog fragmenta, čija je struktura i/ili funkcija ista kao i ona na mestu u molekulu faktora VIII neke druge vrste, i pored toga što se broj nukleinske ili amino kiseline ne mora podudarati. Sekvenca DNK koja "odgovara" sekvenci drugog faktora VIII, u značajnoj meri odgovara toj sekvenci, i se sa sekvencom izabranog SEQ ID br. pod strogo kontrolisanim uslovima. Sekvenca DNK koja "odgovara" sekvenci drugog faktora VIII obuhvata, takođe, i sekvencu koja rezultuje ekspresijom faktora VIII ili nje govog fragmenta, i hibridizovala bi se na izabrani SEQ ID br., da nema viška genet skog koda.

"Jedinstveni" aminokiselinski reziduum ili sekvenca, u smislu u kojem se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinsku sekvencu ili reziduum u molekulu faktora VIII jedne vrste, koji se razlikuje od homolognog reziduuma ili sekvence u molekulu faktora VIII druge vrste.

"Specifična aktivnost", u smislu u kojem se ovde koristi, odnosi se na aktivnost koja će korigovati defekt koagulacije plazme kojoj nedostaje humani faktor VIII. Speci fična aktivnost se meri jedinicama koagulacione aktivnosti po mg ukupnog proteina faktora VIII u standardnom testu, u okviru kojeg se vreme koagulacije humane plazme deficijentne u faktoru VIII, poredi sa vremenom koagulacije zdrave humane plazme. Jedna jedinica aktivnosti faktora VIII predstavlja aktivnost sadržanu u jednom ml zdra ve humane plazme. U samom testu, kraće vreme formiranja ugruška označava veću aktivnost analiziranog faktora VIII. Svinjski faktor VIII poseduje koagulacionu aktivnost u testu humanog faktora VIII.

"Ekspresija" se odnosi na niz procesa, preko kojih se genetska informacija kori sti za stvaranje proizvoda. DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca svinjskog faktora VIII može da se "eksprimira" u ćeliju sisara-domaćina da bi se dobio svinjski protein faktora VIII. Materijali, genske strukture, ćelije-domaćini i uslovi koji dopuštaju pojavu ekspresije date DNK sekvence dobro su poznati u struci, i njima se može mani pulisati i uticati na vreme i razmere ekspresije, kao i na intracelularno ili vanćelijsko razmeštanje eksprimiranog proteina. Uključivanjem, npr., DNK kojom se kodira signal ni peptid na 5' završetku DNK koja kodira svinjski faktor VIII (pošto je, po konvenciji, 5' završetak, onaj kojim se kodira NH2 završetak proteina), eksprimirani protein se eks

portuje iz unutrašnjosti ćelije-domaćina u hranljivu podlogu. Dobijanje kombinacije

DNK kojom se kodira signalni peptid i DNK kojom se kodira svinjski faktor VIII veoma je korisno, jer se eksprimirani faktor VIII eksportuje u hranljivu podlogu, čime se po jednostavljuje proces prečišćavanja. Najpogodniji signalni peptid za ovaj postupak je signalni peptid faktora VIII sisara.

U SEQ ID br: l odnosno 2 prikazani su cDNK nukleotid humanog faktora VIII i predviđene sekvence amino kiselina. Faktor VIII se sintetiše kao protein (300 kDa) jednostrukog lanca, sa homologijom unutrašnje sekvence, koja određuje sekvencu "domena" NH2-Al-A2-B-A3-C l-C2-COOH. U molekulu faktora VIII, "domen" u smislu

u kojem se ovde koristi, predstavlja kontinuiranu sekvencu amino kiselina, definisanu

identitetom unutrašnje sekvence amino kiselina i mestima proteolitičkog cepanja pod dejstvom trombina. Ukoliko nije drugačije naglašeno, u odnosu na humanu sekvencu

amino kiselina, domeni faktora VIII obuhvataju sledeće reziduume amino kiselina (SED ID Br.:: 2): Al, reziduumi Alal-Arg372; A2, reziduumi Ser373-Arg740; B, reziduumi Ser741-Argl648; A3, reziduumi Serl690-Ile2032; Cl, reziduumi Arg2033- Asn2172; C2, reziduumi Ser2173-Tyr2332. Niz A3-Cl-C2 uključuje reziduume Serl690-Tyr2332. Preostali segment, tj. reziduumi Glul649-Argl689, obično se pominje kao aktivacioni peptid lakog lanca faktora VIII. Faktor VIII proteolitički aktivira trombin ili faktor Xa, koji ga odvaja od fon Vilebrandovog faktora, formirajući faktor VIlla sa prokoagulantnom funkcijom. Biološka funkcija faktora VIlla je da višestruko poveća katalitičku efikasnost faktora !Xa u aktiviranju faktora X. Trombinom aktivirani faktor VIlla je Al/A2/A3-Cl-C2 heterotrimer (160 kDa), koji sa faktorom IXa i faktorom X obrazuje kompleks na površini trombocita ili monocita. "Parcijalni domen", u smislu u kojem se ovde koristi, predstavlja kontinuiranu sekvencu amino kiselina, koje obra zuju deo domena.

U smislu u kojem se ovde koristi, pojam "podjedinice" humanog ili životinjskog faktora VIII označava teške i lake lance proteina. Teški lanac faktora VIII sadrži tri domena- Al, A2 i B. I laki lanac faktora VIII sadrži tri domena, tj. domene A3, Cl i C2.

Pojmovi "epitop", "antigensko mesto" i "antigenska determinanta" se, u smislu u kojem se ovde koriste, koriste kao sinonimi i definišu se kao deo humanog ili životinj skog faktora VIII ili njegov fragment, koji antitelo specifično prepoznaje. Može da ga čini svaki broj aminokiselinskih reziduuma, a može da zavisi od primarne, sekundarne ili tercijerne strukture proteina.

Pojam "imunogeno mesto", u smislu u kojem se ovde koristi, definiše se kao deo humanog ili životinjskog faktora VIII, ili njegov fragment , koji specifično pokreće proiz vodnju antitela na faktor VIII ili njegov fragment kod ljudi ili životinja,mereno rutinskim protokolima, npr. imunološkim testovima, kao što su. ELISA ili Betezda test , opisanim u ovom izlaganju. Može da ga čini svaki broj reziduuma aminokiselina, i može da zavisi od primarne, sekundarne ili tercijerne strukture proteina. U nekim oblicima je hibrid ili faktor VIII- ekvivalent hibrida, ili pak njegov fragment, ne-imunogen ili manje imuno gen kod životinja ili kod ljudi od humanog ili svinjskog faktora VIII.

"Deficijencija faktora VIII", u smislu u kojem se ovde koristi, obuhvata manjak koagulantne aktivnosti, koja je posledica produkovanja manjkavog faktora VIII, nedo voljne produkcije ili izostanka stvaranja faktora VIII, ili delimične ili potpune inhibicije faktora VIII inhibitornim antitelima. Hemofilija A je vrsta deficijencije faktora VIII koja je posledica defekta X-vezanog gena i odsustva ili deficita proteina faktora VIII, koji taj gen kodira.

U smislu u kojem se ovde koristi, pojam "dijagnostički testovi" obuhvata testove koji, na neki način,koriste reakciju antigen-antitelo pri određivanju i/ili kvantifikovan ju količine određenog antitela, prisutne u ispitivanom uzorku, a u cilju olakšavanja izbora medicinske terapije. Kvalifikovanim ljudima iz struke su poznati mnogobrojni takvi testovi. U smislu u kojem se ovde koristi, DNK humanog, svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VIII ili njen fragment, kao i iz nje eksprimiran protein, mogu da se, u celini ili delom, supstituišu odgovarajućim reagensima u poznatim testovima , i na ta j način modifikovani testovi mogu da se koriste za otkrivanje i/ili kvantifikaciju antitela na faktor VIII. Primena takvih reagensa , DNK faktora VIII ili njegovog fragmenta , ili iz nje eksprimiranog proteina, omogućava modifikovanje poznatih testova za detekciju antitela na humani ili životinjski faktor VIII. U pomenute testove spadaju ELISA testovi, imunodifuzioni i imunoblot testovi, ali ne samo oni. Ljudi iz struke poznaju metode pogodne za sprovođenje ma kojeg od ovih testova. U smislu u kojem se ovde koristi, kao dijagnostički reagens može da se koristi faktor VIII ili njegov fragment koji pose duje bar jedan epitop proteina. Primer drugih testova u kojima se može koristiti huma ni, svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII ili njegov fragment su Betezda test i antikoagulacioni testovi.

Pojam "DNK kojom se kodira protein, npr. svinjski faktor VIII" označava poli dezoksinukleinsku kiselinu, čija nukleotidna sekvenca prenosi ćeliji-domaćinu kodnu informaciju redosleda amino kiselina u sekvenci konkretnog proteina , npr. svinjskog faktora VIII, a prema poznatim vezama/odnosima u genetskom kodu.

"Proizvod ekspresije" DNK kojom se kodira humani ili životin jski faktor VIII ili modifikovani faktor VIII, predstavlja produkt dobijen ekspresijom referentne DNK u po-godnu ćeliju-domaćina, uključujući karakteristike pre- ili post-translacione modi-

fikacije proteina, koje kodira referentna DNK, uključujući i glikozilaciju, proteolitičko cepanje i slično. U struci se zna da su takve modifikacije moguće i da se mogu pone što razlikovati, zavisno od tipa ćelije-domaćina i drugih činilaca, a da mogu dati molekularne izoforme produkta, uz zadržavanje prokoagulantne aktivnosti. V ., npr. u Lind, P. i sar., Eur.]. Biochem. 232:1927 (1995), koji je referentni sastavni deo ovog izlaganja.

"Vektor ekspresije" je element DNK, često cirkularne strukture, sa sposobnošću da se autonomno replikuje u željenu ćeliju-domaćina, ili da se ugradi u genom ćelije domaćina; poseduje, takođe, i izvesna dobro znana svojstva, koja dozvoljavaju ekspre siju kodirajuće DNK, umetnute u sekvencu vektora na pravom mestu i sa pravilnom orijentacijom. Ta svojstva mogu da obuhvataju jednu ili više promoterskih sekvenci za usmeravanje inicijacije transkripcije kodirajuće DNK i drugih elemenata DNK, npr. po jačivača, mesta poliadenilacije, i sl., struci dobro poznate. Pojam "vektor ekspresije" koristi se za označavanje vektora koji u svojoj sekvenci sadrži ugrađenu kodirajuću se kvencu DNK koja se eksprimira, kao i vektora koji poseduje neophodne elemente kon trole ekspresije, i to tako postavljene u odnosu na mesto ugradnje da taj vektor može da služi za ekspresiju svake kodirajuće DNK ugrađene ta tom mestu , što je takođe blis ko postojećem stanju tehnike. Stoga, npr. vektor kome nedostaje promoter može da postane vektor ekspresije, ako se u njega ugradi promoter kombinovan sa kodira jućomDNK.

OPŠTI OPIS METODA

Patent U.S.5,364,771 opisao je otkriće molekula hibridnog humanog/svinjskog faktora VIII sa koagulantnom aktivnošću, u kojem su elementi molekula humanog ili svinjskog faktora VIII supstituisani odgovarajućim elementima molekula faktora VIII drugih vrsta. U.S. patent 5,663,060 opisuje prokoagulantne molekule hibrida humano/ životinjskog i hibridnog ekvivalenta faktora VIII, u kojima su elementi molekula faktora VIII jedne vrste supstituisani odgovarajućim elementima molekula faktora VIII druge vrste.

lO

S obzirom na to da aktuelna saznanja ukazuju da B domen nema inhibitorni epitop i da je bez poznatog efekta na funkciju faktora VIII, u nekim molekulima je B do men potpuno ili delimično izbrisan iz molekula aktivnog hibrida ili hibridu ekvivalent nog faktora VIII, ili iz njihovih fragmenata ("B(-) faktor VIII") , dobijenih nekim od ovde opisanih metoda.

Gen humanog faktora VIII je izolovan i eksprimiran u ćelije sisara, prema Toole, J.J. i sar, (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute) ; Gitschier , J. i sar. (1984) Nature 312: 326-330 (Genentech); Wood, W.l. i sar. (1984) Nature 312:330-337

(Genentech); Vehar, G.A.i sar. (1984) Nature 312:337-342 (Genentech) ; WO 87104187; WO 88/08035; WO 88/03558; U.S. patent br. 4,757,006, a aminokiselinska sekvenca je izvedena iz cDNK. U.S. patent br. 4,965, 199 Kapona i saradnika, otkriva metod rekombinantne DNK za stvaranje faktora VIII u ćelijama-domaćinima sisara, i prečiš ćavanje humanog faktora VIII. Prezentovani su rezultati ekspresije humanog faktora VIII na ćelije CHO (ovarijuma kineskog hrčka) i BHKC (ćelije bubrega mladunca hrčka). Humani faktor VIII je modifikovan u cilju brisanja dela ili celokupnog B domena (U.S. patent br. 4,868,112), a izveden je pokušaj zamene B domena humanog faktora VIII B domenom humanog faktora V (U.S. patent br. 5,004,803). Sekvenca cDNK kojom se kodira humani faktor VIII i predviđena aminokiselinska sekvenca prikazani su na SEQ ID br. l odnosno 2. Kod SEQ ID br. l , kodna zona počinje na nukleotidnoj poziciji 208, a trojka GCC je kodon za aminokiselinu broj l (Ala) zrelog proteina , kao na SEQ ID br. 2.

Svinjski faktor VIII je izolovan iz plazme [Fass, D.N. i sar. (1982) Blood 59:594]. Parcijalnu aminokiselinsku sekvencu svinjskog faktora VIII, koja odgovara delovima sekvence N-terminalnog lakog lanca, homolognog ceruloplazminu i faktoru koagula

cije V, opisali su Church i sar. (1984) Proe. NatJ. Acad. Sci, USA 81:6934. Toole, J.J. i sar,

(1984) Nature 312:342-347, opisali su delimično formiranje sekvence na N terminalnom završetku četiri aminokiselinska fragmenta svinjskog faktora VIII , ali nisu karakterisali fragmente prema njihovim položajima u molekulu faktora VIII. Aminoki selinsku sekvencu domena B i dela domena A svinjskog faktora VIII prikazali su Toole,

J.J. i sar. (1986) Proe. NatJ. Acad. Sci, USA 83:5939-5942. Sekvenca cDNK koja kodira

kompletan domen A2 svinjskog faktora VIII i predviđenu sekvencu aminokiselina, i hibridni humani/svinjski faktor VIII sa supstitucijama svih domena, sve podjedinice, kao i specifične sekvence amino kiselina prezentovani su u otkriću iz U.S. patenta br.

5,364, 771, pod naslovom "Hibridni humani/svinjski faktor VIII", izdatom 15. ll 1994., i u

WO 93/20093, objavljenom 14.10.1993.godine. Sekvenca cDNK koja kodira domen A2 svinjskog faktora VIII, koji odgovara reziduumima 373-740 kod zrelog humanog faktora VIII, prikazanog na SEQ ID br. l , kao i predviđena sekvenca amino kiselina , prikazani su na SEQ ID br. 3 odnosno 4. Novijeg datuma je otkriće nukleotida i odgovarajućih sekvenci dela domena Al, kojima nedostaje prvih 198 amino kiselina, i odgovarajućih elemenata domena A2 svinjskog faktora VIII,prezentovano i u WO 94111503, objavljeno

26.05.1994.godine.Celokupna sekvenca nukleotida kojom se kodira svinjski faktor VIII,

uključujući i čitav domen Al, aktivacioni peptid, domene A3, Cl i C2, kao i kodiranu sekvencu amino kiselina, dobio je konačno Lollar, što otkriva u U.S. patentu 5,859, 204 od 12.01.1999.godine i u WO 97/49725, objavljenom 31.12.1997., koji su referentni sa stavni deo ovog izlaganja.

I svinjski i humani faktor VIII su izolovani iz plazme kao protein sa dve podje dinice. Poznate kao teški i laki lanac, podjedinice su vezane ne-kovalentnom vezom, koja zahteva prisustvo kalcijuma ili drugih dvovalentnih jona metala. Teški lanac faktora VIII sadrži tri kovalentno vezana domena- Al , A2 i B. Laki lanac faktora VIII takođe sadrži tri domena, označena sa A3, Cl i C2. Domen B nema poznatu biološku funkciju i može se, proteolotički ili metodima tehnologije rekombinantne DNK, odstra niti ili delom odstraniti iz molekula, bez značajnije promene bilo kojeg od merljivih parametara faktora VIII. Humani rekombinantni faktor VIII ima strukturu i funkciju slič nu faktoru VIII iz plazme, iako se ne glikoziluje dok se ne eksprimira u ćelije sisara.

I humani i svinjski aktivirani faktor VIII ("faktor VIlla") imaju po tri podjedinice zbog deobe teškog lanca između domena Al i A2. Ova struktura se označava sa Al/A2/A3-Cl-C2. Humani faktor VIlla nestabilan je u uslovima koji stabilišu svinjski faktor VIlla, po svoj prilici zbog slabije vezanosti podjedinice A2 humanog faktora VIlla. Odvajanje podjedinice A2 humanog i svinjskog faktora VIlla prati gubitak aktiv nosti molekula faktora VIlla. Yakhycev, A. i sar. (1997) Blood 90:Suppl. l , Sažetak #126

donosi saznanja o vezivanju domena A2 proteinom receptornog lipoproteina male gustine, koji navodi na zaključak da, ovim vezivanjem posredovano, ćelijsko preuzima nje A2 deluje smanjivanjem aktivnosti faktora VIII.

Ekspresija "faktora VIII lišenog domena B" pojačava se uključivanjem delova domena B. Uključivanjem onih delova domena B, označenih sa "SQ" [Lind, P. i sar. (1995) supra] postiže se povoljna ekspresija. "SQ" strukturama nedostaje ceo humani domen B, s izuzetkom 5 amino kiselina N-završetka domena B i 9 amino kiselina G završetka domena B.

Imunoreaktivnost i koagulaciona aktivnost prečišćenog hibridnog faktora VIII ili njegovog fragmenta mogu se ispitati standardnim testovima, uključujući i test faktora VIII bez plazme, jednofazni test koagulacije, kao i ELISA test, koristeći prečišćeni re kombinantni humani faktor VIII kao standard.

Za ekspresiju strukture rekombinantnog gena u eukariotske ćelije, zavisno od izbora i suda kvalifikovanog stručnjaka, mogu da se koriste i drugi vektori, uključujući i plazmidne i eukariotske virusne vektore (v. npr. Sambrook i sar., Poglavlje 16). Drugi vektori i ekspresioni sistemi, uključujući i ćelijske sisteme bakterija, kvasaca i inse kata, mogu da se koriste, ali se ne smatraju najpogodnijim zbog razlika u glikozilaciji, ili izostanka glikozilacije.

Protein rekombinantnog faktora VIII može da se eksprimira u različite ćelije, najčešće korišćene za kulturu i ekspresiju rekombinantnog proteina sisara. Konkretno, zaključeno je da su brojne ćelijske linije glodara posebno korisni domaćini za ekspre siju velikih proteina. Pogodne ćelijske, linije kojima raspolaže Američka zbirka tipskih kultura u Rokvilu, Merilend, obuhvataju ćelije bubrega mladunaca hrčka i ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), koje se kultivišu uz korišćenje rutinskih postupaka i podloga.

Osnovu veće koagulacione aktivnosti svinjskog faktora VIII izgleda da čini spontano odvajanje humane podjedinice A2 sa humanog faktora VIlla, koje je brže od odvajanja svinjske podjedinice A2 od svinjskog faktora VIlla. Odvajanje podjedinice A2 vodi gubitku aktivnosti [Lollar , P. i sar. (1990)]. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P.

i sar. (1992) j. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, P.J. i sar. (1992) j. Biol. Chem.

267:13246-13250].

Molekuli faktora VIII sa smanjenom imunoreaktivnošću;

Karakterizacija epitopa sposobnih za imunoreaktivnost sa antitelima koja inhi bišu koagulantno dejstvo faktora VIII ("inhibitori" ili "inhibitorna antitela") ,zasniva se na poznatim odnosima struktura-funkcija u faktoru VIII. Inhibitori, najverovatnije, deluju razaranjem ma koje od makromolekularnih interakcija domenske strukture faktora VIII ili njegovih veza sa fon Vilebrandovim faktorom, trombinom, faktorima Xa,IXa ili X. Ve ćina inhibitornih antitela na humani faktor VIII, međutim , deluje vezivanjem za epitope smeštene u 40 kDaltonskom domenu A2 ili 20 kDaltonskom domenu C2 faktora VIII, uništavajući specifične funkcije vezane za ove domene, kao što su opisali Fulcher i sar. (1985) Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:7728-7732, i Scandella i sar. (1988) Proc.Natl. Acad .Sci USA 85:6152-6156. Prema Scandella i sar. (1993) Blood 82:1767-1775, pored epitopa u domenima A2 i C2, treći epitop bi mogao da postoji u domenu A3 ili Cl la kog lanca faktora VIII. Značaj ovog predpostavljenog trećeg epitopa nije poznat, ali iz gleda da je on odgovoran za manji deo reaktivnosti epitopa kod faktora VIII.

Anti-A2 antitela blokiraju aktivaciju faktora X, što su pokazali Lollar i sar. (1994)

].Clin.lnvest. 93:2497-2504). Prethodna istraživanja genskih mapa delecionom mutage nezom, koja su opisali Ware i sar. (1992) Blood.Coagul.Fibrinolysis :703-716, locirala su epitop A2 u 20 kDaltonskoj zoni NH2-terminalnog kraja 40 kDaltonskog domena A2. Imunoradiometrijski testovi kompeticije su pokazali, prema opisu Scandella i sar.

(1992) Throm.Haemostas 67:665-671 i navodima U.S. patenta 5,859, 204, da inhibitori A2 prepoznaju ili zajednički epitop ili zbijene skupine epitopa.

Manja antigenost i/ili imunogenost molekula životinjskog ili modifikovanog životinjskog faktora VIII može se ispitati u okviru kliničkih ispitivanja kod ljudi.U okviru jednog tipa ispitivanja, čiji je cilj da se odredi da li postoji imunoreaktivnost faktora VIII sa inhibitornim antitelima, faktor VIII je primilo, uglavnom intravenskom infuzijom, 25 pacijenata sa deficijencijom faktora VIII i antitelima koja inhibišu koagulacionu aktiv nost terapijski primenjenog humanog faktora VIII. Raspon doziranje životinjskog ili mo-

difikovanog životinjskog faktora VIII bio je između 5 i 50 J po kilogramu telesne mase, bolje 10-50 ]/kg, a najbolje 40 ]/kg telesne mase. Približno l sat posle svake primene u uzorcima krvi je, jednofaznim testom koagulacije, mereno prisustvo faktora VIII. Postu pak uzimanja uzoraka krvi i merenja ponovljen je približno 5 sati posle infuzije. Ukup

no prisustvo i brzina nestajanja faktora VIII iz uzoraka predstavljaju pokazatelje titra antitela i inhibitorne aktivnosti. Ako je titar antitela visok, prisustvo faktora VIII je, obič no, nemerljivo. Rezultati merenja prisustva su poređeni sa rezultatima merenja prisus tva kod pacijenata koji su primali humani faktor VIII dobijen iz plazme, rekombinantni humani faktor VIII ili supstitute faktora VIII.

Po identifikaciji klinički značajnih epitopa mogu se, u in vitro ispitivanjima na širokom spektru inhibitornih plazmi, eksprimirati molekuli rekombinantnog faktora VIII sa ukrštenom reaktivnošću manjom od,ili jednakom onoj kod svinjskog faktora VIII iz plazme. U cilju smanjena ukrštene reaktivnosti može se izvršiti dodatna mutageneza u zonama epitopa. Iako poželjna, smanjena ukrštena reaktivnost nije neophodna za do

bijanje proizvoda koji bi mogao imati prednosti u odnosu na postojeći koncentrat svinj skog faktora VIII iz plazme, zbog toga što i on može da proizvede neželjene efekte, zbog prisustva kontaminantnih svinjskih proteina ili kontaminacije uzročnicima infek cije, npr. virusima ili prionima. Moleku!rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VIII neće sadržati strane svinjske proteine.

Dijagnostički testovi

U testovima se, kao dijagnostički reagensi za detekciju inhibitornih antitela na humani ili životinjski faktor VIII ili modifikovani životinjski faktor VIII u supstratima kao što su uzorci seruma i telesnih tečnosti pacijenata sa deficijencijom faktora VIII, mogu koristiti cDNK faktora VIII i/ili iz nje eksprimiran protein. Ovi testovi obuhvataju ELISA testove, imunoblotove, RIA testove, imunodifuzione testove i test biološke aktivnosti faktora VIII (npr. testom koagulacije). Načini pripreme ovih reagensa i metodi njihove primene poznati su ljudima iz struke. Na primer, imunološki test za detektovanje inhi bitornih antitela u uzorku seruma pacijenta može da uključi i reakciju ispitivanog uzor ka sa dovoljnom količinom ispitivanog faktora VIII, tako da je merljivi kompleks koji se

može formirati sa inhibitornim antitelima 1z uzorka ispitivanog faktora VIII, zaista antigen.

Na bazi niza cDNK hibridnog faktora VIII, molekula proteina ili njihovih frag menata mogu se formirati sonde nukleinske ili amino kiseline. U nekim oblicima, ove sonde se markiraju bojama ili komercijalnim enzimskim, fluorescentnim, hemolumine scentnim ili radioaktivnim markerima. Aminokiselinske sonde se mogu koristiti za npr. pregled seruma ili drugih telesnih tečnosti u slučajevima kada se sumnja na prisustvo inhibitornih antitela na humani, životinjski ili hibridni humani/životinjski faktor VIII. Ni voi inhibitora kod pacijenata se mogu meriti i porediti sa nivoima kod zdravih ljudi, a mogu se koristiti pri, na primer, odlučivanju o tome da li se u lečenje pacijenta sa defi cijencijom faktora VIII može uključiti životinjski ili modifikovani životinjski faktor VIII. Ove cDNK sonde se mogu koristiti i za istraživanja, pri pregledu DNK datoteka.

Farmaceutske formulacije

Farmaceutske formulacije koje sadrže samo rekombinantni svinjski ili modifi kovani svinjski faktor VIII, ili ove faktore u kombinaciji s odgovarajućim farmaceutskim stabilizatorima, transportnim vehikulumima i nosačima, pripravljaju se prema pozna tim metodima, npr. prema metodu iz Remington's Pharmaceutical Sciences od E.W. Martina.

U jednoj od povoljnih formulacija, adekvatni vehikulumi za intravensku infuziju su fiziološki rastvor ili fosfatni puferovani fiziološki rastvor.

U drugoj odgovarajućoj formulaciji se, kao adekvatni stabilizatori i vehikulumi, nalaze drugi humani ili životinjski proteini, npr. albumin.

Fosfolipidne vezikule ili lipozomske suspenzije smatraju se pogodnim i farma ceutski prihvatljivim nosačima ili transportnim vehikulumima. Mogu se pripravljati prema metodima koje poznaje struka, i mogu da sadrže, npr. fosfatidil-serin/fosfatidil holin ili druge mešavine fosfolipida ili deterdžente, koji zajednički stvaraju negativni napon na površini, pošto se faktor VIII vezuje za fosfolipidne membrane negativnog naelektrisanja. Lipozomi se mogu pripraviti rastvaranjem odgovarajućig lipida (npr. stearoil fosfatidil etanolamina, stearoil fosfatidil-holina, arahadoil fosfatidil-holina i holesterola) u neorganskom rastvaraču; neorganski rastvarač ispari, ostavljajući na zi-

dovima suda tanak film osušenog lipida. Potom se u sud naspe vodeni rastvor hibrid nog faktora VIII. Sadržina suda se promeša kružnim pokretom, čime se sa stranica su da oslobađa lipidni sloj, a agregati lipida rasipaju, obrazujući tako lipozomsku suspenziju.

Rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII može da se kombi nuje i sa drugim pogodnim stabilizatorskim jedinjenjima, vehikulumima i nosačima, kao što su vitamin K-zavisni faktori koagulacije, tkivni faktor, fon Vilebrandov faktor (vWf) ili fragment vWf koji sadrži mesto vezivanja faktora VIII, kao i polisaharidi, npr. saharoza.

Rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII može se prenositi i genskom terapijom, na isti način na koji se može prenostiti i humani faktor VIII, koriš ćenjem retrovirusnih vektora u ulozi sredstava transporta. Ovaj metod se sastoji od ugradnje željene strukturne cDNK faktora VIII u humane ćelije, koje se transplantiraju direktno u organizam pacijenta sa deficijencijom faktora VIII ili se smeštaju u sredstvo pogodno za implantaciju, koje propušta molekule faktora VIII, ali je za ćelije nepro pusno, i takvo sredstvo se potom transplantira pacijentu. Pogodan metod bi bio genski transfer posredovan retrovirusom. U okviru tog metoda se egzogeni gen (npr. cDNK faktora VIII) klonira u genom modifikovanog retrovirusa. Gen se virusnim mehanizmi ma ugrađuje u genom ćelije-domaćina, gde ga ćelija i eksprimira. Retrovirusni vektor je tako modifikovan da ne stvara virus, čime se sprečava virusna infekcija domaćina. Opšti principi ovog tipa terapije su poznati ljudima iz struke i obrađeni su u literaturi [npr. Kohn, D.B. i sar. (1989) Transfusion 29:812-820].

Svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII može da se čuva vezan za vWf da bi se produžio poluživot i rok trajanja hibridnog molekula. Osim toga, liofilizacijom fakto ra VIII, može se poboljšati prinos aktivnih molekula u prisustvu vWf. Važeći metodi ču vanja humanih i životinjskih faktora VIII, koje koriste komercijalni snabdevači, mogu da se primene i na čuvanje rekombinantnog faktora VIII. Ovi metodi obuhvataju: (l) liofi lizaciju faktora VIII u delimično prečišćenom stanju (kao "koncentrata" faktora VIII, koji se, bez dodatnog prečišćavanja, može dati infuzijom); (2) imunoafinitetno

prečišćavanje faktora VIII Zimmermanovim metodom i liofilizaciju u prisustvu albu mina, koji stabilizuje faktor VIII; (3) liofilizaciju rekombinantnog faktora VIII u prisustvu albumina.

Osim toga, saznanja pokazuju da svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII

ostaje neograničeno vreme stabilan na temperaturi od 4°C u 0,6 M NaCl, 20 mM MESi

5 mM CaC12 na pH 6,0, kao i da se u ovim puferima može čuvati u smrznutom stanju, i odmrzavati uz minimalan gubitak aktivnosti.

Terapijski metodi

Rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII se koristi za lečenje nekontrolisanog krvarenja zbog nedostatka faktora VIII (npr. intraartikularne, intrakra nijalne ili gastrointestinalne hemoragije) kod hemofiličara sa inhibitornim antitelima ili bez njih, kao i kod pacijenata sa stečenom deficijencijom faktora VIII, kao posledicom stvaranja inhibitornih antitela. Aktivne supstancije je najbolje primenjivati intravenskim putem.

Osim toga, rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII može da se primeni i putem transplantata ćelija, genetski izmenjenih tako da stvaraju protein, i implantacijom sredstva koje sadrži takve ćelije, kao što je već opisano.

U pogodnom obliku, farmaceutske formulacije rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VIII, samog ili u kombinaciji sa stabilizatorima, trans portnim vehikulumima, i/ili nosačima, daju se pacijentima intravenskom infuzijom, po istoj proceduri koja se koristi za infuziju humanog ili životinjskog faktora VIII.

Terapijske doze formulacije rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VIII, koje se moraju dati pacijentu kojem je takva terapija neophodna, razlikovaće se u zavisnosti od težine deficijencije faktora VIII. Nivo doziranja se, gene ralno, podešava u pogledu učestalosti primene, trajanja primene i broja datih jedini ca, a u skladu sa težinom i trajanjem epizode krvarenja svakog pacijenta. Shodno to me, faktor VIII se u nosaču, transportnom vehikulumu ili stabilizatoru nalazi u količini dovoljnoj da pacijentu obezbedi terapijski efikasnu količinu proteina za zaustavljanje krvarenja, što se meri standardnim testovima koagulacije.

Faktor VIII se klasično definiše kao supstancija prisutna u normalnoj krvnoj plazmi, koja ispravlja defekt koagulacije u plazmi osoba sa hemofilijom A. Za izraču navanje doze faktora VIII za potrebe infuzija kod ljudi koristi se in vitro koagulaciona aktivnost prečišćenog i delimično prečišćenog oblika faktora VIII. Ta aktivnost je i po uzdan pokazatelj aktivnosti izmerene u plazmi pacijenta, kao i korekcije defekta krva renja in vivo. Nisu uočene razlike između ponašanja novih molekula faktora VIII u stan dardnim testovima in vitro i njihovog ponašanja u modelu infuzije kod psa ili kod paci jenata [Lusher, J.M. i sar. 328 New Engl.].Med. 328:453-459; Pittman, D.D. i sar. (1992) Blood 79:389-397; i Brinkhous i sar. (1985) Proe. Nati. Acad. Sci. 82:8752-8755].

Željeni nivo aktivnosti faktora VIII plazme, koji kod pacijenta treba postići pri menom rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VIII, obično je u rasponu od 30 do l OO% normalnog nivoa. U okviru pogodnog načina primene terapij skog faktora VIII, formulacija se primenjuje intravenski, u odgovarajućem rasponu do za, tj. u rasponu od 5 do 50 jedinica po kg telesne mase, još bolje u rasponu od 10 do

50 j/kg telesne mase, a najbolje u dozi od 20-40 j/kg telesne mase; interval između do za je od oko 8 do 24 sata (kod teških hemofiličara), a trajanje terapije izraženo u dani ma je od l do 10 dana, ili do okončanja epizode krvarenja. Videti, npr. Roberts, H.R. i M.R. Jones, "Hemofilija i srodne bolesti- urođene deficijencije protrombina (Faktora ll, Faktora V i Faktora od VII do XII)," Poglavlje 153, 1453-1474, 1460, u Hematology, Williams, W.J. i sar., izdanje (1990). Količine rekombinantnog svinjskog ili modifiko vanog svinjskog faktora VIII, potrebne pacijentima sa inhibitornim antitelima, mogu se razlikovati od potrebnih količina prethodno korišćenog oblika faktora VIII. Na primer, pacijentima može biti potrebna manja količina rekombinantnog svinjskog ili modifi kovanog svinjskog faktora VIII, zbog njegove veće specifične aktivnosti od aktivnosti humanog faktora VIII i smanjene reaktivnosti antitela. Kao i u terapiji humanim ili svinj skim faktorom VIII iz plazme, količina terapijskog faktora VIII koji će se dati infuzijom definiše se jednofaznim testom koagulacije i, u određenim slučajevima, prisustvo in vivo se određuje merenjem faktora VIII u plazmi pacijenta posle primljene infuzije. Podrazumeva se da se, za svakog pojedinog pacijenta, specifični režimi doziranja mo raju, s vremenom, podešavati prema individualnim potrebama i profesionalnom sudu

lica koje primenjuje ili nadgleda primenu formulacija, kao i da su rasponi koncentraci ja izneti u ovom izlaganju samo kao primeri, a nije im svrha da ograniče domet niti pri menu predmetne formulacije u praksi.

Prema potrebi, terapija se može dati u obliku jednokratne intravenske primene formulacije, ili u obliku periodične ili kontinuirane primene tokom dužeg vremenskog perioda. Terapijska formulacija faktora VIII može se, alternativno, primeniti supkutano ili peroralno sa lipozomima, u obliku jednokratne doze ili višekratnih doza u različitim vremenskim intervalima.

Rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VIII može da se, takođe, koristi i za lečenje nekontrolisanog krvarenja zbog pomanjkanja faktora VIII kod hemo filičara, kod kojih su se stvorila antitela na humani faktor VIII. U takvom slučaju nije ne ophodna koagulaciona aktivnost koja bi bila jača od aktivnosti samog humanog ili živo tinjskog faktora VIII. Biće korisna i koagulaciona aktivnost slabija od aktivnosti huma nog faktora VIII (tj. manja od 3000 jedinica/mg), ako tu aktivnost ne neutrališu antitela u plazmi pacijenta.

Ovde je već pokazano da se rekombinantni svinjski i modifikovani svinjski fak tori VIII mogu razlikovati od humanog faktora VIII po svojoj specifičnoj aktivnosti. Pro teini faktora VIII, sa većom prokoagulantnom aktivnošću od humanog faktora VIII, od koristi su u lečenju hemofilije, zbog toga što su, za korekciju deficita faktora VIII, po trebne manje doze. Faktori VIII sa nižom prokoagulantnom aktivnošću od humanog faktora VIII, takođe su pogodni za terapijsku primenu, pod uslovom da imaju bar l % specifične aktivnosti humanog faktora VIII. Faktor VIII ovog pronalaska, koji poseduje prokoagulantnu aktivnost, definisan je, stoga, kao faktor VIII sa najmanje l % specifične aktivnosti humanog faktora VIII.

U svim sledećim primerima, i ne samo njima, podrazumeva se da je u pitanju već opisani molekul rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VIII i metodi njegove izolacije, karakterizacije, dobijanja i primene.

Primer 1: Test svinjskog faktora VIII i hibridnog humano-svinjskog faktora VIII

Koagulaciona aktivnost svinjskog faktora VIII je, na osnovu specifične aktivno sti molekula, veća od aktivnosti humanog faktora VIII. Ovaj zaključak se zasniva na ko rišćenju odgovarajućih standardnih krivih, koje omogućavaju prilično precizna pore đenja humanog i svinjskog faktora VIII. Testovi koagulacije se oslanjaju na sposobnost faktora VIII da skraćuje vreme koagulacije plazme dobijene od pacijenata sa hemo filijom A. Korišćena su dva tipa testova: jednofazni i dvofazni.

Za jednofazni test koagulacije se O, l ml hemofilične A plazme (George King Biochemical, Inc.) 5 minuta inkubirana 37°C, u vodenom kupatilu, sa O, l ml aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog reagensa (APTT) (Organon Teknika) i 0,0 l ml uzorka ili standarda, koji čini razblažena, citratisana plazma zdravog čoveka. Posle inkubacije se dodaje O, l ml 20 mM CaC12 , a vreme potrebno za formiranje fibrinskog ugruška se određuje vizuelnim pregledom.

Jedinica faktora VIII se definiše kao količina prisutna u l ml citratisane zdrave humane plazme. Korišćenjem humane plazme kao standarda, direktno su poređene aktivnosti humanog i svinjskog faktora VIII. Standard plazme ili prečišćeni proteini se rastvaraju u O, 15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pri pH 7 ,4. Standardna kriva je konstruisana na osnovu 3 ili 4 razblaženja plazme, sa najvećim razblaženjem 1150, i na osnovu log10 vremena koagulacije u odnosu na log 10 koncentracije u plazmi, čime je dobijen linear ni grafikon. Jedinice faktora VIII u nepoznatom uzorku su određene interpolacijom u odnosu na standardnu krivu.

Jednofazni test se oslanja na endogenu aktivaciju faktora VIII pod dejstvom ak tivatora, koji se formiraju u hemofiličnoj A plazmi, dok dvofazni testovi određuju proko agulantnu aktivnost prethodno aktiviranog faktora VIII. U dvofaznom testu se uzorci, koji sadrže faktor VIII koji je reagovao sa trombinom, dodaju smeši aktiviranog parci jalnog tromboplastina i humane hemofilične A plazme, prethodno inkubirane 5 minuta na temperaturi od 37°C. Izmerena vremena zgrušavanja se zatim konvertuju u jedinice po ml, prema već opisanoj krivoj humanog standarda. Relativna aktivnost u dvofaznom

testu bila je veća u odnosu na aktivnost u jednofaznom testu zbog toga što je faktor VIII

unapred aktiviran.

Primer 2: Karakterizacija funkcionalne razlike između humanog i svinjskog faktora VIII

Izolovanje svinjskog i humanog faktora VIII iz plazme, kao i humanog rekombi nantnog faktora VIII, opisano je u literaturi kod Fulcher, C.A. i sar. (1982) Proc.Natl. Acad.Sci.USA 79:1648-1652; Toole i sar. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier i sar. (1984) Nature 312:337-342 (Genentech) ; Wood i sar. (1984) Nature

312:330-337 (Genentech); Vehar i sar. 312 Nature 312:337-342 (Genentech) ; Fass i sar. (1982) Blood 59:594; Toole i sar. (1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5939-5942. Ovo se može postići na nekoliko načina. Svi pomenuti preparati su slični po sastavu podjedi nica, iako postoje funkcionalne razlike u pogledu stabilnosti između humanog i svinj skog faktora VIII.

U cilju poređenja humanog rekombinantnog i svinjskog faktora VIII, preparati visoko prečišćenog humanog rekombinantnog faktora VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) i svinjskog faktora VIII [imunološki prečišćeni, shodno opisu kod Fass i sar. (1982) Blood 59:594] podvrgnuti su HPLC sa Mono O™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) anjon-izmenjivačkom kolonom (Pharmacia, Inc.) . Cilj Mono O™ HPLC faze bila je eliminacija manjih nečistoća razmene humanog i svinjskog faktora VIII u zajedničkom puferu za potrebe komparacije. Sadržaj bočica sa 1000 i 2000 jedinica faktora VIII rekonstituisan je sa 5 ml H20. Zatim je dodavan Hepes (2 M, pH 7 , 4) , do ko načne koncentracije od 0,02 M. Faktor VIII je aplikovan na Mono O™ HR 5/5 kolonu , ekvilibrisanu u 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaC12 , pH 7 , 4 (Pufer A plus 0, 15 M NaCl); ispran je sa 10 ml Pufera A+ 0,15 M Na Cl, pa odvojen od apsorbensa sa 20 ml linearnog gradijenta, O , 15 M do 0,90 M NaCl u Puferu A, pri brzini protoka l ml/min.

Za potrebe komparacije humanog faktora VIII iz plazme (prečišćen pomoću Mono O™HPLC) i svinjskog faktora VIII, imunoafinitetno prečišćen svinjski faktor VIII iz plazme je razblažen u odnosu l :4 sa 0,04 M Hepesa, 5 mM CaC12 , 0,01 % Tween-80, pH 7 ,4, pa podvrgnut Mono O™ HPLC pod uslovima istim kao u prethodnom opisu,

kad se radilo o humanom faktoru VIII. Opisani postupci za izolovanje humanog i svinj

skog faktora VIII smatraju se, među ljudima iz struke, standardnim.

Aktivnost faktora VIII određivana je analizom frakcija kolone pomoću jednofaz nog testa koagulacije. Srednje vrednosti rezultata testova, izražene jedinicama aktiv nosti po A280 materijala, prikazane su u Tabeli II, u ukazuju na to da, kad se koristi jed nofazni test, svinjski faktor VIII ima bar šest puta veću aktivnost od humanog faktora VIII.

TABELA II

POREĐENJE KOAGULACIONE AKTIVNOSTI HUMANOG I SVINJSKOG FAKTORA VIII

Aktivnost OIA2ao)

Svinjski

21 300

Humani iz plazme

3 600

Humani rekombinantni

2 400

Primer3: Poređenje stabilnosti humanog i svinjskog faktora VIII

Rezultati jednofaznog testa za faktor VIII odražavaju aktivaciju faktora VIII u uzorku, u faktor VIlla, i mogući gubitak aktivnosti formiranog faktora VIlla. Sprovedeno je direktno poređenje stabilnosti humanog i svinjskog faktora VIII. Uzorci iz Mono O™ HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) razblaženi su do iste koncentracije i sastava pufera i dovedeni u reakciju sa trombinom. Uzorci za dvofazni test koagulacije su uzi mani u različita vremena. Uočeno je da je, kao po pravilu , vršna aktivnost (2. minut) svinjskog faktora VIlla bila l O puta veća od aktivnosti humanog faktora VIlla, a da su aktivnosti oba faktora posle toga opadale, s tim što je aktivnost humanog faktora VIlla opadala brže.

Generalno gledano, pokušaji da se izoluje stabilan humani faktor VIlla nemaju uspeha, čak i kad se obezbede uslovi uslovi koji daju stabilan svinjski faktor VIlla. Kao dokaz ovoga, humani faktor VIII, prečišćen pomoću Mono O™ HPLC, aktiviran je trom

binom i podvrgnut Mono s™ katjon-izmenjivačkoj HPLC (Pharmacia , Inc.) , pod

uslovima pod kojima nastaje stabilni svinjski faktor VIlla, kako opisuju Lollar i sar. (1989) Biochemistry 28:666.

Humani faktor VIII, 43 Jlg/ml (0,2 J.!M) u 0,2 M Na Cl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaC12 , pH 7,4, i l O ml ukupne zapremine, reagovao je l O minuta sa trombinom (0,036

J.!M), a u tom periodu je dodat FPR-CH2Cl D-fenil-prolil-arginil-hlorometilski keton u koncentraciji od 0,2 J.!M, u cilju ireverzibilnog inaktivisanja trombina. Smeša je, potom, razblažena u odnosu l:l sa 40' mM 2-(N-morfolino) etan sulfonskom kiselinom (MES),

5 mM CaC12 , pH 6,0, pa prebačena brzinom od 2 ml/min na Mono s™ HR 5/5 HPLC kolonu (Pharmacia, Inc.), ekvilibrisanu u 5 mM MES, 5mM CaC12 , pH 6,0 (Pufer B) plus O, l M NaCL Faktor VIlla je izdvojen bez ispiranja kolone pomoću 20 ml gradijenta iz O, l M NaCl u 0, 9 M NaCl u Puferu B, brzinom od l ml/min.

Frakcija sa koagulantnom aktivnošću u dvofaznom testu , pod ovim uslovima je eluirala kao pojedinačni pik. Specifična aktivnost pik frakcije bila je približno 7 ,500

JIA280 • Natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) Mono s™

pika faktora VIlla, nakon koje je usledilo bojenje proteina srebrom, otkrila je dve trake koje odgovaraju heterodimernom (A3-Cl -C2/Al) derivatu faktora VIII. Iako bojenje srebrom pod ovim uslovima nije identifikovalo A2 fragment zbog njegove niske koncentracije, ovaj fragment je identifikovan kao oligosastojak pomoću markiranja sa

1251.

Za razliku od rezultata dobijenih sa humanim faktorom VIII, svinjski faktor VIlla, izolovan pod istim uslovima pomoću Mono S™ HPLC , imao je specifičnu aktiv nost 1 ,6 x 106 J!A280 • SDS-PAGE analiza svinjskog faktora VIlla pokazala je prisustvo 3 fragmenta koji odgovaraju podjedinicama Al, A2 i A3-Cl-C2 , što pokazuje da svinjski faktor VIlla poseduje tri podjedinice.

Rezultati Mono S™ HPLC preparata humanog, trombinom aktiviranog faktora VIII pri pH 6,0, ukazuju na to da je humani faktor VIlla nestabilan pod uslovima koji da ju stabilni svinjski faktor VIlla. Međutim, iako je identifikovano prisustvo A2 fragmenta u tragovima u pik frakciji, utvrđivanje toga da li koagulantna aktivnost potiče od malih

količina heterotrimernog faktora VIlla ili od heterodimernog faktora VIlla male speci

fične aktivnosti, nije bilo moguće samo na osnovu ovog metoda.

Odgovor na ovo pitanje bi mogao da pruži način za izolovanje humanog fak tora VIlla pre nego što izgubi svoju podjedinicu A2. Sa tim ciljem je ostvarena izolacija, postupkom koji uključuje smanjenje vrednost pH Mono s™ pufera na pH 5. Humani faktor VIII, prečišćen pomoću Mono Q™ (0,5 mg), razblažen je vodom da se dobije ko

načni sadržaj od 0,25 mg/ml (l J.l) faktora VIII u 0,25 M NaCl, O, l M Hepes, 2,5 mM CaC12 , 0,005% Tween-80, pH 7,4 (ukupne zapremine 7,0 ml). Dodavanjem trombina dobijena je konačna koncentracija od O, 72 J.lm i ostavljena da reaguje 3 min. Zatim je trombin inaktivisan sa FPR-CH2Cl (0,2 J.lm). Potom je smeša razblažena u odnosu 1:1 sa

40 mM natrijum acetata, 5 mM CaC12 , 0,01% Tween-80, pH 5,0, i preneta brzinom od 2

ml/min na Mono s™ HR 5/5 HPLC kolonu, ekvilibrisanu u O, l mM natrijum acetata, 5 mM CaC12 , 0, 01 % Tween-80, uz pH 5,0, i dodatak 0,1 M NaCl. Faktor VIlla je odvojen od apsorbensa bez ispiranja kolone, uz pomoć 20 ml gradijenta, sa O, l M naCl u l ,O M

NaCl u istom puferu i brzinom od l ml/min. Ovo je za posledicu imalo povraćaj koagu lantne aktivnosti u piku, koji je sadržao merljive količine fragmenta A2, što su pokazali SDS-PAGE i bojenje srebrom. Specifična aktivnost frakcije pika bila je desetostruko veća od ponovo uspostavljene aktivnosti uz pH 6,0 (75000 JIA280 v. 7500 JIA280). Među tim, za razliku od svinjskog faktora VIlla izolovanog pri pH 6,0, koji je neograničeno

stabilan na 4°C, aktivnost humanog faktora VIlla je neumoljivo opadala tokom nekoliko sati posle izdvajanja sa Mono s™. Pored toga, specifična aktivnost faktora VIlla pre čišćenog pri pH5,0 i testiranog neposredno potom, iznosila je svega 5% specifične ak tivnosti svinjskog faktora VIlla, što ukazuje na to da se pre izvođenja testa javlja značaj

na disocijacija.

Navedeni rezultati pokazuju da se i humani i svinjski faktor VIlla sastoje od po 3 podjedinice (Al, A2 i A3-Cl-C2). Odvajanje podjedinice A2 odgovorno je za gubitak aktivnosti i humanog i svinjskog faktora VIlla pod određenim uslovima kao što su fizio loška jonska snaga, pH i koncentracija. Relativna stabilnost svinjskog faktora VIlla pod određenim uslovima, posledica je čvršće veze podjedinice A2.

Primer4: Izolacija i sekvenciranje DNK kojom se kodira domen A2 svinjskog faktora

VIII

Ranije sekvenciranje samo za sekvence nukleotida, kojim se kodira domen B i deo domena A2 svinjskog faktora VIII [Toole i sar. (1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA

83:5939-5942]. cDNK i predviđene aminokiselinske sekvence i (SEQ ID br: 3 odnosno

4) celokupnog domena A2 svinjskog faktora VIII izneti su ovde.

Domen A2 svinjskog faktora VIII kloniran je reverznom transkripcijom celo kupne RNK svinjske slezine i pojačavanjem PRC; korišćeni su degenerisani prajmeri, koji se zasnivaju na sekvenci cDNK poznatog humanog faktora VIII i jedan ispravan prajmer, zasnovan na delu sekvence svinjskog faktora VIII. Izolovan je PCR produkt (l kb) i pojačan ubacivanjem u fagemidni vektor BluescriptTM (Stratagene).

Svinjski domen A2 je potpuno sekvenciran didezoksi sekvenciranjem. Sekven

ce cDNK i očekivane aminokiselinske sekvence opisani su na SEQ ID br: 3 odnosno 4.

Primer 5: Potpuna sekvenca DNK kojom se kodira svinjski faktor VIII

Klenow fragment, fosforilisane Clai veze (linkeri) , Noti linkeri, T4 ligaza i Taq DNK polimeraza nabavljeni su od Promega (Madison, Wisconsin) . Polinukleotidna ki naza je pribavljena od Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. y32P-ATP (Redivue, >5000C i/mmol) potiče iz Amershama. pBluescript II KS- i Epicurean XLI Blue ćelije E. coli dobijeni su od Stratagene (La Jolla, California). Sintetički oligonu kleidi su kupljeni od Life Technologies, Inc. ili Cruachem , Inc. 5'-fosforilisani prajmeri su korišćeni prilikom proizvodnje PCR produkata za potrebe kloniranja. Nukleotidno (nt) obrojčavanje oligonukleotida, korišćenih u ulozi prajmera za pojačavanje reakcije lanca polimeraze (PCR) cDNK svinjskog faktora VIII ili genomske DNK, koristilo je cDNK humanog fVIli kao referentni (standard) (Wood i sar. (1984) supr a) .

Ukupna RNK svinjske slezine izolovana je gvanidinium tioci janat-fenol-hloro form kiselinskom ekstrakcijom [Chomczynski i sar. (1987) Anal.Biochem . 162:156-159]. Ako nije drugačije naglašeno, svinjska cDNK je dobijena iz ukupne RNK slezine pomo ću reverzne transkriptaze Moloney virusa mišje leukemije (RT) i sluča jno odabranih heksamera za pokretanje reakcije (First-Strand eDNA Synthesis Kit , Pharmacia Bio-

tech). Reakcije RT su sadržale 45 mM Tris-Cl, ph 8,3, 68 mM Kcl, 15 mM DTT, 9 mM MgC12 , 0,8 mg/ml goveđeg serumskog albumina i l ,8 mM dezoksinukleotidne trifosfa taze (dNTP). Svinjska genomska DNK je izolovana iz slezine primenom standardne procedure (Strauss, W.M. (1995) u Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i sar., urednici, John Wiley & Sons, pp. 2.21-2.2.3). Izolovanje DNK iz agaroz nog gela obavljeno je korišćenjem Geneclean II (Bio 101) ili Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

Reakcije PCR su izvedene pomoću Hybaid OmniGene termociklatora. Za izvo đenje PCR reakcija u kojima učestvuje Taq DNK polimeraza, reakcije su uključivale 0,6 mM MgC12 , 0,2 mM dNTPova, 0,5 1-1M oligonukleotidnih prajmera, 50 j/ml polime-raze i O, l zapreminski deo reakcione smeše prvog lanca cDNK. Ukoliko nije drugačije naglašeno, produkti PCR su izdvajani pomoću gela, krajevi su im zaobljeni pomoću Kleow fragmenta, istaloženi su sa etanolom, pa vezani na EcoRV mesto defosforili sanog pBluescript II KS- ili vezani sa fosforilisanim Clal vezama pomoću T4 ligaze, obrađeni sa Clal, prečišćeni Sephacryl S400 hromatografijom, pa vezani na, pomoću Clal presečen, defosforilisan pBluescript II KS-. Ligacija je obavljena uz pomoć T4 DNK ligaze (Rapid DNA ligation kit, Boehringer Mannheim), osim ako nije drugačije naglašeno. Plazmidi pBluescript II KS- sa umetnutimm delom korišćeni su za trans formisanje Epicurean XLI-Blue ćelija E. coli.

Sekvenciranje plazmidne DNK obavljeno je pomoću automatskog uređaja za sekvenciranje Applied Systems 373a i seta za uklanjanje boje PRISM, ili pak ručno, uz korišćenje seta za sekvenciranje Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation). Direktno sekvenciranje produkata PCR, uključujući i završno markiranje završetka nukleotida sa

32P, obavljeno je primenom protokola sekvenciranja ciklusa (dsDNA Cycle Sequen

cing System, Life Technologies).

Izolacija klonova cDNK svinjskog fVIli koji sadrže kodone 5' UTR sekvence, signalnog peptida i domena Al

5' domena A2 cDNK svinjskog fVIli pojačana je usađenom RT-PCR ukupne RNK slezine ženke svinje, korišćenjem protokola 5' brze amplifikacije završetaka cDNK (5'-RACE) (Marathon eDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). To je

obuhvatilo sintezu prvog lanca cDNK uz pomoć oligo(dT) prajmera za vezivanje i fiksi ranje [Borson, N.D. i sar. (1992) PCR.Methods.Appl. 2_:144-148], sintezu drugog lanca cDNK uz korišćenje DNK polimeraze I E. coli, i vezivanje sa adapterom dvostrukog lanca, proširenim sa 5', SEQ ID Br.:5.

5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3

3'-H2N-CCCGTCCA.P0 4-5'

čiji je kraći lanac blokiran na 3' završetku jednom amino grupom radi redukovanja ne specifičnog prajmiranja PCR, a komplementaran je grupi od 8 nukleotida na 3' zav ršetku (Siebert, P.D. et al. (1995) Nucleic.Acids.Res. 23:1087-1088). U prvoj seriji obav ljenih PCR korišćeni su oligonukleotidi specifični za adapter, SEQ ID Br.: 6 odnosno 5' CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (označen sa APl) kao sens prajmer, i oligonukleotid specifičan za A2-domen svinjskog fVIli, SEQ IN br.: 7 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081.2104) kao antisens prajmer. Druga serija PCR koristila je usađeni, adapter-specifični oligonukleotid, SEQ ID br.: 8 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (označen sa AP2), kao sense prajmer, i usađene, za svinjski domen A2 specifične oligonukleotide, SEQ ID br.: 9 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3 (nt 1497-1520), kao antisense prajmer. PCR su rađe-ne uz pomoć komercijalnog seta (Advantage cDNK PCR core kit), koji obuhvata pro-tokol brzog starta posredovanog antitelima [Kellogg, D.E. i sar. (1994) BioTechniques lQ:1134-

1137]. Uslovi PCR su podrazumevali denaturaciju na 94°C tokom 60 sekundi, nakon koje je usledilo 30 ciklusa (prva serija PCR) odnosno 25 ciklusa (druga serija PCR) od po 30 sek. denaturacije na 94°C, očvršćavanje (30 sek.) na 60°C, i 4-minutna elongacija na 68°C, uz korišćenje uređaja za temperaturnu kontrolu. Ovim postupkom je dobijen ispupčen (=1.6 kb) proizvod, usklađen s amplifikacijom fragmenta, koji zalazi oko 150 bp u 5' UTR. Produkt PCR je kloniran u pBluescript pomoću Clai linkera. Četiri ubačena klona su sekvencirana u oba pravca.

Sekvenca ovih klonova obuhvata zone koje odgovaraju 137 bp 5'UTR, signal-nog peptida domena Al i dela domena A2. Usaglašenost je postignuta na najmanje 3 od 4 mesta. Klonovi su, ipak, sadržali u proseku 4 očigledne mutacije koje je dala PCR, verovatno zbog većeg broja serija PCR, koje su bile potrebne za generisanje proiz-

voda koji se može klonirati. Stoga su, za stvaranje sens lanca fosforilisanog prajmera PCR, korišćene sekvence iz regije signalnog peptida, SEQ ID br.: lO 5'-CCT CTC GAG CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', označene sa RENEOPIGSP, za sintezu drugog produkta PCR u cilju potvrđivanja sekvence i za kloniranje u vektor ekspresije. Masnim slovima označen red označava polazni kodon. Sekvenca 5' ovde predstavlja sekvencu identičnu 5' mesta ugradnje u ekspresioni vek tor sisara ReNeo, korišćen za ekspresiju fVIli (Lubin i sar. (1994) supra). Ova lokacija uključuje i mesto cepanja Xhol (podvučeno). RENEOPIGSP i nukleotid nt 1497-1520 korišćeni su za pokretanje Taq DNK-polimerazom posredovane PCR reakcije u kojoj se, kao kliše, koristi cDNK ženke svinje. DNK polimeraza drugih proizvođača nije omogućila dobijanje merljivog proizvoda. Uslovi PCR su uključivali denaturisanje na

94°C (4 min), 35 ciklusa 1-minutnog denaturisanja na 94°C, očvršćavanje (2 min) na

55°C, i elongaciju 2 min. na 72°C, a zatim završnu fazu elongacije (5 min. na 72°C). Produkt PCR je kloniran u pBluescript pomoću Clai veza. Umetci ova dva klona su sekvencirani u oba pravca i odgovarali su dogovorenom nizu.

Izolacija klonova cDNK svinjskog fVIli, koji sadrže kodone domena A3, Cl i 5' polovinu domena C2

Na početku su klonirana dva produkta RT-PCR svinjske slezine, koja odgova raju fragmentu domena B-A3 (nt 4519-5571) i fragment domena Cl-C2 (nt 6405-6990). Dobijeni završetak 3' domena C2 zalazio je u regiju eksona 26, a to je terminalni ekson u fVIli. Produkt B-A3 je dobijen korišćenjem prajmera specifičnog za svinjski B domen, SEQ ID br: ll 5'-CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3', u kojem podvučena regija odgovara regionu u svinjskom fVIli koji se poklapa sa nt 4519-4530 u humanom fVIli. Regija 5' oligonukleotida obuhvata Noti mesto koje je bilo predviđeno za svrhu kloniranja. Antisens prajmer korišćen za stvaranje B-A3 produkta, SEQ ID br:

12 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3', bazirao se na obrnutom kom

plementu niza eDNA humanog fVIli na nt 5545-5571. Reakcija PCR obuhvatila je 50 mM KCl, lO mM Tris-Cl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 , 3,5 mM dNTPova, 20 )lM prajmere, 25 jedinica/ml Taq DNK polimeraze i 1120 zapremine RT reakcione smeše. Uslovi PCR su uključivali denaturisanje na 94°C tokom 3 min, zatim 30 ciklusa l-minut-

nog denaturisanja na 94°C, očvršćavanje (2 min) na 50°C , i elongaciju 2 min. na 72°C. Proizvodi PCR su fosforilisani uz pomoć T4 DNK kinaze i dodati su Noti linkeri. Posle isecanja pomoću Noti, PCR fragmenti su klonirani u Noti lokaciju BlueScript II KS- i transformisani u XLI-Blue ćelije.

Cl-C2 proizvod je napravljen korišćenjem poznate sekvence humane cDNK za sintetisanje sens i antisens prajmera, SEQ ID br: 13 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) odnosno SEQ ID br: 14 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (obrnutog komplemeta nt 6966-6990). Uslovi PCR su bili identični uslo-vima za generisanje B-A2 proizvoda. Dobijeni fragment je vezan na pNOT vektor klo-niranja pomoću Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime-3, Prime, Inc., Boulder, Colora-do)

i uzga jen u JM l 09 ćelijama.

Plazmidi B-A3 i C l-C2 su delimično sekvencirani da bi se dobili specifično svinjski sens i antisens oligonukleotidi SEQ ID br.: 15 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) odnosno SEQ ID br.: 16 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564). Ovi oligonukleotidi su korišćeni kao prajmeri za stva ranje 2013 bp produkta RT-PCR uz pomoć seta Clontech Advantage eDNA PCR. Ova j produkt , koji odgovara humanom nt 4551-6564, uključuje i regiju koja odgovara aktiva donom peptidu lakog lanca (nt 5002-5124) , domenu A2 (nt 5125-6114) i većem delu domena Cl (nt 6115-6573). Sekvenciranjem klona Cl-C2 utvrđeno je da su humana i svinjska cDNK, od nt 6564 do 3' završetka domena Cl , identične. Produkt PCR je klo niran u EcoR mesto pBluescript II KS-. Četiri klona su potpuno sekvencirana u oba pravca. Usaglašenost je postignura u bar 3 od 4 mesta.

Izolacija klonova cDNK svinjskog fVIli. koji sadrže 3' polovinu kodona domena C2

Domen C2 humanog fVIli (nukleotidi 6574-7053) smešten je u eksone 24-26 (Gitschier J. i sar. (1984) Nature 312:326-330). Humani ekson 25 sadrži 1958 bp, što od govara nukleotidima 6901-8858. Sadrži 1478 bp 3' netransplantiranog niza. Pokušaji da

se klonira cDNK eksona 26 koja odgovara 3' završetku domena C2 i 3' UTR pomoću 3' RACE [Siebert i sar. (1995) supra], inverzne PCR [Ochman, H. i sar. (1990) Bio technology (N.Y.) _a:758-760], PCR restrikcionog mesta [Sarkar , G. i sar. (1993) PCR

Meth.Appl. g:318-322], "nepredvidivo prajmirane" PCR [Dominguez, O. i sar. (1994) Nucleic.Acids.Res. 22:3247-3248] i pregledom biblioteke cDNK svinjske jetre, nisu imali uspeha. Pokušavalo se sa 3' RACE, uz korišćenje iste biblioteke za adapter veza-ne cDNK dvostrukog lanca, koja je s uspehom korišćena za kloniranje 5' završetka cDNK svinjskog fVIli. Neuspeh ovog metoda nije, stoga, bio posledica odsustva cDNK koja odgovara eksonu 26.

Za kloniranje 3' polovine domena C2 korišćena je PCR procedura preklapanja ciljnog gena [Parker, J. i sar. (1991) Nucleic.Acids.Res. 19:3055-3060]. Svinjski specifi čan sens prajmer, SEQ ID br:l7 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (NT 6904-6924)

sintetisan je na bazi inicijalne sekvence domena C2 i korišćen u PCR reakciji sa ne specifičnim prajmerima koji se preklapaju, izabranim među oligonukleotidima kojima je laboratorija raspolagala. Proizvodi PCR su zatim izdvajani pomoću analize eksten zije prajmera [Parker i sar. (1991) BioTechniques lQ:94-101], primenom svinjski speci fičnog internog prajmera, markiranog na 32P završetku , SEQ ID br: 18 5'-CCGTGG TGAACGCTCTGG-ACC-3' (NT 6932-6952). Zanimljivo je da su, od 40 ispitivanih ne specifičnih prajmera, samo dva dala pozitivne proizvode na analizu ekstenzije praj mera, i da su ta dva odgovarala pravilnoj i degenerisanoj humanoj sekvenci na 3' za vršetku domena C2: SEQ ID br: 19 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-

7053) i SEQ ID br: 20 5'-GTA GAGSTSCTGKGCCTCTCAKCCYAG-3' (nt 7027-7053) . Ovi prajmeri su, u početku, bili namenjeni dobijanju proizvoda primenom kon- vencionalne RT-PCR, ali nisu dali dovoljno proizvoda koji bi se mogao uočiti pomoću vezivanja etidijum-bromid-ne boje. PCR proizvod se može, međutim, identifikovati osetljivijim metodom ekstenzije prajmera. Proizvod je prečišćen gelom i direktno se kvenciran. Ovo je proširilo niz svinjskog fVIli dont 7026.

Drugi niz je dobijen analizom ekstenzije prajmera primenjenom na usađeni proizvod PCR, dobijen korišćenjem biblioteke za adapter vezane cDNK dvostrukog lanca , koja je korišćena u prethodno opisanom 5'- RACE protokolu. Prva serija reakcije koristila je ispravan svinjski prajmer SEQ ld br: 21 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGC TGT-3' (nt 6541-6564) i APl prajmer. U drugoj seriji reakcije korišćen je SEQ ID br: 22

5'-AATCAG GACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) i AP2 prajmer. Direktno PCR

sekvenciranje je proširilo sekvencu 3' do kraja domena C2 (nt 7053) . Sekvenca domena C2 bila je jedinstvena, osim na nt 7045, kod 3' završetka domena C2. Analiza ponovljenih PCR reakcija je davala na tom mestu A, G ili udvojeno A/G.

Sekvenciranje je zašlo i u 3' UTR pomoću dva dopunska prajmera, SEQ IN br.:

23 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) i SEQ ID br.: 24 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG G-3' (nt 7008-7031). Dobijeno je približno 15 bp 3' UTR sekvence, iako je sama sekvenca na nekoliko mesta bila nejasna. Zatim je, na osnovu najboljih procena 3' UTR, sintetisano nekoliko antisens prajmera. Ti prajmeri su sadržali obrnuti komplement TGA zaustavnog kodona na 3' završecima. PCR proiz vodi su dobijeni iz genomske DNK svinjske slezine i cDNK svinjske slezine, koje su visuelizovane agaroza gel elektroforezom i bojenjem etidijum bromidom, pomoću specifičnog sens prajmera SEQ ID br: 25 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) i 3' UTR antisens prajmera SEQ ID br: 26 5'-CCTTGCAGGAATTCG ATTCA-3'. Za dobijanje dovoljne količine materijala za svrhe kloniranja, izvršena je druga serija PCR uz pomoć usađenog sens prajmera SEQ ID br.: 27 5'-CCGTGG TGAACGCTCT GGACC-3' (nt 6932-6952) i isti antisens prajmer. Dobijeni 141 bp pro izvod PCR kloniran je u EcoRV-isečen pBluescript II KS-. Za tri klona dobijena iz ge nomske DNK i tri klona iz cDNK uzete su sekvence u oba pravca. Sekvence su bile jasne, osim na nt 7045, gde je genomska DNK bila uvek A, a cDNK uvek G.

Aranžmani više sekvenci DNK humanog, svinjskog i mišjeg fVIli (Sl. lA-l H)

Aranžmani signalnog peptida i regiona Al , A2, A3, Cl i C2 urađeni su uz po

moć CLUSTALW programa [Thompson, J.D. i sar. (1994) Nucleic.Acids.Res. 22:4673-

4680]. Kazne za nezatvoren niz i prazninu u ekstenziji bile su 10 odnosno 0,5. Aranž mani humanog, svinjskog i mišjeg B domena opisani su prethodno [Elder i sar. (1993) supra]. Humani niz A2 odgovara amino kiselinama 373-740 u SEQ ID br:2. Svinjska aminokiselinska sekvenca A2 data je u SEQ ID br:4, a sekvenca amino kiselina domena A2 miša predstavljena je na SEQ ID br:28, amino kiseline 392-759.

Primer 6: Ekspresija aktivnog, rekombinantnog svinjskog faktor a VIII lišenog domena

B (Pir)

Materijali:

Citratisana humana hemofilična A i zdrava donatorska plazma su nabavljene od George King Biomedical, Inc. Fetalni goveđi serum, geneticin, penicilin, streptomi cin i podloge DMEM/Fl2 i AIM-V isporučila je Life Technologies, Inc. Taq DNK poli meraza kupljena je od firme Promega, Vent DNK polimeraza od New England Biolabs, Pfu DNK polimeraza i fagemidni pBlueScript II Ks- od Stratagene. Sintetski oligonu kleotidi su kupljeni od Life Technologies ili Cruachem, Inc. , restrikcioni enzimi od New England Biolabs ili Promega. U proizvodnji PCR produkata za potrebe kloniranja korišćeni su 5'-fosforilisani prajmeri. Za nukleotidno (nt) obeležavanje oligonukleotida korišćenih u ulozi prajmera za PCR pojačavanje cDNK svinjskog fVIli ili genomske DNK, korišćena je cDNK humanog fVIli kao referentni standard [Wood i sar. (1984) Nature 312:330-337]. Ekspresioni vektor fVIli, označen sa HB-/ReNeo isporučio je Bio gen, Inc. HB-/ReNeo sadrži gene ampicilinske i geneticinske rezistencije i cDNK hu manog fVIli, kojoj nedostaje čitav domen B, definisanoj kao Ser741-Arg1648 fragment cepanja pod dejstvom trombina. Za pojednostavljivanje mutageneze domena C2 cDNK humanog fVIli, koji se nalazi na 3' završetku umetka FVIli u ReNeo, ubačeno je Noti mesto od dve 3' baze pre zaustavnog kodona HB-/ReNeo, pomoću mutageneze crno tavanjem ekstenzijom koja se preklapa (SOE). [Horton, R.M. i sar. (1993) Methods. Enzymol. 217:270-279]. Ova struktura je obeležena sa HB eNeo/Notl.

Ukupna RNK je izolovana ekstrakcijom gvanidinuijum tiocijatat-fenol-hlorofor mom [Chomczyinski, P. i sar. (1987) Anal.Biochem . 162:156-159]. cDNK je sintetisana iz mRNK pomoću reverzne transkriptaze (RT) Moloney-evog virusa mišje leukemije i slučajno odabranih heksamera, u skladu sa uputstvom proizvođača (First-Strand cDNK Synthesis Kit, Qiagen, Inc.). Za izvođenje PCR reakcija korišćen je Hybaid OmniGene termociklator koji koristi Taq, Ventili Pfu DNK polimeraze. Produkti PCR su prečišćeni gelom, istaloženi sa etanolom, i vezani u plazmidnu DNK pomoću T4 DNK ligaze (Ra pid DNK ligation kit, Boehringer Mannheim). Plazmidi sa umetkom su korišćeni za transformaciju Epicurean XLI-Blue ćelija. Sve nove sekvence DNK faktora VIII stvore-

ne pomoću PCR, potvrđene su didezoksi sekvenciranjem pomoću automatskog uređa

ja za sekvenciranje Applied Biosystems 373a i seta za eliminaciju boje PRISM. Konstrukcija ekspresionog vektora hibridnog fVIli, HP20. koji sadrži svinjski domen C2

cDNK svinjskog fVIli, koja odgovara 3' završetku domena Cl i čitavom domenu C2, klonirana je u pBluescript pomoću RT-PCR iz ukupne RNK slezine, uz pomoć prajmera, baziranih na poznatoj sekvenci cDNK svinjskog fVIli [Healey, J.F. i sar. (1996) Blood 88:4209-4214]. Ova struktura i HB-/ReNeo su korišćeni kao klišei za dobi janje proizvoda fuzije humanog Cl-svinjskog C2 u pBluescript-u pomoću SOE mutage neze. Fragment C l-C2 iz ovog plazmida je odstranjen uz pomoć Apa/ i Not/, i vezan u Apa/ /Not/-presečen HB-/ReNeo/Not/, čime je dobijen HP20/ReNeo/Not/.

Konstrukcija hibridnog humano/svinjskog faktora VIII bez B domena. koji sadrži svinjski laki lanac (HP18)-

Laki lanac humanog fVIli sastoji se od aminokiselinskih reziduuma Asp1649- Tyr2332. Odgovarajući reziduumi cDNK svinjskog fVIli zamenjeni su ovim regionom HB- da bi se dobio moleku!hibridnog humano/svinjskog fVIli, označen kao HP18. To je izvršeno supstitucijom PCR produkta koji odgovara svinjskom regionu A2, domena A3 i Cl, kao i dela domena C2 u odgovarajući regiju HP20. Da bi se postupak konstrukcije olakšao, u nt 2273 je SOE mutagenezom uvedeno sinonimno Avr/1 mesto, na spoju do mena A2 i A3 HP20.

Konstrukcija hibridnog humano/svinjskog faktora VIII bez B domena, koji sadrži svinjski signalni peptid i domene Al i A2 (HP22)-

Signalni peptid i domeni Al i A2 humanog fVIli sastoje se od aminokiselinskih reziduuma Met(-19)-Arg740. Odgovarajući reziduumi cDNK svinjskog fVIli zamenjeni su ovim regionom HB- da bi se dobio moleku!označen sa HP22. Osim toga, u nt 2273 uvedeno je istoznačno Avr/1 mesto, na sastavu domena A2 i A3 HP22. HP22 je konstru isan stapanjem fragmenta svinjskog signalnog peptida-Al-dela A2 u pBluescript [Healy i sar. (1996) supra] sa hibridnim humano/svinjskim faktorom VIII bez B domena, koji sadrži svinjski domenA2, označen sa HPI [Lubin i sar. (1994) supra].

Konstrukcija svinjskog faktora VIII lišenog domena B [fVIII-(PB-)]

Fragment Spel/Notl HP18/BS (+Avrll) kondenzovan je pomoću Avr/1/Notl i po vezan u HP22/BS (+Avrl) kondenzovanom pomoću Avr/1/Notl da bi se dobila struktura PB-/BS (+Avrll), koja se sastoji od svinjskog fVIli kojem nedostaje čitav B domen. PB je kloniran u ReNeo vezivanjem Xba/Notl fragmenta PB-/BS (+Avrll) u HP22/ReNeo

!Noti (+Avrll).

Ekspresija molekula rekombinantnog fVIli

PB-/ReNeo/Noti (+ Avrll) i HP22/ReNeo/Not/ (+Avrll) su na kratko ubačeni u COS ćelije i eksprimirani kao što je već ranije opisano [Lubin, J .M. i sar. (1994) ].BioJ. Chem. 269:8639-8641]. HB-/ReNeo/Noti i lažna DNK su ubačeni u ulozi kontrole.

Hromogeni test je korišćen za određivanje fVIli (koagulacione) aktivnosti PB-, HP22 i HB-, na sledeći način. Uzorci fVIli u supernatantima COS ćelijske kulture su ak tivirani pomoću 40 nM trombina u O, 15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaC12 , O, l % Tween-80, pH 7,4 u prisustvu 10 nM faktora IXa, 425 nM faktora X i 50 M jednola melarnih fosfatidil-serin/fosfatidil-holinskih (25175 w/w) vezikula. Nakon 5 minuta, re akcija je prekinuta pomoću 0,05 M EDTA i 100 nM rekombinantnog desulfatohirudina, a dobijeni faktor Xa je meren testom hromogenog supstrata. U toku testa hromogenog supstrata je dodato 0,4 mM Spectrozyme Xa, a brzina oslobađanja paranitroanilida je određivana merenjem apsorbanse rastvora na 405 nm.

Rezultati nezavisno ubačenih supernatanta duplikatne ćelijske kulture (apsor

bansa na 405 nm po minutu)

HB-: 13, 9

PB-: 139

HP22: 100 surogat: < 0,2

Ovi rezultati pokazuju da su svinjski fVIli bez domena B i fVIli bez domena B, a koji se sastoji od podjedinica Al i A2, aktivni i ukazuju na to da je njihova aktivnost veća od aktivnosti humanog fVIli bez domena B.

PB- je delimično prečišćen i koncentrovan iz hranljive podloge heparin Sepharose hromatografijom. Heparin-Sepharose (10 ml) je ekvilibrisana sa 0,075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaC12, 0,005% Tween-80, 0,02% natrijum-azida, pH 7,40. Podloga (100-200 ml) eksprimiranih ćelija se nanosi na heparin-Sepharose, koja se po tom ispira sa 30 ml ekvilibracionog pufera bez natrijum-azida. PB- je izdvojen pomoću

0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaC12 , 0,01 % Tween-80, pH 7,40, i čuvan na temperaturi od -80°C. Prinos koagulacione aktivnosti fVIli bio je, po pravilu, 50-75% .

Stabilna ekspresija svinjskog fVIli bez domena B (PB-)

Transfektirane ćelijske linije su čuvane u Dulbecco-voj modifikovanoj Eagle podlozi-Fl2, koja sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 50 ]/ml penicilina i 50 f..lg/ml streptomicina. Pre upotrebe je fetalni goveđi serum l sat termički inaktivisan (50°C). HB-/ReNeo i PB-/ReNeo/Not/(+ Avrll) su stabilno transfektovani u BHK ćelije i birani po geneticinskoj rezistenciji prema opštem, prethodno opisanom protokolu [Lubin i sar. (1994) Biol.Chem. 269:8639-8641], s tom razlikom što su ekspresivne ćelije gajene u hranljivoj podlozi koja je sadržala 600 f.!g/ml geneticina. Ćelije iz Corning T-75 normalnog suda, dorasle do spajanja, prenete su u Nunc trostruki sud u podlozi sa 600 f..lg/ml geneticina, i puštene da se spoje. Zatim je podloga uklonjena i zamenjena AIM V podlogom bez seruma (Life Technologies, Inc.) i bez geneticina. Ekspresija faktora VIII je praćena preko jednofazne koagulacione aktivnosti faktora VIII (v. gore) , a jed nom dnevno je, tokom 4 do 5 dana, uzimano po 100-150 ml podloge. Maksimalni nivoi ekspresije HB- i PB- u podlozi bili su l 02 ]/ml odnosno l 0-12 ]/ml koagulacione aktivno sti faktora VIII.

Prečišćavanje PB-

PB- je istaložen iz supernatanta kulture pomoću 60% zasićenog amonijum sulfata, a zatim prečišćavan pomoću W3-3 imunoafinitetne hromatografi je i Mono Q HPLC , kao što je prethodno navedeno kad je bilo reči o prečišćavanju svinjskog fak tora VIII iz plazme [Lollar i sar. (1993) Factor VIII/factor VIlla. Methods.Enzymol .

222:128-143]. Specifična koagulaciona aktivnost PB- je merena jednofaznim testom ko

agulacije [Lollar i sar. (1993) supra].

Analiziran SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom, preparat PB- je sadržao tri trake uočljivih molekularnih masa 160 kDa, 82 kDa i 76 kDa. Trake od 82 kDa i 76 kDa su prethodno opisane kao heterodimeri, koji sadrže domene Al-A2 i ap-A3-Cl-C2 (gde se ap odnosi na aktivacioni peptid) [Toole i sar. (1984) Nature 312:342-347]. Tra ka od 160 kDa je preneta na poliviniliden-fluoridnu membranu u podvrgnuta se kvenciranju NH2 završetka, koje je dalo Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (gde Xx označava nepo znato), što je sekvenca NH2 završetka faktora VIII jednostrukog lanca [Toole i sar. (1984) supra]. PB- je, tako, delimično prerađen rascepom između domena A2 i A3, i to tako da ga čine dva oblika, protein jednostrukog lanca Al-A2-ap-A3-Cl-C2 i heterodi mer Al-A2/ap-A3-Cl-C2. Postoje podaci o sličnoj obradi za rekombinantni HB- [Lind i sar. (1995) Eur.j.Biochem. 232:19-27].

Karakterizacija svinjskog faktora VIII

Utvrdili smo sekvencu cDNK svinjskog fVIli koja odgovara 137 bp 5' UTR, re gije kojom se kodira signalni peptid (57 bp), kao i domene Al (1119 bp), A3 (990 bp), Cl (456 bp) i C2 (483 bp). Zajedno sa prethodno objavljenom sekvencom domena B i regiona aktivacionog peptida lakog lanca [Toole i sar. (1986) su pra] i domena A2 [Lubin i sar. (1994) supra], sekvenca koja se ovde iznosi kompletira određivanje cDNK svinjskog fVIli, koja odgovara izmenjenom proizvodu. Fragment koji obuhvata regiju 5' UTR, signalni peptid i domen Al cDNK, kloniran je uz pomoć 5'-RACE RT-PCR proto kola. Prajmer koji se bazira na sekvenci humanog C2 pokazao se uspešnim za dobi janje RT-PCR proizvoda koji je doveo do kloniranja domena A3, Cl i 5' polovine do mena C2. Pošto se kloniranje cDNK, koja odgovara 3' polovini domena C2 i 3' UTR cDNK, pokazalo teško izvodljivim, preostali deo domena C2 je, na kraju, kloniran PCR procedurom preklapanja ciljnog gena [Parker i sar. (1991) supra].

Sekvenca SEQ ID br: 29 bila je potpuno jasna osim na nt 7045, uz 3' završetak domena C2, koji je ili A ili G, kao što je napred izneto. Odgovarajući kodon je GAC (Asp) ili AAC (Asn). Humani i mišji kodoni su GAC odnosno CAG (Gln). Ostaje nepo znato da li je u pitanju polimorfizam ili PCR proizvod koji se ponavlja. cDNK rekombi nantnog hibridnog humano/svinjskog fVIli, koja sadrži supstitute svinjskog domena C2

koji odgovara i kodonu GAe i kodonu AAe, stabilno su eksprimirane bez merljivih razlika u pogledu prokoagulantne aktivnosti, što ukazuje na to da nema nikakve funkci onalne razlike između ove dve varijante domena e2.

Poredak predviđene sekvence amino kiselina pune dužine svinjskog fVIli SEQ ID br: 30, zajedno sa publikovanim humanim [Wood i sar. (1984) supra] i mišjim [Elder i sar. (1993) supra] sekvencama, prikazan je na Sl. lA-IH, zajedno sa mestima za iz-mene posle pretvaranja, proteolitičkog rascepa i prepoznavanja od strane drugih ma kromolekula. Stepen podudaranja ovih sekvenci je prikazan u Tabeli VII. Kao što je već naglašeno, domeni B ovih vrsta se više razlikuju nego domeni A ili e. Ovo se sasvim slaže sa zapažanjem da domen B, i pored svoje veličine, nema poznate funkcije [Elder i sar. (1993) supra; Toole i sar. (1986) supra] . Rezultati ovog pronalaska potvrđuju da za aktivnost svinjskog fVIli, domen B nije ni potreban. Na osnovu ovde iznetih poda taka sekvenciranja, može se sintetizovati svinjski fVIli kod kojeg je uklonjen ceo do men B ili deo tog domena, i to ekspresijom DNK kojom se kodira svinjski fVIli, iz koje je uklonjen ceo domen B ili deo kodona svinjskog domena B. Postoje, takođe, veće ra zlike među sekvencama koje odgovaraju domenu Al peptida cepanja APe/faktora IXa (reziduumi 337-372) i aktivacionog peptida lakog lanca (Tabela VII). Mesto cepanja

trombina na poziciji 336, da bi se generisao 337-372 peptid, kod miša, očigledno, ne

postoji, pošto je taj reziduum glutamin, a ne arginin [Elder i sar. (1993) su pra] . Rela tivno brzo razdvajanje peptida cepanja trombina (ili, možda, u mišjem fVIli rudimen tarni aktivacioni peptid 337-372), zapaženo je ranije kod fibrinopeptida [Creighton, T.E. (1993) u Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman, New York, s. 105-138]. Manjak biološke funkcije ovih peptida posle cepanja naveden je kao mo gući uzrok brzog razdvajanje. Smatralo se da je Arg562 u humanom fVIli značajnije mesto cepanja aktiviranog proteina e u toku inaktivisanja fVIli i fVIIIa [Fay, P.J. i sar. (1991) ].Biol.Chem. 266:20139-20145]. Ovo mesto je očuvano i u humanom, i u svinjskom i u mišjem faktoru VIII.

Potencijalna N-vezana mesta glikozilacije (NXS/T, gde X nije prolin) mogu se videti na Sl. lA-IH. Postoji osam sačuvanih N-vezanih mesta glikozilacije: jedno u do menu Al, jedno u domenu A2, četiri u domenu B, jedno u domenu A3 i jedno u domenu

e l. eisteini 19A i domena e su očuvani, dok kod cisteina domena B postoji razdvaja nje. Na homolognim mestima u faktoru V i ceruloplazminu nađeno je šest od sedam di sulfidnih veza iz fVIli, a obe disulfidne veze e domena se nalaze u faktoru V [McMullen, B.A. i sar. (1995) Protein Sci. _4:740-746]. Humani fVIli sadrži sulfatisane tirozine na pozicijama 346, 718, 719, 1664 i 1680 [Pittman, D.D. i sar. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. i sar. (1994) ].Biol.Chem. 269:20095-20102]. Ovi reziduumi su očuvani u fVIli miša i svinjskom fVIli (Sl. l), iako eLUSTALW pro gram nije uspeo da definiše mišji tirozin, koji odgovara Tyr346 u humanom fVIli.

Plazma miša i svinje može da koriguje defekt koagulacije u humanoj hemofi ličnoj A plazmi, što je u saglasnosti sa nivoom očuvanosti reziduuma u domenima A i e ovih životinjskih vrsta. Prokoagulantna aktivnost svinjskog fVIli veća je od one koju poseduje humani fVIli [Lollar, P. i sar. (1992) J.Biol.ehem. 267:23652-23657]. I re kombinantni svinjski fVIli (bez domena B), eksprimiran i prečišćen kao što je ovde izneto, budući sličan svinjskom fVIli iz plazme, takođe ispoljava veću specifičnu koagulantnu aktivnost od humanog fVIli. To je, možda, posledica smanjene brzine spontane disocijacije podjedinice A2 od aktivnog Al /A2/A3-el-e2 heterotrimera fVIli. Ostaje nepoznato da li ova razlika u prokoagulantnoj aktivnosti odražava evolucionu promenu funkcije, kao primer adaptacije vrste [Perutz, M.F. (1996) Adv.Protein.Chem.

36:213-244]. Sada, kada je potpuna sekvenca cDNK svinjskog fVIli, koji odgovara ko

piranom proizvodu, homolog skan mutageneza [eunningham, B.e., i sar (1989) Science 243:1330-1336] mogla bi da obezbedi način za identifikovanje strukturnih raz lika između humanog i svinjskog fVIli, odgovornih za nadmoćnu aktivnost svinjskog fVIli.

Svinjski fVIli je, po pravilu, manje reaktivan u prisustvu inhibitornih antitela, koja se stvaraju kod hemofiličara koji su primali infuzije fVIli, ili onih koja nastaju kao autoantitela kod ljudi uopšte. To i predstavlja osnovu za korišćenje koncentrata svinj skog fVIli u lečenju pacijenata s inhibitornim antitelima [Hay i Lozier (1995) supra]. Većina inhibitora je usmerena na epitope smeštene u domenima A2 ili e2 [Fulcher, e.A. i sar. (1985) Proc.Natl.Acad .Sci. USA 82:7728-7732; Scandella , D. i sar. (1988) Proc.Natl.Acad .Sci. USA 85:6152-6156; Sandella, D. i sar. (1989) Blood 74:1618-1626].

Osim toga, u jednom od domena, A3 ili Cl, identifikovan je i jedan epitop nepoznatog značaja [Scandella i sar. (1989) supra; Scandella, D. i sar. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. i sar. (1994) Blood 84:225a]. Epitop A2 je mapiran u reziduume 484-508 homolog skan mutagenezom [Healey i sar. (1995) supra]. U ovom 25 segmentu rezidu uma relativno je mali deo identične sekvence (16/25 ili 64%). Zanimljivo je da je ovaj region koji se, zbog činjenice da su antitela na njega inhibitorna, može smatrati funk cionalno značajnim, očigledno bio podvrgnut relativno bržem genskom variranju. Aranžman svinjskih domena A2 i A3 ukazuje na to da epitop A2 ne iskazuje merljivu homologiju sa odgovarajućim regionom u domenu A3.

Prema delecionim mapama, predlog je da se predpostavi da je inhibitorni epi top C2 humanog fVIli smešten u reziduume 2248-2312 [Scandella, D. i sar. (1995) Blood 86:1811-1819]. Humani i svinjski fVIli su u ovom rezidualnom segmentu 83% identični. Međutim, homolog skan mutageneza ovog regiona, sa ciljem da se karakte riše epitop C2, otkrila je da se značajna determinanta epitopa C2, neočekivano, nalazi u regionu koji odgovara humanim amino kiselinama 2181-2243 (SWQ ID br.: 2 i Sl. l H.

Napred objašnjenom strategijom (Primer 5) formirani su takvi proteini huma no/svinjskog hibridnog faktora VIII u kojima su različiti delovi domena C2 humanog faktora VIII zamenjeni odgovarajućim delovima svinjskog faktora VIII. Sinteza različitih C2-hibridnih faktora VIII postignuta je konstruisanjem hibridne kodne DNK, pomoću nukleotidnog niza kojim se korira svinjski region C2, predstavljen sa SEQ ID br: 30. Svaka od hibridnih DNK je eksprimirana u transfektirane ćelije, tako da se hibridni fak tori VIII mogu delimično prečistiti iz hranljive podloge. Aktivnost je, u odsustvu inhi bitora, merena jednofaznim testom koagulacije.

Za ispitivanje svakog od hibridnih faktora VIII korišćena je serija od pet huma nih inhibitora. Već je navedeno da inhibitorne plazme, koje sadrže anti faktor VIII antitela, napadaju humani C2 domen, što je potvrđeno sposobnošću rekombinantnog humanog domena C2 da neutrališe inhibiciju. U svim ispitivanim plazmama je titar in hibitora neutralisan za više od 79% domenom C2 ili lakim lancem, a manje od 10% pre ko rekombinantnog humanog domena A2. Osim toga, C2-hibridni faktori VIII su ispiti vani na mišja monoklonalna antitela, koja vezuju domen C2, i kao i humana C2

inhibitorna antitela, i mišja monoklonalna antitela su onemogućila vezivanje faktora

VIII za fosfolipid i fon Vilebrandov faktor.

Upoređivanje titara anhibitornih antitela na CZ-hibridne faktore VIII pokazalo je da je značajna determinanta epitopa inhibitora humanog C2 region reziduuma 2181-

2243 (SEQ ID br. 2; Sl. IH). Anti-C2 antitela usmerena na region COOH-završetka rezi duuma 2253, nisu identifikovana u serumima četiri od pet pacijenata. Pri poređenju hi brida sa svinjskom sekvencom koja odgovara humanim aminokiselinskim reziduumi ma 2181-2199 i 2207-2243, bilo je očigledno da oba regiona doprinose vezivanju antite la. Svinjska aminokiselinska sekvenca, koja odgovara humanim reziduumima 2181-

2243 označena je sa 1982-2044 u SEQ ID br: 29.

Na osnovu Sl. IH može se zapaziti da u regionu 2181-2243 postoji 16 razlika u amino kiselinama između humane i svinjske sekvence. Razlike su uočene na rezi duumima 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2216, 2222, 2224-2227 , 2234, 2238 i 2243. Zamena amino kiselina na jednom ili više od nabrojanih reziduuma, može se sprovesti da bi se dobio modifikovani humani faktor VIII, ne-reaktivan na humana anti-C2 inhibi torna antitela. Alanin skan mutageneza omogućava pogodan metod za stvaranje ala ninskih supstituta za prirodne reziduume, kao što je prethodno opisano. Sve amino ki seline sem alanina se, takođe, mogu supstituisati. Alaninski supstituti za pojedine amino kiseline, posebno one koje nisu identične humane/svinjske ili humane/mišje, ili koje će najverovatnije doprineti vezivanju antitela, mogu da daju modifikovani faktor VIII sa smanjenom reaktivnošću na inhibitorna antitela.

Slike lA-IH zajedno omogućavaju poređenje poravnatih sekvenci amino kise lina humanog, svinjskog i mišjeg faktora VIII. Slika l poredi regione signalnog peptida (humani, SEQ ID br: 31; svinjski, SEQ ID br: 30, amino kiseline 1-19; mišji, SEQ ID br:

28, amino kiseline 1-19) . Upada u oči da su amino kiseline na Sl. lA-IH obrojčane na prvom Alaninu zrelog proteina sa l, dok su amino kiselinama signalnog peptida dođe ljeni negativni brojevi. Sekvenca humanog fVIli na SEQ ID br: 2 počinje, takođe, sa prvim Alaninom zrelog proteina, kao amino kiselina br. l. U sekvencama amino kise lina mišjeg fVIli (SEQ ID br: 28) i svinjskog fVIli (SEQ ID br:30) , prva amino kiselina (alanin) zrelog niza je amino kiselina br. 20. Sl. lA-IH prikazuje nizanje odgovarajućih

sekvenci humanog, mišjeg i svinjskog fVIli, takvo da su regioni najveće identičnosti amino kiselina postavljene jedne uz druge. Aminokiselinski brojevi na Sl. l A- lH od nose se samo na humani fVIli. Na slici lB predstavljeni su nizovi amino kiselina za do men Al fVIli čoveka (SEQ ID br: 2, amino kiseline 1-372) , svinje (SEQ ID br: 30, amino kiseline 20-391) i miša (SEQ ID br: 28, amino kiseline 20-391). Na Sl. IC date su se kvence amino kiselina za domene A2 čoveka (SEQ ID br: 2 , amino kiseline 373-740) , svinje (SEQ ID br: 30, amino kiseline 392-759) i miša (SEQ ID br: 28, amino kiseline

392-759). Slika ID donosi aminokiselinske sekvence domena B humanog faktora VIII

(SEQ ID br: 2, amino kiseline 741-1648), svinjskog fVIli (SEQ ID br: 30, amino kiseline

760-1449) i mišjeg fVIli (SEQ ID br. 28, amino kiseline 760-1640) . Slika lE poredi ami nokiselinske sekvence humanih, svinjskih i mišjih aktivacionih peptida fVIli lakog lanca (SEQ ID br: 2, amino kiseline 1649-1689; SEQ ID br: 30, amino kiseline 1450-

1490; odnosno SEQ ID br: 28, amino kiseline 1641-1678). Na Sl. IF upoređene su se

kvence domena A3 faktora VIII čoveka, svinje i miša (SEQ ID br: 2 , amino kiseline

1690-2019; SEQ ID br. 30, amino kiseline 1491-1820; odnosno SEQ ID br: 28, amino kiseline 1679-2006). Na Sl. lG prikazane su sekvence amino kiselina domena Cl hu manog, svinjskog i mišjeg faktora VIII (SEQ ID br: amino kiseline 2020-2172; SEQ ID br: 30, amino kiseline 1821-1973; odnosno SEQ ID br: 28, amino kiseline 2007-2159). Slika IH daje podatke o sekvencama za domene C2 humanog, svinjskog i mišjeg fak tora VIII (SEQ ID br: 2, amino kiseline 2173-2332; SEQ ID br: 30, amino kiseline 1974-

2133; odnosno SEQ ID br: 28, amino kiseline 2160-2319).

Rombovima su obeležena mesta sulfatisanja tirozina , predložena mesta vezi vanja za faktor IXa, fosfolipide i Protein C su dvostruko podvučena , a regioni koji učestvuju u vezivanju anti-A2 i anti-C2 inhibitornih antitela obeleženi su kurzivom. Zvezdicama su istaknute aminokiselinske sekvence koje su očuvane. V . takođe SEQ ID br: 29 (cDNK svinjskog faktora VIII) i SEQ ID br: 30 (logikom izvedena aminokiselinska sekvenca svinjskog faktora VIII). Sistem obrojčavanja, koji važi za humani fVIli, koristi se kao referentni [Wood i sar. (1984) supra] . Domeni Al, A2 i B definisani su mestima trombinskog cepanja na pozicijama 372 i 740, i jednim nepoznatim mestom cepanja proteaze na poziciji 1648, kao reziduumi 1-372, 373-740 odnosno 741-1648 [Eaton, D.L.

i sar. (1986) Biochemistry 25:8343-8347]. Domeni A2, Cl i C2 definisani su kao rezidu umi 1690-2019, 2020-2172 odnosno 2173-2332 [Vehar i sar. (1984) supra]. Mesta ce panja za trombin (faktor Jia), faktor IXa, faktor Xa i APC [Fay i sar. (1991) supra ; Eaton, D. i sar. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphaer, B.J. i sar. (1992) Blood 80:3120-

3128] prikazana su postavljanjem imena enzima iznad reaktivnog arginina. Jedan ki selinski peptid se odcepljuje od lakog lanca faktora VIII uz pomoć trombina, ili od faktora Xa na poziciji 1689. Predložena mesta vezivanja za faktor IXa [Fay, P.J. i sar. (1994) ].Biol.Chem. 269:29522-20527; Lenting, P.J. i sar. (1994)]. Biol.Chem. 269:7150-

7155], fosfolipid (Foster, P.A. i sar. (1990) Blood 75:1999-2004) i protein C [Walker, F.J.

i sar. (1990) ].Biol.Chem. 265:1484-1489] podvučena su dvostrukom linijom. Kurzivom su označeni regioni koji učestvuju u vezivanju anti-A2 [Lubin i sar (1994) supra ; Healey i sar. (1995) supra], kao i oni koji su ranije predloženi za anti-C2 inhibitorna antitela. Epitop inhibitora C2, identifikovan kao što je ovde opisano (humane amino kiseline

2181-2243) , istaknut je je jednostrukim podvlačenjem na Sl. IH. Mesta sulfatisanja tirozina [Pittman i sar. (1992) supra ; Michnick i sar. (1994) supra] obeležena su znakom+ .

Primer 7: Konstruisanje POL1212 i ekspresija u ćelijama mladunca hrčka

POL1212 je delimično B-bezdomenski svinjski faktor VIII, kod koga je domen

B uklonjen, s tim što je zadržano 12 amino kiselina na NH2 završetku domena B, kao i

12 amino kiselina -COOH završetka.

U Primeru 5 je opisan postupak dobijanja cDNK kojima se kodiraju sekvence domena Al, A2, ap-A3-C l i C2 svinjskog faktora VIII. Nukleotidna sekvenca DNK i izvedena aminokiselinska sekvenca svinjskog faktora VIII, prikazane su kao SEQ ID br:

29 odnosno SEQ ID br: 30. Amplifikovani fragmenti su odvojeno klonirani u plazmidni pBluescript II Ks- (pBS).

POL1212 je cDNK kojom se kodira svinjski fVIli, kojoj nedostaje najveći deo domena B, ali koja sadrži sekvencu DNK kojom se kodira 24-aminokiselinska spona između domena A2 i ap. POL1212 je konstruisan u ekspresionom vektoru sisara, ReNeo, dobijenom od firme Biogen. ReNeo može da se replikuje u bakteriju, replikuje

se kao epizom u COS ćelije u cilju privremene ekspresije faktora VIII ili se može stabilno ugraditi u različite ćelije sisara. ReNeo se sastoji od (l) sekvenci dobijenih iz plazmida pBR322, koji obuhvata poreklo replikacije i gen rezistencije na ampicilin, (2) gen rezistencije na neomicin, čija je ekspresija pod kontrolom SV40 promotera

/pojačivača, SV40 malog t introna i SV40 elemenata regulacije signala poliadenilacije, (3) mesto za umetanje fVIli i njegovog signalnog peptida, čija ekspresija je pod kon trolom SV40 pojačivača, značajnijeg kasnog promotera adenovirusa tipa 2, i sekvence tripartitnog lidera adenovirusa tipa 2. Umesto vektora ReNeo može se koristiti svaki vektor sa sličnim funkcionalnim komponentama.

POL1212/ReNeo je dobijen u nekoliko faza. Prvo su u pBS zasebno sklopljene cDNK za kodiranje teškog lanca svinjskog fVIli (Al-A2) i cDNK za kodiranje svinjskog fVIli lakog lanca (ap-A2-Cl-C2). Od ovih struktura je, u pBS (PB-/pBS) sastavljena cDNK za kodiranje svinjskog fVIli bez B domena. Ovom obliku svinjskog fVIli nedo staje čitav domen B, definisan kao amino kiseline koje odgovaraju reziduumu 741-1648 u humanom fVIli (humani nukleotidi 2278-5001). Zatim je DNK za kodiranje svinjskog A2 zamenjena humanim domenom A2 u ekspresionom vektoru ReNeo humanog fVIli bez B domena (HB-/ReNeo). DNK za kodiranje ostatka svinjskog teškog lanca i DNK za kodiranje svinjskog lakog lanca zamenjene su humanim domenima, u sledeća dva koraka, uz pomoć prethodno formiranih struktura svinjskog teškog lanca/pBS i PB

/pBS. Fragment humanog domena B kojim se kodiraju 5 G-terminalne i N-terminalne amino kiseline umetnut je između domena A2 i A3, čime je dobijena struktura PSQ/ReNeo [Healey i sar. (1998) 92:3701-3709]. Reziduumi Glu2181-Vall2243 sadrže najvažniju determinantu inhibitornog epitopa u domenu C humanog fVIli. Ova struktura je iskorišćena kao kliše za dobijanje fragmenta svinjskog domena B kojim se kodiraju 12 C- terminalne i 12 N-terminalne amino kiseline. Fragment je umetnut između dome-na A2 i A3, čime je dobijena konačna struktura, POL1212/ReNeo.

Spona od 24 amino kiseline POL1212 sastoji se od prvih 12 i poslednjih 12 reziduuma domena B svinjskog fVIli. Taj POL1212linker ima sledeću sekvencu:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR. (SEQ ID br: 32)

Nukleotidna sekvenca koja odgovara linkeru 1212 i obližnjim amino kiseli

namaje:

GTC ATT GAA CCT AGG AGC TTT GCC CAG AAT TCA AGA CCC CCT AGT GCG (SEQ ID br: 33)

V I E PR S FA Q N SR P P S A

AGC GCT CCA AAG CCT CCG GTC CTG CGA CGG CAT CAG AGG GAC ATA S A P K P P V L R RH QR D I

AGC CTT CCT ACT

S L P T

Linker POL1212 je sintetisan SOE mutagenezom na sledeći način: Reakcije PCR korišćene za formiranje produkata SOE bile su sledeće: REAKCIJA#!

Spoljni prajmer: Rev 4, prajmer svinjskog A2, nukleotidi 1742-1761. (SEQ ID

br:29). Sekvenca je bila: 5'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (SEQ ID br: 34) .

Unutrašnji prajmer: OL12, koji je svinjski reverzni prajmer, koji obuhvata prvih (5') 15 amino kiselina OL1212, i poslednjih (3') 5 aminokiselina svinjskog A2. Sekvenca je: 5'-CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCTC AGGTTCAATGAC-3' (SEQ ID br: 35).

Kliše: PSQ/ReNeo

Produkt: svinjska DNK od nukleotida 1742 u domenu A2 do nukleotida 2322 u

OL1212 580 bp

REAKCIJA#2

Spoljni prajmer: P2949 je svinjski reverzni prajmer A3, nukleotidi 2998-3021 SEQ ID br: 29. Sekvenca je: 5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (v. SEQ ID br:29)

Unutrašnji prajmer: OL12+, svinjski prajmer koji pokriva poslednjih(3') 16 amino kiselina OL1212 i prvih (5') 6 amino kiselina aktivacionog peptida, nukleotida 2302-

2367 SEQ ID br. 29. Sekvenca je:

5'-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGA CATAAGCCTTCCTACT-3' (SEQ ID br: 36).

Kliše: PSQ/ReNeo

Produkt: svinjska DNK od nukleotida 2302 u OL1212 to nukleotida 3021 u domenu

A3, 719 bp

REAKCIJA SOE

Prajmer: Rev 4, P2949-

Klišei: fragment iz rxn# l (bp) i lakotopivi fragment iz rxn #2 (bp)

Produkt: svinjska DNK od nukleotida 1742 u domenu A2 do nukleotida 3021 u domenu A3 (SEQ ID br: 29), uključujući OL1212, 1279 bp. Produkt reakcije je istaložen s etanolom.

Linker 1212 je umetnut u PSQ/ReNeo isecanjem produkta SOE (umetka) i PSQ/ReNeo (vektora) pomoću BsaB l. Vektor i umetak su povezani pomoću T4 ligaze, a produkt je korišćen za transformaciju XLI-Blue ćelija E. coli. Od nekoliko kolonija je pripremljena plazmidna DNK, a sekvence linkera 1212 i ostale sekvence dobijene putem PCR su potvrđene analizom DNK sekvence.

KULTURA CRL-1632 ĆELIJA BUBREGA MLADUNCA HRČKA (BHK)

Ćelijska linija BHK (kataloška identifikacija CRL-1632) dobijena je iz ATCC, i čuvana na -20°C do upotrebe. Ćelije su odmrznute na 37°C i smeštene u l O ml kom pletne podloge, definisane kao DMEM/Fl2, 50 j/ml penicilina , 50 flg/ml streptomicina, uz dodatak 10 % fetalnog goveđeg seruma (FBS). FBS je kupljen kod Hyclone, Logan, Utah. Ćelije su centrifugirane 2 minuta brzinom od 300 obrtaja u minutu. Podloga je

aspirirana, a ćelije su ponovo suspendovane u 2 ml kompletne podloge u T-75 normalnom sudu sa 20 ml kompletne podloge.

POL1212 je eksprimiran i u ćelijama bubrega mladog hrčka (BHK) i u ćelija ma ovarijuma kineskog hrčka (CHO). Korišćene su dve linije BHK, i to linija CRL-1632 iz ATCC i druga linija BHK, dobijena od B. Mcgillivray, Univerzitet Britanske Kolumbije [Funk, i sar. (1990) Biochemistry 29:1654-1660]. Ova druga kultura je subkultivisana bez selekcije u laboratoriji pronalazača, i obeležena sa BHK1632 (Emory). Ćelijska CHO linija označena je sa CHO-Kl, ATCC kataloški broj CCL-61. Ekspresija proseč nog klona od Emory-ćelijske linije i CHO-Kl ćelija bila je, prema aktivnosti hromogen skog testa, nešto viša nego od ćelija CRL-1632. Ćelije koje su se razvijale u T-75 normalnom sudu obrazovale su ujednačen monosloj. Pripremljeno je 60 ml kulture XLI-Blue ćelija E. coli u LB/ampicilinu (50 mg/ml) sa POL1212/ReNeo plazmidom

TRANSFEKCIJA CRL-1632 ĆELIJA SA POL1212/ReNeo

DNK celodnevne kulture POL1212/ReNeo XL-l Blue ćelija pripravljena je pomoću seta pribavljenog od Qiagen, Valencia, CA (Spin Miniprep kit). Sadržaj SRL-

1632 ćelija (2 ml) iz normalnog suda podeljen je u dva suda, sud sa osnovnom kul turom (0,2 ml) i suda sa sadržajem za transfekciju (0,3 ml). Drugi sud je dopunjem sve žom hranljivom podlogom, DMEM/Fl2 + 10% Hyclone FBS + 50 j/ml penicilina i 50 J-lg streptomicina. CRL-1632 ćelije su razdeljene na 6 petri-kutija sa udubljenjima, sa ciljem da se postigne 50-90%-no slivanje (kulture) za potrebe transfekcije (0,3 ml ćelija iz normalnog suda T-75 u 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] u svakom udubljenju), a korišćen je svež DMEM/Fl2 + 10% Hyclone FBS + 50 j/ml penicilina, 50 J-lg streptomicina.

U sterilnim 1-2 ml epruvetama pripravljeni su sledeći rastvori:

A) 48 J-ll (10 J-lg) Miniprep POL1212/ReNeo DNK + J-ll podloge bez seruma

(DMEM/Fl2) plus lO J-ll Lipofectina™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) Blago je promešano l O f.!l Lipofectina sa 190 f.!l podloge (lažna transfekcija) i ostavljeno da DNK i Lipofectin reaguju 15 minuta, na sobnoj tem temperaturi. U tom vremenu su ćelije dvaput isprane sa 2 ml DMEM/Fl2. Posle toga je ćelijama dodato još 1,8 ml DMEM/Fl2. Kompleks DNK/Lipofectin je dodavan ćelijama kap po kap, i lakim kružnim pokretom je promešan sadržaj suda. Ćelije su prenoćile u inkubatoru. Potom je uklonjen kompleks DNK/Lipofectin i dodato još 3 ml podloge sa serumom. Ćelije su inkubirane 30-48 sati. Kulture ćelija su podeljenje, u odnosima l :20, l :50 i

1:100, 1:250, 1:500, u petri kutije promera 10 cm u koje je nasuto po 10 ml podloge sa

serumom koja je sadržala 535 f.!g/ml geneticina. Tokom sledećih nekoliko dana, ćelije koje nisu prihvatile POL1212/ReNeo plazmid su, zbog prisustva geneticina, uginule. Preostale ćelije su nastavile da se replikuju u geneticinu, obrazujući u petri kutijama vidljive jednoslojne kolonije.

EKSPRESIJA I ANALIZA POL1212 DOBIJENOG IZ BHK CRL-1632 ĆELIJA

Oko kolonija su postavljeni mali plastični, cilindrični prstenovi. Kolonije su odvojeno aspirirane uz korišćenje kompletne podloge i prenete u epruvete. Ove kolonije se nazivaju prsten-klonirane kolonije. Prsten-klonirane kolonije su prenete u zasebne petri kutije sa 24 udubljenja i gajene u kompletnoj hranljivoj podlozi.

ANALIZA HROMOGENOG SUPSTRATA NA EKSPRESIJU FAKTORA VIII U TRANSFEKTOVANIM CRL-1632 ĆELIJAMA

Uzorci POL1212 iz supernatanata ćelijske kulture pomešani su sa 50 nM prečišćenog svinjskog faktora IXa i 0,05 mM vezikula fosfatidil-holin/fosfatidil-serina (PCPS) u 0,15 M NaCl, 20 m HEPES, 5 mM CaC12 , 0,01 % Tween-80, pH 7,4. Hranljiva podloga lažno transfektovanih ćelija je korišćena kao kontrola. Trombin i faktor X su dodati istovremeno, do postizanja finalne koncentracije od 40 odnosno 425 nM. trombin aktivira faktor VIII, koji potom, zajedno sa PCPS, služi kao kofaktor za faktor IXa u toku aktivacije faktora X.

Aktivacija faktora X kombinacijom faktora !Xa/faktora VIIIa/PCPS prekinuta je nakon 5 minuta dodavanjem EDTA do finalne koncentracije od 50 mM. U isto vreme je

prekinuta i aktivacija faktora VIII trombinom, dodavanjem inhibitora trombina, rekombinantnog desulfatohirudina , do finalne koncentracije od l OO nM. Uzorak reak cione smeše od 25 J-Ll prenet je u udubljenje za mikrotitar, u koje je dodato 74 J-Ll Spectrozyme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), koji je hromogeni supstrat za faktor Xa. Finalna koncentracija Spectrozyme Xa bila je 0,6 mM. Apsorbansa na 405 nm zbog cepanja Spectrozyme Xa faktorom Xa, praćena je neprekidno 5 minuta pomoću Vmax kinetic Plate Reader-a (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA). Rezultati su izraženi kao A405/min.

Hromogena analiza faktora VIII deset prsten-kloniranih kolonija:

Broj kolonije

A405/min

(x l 03

)

Pufer

0, 2

l

2, l

2

8,4

3

6,4

4

10,7

5

12,5

6

7,6

7

51,3

8

139,5

9

3,8

lO

8, 4

Ovi rezultati pokazuju da je svih deset izabranih kolonija eksprimiralo aktivnost faktora VIII, koja je najmanje l O puta veća od polazne.

Aktivnost iz podloge kolonije 8, koja je bila kolonija najveće ekspresije, is pitivana je dalje pomoću jednofaznog testa faktora koagulacije VIII. U tom testu je 50 ml plazme bez faktora VIII (George king Biomedical Overland Park, KA), 5 ml uzorka ili standarda i 50 ml aktiviranog reagensa tromboplastinskog vremena (Organon Tek nika, Durham, NC) inkubirano 3 minuta na 37°C. Uzorci su uključivali podlogu kolonije

8, razblaženu u 0,15 M NaCl, mM HEPES, pH 7,4 (HBS) ili, kao kontrolu , kompletnu hranljivu podlogu. Koagulacija je inicirana dodavanjem 50 ml 20 mM CaC12 . Vreme

koagulacije je mereno pomoću ST4 BIO Coagulation Instrument-a (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). Standardna kriva je dobijena pravljenjem razblaženja donatorske, citratisane zdrave humane plazme, serija 0641 (George King Biomedical, Overland

Park, KA) Koncentracija standarda faktora VIII bila je 0,9 jedinica po mililitru.

Standardna kriva:

Vreme koagulacije

45,2

53,7

62,5

68,9

Razblaženje

Jlml

l)

Nerazblaženo

0,96

2)

1/3(HBS)

0,32

3)

l/ll(HBS)

0,087

4)

1/21(HBS)

0,946

Ispitivane supstancije su dale sledeća vremena koagulacije, pretvorena u jedinice po ml uz pomoć standardne krive:

Vreme

Uzorak koagulacij Jl ml

l)

Kolonija 8 (24h) , l/lO u HBS

(sek.)

40,6

1,74xl0=17, 4

2)

Kolonija 8 (24h), 1110 u HBS

41' l

1,63 X 10 = 16 ,3

3)

Kolonija 8 (24h), 1/20 u HBS

47,7

0,69 X 20 = 13,8

4)

Kolonija 8 (24h) , 1120 u HBS

47, 2

0,73 X 20 = 14,6

5)

Kompletna podloga

82 , 9

0,007

6)

Kompletna podloga

83,3

0 , 006

Ovi rezultati pokazuju da je koagulantna aktivnost kolonije 8 oko 2000 puta veća od one kontrolnog uzorka.

Sekvenca DNK kojom se kodira POL1212 predstavljena je kao SEQ ID br: 37. Kodirana sekvenca amino kiselina POL1212 data je kao SEQ ID br: 38. Dalje prečišćavanje POL1212 može se izvoditi uz pomoć širokog spektra poznatih medoda, npr. imunoafinitetnom hromatografijom i HPLC hromatografijom- v. Primere 2 i 3.

OPŠTE ZAKLJUČNE NAPOMENE

Prihvatiće se da manje varijacije sekvence amino kiselina ili DNK kojom se kodira ta sekvenca povezana sa POL1212, mogu da se uvedu, bez uticaja na suštinske karakteristike funkcije. Na primer, deo sekvence domena B, zadržan kao linker između domena A2 i aktivacionog peptida može da se povećava ili smanjuje u pozna-tim granicama. Varijante sekvence mogu da se ubacuju u zoni !inkera, a da se pri tom očuvaju istovetne funkcionalne karakteristike POL1212, kao što je ovde objašnjeno, i svinjskog faktora VIII bez domena B, kao što je poznato i ovde objašnjeno. Na osnovu poređenja poznatih sekvenci amino kiselina faktora VIII, koje poseduju koagulantnu aktivnost, mogu se - u aminokiselinskoj sekvenci osnovnog POL1212 - praviti vari jacije sekvenci, npr supstitucija pojedinih amino kiselina ili supstitucija peptidnih segmenata sa poznatim funkcionalnim varijantama, a da se pri tom funkcionalne ka rakteristike plazmida u potpunosti očuvaju. Navedeni tipovi varijacija se ne završavaju gornjim nabrajanjem, već samo služe kao primeri modifikacija sekvenci, koje mogu napraviti stručni ljudi prosečnih sposobnosti, a da se pri tom ne modifikuju značajnije funkcionalne karakteristike proteina. Za sve takve varijacije i modifikacije se smatra da spadaju u domen iznetog pronalaska ili njegovog ekvivalenta.

Lista identiteta sekvenci:

SEQ ID Br: Identifikacija

l cDNK humanog faktora VIII. Kodiranje za amino kiselinu br. l zrelog proteina počinje na nukleotidu br. 208

2 Aminokiselinska sekvenca humanog faktora

3 cDNK domena A2 svinjskog faktora VIII

4 Aminokiselinska sekvenca domena A2 svinjskog faktora VIII

5 do 27 Sekvenca oligonukleotidnog prajmera (Primer 5)

38 Aminokiselinska sekvenca mišjeg faktora VIII

29 cDNK svinjskog faktora VIII

30 Aminokiselinska sekvenca svinjskog faktora VIII

31 Aminokiselinska sekvenca signalnog peptida humanog faktora

VIII

32 do 36 Oligonukleotidni prajmer (Primer 7)

37 DNA koja kodira POL1212

38 Aminokiselinska sekvenca POL1212

EMORY UNIVERSITY

Claims

1.DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca POL1212 prikazana u SEQ ID No: 38

2.Ekspresioni vektor koji sadrži DNK prema zahtevu l .

3.DNK prema zahtevu l sa nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 37.

4.Ekspresioni vektor koji sadrži DNK prema zahtevu 3.

5.Modifikovani svinjski faktor VIII sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 38

6.Terapijska formulacija, koja sadrži modifikovan svinjski faktor VIII prema zahtevu 5 i fiziološki prihvatljiv nosač.

7.Metod za dobijanje modifikovanog proteina svinjskog faktora VIII sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 38, koji obuhvata ekspresiju DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca, prikazana u SEQ ID NO: 38, u domaćina-ćeliju sisara.

8.Metod prema zahtevu 7, k a r a k t e r i s a n t i m e što DNK, kojom se kodira amino kiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 38, takođe kodira i signalni peptid, čime se protein modifikovanog svinjskog faktora VIII eksportuje iz domaćina-ćelije sisara.

9.Metod prema zahtevu 8, k a r a k t e r i s a n t i m e što signalni peptid ima sekvencu amino kiselina 1-19 prikazanu u SEQ ID NO: 30

10.Ćelija sisara, koja sadrži i replikuje ekspresioni vektor, koji se sastoji od DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca POL1212 prikazana u SEQ ID NO: 38

11. Ćelija sisara prema zahtevu 10, k a r a k t e r i s a n t i m e što vektor, koji sadrži DNK ima nukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 37.

12. Ćelija prema zahtevu ll, k a r a k t e r i s a n a t i m e što je ćelija-domaćin BHK CRL-1632