MXPA02008798A - Factor vii modificado. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con una forma sin dominio B modificada del factor VIII porcino, a un ADN que codifica para el mismo, y con el uso del mismo para el tratamiento de la hemofilia.

Description

FACTOR VIII MODIFICADO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La coagulación de la sangre comienza cuando las plaquetas se adhieren a la pared cortada de un vaso sanguíneo dañado en un sitio de lesión. Posteriormente, en una cascada de reacciones reguladas enzimáticamente, las moléculas de fibrinógeno solubles son convertidas por la enzima trombina a hebras insolubles de fibrina que mantienen las plaquetas juntas en un trombo. En cada paso en la cascada, un precursor de proteína es convertido a una proteasa que escinde al siguiente precursor de proteína en la serie. Se requieren cofactores en la mayoría de los pasos. El factor VIII circula como un precursor inactivo en la sangre, unido de manera fuerte y no covalente al factor de von Willebrand. El factor VIII es activado proteolíticamente por la trombina o factor Xa, la cual se disocia del factor de von Willebrand y activa su función precoagulante en la cascada. En su forma activa, el factor proteico Villa es un cofactor que incrementa la eficiencia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X por varios órdenes de magnitud. Las personas con deficiencias en el factor VIII o anticuerpos contra el factor VIII que no son tratados con factor VIII padecen hemorragia interna descontrolada que REF.: 141256 puede causar una gama de síntomas serios, desde reacciones inflamatorias en las articulaciones hasta la muerte temprana. Los he ofílieos severos, cuyo número es de aproximadamente 10,000 en los Estados Unidos, pueden ser tratados con infusión de factor VIII, el cual reestablecerá la capacidad de coagulación normal de la sangre si se administra con suficiente frecuencia y concentración. La definición clásica del factor VIII, en efecto, es que es una sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige el defecto de coagulación en el plasma derivado de individuos con hemofilia A. El desarrollo de anticuerpos ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") que inhiben la actividad del factor VIII es una complicación seria en el manejo de pacientes con hemofilia. Los autoanticuerpos se desarrollan en aproximadamente el 20% de los pacientes con hemofilia A en respuesta a infusiones terapéuticas de factor VIII. En pacientes previamente no tratados con hemofilia A que desarrollan inhibidores, el inhibidor usualmente se desarrolla dentro de un año de tratamiento. Adicionalmente, los autoanticuerpos que inactivan el factor VIII ocasionalmente se desarrollan en individuos con niveles de factor VIII anteriormente normales. Si el título inhibidor es suficientemente bajo, los pacientes pueden ser manejados incrementado la dosis de factor VIII. Sin embargo, con frecuencia el titulo de inhibidor es demasiado alto de modo que no puede ser abrumado por el factor VIII. Una estrategia alternativa es desviar la necesidad de factor VIII durante la hemóstasis normal utilizando preparaciones de complejo de factor IX (por ejemplo, KONYNE®, Proplex®) o factor Vlla humano recombinante. Adicionalmente, puesto que el factor VIII porcino usualmente tiene sustancialmente menos reactividad con inhibidores que el factor VIII humano, ha sido utilizada una preparación de factor VIII porcino parcialmente purificado (HYATErC®). Muchos pacientes que han desarrollado anticuerpos inhibidores al factor VIII humano han sido tratados exitosamente con factor VIII porcino y han tolerado tal tratamiento durante periodos prolongados de tiempo. Sin embargo, la administración de factor VIII porcino no es una solución completa debido a que pueden desarrollar inhibidores al factor VIII porcino después de una o más infusiones en algunos pacientes. Varias preparaciones de factor VIII derivado de plasma humano de varios grados de pureza se encuentran comercialmente disponibles para el tratamiento de la hemofilia A. Esas incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de sangre reunida de muchos donadores que es tratada con calor y detergentes contra virus pero que contiene un nivel significativo de proteínas antigénicas; un factor VIII purificado con anticuerpo monoclonal que tiene menores niveles de impurezas antigénicas y contaminación viral; y factor VIII humano recombinante, los ensayos clínicos para el cual están en camino. Desafortunadamente, el factor VIII es inestable a concentraciones y pH fisiológicos, está presente en la sangre a una concentración extremadamente baja (0.2 µg/ml de plasma), y tienen actividad coagulante especifica baja. La preocupación de salud pública con respecto al riesgo del virus u otros contaminantes portados por la sangre han limitado la actividad del factor VIII porcino purificado de sangre porcina. Los hemofílicos requieren el reemplazo diario del factor VIII para evitar hemorragias y la artropatía hemofílica deformante resultante. Sin embargo, los suministros han sido inadecuados y ocurren problemas en el uso terapéutico debido a la dificultad del aislamiento y purificación, inmunogenicidad y la necesidad de remover el riesgo de infectarse con SIDA y hepatitis. El uso de factor VIII recombinante o factor VIII porcino parcialmente purificado no resolverá todos los problemas. Los problemas asociados con el factor VIII derivado de plasma comúnmente utilizado, comercialmente disponible, han estimulado un- interés significativo en el desarrollo de un mejor producto de factor VIII. Existe una necesidad de molécula de factor VIII más potente, de modo que puedan ser proporcionadas más unidades de actividad coagulante por molécula; una molécula de factor VIII que sea estable a un pH y concentración fisiológica seleccionadas; una molécula de factor VIII que sea menos apto para causar la producción de anticuerpos inhibidores; y una molécula de factor VIII que evada la detección inmune en pacientes que ya han adquirido anticuerpos para el factor VIII. Por lo tanto un objeto de la presente invención es proporcionar un factor VIII que corrija la hemofilia en un paciente deficiente en factor VIII o que tenga inhibidores para el factor VIII. Un objeto más de la presente invención es proporcionar métodos para el tratamiento de hemofílicos. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un factor VIII que sea estable a un pH y concentración fisiológica seleccionadas. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un factor VIII que tenga mayor actividad coagulante que el factor VIII humano. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un factor VIII contra el cual se produzca menos anticuerpo.

Un objeto más de la invención es proporcionar un método para producir factor VIII porcino recombinante y factor VIII porcino modificado específicamente. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La determinación de la secuencia de ADN completa que codifica para el factor VIII porcino aquí expuesta ha permitido, por primera vez, la síntesis de un factor VIII porcino de longitud completa mediante la expresión del ADN que codifica para el factor VIII porcino en una célula huésped adecuada. El factor VIII porcino recombinante purificado es por lo tanto un aspecto de la presente invención. El ADN que codifica para cada dominio de factor VIII porcino así como cualquier fragmento especificado del mismo, puede ser expresado de manera similar. Además, el fVIII porcino que tiene todo o parte del dominio B suprimido (fVIII porcino sin dominio B) se vuelve disponible como parte de la presente invención, mediante la expresión del ADN que codifica para el fVIII que tiene una supresión de uno o más codones del dominio B. También se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos para tratar pacientes que tiene deficiencia de factor VIII, que comprende administrar factor VIII porcino recombinante o un factor VIII porcino recombinante modificado, en particular un factor VIII porcino sin dominio B.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1H tomadas juntas proporcionan una comparación de secuencia alineada de las secuencias de ácido de factor VIII de humano, cerdo y ratón. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se especifique o indique otra cosa, como se utiliza aquí, "factor VIII" denota cualquier molécula de proteína de factor VIII funcional de algún mamífero. Como se utiliza aquí, "factor VII de mamífero" incluye al factor VIII con una secuencia de aminoácido derivada de cualquier mamífero no humano, a menos que se especifique otra cosa. "Animal", como se utiliza aqui, se refiere a cerdos y otros mamíferos no humanos. Una "proteína de fusión" o "factor VIII de fusión o fragmento del mismo", como se utiliza aquí, es un producto de un gen híbrido en el cual la secuencia codificadora para una proteína está alterada, por ejemplo, por la parte que une ésta a la secuencia codificadora a una segunda proteína de un gen diferente en el registro del marco de lectura apropiado, de modo que pueda ocurrir la transcripción y traducción ininterrumpida de los segmentos unidos para producir un gen híbrido que codifique para la proteina de fusión. Una secuencia de ácido nucleico o aminoácido "correspondiente", como se utiliza aquí, es una presente en un sitio en una molécula de factor VIII o fragmento de la misma que tenga la misma estructura y/o función que un sitio en la molécula de factor VIII de otra especie, aunque el número de ácido nucleicos o aminoácidos no sea idéntico. Una secuencia de ADN "correspondiente a" otra secuencia de factor VIII corresponde sustancialmente a tal secuencia, y se hibrida a la secuencia de la SEQ ID NO designada bajo condiciones estrictas. Una secuencia de ADN "correspondiente a" otra secuencia de factor VIII también incluye una s cuencia que de como resultado la expresión de un factor VIII o fragmento del mismo y que se hibride a la SEQ ID NO designada pero por la redundancia del código genético. Un residuo o secuencia de aminoácidos "única", como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de aminoácidos o residuo de aminoácidos en la molécula de factor VIII de una especie que sea diferente del residuo o secuencia homologa en la molécula de factor VIII de otra especie. "Actividad específica", como se utiliza aquí, se refiere a la actividad que corregirá el defecto de coagulación del plasma deficiente en factor VIII humano. La actividad específica se mide en unidades de actividad coagulante por miligramo de proteina de factor VIII total en un ensayo estándar en el cual el tiempo de coagulación del plasma deficiente en factor VIII humano es comparado con el del plasma humano normal. Una unidad de actividad de factor VIII es la actividad presente en 1 mililitro de plasma humano normal. En el ensayo, a más corto el tiempo para la formación del coagulo, mayor la actividad del factor VIII que esté siendo ensayado. El factor VIII porcino tiene una actividad coagulante en un ensayo de factor VIII humano. "Expresión" se refiere al conjunto de procesos que ocurren para que la información genética sea utilizada para producir un producto. El ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos del factor VIII porcino puede ser "expresado" dentro de una célula huésped de mamífero para producir la proteína factor VIII porcino. Los materiales, estructuras genéticas, células huésped y condiciones las cuales permiten que ocurra la expresión de una secuencia de ADN dada son bien conocidos en la técnica y pueden ser manipulados para afectar el tiempo y calidad de expresión, así como la ubicación intra o extracelular de la proteína expresada. Por ejemplo, incluyendo el ADN que codifica para un péptido señal en el extremo 5' del ADN que codifica para el factor VIII (siendo el extremo 5' por convección, el extremo que codifica para el NH2 terminal de la proteína) la proteína expresada es exportada del interior de la célula huésped hacia el medio de cultivo. Proporcionar un ADN que codifica para un péptido señal en combinación con el ADN que codifica para el factor VIII porcino es ventajoso debido a que el factor VIII expresado es exportado hacia el medio de cultivo, lo cual simplifica el proceso de purificación. Un péptido señal preferido es un péptido señal del factor VIII de mamífero. Las secuencias de nucleótidos de ADNc y aminoácidos predichas del factor VIII humano se muestran en las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente. El factor VIII es sintetizado como una proteína de una sola cadena de aproximadamente 300 kDa con homología de secuencia interna que define la secuencia de "dominio" NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H. En una molécula de factor VIII, un "dominio", como se utiliza aqui, es una secuencia continua de aminoácidos que está escindida por la identidad de secuencia de aminoácidos interna y sitios de escisión proteolítica por la trombina. A menos que se especifique otra cosa, los dominios del factor VIII incluyen los siguientes aminoácidos residuales, cuando las secuencias son alineadas con la secuencia de aminoácidos humanos (SEQ ID NO: 2) : Al, residuos Alal-Arg372; A2, residuos Ser373-Arg740; B, residuos Ser741-Argl648; A3, residuos Serl690-Ile2032 ; Cl, residuos Arg2033-Asn2172; C2, residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye los residuos Tyr2332. El segmento restante, los residuos Glull649-Argl689, es usualmente referido como el péptido de activación de la cadena ligera del factor VIII. El factor VIII es activado proteoliticamente por la trombina o factor Xa, la cual se disocia del factor de von Willebrand, formando el factor Villa, el cual tiene función procoagulante. La función biológica del factor Villa, es incrementar la eficiencia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud. El factor Villa activado por la trombina es un heterodímero de A1/A2/A3-C1-C2 de 160 kDa forma un complejo en el factor IXa y el factor X sobre la superficie de las plaquetas o monocitos. Un "dominio parcial" como se utiliza aqui es una secuencia continua de aminoácidos que forman parte de un dominio. "Subunidades" de factor VIII, humano o animal, como se utilizan aquí, se refieren a las cadenas pesada y ligera de la proteína. La cadena pesada del factor VIII contiene 3 dominios, Al, A2 y B. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, A3, Cl y C2. Los términos "epítopo", "sitio antigénico" y "determinante antigénico", como se utilizan aquí son utilizados como sinónimos y se definen con una porción del factor de VIII humano o animal o fragmento del mismo que es reconocido específicamente por un anticuerpo. Este puede consistir de cualquier número de residuos de aminoácidos, y puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. El término "sitio inmunogénico", como se utiliza aquí, se define como una región del factor VIII humano o animal o fragmento del mismo, que construye específicamente la producción de anticuerpos al factor VIII, o fragmento, en un humano o animal, de acuerdo a lo medido por protocolos de rutina, tales como el inmunoensayo, por ejemplo ELISA, o el ensayo de Bethesda, descrito aquí. Este puede consistir de cualquier número de aminoácidos residuales, y puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteina. En algunas modalidades, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente o fragmento del mismo es no inmunogénico o menos inmunogénico en un animal o humano que el factor VIII humano o porcino. "Deficiencia de factor VIII", como se utiliza aquí, incluye a la deficiencia y la actividad coagulante causada por la producción del factor VIII defectuoso, por producción inadecuada o ausente de factor VIII, o por inhibición parcial o total del factor VIII por inhibidores. La hemogilia A es un tipo de deficiencia del factor VIII resultante de un defecto en el gen ligado a X y a la ausencia o deficiencia de la proteína factor VIII que codifica. Como se utiliza aquí, "ensayos de diagnóstico" incluyen ensayos que de alguna manera utilizan la interacción antígeno-anticuerpo para detectar y/o cuantificar la cantidad del anticuerpo particular que esta presente en una muestra de prueba para ayudar a la selección de terapias médicas. Existen muchos de tales ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Como se utiliza aquí, ADN del factor VIII humano, porcino o porcino modificado o fragmentos del mismo y proteína expulsada del mismo, completa o en parte, puede ser sustituido por los reactivos correspondientes en los otros ensayos conocidos, por lo que pueden ser utilizados ensayos modificados para detectar y/o cuantificar anticuerpos para el factor VIII. Es el uso de esos reactivos, el ADN del factor VIII o fragmentos del mismo o proteína expresada por el mismo, que permite la modificación de ensayos conocidos para la detección de anticuerpos para el factor VIII humano o animal. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a ELISA, ensayos de inmunoinfusión e imunoelectrotransferencias . Los métodos adecuados para proactivar cualquiera de esos ensayos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Como se utiliza aquí, el factor VIII o fragmento del mismo que incluye al menos un epítopo de la proteína puede ser utilizado como el reactivo de diagnóstico. Ejemplos de otros ensayos en los cuales el factor VIII humano, porcino o porcino modificado o fragmento del mismo que pueden ser utilizados incluyen el ensayo de Bethesda y ensayos de anticoagulación . El término. "ADN que codifica para una proteína, tal como el factor VII porcino" significa un ácido polidesoxinucleico cuya secuencia nucleotídica incorpora información de codificación para una célula huésped para la secuencia de aminoácidos de la proteína, por ejemplo, el factor VIII porcino, de acuerdo a relaciones conocidas del código genético.

El "producto de expresión" de un ADN que codifica para un factor VIII humano o animal o un factor VIII modificado es el producto obtenido de la expresión del ADN de referencia en una célula huésped adecuada, incluyendo características tales como la modificación pre o post-traslacional de la proteina codificada por el ADN de referencia, incluyendo pero sin limitarse a la glicosilacion, escisión proteolitica y similar. Se sabe una técnica que tales modificaciones pueden ocurrir y pueden diferir un tanto dependiendo del tipo de célula huésped y otros factores, y pueden dar como resultado isoformos moleculares del producto, con retención de la actividad procoagulante. Véase, por ejemplo Lind, P. et al., Eur. J. Bi ochem . 232:1927 (1995), incorporado aquí como referencia. Un "vector de expresión" es un elemento de ADN, que con frecuencia de estructura circular, que tiene la capacidad de reproducirse de manera autónoma en una célula huésped deseada, o de integrarse en el genoma de la célula huésped y también posee ciertas características bien conocidas las cuales permiten las expresión de un inserto de ADN codificador en la secuencia del vector en el sitio apropiado y en orientación apropiada. Tales características puede incluir, pero no se limitan a, una o más secuencias promotoras para dirigir el inicio de la transfección del ADN codificador y los otros elementos de ADN tales como mejoradores o amplificadores, sitios de poliadenilación, todos bien conocidos en la técnica. El término "vector de expresión" se utiliza para denotar un vector que tiene una secuencia codificadora de ADN a ser expresada insertada dentro de su secuencia, y un vector que tiene un elementos de control de expresión requisito así arreglado con respecto a un sitio de inserción que puede servir para expresar cualquier ADN codificador insertado en el sitio, todo bien conocido en la técnica. De este modo, por ejemplo, un vector que carece de un promotor puede convertirse en un vector de expresión pero la inserción de un promotor combinado con un ADN codificador. DESCRIPCION GENERAL DE LOS MÉTODOS La Patente Estadounidense 5,364,771 describe el descubrimiento de moléculas del factor VIII humano/porcino híbrido que tiene coactivada coagulante, en los cuales los elementos de la molécula del factor VIII de humano o cerdo son sustituidos por elementos correspondientes de la molécula del factor VIII de la otra especie. La Patente Estadounidense 5,663,060 describe moléculas de factor VIII humano/animal híbrido procoagulante y equivalente híbrido, en los cuales los elementos del factor VIII de una especie están sustituidos por elementos correspondientes a la molécula del factor VIII de la otra especie.

Puesto que la información actual indica que el dominio B no tiene un epítopo inhibidor y no tiene efecto conocido sobre la función del factor VIII, en algunas modalidades el dominio B es completa o totalmente suprimido en moléculas de factor VIII híbrido o equivalente híbrido activas o fragmentos de las mismas ("factor VIIIB"(-)) preparadas por cualquiera de los métodos descritos aquí. El gen del factor VIII fue aislado y expresado en células de mamífero, de acuerdo a lo reportado por Toóle, J. J. et al . (1984) Na ture 312:342-347 (Genetics Institute) ; Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312:326-330 (Genetech); Wood, W.I. et al. (1984) Na ture 312:330-337 (Genetech); Vehar, G.A. et al. (1984) Na ture 312:337-342 (Genetech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; Patente Estadounidense No. 4,757,006, y la secuencia de aminoácidos fue deducida de ADNc. La Patente Estadounidense No. 4,965,199 de Capón et al, describe un método de ADN recombinante para producir factor VIII en células huésped de mamífero y la purificación de factor VIII humano. Ha sido reportada la expresión del factor VIII en células CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de riñon de hámster bebé) . El vector VIII ha sido modificado para su primer parte o todo el dominio B (Patente Estadounidense No. 4,868,112), y han sido intentados el reemplazo del dominio B del factor VIII con el dominio B del factor V humano (Patente Estadounidense No. 5,004,803). La secuencia de ADNc que codifica para el factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos predicha se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. En la SEQ ID NO: 1, la región codificadora comienza en la posición nucleotídica 208, siendo el triplete GCC el codón para el aminoácido número 1 (Ala) de la proteína madura como será en la SEQ ID NO: 2. El factor VIII porcino ha sido aislado de plasma [Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594]. La secuencia de aminoácidos parcial del factor VIII porcino correspondiente a porciones de la secuencia de la cadena ligera N-terminal que tiene un homología con la ceruloplasmina y el factor en la coagulación V fueron descritas por Church et al. (1984) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 8Jj_6934 Toóle, J.J. et al (1984) Nature 312 : 342-347 describieron el secuenciamiento parcial del extremo N-terminal de cuatro fragmentos de aminoácido del factor VIII porcino pero no caracterizaron los fragmentos por sus posiciones en la molécula del factor VIII. La secuencia de aminoácidos de los dominios B y parte del A2 del factor VIII porcino fue reportada por Toóle, J.J. et al. (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci , USA 83:5939-5942. La secuencia de ADNc que codifica para el dominio A2 completo del factor VIII porcino y la secuencia de aminoácidos predicha y el factor VIII humano/porcino híbrido que tiene sustituciones de todos los dominios, todas las unidades y secuencias de aminoácidos específicas fueron descritas en la Patente Estadounidense 5,364,771 titulada "factor VIII humano/porcino híbrido" expedida en noviembre 15, 1994, y en la WO 93/20093 publicada en octubre 14, 1993. La secuencia de ADN que codifica para el dominio A2 del factor VIII porcino correspondiente a los residuos 373-740 en el factor VIII humano, maduro, como se muestra en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos predicha se muestran en la SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. Más recientemente, se reportaron las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos correspondientes de parte del dominio Al que carece de los primeros 198 aminoácidos y el dominio A2 del factor VIII porcino en la WO 94/11503, publicada en mayo 26, 1994. Toda la secuencia nucleotídica que codifica para el factor VIII, que incluye el dominio 1 completo, el péptido de activación, los dominios A3, Cl y C2, asi como la secuencia de aminoácidos codificada, fue obtenida finalmente por Lollar, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,859,204, expedida en eneroi 12, 1999, y en la WO 97/49725, publicada en diciembre 31, 1997, ambas incorporadas aquí como referencia. Ambos factores VIII porcino y humano son aislados de plasma como una proteína de 2 subunidades. Las subunidades, conocidas como cadena pesada y cadena ligera, son mantenidas juntas por un enlace no covalente que requiere calcio y otros iones metálicos covalentes. La cadena pesada del factor VIII contiene tras dominios Al, A2 y B, los cuales están enlazados covalentemente. La cadena ligada del factor VIII también contiene tres dominios, designados como A3, Cl y C2. El dominio B no tiene fusión biológica conocida y puede ser removido, o parcialmente removido de la molécula proteoliticamente o por los métodos de la tecnología del ADN recombinante sin alteración significativa de ningún parámetro medido del factor VIII. El factor VIII recombinante humano tiene una estructura y función similares al factor VIII derivado del plasma, aunque no esta glicosilado a menos de que se exprese en células de mamífero. Ambos factores VIII activados humano y porcino ("factor Villa") tienen tres unidades debido a la escisión de la cadena pesada entre los dominios Al y A2. Esta estructura es designada como A1/A2/A3-C1-C2. El factor Villa humano no esa estable bajo las condiciones que estabilizan al factor Villa porcino, presumiblemente debido a la asociación más débil de la subunidad A2 del factor Villa humano. La disociación de la subunidad A2 del factor Villa humano y porcino está asociada con la pérdida de actividad en la molécula del factor Villa. Yakhy=ev, A. et al. (1997) Blood 90 : Suppl . 1, Abstract #126, reportó la unión del dominio A2 por proteína relacionada con el receptor de lipoproteina de baja densidad, siguiendo que la absorción celular de A2 mediada por tal unión actúa para desregular la actividad del factor VIII. La expresión del "factor VIII sin dominio B" es mejorada mediante la inclusión de porciones del dominio B. Se reportó que la inclusión de aquellas partes del dominio B designadas como "SQ" [Lind, P. et al. (1995) supra ] dio como resultado una expresión favorable. Los constructos "SQ" carecen de todo el dominio B humano excepto por 5 aminoácidos del N-terminal del dominio B y 9 aminoácidos del C-terminal del dominio C. El factor VIII híbrido purificado o fragmento del mismo puede ser ensayado por su inmunoactividad y actividad de coagulación por ensayos estándar incluyendo, por ejemplo, el ensayo del factor VIII libre de plasma, y el ensayo de coagulación de una etapa, y el inmunoensayo inmunosorbente ligado a enzima utilizando factor VIII recombinante purificado como estándar. Otros vectores, incluyendo vectores plasmídicos y virales eucarióticos, pueden ser utilizados para expresar un constructo de gel recombinante en células eucarióticas dependiendo de la preferencia y juicio del experto (véase, por ejemplo, Sambrook et al., capitulo 16). Otros vectores y sistemas de expresión, incluyendo sistemas de células de bacterias, levaduras e insectos, pueden ser utilizados pero no son los preferidos debido a diferencias en, o ausencia de, glicosilación. La proteína factor VIII recombinante puede ser expresada en una variedad de células comúnmente utilizadas para cultivo y expresión de proteínas para mamífero recombinante. En particular, se ha encontrado que un número de líneas de células de roedor son huéspedes especialmente útiles para la expresión de proteínas grandes. Las líneas celulares preferidas, disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, incluyen células de riñon de hámster bebé, y células de ovario de hámster chino (CHO) las cuales son cultivadas utilizando los procedimientos y medios de rutina. Las bases para una mayor actividad coagulante del factor VIII porcino parecen ser la disociación espontanea más rápida de la subunidad A2 humana del factor Villa humano y la subunidad A2 porcina del factor Villa porcino. La disociación de la subunidad A2 conduce a pérdida de la actividad, [Lollar, P. et al. (1990) J. Biol . Chem . 265:1688-1692: Lollar, P. et al. (1992) J. Biol . Chem . 267:23652-23657; Fay, P.J. et al. (1992) J. Biol . Chem . 167:13246-13250] .

Moléculas del Factor VIII con inmunorreactividad reducida : Los epítopos que son inmunorreactivos con anticuerpos que inhiben la actividad coagulante del factor VIII ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") han sido caracterizados sobre la base de relaciones estructura-función en el factor VIII. Presumiblemente, los inhibidores podrían actuar perturbando cualesquier interacciones macromoleculares asociadas con la estructura del dominio del factor VIII o sus asociaciones con el factor de von Willebrand, trombina, factor Xa, factor IXa o factor X. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos inhibidores para el factor VIII actúan uniéndose a epítopos localizados en el dominio A2 de 40 kDa o el dominio C2 de 20 kDa del factor VIII, perturbando las funciones especificas asociadas con esos dominios, de acuerdo a lo descrito por Fulcher et al. (1985) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 85:7728-7732; Scandella et al (1988) Proc. Nati.

Anal. Sci USA 85: 6152-6156. Además de los epitopos A2 y C2, puede existir un tercer epítopo en los dominios A3 y Cl de la cadena ligera del factor VIII, de acuerdo a Scandella et al. (1993) Bl ood 82: 1767-1775. El significado de este tercer supuesto epítopo es desconocido, pero parece contribuir a una función menor de la reactividad epitópica en el factor VIII. Los anticuerpos anti-A2 bloquean la activación del factor X, de acuerdo a lo demostrado por Lollar et al. (1994) J. Clin . Invest . 93:2497-2504. Estudios de trazo de mapas anteriores, por mutagénesis de supresión descritos por Ware et al. (1992) Bl ood Coagul . Fibrinolysi s 3:703-716, localizaron el epítopo A2 dentro de una región de 20 kDa del extremo NH2-terminal del dominio A2 de 40 kDa. Los ensayos in unorradiométricos de competencia han indicado que los inhibidores de A2 reconocen un epítopo común o epítopos a grupos estrechamente, de acuerdo a lo descrito por Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67^:665-671 y demostrado en la Patente Estadounidense 5,859,204. Las moléculas de factor VIII de animal o animal modificadas pueden ser probadas en humanos por su antigenicidad y/o inmunogenicidad reducida en ensayos clínicos. En un tipo de ensayo, designado para determinar si el factor VIII es inmunorreactivo con anticuerpos inhibidores, el factor VIII es administrado, de manera preferible por infusión intravenosa, a aproximadamente 25 pacientes que tienen deficiencia de factor VIII que tienen anticuerpos que inhiben la actividad coagulante del factor VIII terapéutico. La dosis de factor VIII de animal o animal modificado es en un intervalo de entre 5 y 50 Unidades/kg de peso corporal, de manera preferible 10-50 Unidades/kg, de manera más preferible 40 Unidades/kg de peso corporal. Aproximadamente 1 hora después de cada administración, la recuperación del factor VIII de muestras de sangre se mide en un ensayo de coagulación de una etapa. Nuevamente se toman muestras aproximadamente 5 horas después de la infusión, y se mide la recuperación. La recuperación total y la velocidad de desaparición del factor VIII de las muestras es predictiva del título de anticuerpo y la actividad inhibidora. Si el título de anticuerpo es alto, la recuperación de factor VIII usualmente no es medida. Los resultados de recuperación son comparados con los resultados de recuperación en pacientes tratados con factor VIII derivado de plasma, factor VIII recombinante, factor VIII porcino derivado de plasma, y otras formas terapéuticas comúnmente utilizadas del factor VIII o sustituto del factor VIII. Después de la identificación de los epítopos clínicamente significativos, pueden ser expresadas moléculas del factor VIII recombinante que tengan una reactividad cruzada menor o igual en comparación con el factor VIII porcino derivado de plasma cuando se prueben in vi tro contra un estudio amplio de plasma. Puede efectuarse una mutagénesis adicional en regiones epitópicas para reducir la reactividad cruzada. La reactividad cruzada reducida, aunque deseable, no es necesaria para producir un producto que pueda tener ventajas sobre el concentrado del factor VIII porcino derivado de plasma existente, lo cual puede producir efectos laterales debido a proteínas porcinas contaminantes o agentes infecciosos contaminantes tales como virus o priones. Una molécula de factor VIII porcino recombinante o porcina modificada no contendrá proteínas porcinas extrañas. Ensayos de Diagnóstico El ADNc de factor VIII y/o la proteina expresada por el mismo, pueden ser utilizados por completo o en parte en ensayos como reactivos de diagnóstico para la detección de anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano o animal o factor VIII animal en sustratos, incluyendo, por ejemplo, muestras de suero y fluidos corporales de pacientes humanos con deficiencia de factor VIII. Esos ensayos de anticuerpo incluyen ensayos tales como los ensayos de ELISA, inmunoelectrotransferencias, radioinmunoensayos, ensayos de inmunodifusión y ensayos de la actividad biológica del factor VIII (por ejemplo, ensayo de coagulación) . Las técnicas para preparar esos reactivos y métodos para el uso de los mismos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, un inmunoensayo para la detección de anticuerpos inhibidores en una muestra de suero de paciente puede incluir hacer reaccionar la muestra de prueba con una cantidad suficiente de factor VIII a ser probado, de modo que pueda formarse un complejo detectable con los anticuerpos inhibidores en la muestra del factor VIII de prueba es antigénico en realidad. Pueden prepararse sondas de ácidos nucleicos y aminoácidos sobre la base de la secuencia del ADNc del factor VIII hídrido o la molécula de proteína o fragmentos de los mismos. En algunas modalidades, esos pueden ser marcados utilizando tintes o marcas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes o radioactivas que estén comercialmente disponibles. Pueden ser utilizadas sondas de aminoácidos, por ejemplo, para separar suero u otros fluidos corporales donde se sospeche la presencia de inhibidores para el factor VIII humano, animal o de humano/animal híbrido. Los niveles de inhibidores pueden ser cuantificados en pacientes y comparados con controles sanos, pueden ser utilizados, por ejemplo, para determinar al paciente deficiencia de factor VIII pueda ser tratado con un factor VIII de animal o animal modificado. Las sondas de ADNc pueden ser utilizadas, por ejemplo, para propósitos de investigación para separar bibliotecas de ADN. Composiciones Farmacéuticas Las - composiciones farmacéuticas que contienen factor VIII porcino recombinante o porcino modificado, solo o en combinación con compuestos estabilizadores farmacéuticos, vehículos de liberación y/o vehículos portadores apropiados, son preparados de acuerdo a métodos conocidos, como se describe en Remington's Pharmaceuti cal Sci ences por E.W. Martin. En una modalidad preferida, los portadores de vehículos de liberación preferidos para la infusión ultravenosa son solución salina fisiológica o solución salina amortiguada con fosfato. En otra modalidad preferida, los compuestos estabilizadores, vehículos deliberación, y vehículos portadores adecuados, incluyen pero no se limitan a otras proteínas humanas o animales tales como la albúmina. Suspensiones de vesículas fosfolipídicas o liposomales son también preferidas como portadores o vehículos de liberación farmacéuticamente aceptables. Esas pueden ser preparadas de acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden contener, por ejemplo, fosfatidilserina/fosfatidilcolina u otras composiciones de fosfolipidos o detergentes que juntos impartan una carga negativa a la superficie, puesto que el factor VIII se une a membranas fosfolipídicas cargadas negativamente. Los liposomas pueden ser preparados disolviendo lípidos apropiados (tales como la esteroil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina, y colesterol) en un solvente inorgánico que es entonces evaporado, dejando detrás una película delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Una solución acuosa de factor híbrido VIII es entonces introducido en el recipiente. El recipiente es entonces agitado con la mano para liberar el material lipídico de los lados del recipiente y dispersar los agregados lipidíeos, formando por lo tanto la suspensión liposomal . El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado puede ser combinado con otros compuestos estabilizadores, vehículos de liberación y/o vehículos portadores adecuados, incluyendo factores de la coagulación que dependen de la vitamina K, factor tisular, factor de von Willebrand (vWf) o un fragmento de vWf que contenga el sitio de unión del factor VIII, y polisacáridos tales como la sucrosa. El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado también puede ser liberado por terapia genética de la misma manera que el factor VIII humano puede ser liberado, utilizando medios de liberación tales como vectores retrovirales. Este método consiste de la incorporación de ADNc del constructo del factor VIII deseado en células humanas que son transplantadas directamente en un paciente deficiente en un factor VIII o que son colocadas en un dispositivo insertable, permeable a las moléculas del factor VIII pero impermeable a las células, que es entonces transplantado. El método preferible será la transferencia genética mediada de manera retroviral. En ese método, un gen exógeno (por ejemplo, un ADNc de factor VIII) es clonado en el genoma de un retrovirus modificado. El gen es insertado en el genoma de la célula huésped a la maquinaria viral donde será expresado por la célula. El vector retroviral es modificado de modo que no produzca virus, previniendo la infección viral del huésped. Los principios generales para este tipo de terapia son conocidos por aquellos expertos en la técnica y han sido revisados en la literatura [por ejemplo, Kohn, D. B. et al. (1989) Transfusi ón 29: 812-820] . El factor VIII porcino o porcino modificado puede ser almacenado unido al vWf para incrementar la vida media y la vida de anaquel de la molécula híbrida. Adicionalmente, la liofilización del factor VIII puede mejorar el rendimiento de moléculas activas en presencia de vWf. Los métodos actuales para almacenar factor VIII humano o animal utilizados por los distribuidores comerciales pueden ser empleados para almacenar el factor VIII recombinante. Esos métodos incluyen: (1) liofilización de factor VIII en un estado parcialmente purificado (como un "concentrado" de factor VIII que es infundido sin purificación adicional) ; (2) purificación por inmunoafinidad del factor VIII por el método de Zimmerman y liofilización en presencia de albúmina, la cual estabiliza el factor VIII; (3) liofilización de factor VIII recombinante en presencia de albúmina. Adicionalmente, se ha encontrado que el factor VIII porcino o porcino modificado es indefinidamente estable a 4°C en NaCl 0.6 M, MES 20 mM, y CaCl2 5 mM a pH 6.0 y también puede ser almacenado congelado en esos amortiguadores y descongelado con pérdida mínima de actividad. Método de tratamiento El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado es utilizado para tratar la hemorragia descontrolada debido a la deficiencia del factor VIII (por ejemplo, hemorragia intraarticular, intracranial, o gastrointestinal) en hemofílicos con y sin anticuerpos inhibidores en pacientes con deficiencia de factor VIII adquirida debido al desarrollo de anticuerpos inhibidores. Los materiales activos son de manera preferible administrados intravenosamente . Adicionalmente, el factor VIII porcino recombinante o porcino modificado puede ser administrado mediante el transplante de células modificadas genéticamente para producir la proteína mediante la implantación de un dispositivo que contiene tales células, como se describió anteriormente . En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado solo o en combinación con estabilizadores, vehículos de liberación, y/o portadores son infundidas en pacientes intravenosamente de acuerdo al mismo procedimiento que se utilizó para la infusión de factor VIII humano o animal.

Las dosis de tratamiento de composición de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado que deben ser administradas a un paciente que necesite de tal tratamiento variarán dependiendo de la severidad de la deficiencia de factor VIII. De manera general, los niveles de dosificación son ajustados en frecuencia, duración y unidades de acuerdo con la severidad y duración de cada episodio hemorrágico del paciente. En consecuencia, el factor VIII es incluido en un portador, vehículo de liberación o estabilizador farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para proporcionar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína para detener la hemorragia, de acuerdo a lo medido por los ensayos de coagulación estándar. El factor VIII es definido clásicamente como aquella sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige el defecto de coagulación en el plasma derivado de individuos con hemofilia A. La actividad coagulante in vi tro de formas purificadas y parcialmente purificadas del factor VIII es utilizada para calcular la dosis de factor VIII para infusiones en pacientes humanos y es un indicador confiable de la actividad recuperada del plasma del paciente y de la corrección de su defecto hemorrágico in vi vo . No existen discrepancias reportadas entre el ensayo estándar de moléculas de factor VIII novedosas in vi tro y su comportamiento en el modelo de infusión en perros o en pacientes humanos, de acuerdo a Lusher, J. M. et al. 328 New Engl . J. Med. 328:453-459; Pittman, D. D. et al. (1992) Blood 79:389-397; y Brinkhous et al. (11985) Proc . Na ti . Acad. Sci . 82:8752-8755. Usualmente, el nivel de actividad de factor VIII en plasma que se desea lograr en el paciente a través de la administración del factor VIII porcino recombinante o porcino modificado está en el intervalo del 30-1000% del normal. En un modo preferido de administración de factor VIII terapéutico, la composición se proporciona intravenosamente a una dosis preferida en el intervalo de aproximadamente 5 hasta 50 unidades/kg de peso corporal, de manera más preferible en un intervalo de 10-50 unidades/kg de peso corporal, y de manera más preferible a una dosis de 20-40 unidades/kg de peso corporal; la frecuencia del intervalo está en el intervalo de aproximadamente 8 a 24 horas (el hemofílico severamente afectado) ; y la duración del tratamiento en días está en el intervalo de 1 a 10 días o hasta que el episodio hemorrágico sea resuelto. Véase, por ejemplo, Roberts, H. R. y M. R. Jones, "Hemofilia y Condiciones Relacionadas-Deficiencias Congénitas de Protrombina (Factor II, Factor V, y Factores VII a XII)", CH. 153, 1453-1474, 1460, en Hematology, Williams, W. J. et al., ed. (1990). Los pacientes con inhibidores pueden requerir una cantidad diferente de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado que su forma previa de factor VIII. Por ejemplo, los pacientes pueden requerir menos factor VIII porcino recombinante o porcino modificado debido a su mayor actividad específica que el factor VIII humano y su reactividad de anticuerpo disminuida. Como en el tratamiento con el factor VIII humano o porcino derivado de plasma, la cantidad de factor VIII terapéutico infundida es definida por el ensayo de coagulación de factor VIII de una etapa y, en casos seleccionados, la recuperación in vi tro es determinada midiendo el factor VIII en el plasma del paciente después de la infusión. Debe comprenderse que para cualquier objeto particular, los regímenes de dosificación específica deberán ser ajustados con el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración expuestos aquí son ejemplares únicamente y no pretenden limitar el alcance práctico de la composición reclamada. El tratamiento puede tomar la forma de una sola administración intravenosa de la composición o una administración periódica o continua durante un periodo prolongado de tiempo, según se requiera. De manera alternativa, el factor VIII terapéutico puede ser administrado subcutánea u oralmente con liposomas en una o varias dosis a varios intervalos de tiempo. El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado también puede ser utilizado para tratar la hemorragia no controlada debido a la eficiencia del factor VIII en hemofílicos que han desarrollado anticuerpos contra el factor VIII humano. En este caso, la actividad coagulante que es superior al factor VIII humano o animal solo no es necesaria. La actividad coagulante que es inferior a la del factor VIII humano (es decir, menor de 3,000 unidades/mg) será útil si esa actividad no es neutralizada por anticuerpos en el plasma del paciente. Se ha demostrado aquí que el factor VIII porcino recombinante y porcino modificado pueden diferir en su actividad específica del factor VIII humano. Las proteínas de factor VIII que tienen mayor actividad procoagulante a la del factor VIII humano son útiles en el tratamiento de la hemofilia debido a que se requerirán menos dosis para corregir una deficiencia de factor VIII de un paciente. Los factores VIII que tienen menor actividad procoagulante que el factor VIII humano son también adecuados para uso terapéutico siempre que tengan al menos 1% de actividad específica en comparación con el factor VIII humano normal. Un factor VIII de la presente invención que tiene actividad procoagulante se define por lo tanto como aquel que tiene al menos 1% de la actividad específica del factor VIII humano. La molécula de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado y el método para su aislamiento, caracterización, producción y uso descrito de manera general anteriormente serán comprendidos mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Ejemplo 1 : Ensayo del factor VIII porcino y factor humano/porcino híbrido. El factor VIII porcino tiene más actividad coagulante que el factor VIII, sobre la base de la actividad específica de la 'molécula. Esta conclusión se basa en el uso de curvas estándar apropiadas que permiten que el factor VIII porcino humano sea perfectamente comparado. Los ensayos de coagulación se basan en la capacidad del factor VIII para acortar el tiempo de coagulación de plasma derivado de un paciente con hemofilia A. Se emplearon dos tipos de ensayo: el ensayo de una etapa y el de dos etapas. En el ensayo de una etapa, se incubaron 0.1 ml de plasma de hemofilia A (George King Biomedical, Inc.) con 0.1 ml de reactivo de tromboplastina parcial activada (APTT) (Organon Teknika) y 0.01 ml de muestra o estándar, consistente de plasma humano normal diluido, cifrado, durante 5 minutos a 37 °C en un baño de agua. La incubación fue seguida por la adición de 0.1 ml de CaCl2 20 mM, y el tiempo para el desarrollo de un coágulo de fibrina fue determinado por inspección visual. Una unidad de factor VIII se define como la cantidad presente en 1 ml de plasma normal cifrado. Con el plasma humano como estándar, se compararon directamente las actividades del factor humano porcino y humano. Se produjeron diluciones de plasma estándar o proteínas modificadas en NaCl 0.15 M, HEPES 0.02 M, pH 7.4. La curva estándar fue construida sobre la base de 3 ó 4 diluciones de plasma, siendo la mayor dilución de 1/50, y sobre el logio del tiempo de coagulación graficado contra el logio de la concentración de plasma, lo cual dio como resultado una gráfica lineal. Las unidades de factor VIII en una muestra desconocida se determinaron mediante la interpolación de la curva estándar. El ensayo de una etapa depende de la actividad endógena del factor VIII por activadores formados en el plasma de hemofilia A, mientras que el ensayo de dos etapas mide la actividad procoagulante del factor VIII preactivado. En el ensayo de dos etapas, las muestras que contienen factor VIII que habían reaccionado con trombina fueron agregadas a una mezcla de tromboplastina parcial activada y plasma de hemofilia A humana que había sido preincubado durante 5 minutos a 37 °C. Los tiempos de coagulación resultantes fueron entonces convertidos a unidades/ml, sobre la base de la misma curva estándar humana descrita anteriormente. La actividad relativa del ensayo de dos etapas fue mayor que en el ensayo de una etapa debido a que el factor VIII había sido preactivado. Ejemplo 2: Caracterización de la diferencia funcional entre el factor VIII humano y porcino. El aislamiento del factor VIII derivado del plasma porcino o humano y el factor VIII recombinante humano, han sido descritos en la literatura en Fulcher, C. A. et al. (1982) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 79:1648-1652; Toóle et al. (1984) Na ture 312:342-347 (Genetics Institute) ; Gitschier et al. (1984) Na ture 312:326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Na ture 312:330-337 (Genentech); Vehar et al. 312 Na ture 312:337-342 (Genentech); Pass et al. (1982) Blood 59:594; Toóle et al. (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 83:5939-5942. Esto puede lograrse de varias maneras. Todas esas preparaciones son similares a la composición de subunidades, aunque existe una diferencia funcional en la estabilidad entre el factor VIII humano y porcino. Para la comparación del factor VIII recombinante humano y porcino, se sometieron preparaciones del factor VIII recombinante humano altamente purificado (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) y factor VIII porcino [inmunopurificado como se describe en Fass et al. (1982) Bl ood 59:594] a cromatografía de líquidos de alta presión (CLAP) sobre una columna de intercambio aniónico Mono QMR (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) (Pharmacia, Inc.). El propósito del paso de CLAP en Mono QMR fue la eliminación de impurezas menores del intercambio del factor VIII humano y porcino en un amortiguador común para propósitos de comparación. Se reconstituyeron frascos que contenían 1000-2000 unidades de factor VIII con 5 ml de H20. A continuación se agregó Hepes (2 M a pH 7.4) a una concentración final de 0.02 M. Se aplicó factor VIII a la columna Mono QMR HR 5/5 equilibrada en NaCl 0.15 M, Hepes 0.02 M, CaCl2 5 mM, a pH 7.4 (Amortiguador A más NaCl 0.15 M) ; se lavó con 10 ml de Amortiguador A + NaCl 0.15 M; y se eluyó con 20 ml de gradiente lineal, NaCl de 0.15 M a 0.90 M en Amortiguador A a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Para la comparación del factor VIII derivado de plasma humano (modificado por CLAP en Mono QMR) y factor VIII porcino, se diluyo factor VIII porcino derivado de plasma, purificado por inmunoafinidad 1:4 con Hepes 0.04 M, CaCl2 5 M, Tween-80 al 0.01%, a pH 7.4, y se sometió a CLAP sobre Mono QMR bajo las mismas condiciones descritas en el párrafo anterior para el factor VIII humano. Esos procedimientos para el aislamiento del factor VIII humano y porcino son estándares para aquellos expertos en la técnica. Se ensayaron fracciones de columna para determinar la actividad del factor VIII por un ensayo de coagulación de una etapa. Los resultados promedio de los ensayos, expresados en unidades de actividad por A28o de material, se dan en la Tabla II, e indican que el factor VIII porcino tiene al menos seis veces más actividad que el factor VIII humano cuando es utilizado el ensayo de una etapa.

TABLA II COMPARACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DEL FACTOR VIII HUMANO Y PORCINO Actividad (U/A28o) Porcino 21,300 Derivado de plasma humano 3,600 Recombinante humano 2,400 Ejemplo 3 : Comparación de la estabilidad del factor VIII humano y porcino. Los resultados del ensayo de una etapa para el factor VIII reflejan la activación del factor VIII al factor Villa en la muestra y la posible pérdida de la actividad del factor Villa formado. Se hizo una comparación directa de la estabilidad del factor VIII humano y porcino. Se diluyeron muestras de CLAP sobre Mono QMR (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) a la misma concentración y composición de amortiguador y se hicieron reaccionar con trombina. A varios tiempos, se removieron muestras para el ensayo de coagulación de dos etapas. Típicamente, la actividad pico (a los 2 minutos) fue 10 veces mayor para el factor Villa porcino que el humano, y las actividades de ambos factores Villa porcino y humano disminuyeron posteriormente, con la actividad del factor Villa humano disminuyendo más rápidamente. De manera general, los intentos por aislar el factor Villa humano estable no son exitosos aún cuando se utilicen condiciones que produzcan factor Villa porcino estable. Para demostrar esto, el factor Villa humano purificado por CLAP sobre Mono QMR, fue activado con trombina y sometido a CLAP de intercambio catiónico sobre Mono SMR (Pharmacia, Inc.) bajo condiciones que producen factor Villa porcino estable, de acuerdo a lo descrito por Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666. Se hizo reaccionar factor VIII humano, 43 µg/ml (0.2 µM) en NaCl 0.2 M, Hepes 0.01 M, CaCl2 2.5 mM, a pH 7.4, en un volumen total de 10 ml, con trombina (0.036 µM) durante 10 minutos, tiempo al cual se agregó FPR-CH2C1 D-fenil-prolil-arginil-clorometil cetona a una concentración de 0.2 µM para la inactivación irreversible de la trombina. La mezcla fue entonces diluida 1:1 con ácido 2- (N-morfolino) etan sulfónico (MES) 40 mM, CaCl2 5 mM, a pH 6.0, y cargada a 2 ml/min sobre una columna de CLAP Mono SMR HR 5/5 (Pharmacia, Inc.) equilibrada en MES 5 mM, CaCl2 5 mM, a pH 6.0 (Amortiguador B) más NaCl 0.1 M. El factor Villa fue eluido sin lavar la columna con 20 ml de gradiente de NaCl 0.1 M a NaCl 0.9 M en Amortiguador B a l ml/min. La fracción con actividad coagulante en el ensayo de dos etapas, eluyó como un solo pico bajo esas condiciones. La actividad específica de la fracción pico fue de aproximadamente 7,500 U/A280. La electroforesis sobre gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida con (SDS-PAGE) del poco del factor Villa de la Mono SMR, seguida de la tinción con plata de la proteina, reveló dos bandas correspondientes a un derivado heterodi érico (A3-C1-C2/A1) del factor VIII. Aunque el fragmento A2 no fue identificado por la tinción con plata bajo esas condiciones debido a su baja concentración, fue identificado como un constituyente en trazas por mareaje con 125I. En contraste a los resultados con el factor VIII humano, el factor Villa porcino aislado por CLAP sobre Mono SMR bajo las mismas condiciones tuvo una actividad específica de 1.6 x 106 U/A28o. El análisis del factor Villa porcino por SDS-PAGE, reveló 3 fragmentos correspondientes a las subunidades Al, A2 y A3-C1-C2, demostrando que el factor Villa posee tres subunidades. Los resultados de CLAP sobre Mono SMR de preparaciones de factor VIII activadas por trombina humana a pH 6.0 indican que el factor Villa humano es lábil bajo condiciones que producen el factor Villa porcino. Sin embargo, aunque se identificaron cantidades en trazas de fragmento A2 en la fracción pico, la determinación de sí la actividad coagulante resulto de pequeñas cantidades de factor Villa heterotrimérico o de factor Villa heterodimérico que tiene una actividad específica baja no fue posible por este método únicamente. Es deseable una forma de aislar el factor Villa humano antes de que pierda su subunidad A2 para resolver esta cuestión. Hasta este punto, el aislamiento fue logrado en un procedimiento que implica la restricción del pH de los amortiguadores de Mono SMR a pH 5. El factor VIII humano purificado sobre Mono QMR (0.5 mg) fue diluido con H20 para dar una composición final de 0.25 mg/ml (1 µm) de factor VIII en NaCl 0.25 M, Hepes 0.01 M, CaCl2 2.5 M, Tween-80 al 0.005%, a pH 7.4 (volumen total de 7.0 ml). Se agregó trombina a una concentración final de 0.072 µm y se dejo reaccionar durante 3 minutos. La trombina fue entonces inactivada con FPR-CH2C1 (0.2 µm) . La mezcla fue entonces diluida 1:1 con acetato de sodio 40 mM, CaCl2 5 mM, Tween-80 al 0.01%, a pH 5.0, y cargada a 2 ml/min sobre una columna de CLAP Mono SMR equilibrada en acetato de sodio 0.01 M, CaCl2 5 mM, Tween-80 0.01%, a pH 5.0, más NaCl 0.1 M. El factor Villa fue eluido sin lavar la columna con 20 ml con un gradiente de NaCl 0.1 M a NaCl 1.0 M en el mismo amortiguador a 1 ml/min. Esto dio como resultado la recuperación de la actividad coagulante en un pico que contenía cantidades detectables del fragmento A2 de acuerdo a lo demostrado por la SDS-PAGE y tinción con plata. La actividad específica de la fracción pico fue diez veces mayor que la recuperada a pH 6.0 (75,000 U/A28o contra 7,500 U/A280) . Sin embargo, en contraste con el factor Villa porcino aislado a pH 6.0, el cual es indefinidamente estable a 4°C, la actividad del factor Villa humano disminuyó de manera estable durante un periodo de varias horas después de la elución de la Mono SMR. Adicionalmente, la actividad específica del factor Villa purificado a pH 5.0 y ensayado inmediatamente es únicamente el 5% de la del factor Villa porcino, indicando que ocurrió una disociación sustancial antes del ensayo. Esos resultados demuestran que ambos factores Villa humano y porcino están compuestos de tres subunidades (Al, A2 y A3-C1-C2) . La disociación de la subunidad A2 es responsable de la pérdida de actividad del factor Villa humano y porcino bajo ciertas condiciones, tales como la fuerza iónica, pH y concentración fisiológicas. La estabilidad relativa del factor Villa porcino, bajo ciertas condiciones se debe a la fuerte disociación de la subunidad A2.

Ejemplo 4 : Aislamiento y secuenciamiento del ADN que codifica para el dominio A2 del factor VIII porcino . Únicamente la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio B y parte del dominio A2 del factor VIII porcino, ha sido secuenciada anteriormente [Toóle et al. (1986) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 83:5939-5942]. La secuencia de ADNc y aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente) para todo el dominio A2 del factor VIII porcino son descritas aquí. El dominio A2 del factor VIII porcino fue clonado por transfección inversa del ARN total de bazo porcino y amplificación por PCR; se utilizaron cebadores degenerados basados en la secuencia de ADNc del factor VIII humano conocido y un cebador porcino exacto basado en parte de la secuencia del factor VIII porcino. Se aisló un producto de PCR de 1 kb y se amplificó por inserción en un vector de fagémido BluescriptMR (Stratagene) . El dominio A2 porcino, fue secuenciado completamente por el secuenciamiento con didesoxi. La secuencia de ADNc y aminoácidos predicha son descritas en las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente.

-Ejemplo 5 : Secuencia completa del ADN que codifica para el factor VIII porcino.

El fragmento de Klenow. Los enlazantes Clal fosforilados, enlazantes Notl, ligasa T4, y ADN polimerasa Taq fueron comprados de Promega (Madison, Wisconsin) . La polinucleótido cinasa fue comprada de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. El ?32P-ATP (Redivue, >5000Ci/mmol) fue comprado de Amersham. Las células pBluescript II KS- y E. coli Epicurean XLl-Blue fueron compradas de Stratagene (La Jolla, California) . Los oligonucleótidos sintéticos fueron comprados de Life Technologies, Inc. o Cruachem, Inc. Los cebadores fosfoligados en la posición 5' , fueron utilizados cuando los productos de la PCR fueron producidos para propósitos de clonación. La numeración nucleotídica (nt) de los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADNc del fVIII porcino o el ADN genómico, utiliza el ADNc del fVIII humano como referencia (Wood et al. (1984) supra) . El ARN total de bazo porcino fue aislado por extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo [Chomczynski et. al. (1987) Anal . Biochem. 162:156-159]. El ADNc porcino fue preparado de ARN de bazo total utilizando transcriptasa inversa (RT) del virus de la leucemia murina de Moloney y hexámeros aleatorios para llevar la reacción (Equipo de Síntesis de la Primera Hebra del ADNc, Pharmacia Biotech) a menos que se indique otra cosa. Las reacciones de RT contenían Tris-Cl 45 mM, pH 8.3, KCl 68 mM, DTT 15 mM, MgCl2 9 mM, 0.08 mg/ml de sero albúmina bovina y trifosfato de desoxinucleótido (dNTP) 1.8 mM. El ADN genómico porcino fue aislado del bazo utilizando un procedimiento estándar (Strauss, W. M. (1995) In Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., editores, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3). El aislamiento del ADN de geles de agarosa se efectuó utilizando el Equipo Geneclean II (Bio 101) o de Extracción en Gel Quiex II (Qiagen) . Las reacciones de PCR se efectuaron utilizando un termociclador Hybaid OmniGene. Para las reacciones de PCR que emplean ADN polimerasa Taq, las reacciones incluyeron MgCl2 0.6 mM, dNTP 0.2 mM, cebadores oligonucleotidicos 0.5 µ-M, 50 U/ml de polimerasa y un volumen de 0.1 de la mezcla de reacción de la primera hebra de ADNc. Excepto donde se indique otra cosa, los productos de la PCR fueron purificados sobre gel, cortados de manera roma en el extremo con fragmento de Klenow, precipitados con etanol, y ligados al sitio EcoRV de los pBluescript II KS desfosforilado o ligado con enlazantes Clal fosforilados utilizando ligasa T4, digeridos con Clal, purificados por cromatografía sobre Sephacryl S400, y ligados para cortar Clal, pBluescript II KS desfosforilado. Las ligaciones se efectuaron utilizando ADN ligasa T4 (equipo de ligación de ADN Rápida, Boehringer Mannheim) excepto donde se indique otra cosa. Se utilizaron plásmidos de pBluescript II KS que contenían inserto para transformar las células E. coli Epicurean XLl-Blue. El secuenciamiento del ADN plasmídico se efectuó utilizando un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373a automatizado y el equipo terminador de tinte PRISM o manualmente utilizando el equipo de secuenciamiento Sequenase v.2.0 (Amersham Corporation). El secuenciamiento directo de los productos de PCR, incluyendo el mareaje del extremo con 32P de los oligonucleótidos se efectuó utilizando el protocolo de secuenciamiento cíclico (Sistema de Secuenciamiento Cíclico de ADNds, Life Technologies) . Aislamiento de clonas de ADNc de fVIII porcino que contienen las secuencias 5' UTR, péptido señal y codones del dominio Al. El ADNc del fVIII porcino 5' al dominio A2 fue amplificado por RT-PCR amidada de ARN total de bazo de cerdo hembra utilizando una amplificación rápida 5' de los protocolos de los extremos de ADNc (5' -RACE) (Marathón cDNA Amplification, Clontech, Versión PR55453) . Esto incluyó la síntesis de la primera hebra del ADNc utilizando un cebador oligo (dT) acoplado de manera inmóvil [Borson, N. D. et al. (1992) PCR Methods Appl . 2:144-148], la síntesis de la segunda hebra utilizando ADN polimerasa I de E. coli , y ligación con un adaptador de doble hebra extendido 5' , SEQ ID NO: 5 5' -CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3 3' -H2N-CCCGTCCA-P04-5' cuya hebra corta fue bloqueada en el extremo 3' con un grupo amino para reducir el cebado por PCR no específico que era complementario a los 8 nucleótidos en el extremo 3' (Siebert, P. D., et al. (1995) Nucleic . Acids . Res . 23:1087-1088). La primera ronda de PCR se efectuó utilizando un oligonucleótido específico adaptador, SEQ ID NO: 6 5' -CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (designado como API) como cebador sentido, y un oligonucleótido específico del dominio A2 del fVIII porcino SEQ ID NO: 7 5' -CCA TTG ACÁ TGA AGA CCG TIT CTC-3' (nt 2081-2104) como cebador antisentido. La segunda ronda de PCR se efectuó utilizando un oligonucleótido específico del adaptador, anidado, SEQ ID NO: 8 5' -ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (designado como AP2) como cebador sentido, y un oligonucleótido específico del dominio A2 porcino, anidado, SEQ ID NO: 9 5' -GGG TGC AAA GCG CTG ACÁ TCA GTG-3' (nt 1497-1520) como cebador antisentido. La PCR se llevo a cabo utilizando un equipo comercial (equipo central de PCR de ADNc Advantage) , el cual emplea un protocolo de inicio caliente mediado por anticuerpo [Kellogg, D. E. et al. (1994) Bi oTechniques 1_6: 1134-1137] . Las condiciones de la PCR incluyeron la desnaturalización a 94 °C durante 60 segundos, seguido por 30 ciclos (primera PCR) o 25 ciclos (segunda PCR) de desnaturalización durante 30 segundos a 94 °C, recocidos durante 30 segundos a 60°C y alargamiento durante 4 minutos a 68 °C utilizando el control de temperatura de tubo.

Este procedimiento produjo un producto prominente de «1.6 kb, el cual fue consistente con la amplificación de un fragmento que se extiende aproximadamente 150 pb hacia el 5' UTR. El producto de la PCR fue clonado en pBluescript utilizando ligadores Clal. Se secuenciaron los insertos de cuatro clonas en ambas direcciones. Las secuencias de esas clonas incluyeron regiones correspondientes a 137 pb del 5' UTR, el péptido señal, el dominio Al y parte del dominio A2. Se alcanzó un consenso en al menos 3 de 4 sitios. Sin embargo, las clonas tuvieron un promedio de 4 mutaciones generadas por PCR aparentes, presumiblemente debido a las rondas múltiples de PCR requeridas para generar un producto clonable. Por lo tanto, utilizamos la secuencia obtenida de la región del péptido señal para designar un cebador de PCR fosforilado de hebra sentido, SEQ ID NO: 10 5' -CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3' , designado como RENEOPIGSP, para la síntesis de otro producto de PCR para confirmar la secuencia y para la clonación en un vector de expresión. La secuencia en negrillas representa el codón de inicio. La secuencia 5' a esta, representa una secuencia idéntica a la 5' del sitio de inserción en el vector de expresión de mamífero ReNeo usado para la expresión del fVIII (Lubin et al. (1994) supra ) . Este sitio incluye un sitio de escisión de Xhol (subrayado) . El RENEOPIGSP y el oligonucleótido nt 1497-1520 fueron utilizados para cebar una reacción de PCR mediada por ADN polimerasa Taq utilizando ADNcd de bazo de porcino hembra como patrón. Las ADN polimerasas de varios otros fabricantes no produjeron un producto detectable. Las condiciones de la PCR incluyeron desnaturalización a 94°C durante cuatro minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturalización durante 1 minutos a 94 °C, recocidos durante 2 minutos a 55°C y alargamiento durante 2 minutos a 72°C, seguido por un paso de alargamiento final durante 5 minutos a 72 °C. El producto de la PCR fue clonado en pBluescript utilizando enlazantes Clal. Los insertos de esas dos clonas fueron secuenciados en ambas direcciones y comparados para la secuencia de consenso.

Aislamiento de clonas de ADNc de fVIII porcino que contienen codones del dominio A3, Cl y la mitad 5' del C2.

Inicialmente, se clonaron dos productos de RT-PCR de bazo porcino, correspondientes al fragmento del dominio B-A3 (nt 4519-5571) y un fragmento del dominio C1-C2 (nt 6405-6990) . El extremo 3' del dominio C2 que se obtuvo se extendió hacia la región 26 del exón, la cual es el exón terminal del fVIII. El producto B-A3 se produjo utilizando el cebador del dominio B específico porcino, SEQ ID NO: 11 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3' , donde la región subrayada corresponde a una región en el fVIII porcino que se alinea con nt 4519-4530 en el fVIII. La región 5' del oligonucleótido incluye un sitio de Notl que originalmente se pretendía sirviera para propósitos de clonación. El cebador antisentido utilizado en la generación del producto B-A3, la SEQ ID NO: 12 5' GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3' se basó en el complemento inverso de la secuencia de ADNc del fVIII humano en nt 5545-5571. La reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 9.0, Tritón X-100 al 0.01%, MgCl2 1.5 M, dNTP 2.5 mM, 20 µM de cebadores, 25 unidades/ml de ADN polimerasa Taq y un volumen de 1/20 de la mezcla de reacción de RT. Las condiciones de la PCR fueron desnaturalización a 94°C durante 3 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturalización durante 1 minutos a 94 °C, recocido durante 2 minutos a 50°C y alargamiento durante 2 minutos a 72 °C. Los productos de la PCR fueron fosforilados utilizando ADN cinasa T4 y se agregaron enlazantes de Notl. Después de cortar con Notl, los fragmentos de la PCR fueron clonados en el sitio Notl del Bluescript II-KS y transformados en células XLl-Blue. El producto C1-C2 fue producido utilizando la secuencia de ADNc humano conocido para sintetizar los cebadores sentido y antisentido, SEQ ID NO: 13 5' -AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) y SEQ ID NO: 14 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (complemento inverso de nt 6966-6990), respectivamente. Las condiciones de la PCR fueron idénticas a aquellas utilizadas para generar el producto B-A2. El fragmento resultante fue ligado al vector de clonación pNOT utilizando el sistema de clonación Prime PCR Cloner (5 prima-3 prima, Inc., Boulder, Colorado) y haciendo crecer en células JM109. Los plásmidos B-A3 y C1-C2 fueron parcialmente secuenciados para producir los oligonucleótidos sentido y antisentidos porcino, SEQ ID NO: 15 5' -GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) y SEQ ID NO: 16 5' -ACÁ GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564) respectivamente. Esos oligonucleótidos fueron utilizados como cebadores para generar un producto de RT-PCR de 2013 pb utilizando un equipo de PCR de ADNc Clontech Advantage. Este producto, el cual corresponde al nt 4551-6564 humano, incluye la región correspondiente al péptido de activación de la cadena ligera (nt 5002-5124), dominio A3 (nt 5125-6114) y la mayoría del dominio Cl (nt 6115-6573) . La secuencia de la clona C1-C2 ha establecido que los ADN humano y porcino del nt 6565 al extremo 3' del dominio Cl eran idénticas. El producto de la PCR se clonó en el sitio EcoRV del pBlueScript II KS-. Se secuenciaron completamente cuatro clonas en ambas direcciones. Se alcanzó el consenso en al menos 3 de 4 sitios . Aislamiento de las clonas de ADNc del fVIII porcino que contienen los codones semi 3' del dominio C2. El dominio C2 del fVIII humano (nucleótidos 6574-7053) está contenido dentro de los hexones 24-26 [Gitschier J. et al. (1984) Nature 312:326-330]. El hexón humano 26 contiene 1958 pb, correspondiente a los nucleótidos 6901-8858. Este incluye 1478 pb de la secuencia no traducida 3'. Los intentos por clonar el ADNc del hexón 26 correspondiente al extremo 3' del dominio C2 y el 3' UTR por RACE 3' [Siebert et al. (1995) supra] , PCR inversa [Ochman, H. et al. (1990) Bi otechnol ogy (N.Y.) 8:759-760], PCR del sitio de restricción [Sarkar, G. et al. (1993) PCR Meth . Appl . 2:318-322], PCR "cebada de manera impredecible" [Domínguez, O. et al. (1994) Nucl ei c . Acids Res . .22:3247-3248] y por separación de una biblioteca de ADNc de hígado porcino fallaron. Se intentó la RACE 3' utilizando la misma biblioteca ADN de doble hebra ligado al adaptador, se utilizó exitosamente para clonar el extremo 5' del ADNc del factor VIII porcino. De este modo, la falla de este método no se debió a la ausencia del ADNc correspondiente al hexón 26. Se utilizó un procedimiento de PCR andante del gen dirigido [Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic . Acids . Res . 1_9: 3055-3060] para clonar la mitad 3' del dominio C2. Se sintetizó un cebador sentido que es específico porcino, SEQ ID NO: 17 5' -TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924) basado en la secuencia del dominio C2 inicial y se utilizó en una versión inicial de PCR con cebadores "andantes" no específicos seleccionados de oligonucleótidos disponibles en el laboratorio. Los productos de la PCR fueron entonces dirigidos por análisis de selección del cebador [Parker et al. (1991) BioTechniques K>: 94-101] utilizando un cebador interno específico porcino marcado en el extremo 32P, SEQ ID NO: 18 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952). De manera interesante, de los 40 cebadores no específicos probados, únicamente dos produjeron productos positivos en el análisis de extensión del cebador y esos dos correspondieron a una secuencia humana exacta y una degenerada en el extremo 3' del dominio C2 : SEQ ID NO: 19 5' -GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) y SEQ ID NO: 20 5' -GTAGAGGSTSCTGKCCCTCRCAKCCYAG-3', (nt 7027-7053). Esos cebadores habían sido inicialmente diseñados para producir un producto por RT-PCR convencional pero no produjeron suficiente producto que pudiera ser visualizado por unión de tinte de bromuro de etidio. Sin embargo, pudo ser identificado un producto de PCR por el método de la extensión de cebador más sencillo. Esto producto fue purificado en gel y secuenciado directamente. Esto extendió la secuencia del fVIII porcino 3' al nt 7026. Se obtuvo una secuencia adicional por análisis de extensión del cebador de producto de PCR anidada generada utilizando la biblioteca de ADNc de doble hebra ligada al adaptador utilizada en el protocolo 5' -RACE descrita anteriormente. La primera ronda de reacción utilizó el cebador exacto porcino SEQ ID NO: 21 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (nt 6541-6564) y el cebador API. La segunda reacción se utilizó en SEQ ID NO: 22 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) y el cebador AP2. El secuenciamiento por PCR directa extendió la secuencia 3' al extremo del dominio C2 (nt 7053) . La secuencia del dominio C2 fue única excepto en el nt 7045 cerca del extremo 3' del dominio C2. El análisis de reacciones de PCR repetidas produjo A, G o una doble lectura de A/G en este sitio. El secuenciamiento se extendió hacia 3'UTR utilizando dos cebadores adicionales, SEQ ID NO: 23 5' -GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) y SEQ ID NO: 24 5' -CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031) . Se obtuvieron aproximadamente 15 pb de la secuencia de 3' UTR, aunque la secuencia no fue clara en varios sitios. Se sintetizaron entonces varios cebadores antisentido basados en los mejores estimados de la secuencia no traducida 3' . Esos cebadores incluyeron el complemento inverso del codón de alto TGA en sus términos 3' . Se obtuvieron productos de PCR de ADN genómico de vaso porcino y ADNc de bazo porcino que fueron visualizados por electroforesis sobre gel de agarosa y tinción con bromuro de etilio utilizando un cebador sentido específico SEQ ID NO: 25 5' -AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) y el cebador antisentido 3'UTR, SEQ ID NO: 26 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3' . Para obtener cantidades suficientes de material para propósitos de clonación, se efectúo una segunda ronda de PCR utilizando un cebador sentido anidado, SEQ ID NO: 27 5' -CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) y el mismo cebador antisentido. El producto de la PCR de 141 pb fue clonado en pBlueScript II KS- cortado con EcoRV. Se obtuvo la secuencia de tres clonas derivadas de ADN genómico y tres clonas derivadas de ADNc en ambas direcciones. La secuencia no fue ambigua excepto en el nt 7045, donde el ADN genómico fue siempre A y el ADNc fue siempre G. Alineaciones de secuencias de ADN múltiples de fVIII humano, porcino y de ratón (Figura 1A-1H) . Se efectuaron las alineaciones del péptido señal, donde las regiones Al, A2, A3, Cl y C2 utilizando el programa CLUSTALW [Thompson, J.D. et al. (1994) Nucl eic . Acids . Res . 22:4673-4680]. Las penalidades de espacio abierto y extensión de espacio fueron de 10 y 0.05 respectivamente. Las alineaciones de los dominios B de ratón y cerdo han sido descritas anteriormente [Eider et al. (1993) supra] . La secuencia A2 humana corresponde a los aminoácidos 373-740 en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos A2 porcina está dada en la SEQ ID NO: 4, y la secuencia de aminoácido del dominio A2 de ratón está dada en la SEQ ID NO: 28, aminoácidos 392-759. Ejemplo 6: Expresión de factor VIII porcino sin dominio B recombinante (PB' ) Materiales Los plasmas humanos reunidos de hemofilia A y normal descifrados se compraron de George King Biomedical, Inc. El suero bovino fetal, geniticina, penicilina, estreptomicina, medio DMEM/F12 y medio AIM-V se compraron de Life Technologies, Inc. La ADN polimerasa Taq fue comprada de Promega. La ADN polimerasa Vent fue comprada de New England Biolabs. La ADN polimerasa Pfu y el fagémido pBlueScript II KS" fueron comprados de Stratagene. Los oligonucleótidos sintéticos fueron comprados de Life Technologies o Cruachem, Inc. Las enzimas de restricción fueron compradas de New England Biolabs o Promega. Los cebadores en la posición 5' fueron utilizados cuando los productos de la PCR fueron producidos para propósitos de clonación. La numeración nucleotídica (nt) de los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADNc del fVIII porcino o ADN genómico utiliza el ADNc del fVIII humano como referencia [Wood et al. (1984) Nature 312:330-337]. Un vector de expresión del fVIII designado como HB"/ ReNeo fue obtenido de Biogen, Inc. El HB"/ ReNeo contiene genes de resistencia a la ampicilina y geniticina y un ADNc de fVIII humano que carece de todo el dominio B, definido como el fragmento de escisión Ser741-Argl648 producido por la trombina. Para simplificar la mutagénesis del ADNc del dominio C2 del fVIII, el cual está en el extremo 3' del inserto del fVIII romano en ReNeo, se introdujo un sitio Notl dos bases 3' al codón de alto de HB'/ReNeo mutagénesis de extensión por empalme o superposición (SOE) [Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol . 217 :270-279] . Este constructo se designó como HB" ReNeo/Notl. El ARN total fue aislado por extracción ácido con tiocianato de guanidina-fenol-cloroformo [Chomczynski, P. et al. (1987) Anal . Biochem. 162:156-159]. El ADNc fue sintetizado de ARNm utilizando trasncriptasa inversa de virus de leucemia murina de Moloney (RT) y hexámeros aleatorios de acuerdo a instrucciones suministradas por el fabricante (equipo de síntesis de la primera hebra del ADNc, Pharmacia Biotech) . El ADN plasmídico fue purificado utilizando el equipo Qiagen Plasmid Maxi (Qiagen, Ine) . Las reacciones de PCR se efectuaron utilizando un termocilador Hybaid OmniGene utilizando ADN polimerasa Taq, Vent o Pfu . Los productos de la PCR fueron purificados sobre gel, precipitados con etanol, y ligados en ADN plasmídico utilizando ADN T4 (equipo de ligación rápida de ADN, Boehringer Mannheim) . Los plásmidos que contienen inserto fueron utilizados para transformar células de E. coli Epicurean XLl-Blue. Todas las secuencias de ADN de fVIII novedosas generadas por PCR fueron confirmadas por secuenciamiento con didesoxi utilizando un secuenciador de ADN Applied Biosistems 373a automatizado y el equipo terminador de tinte PRISM. Construcción de un vector de expresión de fVIII híbrido, HP20, que contiene el dominio C2 porcino. Un ADNc de fVIII porcino correspondiente al extremo 3' del dominio Cl y todos los dominios C2 fue clonado en pBlueScript por RT-PCR de ARN total de vaso utilizando cebadores basados en la secuencia de ADNc del fVIII porcino conocido [Healey, J.F. et al (1996) Blood 88 : 4209-4214] . Este constructo y el HB"/ReNeo fueron utilizados como patrones para construir un producto de fusión de Cl humano-C2 porcino en pBlueScript por mutagénesis SOE. El fragmento C1-C2 en este plásmido fue removido con Apal y Notl y ligado en HB~ /ReNeo/Notl cortado con Apal/Notl para producir HP20/ReNeo/NotI. Constructo de fVIII humano/porcino híbrido con el dominio B suprimido que contiene la cadena ligera porcina (HP18)- La cadena ligera del fVIII humano consiste de los aminoácidos residuales Aspl649-Tyr2332. Los residuos correspondientes en el ADNc del fVIII porcino fueron sustituidos por esta región del HB" para producir una molécula de fVIII humano/porcino híbrido designada como HP18. Esto se hizo sustituyendo un producto de PCR correspondiente a la región A2 porcina, el dominio A3, el dominio Cl y parte del dominio C2 para la región correspondiente en el HP20. Para facilitar las construcciones, se introdujo un sitio Avrll sinónimo en el nt 2273 en la unión de los dominios A2 y A3 del HP20 por mutagénesis SOE. Construcción del fVIII humano/porcino híbrido con el dominio B suprimido que contiene el péptido señal , dominio Al y dominio A2 porcinos (HP22) - El péptido señal, el dominio Al y los dominios A2 del fVIII humano consisten de los aminoácidos residuales Met (-19) -Arg740. Los residuos correspondientes en el ADNc del fVIII porcino fueron sustituidos por esta región del HB" para producir una molécula designada como HP22. Adicionalmente, se introdujo un sitio Avrll sinónimo en el nt 2273 en la unión de los dominios A2 y A3 del HP22 por mutagénesis SOE. El HP22 fue concedido por fusión de un péptido señal porcino-Al-fragmento de A2 parcial en pBlueScript [Healy et al. (1996) supra] con un fVIII humano/porcino híbrido sin dominio B que contiene el dominio A2 porcino, designado como HP1 [Lubin et al. (1994) supra ] . Construcción del fVIII sin dominio B porcino- (PB") El fragmento Spel/Notl del HP18/BS (+AvrII) fue digerido con Avrll/Notl y ligado en HP22/BS (+AvrII) digerido con Avrll/Notl para producir un constructo PB"/BS (+ AvrJJ) el cual consiste del fVIII porcino que carece de todo el dominio B. El PB- fue clonado en ReNeo ligando un fragmento de Xba/Notl del PB"/BS (+AvrII) en el HP22/ReNeo/NotI ( + Avr 11) . Expresión de moléculas de fVIII recombinante. El PB'/ReNeo/Notl ( +AvrII) y el HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) fueron transfectados transitoriamente en células COS y expresados como se describió anteriormente [Lubin, I.M. et al. (1994) J. Biol . Chem . 269:8639-8641]. El HB"/ReNeo/NotI y no el ADN (simulado) fueron transfectados como control.

La actividad del fVIII del PB", HP22, y HB" fueron medidas por un ensayo cromogénico como sigue. Muestras de fVIII en sobrenadantes de cultivo de células COS fueron activadas por trombina 40nM NaCl 0.15, HEPES 20mM, cAC12 5Mm, Tween-80 0.01%, pH 7.4 en presencia de factor Ixa lOnM, factor IXa 425 nM, y fosfatidilserina unilamelar 50 µm [vesículas de fosfatidilcolina (25/75 p/p) . 5 minutos después, la reacción fue detenida con EDTA 0.05 M y desulfatoiridio recombinante 100 nM y el factor Xa resultante fue medido por el ensayo de sustrato cromogénico. En el ensayo de sustrato cromogénico, se agregó espectrozima Xa 0.4mM y la velocidad de liberación de para-nitroanilina fue medida midiendo la absorbencia de la solución 405nm. Los resultados de sobrenadantes de cultivo celular por duplicado transportados independientemente (absorbencia a 405 nm por minuto) HB": 13.9 PB": 139 HP22: 100 simulado: <0.2 Esos resultados indican que el fVIII sin dominio B porcino y el fVIII sin dominio B consisten de las subunidades Al y A2 porcinas son activos y sugieren que tienen actividad superior a la del fVIII sin dominio B humano.

El PB" fue purificado parcialmente y concentrado del medio de crecimiento por cromatografía con heparina- Sefaróse. La heparina-Sefaróse (10 ml) fue equilibrada con NaCl 0.075 M, HEPES 10 mM, CaCl2 2.5mM, Tween-80 al 0.005%, azida de sodio al 0.02%, pH 7.40. El medio (100-200ml) para las células expresantes fue aplicado a la heparina-Sefarose, la cual fue entonces lavada con 30 ml de amortiguador de equilibrio sin azida de sodio. El PB" fue eluído con NaCl 0.65 M, HEPES 20 mM, CaCl2 5mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.40 y se almacenó a -80 °C. El rendimiento de la actividad coagulante del factor fVIII fue típicamente de 50-75%. Expresión estable del fVIII sin dominio B porcino (PB") Se mantuvieron líneas celulares transfectadas en medio F12 de Eagle modificado de Dulbecco con un contenido del 10% de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50µg/ml de estreptomicina. El suero bovino fetal fue inactivado con calor a 50°C durante una hora antes de sus uso. El HB'/ReNeo y el PB"ReNeo/NotI (+ Avrll) fueron transfectados de manera estable en células BHK y seleccionados por su resistencia a la geniticina utilizando un protocolo general que ha sido descrito anteriormente [Lubin et al. (1994) Biol . Chem. 269: 8639-8641] excepto que las células expresantes fueron mantenidas en medio de crecimiento que contenida 600µg/ml de geneticina. Las células de los matraces Corning T-75 crecieron hasta la confluencia donde se transfirieron a matraces tiples Nunc en un medio que contenía 600µg/ml de geneticina y crecieron hasta la confluencia. El medio fue removido y reemplazado con medio AIM-V libre de suero (Life Technologies, Inc.) sin geneticina. La expresión del factor VIII fue identificada por la actividad coagulante del factor VIII de una etapa ( vide supra) y se recolectaron 100-150 ml de medio una vez al dia durante 4 horas por cinco días. Los niveles de expresión máxima en el medio para HB" y PB" fueron de 102 unidades por ml y 10-12 unidades por ml de actividad coagulante del factor VIII, respectivamente. Purificación de PB" El PB" fue precipitado de sobrenadante de cultivo utilizando sulfato de amonio saturado al 60% y a continuación purificado por cromatografía de inmunoafinidad W3-3 y cromatografía de líquidos de alta presión mono Q como se describió anteriormente para la purificación del factor VIII porcino derivado de plasma [Lollar et al. (1993) Factor VIH/factor Villa. Methods Enzymol . 222:128-143.] la actividad coagulante especifica del PB" fue medida por un ensayo de coagulación de una etapa [Lollar et al. (1993) supra] y fue similar al factor VIII porcino derivado del plasma .

Cuando se analizó por electroforesis sobre SDS-poliacrilamida, la preparación de PB" contenía tres bandas masas moleculares aparentes de 160 kDa, 82 kDa, y 76 kDa. Las bandas de 82 kDa y 76 kDa han sido descritas anteriormente como heterodimeros que contienen los dominios A1-A2 y ap-A3-C1-C2 (donde ap se refiere a un péptido de activación) [Toóle et al. (1984) Na ture 312:342-347] . La banda 160 kDa fue transferida a una membrana de fluoruro de polivinilideno y sometida a secuenciamiento de NH2-terminal, el cual produjo Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (donde Xx representa un indeterminado) la cual es la secuencia NH2-terminal del factor VIII de una sola cadena [Toóle et al. (1984) supra] . De este modo, el PB" es procesado parcialmente por escisión entre los dominios A2 y A3, de modo que este consiste de dos formas, proteína A1-A2-ap-A3-Cl-C2 de una sola cadena y un heterodímero Al-A2/ap-A3-C1-C2. Ha sido reportado un procesamiento similar al HB" recombinante [Lind et al. (1995) Eur. J. Bi ochem . 232:19-27] . Caracterización del factor VIII porcino Hemos determinado la secuencia del ADNc del fVIII porcino correspondiente a 137 pb del 5' UTR, la región codificadora del péptido señal (57 pb) , y los dominios Al (1119 pb) , A3 (990 pb) , Cl (456 pb) , y C2 (483 pb) . Aunque con la secuencia publicada anteriormente del dominio B y las regiones del péptido de activación de la cadena ligera [Toóle et al. (1986) supra] y el dominio A2 [Lubin et al. (1994) supra] , la secuencia reportada aquí completa la determinación del ADNc del fVIII porcino correspondiente al producto traducido. Un fragmento que incluyo la región 5' UTR, el péptido señal, y el ADNc del dominio Al fue clonado utilizando un protocolo de RT-PCR de 5' -RACE. Un cebador basado en la secuencia C2 humana fue exitoso para producir un producto de RT-PCR que condujo a la clonación del dominio A3, Cl y semi 5' del C2. El ADNc correspondiente al semi 3' del dominio C2 y el ADNc de 3' UTR probaron ser difíciles de clonar. El resto del dominio C2 finalmente fue clonado por un procedimiento de PCR andante del gen objetivo [Parker et al. (1991) supra ] . La secuencia reportada aquí SEQ ID NO: 29 fue inambigua excepto en el nt 7045 cerca del extremo 3' del dominio C2, el cual es A o G como se describió anteriormente. El codón correspondiente GAC (Asp) o AAC (Asn) . Los codones humano y de ratón son GAC y CAG (Gln) , respectivamente. Si esto representa un polimorfismo o un artefacto de PCR reproducible se desconoce. Los ADNc de fVIII sin dominio B humano/porcino híbrido recombinante que contienen sustituciones de dominio C2 porcino correspondientes a ambos de los codones GAC y AAC han sido expresados de manera estable sin diferencia detectable en la actividad procoagulante. Esto indicó que no existe una diferencia funcional entre esas dos variantes del dominio C2. La alineación de la secuencia de aminoácidos predicha de la SEQ ID NO: 30 del fVIII porcino de longitud completa con las secuencias humana [Wood et al. (1984) supra] y murino [Eider et al. (1993) supra ] se muestra en la Figura 1A-1H junto con sitios para la modificación postranslacional, escisión proteolítica y reconocimiento por otras macromoléculas. El grado de identidad de las secuencias alineadas se muestra en la Tabla VII. Como se hizo notar anteriormente, los dominios B de esas especies son más divergentes que los dominios A o C. Esto es consistente con la observación de que el dominio B no tiene función conocida, a pesar de su gran tamaño [Eider et al. (1-393) supra; Toóle et al. (1986) supra] . Los resultados de la presente invención confirman que el dominio B del fVIII porcino no es necesario para la actividad. Sobre la base de los datos de secuencia presentados aquí, el fVIII porcino tiene toda o parte del dominio B suprimido puede ser sintetizado el ADN que codifica para el fVIII porcino que tiene suprimidos del mismo todo o parte de los codones del dominio C porcino. También existe más divergencia de secuencias correspondientes al dominio del péptido de escisión de APC del dominio Al/del factor IXa (residuos 337-372) y el péptido de activación de la cadena ligera (Tabla VII) . El sitio de escisión de trombina en la posición 336 para generar el péptido 337-372 se pierde aparentemente en el ratón debido a que este residuo es glutamina en lugar de arginina [Eider et al. (1993) supra] . La divergencia relativamente rápida de los péptidos de escisión de trombina (o en el fVIII de ratón un péptido de activación 337-372 posiblemente vestigial) ha sido previamente notado por los fibrinopéptidos [Creighton, T. E. (1993) En Proteins: Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman, New York, pp. 105-138] . La ausencia de función biológica de esos péptidos una vez escindidos ha sido citada como una posible razón para la rápida divergencia. Se ha propuesto que la Arg562 en el fVIII humano es el sitio de escisión más importante para la proteína C activada durante la inactivación del fVIII y fVIIIa [Fay, P. J. et al. (1991) J. Bi ol . Chem. 266:20139-20145] . Este sitio está conservado en el fVIII humano, porcino y de ratón. Los sitios de glicosilación ligados a N potenciales (NXS/T donde X no es prolina) pueden ser observados en las Figuras 1A-1H. Existen ocho sitios de glicosilación ligados a N conservados: uno en el dominio Al, uno en el dominio A2, cuatro en el dominio B, uno en el dominio A3, y uno en el dominio Cl. Las 19 cisteínas en los dominios A y C están conservadas, mientras que existe divergencia de las cisteínas del dominio B. Seis de los siete enlaces disulfuro en el fVIII se encuentran en sitios homólogos en el factor V y la ceruloplasmina, y ambos enlaces disulfuros del dominio C se encuentran en el factor V [McMullen, B. A. et al. (1995) Protein Sci . 4:740-746], El fVIII humano contiene tirosinas sulfatadas en las posiciones 346, 718, 719, 723, 1664 y 1680 [Pittman, D. D. et al. (1992) Biochemi stry 31:3315-3325; Michnick, D. A. et al (1994) J. Biol . Chem. 269:20095-20102] . Esos residuos están conservados en el fVIII de ratón y el fVIII porcino (Figura 1), aunque el programa CRUSTALW falló en alinear la tirosina de ratón correspondiente a la Tyr346 en el fVIII. El plasma de ratón y cerdo puede corregir el efecto de coagulación en el plasma de hemofilia A humana, lo cual es consistente con el nivel de conservación de los residuos en los dominios A y C de esas especies. La actividad procoagulante del fVIII porcino es superior a la del fVIII humano [Lollar, P. et al. (1992) J. Biol . Chem . 267:23652-23657]. El factor VIII porcino recombinante (con el dominio B suprimido) expresado y purificado como se describe aquí también presenta una actividad coagulante específica mayor que el fVIII humano, siendo comparable a la del fVIII porcino derivado del plasma. Esto puede deberse a una velocidad de disociación espontánea disminuida de la subunidad A2 del heterodímero de fVIII 2A A1/A2/A3-C1-C2 activo. Si esta diferencia en la actividad procoagulante refleja un cambio evolutivo en la función como un ejemplo de adaptación de las especies [Perutz, M. F. (1996) Adv. Protein Chem. 36:213-244] se desconoce. Ahora que la secuencia del ADNc del fVIII correspondiente al producto traducido está completa, la mutagénesis de exploración homologa [Cunningham, B. C, et al. (1989) Sci ence 243 : 1330-1336] puede proporcionar una formar de identificar diferencias estructurales entre el fVIII humano y porcino que sean responsables de la actividad superior del último. El fVIII es típicamente menos reactivo con anticuerpos inhibidores que surjan en hemofílicos que hayan sido transfundidos con fVIII o que surjan como anticuerpos en la población general. Esta es la base para utilizar concentrado de fVIII porcino en el manejo de pacientes con anticuerpos inhibidores [Hay y Lozier (1995) supra] . La mayoría de los inhibidores son dirigidos contra epítopos localizados en el dominio A2 o el dominio C2 [Fulcher, C. A. et al. (1985) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 82:7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 85:6152-61156; Scandella, D. et al. (1989) Bl ood 74:1618-1626] . Adicionalmente, ha sido identificado un epítopo de significado desconocido que está en el dominio A3 o Cl [Scandella et al. (1989) supra ; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. Et al. (1994) Blood 84:224a]. Ha sido trazado el mapa del epitopo A2 en los residuos 484- 508 por mutagénesis de exploración homologa [Healey et al. (1995) supra ] . En este segmento de 25 residuos, existe una proporción relativamente baja de secuencia idéntica (16/25 ó 64%) . Es interesante que esta región, la cual parece funcionalmente importante sobre la base del hecho de que los anticuerpos para esta son inhibidores, aparentemente ha sido sometida a un arrastre genético relativamente más rápido. La alineación del dominio A2 y los dominios A3 porcino indica que el epítopo A2 no comparte homología detectable con la región correspondiente en el dominio A3. Se ha propuesto que el epítopo inhibidor de C2 del fVIII humano se localiza dentro de los residuos 2248-2312 por medio de trazos de mapas de supresión [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819] . El fVIII humano y porcino son 83% idénticos en este segmento de 65 residuos. Sin embargo, la mutagénesis de exploración de homología de esta región para caracterizar el epítopo C2 ha revelado que un determinante mayor del epítopo C2 se localizaba inesperadamente en la región correspondiente a los aminoácidos humanos 2181-2243 (SEQ ID NO: 2) y Figura ÍH. Se produjeron proteínas de factor VIII híbridas humanas-porcinas en las cuales fueron reemplazadas varias porciones del dominio C2 del factor VIII humano por las porciones correspondientes del factor VIII porcino, utilizando la estrategia descrita aquí. (Ejemplo 5) Se efectuó la síntesis de los diferentes factores VIII híbridos con C2 construyendo ADN de codificación híbrido, utilizando la secuencia nucleotidica que codifica para la región C2 porcina dada en la SEQ ID NO: 30. Cada ADN híbrido fue expresado en células transfectadas, de modo que el factor VIII híbrido pudiera ser purificado parcialmente del medio de crecimiento. La actividad, en ausencia de cualquier inhibidor, fue medida por el ensayo de coagulación en una etapa. Se utilizó una batería de cinco inhibidores humanos para probar cada factor VIII híbrido. Se ha demostrado previamente que los plasmas inhibidores que contienen anticuerpo antifactor VIII están dirigidos contra el dominio C2 humano, sobre la base de la capacidad del dominio C2 humano recombinante para neutralizar la inhibición. En todos los plasmas de prueba, el título de inhibidor fue neutralizado en más del 79% por el dominio C2 o la cadena ligera pero menos del 10% por el dominio A2 humano recombinante. Además los factores VIII con C2 fueron probados contra un anticuerpo monoclonal murino, el cual se une al dominio C2, y anticuerpos inhibidores de C2 humanos similares, que inhibieron la unión del factor VIII de fosfolípido a un factor de von Willebrand.

Comparando los títulos de inhibidor de anticuerpo contra factores VIII híbridos de C2, el determinante mayor del epítopo inhibidor de C2 humano mostró ser una región de los residuos 2181-2243 (SEQ ID NO: 2, véase también la Figura ÍH) . Los anticuerpos anti-C2 dirigidos a una región COOH-terminal al residuo 2253 no fueron identificados en cuatro de los sueros de cinco pacientes . En comparación los híbridos que tienen la secuencia porcina correspondiente a los aminoácidos residuales números 2181-2199 y 2207-2243, fue evidente . que ambas regiones contribuyen a la unión del anticuerpo. La secuencia de aminoácidos porcina correspondiente a dos residuos humanos 2181-2243 se numeró como 1982-2044 en la SEQ ID NO: 30. La secuencia del ADN porcino que codifica para los aminoácidos porcinos numerados como 1982-2044 es la de los nucleótidos numerados como 5944-6132 en la SEQ ID NO: 29. Refiriéndose a la Figura ÍH, puede observarse que en la región 2181-2243, existen 16 aminoácidos diferentes entre las secuencias humana y porcina. Las diferencias se encuentran en los residuos 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 y 2243. Puede llevarse a cabo el reemplazo de aminoácidos en uno o más de esos residuos numerados para producir un factor VIII humano modificado no reactivo con anticuerpos inhibidores anti-C2 humanos. La mutagénesis de exploración de Alanina proporciona un método conveniente para generar sustituciones de alanina por residuos naturales, como se describió anteriormente. También pueden ser sustituidos otros aminoácidos diferentes a la alanina, como se describe aquí. Las sustituciones de alanina por aminoácidos individuales, especialmente aquellos que no son idénticos entre humano/porcino o humano/ratón porque es muy probable que contribuyan a la unión del anticuerpo, pueden producir un factor VIII modificado con actividad reducida para anticuerpos inhibidores. Las Figuras 1A-1H tomadas juntas proporciona una comparación de secuencia alineada de la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano, de cerdo y ratón. La Figura ÍA compara las regiones del péptido señal (humana SEQ ID NO: 31; porcina, SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1-19; murina, SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1-19) . Nótese que los aminoácidos en las Figuras 1A-1H están numerados en la primera Alanina de la proteína madura como número 1, con los aminoácidos del péptido señal con números negativos asignados. La secuencia del fVIII humano de la SEQ ID NO: 2 también comienza con la primera alanina de la proteína madura como aminoácidos número 1. En las secuencias de aminoácidos del fVIII de ratón (SEQ ID NO: 28) y el fVIII porcino (SEQ ID NO: 30), el primer aminoácidos (alanina) de la secuencia madura es el aminoácido número 20. La Figura 1A-1H muestra una alineación de las secuencias correspondientes del fVIII humano, de ratón y cerdo, de modo que las regiones de mayor identidad de aminoácidos están yuxtapuestas. Los números de aminoácidos en las Figuras 1A-1H se aplican al fVIII únicamente. La Figura IB da la secuencias de aminoácidos para el dominio Al de humano (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1-372), porcino (SEQ ID NO: 30, aminoácidos 20-391), y murino (SEQ ID NO: 28, aminoácidos 20-391). La Figura 1C proporciona las secuencias de aminoácidos para los dominios A2 del factor VIII para humano (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 373-740), cerdo (SEQ ID NO: 30, aminoácidos 392-759) y ratón (SEQ ID NO: 28, aminoácidos 392-759) . La Figura ID proporciona las secuencias de aminoácidos de dominios B del factor VIII (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 741-1648), cerdo (SEQ ID NO: 30, aminoácidos 760-1449), y ratón (SEQ ID NO: 28, aminoácidos 760-1640) . La Figura ÍE compara las secuencias de aminoácidos de los péptidos de activación de la cadena ligera del factor VIII de humano, cerdo y ratón (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1649-1689; SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1450-1490; y SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1641-1678, respectivamente) . La Figura 1F proporciona la comparación de secuencia para los dominios A3 del factor VIII humano, de cerdo y ratón (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1690-2019; SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1491-1820; y SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1679-2006, respectivamente. La Figura 1G proporciona secuencias de aminoácidos para los dominios Cl del factor VIII de humano, cerdo y ratón (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 2020-2172; SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1821-1973; y SEQ ID NO: 28, aminoácidos 2007-2159, respectivamente) . La Figura ÍH proporciona datos de secuencia para los dominios C2 de los dominios C2 del factor VIII de humano, cerdo y ratón, (SEQ ID NO: 2, aminoácidos 2173-2332; SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1974-2133; y SEQ ID NO: 28, aminoácidos 2160-2319, respectivamente) . Los diamantes representan sitios de sulfatación de tirosina, sitios de unión propuestos para el factor IXa, el fosfolípido y la proteína C están doblemente subrayados, y las regiones implicadas en anticuerpos inhibidores anti-A2 y anti-C2 de inhibición están en itálicas. Los asteriscos resaltan la secuencia de aminoácidos que están conservadas. Véase también la SEQ ID NO: 29 (ADNc de factor VIII porcino) y SEQ ID NO: 30 (secuencia de aminoácidos deducida del factor VIII porcino) . El sistema de numeración humano es utilizado como referencia [Wood et al. (1984) supra] . Los dominios Al, A2 y B son definidos por sitios de escisión de trombina en las posiciones 372 y 740 y un sitio de escisión de proteasa desconocido en 1648 como residuos 1-372, 373-740 y 741-1648, respectivamente [Eaton, D. L. et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347]. Los dominios A3, Cl y C2 son definidos como residuos 1690-2019, 2020-2172 y 2173-2332, respectivamente [Vehar et al. (1994) supra ] . Los sitios de escisión para la trombina (factor lía), factor IXa, factor Xa y APC [Fay et al. (1991) supra ; Eaton, D. et al. (1986) Biochemi stry 25;505-512; Lamphear, B. J. et al. (1992) Blood 80:3120-3128] se muestran colocando el nombre de la enzima sobre la arginina reactiva. Un péptido ácido es escindido de la cadena ligera del fVIII por la trombina o factor Xa en la posición 1689. Los sitios de unión propuestos para el factor IXa [Fay, P. J. et al (1994) J. Biol . Chem. 269:20522-20527; Lenting, P. J. et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:7150-7155) , fosfolípido (Foster, P. A. et al. (1990) Bl ood 75:1999-2004) y proteína C (Walker, F. J. et al. (1990) J. Biol . Che . . 265: 1484-1489] están doblemente subrayados. Las regiones implicadas en el anti-A2 de unión [Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra] ; y los anticuerpos inhibidores anti-C2 propuestos previamente están en itálicas. El epítopo inhibidor de C2 identificado como se describe aquí (aminoácidos humanos 2181-2243) mostrado por un solo subrayado en la Figura ÍH. Los sitios de sulfatación de tirosina [Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994 supra ] son mostrados por . Ejemplo 7: Construcción de POL1212 y Expresión en Células de Riñon de Hámster Bebe El POL1212 es un factor VIII porcino parcialmente sin dominio B, que tiene el dominio B suprimido excepto que 12 aminoácidos de NH2 terminal del dominio B y 12 aminoácidos del -COOH terminal están retenidos. Los ADNc que codifican para las secuencias para los dominios del fVIII porcino Al, A2, ap-A3-Cl, y C2, se obtuvieron como se describió en el Ejemplo 5. La secuencia nucleotídica del ADN y la secuencia de aminoácidos derivada del factor VIII porcino son presentadas como SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, respectivamente. Los fragmentos amplificados fueron clonados por separado en el plásmido pBluescript II KS" (pBS) . El POL1212 se refiere al ADNc que codifica para el fVIII porcino que carece de la mayoría del dominio B, pero que contiene la secuencia de ADN que codifica para un enlazante de 24 aminoácidos entre los dominios A2 y ap. El POL1212 fue construido en un vector de expresión de mamífero, ReNeo el cual fue obtenido de Biogen. El ReNeo puede reproducirse en bacterias, reproducirse como un episoma en células COS para la expresión transitoria del factor VIII, o ser integrado de manera estable en una variedad de células de mamífero. Este consiste de 1) secuencias derivadas del plásmido pBR322 que incluyen un origen de reproducción y un gen de resistencia a la ampicilina, 2) un gen de resistencia a la neomicina, cuya expresión está bajo el control del promotor/amplificador del SV40, el intrón t pequeño de SV40, y los elementos reguladores de la señal de poliadenilación del SV40, 3) un sitio para la inserción del fVIII y su péptido señal, la expresión del cual es bajo el control del amplificador mejorador del SV40, promotor tardío mayor del tipo 2 de adenovirus, y secuencia líder tripartita del tipo 2 de adenovirus. Puede ser utilizado cualquier vector que tenga componentes funcionales similares en lugar del vector ReNeo. El POL1212ReNeo fue preparado en varios pasos. Primero, los ADNc que codifican para la cadena pesada del fVIII porcino (A1-A2) y los ADNc que codifican para la cadena ligera del fVIII porcino (ap-A3-Cl-C2) fueron montados por separado en pBS . De esos constructor, el ADNc que codifica para el fVIII sin dominio B, fue montado en pBS (PB-/pBS) . Esta forma del fVIII porcino carece de todo el dominio B, definido como aminoácidos correspondientes a los residuos 741 - 1648 en el fVIII humano (nucleótidos humanos 2278 - 5001) . A continuación, el ADN que codifica para el A2 porcino fue sustituido por el dominio A2 humano en el vector de expresión fVIII sin dominio B humano ReNeo (HB-/ReNEo) . El ADN que codifica para el resto de la cadena pesada porcina y el ADN que codifica para la cadena ligera porcina fue sustituido por los dominios humanos en dos pasos adicionales utilizando constructos de cadena pesada porcina/pBS y PB-/pBS producidos anteriormente. Un fragmento del dominio B humano que codifica para los 5 aminoácidos C terminal y 9 N-terminal, fue insertado entre los dominios A2 y A3, produciendo un constructo llamado PSQ/ReNeo [Healey et al. (1998) 92:3701-3709]. Los residuos Glu2181-Val2243 contienen un determinante mayor del epítopo inhibidor en el dominio C2 del factor VIII) . Este constructo fue utilizado como patrón para producir un fragmento del dominio B porcino que codifica para los 12 aminoácidos C-terminal y 12 N-terminal. Este fragmento fue insertado entre los dominios A2 y A3, dando como resultado el constructo final, POL1212/ReNeo. El enlazante de 24 aminoácidos POL1212 consiste de los primeros 12 y los últimos 12 residuos del dominio B del fVIII porcino. El enlazante POL1212 tiene la siguiente secuencia: SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR. (SEQ ID NO: 32) La secuencia nucleotídica correspondiente al enlazante 1212 y los aminoácidos circundantes es: GTC ATT GAA CCT AGG AGC TTT GCC CAG AAT TCA AGA CCC CCT AGT GCG (SEQ ID NO: 33) V I E P R S F A Q N S R P P S A GC GCT CCA AAG CCT CCG GTC CTG CGA CGG CAT CAG AGG GAC ATA S A P K P P V L R R H Q R D I AGC CTT CCT ACT S L P T El enlazante POL1212 fue sintetizado por mutagénesis de extensión por empalme por superposición (SOE) , como sigue: Las reacciones de PCR utilizadas para producir productos de SOE fueron las siguientes: REACCIÓN #1 Cebador externo: Rev 4, el cual es un cebador A2 porcino, nucleótidos 1742-1761. (SEQ ID NO:29). La secuencia es 5'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (SEQ ID NO:34). Cebador interno: 0L12, el cual es un cebador inverso porcino que cubre los primeros 15 aminoácidos (5') del OL1212 y los últimos 5 aminoácidos (3') del A2 porcino. La secuencia es: 5'-CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTCAATG AC-3' (SEQ ID NO: 35) . Patrón : PSQ/ReNeo. Producto: ADN porcino del nucleótido 1742 en el dominio A2 a 2322 en el OL1212, 580 pb . REACCIÓN #2 Cebador externo: El P2949 es un cebador A3 inverso porcino, nucleótidos 2998-3021 de la SEQ ID NO:29.

La secuencia es: 5' -GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (véase la SEQ ID NO: 29) . Cebador interno: 0L12+, un cebador porcino que cubre los últimos 16 aminoácidos (3') del OL1212 y los primeros 6 aminoácidos (5') del péptido de activación, nucleótido 2302-2367 de la SEQ ID NO:29. La secuencia es: 5'-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATAAGCC TTCCTACT-3' (SEQ ID NO:36). Patrón : PSQ/ReNeo-. Producto: Porcino del nucleótido 2302 en el OL1212 al nucleótido 3021 en el dominio A3, 719 pb. REACCIÓN DE SOE Cebadores : Rev 4, P2949-. Patrones : Fragmento de rxn #1 (pb) y fragmento de bajo punto de fusión de rxn #2 (pb) . Producto: ADN porcino del nucleótido 1742 en el dominio A2 al nucleótido 3021 en el dominio A3 (SEQ ID NO:29), incluyendo el OL1212, 1279 pb. El producto de reacción fue precipitado con etanol. El enlazante 1212 fue insertado en el PSQ/ReNeo cortando el producto de SOE (inserto) y el PSQ/ReNeo (vector) con BsaB I. El vector y el inserto fueron ligados utilizando ligasa T4 y el producto fue utilizado para transformar células de E. coli XLl-Blue. El ADN plasmídico fue preparado de varias colonias, y la secuencia del enlazante 1212 y otras secuencias generadas por PCR fueron verificadas por análisis de secuencia de ADN. CULTIVO DE CÉLULAS CRL-1632 DE RIÑON HÁMSTER BEBE (BHK) Se obtuvo una línea celular de BHK de la ATCC, identificación de acceso CRL-1632 y se almacenó a -20°C hasta su uso adicional. Las células fueron descongeladas a 37°C y colocadas en 10 ml de medio completo, definido como DMEM/F12, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina más 10% de suero bovino fetal (FBS) . El FBS fue comprado de Hyclone, Logan Utah. Las células fueron centrifugadas durante 2 minutos a 300 RPM. El medio fue aspirado y las células fueron resuspendidas en dos ml de medio completo en un matraz T-75 que contenia 20 ml de medio completo. El POL1212 ha sido expresado en células de riñon de hámster bebe (BHK) y ovario de hámster Chino (CHO) . Se utilizaron dos líneas de BHK, la línea CRL-1632 de la ATCC y otra línea de BHK obtenida de R. Mcgillivray, Universidad de la Columbia Británica, [Funk, et al. (1990) Biochemistry 29:1654-1660]. Las últimas fueron cultivadas sin selección en el laboratorio del inventor y designadas como BHK1632 (Emory) . La linea celular de CHO fue la CHO-Kl, acceso ATCC CCL-61. La expresión de la clona promedio de la línea celular de Emory y de la célula CHO-Kl fue un tanto mayor que la de las células CRL-1632 a juzgar por la actividad del ensayo cromogénico. Las células que crecieron en el matraz T-75, formaron una monocapa confluente. Se prepararon 60 ml de cultivo de células de E. coli XLl-Blue en LB/ampicilina (50 mg/ml) que contenían el plásmido POL1212/ReNeo . TRANSFECCION DE CÉLULAS BHK CRL-1632 CON POL1212/ReNeo El ADN del cultivo nocturno de células POL1212/ReNeo XLl-Blue fue preparado utilizando un equipo Qiagen, Valencia, CA Spin Miniprep. Un matraz de las células CRL-1632 fue dividido en un matraz patrón con 0.2 ml y un matraz para transfección con 0.3 ml de 2 ml en total. El otro matraz fue alimentado con medio fresco. El medio fresco fue DMEM/F12 + 10% de FBS Hyclone + 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina. Las células CRL-1632 fueron divididas en placas de 6 pozos a una confluencia de 50-90% para transfección (0.3 ml de células del matraz T-75 en 2 ml de Versene 1:5000 [Life Technologies, Gaithersburg, MD] en cada pozo) utilizando el DMEM/F12 + 10% de FBS Hyclone + 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina fresco. Las siguientes soluciones fueron preparadas en tubos de prueba de 1-2 ml estériles; A) 48 µl (10 µg) de ADN de POL1212/ReNeo Miniprepr más µl de medio sin suero (DMEM/F12) más 10 µl de LipofectinMR (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . B) 10 µl de Lipofectin más 190 µl de medio (transfección simulada) se mezclaron suavemente y el ADN y el Lipofectin se dejaron reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, las células fueron lavadas dos veces con 2 ml de DMEM/F12. A continuación se agregaron 1.8 ml de DMEM/F12 a las células. El complejo de ADN/Lipofectin fue agregado por goteo a las células, y agitado suavemente para mezclar. Las células permanecieron en el incubador durante la noche. Se removió el ADN/Lipofectin y se agregaron 3 ml de medio con suero a las células. Las células se incubaron 30-48 horas. La Geniticina de compró de Life Technologies, Gaithersburg, MD. Los cultivos celulares fueron divididos 1:20, 1:50, y 1:100, 1:250, 1:500 sobre placas de 10 cm en 10 ml de medio con suero que contenía 535 µg/ml de geneticina. Durante los siguientes varios días las células no absorbieron al plásmido POL1212/ReNeo murieron debido a la presencia de geneticina. Las células restantes continuaron reproduciéndose en geneticina, formando colonias de monocapas visibles sobre las placas.

EXPRESIÓN Y ENSAYO DE POL1212 DE CÉLULAS BHK CRL-1632 Se colocaron anillos cilindricos de plástico pequeños alrededor de las colonias. Las colonias fueron aspiradas por separado utilizando medio completo y transferidas a tubos de prueba. Esas colonias son referidas como 'colonias clonadas en anillo. Las colonias clonadas en anillo fueron cultivadas por separado en placas de 24 pozos y se hicieron crecer en medio completo. ENSAYO DE SUSTRATO CROMOGENICO PARA LA EXPRESIÓN DEL FACTOR VIII POR CÉLULAS CRL-1632 TRANSFECTADAS Las muestras de POL1212 de las células de cultivo celular fueron mezcladas con factor IXa porcino purificado con 50 nM y vesículas de fosfatidilcolina/fosfatidilserina (PCPS) 0.05 mM en NaCl 0.15 M, HEPES 20 m, CaC12 5 mM, Tween 80 0.01%, pH 7.4. Como control, se utilizó medio de cultivo celular para células transfectadas de manera simulada. Se agregaron trombina y factor X simultáneamente a concentraciones finales de 40 y 425 nM, respectivamente. La trombina activa al factor VIII, el cual entonces, junto con PCPS, sirve como cofactor para el factor IXa durante la activación del factor X. 5 minutos después, la activación del factor X por el factor IXa/factor VlIIa/PCPS fue detenida por la adición 17 de EDTA a una concentración final de 50 mM. Al mismo tiempo la activación del factor VIII por la trombina fue detenida por la adición del inhibidor de trombina, desulfatohirudina recombinante, a una concentración final de 100 nM. Se transfirió una muestra de 25 µl de mezcla de reacción a un pozo microtitulador, al cual se agregaron 74 µl de Spectozyme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT) , el cual es un sustrato cromogénico para el factor Xa. La concentración final de la Spectrozyme Xa fue de 0.6 mM. La absorbancia a 405 nm debido a escisión de Spectrozyme Xa por el factor Xa fue verificada continuamente durante 5 minutos con un Lector de Placas de Vmax Cinética (Molecular Devices, INc, Menlo park, CA) . Los resultados se expresan en términos de A405/min.

Ensayo cromogénico del factor VIII de diez colonias clonadas en anillo Esos resultados muestran que todas las colonias que fueron seleccionadas expresan factor VIII que es al menos diez veces mayor que la del fondo. La actividad del medio de la colonia 8, la cual fue la colonia de la expresión, fue examinada adicionalmente por un ensayo de coagulación de factor VIII de una etapa. En este ensayo, se incubaron 50 ml de plasma deficiente del factor VIII (George King Biomedical Overland Park, KA) , 5 ml de muestra o estándar, y 50 ml de reactivo de tiempo de tromboplastina particulada activada (Organon Teknika, Durham, NC) 3 minutos a 37°C. Las muestras incluyen medios de la colonia 8 diluido en NaCl. 0.15 M, hepes mM, pH 7.4 (HBS) o, como control, medio completo. La coagulación fue iniciada por la adición de 50 ml de CaC12 20 mM. El tiempo de coagulación fue medido utilizando un Instrumento de Coagulación ST4 BIO (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) . Se obtuvo una curva estándar haciendo diluciones del plasma humano normal cifrado, reunido, lote 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA) . La concentración del factor VIII del estándar fue de 0.9 unidades por ml .

Curva Estándar: Dilución U/ml Tiempo de Coagulación 1) Sin diluir 0.96 45.2 2) 1/3 (HBS) 0.32 53.7 3)1/11 (HBS) 0.087 62.5 4) 1/21 (HBS) 0.046 68.9 La regresión lineal de los tiempos de coagulación contra el logaritmo de la concentración del estándar produjo un coeficiente de correlación de 0.997. La sustancias dan los siguientes tiempos de coagulación, los cuales fueron convertidos a unidades por ml utilizando la curva estándar: Estos resultados muestran que la actividad de coagulación de la colonia 8 es de aproximadamente 2000 veces mayor que la de muestra control. La secuencia de ADN que codifica para POL1212 se expone como SEQ ID NO: 37. La secuencia de aminoácidos codificada de POL1212 se expone como SEQ ID NO: 38. La purificación adicional de POL1212 puede llevarse a cabo utilizando una variedad de métodos conocidos tales como la cromatografía de inmunoafinidad y cromatografía CLAP-véanse los Ejemplos 2 y 3.

OBSERVACIONES SOBRE LAS CONCLUSIONES GENERALES Se comprenderá que pueden ser introducidas variaciones menores de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de ADN que codifica para tal secuencia en relación al POL1212 sin afectar los atributos esenciales de su función. Por ejemplo, la longitud de la secuencia del dominio B retenida como un enlazante/entre el dominio Al2 y el péptido de activación puede incrementarse o disminuir dentro de límites conocidos en la técnica. Pueden ser introducidas variantes de secuencia en la región del enlazante reteniendo a la vez los atributos funcionales equivalentes del POL1212 como se enseña aquí y del factor VIII sin dominio B porcino como es enseñado aquí como es sabido en la técnica. Sobre la base de comparaciones de secuencias de aminoácidos de factor VIII conocidas que tiene actividad coagulante de sangre humana, pueden producirse variantes de secuencia tales como sustituciones de aminoácidos individuales o sustituciones de segmentos peptídicos con variantes funcionales conocidas en la secuencia de aminoácidos de POL1212 básica, reteniendo a la vez los atributos funcionales equivalentes del mismo. Los tipos de variación anteriores no pretenden ser exhaustivos, sino únicamente ejemplares de las modificaciones de secuencia que podrían ser producidas por aquellos expertos en la técnica, sin modificar sustancialmente los atributos funcionales de la proteína. Se considera que todas las variaciones y modificaciones caen' dentro del alcance de la invención como se reclama o como equivalentes de las mismas.

Listado de ID de Secuencia SEQ ID NO: Identificación 1 ADNc de factor VIII humano. Que codifica para el aminoácido número 1 de la proteína madura que comienza en el nucleótido número 208. 2 Secuencia de aminoácido del factor humano. 3 ADNc del dominio A2 del factor VIII porcino. 4 Secuencia de aminoácidos del dominio A2 del factor VIII porcino. 5 hasta 27 Secuencia del cebador oligonucleotidico (Ejemplo 5) . 28 Secuencia de aminoácido del factor VIII murino. 29 ADNc del factor VIII porcino. 30 Secuencia de aminoácido del factor VIII 31 ßecoénsia de aminoácidos de péptido señal del factor VIII. 2 hasta 36 Cebador oligonucleotidico (Ejemplo 7) 37 ADN que codifica para POL1212 38 Secuencia de aminoácidos del POL1212 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

~ LISTADO DE SECUENCIAS <110> Emory University <120> FACTOR VIII MODIFICADO <130> 75-951 WO 5 <140> AUN NO ASIGNADO <141> 2001-02-16 <150> US 09/523,656 10 <151> 2000-03-10 150> US 09/037,601 <151> 1998-03-10 15 <150> US 08/670,707 <151> 1996-06-26 <160> 38 <170> Patentln Ver. 2.0 20 <210> 1 <211>9009 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (208) .. (7203) <400> 1 cagtgggtaa gttccttaaa tgctctgcaa agaaattggg acttttcatt aaatcagaaa 60 ttttactttt ttcccctcct gggagctaaa gatattttag agaagaatta accttttgct 120 tctccagttg aacatttgta gcaataagtc atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt 180 ctgtgccttt tgcgattctg ctttagt gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca 234 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala 1 5 gtg gaa ctg tea tgg gac tat atg caa agt gat etc ggt gag ctg cct 282 Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro 10 15 20 25 3 gtg gac gca aga ttt cct cct aga gtg cca aaa tet ttt cca ttc aac 330 Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn 30 35 40 acc tea gtc gtg tac aaa aag act ctg ttt gta gaa ttc acg gtt cac 378 Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His 45 50 55 att tta aaa ata gat aag aaa agg acá ccc tgg atg ggt atg ata ggt 426 Leu Phe Asn He Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly 60 65 70 cct acc ate cag gct gag gtt tat gat acá gtg gta att acá att aag 474 Pro Thr He Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val He Thr Leu Lys 75 80 85 aaa atg gct tec cat cct gtc agt ctt cat gct gtt ggt gta tec tac 522 Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr 90 95 100 105 tgg aaa gct tet gag gga gct gaa tat gat gat cag acc agt caa agg 570 Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Gln Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg 110 115 120 fc gag aaa gaa gat gat aaa gtc ttc cct ggt gga age cat acá tat gtc 618 Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val 125 130 135 5 tgg cag gtc ctg aaa gag aat ggt cca atg gcc tet gac cca ctg tgc 666 Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp -Pro Leu Cys 140 145 150 ctt acc tac tea tat ctt tet cat gtg gac ctg gta aaa gac ttg aat 714 0 Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn 155 160 165 tea ggc ctcc att gga gcc cta cta gta tgt aga gaa ggg agt atg gcc 762 Ser Gly Leu He Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala 5 170 175 180 185 aag gaa aag acá cag acc ttg cac aaa ttt ata cta ctt ttt gct gta 810 Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe He Leu Leu Phe Ala Val 190 195 200 0 ttt gat gaa ggg aaa agt tgg cac tea gaa acá aag aac tec ttg atg 858 Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met 205 210 215 5 cag gat agg gat gct gaa tet gct cgg gcc tgg cct aaa atg cac acá 906 Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr 220 225 230 gtc aat ggt tat gta aac agg tet ctg cca ggt ctg att gga tgc cac 954 Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu He Gly Cys His 235 240 245 agg aaa tea gtc tat tgg cat gtg att gga atg ggc acc act cct gaa 1002 Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val He Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu 250 255 260 265 gtg cac tea ata ttc etc gaa ggt cac acá ttt ctt gtg agg aac cat 1050 Val His Ser He Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His 270 275 280 cgc cag gcg tec ttg gaa ate tag cca ata act ttc ctt act gct caa 1098 Arg Gln Ala Ser Leu Gln He Ser Pro He Thr Phe Leu Thr Ala Gln 285 290 295 acá etc ttg atg gac ctt gga aag ttt cta ctg ttt tgt cat ate tet 1146 Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His He Ser 300 305 310 tec cac caa cat gat ggc atg gaa gct tat gtc aaa gta gac age tgt 1194 Ser His Gln His Asp Gly Met Gln Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys 315 320 325 acá gag gaa ccc caa cta cga atg aaa aat aat gaa gaa gcg gaa gac 1242 Pro Glu Glu Pro Glu Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp 330 335 340 345 tat gat gat gat ctt act gat tet gaa atg gat gtg gtc agg ttt gat 1290 Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp 350 355 360 gat gac aac tet ct tec ttt ate caa att aga tea gtt gcc aag aag 1338 Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe He Gln He Arg Ser Val Ala Lys Lys 365 370 375 cat cct aaa act tgg gta cat tac att gct gat gaa gag gag gac tgg 1386 His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr He Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp 380 385 390 gac tat gct ccc tta gtc etc gcc ccc qat gac aga agt tat aaa agt 1434 Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser 395 400 405 7 aaa tat ttg aaa aat gga aat cag agg att ggt agg aag taa aaa aaa 1482 Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg He Gly Arg Lys Tyr Lys Lys 410 415 420 425 gtc cga ttt atg gca taa acá gat gaa acc ttt aag act cgt gaa gct 1530 Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala 430 435 440 att cag cat gaa tea gga ate ttg gga cct tta ctt tat ggg gaa gtt 1578 He Gln His Glu Ser Gly He Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val 445 450 455 gga gaa acá ctg ttg att ata ttt aag aat aaa gaa aga aga acá tat 1626 Gly Asp Thr Leu Leu He He Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr 460 465 470 aac ate tac cct cac gga ate act gat gtc cgt cct ttg tat tea agg 1674 Asn He Tyr Pro His Gly He Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg 475 480 485 aga tta cca aaa ggt gta aaa cat ttg aag gat ttt acá att atg acá 1722 Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro He Leu Pro 490 495 500 505 A gga gaa ata ttc aaa tat aaa tgg acá gtg act gta gaa gat ggg cca 1770 Gly Glu He Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro 510 515 520 act aaa tea gat cct cgg tgc ctg acc cgc tat tac tat agt ttc gtt 1818 Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val 525 530 535 aat atg gag aga gat cta gct tea gga etc att ggc cct etc etc ate 1866 Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He 540 545 550 tgc tac aaa gaa tet gta gat caa aga gga aac cag ata atg tea gac 1914 Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln He Met Ser Asp 555 560 565 aag agg aat gtc ate ctg ttt tet gta ttt gat gag aac cga age tgg 1962 Lys Arg Asn Val He Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp 570 575 580 585 tac cta acá gag aat ata caa age ttt etc ccc aat cca gct gga gtg 2010 Tyr Leu Thr Gln Asn He Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val 590 595 600 cag ctt gag gat cca gag ttc aaa gcc tec aac ate atg cac age ate 2058 Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn He Met His Ser He 605 610 615 aat ggc tat gtt ttt gat agt ttg aag ttg tea gtt tgt ttg cat gag 2106 Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu 620 625 630 gtg gca tac tgg tac att cta aga att gga gca cag act gac ttc ctt 2154 Val Ala Tyr Trp Tyr He Leu Ser He Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu 635 640 645 tet gtc ttc ttc tet gga tat acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa 2202 Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu 650 655 660 665 gac acá etc acc cta ttc cca ttc tea gga gaa act gtc ttc atg tag 2250 Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser 670 675 680 atg gaa aac acá ggt cta tgg att ctg ggg tgc cac aac tea gac ttt 2298 Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp He Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe 685 690 695 10 cgg aac aga ggc atg acc gcc tta ctg aag gtt tet agt tgt gac aag 2346 Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys 700 705 710 aac act ggt gat tat tac gag gac agt tat gaa gat att tea gca tac 2394 Asn Asn Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp He Ser Ala Tyr 715 720 725 ttg ctg agt aaa aac aat gcc att gaa cca aga age ttc tec cag aat 2442 Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala He Gln Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn 730 735 740 745 tea aga aac cct age act agg caa aag caa ttt aat gcc acc acá att 2490 Ser Arg His Pro Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr He 750 755 760 cca gaa aat gac ata gag aag act gac act tgg ttt gaa cac aga acá 2538 Pro Glu Asn Asp He Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr 765 770 775 cct atg cct aaa ata caa aat gtc tec tet agt gat ttg ttg atg etc 2586 Pro Met Pro Lys He Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu 780 785 790 11 ttg cga cag agt cct act cca cat ggg cta tec tta tet gat etc caa 2634 Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln 795 800 805 gaa gcc aaa tat gag act ttt tet gat gat cca tea cct gga gca ata 2682 Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala He 810 815 820 825 gac agt aat aac aga atg tat gaa atg acá aaa tta agg acá aag ata 2730 Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu 830 835 840 cat cac agt ggg gac atg gta ttt acc cct gag tea ggc etc caa tta 2778 His His Ser Gly Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu 845 850 855 aga tta aat gag aaa ctg ggg acá act gca gca acá gag ttg aag aaa 2826 Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys 860 865 870 ctt gat ttc aaa gtt tet agt acá tea aat aat ctg att tea acá att 2874 Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu He Ser Thr He 875 880 885 12 acá taa gaa aat ttg gaa gca ggt act gat aat acá agt tac tta gga 2922 Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly 890 895 900 905 ccc cca agt atg cca gtt cat tat gat agt caa tta gat acc act cta 2970 Pro Pro Ser Met Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu 910 915 920 ttt ggc aaa aag tea tet ccc att aat gag tet ggt gga cct ctg aga 3018 Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro Leu Thr Gln Ser Gly Gly Pro Leu Ser 925 930 935 ttg agt gaa gaa aat aat gat tea aag ttg tta gaa taa ggt tta atg 3066 Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met 940 945 950 aat age caa gaa agt tea tgg gga aaa aat gta tcg tea acá gag agt 3114 Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser 955 960 965 ggt agg tta ttt aaa ggg aaa aga gct cat gga cct gct ttg ttg act 3162 Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr 970 975 980 985 13 aaa gat aat gcc tta ttc aaa gtt age ate tet ttg tta aag acá aac 3210 Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys Val Ser He Ser Leu Leu Lys Thr Asn 990 995 1000 aaa act tec aat aat tea gca act aat aga aag act cac att gat ggc 3258 Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His He Asp Gly 1005 1010 1015 acá tea tta tta att gag aat agt cca tea gtc tgg caa aat ata tta 3306 Pro Ser Leu Leu He Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn He Leu 1020 1025 1030 gaa agt gac act gag ttt aaa aaa gtg acá cct ttg att cat gac aga 3354 Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu He His Asp Arg 1035 1040 1045 atg ctt atg gac aaa aat gct acá gct ttg agg cta aat cat atg tea 3402 Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser 1050 1055 1060 1065 aat aaa act act tea tea aaa aac atg gaa atg gtc aaa cag aaa aaa 3450 Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys 1070 1075 1080 14 gag gga ccc att acá acá gat gaa caa aat acá gat atg tag tta ttt 3498 Glu Gly Pro He Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe 1085 1090 1095 aag atg cta ttc ttg cca gaa tea gca agg tgg ata caa agg act cat 3546 Lys Met Leu Phe Leu Pro Gln Ser Ala Arg Trp He Gln Arg Thr His 1100 1105 1110 gga aag aac tet ctg aac tet ggg caa ggc ccc agt cca aag caa tta 3594 Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu 1115 1120 1125 gta tec tta gga cca gaa aaa tet gtg gaa ggt cag aat ttc ttg tet 3642 Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser 1130 1135 1140 1145 gag aaa aac aaa gtg gta gta gga aag ggt gaa ttt acá aag gaa gta 3690 Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val 1150 1155 1160 gga etc aaa gag atg gtt ttt cca age aga aga aac cta ttt ctt act 3738 Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr 1165 1170 1175 15 aac ttg gat aat tta cat gaa aat aat acá cac aat caa gaa aaa aaa 3786 Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys 1180 1185 1190 att aag gaa gaa ata gaa aag aag gaa acá tta ata aaa gag aat gta 3834 He Gln Glu Gln He Gln Lys Lys Gln Thr Leu He Gln Glu Asn Val 1195 1200 1205 gtt ttg cct cag ata cat acá gtg act ggc act aag aat ttc atg aag 3882 Val Leu Pro Gln He His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys 1210 1215 1220 1225 aac ctt ttc tta ctg age act agg caa aat gta gaa ggt taa tat gag 3930 Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu 1230 1235 1240 ggg gca tat gct cca gta ctt caa gat ttt agg tea tta aat gat tea 3978 Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser 1245 1250 1255 acá aat aga acá aag aaa cac acá gct cat ttc tea aaa aaa ggg gag 4026 Thr Asn Arg Thr Lys Lys His Thr Arg His Phe Ser Lys Lys Gly Gln 1260 1265 1270 16 gaa gaa aao ttg gaa ggc ttg gga aat caa acá aag aaa att gta gag 4074 Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln He Val Glu 1275 1280 1285 aaa tat gaa tgc acc acá agg ata tet cct aat acá age cag cag aat 4122 Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg He Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn 1290 1295 1300 1305 ttt gtc acg caa cgt agt aag aga gct ttg aaa aaa ttc aga etc acá 4170 Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro 1310 1315 1320 cta gaa gaa acá gaa ctt gaa aaa agg ata att gtg gat gaa acc taa 4218 Leu Gln Gln Thr Gln Leu Gln Lys Arg He He Val Asp Asp Thr Ser 1325 1330 1335 acc aag tgg tac aaa aac atg aaa aat ttg acc ccg aga acc etc acá 4266 Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr 1340 1345 1350 cag ata gac tac aat gag aag gag aaa ggg gcc att act cag tet ccc 4314 Gln He Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Sly Ala He Thr Gln Ser Pro 1355 1360 1365 17 tta tea gat tgc ctt aag agg agt cat age ate cct caa gca aat aga 4362 Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser He Pro Gln Ala Asn Arg 1370 1375 1380 1385 tet cca tta ccc att gca aag gta tea tea ttt acá tet att aga ct 4410 Ser Pro Leu Pro He Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser He Arg Pro 1390 1395 1400 ata tat ctg acc agg gtc ata ttc caa gac aac tet tet cat ctt acá 4458 He Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro 1405 1410 1415 gca gca tet tat aga aag aaa gat tet ggg gtc caa gaa age agt cat 4506 Alaa Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Sly Val Gln Glu Ser Ser His 1420 1425 1430 ttc tta caa gga gcc aaa aaa aat aac ctt tet tta gcc att cta acc 4554 Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala He Leu Thr 1435 1440 1445 ttg gag atg act ggt gat caa aga gag gtt gga tea atg ggg acá agt 4602 Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser 1450 1455 1460 1465 18 gcc acá aat taa gtc acá tac aag aaa gtt gag aac act gtt ate acg 4650 Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro 1470 1475 1480 aaa cca gaa ttg ccc aaa acá tat ggc aaa gtt gaa ttg att cca aaa 4698 Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys 1485 1490 1495 gtt cac att tat cag aag gac ata ttc aat acg gaa aat aga aat ggg 4746 Val His He Tyr Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly 1500 1505 1510 tet act ggc cat ctg gat ate gtg gaa ggg aga att att cag gga acá 4794 Ser Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Sly Thr 1515 1520 1525 gag gga gcg att aag tgg aat gaa gaa aac aga cct gga aaa gtt ccc 4842 Glu Gly Ala He Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Sly Lys Val Pro 1530 1535 1540 1545 ttt atg aga gta gca acá gaa aga tet gaa aag act cac tac aag ata 4890 Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu 1550 1555 1560 19 ttg gat cct att gct tgg gat aao cao tat ggt aat aag ata cca aaa 4938 Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln He Pro Lys 1565 1570 1575 gaa gag tgg aaa tao aaa gag aag taa acá gaa aaa acá gat ttt aag 4986 Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys 1580 1585 1590 aaa aag gat acc att ttg tec ctg aaa gct tgt gaa age aat cat gaa 5034 Lys Lys Asp Thr He Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala 1595 1600 1605 ata gca gca ata aat gag gga caa aat aag ccc gaa ata gaa gtc acc 5082 He Ala Ala He Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Gln He Gln Val Thr 1610 1615 1620 1625 tgg goa aag aaa ggt agg aat gaa agg ctg tgo tot aaa aac acá oca 5130 Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Gln Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro 1630 1635 1640 gtc ttg aaa cgc cat caa cgg gaa ata aat cgt act act att cag taa 5178 Val Leu Lys Arg His Gln Arg Gln He Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser 1645 1650 1655 20 gat caa gag gaa att gac tat gat gat acc ata tea gtt gaa atg aag 5226 Asp Gln Glu Glu He Asp Tyr Asp Asp Thr He Ser Val Gln Met Lys 1660 1665 1670 aag gaa gat ttt gac att tat gat gag gat gaa aat cag age cac cgc 5274 Lys Glu Asp Phe Asp He Tyr Asp Glu Asp Gln Asn Gln Ser Pro Arg 1675 1680 1685 age ttt caa aag aaa acá aga cac tat ttt att gat gca gtg gag agg 5322 Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe He Ala Ala Val Gln Arg 1690 1695 1700 1705 etc tgg gat tat ggg atg agt age tec cca cat gtt ata aga aac agg 5370 Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 1710 1715 1720 gct cag agt ggc agt gta aat cag tta aag aaa gtt gtt tta cag gaa 5418 Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu 1725 1730 1735 ttt act gat gga tac ttt act aag cao tta tao cgt gga gaa ata aat 5466 Phe Thr Asp Sly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Gln Leu Asn 1740 1745 1750 21 gaa cat ttg gga etc ctg ggg cca tat ata aga gaa gaa gtt gaa gat 5514 Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr He Arg Ala Glu Val Gln Asp 1755 1760 1765 aat ate atg gta act tta aga aat cag gca tet cgt ccc tat tao ttc 5562 Asn He Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 1770 1775 1780 1785 tat tet age att att tet tat gag gaa gat aag agg oaa gga gca gaa 5610 Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Gln Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Gln 1790 1795 1800 cct aga aaa aac ttt gtc aag cct aat gaa acá aaa act tac ttt tgg 5658 Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp 1805 1810 1815 aaa gtg caa cat cat atg gca cca act aaa gat gag ttt gac tga aaa 5706 Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Gln Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830 gcc tgg gct tat ttc tet gat gtt gaa ctg gaa aaa gat gtg cac taa 5754 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Gln Lys Asp Val His Ser 1835 1840 1845 22 gga ctg att gga ccc att ctg gta tgc aaa act aac acá ctg aaa aat 5802 Gly Leu He Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 1850 1855 1860 1865 gct cat ggg aga caa gtg acá gta cag gaa ttt gct ctg ttt ttc aac 5850 Ala His Gly Arg Glu Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 1885 1875 1880 ate ttt gat gag acá aaa aga tgg tac ttc aat gaa aat atg gaa aga 5898 He Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg 1885 1890 1895 aac tgc agg gct ccc tgc aat ate cag atg gaa gat ccc act ttt aaa 5946 Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn He Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1900 1905 1910 gag aat tat cgc ttc cat gca ata aat gga tac ata atg gat acá cta 5994 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala He Asn Gly Tyr He Met Asp Thr Leu 1915 - 1920 1925 cct ggc tta gta atg gat aag gat caa agg att cga tgg tat ctg etc 6042 Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg He Arg Trp Tyr Leu Leu 1930 1935 1940 1945 23 age atg ggc age aat gaa aac ata cat tet att cat ttc agt gga cat 6090 Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn He His Ser He His Phe Ser Gly His 1950 1955 1960 gtg tta act gta cga aaa aaa gag gag tat aaa atg gaa ctg tac aat 6138 Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 1965 1970 1975 cta tat cca ggt gtt ttt gag aaa gtg gaa atg tta caa tea aaa gct 6186 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala 1980 1985 1990 gga att tgg cgg gtg gaa tgc att att ggc gag aat cta cat gct ggg 6234 Gly He Trp Arg Val Glu Cys Leu He Gly Glu His Leu His Ala Gly 1995 2000 2005 atg aga acá att ttt ctg gtg tac aga aat aag tgt cag act ccc atg 6282 Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu 2010 2015 2020 2025 gga atg gct tet gga cac att aga gat ttt aag att acá gct taa gga 6330 Gly Met Ala Ser Gly His He Arg Asp Phe Gln He Thr Ala Ser Gly 2030 2035 2040 24 caa tat gga cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt aat tat tec gga 6378 Gln Tyr Gly Gln Trp Ma Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly 2045 2050 2055 taa ata aat gcc tgg aga acá aag gag ccc ttt tet tgg ata aag gtg 6426 Ser He Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp He Lys Val 2060 2065 2070 gat atg ttg gca acá atg att att aac ggc ata aag acá aag ggt gaa 6474 Asp Leu Leu Ala Pro Met He He His Gly He Lys Thr Gln Gly Ala 2075 2080 2085 cgt aag aag ttc taa aga cta tac ata tet aag ttt ata ata atg tat 6522 Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr He Ser Gln Phe He He Met Tyr 2090 2095 2100 2105 agt att gat ggg aag aag tgg cag act tat aga gga aat tec act gga 6570 Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly 2110 2115 2120 acá tta atg gta ttc ttt gga aat gtg gat tea tet ggg ata aaa aaa 6618 Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly He Lys His 2125 2130 2135 25 aat att ttt aaa aat acá att att gct aga taa ata cgt ttg caa acá 6666 Asn He Phe Asn Pro Pro He He Ala Arg Tyr He Arg Leu His Pro 2140 2145 2150 act cat tat aga att aga aga act att aga atg gag ttg atg gga tgt 6714 Thr His Tyr Ser He Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys 2155 2160 2165 gat tta aat agt tga aga atg acá ttg gga atg gag agt aaa gaa ata 6762 Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala He 2170 2175 2180 2185 taa gat gaa aag att aat gat tal, taa taa ttt acá aat atg ttt gaa 6810 Ser Asp Ala Gln He Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala 2190 2195 2200 acc tgg tet act tea aaa gat aga att aaa ata aaa ggg agg agt aat 6858 Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn 2205 2210 2215 gca tgg aga cat aag gtg aat aat acá aaa gag tgg ctg aaa gtg gaa 6906 Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp 2220 2225 2230 26 ttc cag aag acá atg aaa gta acá gga gta aat aat aag gga gta aaa 6954 Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys 2235 2240 2245 tet ctg ctt acc age atg tat gtg aag gag ttc etc ate tec age agt 7002 Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu He Ser Ser Ser 2250 2255 2260 2265 caa gat ggc cat aag tgg act etc ttt ttt cag aat ggc aaa gta aag 7050 Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys 2270 2275 2280 gtt ttt cag gga aat caa gac tec ttc acá cct gtg gtg aac tet cta 7098 Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu 2285 2290 2295 gac cca ccg tta ctg act cgc tac ctt cga att cac ccc cag agt tgg 7146 Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg He His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 gtg cac cag att gcc ctg agg atg gag gtt ctg ggc tgc gag gca cag 7194 Val His Gln He Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln 2315 2320 2325 27 gac etc tac tgagggtggc cactgcagca cctgccactg ccgtcacctc 7243 Asp Leu Tyr 2330 tccctcctca gctccagggc agtgtccctc cctggcttgc cttatacctt tgtgctaaat 7303 cctagcagac actgccttga agcctcctga attaactatc atcagtcctg catttctttg 7363 gtggggggee aggagggtge atccaattta aettaactet tacctatttt ctgcagctgc 7423 teccagatta ctccttcctt ccaatataac taggcaaaaa gaagtgagga gaaaaatgca 7483 tgaaagcatt cttccctgaa aagttaggcc tatcagagtc accacttcct ctgttgtaga 7543 aaaactatgt gatgaaactt tgaaaaagat atttatgatg ttaacattta aggttaagcc 7603 tcatacgttt aaaataaaac tctcagttgt ttattatcct gatcaageat ggaacaaagc 7663 atgtttcagg atcagatcaa tacaatattg gagtcaaaag gcaaatcatt tggaaaatct 7723 gaaaaatgga gagaatacaa taactactaa agtaaagtct gtttctgatt ccttacacat 7783 agatataatt atgttattta gtcattatga ggggcacatt ettatateca aaactagcat 7843 tcttaaactg agaattatag atggggttaa agaatcecta agtcccctga aattatataa 7903 ggcattctgt ataaatgaaa atgtgcattt ttctgacgag tgtaaataga tataaageca 7963 ttggtcttaa ttctgaccaa taaaaaaata agtcaggagg atgcaattgt tgaaagattt 8023 gaaataaaat aacatgtctt cttgaaattt gtgatggaca agaaagaaaa tgatgatgac 8083 attaggcttc taaaggaaat aaatttaata tttctgtgga aatatgagga aaatccatgg 8143 ttatctgaga taggagatac aaaetttgta attataataa tgcactcagt ttactatetc 8203 cctctactaa tttcctgatg aaaataacac aacaaaaatg taaaagggga aattatatac 8263 cgtgactgaa aaatagagtc ctacttaaat agttgaaata tcaaggaggt cagaagaaaa 8323 ttggactggt gaaaacagaa aaaacactcc agtctgccat atcaccacac aataggatcc 8383 28 cccttcttga cctacacacc aataagattg tgaagggttt actgatcctt caatctgact 8443 gcaccccttc actatgacta cacagaaatc tcatgatagt aaagggggat ggaggcaagg 8503 ataagttata gagcagttgg aggaagcatc aaaagactge aacccagggc aaatggaaaa 8563 caggagatcc taatatgaaa gaaaaatgga tcccaatctg agaaaaggca aaagaatggc 8623 tacttttttc tatgctggag tattttctaa taatcctgct tgaccettat ctgacctctt 8683 tggaaactat aacatagctg tcacagtata gtcacaatcc acaaatgatg caggtgcaaa 8743 tggtttatag ccctgtgaag ttcttaaagt ttagaggcta acttacagaa atgaataagt 8803 tgttttgttt tatagcccgtg tagaggagtt aacccaaag gtgatatggt tttatttcct 8863 gttatgttta acttgataat cttattttgg cattcttttc ccattgacta tatacatetc 8923 tatttctcaa atgttcatgg aactagctct tttattttcc tgctggtttc ttcagtaatg 8983 agttaaataa aacattgaca cataca 9009 <210> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser 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Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 13 aggaaattcc actggaacct tn 22 <210> 14 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 56 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 14 ctgggggtga attegaaggt agcgn 25 <210> 15 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 15 gagttcatcg ggaagacctg ttg 23 <210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 57 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 16 acagcccatc aactccatgc gaag 24 <210> 17 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 17 tcagggcaat caggactcc 19 <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 18 ccgtggtgaa cgctctggac c 21 <210> 19 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 19 gtagaggtcc tgtgcctcgc agcc 24 <210> 20 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 59 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 20 gtagagstsc tgkgcctcrc akccyag 27 <210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 21 cttcgcatgg agttgatggg ctgt 24 <210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 60 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 22 aatcaggact cctccacccc g 21 <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 23 ggatccaccc cacgagctgg 20 <210> 24 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 61 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 24 cgccctgagg ctcgaggttc tagg 24 <210> 25 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 25 aatcaggact cctccacccc cg 22 <210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 62 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 26 ccttgcagga attcgattca 20 <210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 27 ccgtggtgaa cgctctggac c 21 <210> 28 <211> 2319 <212> PRT <213> Mus músculo 63 <400> 28 Met Gln He Ma Leu Phe Ma Cys Phe Phe Leu Ser Leu Phe Asn Phe 1 5 10 15 Cys Ser Ser Ma He Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ma Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asn Tyr He Gln Ser Asp Leu Leu Ser Val Leu His Thr Asp Ser 35 40 45 Arg Phe Leu Pro Arg Met Ser Thr Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser He 50 55 60 Met Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Tyr Lys Asp Gln Leu Phe Asn 65 70 75 80 He Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He 85 90 95 Trp Thr Glu Val 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(6399) <400> 29 atg cag cta gag etc tec acc tgt gtc ttt ctg tgt etc ttg cca etc 48 Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu 1 5 10 15 ggc ttt agt gcc ate agg aga tac tac ctg ggc gca gtg gaa ctg tec 96 Gly Phe Ser Ala He Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ma Val Glu Leu Ser 20 25 30 82 tgg gac tac cgg caa agt gaa etc etc cgt gag ctg cac gtg gac acc 144 Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr 35 40 45 aga ttt cct gct acá gcg cca gga gct ctt ccg ttg ggc ccg tea gtc 192 Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val 50 55 60 ctg tac aaa aag act gtg ttc gta gag ttc acg gat caa ctt ttc age 240 Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser 65 70 75 80 gtt gcc agg ccc agg cca cca tgg atg ggt ctg ctg ggt cct acc ate 288 Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He 85 90 95 cag gct gag gtt tac gac acg gtg gtc gtt acc ctg aag aac atg gct 336 Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ma 100 105 110 tet cat ccc gtt agt ctt cac gct gtc ggc gtc tec ttc tgg aaa tet 384 Ser His Pro Val Ser Leu His Ma Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser 115 120 125 83 tec gaa ggc gct gaa tat gag gat cac acc age caa agg gag aag gaa 432 Ser Glu Gly Ma Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu 130 135 140 gac gat aaa gtc ctt ccc ggt aaa age caa acc tac gtc tgg cag gtc 480 Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val 145 150 155 160 ctg aaa gaa aat ggt cca acá gcc tet gac cca cca tgt etc acc tac 528 Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ma Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr 165 170 175 tea tac ctg tet cac gtg gac ctg gtg aaa gac ctg aat tcg ggc etc 576 Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190 att gga gcc ctg ctg gtt tgt aga gaa ggg agt ctg acc aga gaa agg 624 He Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205 acc cag aac ctg cac gaa ttt gta cta ctt ttt gct gtc ttt gat gaa 672 Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ma Val Phe 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He Ser Ser His His 325 330 335 cat ggt ggc atg gag gct cac gtc aga gta gaa age tgc gcc gag gag 1056 His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu 340 345 350 ccc cag ctg cgg agg aaa gct gat gaa gag gaa gat tat gat gac aat 1104 Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn 355 360 365 ttg tac gac tcg gac atg gac gtg gtc cgg etc gat ggt gac gac gtg 1152 Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val 370 375 380 tet ccc ttt ate caa ate cgc tcg gtt gcc aag aag cat ccc aaa acc 1200 Ser Pro Phe He Gln He Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 tgg gtg cac tac ate tet gca gag gag gag gac tgg gac tac gcc ccc 1248 Trp Val His Tyr He Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ma Pro 405 410 415 86 gcg gtc ccc age ccc agt gac aga agt tat aaa agt etc tac ttg aac 1296 Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn 420 425 430 agt ggt cct cag cga att ggt agg aaa tac aaa aaa gct cga ttc gtc 1344 Ser Gly Pro Gln Arg He Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val 435 440 445 gct tac acg gat gta acá ttt aag act cgt aaa gct att ccg tat gaa 1392 Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ma He Pro Tyr Glu 450 455 460 tea gga ate ctg gga cct tta ctt tat gga gaa gtt gga gac acá ctt 1440 Ser Gly He Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 ttg att ata ttt aag aat aaa gcg age cga cca tat aac ate tac cct 1488 Leu He He Phe Lys Asn Lys Ma Ser Arg Pro Tyr Asn He Tyr Pro 485 490 495 cat gga ate act gat gtc age gct ttg cac cca ggg aga ctt cta aaa 1536 His Gly He Thr Asp Val Ser Ma Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys 500 505 510 87 ggt tgg aaa cat ttg aaa gac atg cca att ctg cca gga gag act ttc 1584 Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro He Leu Pro Gly Glu Thr Phe 515 520 525 aag tat aaa tgg acá gtg act gtg gaa gat ggg cca acc aag tec gat 1632 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 cct cgg tgc ctg acc cgc tac tac tcg age tec att aat cta gag aaa 1680 Pro Arg Cys Leu 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Tyr He Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 tet ggc tac acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa gac acá etc acc 2064 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 ctg ttc ccc ttc tea gga gaa acg gtc ttc atg tea atg gaa aac cca 2112 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 89 ggt etc tgg gtc cta ggg tgc cac aac tea gac ttg cgg aac aga ggg 2160 Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 atg acá gcc tta ctg aag gtg tat agt tgt gac agg gac att ggt gat 2208 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp He Gly Asp 725 730 735 tat tat gac aac act tat gaa gat att cca ggc ttc ttg ctg agt gga 2256 Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp He Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly 740 745 750 aag aat gtc att gaa ccc aga age ttt gcc cag aat tea aga ccc cct 2304 Lys Asn Val He Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro 755 760 765 agt gcg age caa aag caa ttc caa acc ate acá agt cca gaa gat gac 2352 Ser Ala Ser Gln Lys Gln Phe Gln Thr He Thr Ser Pro Glu Asp Asp 770 775 780 gtg gag ctt gac ccg cag tet gga gag aga acc caa gca ctg gaa gaa 2400 Val Glu Leu Asp Pro Gln Ser Gly Glu Arg Thr Gln Ala Leu Glu Glu 785 790 795 800 90 cta agt gtc ccc tet ggt gat ggg tcg atg etc ttg gga cag aat cct 2448 Leu Ser Val Pro Ser Gly Asp Gly Ser Met Leu Leu Gly Gln Asn Pro 805 810 815 gct cca cat ggc tea tec tea tet gat ctt caa gaa gcc agg aat gag 2496 Ma Pro His Gly Ser Ser Ser Ser Asp Leu Gln Glu Ala Arg Asn Glu 820 825 830 gct gat gat tat tta cct gga gca aga gaa aga ggc acg gcc cca tec 2544 Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gly Ma Arg Glu Arg Gly Thr Ala Pro Ser 835 840 845 gca gcg gca cgt etc aga cca gag ctg cat cac agt gcc gaa aga gta 2592 Ala Ala Ala Arg Leu Arg Pro Glu. Leu His His Ser Ala Glu Arg Val 850 855 860 ctt act cct gag cca gag aaa gag ttg aag aaa ctt gat tea aaa atg 2640 Leu Thr Pro Glu Pro Glu Lys Glu Leu Lys Lys Leu Asp Ser Lys Met 865 870 875 880 tet agt tea tea gac ctt cta aag act tcg cca acá att cca tea gac 2688 Ser Ser Ser Ser Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Thr He Pro Ser Asp 885 890 895 91 acg ttg tea gcg gag act gaa agg acá cat tec tta ggc ccc cca cac 2736 Thr Leu Ser Ala Glu Thr Glu Arg Thr His Ser Leu Gly Pro Pro His 900 905 910 ccg cag gtt aat ttc agg agt caa tta ggt gcc att gta ctt ggc aaa 2784 Pro Gln Val Asn Phe Arg Ser Gln Leu Gly Ala He Val Leu Gly Lys 915 920 925 aat tea tet cac ttt att ggg gct ggt gtc cct ttg ggc tcg act gag 2832 Asn Ser Ser His Phe He Gly Ma Gly Val Pro Leu Gly Ser Thr Glu 930 935 940 gag gat cat gaa age tec ctg gga gaa aat gta tea cca gtg gag agt 2880 Glu Asp His Glu Ser Ser Leu Gly Glu Asn Val Ser Pro Val Glu Ser 945 950 955 960 gac ggg ata ttt gaa aag gaa aga gct cat gga cct gct tea ctg acc 2928 Asp Gly He Phe Glu Lys Glu Arg Ala His Gly Pro Ala Ser Leu Thr 965 970 975 aaa gac gat gtt tta ttt aaa gtt aat ate tet ttg gta aag acá aac 2976 Lys Asp Asp Val Leu Phe Lys Val Asn He Ser Leu Val Lys Thr Asn 980 985 990 92 aag gca cga gtt tac tta aaa act aat aga aag att cac att gat gac 3024 Lys Ala Arg Val Tyr Leu Lys Thr Asn Arg Lys He His He Asp Asp 995 1000 1005 gca gct tta tta act gag aat agg gca tet gca acg ttt atg gac aaa 3072 Ala Ala Leu Leu Thr Glu Asn Arg Ala Ser Ala Thr Phe Met Asp Lys 1010 1015 1020 aat act acá gct tcg gga tta aat cat gtg tea aat tgg ata aaa ggg 3120 Asn Thr Thr Ala Ser Gly Leu Asn His Val Ser Asn Trp He Lys Gly 1025 1030 1035 1040 ccc ctt ggc aag aac ccc cta age tcg gag cga ggc ccc agt cca gag 3168 Pro Leu Gly Lys Asn Pro Leu Ser Ser Glu Arg Gly Pro Ser Pro Glu 1045 1050 1055 ctt ctg acá tet tea gga tea gga aaa tet gtg aaa ggt cag agt tet 3216 Leu Leu Thr Ser Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val Lys Gly Gln Ser Ser 1060 1065 1070 ggg cag ggg aga ata cgg gtg gca gtg gaa gag gaa gaa ctg age aaa 3264 Gly Gln Gly Arg He Arg Val Ma Val Glu Glu Glu Glu Leu Ser Lys 1075 1080 1085 93 ggc aaa gag atg atg ctt ccc aac age gag etc acc ttt etc act aac 3312 Gly Lys Glu Met Met Leu Pro Asn Ser Glu Leu Thr Phe Leu Thr Asn 1090 1095 1100 tcg gct gat gtc caa gga aac gat acá cac agt caa gga aaa aag tet 3360 Ser Ala Asp Val Gln Gly Asn Asp Thr His Ser Gln Gly Lys Lys Ser 1105 1110 1115 1120 cgg gaa gag atg gaa agg aga gaa aaa tta gtc caa gaa aaa gtc gac 3408 Arg Glu Glu Met Glu Arg Arg Glu Lys Leu Val Gln Glu Lys Val Asp 1125 1130 1135 ttg cct cag gtg tat acá gcg act gga act aag aat ttc ctg aga aac 3456 Leu Pro Gln Val Tyr Thr Ala Thr Gly Thr Lys Asn Phe Leu Arg Asn 1140 1145 1150 att ttt cac caa age act gag ccc agt gta gaa ggg ttt gat ggg ggg 3504 He Phe His Gln Ser Thr Glu Pro Ser Val Glu Gly Phe Asp Gly Gly 1155 1160 1165 tea cat gcg ccg gtg cct caa gac age agg tea tta aat gat tcg gca 3552 Ser His Ala Pro Val Pro Gln Asp Ser Arg Ser Leu Asn Asp Ser Ala 1170 1175 1180 94 gag aga gca gag act cac ata gcc cat ttc tea gca att agg gaa gag 3600 Glu Arg Ala Glu Thr His He Ma His Phe Ser Ma He Arg Glu Glu 1185 1190 1195 1200 gca ccc ttg gaa gcc ccg gga aat cga acá ggt cca ggt ccg agg agt 3648 Ala Pro Leu Glu Ma Pro Gly Asn Arg Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser 1205 1210 1215 gcg gtt ccc cgc cgc gtt aag cag age ttg aaa cag ate aga etc ccg 3696 Ala Val Pro Arg Arg Val Lys Gln Ser Leu Lys Gln He Arg Leu Pro 1220 1225 1230 cta gaa gaa ata aag cct gaa agg ggg gtg gtt ctg aat gcc acc tea 3744 Leu Glu Glu He Lys Pro Glu Arg Gly Val Val Leu Asn Ala Thr Ser 1235 1240 1245 acc cgg tgg tet gaa age agt cct ate tta caa gga gcc aaa aga aat 3792 Thr Arg Trp Ser Glu Ser Ser Pro He Leu Gln Gly Ala Lys Arg Asn 1250 1255 1260 aac ctt tet tta cct ttc ctg acc ttg gaa atg gcc gga ggt caa gga 3840 Asn Leu Ser Leu Pro Phe Leu Thr Leu Glu Met Ma Gly Gly Gln Gly 1265 1270 1275 1280 95 aag ate age gcc ctg ggg aaa agt gcc gca ggc ccg ctg gcg tec ggg 3888 Lys He Ser Ala Leu Gly Lys Ser Ma Ala Gly Pro Leu Ala Ser Gly 1285 1290 1295 aag ctg gag aag gct gtt etc tet tea gca ggc ttg tet gaa gca tet 3936 Lys Leu Glu Lys Ma Val Leu Ser Ser Ala Gly Leu Ser Glu Ma Ser 1300 1305 1310 ggc aaa gct gag ttt ctt cct aaa gtt cga gtt cat cgg gaa gac ctg 3984 Gly Lys Ala Glu Phe Leu Pro Lys Val Arg Val His Arg Glu Asp Leu 1315 1320 1325 ttg cct caa aaa acc age aat gtt tet tgc gca cac ggg gat etc ggc 4032 Leu Pro Gln Lys Thr Ser Asn Val Ser Cys Ala His Gly Asp Leu Gly 1330 1335 1340 cag gag ate ttc ctg cag aaa acá cgg gga cct gtt aac ctg aac aaa 4080 Gln Glu He Phe Leu Gln Lys Thr Arg Gly Pro Val Asn Leu Asn Lys 1345 1350 1355 1360 gta aat aga cct gga agg act ccc tec aag ctt ctg ggt ccc ccg atg 4128 Val Asn Arg Pro Gly Arg Thr Pro Ser Lys Leu Leu Gly Pro Pro Met 1365 1370 1375 96 ccc aaa gag tgg gaa tec cta gag aag tea cca aaa age acá gct etc 4176 Pro Lys Glu Trp Glu Ser Leu Glu Lys Ser Pro Lys Ser Thr Ma Leu 1380 1385 1390 agg acg aaa gac ate ate agt tta ccc ctg gac cgt cac gaa age aat 4224 Arg Thr Lys Asp He He Ser Leu Pro Leu Asp Arg His Gln Ser Asn 1395 1400 1405 cat tea ata gca gca aaa aat gaa gga caa gcc gag acc caa aga gaa 4272 His Ser He Ala Ma Lys Asn Glu Gly Gln Ala Glu Thr Gln Arg Glu 1410 1415 1420 gcc gcc tgg acg aag cag gga ggg cct gga agg ctg tgc gct cca aag 4320 Ala Ala Trp Thr Lys Gln Gly Gly Pro Gly Arg Leu Cys Ala Pro Lys 1425 1430 1435 1440 cct ccg gtc ctg cga cgg cat cag agg gac ata age ctt cct act ttt 4368 Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp He Ser Leu Pro Thr Phe 1445 1450 1455 cag ccg gag gaa gac aaa atg gac tat gat gat ate ttc tea act gaa 4416 Gln Pro Gln Gln Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp He Phe Ser Thr Gln 1460 1465 1470 97 acg aag gga gaa gat ttt gac att tac ggt gag gat gaa aat cag gac 4464 Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp He Tyr Gly Glu Asp Glu Asn Gln Asp 1475 1480 1485 cct cgc age ttt cag aag aga acc cga cac tat ttc att gct gcg gtg 4512 Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His Tyr Phe He Ala Ma Val 1490 1495 1500 gag cag etc tgg gat tac ggg atg age gaa tec ccc cgg gcg cta aga 4560 Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu Ser Pro Arg Ala Leu Arg 1505 1510 1515 1520 aac agg gct cag aac gga gag gtg cct cgg ttc aag aag gtg gtc ttc 4608 Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg Phe Lys Lys Val Val Phe 1525 1530 1535 cgg gaa ttt gct gac ggc tec ttc acg cag ccg tcg tac cgc ggg gaa 4656 Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Gly Glu 1540 1545 1550 ' etc aac aaa cac ttg ggg etc ttg gga ccc tac ate aga gcg gaa gtt 4704 Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr He Arg Ala Glu Val 1555 1560 1565 98 gaa gac aac ate atg gta act ttc aaa aac cag gcg tet cgt ccc tat 4752 Glu Asp Asn He Met Val Thr Phe Lys Asn Gln Ma Ser Arg Pro Tyr 1570 1575 1580 tec ttc tac tcg age ctt att tet tat ccg gat gat cag gag caa ggg 4800 Ser Phe Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Pro Asp Asp Gln Glu Gln Gly 1585 1590 1595 1600 gca gaa cct cga cac aac ttc gtc cag cca aat gaa acc aga act tac 4848 Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro Asn Glu Thr Arg Thr Tyr 1605 1610 1615 ttt tgg aaa gtg cag cat cac atg gca ccc acá gaa gac gag ttt gac 4896 Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp 1620 1625 1630 tgc aaa gcc tgg gcc tac ttt tet gat gtt gac ctg gaa aaa gat gtg 4944 Cys Lys Ala Trp Ma Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val 1635 1640 1645 cac tea ggc ttg ate ggc ccc ctt ctg ate tgc cgc gcc aac acc ctg 4992 His Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He Cys Arg Ala Asn Thr Leu 1650 1655 1660 99 aac gct gct cac ggt aga caa gtg acc gtg caa gaa ttt gct ctg ttt 5040 Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe 1665 1670 1675 1680 ttc act att ttt gat gag acá aag age tgg tac ttc act gaa aat gtg 5088 Phe Thr He Phe Asp Gln Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Gln Asn Val 1685 1690 1695 gaa agg aac tgc cgg gcc ccc tgc cac ctg cag atg gag gac ccc act 5136 Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu Gln Met Glu Asp Pro Thr 1700 1705 1710 ctg aaa gaa aac tat cgc ttc cat gca ate aat ggc tat gtg atg gat 5184 Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala He Asn Gly Tyr Val Met Asp 1715 1720 1725 acá etc cct ggc tta gta atg gct cag aat caa agg ate cga tgg tat 5232 Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ma Gln Asn Gln Arg He Arg Trp Tyr 1730 1735 1740 ctg etc age atg ggc age aat gaa aat ate cat tcg att cat ttt age 5280 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn He His Ser He His Phe Ser 1745 1750 1755 1760 100 gga cac gtg ttc agt gta cgg aaa aag gag gag tat aaa atg gcc gtg 5328 Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ma Val 1765 1770 1775 tac aat etc tat ccg ggt gtc ttt gag acá gtg gaa atg cta ccg tec 5376 Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser 1780 1785 1790 aaa gtt gga att tgg cga ata gaa tgc ctg att ggc gag cac ctg caa 5424 Lys Val Gly He Trp Arg He Glu Cys Leu He Gly Glu His Leu Gln 1795 1800 1805 gct ggg atg age acg act ttc ctg gtg tac age aag gag tgt cag gct 5472 Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr Ser Lys Glu Cys Gln Ma 1810 1815 1820 cca ctg gga atg gct tet gga cgc att aga gat ttt cag ate acá gct 5520 Pro Leu Gly Met Ma Ser Gly Arg He Arg Asp Phe Gln He Thr Ma 1825 1830 1835 1840 tea gga cag tat gga cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt cat tat 5568 Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ma Pro Lys Leu Ma Arg Leu His Tyr 1845 1850 1855 101 tec gga tea ate aat gcc tgg age acc aag gat ccc cac tec tgg ate 5616 Ser Gly Ser He Asn Ala Trp Ser Thr Lys Asp Pro His Ser Trp He 1860 1865 1870 aag gtg gat ctg ttg gca cca atg ate att cac ggc ate atg acc cag 5664 Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met He He His Gly He Met Thr Gln 1875 1880 1885 ggt gcc cgt cag aag ttt tec age etc tac ate tec cag ttt ate ate 5712 Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr He Ser Gln Phe He He 1890 1895 1900 atg tac agt ctt gac ggg agg aac tgg cag agt tac cga ggg aat tec 5760 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln Ser Tyr Arg Gly Asn Ser 1905 1910 1915 1920 acg ggc acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat gtg gac gca tet ggg att 5808 Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ala Ser Gly He 1925 1930 1935 aaa cac aat att ttt aac cct ccg att gtg gct cgg tac ate cgt ttg 5856 Lys His Asn He Phe Asn Pro Pro He Val Ala Arg Tyr He Arg Leu 1940 1945 1950 102 cac cca acá cat tac age ate cgc age act ctt cgc atg gag ttg atg 5904 His Pro Thr His Tyr Ser He Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met 1955 1960 1965 ggc tgt gat tta aac agt tgc age atg ccc ctg gga atg cag aat aaa 5952 Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Gln Asn Lys 1970 1975 1980 gcg ata tea gac tea cag ate acg gcc tec tec cac cta age aat ata 6000 Ala He Ser Asp Ser Gln He Thr Ala Ser Ser His Leu Ser Asn He 1985 1990 1995 2000 ttt gcc acc tgg tet cct tea caa gcc cga ctt cac etc cag ggg cgg 6048 Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg 2005 2010 2015 acg aat gcc tgg cga ccc cgg gtg age age gca gag gag tgg ctg cag 6096 Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser Ala Glu Glu Trp Leu Gln 2020 2025 2030 gtg gac ctg cag aag acg gtg aag gtc acá ggc ate acc acc cag ggc 6144 Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr Gly He Thr Thr Gln Gly 2035 2040 2045 103 gtg aag tec ctg etc age age atg tat gtg aag gag ttc etc gtg tec 6192 Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Val Ser 2050 2055 2060 agt agt cag gac ggc cgc cgc tgg acc ctg ttt ctt cag gac ggc cac 6240 Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu Phe Leu Gln Asp Gly His 2065 2070 2075 2080 acg aag gtt ttt cag ggc aat cag gac tec tec acc ccc gtg gtg aac 6288 Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Ser Thr Pro Val Val Asn 2085 2090 2095 gct ctg gac ccc ccg ctg ttc acg cgc tac ctg agg ate cac ccc acg 6336 Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg He His Pro Thr 2100 2105 2110 age tgg gcg cag cac ate gcc ctg agg etc gag gtt cta gga tgt gag 6384 Ser Trp Ala Gln His He Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Glu 2115 2120 2125 gca cag gat etc tac tga 6402 Ala Gln Asp Leu Tyr 2130 104 <210> 30 <211> 2133 <212> PRT <213> Porcino <400> 30 Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu 1 5 10 15 Gly Phe Ser Ala He Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val 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111 Leu Thr Pro Glu Pro Glu Lys Glu Leu Lys Lys Leu Asp Ser Lys Met 865 870 875 880 Ser Ser Ser Ser Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Thr He Pro Ser Asp 885 890 895 Thr Leu Ser Ala Glu Thr Glu Arg Thr His Ser Leu Gly Pro Pro His 900 905 910 Pro Gln Val Asn Phe Arg Ser Gln Leu Gly Ala He Val Leu Gly Lys 915 920 925 Asn Ser Ser His Phe He Gly Ala Gly Val Pro Leu Gly Ser Thr Glu 930 935 940 Glu Asp His Glu Ser Ser Leu Gly Glu Asn Val Ser Pro Val Glu Ser 945 950 955 960 Asp Gly He Phe Glu Lys Glu Arg Ala His Gly Pro Ala Ser Leu Thr 965 970 975 Lys Asp Asp Val Leu Phe Lys Val Asn He Ser Leu Val Lys Thr Asn •980 985 990 112 Lys Ala Arg Val Tyr Leu Lys Thr Asn Arg Lys He His He Asp Asp 995 1000 1005 Ala Ala Leu Leu Thr Glu Asn Arg Ala Ser Ala Thr Phe Met Asp Lys 1010 1015 1020 Asn Thr Thr Ala Ser Gly Leu Asn His Val Ser Asn Trp He Lys Gly 1025 1030 1035 1040 Pro Leu Gly Lys Asn Pro Leu Ser Ser Glu Arg Gly Pro Ser Pro Glu 1045 1050 1055 Leu Leu Thr Ser Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val Lys Gly Gln Ser Ser 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Leu Thr Leu Glu Met Ala Gly Gly Gln Gly 1265 1270 1275 1280 Lys He Ser Ala Leu Gly Lys Ser Ala Ala Gly Pro Leu Ala Ser Gly 1285 1290 1295 Lys Leu Glu Lys Ala Val Leu Ser Ser Ala Gly Leu Ser Glu Ala Ser 1300 1305 1310 Gly Lys Ala Glu Phe Leu Pro Lys Val Arg Val His Arg Glu Asp Leu 1315 1320 1325 Leu Pro Gln Lys Thr Ser Asn Val Ser Cys Ala His Gly Asp Leu Gly 1330 1335 1340 Gln Glu He Phe Leu Gln Lys Thr Arg Gly Pro Val Asn Leu Asn Lys 1345 1350 1355 1360 Val Asn Arg Pro Gly Arg Thr Pro Ser Lys Leu Leu Gly Pro Pro Met 1365 1370 1375 115 Pro Lys Glu Trp Glu Ser Leu Glu Lys Ser Pro Lys Ser Thr Ala Leu 1380 1385 1390 Arg Thr Lys Asp He He Ser Leu Pro Leu Asp Arg His Glu Ser Asn 1395 1400 1405 His Ser He Ala Ala Lys Asn Glu Gly Gln Ala Glu Thr Gln Arg Glu 1410 1415 1420 Ala Ala Trp Thr Lys Gln Gly Gly Pro Gly Arg Leu Cys Ala Pro Lys 1425 1430 1435 1440 Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp He Ser Leu Pro Thr Phe 1445 1450 1455 Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp He Phe Ser Thr Glu 1460 1465 1470 Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp He Tyr Gly Glu Asp Glu Asn Gln Asp 1475 1480 1485 Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His Tyr Phe He Ala Ala Val 1490 1495 1500 116 Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu Ser Pro Arg Ala Leu Arg 1505 1510 1515 1520 Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg Phe Lys Lys Val Val Phe 1525 1530 1535 Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Gly Glu 1540 1545 1550 Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr He Arg Ala Glu Val 1555 1560 1565 Glu Asp Asn He Met Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr 1570 1575 1580 Ser Phe Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Pro Asp Asp Gln Glu Gln Gly 1585 1590 1595 1600 Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro Asn Glu Thr Arg Thr Tyr 1605 1610 1615 Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp 1620 1625 1630 117 Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val 1635 1640 1645 His Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He Cys Arg Ala Asn Thr Leu 1650 1655 1660 Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe 1665 1670 1675 1680 Phe Thr He Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val 1685 1690 1695 Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu Gln Met Glu Asp Pro Thr 1700 1705 1710 Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala He Asn Gly Tyr Val Met Asp 1715 1720 1725 Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asn Gln Arg He Arg Trp Tyr 1730 1735 1740 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn He His Ser He His Phe Ser 1745 1750 1755 1760 118 Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val 1765 1770 1775 Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser 1780 1785 1790 Lys Val Gly He Trp Arg He Glu Cys Leu He Gly Glu His Leu Gln 1795 1800 1805 Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr Ser Lys Glu Cys Gln Ala 1810 1815 1820 Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg He Arg Asp Phe Gln He Thr Ala 1825 1830 1835 1840 Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr 1845 1850 1855 Ser Gly Ser He Asn Ala Trp Ser Thr Lys Asp Pro His Ser Trp He 1860 1865 1870 Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met He He His Gly He Met Thr Gln 1875 1880 1885 119 Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr He Ser Gln Phe He He 1890 1895 1900 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln Ser Tyr Arg Gly Asn Ser 1905 1910 1915 1920 Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ala Ser Gly He 1925 1930 1935 Lys His Asn He Phe Asn Pro Pro He Val Ala Arg Tyr He Arg Leu 1940 1945 1950 His Pro Thr His Tyr Ser He Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met 1955 1960 1965 Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Gln Asn Lys 1970 1975 1980 Ala He Ser Asp Ser Gln He Thr Ala Ser Ser His Leu Ser Asn He 1985 1990 1995 2000 Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg 2005 2010 2015 120 Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser Ala Glu Glu Trp Leu Gln 2020 2025 2030 Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr Gly He Thr Thr Gln Gly 2035 2040 2045 Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Val Ser 2050 2055 2060 Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu Phe Leu Gln Asp Gly His 2065 2070 2075 2080 Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Ser Thr Pro Val Val Asn ' 2085 2090 2095 Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg He His Pro Thr 2100 2105 2110 Ser Trp Ala Gln His He Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Glu 2115 2120 2125 Ala Gln Asp Leu Tyr 121 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Gln He Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: enlazante <400> 32 Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro 1 5 10 15 122 Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg 20 <210> 33 <211> 105 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: enlazante <400> 33 gtcattgaac etaggagett tgeccagaat tcaagacccc ctagtgcgag cgctccaaag 60 cctccggtcc tgcgacggca tcagagggac ataagccttc ctact 105 <210> 34 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico 123 <400> 34 gaggaaaacc agatgatgtc a 21 <210> 35 -<211> 60 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico <400> 35 etttggageg ctcgcactag ggggtcttga attctgggca aagctcctag gttcaatgac 60 <210> 36 <211> 66 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador oligonucleotídico 124 <400> 36 cctagtgcga gcgctccaaa gcctccggtc ctgcgacggc atcagaggga cataageett 60 cctact 66 <210> 37 <211> 4404 ¡ <212> ADN ¡ <213> Porcino ¡ 10 ¡ <220> ' <221> CDS I <222> ( 1 ) . . ( 4401 ) 15 <400> 37 atg cag cta gag etc tec acc tgt gtc ttt ctg tgt etc ttg cca etc 48 Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu 1 5 10 15 20 ggc ttt agt gcc ate agg aga tac tac ctg ggc gca gtg gaa ctg tec 96 i Gly Phe Ser Ala He Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ma Val Glu Leu Ser 20 25 30 125 tgg gac tac cgg caa agt gaa etc etc cgt gag ctg cac gtg gac acc 144 Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr 35 40 45 aga ttt cct gct acá gcg cca gga gct ctt ccg ttg ggc ccg tea gtc 192 Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val 50 55 60 ctg tac aaa aag act gtg ttc gta gag ttc acg gat caa ctt ttc age 240 Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser 65 70 75 80 gtt gcc agg ccc agg cca cca tgg atg ggt ctg ctg ggt cct acc ate 288 Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He 85 90 95 cag gct gag gtt tac gac acg gtg gtc gtt acc ctg aag aac atg gct 336 Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ma 100 105 110 tet cat ccc gtt agt ctt cac gct gtc ggc gtc tec ttc tgg aaa tet 384 Ser His Pro Val Ser Leu His Ma Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser 115 120 125 126 tec gaa ggc gct gaa tat gag gat cac acc age caa agg gag aag gaa 432 Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu 130 135 140 gac gat aaa gtc ctt ccc ggt aaa age caa acc tac gtc tgg cag gtc 480 Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val 145 150 155 160 ctg aaa gaa aat ggt cca acá gcc tet gac cca cca tgt ctt acc tac 528 Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr 165 170 175 tea tac ctg tet cac gtg gac ctg gtg aaa gac ctg aat tcg ggc etc 576 Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190 att gga gcc ctg ctg gtt tgt aga gaa ggg agt ctg acc aga gaa agg 624 He Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205 acc cag aac ctg cac gaa ttt gta cta ctt ttt gct gtc ttt gat gaa 672 Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ma Val Phe Asp Glu 210 215 220 127 ggg aaa agt tgg cac tea gca aga aat gac tec tgg acá cgg gcc atg 720 Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ma Met 225 230 235 240 gat ccc gca cct gcc agg gcc cag cct gca atg cac acá gtc aat ggc 768 Asp Pro Ala Pro Ma Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly 245 250 255 tat gtc aac agg tet ctg cca ggt ctg ate gga tgt cat aag aaa tea 816 Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu He Gly Cys His Lys Lys Ser 260 265 270 gtc tac tgg cac gtg att gga atg ggc acc age ccg gaa gtg cac tec 864 Val Tyr Trp His Val He Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser 275 280 285 att ttt ctt gaa ggc cac acg ttt etc gtg agg cac cat cgc cag gct 912 He Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ma 290 295 300 tec ttg gag ate tcg cca cta act ttc etc act gct cag acá ttc ctg 960 Ser Leu Glu He Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ma Gln Thr Phe Leu 305 310 315 320 128 atg gac ctt ggc cag ttc cta ctg ttt tgt cat ate tet tec cac cac 1008 Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His He Ser Ser His His 325 330 335 cat ggt ggc atg gag gct cac gtc aga gta gaa age tgc gcc gag gag 1056 His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu 340 345 350 ccc cag ctg cgg agg aaa gct gat gaa gag gaa gat tat gat gac aat 1104 Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn 355 360 365 ttg tac gac tcg gac atg gac gtg gtc cgg etc gat ggt gac gac gtg 1152 Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val 370 375 380 tet ccc ttt ate caa ate cgc tcg gtt gcc aag aag cat ccc aaa acc 1200 Ser Pro Phe He Gln He Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 tgg gtg cac tac ate tet gca gag gag gag gac tgg gac tac gcc ccc 1248 Trp Val His Tyr He Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ma Pro 405 410 415 129 gcg gtc ccc age ccc agt gac aga agt tat aaa agt etc tac ttg aac 1296 Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn 420 425 430 agt ggt cct cag cga att ggt agg aaa tac aaa aaa gct cga ttc gtc 1344 Ser Gly Pro Gln Arg He Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val 435 440 445 gct tac acg gat gta acá ttt aag act cgt aaa gct att ccg tat gaa 1392 Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ma He Pro Tyr Glu 450 455 460 tea gga ate ctg gga cct tta ctt tat gga gaa gtt gga gac acá ctt 1440 Ser Gly He Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 ttg att ata ttt aag aat aaa gcg age cga cca tat aac ate tac cct 1488 Leu He He Phe Lys Asn Lys Ma Ser Arg Pro Tyr Asn He Tyr Pro 485 490 495 cat gga ate act gat gtc age gct ttg cac cca ggg aga ctt cta aaa 1536 His Gly He Thr Asp Val Ser Ma Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys 500 505 510 130 ggt tgg aaa cat ttg aaa gac atg cca att ctg cca gga gag act ttc 1584 Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro He Leu Pro Gly Glu Thr Phe 515 520 525 aag tat aaa tgg acá gtg act gtg gaa gat ggg cca acc aag tec gat 1632 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 cct cgg tgc ctg acc cgc tac tac tcg age tec att aat cta gag aaa 1680 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser He Asn Leu Glu Lys 545 550 555 560 gat ctg gct tcg gga etc att ggc cct etc etc ate tgc tac aaa gaa 1728 Asp Leu Ala Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 tet gta gac caa aga gga aac cag atg atg tea gac aag aga aac gtc 1776 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 ate ctg ttt tet gta ttc gat gag aat caa age tgg tac etc gca gag 1824 He Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu 595 600 605 131 aat att cag cgc ttc etc ccc aat ccg gat gga tta cag ccc cag gat 1872 Asn He Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp 610 615 620 cca gag ttc caa gct tet aac ate atg cac age ate aat ggc tat gtt 1920 Pro Glu Phe Gln Ma Ser Asn He Met His Ser He Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 ttt gat age ttg cag ctg tcg gtt tgt ttg cac gag gtg gca tac tgg 1968 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 tac att cta agt gtt gga gca cag acg gac ttc etc tec gtc ttc ttc 2016 Tyr He Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 tet ggc tac acá ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa gac acá etc acc 2064 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 ctg ttc ccc ttc tea gga gaa acg gtc ttc atg tea atg gaa aac cca 2112 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 132 ggt etc tgg gtc ctt ggg tgc cac aac tea gac ttg cgg aac aga ggg 2160 Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 atg acá gcc tta ctg aag gtg tat agt tgt gac agg gac att ggt gat 2208 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp He Gly Asp 725 730 735 tat tat gac aac act tat gaa gat att cca ggc ttc ttg ctg agt gga 2256 Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp He Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly 740 745 750 aag aat gtc att gaa cct agg age ttt gcc cag aat tea aga ccc cct 2304 Lys Asn Val He Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro 755 760 765 agt gcg age gct cca aag cct ccg gtc ctg cga cgg cat cag agg gac 2352 Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp 770 775 780 ata age ctt cct act ttt cag ccg gag gaa gac aaa atg gac tat gat 2400 He Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp 785 790 795 800 133 gat ate ttc tea act gaa acg aag gga gaa gat ttt gac att tac ggt 2448 Asp He Phe Ser Thr Glu Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp He Tyr Gly 805 810 815 gag gat gaa aat cag gac cct cgc age ttt cag aag aga acc cga cac 2496 Glu Asp Glu Asn Gln Asp Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His 820 825 830 tat ttc att gct gcg gtg gag cag etc tgg gat tac ggg atg age gaa 2544 Tyr Phe He Ala Ma Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu 835 840 845 tec ccc cgg gcg cta aga aac agg gct cag aac gga gag gtg cct cgg 2592 Ser Pro Arg Ala Leu Arg Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg 850 855 860 ttc aag aag gtg gtc ttc cgg gaa ttt gct gac ggc tec ttc acg cag 2640 Phe Lys Lys Val Val Phe Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln 865 870 875 880 ccg tcg tac cgc ggg gaa etc aac aaa cac ttg ggg etc ttg gga ccc 2688 Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro 885 890 895 134 tac ate aga gcg gaa gtt gaa gac aac ate atg gta act ttc aaa aac 2736 Tyr He Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn He Met Val Thr Phe Lys Asn 900 905 910 cag gcg tet cgt ccc tat tec ttc tac tcg age ctt att tet tat ccg 2784 Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Pro 915 920 925 gat gat cag gag caa ggg gca gaa cct cga cac aac ttc gtc cag cca 2832 Asp Asp Gln Glu Gln Gly Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro 930 935 940 aat gaa acc aga act tac ttt tgg aaa gtg cag cat cac atg gca ccc 2880 Asn Glu Thr Arg Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro 945 950 955 960 acá gaa gac gag ttt gac tgc aaa gcc tgg gcc tac ttt tet gat gtt 2928 Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val 965 970 975 gac ctg gaa aaa gat gtg cac tea ggc ttg ate ggc ccc ctt ctg ate 2976 Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He 980 985 990 135 tgc cgc gcc aac acc ctg aac gct gct cac ggt aga caa gtg acc gtg 3024 Cys Arg Ala Asn Thr Leu Asn Ma Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val 995 1000 1005 caa gaa ttt gct ctg ttt ttc act att ttt gat gag acá aag age tgg 3072 Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr He Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp 1010 1015 1020 tac ttc act gaa aat gtg gaa agg aac tgc cgg gcc ccc tgc cat ctg 3120 Tyr Phe Thr Glu Asn Val Glu Arg Asn Cys Arg Ma Pro Cys His Leu 1025 1030 1035 1040 cag atg gag gac ccc act ctg aaa gaa aac tat cgc ttc cat gca ate 3168 Gln Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ma He 1045 1050 1055 aat ggc tat gtg atg gat acá etc cct ggc tta gta atg gct cag aat 3216 Asn Gly Tyr Val Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asn 1060 1065 1070 caa agg ate cga tgg tat ctg etc age atg ggc age aat gaa aat ate 3264 Gln Arg He Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn He 1075 1080 1085 136 cat tcg att cat ttt age gga cac gtg ttc agt gta cgg aaa aag gag 3312 His Ser He His Phe Ser Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu 1090 1095 1100 gag tat aaa atg gcc gtg tac aat etc tat ccg ggt gtc ttt gag acá 3360 Glu Tyr Lys Met Ma Val Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr 1105 1110 1115 1120 gtg gaa atg cta ccg tec aaa gtt gga att tgg cga ata gaa tgc ctg 3408 Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Val Gly He Trp Arg He Glu Cys Leu 1125 1130 1135 att ggc gag cac ctg caa gct ggg atg age acg act ttc ctg gtg tac 3456 He Gly Glu His Leu Gln Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr 1140 1145 1150 age aag gag tgt cag gct cca ctg gga atg gct tet gga cgc att aga 3504 Ser Lys Glu Cys Gln Ala Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg He Arg 1155 1160 1165 gat ttt cag ate acá gct tea gga cag tat gga cag tgg gcc cca aag 3552 Asp Phe Gln He Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys 1170 1175 1180 137 ctg gcc aga ctt cat tat tec gga tea ate aat gcc tgg age acc aag 3600 Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser He Asn Ma Trp Ser Thr Lys 1185 1190 1195 1200 gat ccc cac tec tgg ate aag gtg gat ctg ttg gca cca atg ate att 3648 Asp Pro His Ser Trp He Lys Val Asp Leu Leu Ma Pro Met He He 1205 1210 1215 cac ggc ate atg acc cag ggt gcc cgt cag aag ttt tec age etc tac 3696 His Gly He Met Thr Gln Gly Ma Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1220 1225 1230 ate tec cag ttt ate ate atg tac agt ctt gac ggg agg aac tgg cag 3744 He Ser Gln Phe He He Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln 1235 1240 1245 agt tac cga ggg aat tec acg ggc acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat 3792 Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn 1250 1255 1260 gtg gac gca tet ggg att aaa cac aat att ttt aac cct ccg att gtg 3840 Val Asp Ala Ser Gly He Lys His Asn He Phe Asn Pro Pro He Val 1265 1270 1275 1280 138 gct cgg tac ate cgt ttg cac cca acá cat tac age ate cgc age act 3888 Ala Arg Tyr He Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser He Arg Ser Thr 1285 1290 1295 ctt cgc atg gag ttg atg ggc tgt gat tta aac agt tgc age atg ccc 3936 Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro 1300 1305 1310 ctg gga atg cag aat aaa gcg ata tea gac tea cag ate acg gcc tec 3984 Leu Gly Met Gln Arn Lys Ala He Ser Asp Ser Gln He Thr Ma Ser 1315 1320 1325 tec cac cta age aat ata ttt gcc acc tgg tet cct tea caa gcc cga 4032 Ser His Leu Ser Asn He Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg 1330 1335 1340 ctt cac etc cag ggg cgg acg aat gcc tgg cga ccc cgg gtg age age 4080 Leu His Leu Gln Gly Arg Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser 1345 1350 1355 1360 gca gag gag tgg ctg cag gtg gac ctg cag aag acg gtg aag gtc acá 4128 Ala Glu Glu Trp Leu Gln Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr 1365 1370 1375 139 ggc ate acc acc cag ggc gtg aag tec ctg etc age age atg tat gtg 4176 Gly He Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val 1380 1385 1390 aag gag ttc etc gtg tec agt agt cag gac ggc cgc cgc tgg acc ctg 4224 Lys Glu Phe Leu Val Ser Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu 1395 1400 1405 ttt ctt cag gac ggc cac acg aag gtt ttt cag ggc aat cag gac tec 4272 Phe Leu Gln Asp Gly His Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser 1410 1415 1420 tec acc ccc gtg gtg aac gct ctg gac ccc ccg ctg ttc acg cgc tac 4320 Ser Thr Pro Val Val Asn Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr 1425 1430 1435 1440 ctg agg ate cac ccc acg age tgg gcg cag cac ate gcc ctg agg etc 4368 Leu Arg He His Pro Thr Ser Trp Ala Gln His He Ala Leu Arg Leu 1445 1450 1455 gag gtt cta gga tgt gag gca cag gat etc tac tga 4404 Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1460 1465 140 <210> 38 <211> 1467 <212> PRT <213> Porcino <400> 38 Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu 1 5 10 15 Gly Phe Ser Ala He Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr 35 40 45 Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val 50 55 60 Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser 65 70 75 Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He 85 90 95 141 Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala 100 105 110 Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser 115 120 125 Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu 130 135 140 Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val 145 150 155 160 Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr 165 170 175 Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190 He Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205 Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu 210 215 220 142 Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met 225 230 235 240 Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly 245 250 255 Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu He Gly Cys His Lys Lys Ser 260 265 270 Val Tyr Trp His Val He Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser 275 280 285 He Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ala 290 295 300 Ser Leu Glu He Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu 305 310 315 320 Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His He Ser Ser His His 325 330 335 His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu. Ser Cys Ala Glu Glu 340 345 350 143 Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn 355 360 365 Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val 370 375 380 Ser Pro Phe He Gln He Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr He Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn 420 425 430 Ser Gly Pro Gln Arg He Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala He Pro Tyr Glu 450 455 460 Ser Gly He Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 144 Leu He He Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn He Tyr Pro 485 490 495 His Gly He Thr Asp Val Ser Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys 500 505 510 Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro He Leu Pro Gly Glu Thr Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser He Asn Leu Glu Lys 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 He Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu 595 600 605 145 Asn He Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn He Met His Ser He Asn Gly Tyr Val 625 630 635 - 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr He Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp He Gly Asp 725 730 735 146 Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp He Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly 740 745 750 Lys Asn Val He Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro 755 760 765 Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp 770 775 780 He Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp 785 790 795 800 Asp He Phe Ser Thr Glu Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp He Tyr Gly 805 810 815 Glu Asp Glu Asn Gln Asp Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His 820 825 830 Tyr Phe He Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu 835 840 845 Ser Pro Arg Ala Leu Arg Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg 850 855 860 147 Phe Lys Lys Val Val Phe Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln 865 870 875 880 Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro 885 890 895 Tyr He Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn He Met Val Thr Phe Lys Asn 900 905 910 Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Pro 915 920 925 Asp Asp Gln Glu Gln Gly Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro 930 935 940 Asn Glu Thr Arg Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro 945 950 955 960 Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val 965 970 975 sp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu He 980 985 990 148 Cys Arg Ala Asn Thr Leu Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val 995 1000 1005 Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr He Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp 1010 1015 1020 Tyr Phe Thr Glu Asn Val Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu 1025 1030 1035 1040 Gln Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe Hís Ala He 1045 1050 1055 Asn Gly Tyr Val Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asn 1060 1065 1070 Gln Arg He Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn He 1075 1080 1085 His Ser He His Phe Ser Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu 1090 1095 1100 Glu Tyr Lys Met Ala Val Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr 1105 1110 1115 1120 149 Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Val Gly He Trp Arg He Glu Cys Leu 1125 1130 1135 He Gly Glu His Leu Gln Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr 1140 1145 1150 Ser Lys Glu Cys Gln Ala Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg He Arg 1155 1160 1165 Asp Phe Gln He Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys 1170 1175 1180 Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser He Asn Ala Trp Ser Thr Lys 1185 1190 1195 1200 Asp Pro His Ser Trp He Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met He He 1205 1210 1215 His Gly He Met Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1220 1225 1230 He Ser Gln Phe He He Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln 1235 1240 1245 150 Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn 1250 1255 1260 Val Asp Ala Ser Gly He Lys His Asn He Phe Asn Pro Pro He Val 1265 1270 1275 1280 Ala Arg Tyr He Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser He Arg Ser Thr 1285 1290 1295 Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro 1300 1305 1310 Leu Gly Met Gln Asn Lys Ala He Ser Asp Ser Gln He Thr Ala Ser 1315 1320 1325 Ser His Leu Ser Asn He Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg 1330 1335 1340 Leu His Leu Gln Gly Arg Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser 1345 1350 1355 1360 Ala Glu Glu Trp Leu Gln Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr 1365 1370 1375 *. 151 Gly He Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val 1380 1385 1390 Lys Glu Phe Leu Val Ser Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu 5 1395 1400 1405 Phe Leu Gln Asp Gly His Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser 1410 1415 1420 10 Ser Thr Pro Val Val Asn Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr 1425 1430 1435 1440 Leu Arg He His Pro Thr Ser Trp Ala Gln His He Ala Leu Arg Leu 1445 1450 1455 15 Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1460 1465

Claims (1)

1. 94 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de POL1212 como se expone en la SEQ ID NO: 38. 2. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un ADN de conformidad con la reivindicación 1. 3. El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 37. 4. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un ADN de conformidad con la reivindicación 3. 5. Un factor VIII porcino modificado, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38. 6. Una composición terapéutica, caracterizada porque comprende un factor VIII porcino modificado de conformidad con la reivindicación 5 y un portador fisiológicamente aceptable. 7. Un método para producir una proteína de factor VIII porcino modificado, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, caracterizado porque comprende 95 expresar en una célula huésped de mamífero un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 38. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 también codifica para un péptido señal, por lo que la proteína del factor VIII porcino modificado es exportada de la célula huésped de mamífero. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos 1-19 de la SEQ ID NO: 30. 10. Una célula de mamífero, caracterizada porque contiene y reproduce un vector de expresión que comprende ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos del POL1212 como se expone en la SEQ ID NO: 38. 11. La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el vector que comprende ADN tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 37. 12. La célula de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula huésped es BHK CRL-1632.