SK286205B6

SK286205B6 - Modifikovaný faktor VIII a DNA, ktorá ho kóduje

Info

Publication number: SK286205B6
Application number: SK1439-2002A
Authority: SK
Inventors: John S. Lollar
Original assignee: Emory University
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2008-05-06
Also published as: JP4044337B2; NO20024296D0; RU2285724C2; LTC1280540I2; CY2016011I2; NZ520799A; IL151371A0; CY2016011I1; BRPI0109131B1; AU3841601A; NL300808I2; SK14392002A3; EE200200510A; HUP0300586A2; HUS1600020I1; BE2016C024I2; DE60133541D1; RU2002124123A; SI1280540T1; KR20020081426A

Abstract

Je uvedená modifikovaná forma prasačieho faktora VIII, ktorý nemá doménu B, DNA kódujúca túto formua ich použitie na liečenie hemofílie.

Description

Modifikovaný faktor VIII a DNA, ktorá ho kóduje

Patent si nárokuje prioritu z prihlášky USA č. 09/037,601 podanej 10. marca 1998; ktorá predstavuje prihlášku, ktorá čiastočne pokračuje v prihláške USA č. 08/670,707 podanej 26. júna 1996, na základe ktorej bol udelený patent USA č. 5 859 204, a 26. júna 1997 bola podaná medzinárodná prihláška PCT/US97/11155.

Vláde USA prináležia isté práva vzhľadom na predkladaný vynález, ktoré vyplývajú z grantu č. HL46215 Národných ústavov zdravia, z ktorého bol čiastočne financovaný výskum, ktorý viedol k predkladanému vynálezu.

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka oblasti krvnej koagulácie, najmä faktora VIII. Konkrétne sa vynález týka modifikovanej formy prasačieho faktora VIII, ktorému chýba doména B, DNA, ktorá kóduje túto formu a ich použitia v lekárstve.

Doterajší stav techniky

Koagulácia (zrážanie) krvi začína tým, že doštičky adherujú na plochu rezu v poranenej krvnej cieve v mieste lezie. Následne sa v kaskáde enzymaticky regulovaných reakcií premieňajú rozpustné molekuly fibrinogénu za účasti enzýmu trombínu na nerozpustné vlákna fibrínu, ktoré držia doštičky pohromade v trombe. V každom kroku tejto kaskády je proteínový prekurzor premieňaný na proteázu, ktorá štiepi nasledujúci proteínový prekurzor v rade. Vo väčšine krokov sú potrebné kofaktory.

Faktor VIII cirkuluje ako inaktívny prekurzor v krvi, tesne a nekovalentne viazaný na von Willebrandov faktor. Faktor VIII je proteolyticky aktivovaný trombínom alebo faktorom Xa, ktorý ho disociuje od von Willcbrandovho faktora a aktivuje jeho prokoagulačnú funkciu v kaskáde. Vo svojej aktívnej forme je proteínový faktor VlIIa kofaktorom, ktorý zvyšuje katalytickú účinnosť faktora IXa na aktiváciu faktora X až o niekoľko rádov.

Ľudia s deficienciami faktora VIII alebo protilátkami proti faktoru VIII, ktorí nie sú liečení faktorom VIII, trpia nekontrolovaným vnútorným krvácaním, ktoré môže spôsobovať rad vážnych symptómov, od zápalových reakcií v kĺboch až po predčasné úmrtie. Ťažkí hemofilici, ktorých je iba v USA približne 10 000, sa môžu liečiť infúziami ľudského faktora VIII, ktorý obnoví normálnu koagulačnú schopnosť krvi, pokiaľ je liečenie uskutočňované v dostatočnej frekvencii a koncentrácii. Klasická definícia faktora VIII je, že je to látka prítomná v normálnej krvnej plazme, ktorá koriguje defekty koagulácie v plazme pochádzajúcej od jedincov s hemofíliou A.

Vytváranie protilátok („inhibítorov“ alebo „inhibičných protilátok“), ktoré inhibujú aktivitu faktora VIII, je vážnou komplikáciou pri liečení pacientov s hemofíliou. Autoprotilátky sa vyvíjajú približne u 20 % pacientov s hemofíliou A v reakcii na terapeutickú infúziu faktora VIII. U pacientov s hemofíliou A, ktorí neboli predtým liečení, a u ktorých sa vyvinuli inhibítory, sa zvyčajne inhibítor vyvinie v priebehu jedného roku liečenia. Navyše autoprotilátky, ktoré inaktivujú faktor VIII, sa príležitostne vyvíjajú aj u jedincov, ktorí mali aj predtým normálnu hladinu faktora VIII. Keď je titer inhibítorov dostatočne nízky, pacient sa môže liečiť zvyšujúcimi sa dávkami faktora VIII. Ale často je titer inhibitora tak vysoký, že sa nemôže prekonať ani faktorom VIII. Alternatívnou stratégiou je preto obídenie potreby faktora VIII v priebehu normálnej homeostázy použitím komplexných prípravkov faktora IX (napríklad KONYNE®, Proplex®) alebo rekombinantného ľudského faktora VlIIa. Navyše sa použil aj prípravok čiastočne purifikovaného prasačieho faktora VIII (HYATE:C®), pretože prasačí faktor VIII má zvyčajne podstatne nižšiu inhibičnú reaktivitu ako ľudský faktor VIII. Mnoho pacientov, u ktorých sa vyvinuli inhibičné protilátky na ľudský faktor VIII, sa úspešne liečilo prasačím faktorom VIII a toto liečenie bolo dlho tolerované. Ale podávanie prasačieho faktora VIII nie je úplným riešením, pretože sa u niektorých pacientov po jednej alebo viacerých infúziách vyvinú protilátky na prasačí faktor VIII.

Niekoľko prípravkov ľudského, z plazmy pochádzajúceho faktora VIII s rôznym stupňom čistoty, je dostupných komerčne na liečenie hemofílie A. Patrí k nim tiež čiastočne purifikovaný faktor VIII pochádzajúci zo zlúčenej krvi mnohých darcov, ktorá bola protivírusovo ošetrená pôsobením tepla a detergentov, ale obsahuje významnú hladinu antigénnych proteínov, faktor VIII purifikovaný pomocou monoklonálnych protilátok, ktorý má nižšiu hladinu antigénnych nečistôt a vírusovej kontaminácie a rekombinantný ľudský faktor VIII, ktorý je zatiaľ v štádiu klinických skúšok. Nanešťastie ľudský faktor VIII je nestabilný pri fyziologických koncentráciách a pH, je prítomný v krvi v mimoriadne nízkej koncentrácii (0,2 pg/ml plazmy) a má veľmi nízku špecifickú koagulačnú aktivitu. Obavy v zdravotníctve, ktoré sa týkajú rizika vírusovej infekcie alebo inej krvou prenášanej kontaminácie, obmedzujú užitočnosť prasačieho faktora VIII purifikovaného z prasačej krvi.

Hemofilici vyžadujú denné dopĺňanie faktora VIII na prevenciu krvácania a v dôsledku toho vznikajúcej deformujúcej artropatie hemofílikov. Ale prísun je nedostatočný a terapeutické použitie je problematické z dôvodu namáhavej izolácie, imunogenicity, a tiež nutnosti odstrániť riziko infekcií AIDS a hepatitídy. Ani použitie rekombinantného ľudského faktora VIII alebo čiastočne purifikovaného prasačieho faktora VIII nerieši všetky už skôr uvedené problémy.

Problémy spojené so všeobecne používaným, komerčne dostupným faktorom VIII, ktorý pochádza z plazmy, významne stimulovali záujem o vývoj lepšieho prípravku faktora VIII. Existuje potreba účinnejšieho faktora VIII, aby sa mohlo jednou molekulou podať viac jednotiek koagulačnej aktivity, stabilnejšieho faktora VIII, ktorého molekula je stabilná vo vybranom pH a fyziologickej koncentrácii, faktora VIII, ktorého molekula je menej náchylná na to, aby vyvolávala tvorbu inhibičných protilátok, a nakoniec faktora VIII, ktorého molekula unikne imunitnej detekcii (rozpoznaniu) v organizme pacienta, ktorý už získal protilátky na ľudský faktor VIII.

Preto je cieľom predkladaného vynálezu poskytnúť faktor VIII, ktorý lieči hemofíliu u pacienta s defícienciou faktora VIII alebo s inhibíciou ľudského faktora VIII.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsoby liečenia hemofílikov.

Ešte ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť faktor VIII, ktorý je stabilný pri vybranom pH a fyziologických koncentráciách.

Ešte ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť faktor VIII, ktorý má väčšiu koagulačnú aktivitu ako ľudský faktor VIII.

A ešte ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť faktor VIII, na ktorý sa bude tvoriť menej protilátok.

A ešte ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť spôsob výroby rekombinantného prasačieho faktora VIII a najmä špecificky modifikovaného prasačieho faktora VIII.

Podstata vynálezu

Určenie celej DNA sekvencie, kódujúcej prasačí faktor VIII, ktorá je uvedená v zozname sekvencií, umožnilo po prvýkrát syntézu úplného prasačieho faktora VIII použitím expresie DNA, ktorá kóduje prasačí faktor VIII vo vhodných hostiteľských bunkách. Purifikovaný rekombinantný prasačí faktor VIII je preto jedným aspektom predkladaného vynálezu. DNA, ktorá kóduje každú z domén prasačieho faktora VIII rovnako tak ako akýkoľvek jeho špecifický fragment, sa môžu obdobne exprimovať. Okrem toho prasačí faktor VIII (fVIII), ktorý má deletovanú (odstránenú) časť alebo celú doménu B (prasačí fVIII bez domény B) je poskytnutý ako súčasť predkladaného vynálezu, a to tým, že sa exprimuje DNA, ktorá kóduje prasačí fVIII, ktorý má deléciu jedného alebo viacerých kodónov v B doméne.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje farmaceutické kompozície a spôsoby liečenia pacientov, ktorí trpia deficienciou faktora VIII, ktoré zahŕňajú podávanie rekombinantného prasačieho faktora VIII alebo modifikovaného rekombinantného prasačieho faktora VIII, najmä prasačieho faktora VIII, ktorému chýba doména B.

Podrobný opis vynálezu

Pokiaľ nie je uvedené inak, používaný termín „faktor VIII“ označuje akúkoľvek funkčnú molekulu proteínu faktora VIII z akéhokoľvek cicavca.

Termín „cicavčí faktor VIII“, ako je používaný, zahŕňa faktor VIII, ktorého aminokyselinová sekvencia je odvodená z akéhokoľvek cicavca, okrem človeka, pokiaľ nie je konkrétne uvedené inak. Termín „zviera” alebo „živočích“ označuje napr. prasa a ďalšie cicavce s výnimkou človeka.

Termín „fúzny proteín” alebo „fúzny faktor VIII, alebo jeho fragment” v predkladanom opise označuje produkt hybridného génu, kde kódujúca sekvencia jedného proteínu je zmenená, napríklad spojením s časťou kódujúcej sekvencie druhého proteínu z iného génu v správnom čítacom rámci, takže dochádza k neprerušenej transkripcii a translácii spojených segmentov, takže vzniká hybridný gén kódujúci fúzny proteín.

„Zodpovedajúca” nukleová kyselina alebo aminokyselina, alebo ich sekvencia, tak ako sa tu používa, je prítomná v mieste molekuly faktora VIII alebo jej fragmentu, ktoré má rovnakú štruktúru a/alebo fiinkciu ako miesto molekuly faktora VIII iného biologického druhu, aj keď počet báz nukleových kyselín alebo aminokyselín nemusí byť identický. DNA sekvencia „zodpovedajúca” inej sekvencií faktora VIII v podstate zodpovedá takej sekvencií a hybridizuje s takto označenou sekvenciou za stringentných podmienok. DNA sekvencia „zodpovedajúca” inej sekvencií faktora VIII tiež zahŕňa sekvenciu, ktorá je výsledkom expresie faktora VIII alebo jeho fragmentu a hybridizovala by s označenou sekvenciou, ak by neexistovala redundancia genetického kódu.

Termín jedinečný” aminokyselinový zvyšok alebo sekvencia označujú akýkoľvek aminokyselinový zvyšok alebo akúkoľvek sekvenciu v molekule faktora VIII jedného biologického druhu, ktorá je odlišná od ho mologického zvyšku alebo sekvencie molekuly faktora VIII iného biologického druhu.

Termín „špecifická aktivita” ako sa používa, sa týka aktivity, ktorá napraví defekt koagulácie v ľudskej plazme, ktorá je deficientna na faktor VIII. Špecifická aktivita sa meria v jednotkách aktivity zrážania na jeden miligram celkového proteínu faktora VIII v štandardnom teste, keď je koagulačný čas ľudskej plazmy deficientny na faktor VIII porovnávaný s normálnou ľudskou plazmou. Jedna jednotka aktivity faktora VIII je aktivita prítomná v jednom mililitri normálnej ľudskej plazmy. V tomto teste, čím kratší čas je potrebný na vytvorenie trombu, tým väčšia je aktivita testovaného faktora VIII. Prasačí faktor VIII prejavuje koagulačnú aktivitu v teste na ľudský faktor VIII.

Termín „expresia” sa týka súboru procesov, ku ktorým dochádza, keď sa používa genetická informácia na to, aby poskytla produkt. DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu prasačieho faktora VIII, sa môže „exprimovať” v cicavčej hostiteľskej bunke, aby sa získal proteín prasačieho faktora VIII. Materiály, genetické štruktúry, hostiteľské bunky a podmienky, ktoré umožňujú expresiu danej DNA sekvencie sú odborníkom dobre známe, a môžu sa upraviť tak, aby sa ovplyvnil čas a množstvo expresie, rovnako ako intra- alebo extraceluláma lokalizácia exprimovaného proteínu. Napríklad po vložení DNA, ktorá kóduje signálny peptid na 5’ konci DNA kódujúcej prasačí faktor VIII (5’ koniec je zvyčajne koniec DNA, ktorý kóduje NH₂ terminálnu časť proteínu), je exprimovaný proteín exportovaný zvnútra hostiteľskej bunky do kultivačného média. Vytvorenie kombinácie DNA, ktorá kóduje signálny peptid s DNA, ktorá kóduje prasačí faktor VIII, je výhodné, pretože exprimovaný faktor VIII je exportovaný do kultivačného média, čo zjednodušuje proces purifikácie. Výhodný signálny peptid je signálny peptid cicavčieho faktora VIII.

Nukleotidová sekvencia cDNA ľudského faktora VIII a predikovaná aminokyselinová sekvencia sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a 2, v uvedenom poradí. Faktor VIII sa syntetizuje ako približne 300 kDa jednoreťazcový proteín s vnútornou sekvenčnou homológiou, ktorá definuje „doménovú” sekvenciu NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. V molekule faktora VIII termín „doména” označuje súvislú sekvenciu aminokyselín, ktorá je definovaná internou aminokyselinovou sekvenčnou identitou a miestami proteolytického štiepenia trombínom. Pokiaľ nie je uvedené inak, domény faktora VIII zahŕňajú nasledujúce aminokysclinové zvyšky, keď sa sekvencie priradia („align”) k ľudskej aminokyselinovej sekvencii (sekvencia SEQ ID NO: 2): Al, zvyšky Alal-Arg372; A2, zvyšky Ser373-Arg740; B, zvyšky Ser741-Argl648; A3, zvyšky Serl690-Ile2032; Cl, zvyšky Arg2033-Asn2172; C2, zvyšky Ser2173-Tyr2332. Sekvencia A3-C1-C2 zahŕňa zvyšky Serl690-Tyr2332. Zostávajúci segment, ktorý zahŕňa zvyšky Glul649-Argl689, je zvyčajne označovaný ako aktivačný peptid ľahkého reťazca faktora VIII. Faktor VIII je proteolyticky aktivovaný trombínom alebo faktorom Xa, ktorý ho disociuje od von Willebrandovho faktora, vytvára sa tak faktor VlIIa, ktorý má prokoagulačnú funkciu. Biologická funkcia faktora Vitia je zvyšovanie katalytickej účinnosti faktora IXa proti aktivácii faktora X až o niekoľko rádov. Trombínom aktivovaný faktor VlIIa je 160 kDa veľký heterotrimér A1/A2/A3-C1-C2, ktorý vytvára komplex s faktorom IXa a faktorom X na povrchu doštičiek alebo monocytov. „Čiastočná” doména v texte označuje súvislú sekvenciu aminokyselín, ktorá tvorí časť domény.

„Podjednotky” ľudského alebo zvieracieho faktora VIII označujú ťažké a ľahké proteínové reťazce. Ťažký reťazec faktora VIII obsahuje tri domény, Al, A2 a B. Ľahký reťazec faktora VIII obsahuje tiež tri domény, a to A3, Cl a C2.

Termíny „epitop,” „antigénne miesto” a „antigénny determinant” sú v texte používané ako synonymá, a sú definované ako časť ľudského alebo zvieracieho faktora VIII, alebo fragmenty, ktoré sú špecificky rozpoznávané protilátkou. Môže pozostávať z ľubovoľného počtu aminokyselinových zvyškov a môže závisieť od primárnej, sekundárnej alebo terciámej štruktúry proteínu.

Termín „imunogénne miesto” je v texte definovaný ako úsek ľudského alebo zvieracieho faktora VIII, alebo jeho fragmentu, ktorý špecificky vyvoláva tvorbu protilátok proti faktoru VIII, alebo jeho fragment, u človeka alebo zvieraťa, ktorý je detegovaný rutinným postupom, ako je napr. imunotest, napr. ELISA alebo opísaný tzv. Bethesda test. Môže pozostávať z ľubovoľného počtu aminokyselinových zvyškov a môže závisieť od primárnej, sekundárnej alebo terciámej štruktúry proteínu. V niektorých uskutočneniach hybridný alebo hybridný ekvivalentný faktor VIII, alebo jeho fragment nie je imunogénny alebo je menej imunogénny u zvieraťa alebo človeka než ľudský alebo prasačí faktor VIII.

„Deficiencia faktora VIII”, tak ako sa tu používa, zahŕňa deficienciu koagulačnej aktivity spôsobenú tvorbou defektného faktora VIII, nedostatočnou alebo nulovou tvorbou faktora VIII, alebo čiastočnou, alebo úplnou inhibíciou faktora VIII vplyvom inhibítorov. Hemofília A je typ deficiencie faktora VIII, ktorý je dôsledkom defektu na X-viazanom géne a absencie alebo deficiencie proteínu faktora VIII, ktorý gén kóduje.

Termín „diagnostický test” sa týka všetkých testov, ktoré nejakým spôsobom využívajú interakcie antigénu s protilátkou na detekciu a/alebo kvantifikáciu množstva sledovanej protilátky, ktorá je prítomná v testovanej vzorke, ako pomoc pri stanovení vhodnej terapie. Odborníkom je známy celý rad takých testov. Je zrejmé, že ľudská, prasačia alebo modifikovaná prasačia DNA faktora VIII alebo jej fragment a z nej exprimovaný proteín, celý alebo jeho časť, sa môžu využiť na nahradenie zodpovedajúcich reagencií v známych testoch, takže potom sa takto modifikovaný test môže použiť na detekciu a/alebo kvantifikáciu protilátok

SK 286205 Β6 proti faktoru VIII. Je to práve použitie týchto reagencií, DNA faktora VIII alebo jej fragmentu, alebo z nich exprimovaného proteínu, čo dovoľuje modifikovať známe testy, aby boli vhodné na detekciu protilátok proti ľudskému alebo zvieraciemu faktoru VIII. K takýmto testom patria, bez toho, aby bol zoznam obmedzujúci, ELISA testy, imunodifúzne testy a imunoprenosové testy (imunobloty). Vhodné postupy na realizáciu týchto testov sú odborníkom dobre známe. Faktor VIII alebo jeho fragment, ktorý obsahuje aspoň jeden epitop proteínu, sa môže použiť ako diagnostická reagencia. Medzi príklady ďalších testov, kde sa môže využiť ľudský, prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII lebo jeho fragment, je Bethesda test a antikoagulačný test.

Termín „DNA kódujúca proteín, ako prasačí faktor Vili“ znamená polydeoxynukleovú kyselinu, ktorej nukleotidová sekvencia predstavuje kódujúcu informáciu pre hostiteľskú bunku na expresiu aminokyselinovej sekvencie proteínu, teda napr. prasačieho faktora VIII, v súlade so známymi vzťahmi genetického kódu.

Termín „expresný produkt“ DNA, ktorý kóduje ľudský alebo zvierací faktor VIII alebo modifikovaný faktor VIII je produkt získaný expresiou príslušnej DNA vo vhodnej hostiteľskej bunke, pričom expresia zahŕňa také pre- alebo posttranslačné modifikácie proteínu kódovaného príslušnou DNA, ako je, bez toho, aby bol zoznam obmedzujúci, glykozylácia, proteolytické štiepenie a pod. Odborníkovi je známe, že k takýmto modifikáciám dochádza a môžu sa mierne líšiť v závislosti od typu hostiteľskej bunky a ďalších faktorov a v ich dôsledku dochádza k vzniku molekulárnych izoforiem produktu, ktorý si však uchováva prokoagulačnú aktivitu. Pozri napr. publikácie Lind, P. et al., Eur. J. Biochem, 232:1927 (1995), zahrnutá formou odkazu.

Termín „expresný vektor“ označuje DNA element, často s kruhovou štruktúrou, ktorý má schopnosť autonómne sa replikovať v požadovanej hostiteľskej bunke alebo sa integrovať do genómu hostiteľskej bunky a má tiež určité, odborníkom dobre známe, rysy, ktoré umožňujú expresiu kódujúcej DNA, ktorá sa vložila do sekvencie vektora vo vhodnom mieste a vo vhodnej orientácii. Medzi tieto rysy patrí, ale bez obmedzenia, prítomnosť promótorovej sekvencie na riadenie iniciácie transkripcie kódujúcej DNA a tiež ďalšie DNA elementy, ako sú napr. enhancery, polyadenylačné miesta a pod., všetko odborníkom dobre známe. Termín „expresný vektor“ sa používa na označenie tak vektorov, ktoré majú DNA kódujúcu sekvenciu, ktorá sa má exprimovať, vloženú do svojej sekvencie, ako aj vektorov, ktoré majú potrebné elementy na kontrolu expresie vzhľadom na miesto inzercie usporiadané tak, že môžu slúžiť na expresiu akejkoľvek sekvencie DNA, ktorá je vložená do tohto miesta inzercie, všetko v odbore dobre známe. Tak napríklad vektor, ktorému chýba promótor, sa môže stať expresným vektorom tak, že sa do neho vloží promótor kombinovaný s kódujúcou DNA.

Všeobecný opis metód

Patent USA č. 5,364,771 opísal objav molekuly hybridného ľudského/prasačieho faktora VIII, ktorá mala koagulačnú aktivitu, v ktorej boli elementy molekuly faktora VIII iných biologických druhov nahradené zodpovedajúcimi elementmi ľudského alebo prasačieho faktora VIII. Patent USA č. 5,663,060 opisuje prokoagulačné hybridné ľudské/zvieracie a hybridné ekvivalentné molekuly faktora VIII, kde elementy v molekule faktora VIII jedného biologického druhu boli nahradené elementmi molekuly faktora VIII iného biologického druhu.

Pretože súčasné informácie naznačujú, že B doména nemá žiadny inhibičný epitop a nemá žiadny známy účinok na funkciu faktora VIII, v niektorých uskutočneniach vynálezu je B doména, celá alebo aspoň jej časť, deletovaná v aktívnej hybridnej molekule alebo hybridnej ekvivalentnej molekule faktora VIII, alebo jej fragmentoch („B(-) faktor Vili“), pripravených ktoroukoľvek z opísaných metód.

Gén pre ľudský faktor VIII sa izoloval a exprimoval v cicavčích bunkách ako publikovali Toole, J. J. et al. (1984) Náture 312:342-347 (Genetics Inštitúte); Gitschier, J. et al. (1984) Náture 312:326-330 (Genetech); Wood, W.I. et al. (1984) Náture 312:330-337 (Genetech); Vehar, G. A. et al. (1984) Náture 312:337-342 (Genetech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; Patent USA č. 4,757,006 a aminokyselinová sekvencia sa dedukovala z cDNA. Patent USA č. 4 965 199 (Capon et al.) odhaľuje metódu rekombinantnej DNA na prípravu faktora VIII v cicavčích hostiteľských bunkách a purifikáciu ľudského faktora VIII. Opísala sa tiež expresia ľudského faktora VIII v bunkách CHO (ovárium čínskeho škrečka, Chinese hamster ovary) a bunkách BHKC (obličkové bunky novorodených škrečkov, baby hamster kidney cells). Ľudský faktor VIII sa modifikoval tým, že sa odstránila B doména, buď celá, alebo jej časť (Patent USA č. 4,868,112) a vyskúšalo sa nahradenie B domény ľudského faktora VIII B doménou ľudského faktora V (Patent USA č. 5,004,803). cDNA sekvencia, ktorá kóduje ľudský faktor VIII a predikovaná aminokyselinová sekvencia sú uvedené v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a sekvencia SEQ ID NO: 2, v uvedenom poradí. V sekvencii SEQ ID NO: 1 začína kódujúci úsek nukleotidom v polohe 208, pričom triplet GCC je kodónom pre aminokyselinu číslo 1 (Ala) zrelého proteínu, ktorý je uvedený ako sekvencia SEQ ID NO: 2.

Prasačí faktor VIII sa izoloval z plazmy (Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594). Čiastočná aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII zodpovedajúca úsekom N-konca ľahkého reťazca, ktorá má homológiu s ceruloplazmínom a koagulačným faktorom V je opísaná v publikácii Church et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) Náture 312:342-347 opísal čiastočné sekvenovanie N-koncovej časti štyroch aminokyselinových fragmentov prasačieho faktora VIII, ale necharakterizoval fragmenty vzhľadom na ich pozíciu v molekule faktora VIII. Aminokyselinová sekvencia B domény a časti A2 domény prasačieho faktora VIII sú opísané v publikácii Toole, J.J. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81:5939-5942. cDNA sekvencia kódujúca úplnú A2 doménu prasačieho faktora VIII a predikovaná aminokyselinová sekvencia a tiež hybridný ľudský/prasačí faktor VIII, ktorý má substitúciu všetkých domén, všetkých podjednotiek a špecifických aminokyselinových sekvencii, sú opísané v patente USA č. 5 364 771 nazvanom „Hybridný/prasačí faktor VIII“, ktorý bol udelený 15. novembra 1994 a tiež v medzinárodnej prihláške 93/20093 zverejnenej 14. apríla 1993. cDNA sekvencia, ktorá kóduje A2 doménu prasačieho faktora VIII, zodpovedajúca zvyškom 373-740 zrelého ľudského faktora VIII, ako je uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 1 a predikovaná aminokyselinová sekvencia sú uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 3 a 4. Nedávno nukleotidová sekvencia a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia časti Al domény, ktorej chýba prvých 198 aminokyselín a A2 domény prasačieho faktora VIII boli opísané v medzinárodnej prihláške WO 94/11503 zverejnenej 26. mája 1994. Celá nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje prasačí faktor VIII, vrátane úplnej Al domény, aktivačného peptidu, domén A3, Cl a C2 a tiež kódovaná aminokyselinová sekvencia, sa nakoniec získali a opísali Lollarom v patente USA č. 5,859,204, udelenom 12. januára 1999 a tiež v medzinárodnej prihláške WO 97/49725, zverejnenej 31. decembra 1997, pričom obe publikácie sú zahrnuté formou odkazu.

Tak prasačí ako aj ľudský faktor VIII sa izoloval z plazmy ako proteín zložený z dvoch podjednotiek. Podjednotky, známe ako ťažký reťazec a ľahký reťazec, držia pohromade nekovalentnou väzbou, ktorá vyžaduje kalcium alebo iný divalentý kovový ión. Ťažký reťazec faktora VIII obsahuje tri domény Al, A2 a B, ktoré sú spojené kovalentne. Ľahký reťazec faktora VIII tiež obsahuje tri domény, označené A3, Cl a C2. B doména nemá žiadnu známu biologickú funkciu a teda sa môže odstrániť, celá alebo jej časť, z molekuly proteolyticky alebo metódami rekombinantnej DNA, bez toho, aby sa významne zmenil akýkoľvek merateľný parameter faktora VIII. Ľudský rekombinantný faktor VIII má podobnú štruktúru a funkciu ako faktor VIII, ktorý pochádza z plazmy, aj keď nie je glykozylovaný, pokiaľ nie je exprimovaný v cicavčích bunkách.

Tak ľudský ako aj prasačí aktivovaný faktor VIII („faktor VlIIa“) má tri podjednotky a to vďaka štiepeniu ťažkého reťazca medzi doménami Al a A2. Táto štruktúra je označená ako A1/A2/A3-C1-C2. Ľudský faktor VlIIa nie je stabilný v podmienkach, ktoré stabilizujú prasačí faktor VlIIa, pravdepodobne preto, že je slabšia asociácia A2 podjednotky ľudského faktora VlIIa. Disociácia A2 podjednotky ľudského a prasačieho faktora VlIIa je spojená so stratou aktivity molekuly faktora VlIIa. Yakhyaev, A. et al. (1997) Blood 90: Suppl. 1, Abstract #126) opísali väzbu A2 domény pomocou proteínu príbuzného receptoru lipoproteínu s nízkou hustotou (low density lipoprotein receptor-related protein), čo vedie k domnienke, že bunkový príjem A2 sprostredkovaný takouto väzbou pôsobí na down-reguláciu aktivity faktora VIII.

Expresia „faktora VIII, ktorý nemá B doménu“ je zosilovaná vložením časti B domény. Vloženie časti B domény označenej „SQ“ viedlo, ako je publikované (Línd, P. et al. (1995) supra), k priaznivej expresii. „SQ“ konštrukty nemajú celú ľudskú B doménu s výnimkou 5 aminokyselín N-konca B domény a 9 aminokyselín C-konca B domény.

Purifikovaný hybridný faktor VIII alebo jeho fragment sa preto môžu testovať na imunorcaktivitu a koagulačnú aktivitu v štandardných testoch, ku ktorým patrí napríklad test s plazmou bez faktora VIII, jednofázový koagulačný test a ELISA test využitím purifikovaného rekombinantného ľudského faktora VIII ako štandardu.

Ďalšie vektory, ktoré zahŕňajú tak plazmidy, ako aj eukaryotické vírusové vektory, sa môžu využiť na expresiu rekominantného génového konštruktu v eukaryotických bunkách v závislosti od požiadaviek a posúdenia odborníka (pozri napr. Sambrook et al., kapitola 16). Medzi ďalšie vektory a expresné systémy, ktoré sa môžu použiť, patria tiež bakteriálne, kvasinkové systémy a systém buniek hmyzu, ale nie sú výhodné, lebo poskytujú odlišnú glykozyláciu alebo ju vôbec nemajú.

Proteín rekombinantného faktora VIII sa môže exprimovať v celom rade rôznych buniek všeobecne používaných na kultiváciu a expresiu rekombinantných cicavčích proteínov. Najmä sa našiel rad vhodných bunkových línií hlodavcov, ktoré sú zvlášť užitočnými hostiteľskými systémami na expresiu veľkých proteínov.

Výhodné bunkové línie, ktoré sa môžu získať z Americkej zbierky mikroorganizmov (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD), sú predovšetkým obličkové bunky novorodených škrečkov (BHK) a bunky ovárií čínskeho škrečka (CHO), ktoré sa kultivujú rutinným spôsobom v známych kultivačných médiách.

Základnou príčinou vyššej koagulačnej aktivity prasačieho faktora VIII je, ako sa zdá, rýchlejšia spontánna disociácia ľudskej A2 podjednotky od ľudského faktora VlIIa než prasačej A2 podjednotky od prasačieho faktora VlIIa. Disociácia A2 podjednotky vedie k strate aktivity (Lollar, P. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, P.J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250).

Molekuly faktora VIII so zníženou imunoreaktivitou

Epitopy, ktoré sú imunoreaktívne s protilátkami, ktoré inhibujú koagulačnú aktivitu faktora VIII („inhibítory“ alebo „inhibičné protilátky“), boli charakterizované na základe známych vzťahov štruktúra-funkcia fak tora VIII. Inhibítory najskôr pôsobia tým, že porušia niektorú z makromolekulámych interakcií spojených s doménovou štruktúrou faktora VIII alebo s jeho naviazaním na von Willebrandov faktor, trombín, faktor Xa, faktor IXa alebo faktor X. Ale väčšina inhibičných protilátok na ľudský faktor VIII pôsobí tým, že sa naviaže na epitopy lokalizované na 40 kDa A2 doméne alebo 20 kDa C2 doméne faktora VIII a tým narušia špecifické funkcie spojené s týmito doménami, ako to predpokladali Fulcher et al. (1985 Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:7728-7732; a Scandella et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6152-6156. Navyše k A2 a C2 epitopom môže patriť ešte tretí epitop v A3 alebo Cl doméne ľahkého reťazca faktora VIII, podľa publikácie Scandella et al. (1993) Blood 82:1767-1775. Význam predpokladaného tretieho epitopu je neznámy, ale mohol by byť zodpovedný za malú frakciu epitopovej reaktivity faktora VIII.

Anti-A2 protilátky blokujú aktiváciu faktora X, ako ukázali Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Predchádzajúce mapovacie štúdie delečnej mutagenézy, opísané v Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3:703-716, lokalizovali A2 epitop do 20 kDa úseku NH₂ koncového úseku 40 kDa A2 domény. Kompetitívne imunorádiometrické testy ukázali, že A2 inhibítory rozpoznávajú buď spoločný epitop, alebo tesne zluknuté (clustered) epitopy, ako opísali Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67:665-671, a ako je ukázané v patente USA č. 5 859 204.

Zvieracie alebo modifikované zvieracie molekuly faktora VIII sa môžu testovať u ľudí na zníženú antigenicitu a/alebo imunogenicitu v príslušných klinických skúškach. V jednom type klinických skúšok, navrhnutých na zistenie toho, či je faktor VIII imunoreaktívny s inhibičnými protilátkami, sa faktor VIII podáva, výhodne intravenózne infúziou, približne 25 pacientom, ktorí trpia deficienciou faktora VIII a majú protilátky, ktoré inhibujú koagulačnú aktivitu terapeutického ľudského faktora VIII. Dávky zvieracieho alebo modifikovaného zvieracieho faktora VIII sú v rozmedzí 5 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, výhodne 10 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti a najvýhodnejšie 40 jednotiek/kg telesnej hmotnosti. Približne 1 hodinu po každom podaní je nové obnovenie faktora VIII vo vzorkách krvi merané jednofázovým koagulačným testom. Vzorky sa odoberajú približne 5 hodín po infúzii a meria sa obnovenie. Celková hladina a rýchlosť vymiznutia faktora VIII zo vzoriek slúži na predpoveď titra protilátky a inhibičnej aktivity. Ak je titer protilátky vysoký, obnovenie hladiny faktora VIII sa nemôže merať. Výsledky meraní sa porovnávajú s výsledkami získanými od pacientov, ktorí boli liečení ľudským faktorom VIII pochádzajúcim z plazmy, prasačím faktorom VIII alebo inou všeobecne používanou terapeutickou formou faktora VIII alebo substituenta faktora VIII.

Po identifikácii klinicky významných epitopov sa môžu exprimovať také rekombinantné molekuly faktora VIII, ktoré majú menšiu alebo rovnakú skríženú reaktivitu v porovnaní s prasačím faktorom VIII pochádzajúcim z plazmy, keď sú testované in vitro oproti celému spektru plazmy s inhibítormi. Dodatočná mutagenéza v úsekoch epitopov sa môže uskutočniť s cieľom redukovať skríženú reaktivitu. Znížená reaktivita, pretože je žiaduca, nie je nevyhnutná na prípravu výsledného produktu, ktorý aj tak môže mať výhody v porovnaní s existujúcimi koncentrátmi prasačieho faktora VIII získaného z plazmy, ktoré majú rad nežiaducich vedľajších príznakov v dôsledku kontaminácie prasačími proteínmi alebo kontaminácie infekčnými agens, ako sú vírusy alebo prióny. Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII neobsahuje cudzorodé prasačie proteíny.

Diagnostické testy cDNA faktora VIII a/alebo proteín z nej exprimovaný, buď z celej, alebo z jej časti, sa môžu použiť v testoch ako diagnostické reagencie na detekciu inhibičných protilátok proti ľudskému alebo zvieraciemu faktoru VIII alebo modifikovanému zvieraciemu faktoru VIII v substrátoch, ku ktorým patria napr. vzorky séra a telesných tekutín pacientov s deficienciou faktora VIII. Medzi takého protilátkové testy patria najmä ELISA testy, imunobloty, rádioimunotesty, imunodifuzne testy a testy biologickej aktivity faktora VIII (napr. koagulačný test). Techniky na prípravu týchto reagencii a metódy ich použitia sú odborníkom dobre známe. Tak napríklad imunotest na detekciu inhibičných protilátok vo vzorke séra pacienta môže zahŕňať kroky, keď sa nechá reagovať testovaná vzorka s dostatočným množstvom testovaného faktora VIII a keď sa vytvorí s inhibičnými protilátkami detegovateľný komplex, potom testovaný faktor VIII je skutočne antigénny.

Sondy nukleových kyselín a aminokyselín sa môžu pripraviť na základe sekvencii cDNA hybridného faktora VIII alebo proteínu, alebo ich fragmentov. V niektorých uskutočneniach vynálezu sa môžu tieto sondy označiť, buď použitím farbiva, alebo enzymaticky, fluorescenčnými, chemiluminiscenčnými alebo rádioaktívnymi značkami, ktoré sú komerčne dostupné. Aminokyselinové sondy sa môžu použiť na skríning napríklad séra alebo iných telesných tekutín podozrivých z prítomnosti inhibítorov ľudského, zvieracieho alebo hybridného ľudského/zvieracieho faktora VIII. Hladiny inhibítorov sa môžu kvantifikovať u pacientov a porovnávať so zdravými kontrolami a môžu sa použiť napríklad na stanovenie, či sa pacient s deficienciou faktora VIII môže liečiť zvieracím alebo modifikovaným zvieracím faktorom VIII. cDNA sondy sa môžu použiť napríklad vo výskume na skríning DNA knižníc.

Farmaceutické kompozície

Farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII, samotný alebo v kombinácii s vhodnými farmaceutickými stabilizujúcimi látkami, nosičmi alebo prostriedkami na podávanie (vehikulá), sa pripravujú metódami, ktoré sú odborníkom známe, napr. ako sú opísané v príručke Remington's Pharmaceutical Science (E. W. Martin).

V jednom výhodnom uskutočnení sú vhodnými nosičmi alebo prostriedkami na podávanie intravenóznou infúziou fyziologický roztok soli alebo roztok soli pufrovaný fosfátom.

V inom výhodnom uskutočnení sú vhodným stabilizátorom, nosičom alebo prostriedkom na podávanie, ale bez obmedzenia, ľudské alebo zvieracie proteíny, ako je napr. albumín.

Fosfolipidové vezikuly alebo lipozómové suspenzie sú tiež výhodnými farmaceutický prijateľnými nosičmi alebo prostriedkami na podávanie. Môžu sa pripraviť štandardnými postupmi, ktoré sú odborníkom známe a obsahujú napríklad fosfatidylserín/fosfatidylcholín alebo iné kompozície fosfolipidov alebo detergentov, ktoré spoločne vytvárajú negatívny náboj na povrchu, pretože faktor VIII sa viaže na negatívne nabité fosfolipidové membrány. Lipozómy sa môžu pripraviť rozpustením vhodných lipidov (ako je napr. stearoylfosfatidyletanolamín, stearoylfosfatidylcholín, arachadoylfosfatidylcholín a cholesterol) v anorganickom rozpúšťadle, ktoré sa nechá odpariť a na povrchu použitej nádoby zostane tenký film vyschnutého lipidu. Do nádoby sa potom vnesie vodný roztok hybridného faktora VIII. Nádobou sa potom krúži, aby sa uvoľnil lipidový materiál zo stien nádoby a lipidové agregáty dispergovali, čím sa vytvorí lipozómová suspenzia.

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môžu kombinovať s ďalšími vhodnými stabilizujúcimi zlúčeninami, prostriedkami na podávanie a/alebo nosičmi, vrátane koagulačných faktorov závislých od vitamínu K, tkanivových faktorov a von Willebrandovho faktora (vWf) alebo fragmentu vWf, ktorý obsahuje väzbové miesto pre faktor VIII a polysacharidov, ako je napr. sacharóza.

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môže tiež podávať metódami génovej terapie rovnakým spôsobom, ako sa podáva ľudský faktor VIII a to použitím retrovírusových vektorov. Táto metóda spočíva v tom, že sa konštrukt s požadovanou cDNA faktora VIII vnesie do ľudských buniek, ktoré sú potom priamo transplantované pacientovi s deficienciou faktora VIII alebo sú vložené do implantovaného zariadenia, ktoré prepúšťa molekuly faktora VIII ale neprepúšťa bunky, a toto zariadenie je potom transplantované. Vhodným spôsobom je prenos génu sprostredkovaný retrovírusovým vektorom. Pri tomto spôsobe je exogénny gén (napr. faktor VIII cDNA) klonovaný do genómu modifikovaného retrovírusu. Gén sa potom vloží do genómu hostiteľskej bunky prostredníctvom vírusového mechanizmu, kde je potom bunkou exprimovaný. Retrovírusový vektor je modifikovaný tak, že neprodukuje vírus, čo zabraňuje vírusovej infekcii hostiteľa. Všeobecné princípy génovej terapie sú odborníkom známe a boli publikované v odbornej literatúre (napr. Kohn, D. B. et al. (1989) Transfusion 29:812-820).

Prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môže uchovávať naviazaný na vWf, čo zvyšuje polčas a tiež čas uskladnenia hybridnej molekuly. Navyše lyofilizáciou faktora VIII sa môže zlepšiť výťažok aktívnych molekúl v prítomnosti vWf. Súčasné metódy uchovávania (uskladnenia) ľudského a zvieracieho faktora VIII používané komerčnými dodávateľmi sa môžu využiť tiež na uchovanie rekombinantného faktora VIII. Tieto metódy zahŕňajú: (1) lyofilizáciu faktora VIII v čiastočne purifikovanom stave (ako je „koncentrát“ faktora VIII, ktorý sa môže použiť na infúziu bez ďalšej purifikácie) (2) imunoafinitnú purifikáciu faktora VIII Zimmermanovou metódou a lyofilizáciou v prítomnosti albumínu, ktorý stabilizuje faktor VIII; (3) lyofilizáciu rekombinantného faktora VIII v prítomnosti albumínu.

Navyše sa zistilo, že prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII je prakticky nekonečne stabilný pri 4 °C v 0,6 M NaCl, 20 mM MES a 5 mM CaCl₂ a pri pH 6,0 a môže sa tiež uchovávať zamrazený v takýchto pufroch, pričom po rozmrazení prejavuje minimálnu stratu aktivity.

Liečenie

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa používajú na liečenie spontánneho krvácania spôsobeného deficienciou faktora VIII (napr. intraartikuláma, intrakraniálna alebo gastrointestinálna hemorágia) u hemofilikov s alebo bez inhibičných protilátok, a tiež u pacientov so získanou deficienciou faktora VIII spôsobenou rozvojom inhibičných protilátok. Účinné látky sa podávanú výhodne intravenózne.

Navyše sa môže rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII podávať transplantáciou buniek, ktoré sa geneticky modifikovali tak, aby produkovali tento proteín alebo implantáciou zariadenia, ktoré obsahuje také modifikované bunky, ako už bolo opísané.

Vo výhodnom uskutočnení farmaceutické kompozície obsahujú rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII, samotný alebo v kombinácii so stabilizátormi, prostriedkami na prenos (doručenie) a/alebo nosičmi, sú podávané pacientom intravenózne infúziou, teda rovnako ako sa podávajú prípravky ľudského alebo zvieracieho faktora VIII.

Liečebné dávky kompozície rekombinantného prasačieho alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII, ktoré je potrebné podávať pacientom, ktorí takéto liečenie potrebujú, sa veľmi líšia v závislosti od závažnosti deficiencie faktora VIII. Všeobecne sa dávky, ich frekvencia, trvanie a počet jednotiek, určia tak, aby zodpoSK 286205 B6 vedali závažnosti a trvaniu krvácavých periód u každého pacienta. Teda faktor VIII sa vmieša do farmaceutický prijateľného nosiča, vehikula alebo stabilizátora v takom množstve, ktoré je postačujúce na to, aby sa pacientovi podalo terapeuticky účinné množstvo proteínu, ktoré zastaví krvácanie, čo sa meria pomocou štandardných koagulačných testov.

Faktor VIII je klasicky definovaný ako taká látka prítomná v normálnej krvnej plazme, ktorá koriguje defekty koagulácie v plazme pochádzajúce od jedincov s hemofíliou A. Koagulačná aktivita in vitro purifikovanej a čiastočne purifikovanej formy faktora VIII sa používa na vypočítame dávky faktora VIII pre infúzie ľudským pacientom a je spoľahlivým indikátorom aktivity získanej z plazmy pacienta a korekcie in vivo krvácavých porúch. Doteraz neboli opísané žiadne nezhody medzi štandardným testom nových molekúl faktora VIII in vitro a ich správaním na infuznom modeli psa alebo u ľudských pacientov, podľa Lusher, J. M. et al. 328 New Engl. J. Med. 328:453-459; Pittman, D.D. et al. (1992) Blood 79:389-397; a Brinkhous et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755.

Zvyčajne požadovaná plazmatická hladina aktivity faktora VIII, ktorá sa má dosiahnuť u pacientov podávaním rekombinantného prasačieho alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII je v rozmedzí 30 až 100 % normálnych hodnôt. Pri výhodnom spôsobe podávania terapeutického faktora VIII je kompozícia podávaná intravenózne vo výhodných dávkach v rozsahu 5 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, výhodnejšie 10 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti a najvýhodnejšie v rozsahu 20 až 40 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, v intervale frekvencie 8 až 24 hodín (u pacientov s ťažkou hemofíliou) a trvania liečenia v rozsahu 1 až 10 dní alebo do zastavenia krvácania (pozri napr. Roberts, H. R., a M. R. Jones, „Hemophilia and Related Conditions-Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII), „Ch. 153, 1453-1474, 1460, in Hematology, Williams, W. J., et al. ed. (1990)). Pacienti s inhibítormi môžu vyžadovať odlišné množstvá rekombinantného alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII, ktoré dostávali. Napríklad pacient môže vyžadovať menej rekombinantného alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII, pretože má vyššiu špecifickú aktivitu ako ľudský faktor VIII a zníženú protilátkovú reaktivitu. Rovnako ako pri liečení ľudským alebo z plazmy získaným prasačím faktorom VIII, množstvo terapeutického faktora VIII podávané infúziou je definované jednofázovým koagulačným testom faktora VIII a vo vybratých prípadoch, in vivo opäť dosiahnutá hladina sa meria stanovením faktora VIII v plazme pacientov po infúzii. Je však potrebné pochopiť, že pre akéhokoľvek konkrétneho jedinca by sa mal prispôsobiť dávkovací režim podľa jeho individuálnej potreby a na základe úsudku odborníka, ktorý podáva alebo dohliada na podávanie kompozícií a teda dávky a uvedené koncentrácie sú iba príklady a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.

Liečenie môže mať podobu jediného intravenózneho podania kompozície alebo periodického, alebo súvislého podávania po dlhší čas, podľa toho, ako je to potrebné. Alternatívne sa môže terapeutický faktor VIII podávať subkutánne alebo perorálne s lipozómami v jednej alebo niekoľkých dávkach v rôznych časových intervaloch.

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môže tiež použiť na liečenie nekontrolovaného krvácania spôsobeného deficienciou faktora VIII u hemofilikov, u ktorých sa vyvinuli protilátky proti ľudskému faktoru VIII. V takomto prípade nie je nutná koagulačná aktivita, ktorá je vyššia než aktivita samotného ľudského alebo zvieracieho faktora VIII. Koagulačná aktivita, ktorá je nižšia než aktivita ľudského faktora VIII (t. j. napr. nižšia než 3000 jednotiek/mg) je užitočná, ak táto aktivita nie je neutralizovaná protilátkami v plazme pacientov.

Demonštrovalo sa, že rekombinantný prasačí a modifikovaný prasačí faktor VIII sa môžu líšiť v špecifickej aktivite od ľudského faktora VIII. Proteíny faktora VIII, ktoré majú vyššiu prokoagulačnú aktivitu než ľudský faktor VIII, sú užitočné na liečenie hemofílie, pretože sú potrebné nižšie dávky, aby sa korigovala defíciencia faktora VIII u pacientov. Faktor VIII, ktorý má nižšiu prokoagulačnú aktivitu než ľudský faktor VIII, je tiež vhodný na terapeutické použitie za predpokladu, že má aspoň 1 % špecifickej aktivity v porovnaní s normálnym ľudským faktorom VIII. Faktor VIII podľa predkladaného vynálezu, ktorý má prokoagulačnú aktivitu, je teda definovaný ako faktor, ktorý má aspoň 1 % špecifickej aktivity ľudského faktora Vili.

Molekula rekombinantného prasačieho alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII a spôsoby jej izolácie, charakterizácie, prípravy a použitia, všeobecne opísané, budú podrobnejšie vysvetlené pomocou príkladov, ktoré sú opísané.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázky 1A-1H spolu poskytujú porovnania priradených sekvencií nukleovej kyseliny ľudského, prasačieho a myšieho faktora VIII.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Test prasačieho faktora VIII a hybridného ľudského/prasačieho faktora VIII

Prasačí faktor VIII má vyššiu koagulačnú aktivitu než ľudský faktor VIII, pokiaľ ide o špecifickú aktivitu molekuly. Tento záver je založený na použití vhodných štandardných kriviek, ktoré umožňujú uskutočniť správne porovnanie ľudského a prasačieho faktora VIII. Koagulačné testy sú založené na schopnosti faktora VIII skracovať koagulačný čas plazmy, ktorá pochádza od pacientov s hemofíliou A. Použili sa dva typy testov: jednofázový a dvojfázový test.

V jednofázovom teste sa 0,1 ml plazmy s hemofíliou A (George King Biomedical, Inc.) inkubuje s 0,1 ml činidla pre aktivovaný parciálny tromboplastínový test (APTT) (Organon Teknika) a 0,01 ml vzorky alebo štandardu, ktorým je nariedená normálna ľudská plazma s citrátom, počas 5 minút pri 37 °C vo vodnom kúpeli. Po inkubácii sa pridá 0,1 ml 20 mM CaCl₂ a čas potrebný na vývoj fibrínovej zrazeniny sa stanoví vizuálnym hodnotením vzorky.

Jednotka faktora VIII je definovaná ako množstvo prítomné v 1 ml citrátom ošetrenej normálnej ľudskej plazmy. S ľudskou plazmou ako štandardom sa priamo porovnali aktivity prasačieho a ľudského faktora VIII. Riedenia plazmového štandardu alebo purifikovaných proteínov sa uskutočnili v 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pH 7,4. Štandardná (kalibračná) krivka sa skonštruovala pomocou 3 alebo 4 riedení plazmy, kde najväčšie riedenie bolo 1/50, vynesením logio koagulačného času oproti log₁₀ koncentrácie v plazme, čo poskytlo lineárnu závislosť. Jednotky faktora VIII v neznámej vzorke sa stanovili interpoláciou z tejto štandardnej krivky.

Jednofázový test sa spolieha na aktiváciu faktora VIII pomocou aktivátorov, ktoré sú vytvárané v plazme s hemofíliou A, zatiaľ čo dvojfázový test meria prokoagulačnú aktivitu preaktivovaného faktora VIII. V dvojfázovom teste sú vzorky obsahujúce faktor VIII, ktoré sa ponechali reagovať s trombínom, pridané k zmesi aktivovaného čiastočného tromboplastínu a ľudskej plazmy s hemofíliou A, ktorá sa preinkubovala 5 minút pri 37 °C. Výsledný koagulačný čas je potom prepočítaný na jednotky/ml a to pomocou rovnakej štandardnej krivky, aká bola opísaná. Relatívna aktivita v dvojfázovom teste je vyššia ako v jednofázovom teste, pretože faktor VIII sa preaktivoval.

Príklad 2

Charakterizácia funkčných rozdielov medzi ľudským a prasačím faktorom VIII

Izolácia prasačieho a ľudského faktora VIII, ktorý pochádza z plazmy a ľudského rekombinantného faktora VIII, už sú opísané v odbornej literatúre, pozri Fulcher C. A. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1648-1652; Toole et al. (1984) Náture 312:342-347 (Genetics Inštitúte); Gitschier et al. (1984) Náture 312:326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Náture 312:330-337 (Genentech); Vehar et al. Náture 312:337-342 (Genentech); Fass et al. (1982) Blood 59:594; Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. Táto sa môže uskutočniť rôznymi spôsobmi. Všetky preparáty sú podobné svojím podjednotkovým zložením, hoci v stabilite je funkčný rozdiel medzi ľudským a prasačím faktorom VIII.

Na porovnanie ľudského rekombinantného a prasačieho faktora VIII sa preparáty vysoko purifikovaného ľudského rekombinantného faktora VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) a prasačieho faktora VIII (imunopurifikovaného, ako sa opísalo vo Fass at al. (1982) Blood 59:594) podrobili analýze vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) na aniónovej ionomeničovej kolóne Mono Q™ (Pharmacia-LKB; Piscataway, NJ). Cieľom kroku na Mono Q™ HPLC bolo eliminovať malé nečistoty po prevedení ľudského a prasačieho faktora VIII do spoločného pufra na účely porovnania. Fiolky, ktoré obsahovali 1000 až 2000 jednotiek faktora VIII, sa rekonštituovali 5 ml H₂O. Potom sa pridal Hepes (2 M s pH 7,4) do výslednej koncentrácie 0,02 M. Faktor VIII sa naniesol na kolónu Mono Q™ HR 5/5 ekvilibrovanú v 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCl₂, pri pH 7,4 (Pufor A plus 0,15 M NaCl); premyl 10 ml Pufra A + 0,15 M NaCl; a eluoval 20 ml lineárneho gradientu, 0,15 M až 0,90 M NaCl v Pufri A pri prietoku 1 ml/min.

Na porovnanie ľudského faktora VIII pochádzajúceho z plazmy (purifikovaného na Mono Q™ HPLC) a prasačieho faktora VIII (imunoafinitne purifikovaného) pochádzajúceho z plazmy sa prasačí faktor VIII nariedil 1 : 4 s 0,04 M Hepes, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4 a potom čistil na Mono Q™ HPLC za rovnakých podmienok, ako sa opísalo v predchádzajúcom odseku pre ľudský faktor VTTT. Tieto postupy izolácie ľudského a prasačieho faktora VIII sú štandardné a odborníkom dobre známe.

Frakcie z kolóny sa testovali na aktivitu faktora VIII jednofázovým koagulačným testom. Priemerné hodnoty výsledkov testov vyjadrené v jednotkách aktivity na jednotku A₂₈₀ materiálu sú uvedené v tabuľke II a ukazujú, že prasačí faktor VIII má prinajmenšom šesťkrát vyššiu aktivitu než ľudský ťaktor VIII pri použití jednorazového testu.

Aktivita (U/A_28o)

Tabuľka II

Porovnanie koagulačnej aktivity ľudského a prasačieho faktora VIII

Prasačí

Ľudský, pochádzajúci z plazmy

Ľudský rekombinantný

21300

3600

2400

Príklad 3

Porovnanie stability ľudského a prasačieho faktora VIII

Výsledky jednofázového testu na faktor VIII odrážajú aktiváciu faktora VIII na faktor VlIIa vo vzorke a možnú stratu aktivity vytvoreného faktora VlIIa. Uskutočnilo sa priame porovnanie stability ľudského a prasačieho faktora VIII. Vzorky z Mono Q™ HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, N. J.) sa nariedili na rovnakú koncentráciu a rovnakým pufrom a uskutočnila sa reakcia s trombínom. Vzorky sa odoberali v rôznych časoch na dvojfázový koagulačný test. Typický vrchol aktivity (v 2. minúte) bol 10 x vyšší pre prasačí faktor VlIIa než ľudský faktor VlIIa a aktivity tak prasačieho ako aj ľudského faktora VlIIa postupne klesali, pričom aktivita ľudského faktora VlIIa klesala rýchlejšie.

Všeobecne môžeme povedať, že pokusy izolovať stabilný ľudský faktor VlIIa neboli úspešné dokonca ani v podmienkach, keď sa použili podmienky, ktoré umožnili izolovať stabilný prasačí faktor VlIIa. Na demonštráciu tejto skutočnosti ľudský faktor VIII purifikovaný na Mono Q™ HPLC sa aktivoval trombínom a vystavil Mono S™ ionomeničovej HPLC (Pharmacia, Inc.) v podmienkach, ktoré viedli k získaniu stabilného prasačieho faktora VlIIa, ako to opísali Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666.

Ľudský faktor VIII, 43 pg/ml (0,2 μΜ) v 0,2 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4 v 10 ml celkového objemu, sa nechal reagovať s trombínom (0,036 μΜ) 10 minút, kedy sa pridal FPR-CH₂Cl-D-fenyl-prolyl-arginyl-chlórmetylketón do koncentrácie 0,2 μΜ pre ireverzibilnú inaktiváciu trombínu. Zmes sa potom nariedila 1 : 1 so 40 mM 2-(N-morfolino)etán-sulfónovou kyselinou (MES), 5 mM CaCl₂, pH 6,0 a naniesla sa prietokom 2 ml/min. na kolónu Mono S™ HR5/5 HPLC (Pharmacia, Inc.) ekvilibrovanú v 5 mM CaCl₂, pH 6,0 (Pufor B) + 0,1 M NaCl. Faktor VlIIa sa eluoval bez premytia kolóny 20 ml gradientu od 0,1 M NaCl do 0,9 M NaCl v Pufri BI pri prietoku 1 ml/min.

Frakcie s koagulačnou aktivitou v dvojfázovom teste sa eluovali za týchto podmienok ako jediný vrchol. Špecifická aktivita vrcholovej frakcie bola približne 7500 U/A₂₈₀. Elektroforéza na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) vrcholovej frakcie faktora VlIIa po Mono S™, doplnená farbením proteínu striebrom, ukázala dva pásy zodpovedajúce heterodimérickému (A3-C1-C2/A1) derivátu faktora VIII. Hoci v týchto podmienkach fragment nebol identifikovaný farbením striebrom vzhľadom na jeho nízku koncentráciu, identifikoval sa ako stopová zložka po značení pomocou ¹²⁵I.

V kontraste s výsledkami s ľudským faktorom VIII, prasačí faktor VIII izolovaný pomocou Mono S™ HPLC za rovnakých podmienok mal špecifickú aktivitu 1,6 x 10⁶ U/A₂₈₍₎. Analýza prasačieho faktora VlIIa použitím SDS-PAGE odhalila tri fragmenty zodpovedajúce Al, A2 a A3-C1-C2 podjednotkám, čo ukázalo, že prasačí faktor VIII obsahuje tri podjednotky.

Výsledky analýzy použitím Mono S™ HPLC preparátov ľudského trombínom aktivovaného faktora VIII pri pH 6,0 ukázali, že ľudský faktor VlIIa je labilný v podmienkach, v ktorých sa môže získať stabilný prasačí faktor VlIIa. Hoci boli identifikované stopové množstvá A2 fragmentu vo vrcholovej frakcii, určenie toho, Či koagulačná aktivita vyplývajúca z malého množstva heterotrimérického faktora VlIIa alebo z heterodimérického faktora VlIIa, ktorý má nízku špecifickú aktivitu, by nebolo možné len touto samotnou metódou.

Spôsob, ako izolovať ľudský faktor VlIIa ešte predtým, než stratí svoju A2 podjednotku, je potrebný na rozhodnutie tejto otázky. S týmto cieľom sa uskutočnila izolácia postupom, ktorý zahŕňal redukciu pH Mono S™ pufŕa na pH 5. Mono Q™ purifikovaný ľudský faktor VIII (0,5 mg) sa nariedil vodou, takže poskytol výslednú kompozíciu 0,25 mg/ml (1 μΜ) faktora VIII v 0,25 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, 0,005 % Tween 80, pH 7,4 (celkový objem 7,0 ml). Trombín sa pridal do výslednej koncentrácie 0,072 μΜ a ponechal reagovať 3 minúty. Trombín sa potom inaktivoval s FPR-CH₂C1 (0,2 μΜ). Zmes sa nariedila 1 : 1 so 40 mM acetátom sodným, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 5,0 a bola nanesená prietokom 2 ml/min. na kolónu Mono S™ HR5/5 HPLC ekvilibrovanú v 0,01 M acetáte sodnom, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween 80, pH 5,0, plus 0,1 M NaCl. Faktor VlIIa sa eluoval bez premytia kolóny a s 20 ml gradientu 0,1 M NaCl až 1,0 M NaCl v rovnakom pufri prietokom 1 ml/min. Takto sa získala koagulačná aktivita vo vrcholovej frakcii, ktorá obsahovala detegovateľné množstvo A2 fragmentov, ako sa dokázalo pomocou SDS-PAGE a farbením striebrom. Špecifická aktivita vrcholovej frakcie bola desaťkrát vyššia než aktivita izolovaná pri pH 6,0 (75000 U/A₂8o oproti 7500 U/A_28o. Ale v kontraste s prasačím faktorom VlIIa izolovaným pri pH 6,0, ktorý je prakticky nekonečne stabilný pri 4 °C, aktivita ľudského faktora VIII sa trvalo znižuje počas niekoľkých hodín po elúcii z kolóny Mono S™. Navyše špecifická aktivita faktora VIII, purifikovaného pri pH 5,0 a testovaného bezprostredne potom, je iba 5 % aktivity prasačieho faktora VlIIa, čo ukazuje na značnú disociáciu, ku ktorej došlo pred testom.

II

Tieto výsledky ukazujú, že tak ľudský ako aj prasačí faktor VHIa sú zložené z troch podjednotiek (Al, A2 a A3-C1-C2). Disociácia A2 podjednotky má za následok stratu aktivity tak ľudského, ako aj prasačieho faktora VlIIa za istých podmienok, ako je napr. fyziologická iónová sila, pH a koncentrácia. Relatívna stabilita prasačieho faktora VlIIa za určitých podmienok je lepšia z dôvodu silnejšej asociácie A2 podjednotky.

Príklad 4

Izolácia a sekvenovanie DNA, ktorá kóduje A2 doménu prasačieho faktora VIII

Iba nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje B doménu a časť A2 domény prasačieho faktora VIII sa sekvenovala už skôr (pozri Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942). cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvencia (sekvencia SEQ ID NO: 3 a 4, v uvedenom poradí) celej A2 domény prasačieho faktora VIII sú prvýkrát opísané v predkladanej prihláške.

A2 doména prasačieho faktora VIII sa klonovala reverznou transkripciou celkovej RNA z prasačej sleziny a potom PCR amplifikáciou. Použili sa degenerované priméry navrhnuté podľa známej cDNA sekvencie ľudského faktora VIII a presné prasačie priméry založené na čiastočnej sekvencii prasačieho faktora VIII. 1 kb PCR produkt sa izoloval a ampliftkoval po vložení do fagemidového vektora Bluescript™ (Stratagen).

Prasačia A2 doména sa kompletne sekvenovala dideoxy-sekvenovaním. cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvencia sú uvedené v zozname sekvencii ako sekvencie SEQ ID NO: 3 a 4, v uvedenom poradí.

Príklad 5

Úplná sekvencia DNA, ktorá kóduje prasačí faktor VIII

Klenowov fragment, fosforylované C/αΙ linkery, Nôti linkery, T4 ligáza a Taq DNA polymeráza sa kúpili od firmy Promega (Madison, Wisconsin). Polynukleotidkináza sa kúpila od firmy Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. γ³²-ΑΤΡ (Redivue, >5000 Ci/mmol) bol kúpený od firmy Amersham. pBluescript II KS- a bunky E. coli Epicurean XL1 Blue boli kúpené od firmy Stratagen (La Jolla, Califomia). Syntetické oligonukleotidy boli kúpené od firmy Life Technologies, Inc. alebo Cruachem, Inc. 5’-fosforylované priméry sa použili, keď sa PCR produkty pripravovali na účely klonovania. Číslovanie nukleotidov (nt) v oligonukleotidoch, ktoré sa použili ako priméry na polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) na amplifikáciu prasačej fVIII cDNA alebo genómovej DNA, je na základe ľudskej fVIII cDNA ako referencie (Wood et al. (1984) supra).

Celková RNA z prasačej sleziny sa izolovala kyslou extrakciou použitím guanidíntiokyanát-fenolchloroformu (Chomczynski et al. (1987) Anál. Biochem. 162:156-159). Prasačia cDNA sa pripravila z celkovej RNA zo sleziny použitím reverznej transkriptázy (RT) z Moloneyho myšieho leukemického vírusu (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech), pokiaľ nie je uvedené inak. RT reakcia obsahovala 45 mM Tris-Cl, pH 8,3; 68 mM KC1, 15 mM DTT, 9 mM MgCl₂, 0,08 mg/ml hovädzieho sérového albumínu a 1,8 mM deoxynukleotidtrifosfátu. Prasačia genómová DNA sa izolovala zo sleziny štandardným protokolom (Strauss, W. M. (1995) v Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., editors, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3. Izolácia DNA z agarózových gélov sa uskutočnila pomocou súpravy Genclean II (Bio 101) alebo Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

PCR reakcie sa uskutočňovali pomocou termocykléra Hybaid OmniGen. Pre PCR reakciu uskutočňovanú s Taq DNA polymerázou, reakčná zmes obsahovala 0,6 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μΜ oligonukleotidové priméry, 50 U/ml polymerázy a 0,1 objemu reakčnej zmesi prvého reťazca cDNA. S výnimkou, keď je uvedené inak, sa PCR produkty purifikovali z gélu, zatupili sa Klenowým fragmentom, precipitovali etanolom a buď ligovali do E'coRV miesta defosforylovaného pBluescript II KS-, alebo ligovali s fosforylovanými C/nl linkermi použitím T4 ligázy, poštiepili Claí a purifikovali pomocou chromatografie na Sephacryl S400 a potom ligovali do Clal poštiepeného, defosforylovaného pBluescript II KS-. Ligácie sa uskutočnili pomocou DNA ligázy (Rapid DNA Iigation kit; Boehrmger Mannheim) s výnimkou prípadov, keď je špecificky uvedené inak. Plazmidy pBluescript IIKS-, ktoré obsahovali inzert, sa použili na transformáciu buniek E. coli Epicurean XLl-Blue.

Sekvenovanie plazmidovej DNA sa uskutočnilo použitím automatického sekvenátora Applied Biosystems 373a a farbiacej terminačnej súpravy PRISM alebo manuálne použitím kitu na sekvenovanie Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation). Priame sekvenovanie PCR produktov, ktoré obsahovali ³²P-koncovo značené oligonukleotidy, sa uskutočnilo použitím protokolu na cyklické sekvenovanie (dsDNA Cycle Sequencing Systen, Life Technologies).

Izolácia klonov prasačej cDNA pre fVIII, ktoré obsahujú sekvenciu 5’UTR signálny peptid a doménu Al

5’ úsek prasačej fVIII cDNA až po doménu A2 sa amplifikoval „hniezdovou“ („nested“) RT-PCR z celkovej RNA, ktorá sa odobrala zo sleziny prasnice použitím metódy 5’ rýchlej amplifikácie cDNA koncov (5’-RACE) (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). Metóda zahŕňa syntézu prvého reťazca cDNA použitím oligo(dT) „lock-docking“ priméru (Borson, N. D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2:144-148), syntézu druhého reťazca cDNA použitím E. coli DNA polymerázy I a ligáciu s 5’-predlženým dvojreťazcovým adaptorom, sekvencia SEQ ID NO: 5:

5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3’ 3’-H₂N-CCC GTC CA-PO₄-5’, ktorého krátky reťazec sa blokoval na 3 'konci aminoskupinou, aby sa redukovalo nešpecifické nasadanie priméru, a ktorý bol komplementárny k 8 nukleotidom na 3’-konci (Siebert, P. D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23: 1087-1088). Prvý cyklus PCR sa uskutočnil použitím adaptor-špecifického oligonukleotidu, sekvencia SEQ ID NO: 6: 5’-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3’ (označený AP1) ako „sense“ priméru, a oligonukleotidu špecifického pre A2 doménu prasačieho fVIII sekvencia SEQ ID NO: 7: 5’-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3’ (nt 2081-2104) ako „antisense“ priméru. Druhý cyklus PCR sa uskutočnil použitím „hniezdového“ („nested“), adaptor-špecifického oligonukleotidu sekvencia SEQ ID NO: 8: 5’-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3’ (označený AP2) ako „sense“ priméru, a hniezdového oligonukleotidu špecifického pre prasačiu doménu A2, sekvencia SEQ ID NO: 9: 5’-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3’ (nt 1497-1520) ako „antisense“ priméru. PCR sa uskutočnila použitím komerčnej súpravy (Advantage cDNA PCR core kit), ktorá používa protilátkami-sprostredkovaný postup horúceho štartu (Kellogg, D.E. et al., (1994) BioTechniques 16:1134-1137).

Podmienky na PCR boli nasledujúce: denaturácia pri 94 °C po 60 sekúnd, nasledovaná 34 cyklami (prvá PCR) alebo 25 cyklami (druhá PCR), denaturácia 30 sekúnd pri 94 °C, nasadnutie primérov („annealing“) 30 sekúnd pri 60 °C a predlžovanie (syntéza) 4 minúty pri 68 °C použitím kontroly teploty priamo v skúmavke. Tento postup poskytol vylúčený produkt približne veľkosti 1,6 kb, čo bolo v súlade s amplifikáciou fragmentu zahŕňajúceho približne úsek 150 bp z 5’UTR. PCR produkt sa klonoval do pBluescript použitím Clal linkerov. Inzerty štyroch klonov sa sekvenovali v oboch smeroch.

Sekvencie týchto klonov zahŕňali úseky zodpovedajúce 137 bp 5’UTR, signálnemu peptidu, Al doméne a Časti A2 domény. Zhoda sa dosiahla aspoň v 3 zo 4 miest. Ale klony obsahovali v priemere 4 mutácie zjavne vnesené v priebehu PCR, zrejme v dôsledku viacerých cyklov PCR potrebných na získanie klonovateľného produktu. Teda sa použila sekvencia získaná z úseku signálneho peptidu na prípravu fosforylovaného PCR priméru „sense“ reťazca so sekvenciou SEQ ID NO: 10 5’-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG TCT TCC ACC TG-3’, nazvaného RENEOPIGSP, na syntézu ďalšieho PCR produktu na potvrdenie sekvencie a na klonovanie do expresného vektora. Sekvencia vyznačená hrubo predstavuje štart-kodón. Sekvencia 5'smerom od neho predstavuje sekvenciu identickú s 5’inzerčným miestom cicavčieho expresného vektora ReNeo použitého na expresiu fVIII (Lubín et al. (1994) supra). Toto miesto obsahuje ATíoI štiepne miesto (podčiarknuté). RENEOPIGSP a nt 1497-1520 oligonukleotid sa použili ako priméry pre Taq DNA polymerázou sprostredkovanú PCR reakciu, kde sa použila ako templát cDNA zo sleziny prasnice. DNA polymeráza od niekoľkých ďalších výrobcov neposkytla detegovateľný produkt. Podmienky na PCR boli nasledujúce: denaturácia pri 94 °C 4 minúty, nasledovaná 35 cyklami denaturácie pri 94 °C 1 minútu, nasadnutie primérov pri 55 °C 2 minúty a predlžovanie pri 72 °C 2 minúty, nasledovaná konečným predlžovacím krokom 5 minút pri 72 °C. PCR produkt sa klonoval do pBluescript použitím Clal linkerov. Inzerty z dvoch týchto klonov sa sekvenovali a v oboch smeroch a zhodli sa s kanonickou (consensus) sekvenciou.

Izolácia klonov prasačej fVIII cDNA, ktorá obsahuje kodóny pre domény A3, C1 a 5'-polovicu C2 domény

Najskôr sa dva produkty RT-PCR z prasačej sleziny zodpovedajúce fragmentu B-A3 domény (nt 4519-5571) a fragmentu C1-C2 domény (nt 6405-6990) klonovali. 3’ koniec C2 domény, ktorý sa získal predĺžením do úseku exónu 26, ktorý je terminálnym exónom fVIII. B-A3 produkt sa pripravil použitím priméru špecifického pre prasačiu B doménu, sekvencia SEQ ID NO: 11:

5’-CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T-3’.kde podčiarknutý úsek zodpovedá úseku v prasačom fVIII, ktorý nasadá na úsek nt 4519-45530 ľudského fVIII. 5 úsek oligonukleotidu obsahuje Notl miesto, ktoré sa pôvodne zamýšľalo použiť na účely klonovania. „Antisense“ primér použitý na generovanie B-A3 produktu sekvencie SEQ ID NO: 12: 5’-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3’ je založený na reverznom komplemente ľudskej fVIII cDNA sekvencie, ktorá zahŕňa nt 5545-5571. PCR reakcia obsahovala 50 mM KC1, 10 mM Tris-Cl, pH 9,0, 0,1 % Tween X-100, 1,5 mM MgCl₂, 2,5 mM dNTPs, 20 μΜ priméry, 25 jednotiek/ml Taq DNA polymerázy a 1/20 objemu RT reakčnej zmesi. PCR podmienky boli denaturácia pri 94 °C 3 minúty, nasledovaná 30 cyklami denaturácie 1 minútu pri 94 °C, nasadnutie primérov 2 minúty pri 50 °C a predlžovanie 2 minúty pri 72 °C. PCR produkty sa fosforylovali použitím T4 DNA kinázy a pridali sa Notl linkery. Po poštiepení Notl sa PCR fragmenty klonovali do Notl miesta plazmidu BlueScript II KS- a transformovali do buniek XLl-Blue.

C1-C2 produkt sa pripravil použitím známej ľudskej cDNA sekvencie pre syntézu „sense“ a „antisense“ primérov, sekvencia SEQ ID NO: 13: 5’-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3’ (nt 6405-6426) a sekvencia SEQ ID NO: 14:

5’-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3’ (reverzný komplement k nt 6966-6990) v uvedenom poradí. PCR podmienky boli identické s podmienkami použitými na prípravu B-A2 produktu. Vzniknutý fragment sa ligoval do pNOT klonovacieho vektora použitím súpravy Prime PCR Cloner Cloning Systém (5’ Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) a pestoval v bunkách JM109.

Plazmidy B-A3 a C1-C2 sa čiastočne sekvenovali na prípravu „sense“ a „antisense“ oligonukleotidov špecifických pre prasačiu sekvenciu, sekvencia SEQ ID NO: 15:

5’-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3’ (nt 4551-4573) a sekvencia SEQ ID NO: 16: 5’-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3’ (nt 6541 - 6564), v uvedenom poradí. Tieto oligonukleotidy sa použili ako priméry na vytvorenie 2013 bp RT-PCR produktu použitím súpravy Clontech Advantage cDNA PCR. Tento produkt, ktorý zodpovedá ľudskému úseku nt 4551-6564, obsahuje úsek zodpovedajúci aktivačnému peptidu ľahkého reťazca (nt 5002-5124), A3 doméne (nt 5125-6114) a väčšine C1 domény (nt 6115-6573). Sekvenovaním C1-C2 klonu sa stanovilo, že ľudská a prasačia cDNA od nt 6565 až do 3'konca C1 domény sú identické. PCR produkt sa klonoval do EcoRV miesta pBluescript IIKS-. Štyri klony sa úplne sekvenovali v oboch smeroch. Zhoda sa dosiahla aspoň v troch zo štyroch miest.

Izolácia prasačích klonov fVIII cDNA, ktoré obsahujú kodóny pre 3 'polovicu C2 domény

C2 doména ľudského fVIII (nukleotidy 6574 - 7053) je obsiahnutá vnútri exónov 24 až 26 (Gitschier J. at al. (1984) Náture 312:326-330). Ľudský exón 26 obsahuje 1958 bp a zodpovedá nukleotidom 6901 - 8858. Zahŕňa tiež 1478 bp úsek 3’netranslatovanej sekvencie. Pokusy o klonovanie cDNA exónu 26 zodpovedajúce 3’koncu C2 domény 3’UTR metódou ,,3’RACE“ (Siebert et al. (1995) supra), inverznou PCR (Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology (N.Y.) 8:759-760), PCR reštrikčných miest (Sarkar, G, et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322), PCR s nepredvídateľnými primérmi („unpredictably primed“ PCR) (Dominiguez, O. et al. (1994) Nucleic. Acids Res. 22:3247-3248) alebo skríningom cDNA knižnice z prasačej pečene celkom zlyhali. Metóda 3’RACE sa úspešne použila s rovnakou adaptor-ligovanou dvojreťazcovou cDNA knižnicou na klonovanie 5 'konca prasačej fVIII cDNA. Takže neúspech tejto metódy nebol dôsledkom absencie cDNA zodpovedajúcej exónu 26.

Postup „cielenej prechádzky po géne s PCR“ („targeted gene walking PCR; Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055-3060) sa použil na klonovanie 3'polovice C2 domény. „Sense“ primér špecifický pre prasačiu sekvenciu, sekvencia SEQ ID NO: 17: 5’-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3’ (nt 6904-6924) sa syntetizoval na podklade začiatočnej sekvencie C2 domény a použil sa na PCR reakcie s nešpecifickými „walking“ primérmi vybranými z oligonukleotidov dostupných v laboratóriu. PCR produkty sa potom zacielili analýzou extenzie primérov (Parker et al. (1991) BioTechniques 10:94-101 použitím a ³²P-koncovo značeného interného priméru špecifického pre prasačiu sekvenciu, sekvencia SEQ ID NO: 18:

5’-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3’ (nt 6932-6952). Je zaujímavé, že zo 40 testovaných nešpecifických primérov iba dva poskytli pozitívne produkty v analýze extenzie primérov a tieto dva produkty zodpovedali presnej a degenerovanej ľudskej sekvencii 3’konca C2 domény: sekvencia SEQ ID NO:19: 5’GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3’ (nt 7030-7453) a sekvencia SEQ ID NO: 20: 5’-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3’, (nt 7027-7053). Tieto priméry sa pôvodne navrhli na získanie dostatočného množstva produktu pomocou konvenčnej RT-PCR, ale neviedli k získaniu dostatočného množstva produktu, ktoré by sa mohlo vizualizovať väzbou etídiumbromidového farbiva. Ale PCR produkt sa mohol identifikovať omnoho citlivejšie metódou extenzie primérov. Tento produkt sa purifikoval z gélu a priamo sekvenoval. To viedlo k extenzii sekvencie prasačieho fVIII 3 'až k nt 7026.

Ďalšia sekvencia sa získala analýzou extenzie primérov produktov pripravených hniezdovou PCR použitím adaptor-ligovanej dvojreťazcovej cDNA knižnice postupom ,,5’RACE“, už skôr opísaným. Prvý cyklus reakcie sa uskutočnil použitím presného prasačieho priméru sekvencie SEQ ID NO: 21: 5’CTTCGCATGGAGTTGATGGCCTGT-3’ (nt 6541-6564) a priméru AP1. Druhý cyklus reakcie sa uskutočnil použitím priméru sekvencie SEQ ID NO: 22: 5’-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3’ (nt 6913-6934) a AP2 priméru. Priame PCR sekvenovanie predĺžilo sekvenciu k 3’koncu C2 domény (nt 7053). Sekvencia C2 domény je jedinečná s výnimkou nt 7045 v blízkosti 3’konca C2 domény. Analýza opakovaných PCR reakcií poskytla buď A, G, alebo dokonca dvojité čítanie A/G v tejto pozícii.

Sekvenovanie sa predĺžilo po 3 ’UTR použitím dvoch ďalších primérov a to sekvencie SEQ ID NO: 23: 5’-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3’ (nt 6977-6996) a sekvencie SEQ ID NO:24: 5’-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3’ (nt 7008-7031). Približne 15 bp fragment 3’UTR sekvencie sa získal, hoci sekvencia bola v niektorých miestach nejasná. Niekoľko „antisense“ primérov sa potom syntetizovalo na základe čo najlepšieho určenia 3’netranslatovanej sekvencie. Tieto priméry zahŕňali reverzný komplement TGA stop kodónu na ich 3 'konci. PCR produkty tak z genómovej DNA prasačej sleziny ako aj z cDNA prasačej sleziny, vizualizované elektroforézou na agarózovom géli a zafarbené etídiumbromidom, sa získali použitím špecifického „sense“ priméru sekvencie SEQ ID NO: 25: 5’-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3’ (nt 6913-6934) a 3’UTR „antisense“ priméru sekvencie SEQ ID NO: 26 5’CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3’. Na získanie dostatočného množstva materiálu na účely klonovama sa uskutočnil druhý cyklus PCR použitím hniezdového „sense“ priméru sekvencie SEQ ID NO: 27 5’

SK 286205 Β6

CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3’ (nt 6932-6952) a rovnakého „antisense“ priméru. PCR produkt veľkosti 141 bp sa klonoval do EcoRV poštiepeného pBluescnpt II KS-. Sekvencia troch klonov získaných z genómovej DNA a troch klonov získaných z cDNA sa určila v oboch smeroch. Sekvencia bola jednoznačná s výnimkou polohy 7045, kde v genómovej DNA bolo vždy A, zatiaľ čo v cDNA bolo vždy G.

Viacnásobné priradenie sekvencie DNA ľudského, prasačieho a myšieho ÍVIII (pozri obrázky 1A až 1H)

Porovnanie sekvencií signálneho peptidu a úsekov Al, A2, A3, Cl a C2 úsekov sa uskutočnilo použitím programu CLUSTALW (Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22:4673-4680). „Trestné“ body za medzery „gap open“ a „gap extension“ v porovnávaných sekvenciach boli 10 a 0,05 v uvedenom poradí. Porovnanie ľudskej, myšej a prasačej sekvencie B domény bolo už opísané (Elder et al. (1993) supra). Ľudská A2 sekvencia zodpovedá aminokyselinám 373-740 v sekvencií SEQ ID NO 2. Prasačia aminokyselinová sekvencia A2 je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 4 a myšia aminokyselinová sekvencia A2 domény je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 392-759.

Príklad 6

Expresia aktívneho rekombinantného prasačieho faktora VIII postrádajúceho doménu B (PB)

Materiály

Citrátom ošetrená krv s hemofíliou A a normálna ľudská plazma sa kúpili od George King Biomedical, Inc. Fetálne hovädzie sérum, geneticin, penicilín, streptomycín a DMEM/F12 médium a AIM-V médium boli kúpené od Life Technologies, Inc. Taq DNA polymeráza bola zakúpená od firmy Promega. Vent DNA polymeráza bola zakúpená od firmy New England Biolabs. Pfu DNA polymeráza a fagemid pBluescript II KS' boli zakúpené od firmy Stratagen. Syntetické oligonukleotidy boli kúpené od firmy Life Technologies alebo Cruachem, Inc. Reštrikčné enzýmy boli od firmy New England Biolabs alebo Promega. 5’-Fosforylované priméry sa použili, keď sa PCR produkty pripravovali na klonovacie účely. Číslovanie nukleotidov (nt) v oligonukleotidoch, ktoré sa použili ako priméry na amplifikáciu prasačej fVIII cDNA alebo genómovej DNA v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) vychádzalo z ľudskej fVIII cDNA ako referenčnej sekvencie (Wood et al. (1984) Náture 312:330-337). A fVIII expresný vektor nazvaný HB'/ReNeo sa získal od firmy Biogen, Inc. HB'/ReNeo obsahuje gény rezistencie na ampicilín a geneticin a cDNA ľudského fVIII, ktorému chýba celá B doména, definovanú ako štiepny fragment Ser741-Argl648 produkovaný trombínom. Na uľahčenie mutagenézy cDNA fVIII C2 domény, ktorá je na 3 'konci inzertu fVIII v ReNeo, sa miesto Nôti vnieslo 2 bázy od 3'stop kodónu HB'/ReNeo použitím mutagenézy typu „splicing-by-overlap extension“(SOE) (Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217:270-279). Tento konštrukt bol nazvaný HB'ReNeo.Wo/I.

Celková RNA sa izolovala metódou kyslej guanidínium tiokyanát-fenol-chloroformovej extrakcie (Chromczynski, P. et al. (1987) Anál. Biochem. 162:156-159). cDNA sa syntetizovala z mRNA použitím reverznej transkriptázy (RT) z Moloneyho myšieho leukemického vírusu a náhodných hexamérov podľa inštrukcií výrobcu kitu (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Plazmidová DNA sa purifikovala použitím súpravy Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Inc.). PCR reakcie sa uskutočnili použitím termocykléra Hybaid OmniGen použitím Taq, Vent alebo Pfu DNA polymeráz. PCR produkty sa purifikovali na géli, precipitovali etanolom a ligovali do plazmidovej DNA použitím T4 DNA ligázy (Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim). Inzerty obsahujúce plazmidy sa použili na transformáciu buniek E. coli Epicurean XLl-Blue. Všetky nové fVIII DNA sekvencie vytvorené pomocou PCR sa potvrdili dideoxysekvenovaním použitím automatického DNA sekvenátora Applied Biosystems 373a a kitu terminačných farbív PRISM.

Konštrukcia hybridného expresného vektora fVIII HP20 obsahujúceho prasačiu C2 doménu

Prasačia fVIII cDNA zodpovedajúca 3’koncu Cl domény a celej C2 doméne sa klonovala do pBluescript použitím RT PCR z celkovej RNA zo sleziny použitím primérov založených na známej prasačej fVIII cDNA sekvencií (Healey, J.F. et al. (1996) Blood 88:4209-4214). Tento konštrukt a konštrukt HB'/ReNeo sa použili ako templáty na konštrukciu fiízneho produktu „ľudský Cl- prasačí C2“ v pBlueScript mutagenézou SOE. C1-C2 fragment z tohto plazmidu sa vyštiepil s Jpal a Bo tí a ligoval do Apal/Noíl-poštiepeného konštruktu HB'/ReNeoNotI, aby tak vznikol HP20/ReNeo/NotI konštrukt.

Konštrukcia hybridného ľudského/prasačieho fVIII obsahujúceho prasačí ľahký reťazec (HP18)Ľahký reťazec ľudského fVIII pozostáva z aminokyselinových zvyškov Aspl649 až Tyr2332. Zodpovedajúcimi zvyškami prasačej fVIII cDNA sa tento úsek nahradil v HB-, čím sa pripravila hybridná ľudsko/prasačia fVIII molekula nazvaná HP18. Uskutočnilo sa to tak, že zodpovedajúci úsek v HP20 sa nahradil PCR produktmi, ktoré zodpovedajú prasačiemu úseku A2, doméne A3, Cl a časti C2 domény. Na uľahčenie konštrukcie sa synonymné ,4 wll miesto SOE mutagenézou vnieslo do nt 2273 na spojnicu A2 a A3 domény v HP20.

Konštrukcia hybridu ľudského/prasačieho fVTll, ktorý nemá B doménu, a ktorý obsahuje prasačí signálny peptid, A1 doménu a A2 doménu (HP22)Signálny peptid ľudského fVIII s A1 doménou a A2 doménou pozostáva z aminokyselinových zvyškov Met(-19)-Arg740. Tento úsek HB- sa nahradil zodpovedajúcimi zvyškami prasačej fVIII cDNA a takto sa pripravila molekula nazvaná HP22. Navyše sa synonymné A vrll miesto SOE mutagenézou vnieslo do nt 2273 na spojnicu A2 a A3 domény v HP20. HP22 sa skonštruoval fúziou fragmentu prasačí signálny peptid-A1 -parciálny fragment A2 v pBlueScript (Healy et al. (1996) supra) s hybridným ľudským/prasačím fVIII, ktorý nemá doménu B, obsahujúcim prasačiu A2 doménu, označovanú HP1 (Lubín et al. (1994) supra).

Konštrukcia prasačieho fVIII bez B domény (PB)

Spel/Notl fragment HP18/BS (+Avrll) sa poštiepil Avrľl/NotI a ligoval sa do ďvrlLWoŕl-poštiepeného HP22BS (+A vžil), čím sa pripravil konštrukt PB7BS (+Avrll), ktorý pozostáva z prasačieho fVIII, ktorý nemá celú B doménu. PB- sa klonoval do ReNeo ligovaním XballNotl fragmentu z PB /BS (++Ívrll) do HP22/ReNco/NotI (+JvrII).

Expresia rekombinantných molekúl fVIII

PB/ReNeo/NotI (+ďvrll) a HP22/ReNeo/NotI (+Λ vrll) sa prechodne transfekovali do COS buniek a exprimovali, ako už je opísané (Lubín, LM. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:8639-8641). Ako kontroly sa uskutočnili transfekcie HB'/ReNeo/NotI a bez DNA.

Aktivita fVIII PB', HP22 a HB’ sa merali chromogénnym testom nasledujúcim spôsobom. Vzorky fVIII v supematantoch COS bunkových kultúr sa aktivovali 40 nM trombínom v 0,15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4 v prítomnosti 10 nM faktora IXa, 425 nM faktora X a 50 μΜ unilamelámych fosfatidylserín/fosfatidylcholínových (25/75 hmotn./hmotn.) vezikúl. Po 5 minútach sa reakcia zastavila 0,05 M EDTA a 100 nM rekombinantného desulfatohirudínu a výsledný faktor Xa sa meral testom s chromogénnym substrátom. Pri teste s chromogénnym substrátom sa pridalo 0,4 mM Spectrozym Xa a sledovalo sa uvoľňovanie paranitroanilidu meraním absorbancie roztoku pri 405 nm.

Výsledky zo supematantov dvoch nezávisle transfekovaných bunkových kultúr (absorbancia 405 nm za 1 minútu) boli nasledujúce:

HB’: 13,9, PB': 139, HP22: 100, „slepá“ kontrola: < 0,2.

Tieto výsledky ukazujú, že prasačí fVIII, ktorému chýba doména B a fVIII, ktorý nemá doménu B pozostávajúcu z prasačej Al a A2 podjednotky, sú aktívne a vedú k predpokladu, že majú dokonca vyššiu aktivitu než ľudský fVIII, ktorý nemá doménu B.

PB sa čiastočne purifikoval a koncentroval z rastového média chromatografiou na heparín-Sepharose. Heparín-Sepharose (10 ml) sa ekvilibrovala s 0,075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl₂, 0,005 % Tween-80, 0,02 % azid sodný, pH 7,4. Médium (100 až 200 ml) z exprimujúcich buniek sa nanieslo na heparín-Sepharose, ktorá sa potom premyla 30 ml ekvilibračného pufra bez azidu sodného. PB sa eluoval 0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4 a potom sa uskladnil pri -80 °C. Výťažok fVIII koagulačnej aktivity bol typicky 50 až 75 %.

Stabilná expresia prasačieho fVIII, ktorému chýba doména B (PB )

Transfekované bunkové línie sa udržiavali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu F12, ktoré obsahovalo 10 % fetálne hovädzie sérum, 50 U/ml penicilínu, 50 pg/ml streptomycínu. Fetálne hovädzie sérum sa tepelne inaktivovalo pri 50 °C jednu hodinu pred použitím. HB'/ReNeo a PB'ReNeo/NotI (+ďvrll) sa stabilne transfekovali do buniek BHK a selektovali na rezistenciu na geneticín použitím všeobecne známeho postupu, ktorý sa už publikoval skôr (Lubín et al. (1994) Biol. Chem. 269:8639-8641) s výnimkou toho, že bunky, ktoré sa exprimujú, sa udržiavali v rastovom médiu, ktoré obsahovalo 600 pg/ml geneticínu. Bunky z kultivačných fliaš Coming T-75 pestované do konfluencie sa preniesli do trojhranných kultivačných fliaš Nunc s médiom, ktoré obsahovalo 600 pg/ml geneticínu a ďalej pestovali až do konfluencie. Médium sa odoberalo a nahradilo AIM-V médiom bez séra (Life Technologies, Inc.) a bez geneticínu. Expresia faktora VIII sa monitorovala jednofázovým testom koagulačnej aktivity faktora VIII (pozri skôr) a 100 až 150 ml sa odoberalo jedenkrát denne počas štyroch až piatich dni. Maximálne hladiny expresie v médiu pre HB a PB' boli 102 jednotiek koagulačnej aktivity faktora VIII na jeden ml a 10 až 12 jednotiek na ml, v uvedenom poradí.

Purifikácia PB’

PB' sa precipitoval zo supematantu kultúry použitím 60 % saturovaného roztoku síranu amónneho a potom sa purifikoval W3-3 imunoafinitnou chromatografiou na mono Q HPLC, ako sa už skôr opísalo pre puri

SK 286205 Β6 fikáciu z plazmy pochádzajúceho prasačieho faktora VIII (Lollar et al. (1993) Factor VIII/Factor VlIIa. Methods Enzymol. 222:128-143). Špecifická koagulačná aktivita PB' sa merala jednofázovým koagulačným testom (Lollar et al. (1993) supra) a podobala sa aktivite prasačieho faktora VIII pochádzajúceho z plazmy.

Keď sa PB’ preparát analyzoval elektroforézou na SDS polyakrylamidovom géli, obsahoval tri pásy s molekulovou hmotnosťou 160 kDa, 82 kDa a 76 kDa. 82 kDa a 76 kDa pásy boli už skôr opísané ako heterodiméry obsahujúce A1-A2 a ap-A3-Cl-C2 domény (kde ap označuje aktivačný peptid) (pozri Toole at al. (1984) Náture 312:342-347). 160 kDa pás sa preniesol na polyvinylidénfluoridovú membránu a potom sa podrobil NH₂-koncovému sekvenovaniu, ktoré poskytlo fragment Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (kde Xx predstavuje neurčenú polohu), čo je NH₂-koncová sekvencia jednoreťazcovej molekuly faktora VIII (Toole et al. (1984) supra). Takže PB'je čiastočne opracovávaný štiepením medzi doménami A2 a A3, takže pozostáva z dvoch foriem a to jednoreťazcového proteínu Al-A2-ap-A3-Cl-C2 a heterodiméru Al-A2-ap-A3-Cl-C2. Podobné opracovanie rekombinantného HB' tiež opísali (Línd et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:19-27).

Charakterizácia prasačieho faktora VIII

Stanovila sa cDNA sekvencia prasačieho fVIII zodpovedajúca 137 bp 5’UTR, úsek kódujúci signálny peptid (57 bp) a Al (1119 bp), A3 (990 bp), C1 (456 bp) a C2 (483 bp) domény.

Spoločne so skôr publikovanou sekvenciou B domény a úsekov aktivačného peptidu ľahkého reťazca (Toole et al. (1986) supra) a A2 domény (Lubín et al. (1994) supra), sekvencia opísaná v predkladanej prihláške dokončuje stanovenie úplnej sekvencie cDNA prasačieho fVIII zodpovedajúcej translatovanému produktu. Fragment, ktorý zahŕňal cDNA pre 5’UTR úsek, signálny peptid a Al doménu sa klonoval použitím postupu 5’-RACE RT PCR. Primér odvodený z ľudskej C2 sekvencie úspešne viedol k vytvoreniu RT PCR produktu, ktorý potom umožnil klonovanie domén A3, C1 a 5’-časti C2 domény. cDNA zodpovedajúca 3’-časti C2 domény a 3’UTR cDNA sa ukázali ako veľmi namáhavé substráty na klonovanie. Zvyšok C2 domény sa nakoniec klonoval postupom „targeted gene walking PCR“ (Parker et al. (1991) supra).

Sekvencia opísaná v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 29 bola stanovená jednoznačne s výnimkou nukleotidu 7045 blízko 3’konca C2 domény, kde bolo buď A, alebo G, ako sa opísalo. Zodpovedajúci kodón je GAC (Asp) alebo AAC (Asn). Ľudské a myšie kodóny sú GAC a CAG (Gin), v uvedenom poradí. Či v tomto prípade ide o polymorfizmus alebo reprodukovateľný artefakt vnesený PCR je doteraz neznáme. cDNA pre rekombinantný hybridný ľudský/prasačí fVIII, ktorý postráda doménu B obsahujúcu substitúcie prasačej C2 domény zodpovedajúcej tak GAC ako aj AAC kodónu sa stabilne exprimovali bez detegovateľného rozdielu v prokoagulačnej aktivite. Tento výsledok ukazuje, že nie je funkčný rozdiel medzi dvoma variantmi C2 domény.

Porovnanie predikovanej aminokyselinovej sekvencie úplného prasačieho fVIII (sekvencia SEQ ID NO: 30) s publikovanou ľudskou sekvenciou (Wood et al. (1984) supra) a myšou sekvenciou (Elder et al. (1993) supra) je ukázané na obrázku 1A až 1H, spoločne s miestami pre post-translačné modifikácie, proteolytické štiepenie, a rozpoznávame inými makromolekulami. Stupeň identity porovnaných/priradených sekvencií je uvedený v tabuľke VII. Ako bolo už skôr uvedené, B domény týchto biologických druhov sú viac divergentné (viac sa odlišujú) ako A alebo C domény. To je však v súlade s pozorovaním, že B doména nemá žiadnu známu funkciu, bez ohľadu na značnú veľkosť tejto domény. (Elder et al. (1993) supra; Toole at al. (1986) supra). Výsledky získané v predkladanom vynáleze potvrdzujú, že B doména prasačieho fVIII nie je nevyhnutná na jeho aktivitu. Na základe opísaných sekvenčných údajov sa syntetizoval prasačí fVIII, ktOTý má deletovanú (odstránenú) aspoň časť alebo celú B-doménu a potom sa exprimoval prasačí fVIIla z kódujúcej DNA, ktorá má deletované všetky alebo časť kodónov prasačej B domény. Existuje tiež vyššia divergencia sekvencií, ktoré zodpovedajú šiepnemu peptidu Al doména APC/faktor IXa (zvyšky 337-372) a aktivačnému peptidu ľahkého reťazca (tabuľka VII). Trombínové štiepne miesto v polohe 336 na vytvorenie peptidu 337-372 je pri myšiach zjavne stratené, lebo tento zvyšok je glutamín namiesto arginínu (Elder et al. (1993) supra). Relatívne rýchla divergencia trombínových štiepnych peptidov (alebo pri myšom fVIII možno zvyškového aktivačného peptidu 337-372) sa poznala už skôr pri fibrinopeptidoch (Creighton, T. E. (1993) Proteins: Structures a Molecular Properties, W. H. Freeman, New York, pp. 105-138). Nedostatok biologickej funkcie týchto peptidov, len čo sú poštiepené, bol citovaný ako jeden z možných dôvodov rýchlej divergencie. Arg562 v ľudskom fVIII sa navrhol ako dôležité štiepne miesto pre aktivačný proteín C v priebehu inaktivácie fVIII a fVIIla (Fay, P.J. at al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145). Tieto miesta sú konzervatívne (sú zachované) tak v ľudskej, ako aj v prasačej a myšej sekvencií fVIII.

Potenciálne miesta N-glykozylácie (NXS/T, kde X nie je prolín) sú vidieť na obrázku 1A až 1H. Je tam osem konzervatívnych N-viažucich glykozylačných miest: jedno je v Al doméne, jedno v A2 doméne, štyri v B doméne, jedno v A3 doméne a jedno v C1 doméne. 19 cysteínových zvyškov v A a C doméne je tiež zachovaných, zatiaľ čo existuje divergencia cysteínových zvyškov v B doméne. Šesť zo siedmich disulfidických väzieb v molekule fVIII sú na homologických miestach s faktorom V a ceruloplazmínom a obe disulfidické väzby C domény sa našli tiež vo faktore V (McMullen, B. A. et al. (1995) Protein Sci. 4:740-746). Ľudský fVIII obsahuje sulfátovaný tyrozín v pozíciách 346, 718, 719, 723, 1664 a 1680 (Pitman, D.D. et al.

(1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102). Tieto zvyšky sú zachované aj v myšom a prasačom fVIII (obrázok 1), hoci program CLUSTALW zlyhal v priradení tyrozínového zvyšku v myšej sekvencii zodpovedajúcemu Tyr346 v ľudskom fVIII.

Myšia a prasačia plazma môžu korigovať defekty koagulácie v ľudskej plazme s hemofíliou A, čo je v súlade s hladinou konzervatívnych zvyškov v doménach A a C týchto biologických druhov. Prokoagulačná aktivita prasačieho fVIII je vyššia než ľudského fVIII (Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657). Rekombinantný prasačí faktor VIII (s deletovanou B doménou) exprimovaný a purifikovaný, ako už je opísané má, tiež vyššiu špecifickú koagulačnú aktivitu než ľudský fVIII, porovnateľnú s prasačím fVIII pochádzajúcim z plazmy. To by mohlo byť spôsobené zníženou spontánnou rýchlosťou disociácie A2 podjednotky z aktívneho heterotriméru fVIIIa: A1/A2/A3-C1-C2. Či rozdiely v prokoagulačnej aktivite odrážajú evolučnú zmenu vo funkcii ako príklad adaptácie druhov (Perutz, M.F. (1996) Adv. Proteín Chem. 36:213-244), nie je známe. Teraz, keď je prasačia cDNA fVIII sekvencia zodpovedajúca translatovanému produktu úplná, homologická skenovacia mutagenéza (Cunningham, B.C. et al. (1989) Science 243:1330-1336) môže poskytnúť spôsob na identifikáciu štruktúrnych rozdielov medzi ľudským a prasačím fVIII, ktoré sú príčinou vyššej aktivity prasačieho proteínu.

Prasačí fVIII je typicky menej reaktívny s inhibičnými protilátkami, ktoré sa tvoria u hemofilikov, ktorým bola podaná transfúzia s fVIII, alebo ktoré sa tvoria ako autoprotilátky vo všeobecnej populácii. To predstavuje základ na použitie koncentrátu prasačieho fVIII pri liečení pacientov s inhibičnými protilátkami (Hay a Lozier (1995) supra). Väčšina inhibičných protilátok je namierená proti epitopom, ktoré sú lokalizované v doméne A2 alebo C2 (Fulcher, C.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74:1618-1626). Navyše sa identifikoval epitop neznámeho významu, ktorý leží buď v doméne A3, alebo Cl (Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84:224a). A2 epitop sa mapoval do polohy zvyškov 484 až 508 metódou homologickej skenovacej mutagenézy (Healey et al. (1995) supra). V tomto segmente s veľkosťou 25 aminokyselinových zvyškov je relatívne nízky podiel identických sekvencii (16/25 alebo 64 %). Je zaujímavé, že tento úsek, ktorý, ako sa zdá, je funkčne dôležitý a to na základe faktu, že protilátky proti nemu majú inhibičný účinok, bol zjavne vystavený relatívne rýchlejšiemu genetickému driftu. Porovnanie prasačej A2 domény a A3 domény ukazuje, že A2 epitop nezdieľa žiadnu detegovateľnú homológiu so zodpovedajúcim úsekom v A3 doméne.

Pomocou delečného mapovania sa navrhla lokalizácia C2 inhibičného epitopu ľudského fVIII do úsekov zvyškov 2248 až 2312 (Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819). Ľudský a prasačí fVIII sú na 83 % identické v tomto segmente 65 aminokyselinových zvyškov. Ale homologická skenovacia mutagenéza tohto úseku s cieľom charakterizovať C2 epitop viedla k odhaleniu, že hlavný determinant C2 epitopu je neočakávane lokalizovaný v úseku, ktorý zodpovedá aminokyselinám 2181 až 2243 (pozri sekvencia SEQ ID NO: 2 a obrázok 1H).

Pripravili sa proteíny hybridného ľudského-prasačieho faktora VIII, v ktorých sa rôzne úseky C2 domény ľudského faktora VIII nahradili zodpovedajúcimi časťami prasačieho faktora VIII a to použitím opísanej stratégie (pozri príklad 5). Syntéza rôznych C2 hybridných faktorov VIII sa uskutočnila prostredníctvom konštrukcie hybridnej kódujúcej sekvencie DNA, využitím nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje prasačí C2 úsek uvedený ako sekvencia SEQ ID NO:30. Každá hybridná DNA sa exprimovala v transfekovaných bunkách, takže sa hybridné faktory VIII mohli čiastočne purifikovať z rastového média. Aktivita sa merala, v neprítomnosti inhibítorov, jednofázovým koagulačným testom.

Zostava piatich ľudských inhibítorov sa použila na testovanie každého z hybridných faktorov VIII. Už skôr sa dokázalo, že inhibičné plazmy, ktoré obsahujú protilátky anti-faktor VIII sú namierené proti ľudskej C2 doméne, a to na základe schopnosti rekombinantnej ľudskej C2 domény neutralizovať inhibíciu. Vo všetkých testovaných plazmách sa titer inhibítorov neutralizoval viac než na 79 % C2 doménou alebo ľahkým reťazcom, ale menej než na 10 % rekombinantnou ľudskou A2 doménou. Navyše C2-hybridné faktory VIII sa testovali proti myšej monoklonálnej protilátke, ktorá sa viaže na C2 doménu, a podobne ako ľudské C2 inhibičné protilátky, inhibovala väzbu faktora VIII na fosfolipid a na von Willebrandov faktor.

Porovnaním titrov inhibičných protilátok proti C2-hybridným faktorom VIII sa ukázalo, že hlavný determinant epitopu ľudského C2 inhibítora je úsek aminokyselinových zvyškov 2181 až 2243 (pozri sekvencia SEQ ID NO: 2 a tiež obrázok 1H). Anti-C2 protilátky namierené proti úsekom smerom k COOH-koncu od zvyšku 2253 sa neidentifikovali v štyroch z piatich sér pacientov. Porovnaním hybridov, ktoré majú prasačie sekvencie zodpovedajúce ľudským aminokyselinovým zvyškom v polohách 2181 až 2199 a 2207 až 2243 sa ukázalo, že oba úseky prispievajú k väzbe protilátky. Prasačia aminokyselinová sekvencia zodpovedajúca ľudským zvyškom 2181 až 2243 je číslovaná 1982 až 2044 v sekvencii SEQ ID NO: 30. Sekvencia prasačej DNA, ktorá kóduje prasačie aminokyseliny očíslované 1982 až 2044 je sekvencia nukleotidov 5944 až 6132 v sekvencii SEQ ID NO: 29.

S odkazom na obrázok 1H vidieť, že v úseku 2181 až 2243 je 16 aminokyselinových rozdielov medzi ľudskou a prasaČou sekvenciou. Rozdiely sa našli vo zvyškoch 2181, 2182, 2188, 2195 až 2197, 2199, 2207,

2216, 2222, 2224 až 2227, 2234, 2238 a 2243. Nahradenie jedného alebo viacerých z týchto aminokyselinových zvyškov sa môže uskutočniť, čím sa získa modifikovaný ľudský faktor VIII, ktorý je nereaktívny s ľudskými anti-C2 inhibičnými protilátkami. Alanínová skenovacia mutagenéza poskytuje vhodný spôsob na vytváranie alanínových substitúcií prirodzene sa vyskytujúcich zvyškov, ako už bolo opísané. Tiež aminokyseliny iné než alanín sa môžu nahradiť. Alanínové substitúcie jednotlivých aminokyselín, najmä tých, ktoré sú odlišné v ľudskej/prasačej alebo ľudskej/myšej sekvencii, alebo ktoré s najväčšou pravdepodobnosťou prispievajú k väzbe protilátky, môžu poskytnúť modifikovaný faktor VIII so zníženou reaktivitou a inhibičnými protilátkami.

Obrázky 1A až 1H spolu dohromady ukazujú priradené (porovnané) aminokyselinové sekvencie ľudského, prasačieho a myšieho faktora VIII. Obrázok 1A porovnáva úseky signálneho peptidu (ľudskej sekvencie SEQ ID NO: 31; prasačej sekvencie SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1 až 19; myšej sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 1 až 19). Aminokyseliny na obrázkoch 1A až 1H sú číslované tak, že prvý alanín zrelého proteínu je označený ako č. 1 a teda aminokyseliny signálneho peptidu majú negatívne čísla. Ľudská fVIII sekvencia v sekvencii SEQ ID NO: 2 tiež začína prvým alanínom zrelého proteínu ako aj aminokyselinou č. 1. V aminokyselinovej sekvencii myšieho fVIII (sekvencia SEQ ID NO: 28) a prasačieho fVIII (sekvencia SEQ ID NO: 30) je prvá aminokyselina (alanín) zrelého proteínu označená ako aminokyselina č. 20. Obrázky 1A až 1H ukazujú porovnanie zodpovedajúcich sekvencii ľudského, myšieho a prasačieho fVIII a to tak, že úseky s najväčšou aminokyselinovou identitou ležia vedľa seba. Číslovanie aminokyselín na obrázkoch 1A až 1H platí len pre ľudský fVIII. Obrázok 1B ukazuje aminokyselinovú sekvenciu ľudskej (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 1 až 372), prasačej (sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 20 až 391) a myšej (sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 20 až 391) A1 domény. Obrázok 1C ukazuje aminokyselinovú sekvenciu ľudskej (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 373 až 740), prasačej (sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 392 až 759) a myšej (sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 392 až 759) domény A2 faktora VIII. Obrázok 1D poskytuje aminokyselinovú sekvenciu ľudskej (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 741 až 1648), prasačej (sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 760 až 1449) a myšej (sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 760 až 1644) B domény faktora VIII. Obrázok 1E porovnáva aminokyselinové sekvencie ľudského, prasačieho a myšieho (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 1649 až 1689; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1450 až 1490; a sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 1641 až 1678, v uvedenom poradí) aktivačného peptidu ľahkého reťazca faktora VIII. Obrázok 1F poskytuje porovnanie ľudskej, prasačej a myšej sekvencie (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 1690 až 2019; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1491 až 1820; a sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 1679 až 2006, v uvedenom poradí) A3 domény faktora VIII. Obrázok 1G ukazuje aminokyselinové sekvencie C1 domény ľudského, prasačieho a myšieho (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 2020 až 2172; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1821 až 1973; a sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 2007 až 2159, v uvedenom poradí) faktora VIII. Obrázok 1H ukazuje sekvencie C2 domény ľudského, prasačieho a myšieho (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 2173 až 2332; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1974 až 2133; a sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 2160 až 2319, v uvedenom poradí) faktora VIII.

Kosoštvorce označujú miesta sulfátovaného tyrozínu, predpokladané väzbové miesta faktora IXa, fosfolipidu a proteínu C sú dvakrát podčiarknuté a úseky, ktoré sa podieľajú na väzbe anti-A2 a anti-C2 inhibičných protilátok sú vyznačené kurzívou. Hviezdičky vyznačujú konzervatívne aminokyselinové sekvencie. Pozri tiež sekvenciu SEQ ID NO: 29 (cDNA prasačieho faktora VIII) a sekvenciu SEQ ID NO: 30 (dedukovaná aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII). Použil sa systém číslovania ľudskej sekvencie ako referencia (Wood et al. (1984) supra). Al, A2 a B domény sú definované trombínovými štiepnymi miestami v pozícii 372 a 740 a štiepnym miestom neznámej proteázy v polohe 1648 ako segmenty zvyškov 1 až 372, 373 až 740 a 741 až 1648, v uvedenom poradí (Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347). A3, C1 a C2 domény sú definované ako zvyšky 1690 až 2019, 2020 až 2172 a 2173 a až 2332, v uvedenom poradí (Vehar et al. (1984) supra). Štiepne miesta pre trombín (faktor Ha), faktor IXa, faktor Xa a APC (Fay et al: (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. et al, (1992) Blood 80:3120-3128) sú ukázané tak, že meno enzýmu je umiestnené nad reaktívnym arginínom. Kyslý peptid je odštiepený od ľahkého reťazca fVIII trombínom alebo faktorom Xa v polohe 1689. Predpokladané väzbové miesta pre faktor IXa (Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), fosofolipid (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004) a proteín C (Walker, F.J. et al. (1990)J. Biol. Chem. 265:1484-1489) sú dvakrát podčiarknuté. Úseky, ktoré sa zúčastňujú na väzbe anti-A2 (Lubín et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra); a už skôr navrhnuté pre anti-C2 inhibičné protilátky sú vyznačené kurzívou. C2 inhibítorový epitop identifikovaný, ako už bolo opísané (aminokyseliny 2181 až 2243 v ľudskej sekvencii) je ukázaný ako jedenkrát podčiarknutý úsek na obrázku 1H. Miesta sulfátovaného tyrozínu (Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994) supra) sú označené symbolom ♦.

Príklad 7

Konštrukcia POL1212 a expresia v bunkách obličiek novorodených škrečkov

POL1212 je prasačí faktor VIII čiastočne bez domény B, ktorý má B doménu deletovanú okrem toho, že 12 aminokyselín NH₂ konca B domény a 12 aminokyselín -COOH konca sú zachované.

cDNA kódujúce sekvencie pre domény Al, A2, ap-A3-Cl a C2 prasačieho fVIII sa získali, ako už bolo opísané v príklade 5. Nukleotidová sekvencia DNA a odvodená aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII sú uvedené v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 29 a sekvencia SEQ ID NO: 30 v uvedenom poradí. Amplifikované fragmenty sa oddelene klonovali do plazmidu pBluescript II KS' (pBS).

POL1212 sa týka cDNA kódujúcej prasačí fVIII, ktorá nemá väčšinu B domény, ale obsahuje DNA sekvenciu, ktorá kóduje 24 aminokyselinový linker medzi doménami A2 a ap. POL1212 sa skonštruoval v cicavčom expresnom vektore, ReNeo, ktorý sa získal od firmy Biogen. ReNeo sa môže replikovať v baktériách, môže sa replikovať ako epizóm v bunkách COS na prechodnú expresiu faktora VIII alebo sa môže stabilne integrovať do celého radu cicavčích buniek. Skladá sa zo (1) sekvencií odvodených z plazmidu pBR322, ktoré obsahujú počiatok replikácie a gén rezistencie na ampicilín, (2) génu rezistencie na neomycín, ktorého expresia je pod kontrolou SV40 promótora/enhancera, SV40 malého t intrónu a regulačného elementu SV40 polyadenylačného signálu, (3) miesta pre inzerciu fVIII a jeho signálneho peptidu, ktorého expresia je pod kontrolou SV40 enhancera, hlavného neskorého promótora adenovírusu typu 2 a tripartitnej vedúcej sekvencie adenovírusu typu 2. Namiesto ReNeo vektora sa môže použiť každý vektor, ktorý má podobné funkčné zložky.

POL1212/ReNeo sa pripravil v niekoľkých krokoch. Najskôr sa cDNA, ktoré kódujú ťažký reťazec prasačieho fVIII (A1-A2) a cDNA, ktoré kódujú ľahký reťazec prasačieho fVIII (ap-A3-Cl-C2), oddelene zostavili v pBS. Z týchto konštruktov sa DNA, ktorá kóduje prasačí fVIII bez domény B, zostavila v pBS (PB-/pBS). Táto forma prasačieho fVIII nemá celú B doménu, definované ako aminokyseliny zodpovedajúce zvyškom 741-1648 v ľudskom fVIII (nukleotidy 2278-5001 v ľudskej sekvencií). Ďalej bola ľudská A2 doména v expresnom vektore ReNeo (ΗΒ/ReNeo) s ľudským fVIII, ktorému chýba doména B substituovaná DNA, ktorá kóduje prasačí A2. Ľudské domény sa substituovali DNA, ktorá kóduje zvyšok prasačieho ťažkého reťazca a DNA, ktorá kóduje prasačí ľahký reťazec v dvoch ďalších krokoch použitím konštruktov s prasačím ťažkým reťazcom/pBS a PB/pBS, ktoré boli vytvorené skôr. Fragment ľudskej B domény kódujúci 5 C-koncových a 9 N-koncových aminokyselín sa vložil medzi A2 a A3 domény za vzniku konštruktu nazvaného PSQ/ReNeo (Healey et al., 1998, 92: 3701-3709). Zvyšky Glu2181-Vall2234 obsahujú hlavný determinant inhibičného epitopu v C2 doméne ľudského faktora VIII. Tento konštrukt sa použil ako templát na vytvorenie fragmentu prasačej B domény kódujúcej 12 C-koncových a 12 N-koncových aminokyselín. Tento fragment sa vložil medzi domény A2 a A3, čo malo za následok konečný konštrukt, POL1212/ReNeo.

POL1212 linker s 24 aminokyselinami sa skladá z prvých 12 a posledných 12 zvyškov B domény prasačieho ťVIII. POL1212 linker má nasledujúcu sekvenciu:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (sekvencia SEQ ID NO: 32)

Nukleotidová sekvencia zodpovedajúca 1212 linkeru a susediacim aminokyselinám je (sekvencia SEQ ID NO: 33)

GTC

ATT

GAA

CCT

AGG

AGC

TTT

GCC

CAG

AAT

TCA

AGA

CCC

CCT

AGT

V

I

E

P

R

S

F

A

Q

N

S

R

P

S

GCG

AGC

GCT

CCA

AAG

CCT

CCG

GTC

CTG

CGA

CGG

CAT

CAG

AGG

GAC

A

S

A

P

K

P

V

L

R

H

Q

R

D

ATA

AGC

CTT

CCT

ACT

I

S

L

P

T

POL1212 linker sa syntetizoval mutagenézou „splicing-by-overlap extension“ (SOE) takto: PCR reakcie použité na vytváranie SOE produktov boli tieto:

Reakcia č. 1

Vonkajší primér: Rev 4, čo je primér pre prasačí A2, nukleotidy 1742-1761. (sekvencia SEQ ID NO: 29). Sekvencia je: 5’-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3’ (sekvencia SEQ ID NO: 34).

Vnútorný primér: OL12 čo je prasačí reverzný primér pokrývajúci prvých (5’) 15 aminokyselín OL1212 a posledných (3’) 5 aminokyselín prasačí A2. Sekvencia je:

5’-CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTCAATGAC-3’ (sekvencia SEQ ID NO: 35)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasačia DNA od nukleotidu 1745 v A2 doméne k 2322 v OL1212, 580 bp

SK 286205 Β6

Reakcia č. 2

Vonkajší primér: P2949 je prasačí reverzný A3 primér, nukleotídy 2998-3021 zo sekvencie SEQ ID NO: 29. Sekvencia je: 5’-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3’ (pozri sekvencia SEQ ID NO: 29)

Vnútorný primér: OL12+, prasačí primér pokrývajúci posledných (3’) 16 aminokyselín OL1212 a prvých (5’) 6 aminokyselín aktivačného peptidu, nukleotídy 2302-2367 zo sekvencie SEQ ID NO: 29. Sekvencia je: 5’-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATAAGCCTTCCTACT-3’ (sekvencia SEQ ID NO: 36)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasačí od nukleotidu 2302 v OL1212 do nukleotidu 3021 v doméne A3, 719 bp

SOE reakcia

Priméry: Rev 4, P2949Templáty: Fragment z reakcie č. 1 (bp) a fragment s nízkou teplotou topenia z reakcie č. 2 (bp)

Produkt: prasačia DNA od nukleotidu 1742 v A2 doméne do nukleotidu 3021 v A3 doméne (sekvencia SEQ ID NO: 29) vrátane OL1212,1279 bp. Reakčný produkt bol precipitovaný etanolom.

1212 linker sa vložil do PSQ/ReNeo štiepením SOE produktu (inzertu) a PSQ/ReNeo (vektora) s ÄsoBI. Vektor a inzert sa ligovali použitím T4 ligázy a produkt sa použil na transformáciu buniek E. coli XLl-Blue. Plazmidová DNA sa pripravila z niekoľkých kolónií a sekvencia 1212 linkera a ďalšia PCR generovaná sekvencia sa overili sekvenčnou analýzou DNA.

Pestovanie buniek obličiek novorodených škrečkov (BHK) CRL-1632

Bunková línia BHK sa získala zo zbierky ATCC, prístupová identifikácia CRL-1632 a uložila sa zamrazená pri -20 °C až do ďalšieho použitia. Bunky sa rozmrazili pri 37 °C a vložili do 10 ml kompletného média, definovaného ako DMEM/F12, 50 U/ml penicilínu, 50 pg/ml streptomycínu plus 10 % fetálne hovädzie sérum (FBS). FSB bolo kúpené od firmy Hyclone, Logan, Utah. Bunky sa centrifugovali počas 2 minút v 300 RPM. Médium sa odsalo a bunky sa resuspendovali v 2 ml kompletného média vo fľaši T-75 obsahujúcej 20 ml kompletného média.

POL1212 sa exprimoval v bunkách tak obličiek novorodených škrečkov (BHK), ako v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka (CHO). Použili sa dve BHK línie, línia CRL-1632 z ATCC a ďalšia BHK línia získaná od R. Mcgillivray, University of British Columbia, (Funk, et al., (1990) Biochemistry, 29:1654-1660). Posledné uvedené sa pestovali bez selekcie v laboratóriu pôvodcov a nazvali sa BHK 163 2 (Emory). CHO bunková línia bola CHO-K1, ATCC prístupové č. CCL-61. Expresia priemerného klonu z bunkovej línie Emory a z buniek CHO-K1 bola vyššia než z buniek CRL-1632, ako sa usúdilo z aktivity v chromogénnom teste.

Bunky pestované vo fľašiach T-75 vytvorili konfluentnú monovrstvu. Pripravilo sa 60 ml kultúry buniek E coli XLl-Blue, ktoré nesú plazmid POL1212/ReNeo v médiu LB/ampicilín (50 mg/ml).

Transfekcia buniek CRL-1632 BHK plazmidom POL1212/ReNeo

DNA z kultúry buniek POL1212/ReNeo XLl-Blue pestovaných cez noc sa pripravila použitím súpravy na minipreparáciu Spin Miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA). Jedna fľaša buniek CRL-1632 sa rozdelila do zásobnej fľaše s 0,2 ml a do fľaše na transfekciu s 0,3 ml z celkových 2 ml. Ďalšia fľaša bola doplnená čerstvým médiom. Médium bolo DMEM/F12 + 10 % Hyclone FBS + 50 U/ml penicilínu, 50 pg/ml streptomycínu. Bunky CRL-1632 sa rozdelili do 6 jamkových doštičiek s cieľom dosiahnuť 50 až 90 % konfluenciu na transfekciu (0,3 ml buniek z fľaše T-75 v 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] v každej jamke) použitím čerstvého média DMEM/F12 + 10 % Hyclone FBS + 50 U/ml penicilín, 50 ug/ml streptomycín.

Nasledujúce roztoky sa pripravili v sterilných skúmavkách s objemom 1 až 2 ml:

A) 48 μΐ (10 μg) Miniprep POL1212/ReNeo DNA plus μΐ médium bez séra (DMEM/F12) plus 10 ml Lipofectin™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) 10 μΐ Lipofectin plus 190 μΐ média („slepá“ transfekcia) sa jemne zmiešalo a DNA a Lipofectin sa nechali reagovať 15 minút pri teplote miestnosti. Počas tohto času sa bunky premyli dvakrát s 2 ml DMEM/F12. 1,8 ml DMEM/F12 sa potom pridalo k bunkám. Komplex DNA/Lipofectin sa pridal po kvapkách k bunkám a jemne pretrepal, aby sa premiešal. Bunky sa ponechali v inkubátore cez noc. DNA/Lipofectin sa odobral a pridali sa 3 ml média so sérom k bunkám. Bunky sa potom inkubovali 30 až 48 hodín. Geneticín sa zakúpil od firmy Life Technologies, Gaithersburg, MD. Bunkové kultúry sa nariedili 1:20, 1:50 a 1:100, 1:250, 1:500 a naniesli na 10 cm misky v 10 ml média so sérom obsahujúcim 535 pg/ml geneticínu. Za niekoľko dní bunky, ktoré neprijali plazmid POL1212^/ReNeo, sa usmrtili pôsobením geneticínu. Zvyšné bunky pokračovali v replikácii v médiu s geneticínom a vytvorili na miskách viditeľné monovrstvové kolónie.

Expresia a test POL 1212 v bunkách BHK CRL-1632

Malé plastové krúžky sa umiestnili okolo kolónií. Kolónie sa odsali oddelene použitím kompletného mé21 dia a preniesli do skúmaviek. Tieto kolónie sú označované ako „kruhovo klonované kolónie“. Tieto kruhovo klonované kolónie sa naniesli na 24 jamkové doštičky a ďalej sa pestovali v kompletnom médiu.

Test s chromogénnym substrátom na expresiu faktora VIII pomocou buniek transfekovaných CRL-1632

Vzorky POL1212 zo supernatantov bunkových kultúr sa zmiešali s 50 nM purifikovaného prasačieho faktora IXa a 0,05 mM fosfatidylcholín/fosfatidylserínových (PCPS) vezikúl v 0,15 M NaCl, 20 m HEPES, 5 mM CaCE, 0,01 % Tween 80, pH 7,4. Ako kontrola sa použilo médium z bunkových kultúr „slepo“ transfekovaných buniek. Trombín a faktor X sa pridali simultánne do výslednej koncentrácie 40 a 425 nM, v uvedenom poradí. Trombín aktivuje faktor VIII, ktorý potom spolu s PCPS slúži ako kofaktor pre faktor IXa v priebehu aktivácie faktora X.

Po 5 minútach aktivácia faktora X pomocou faktora IXa/faktora VlIIa/PCPS sa zastavila pridaním EDTA na výslednú koncentráciu 50 mM. V rovnakom čase sa aktivácia faktora VIII trombínom zastavila pridaním inhibítora trombínu, rekombinantného desulfatohirudínu, do výslednej koncentrácie 100 nM. 25 μΐ vzorka reakčnej zmesi sa preniesla do jamky mikrotitračnej doštičky, kam sa pridalo 74 μΐ Spectrozymu Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), čo je chromogénny substrát pre faktor Xa. Výsledná koncentrácia Spectrozymu Xa bola 0,6 mM. Zmena absorbancie pri 405 nm v dôsledku štiepenia Spectrozymu Xa faktorom Xa sa monitorovala súvisle počas 5 minút pomocou čítacieho zariadenia pre mikrotitračné doštičky Vmax Kinetic Plate Reader (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA). Výsledky sú vyjadrené ako hodnoty A₄₀₅/min.

Chromogénny test na Faktor VIII desiatich kruhovo-klonovaných kolónií:

Počet kolónií Pufor

A^/min. (xlO³)

0,2

2,1

8.4

6.4

10,7

12.5

7,6

51,3

139.5

3,8

8.4

Tieto výsledky ukazujú, že všetkých desať kolónií, ktoré sa vybrali, prejavuje aktivitu faktora VIII aspoň desaťkrát vyššiu, než je hodnota pozadia.

Aktivita z média kolónie 8, ktorá bola kolóniou s najvyššou expresiou, sa ďalej skúmala pomocou jednofázového koagulačného testu faktora VIII. V tomto teste sa 50 ml plazmy deficientnej na faktor VIII (George King Biomedical Overland Park, KA), 5 ml vzorky alebo štandardu a 50 ml aktivovanej partikulámej tromboplastinovej časovej reagencie (activated particulate thromboplastin tíme reagent) (Organon Teknika, Durham, NC) inkubovalo 3 minúty pri 37 °C. Vzorky obsahujú médium z kolónie 8 nariedené v 0,15 M NaCl, mM Hepes, pH 7,4 (HBS) alebo ako kontrolu, kompletné médium. Koagulácia sa iniciovala pridaním 50 ml 20 mM CaCl₂. Koagulačný čas sa meral použitím zariadenia ST4 BIO Coagulation Inštrument (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). Štandardná (kalibračná) krivka sa získala pomocou riedenia zlúčenej, citrátom ošetrenej normálnej ľudskej plazmy, šarža č. 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA). Koncentrácia štandardu faktora VIII bola 0,9 jednotky na 1 ml.

Štandardná (kalibračná) krivka:

Riedenie	U/ml	Koagulačný čas
1. neriedené	0,96	45,2
2. 1/3 (HBS)	0,32	53,7
3. 1/11 (HBS)	0,087	62,5
4. 1/21 (HBS)	0,046	68,9

Lineárna regresia funkcie koagulačného času oproti logaritmu koncentrácie štandardu poskytla korelačný koeficient 0,997.

Test látok poskytol nasledujúce koagulačnc časy, ktoré sa previedli na hodnoty jednotky/ml použitím štandardnej krivky:

SK 286205 Β6

Vzorka	Koagulačný čas (s)	U/ml
1. Kolónia 8 (24h), 1/10 v HBS	40,6	1,74x10=17,4
2. Kolónia 8 (24h), 1/10 v HBS	41,1	1,63 x 10= 16,3
3. Kolónia 8 (24h), 1/20 v HBS	47,7	0,69x20= 13,8
4. Kolónia 8 (24h), 1/20 v HBS	47,2	0,73x20= 14,6
5. Úplné médium	82,9	0,007
6. Úplné médium	83,3	0,006

Tieto výsledky ukazujú, že koagulačná aktivita kolónie 8 je približne 2000-krát vyššia než pri kontrolnej vzorke.

DNA sekvencia kódujúca POL1212 je uvedená v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 37. Kódovaná aminokyselinová sekvencia POL1212 je uvedená v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO 38. Ďalšie purifikácie POL1212 sa môžu uskutočňovať pomocou celého radu známych metód, ako je napr. imunoafinitná chromatografia a HPLC chromatografia-pozri príklady 2 a 3.

Všeobecné poznámky na záver

Treba mať na zreteli, že malé variácie aminokyselinovej sekvencie alebo DNA sekvencie, ktoré kódujú aminokyselinovú sekvenciu týkajúcu sa POL1212, sa môžu vniesť bez toho, aby sa podstatne zmenili ich základné funkcie. Napríklad dĺžka sekvencie B domény, ktorá sa ponechala ako linker medzi A2 doménou a aktivačným peptidom, sa môže zväčšiť alebo zmenšiť v rámci možností, ktoré vyplývajú zo stavu techniky. Sekvenčné varianty sa môžu vniesť do úseku linkera, pričom sa zachová ekvivalentne funkčný POL1212 a prasačí faktor VIII bez domény B, ako je ukázané v tomto texte, a ako je známe v stave techniky. Na základe porovnaní známych aminokyselinových sekvencií faktorov VIII, ktoré majú koagulačnú aktivitu v ľudskej krvi, sa môžu pripraviť na základe aminokyselinovej sekvencie POL1212 sekvenčného variantu tak substitúciami jednotlivých aminokyselín ako aj substitúciami peptidových segmentov známymi funkčnými variantmi, ktoré si zachovajú svoje základné funkcie. Uvedené varianty nie sú nijako vyčerpávajúce ani obmedzujúce, sú uvedené iba ako príklad modifikácií sekvencií, ktoré môžu byť pripravené odborníkom na základe stavu techniky, bez toho, aby sa podstatne zmenili vlastnosti proteínu. Všetky takéto varianty a modifikácie spadajú do nárokov predkladaného vynálezu alebo ich ekvivalentov.

Prehľad sekvencií uvedených v zozname sekvencií:

Sekvencia SEQ IDNO: 1

Identifikácia cDNA ľudského faktora VIII, kód pre aminokyselinu NO: 1 zrelého proteínu začína nukleotidomNO: 208

2 3 4 5 až 27 28 29 30 31 32 až 36 37 38

Aminokyselinová sekvencia ľudského faktora cDNA A2 domény prasačieho faktora VIII Aminokyselinová sekvencia A2 domény prasačieho faktora VIII Sekvencia oligonukleotidových primérov (pozri príklad 5) Aminokyselinová sekvencia myšieho faktora VIII cDNA prasačieho faktora VIII Aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII Aminokyselinová sekvencia signálneho peptidu ľudského faktora VIII Sekvencia oligonukleotidových primérov (pozri príklad 7) DNA kódujúca POL1212 Aminokyselinová sekvencia POLI212

Zoznam sekvencií <110> Emory University <120> Modifikovaný factor VIII <130> 75-951 WO <140> PCT/US01/05076 <141> 2001-02-16 <150> US 09/523,656 <151> 2000-03-10 <150> US 09/037,601 <151> 1998-03-10 <150> US 08/670,707 <151> 1996-06-26

<160>	38
<170>	Paten	itln Ver. 2.0
<210>	1
<211>	9009
<212>	DNA
<213>	Hon: o	sapiens
<220>
<221>	CD S
<222>	(208)	.. (7203)

<400> 1 cagtgggtaa gttccttaaa tgctctgcaa agaaattggg acttttcatt aaatcagaaa 60 ttttactttt ttcccctcct gggagctaaa gatattttag agaagaatta accttttgct 120 tctccagttg aacatttgta gcaataagtc atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt 180 ctgtgccttt tgcgattctg ctttagt gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca 234

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala

5

gtg Val 10

gaa Glu

ctg Leu

tca Ser

tgg gac

tat Tyr

atg Met

caa Gin

agt Ser

gat Asp 20

ctc Leu

ggt gag

ctg Leu

cct Pro 25

282

Trp

Asp 15

Gly

Glu

gtg

gac

gca

aga

ttt

cct

aga

gtg

cca

aaa

tet

ttt

cca

ttc

aac

330

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

30

35

40

acc

tca

gtc

gtg

tac

aaa

aag

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gtt

cac

378

Thr

Ser

Val

Tyr

Lys

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Val

His

45

50

55

ctt

ttc

aac

atc

get

aag

cca

agg

cca

ccc

tgg

atg

ggt

ctg

cta

ggt

426

Leu

Phe

Asn

íle

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

60

65

70

cct

acc

atc

cag

get

gag

gtt

tat

gat

aca

gtg

gtc

att

aca

ctt

aag

474

Pro

Thr

íle

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

íle

Thr

Leu

Lys

75

80

85

aac

atg

get

tcc

cat

cct

gtc

agt

ctt

cat

get

gtt

ggt

gta

tcc

tac

522

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

90

95

100

105

tgg

aaa

get

tet

gag

gga

get

gaa

tat

gat

cag

acc

agt

caa

agg

570

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

110

115

120

gag aaa gaa gat

gat Asp

aaa gtc

ttc Phe

cct ggt gga Pro Gly Gly 130

age Ser

cat His

aca Thr 135

tat Tyr

gtc Val

618

Glu

Lys

Glu

Asp 125

Lys

Val

5

tgg

cag

gtc

ctg

aaa

gag

aat

ggt

cca

atg

gcc

tet

gac

cca

ctg

tgc

666

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

140

145

150

ctt

acc

tac

tca

tat

ctt

tet

cat

gtg

gac

ctg

gta

aaa

gac

ttg

aat

714

10

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

155

160

165

tca

ggc

ctc

att

gga

gcc

cta

gta

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

gcc

762

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala

15

170

175

180

185

aag

gaa

aag

aca

cag

acc

ttg

cac

aaa

ttt

ata

cta

ctt

ttt

get

gta

810

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr

Leu

His

Lys

Phe

íle

Leu

Phe

Ala

Val

on

190

195

200

zu

ttt

gat

gaa

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gaa

aca

aag

aac

tcc

ttg

atg

858

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Leu

Met

205

210

215

25

cag

gat

agg

gat

get

gca

tet

get

cgg

gcc

tgg

cct

aaa

atg

cac

aca

906

Gin

Asp

Arg

Asp

Ala

Ser

Ala

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

220

225

230

gtc

aat

ggt

tat

gta

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

att

gga

tgc

cac

954

30

Val

Asn

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

235

240

245

agg

aaa

tca

gtc

tat

tgg

cat

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

act

cct

gaa

1002

Arg

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp

His

val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Pro

Glu

35

250

255

260

265

gtg

cac

tca

ata

ttc

ctc

gaa

ggt

cac

aca

ttt

ctt

gtg

agg

aac

cat

1050

Val

His

Ser

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

Asn

His

270

275

280

4U

cgc

cag

gcg

tcc

ttg

gaa

atc

tcg

cca

ata

act

ttc

ctt

act

get

caa

1098

Arg

Gin

Ala

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

íle

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

285

290

295

45

aca

ctc

ttg

atg

gac

ctt

gga

cag

ttt

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

1146

Thr

Leu

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

300

305

310

tcc

cac

caa

cat

gat

ggc

atg

gaa

get

tat

gtc

aaa

gta

gac

age

tgt

1194

50

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

315

320

325

cca

gag

gaa

CCC

caa

cta

ega

atg

aaa

aat

gaa

gcg

gaa

gac

1242

Pro

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

Met

Lys

Asn

Glu

Ala

Glu

Asp

55

330

335

340

345

tat

gat

ctt

act

gat

tet

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

1290

Tyr

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Arg

Phe

Asp

350

355

360

gat

gac

aac

tet

cct

tcc

ttt

atc

caa

att

ege

tca

gtt

gcc

aag

1338

Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

C

365

370

375

J

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

tac

att

get

gaa

gag

gac

tgg

1386

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

Tyr

íle

Ala

Glu

Asp

Trp

380

385

390

10

gac

tat

get

ccc

tta

gtc

ctc

gcc

ccc

gat

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

1434

Asp

Tyr

Ala

Pro

Leu

Val

Leu

Ala

Pro

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

395

400

405

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

cag

cgg

att

ggt

agg

aag

tac

aaa

1482

15

Gin

Tyr

Leu

Asn

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

410

415

420

425

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

get

1530

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

20

430

435

440

att

cag

cat

gaa

tca

gga

atc

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

1578

íle

Gin

His

Glu

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

9«

445

450

455

ZD

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

caa

gca

age

aga

cca

tat

1626

Gly

Asp

Thr

Leu

íle

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

460

465

470

30

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

act

gat

gtc

cgt

cct

ttg

tat

tca

agg

1674

Asn

íle

Tyr

Pro

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

475

480

485

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

cat

ttg

aag

gat

ttt

cca

att

ctg

cca

1722

35

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

íle

Leu

Pro

490

495

500

505

gga

gaa

ata

ttc

aaa

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

1770

Gly

Glu

íle

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

40

510

515

520

act

aaa

tca

gat

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tat

tac

tet

agt

ttc

gtt

1818

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Phe

Val

525

530

535

HO

aat

atg

gag

aga

gat

cta

get

tca

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

atc

1866

Asn

Met

Glu

Arg

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

540

545

550

50

tgc

tac

aaa

gaa

tet

gta

gat

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tca

gac

1914

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

íle

Met

Ser

Asp

555

560

565

aag

agg

aat

gtc

atc

ctg

ttt

tet

gta

ttt

gat

gag

aac

ega

age

tgg

1962

55

Lys

Arg

Asn

Val

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

570

575

580

585

tac

ctc

aca

gag

aat

ata

caa

ege

ttt

ctc

ccc

aat

cca

get

gga

gtg

2010

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

60

590

595

600

cag Gin

ctt Leu

gag Glu

gat Asp 605

cca Pro

gag Glu

ttc Phe

caa Gin

gcc Ala 610

tcc Ser

aac Asn

atc íle

atg Met

cac His 615

age Ser

atc íle

2058

5

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

ttg

cag

ttg

tca

gtt

tgt

ttg

cat

gag

2106

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

620

625

630

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

cta

age

att

gga

gca

cag

act

gac

ttc

ctt

2154

10

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

íle

Leu

Ser

íle

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

635

640

645

tct

gtc

ttc

tct

gga

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

2202

Ser

Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

15

650

655

660

665

gac

aca

ctc

acc

cta

ttc

cca

ttc

tca

gga

gaa

act

gtc

ttc

atg

tcg

2250

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

on

670

675

680

zu

atg

gaa

aac

cca

ggt

cta

tgg

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttt

2298

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

íle

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

685

690

695

25

cgg

aac

aga

ggc

atg

acc

gcc

tta

ctg

aag

gtt

tct

agt

tgt

gac

aag

2346

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Ser

Cys

Asp

Lys

700

705

710

aac

act

ggt

gat

tat

tac

gag

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tca

gca

tac

2394

30

Asn

Thr

Gly

Asp

Tyr

Glu

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

íle

Ser

Ala

Tyr

715

720

725

ttg

ctg

agt

aaa

aac

aat

gcc

att

gaa

cca

aga

age

ttc

tcc

cag

aat

2442

Leu

Ser

Lys

Asn

Ala

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

35

730

735

740

745

tca

aga

cac

cct

age

act

agg

caa

aag

caa

ttt

aat

gcc

acc

aca

att

2490

Ser

Arg

His

Pro

Ser

Thr

Arg

Gin

Lys

Gin

Phe

Asn

Ala

Thr

íle

40

750

755

760

cca

gaa

aat

gac

ata

gag

aag

act

gac

cct

tgg

ttt

gca

cac

aga

aca

2538

Pro

Glu

Asn

Asp

íle

Glu

Lys

Thr

Asp

Pro

Trp

Phe

Ala

His

Arg

Thr

765

770

775

45

cct

atg

cct

aaa

ata

caa

aat

gtc

tcc

tct

agt

gat

ttg

atg

ctc

2586

Pro

Met

Pro

Lys

íle

Gin

Asn

Val

Ser

Asp

Leu

Met

Leu

780

785

790

ttg

ega

cag

agt

cct

act

cca

cat

ggg

cta

tcc

tta

tct

gat

ctc

caa

2634

50

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Thr

Pro

His

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

Asp

Leu

Gin

795

800

805

gaa

gcc

aaa

tat

gag

act

ttt

tct

gat

cca

tca

cct

gga

gca

ata

2682

Glu

Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly

Ala

íle

55

810

815

820

825

gac

agt

aat

aac

age

ctg

tct

gaa

atg

aca

cac

ttc

agg

cca

cag

ctc

2730

Asp

Ser

Asn

Ser

Leu

Ser

Glu

Met

Thr

His

Phe

Arg

Pro

Gin

Leu

830

835

840

cat His

cac His

agt Ser

ggg Gly 845

gac Asp

atg Met

gta Val

ttt Phe

acc Thr 850

cct Pro

gag Glu

tca Ser

ggc Gly

ctc Leu 855

caa Gin

tta Leu

2778

5

aga

tta

aat

gag

aaa

ctg

ggg

aca

act

gca

aca

gag

ttg

aag

aaa

2826

Arg

Leu

Asn

Glu

Lys

Leu

Gly

Thr

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

860

865

870

ctt

gat

ttc

aaa

gtt

tct

agt

aca

tca

aat

ctg

att

tca

aca

att

2874

10

Leu

Asp

Phe

Lys

Val

Ser

Thr

Ser

Asn

Leu

íle

Ser

Thr

íle

875

880

885

cca

tca

gac

aat

ttg

gca

ggt

act

gat

aat

aca

agt

tcc

tta

gga

2922

Pro

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala

Gly

Thr

Asp

Asn

Thr

Ser

Leu

Gly

15

890

895

900

905

ccc

cca

agt

atg

cca

gtt

cat

tat

gat

agt

caa

tta

gat

acc

act

cta

2970

Pro

Ser

Met

Pro

Val

His

Tyr

Asp

Ser

Gin

Leu

Asp

Thr

Leu

on

910

915

920

ttt

ggc

aaa

aag

tca

tct

ccc

ctt

act

gag

tct

ggt

gga

cct

ctg

agc

3018

Phe

Gly

Lys

Ser

Pro

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Pro

Leu

Ser

925

930

935

25

ttg

agt

gaa

aat

gat

tca

aag

ttg

tta

gaa

tca

ggt

tta

atg

3066

Leu

Ser

Glu

Asn

Asp

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Met

940

945

950

aat

agc

caa

gaa

agt

tca

tgg

gga

aaa

aat

gta

tcg

tca

aca

gag

agt

3114

30

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Trp

Gly

Lys

Asn

Val

Ser

Thr

Glu

Ser

955

960

965

ggt

agg

tta

ttt

aaa

ggg

aaa

aga

get

cat

gga

cct

get

ttg

act

3162

Gly

Arg

Leu

Phe

Lys

Gly

Lys

Arg

Ala

His

Gly

Pro

Ala

Leu

Thr

35

970

975

980

985

aaa

gat

aat

gcc

tta

ttc

aaa

gtt

agc

atc

tct

ttg

tta

aag

aca

aac

3210

Lys

Asp

Asn

Ala

Leu

Phe

Lys

Val

Ser

íle

Ser

Leu

Lys

Thr

Asn

Afl

990

995

1000

H-U

aaa

act

tcc

aat

tca

gca

act

aat

aga

aag

act

cac

att

gat

ggc

3258

Lys

Thr

Ser

Asn

Ser

Ala

Thr

Asn

Arg

Lys

Thr

His

íle

Asp

Gly

1005

1010

1015

45

cca

tca

tta

att

gag

aat

agt

cca

tca

gtc

tgg

caa

aat

ata

tta

3306

Pro

Ser

Leu

íle

Glu

Asn

Ser

Pro

Ser

Val

Trp

Gin

Asn

íle

Leu

1020

1025

1030

gaa

agt

gac

act

gag

ttt

aaa

gtg

aca

cct

ttg

att

cat

gac

aga

3354

50

Glu

Ser

Asp

Thr

Glu

Phe

Lys

Val

Thr

Pro

Leu

íle

His

Asp

Arg

1035

1040

1045

atg

ctt

atg

gac

aaa

aat

get

aca

get

ttg

agg

cta

aat

cat

atg

tca

3402

Met

Leu

Met

Asp

Lys

Asn

Ala

Thr

Ala

Leu

Arg

Leu

Asn

His

Met

Ser

55

1050

1055

1060

1065

aat

aaa

act

tca

aaa

aac

atg

gaa

atg

gtc

caa

cag

aaa

3450

Asn

Lys

Thr

Ser

Lys

Asn

Met

Glu

Met

Val

Gin

Lys

1070

1075

1080

gag Glu

ggc Gly

ccc att Pro íle 1085

cca Pro

gat Asp

gca caa Ala Gin 1090

aat Asn

cca Pro

gat Asp

atg tcg Met Ser 1095

ttc Phe

ttt Phe

3498

5

aag

atg

cta

ttc

ttg

cca

gaa

tca

gca

agg

tgg

ata

caa

agg

act

cat

3546

Lys

Met

Leu

Phe

Leu

Pro

Glu

Ser

Ala

Arg

Trp

íle

Gin

Arg

Thr

His

1100

1105

1110

gga

aag

aac

tct

ctg

aac

tct

ggg

caa

ggc

ccc

agt

cca

aag

caa

tta

3594

10

Gly

Lys

Asn

Ser

Leu

Asn

Ser

Gly

Gin

Gly

Pro

Ser

Pro

Lys

Gin

Leu

1115

1120

1125

gta

tcc

tta

gga

cca

gaa

aaa

tct

gtg

gaa

ggt

cag

aat

ttc

ttg

tct

3642

Val

Ser

Leu

Gly

Pro

Glu

Lys

Ser

Val

Glu

Gly

Gin

Asn

Phe

Leu

Ser

15

1130

1135

1140

1145

gag

aaa

aac

aaa

gtg

gta

gga

aag

ggt

gaa

ttt

aca

aag

gac

gta

3690

Glu

Lys

Asn

Lys

Val

Gly

Lys

Gly

Glu

Phe

Thr

Lys

Asp

Val

1150

1155

1160

zu

gga

ctc

aaa

gag

atg

gtt

ttt

cca

age

aga

aac

cta

ttt

ctt

act

3738

Gly

Leu.

Lys

Glu

Met

Val

Phe

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Phe

Leu

Thr

1165

1170

1175

25

aac

ttg

gat

aat

tta

cat

gaa

aat

aca

cac

aat

caa

gaa

aaa

3786

Asn

Leu

Asp

Asn

Leu

His

Glu

Asn

Thr

His

Asn

Gin

Glu

Lys

1180

1185

1190

att

cag

gaa

ata

gaa

aag

gaa

aca

tta

atc

caa

gag

aat

gta

3834

30

íle

Gin

Glu

íle

Glu

Lys

Glu

Thr

Leu

íle

Gin

Glu

Asn

Val

1195

1200

1205

gtt

ttg

cct

cag

ata

cat

aca

gtg

act

ggc

act

aag

aat

ttc

atg

aag

3882

Val

Leu

Pro

Gin

íle

His

Thr

Val

Thr

Gly

Thr

Lys

Asn

Phe

Met

Lys

35

1210

1215

1220

1225

aac

ctt

ttc

tta

ctg

age

act

agg

caa

aat

gta

gaa

ggt

tca

tat

gag

3930

Asn

Leu

Phe

Leu

Ser

Thr

Arg

Gin

Asn

Val

Glu

Gly

Ser

Tyr

Glu

40

1230

1235

1240

ggg

gca

tat

get

cca

gta

ctt

caa

gat

ttt

agg

tca

tta

aat

gat

tca

3978

Gly

Ala

Tyr

Ala

Pro

Val

Leu

Gin

Asp

Phe

Arg

Ser

Leu

Asn

Asp

Ser

1245

1250

1255

45

aca

aat

aga

aca

aag

aaa

cac

aca

get

cat

ttc

tca

aaa

ggg

gag

4026

Thr

Asn

Arg

Thr

Lys

His

Thr

Ala

His

Phe

Ser

Lys

Gly

Glu

1260

1265

1270

gaa

aac

ttg

gaa

ggc

ttg

gga

aat

caa

acc

aag

caa

att

gta

gag

4074

50

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Leu

Gly

Asn

Gin

Thr

Lys

Gin

íle

Val

Glu

1275

1280

1285

aaa

tat

gca

tgc

acc

aca

agg

ata

tct

cct

aat

aca

age

cag

aat

4122

Lys

Tyr

Ala

Cys

Thr

Arg

íle

Ser

Pro

Asn

Thr

Ser

Gin

Asn

55

1290

1295

1300

1305

ttt

gtc

acg

caa

cgt

agt

aag

aga

get

ttg

aaa

caa

ttc

aga

ctc

cca

4170

Phe

Val

Thr

Gin

Arg

Ser

Lys

Arg

Ala

Leu

Lys

Gin

Phe

Arg

Leu

Pro

1310

1315

1320

cta Leu

gaa Glu

gaa aca Glu Thr 1325

gaa Glu

ctt Leu

gaa Glu

aaa agg Lys Arg 1330

ata íle

att íle

gtg Val

gat Asp

gac Asp 1335

acc Thr

tca Ser

4218

5

acc

cag

tgg

tcc

aaa

aac

atg

aaa

cat

ttg

acc

ccg

agc

acc

ctc

aca

4266

Thr

Gin

Trp

Ser

Lys

Asn

Met

Lys

His

Leu

Thr

Pro

Ser

Thr

Leu

Thr

1340

1345

1350

cag

ata

gac

tac

aat

gag

aag

gag

aaa

ggg

gcc

att

act

cag

tct

ccc

4314

10

Gin

íle

Asp

Tyr

Asn

Glu

Lys

Glu

Lys

Gly

Ala

íle

Thr

Gin

Ser

Pro

1355

1360

1365

tta

tca

gat

tgc

ctt

acg

agg

agt

cat

agc

atc

cct

caa

gca

aat

aga

4362

Leu

Ser

Asp

Cys

Leu

Thr

Arg

Ser

His

Ser

íle

Pro

Gin

Ala

Asn

Arg

15

1370

1375

1380

1385

tct

cca

tta

CCC

att

gca

aag

gta

tca

ttt

cca

tct

att

aga

cct

4410

Ser

Pro

Leu

Pro

íle

Ala

Lys

Val

Ser

Phe

Pro

Ser

íle

Arg

Pro

1390

1395

1400

dAJ

ata

tat

ctg

acc

agg

gtc

cta

ttc

caa

gac

aac

tct

cat

ctt

cca

4458

íle

Tyr

Leu

Thr

Arg

Val

Leu

Phe

Gin

Asp

Asn

Ser

His

Leu

Pro

1405

1410

1415

25

gca

tct

tat

aga

aag

aaa

gat

tct

ggg

gtc

caa

gaa

agc

agt

cat

4506

Ala

Ser

Tyr

Arg

Lys

Asp

Ser

Gly

Val

Gin

Glu

Ser

His

1420

1425

1430

ttc

tta

caa

gga

gcc

aaa

aat

aac

ctt

tct

tta

gcc

att

cta

acc

4554

30

Phe

Leu

Gin

Gly

Ala

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ala

íle

Leu

Thr

1435

1440

1445

ttg

gag

atg

act

ggt

gat

caa

aga

gag

gtt

ggc

tcc

ctg

ggg

aca

agt

4602

Leu

Glu

Met

Thr

Gly

Asp

Gin

Arg

Glu

Val

Gly

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser

35

1450

1455

1460

1465

gcc

aca

aat

tca

gtc

aca

tac

aag

aaa

gtt

gag

aac

act

gtt

ctc

ccg

4650

Ala

Thr

Asn

Ser

Val

Thr

Tyr

Lys

Val

Glu

Asn

Thr

Val

Leu

Pro

1470

1475

1480

4-U

aaa

cca

gac

ttg

ccc

aaa

aca

tct

ggc

aaa

gtt

gaa

ttg

ctt

cca

aaa

4698

Lys

Pro

Asp

Leu

Pro

Lys

Thr

Ser

Gly

Lys

Val

Glu

Leu

Pro

Lys

1485

1490

1495

45

gtt

cac

att

tat

cag

aag

gac

cta

ttc

cct

acg

gaa

act

agc

aat

ggg

4746

Val

His

íle

Tyr

Gin

Lys

Asp

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Thr

Ser

Asn

Gly

1500

1505

1510

tct

cct

ggc

cat

ctg

gat

ctc

gtg

gaa

ggg

agc

ctt

cag

gga

aca

4794

50

Ser

Pro

Gly

His

Leu

Asp

Leu

Val

Glu

Gly

Ser

Leu

Gin

Gly

Thr

1515

1520

1525

gag

gga

gcg

att

aag

tgg

aat

gaa

gca

aac

aga

cct

gga

aaa

gtt

ccc

4842

Glu Gly

Ala

íle

Lys

Trp

Asn

Glu

Ala

Asn

Arg

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

55

1530

1535

1540

1545

ttt

ctg

aga

gta

gca

aca

gaa

agc

tct

gca

aag

act

ccc

tcc

aag

cta

4890

Phe

Leu

Arg

Val

Ala

Thr

Glu

Ser

Ala

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

1550 1555 1560

ttg Leu

gat Asp

cct ctt Pro Leu 1565

get Ala

tgg Trp

gat Asp

aac cac Asn His 1570

tat Tyr

ggt Gly

act Thr

cag ata Gin íle 1575

cca Pro

aaa Lys

4938

5

gaa

gag

tgg

aaa

tcc

caa

gag

aag

tca

cca

gaa

aaa

aca

get

ttt

aag

4986

Glu

Trp

Lys

Ser

Gin

Glu

Lys

Ser

Pro

Glu

Lys

Thr

Ala

Phe

Lys

1580

1585

1590

aaa

aag

gat

acc

att

ttg

tcc

ctg

aac

get

tgt

gaa

agc

aat

cat

gca

5034

10

Lys

Asp

Thr

íle

Leu

Ser

Leu

Asn

Ala

Cys

Glu

Ser

Asn

His

Ala

1595

1600

1605

ata

gca

ata

aat

gag

gga

caa

aat

aag

CCC

gaa

ata

gaa

gtc

acc

5082

íle

Ala

íle

Asn

Glu

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Glu

íle

Glu

Val

Thr

15

1610

1615

1620

1625

tgg

gca

aag

caa

ggt

agg

act

gaa

agg

ctg

tgc

tet

caa

aac

cca

5130

Trp

Ala

Lys

Gin

Gly

Arg

Thr

Glu

Arg

Leu

Cys

Ser

Gin

Asn

Pro

1630

1635

1640

ZU

gtc

ttg

aaa

ege

cat

caa

cgg

gaa

ata

act

cgt

act

ctt

cag

tca

5178

Val

Leu

Lys

Arg

His

Gin

Arg

Glu

íle

Thr

Arg

Thr

Leu

Gin

Ser

1645

1650

1655

25

gat

caa

gag

gaa

att

gac

tat

gat

acc

ata

tca

gtt

gaa

atg

aag

5226

Asp

Gin

Glu

íle

Asp

Tyr

Asp

Thr

íle

Ser

Val

Glu

Met

Lys

1660

1665

1670

aag

gaa

gat

ttt

gac

att

tat

gat

gag

gat

gaa

aat

cag

agc

CCC

ege

5274

30

Lys

Glu

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr

Asp

Glu

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Pro

Arg

1675

1680

1685

agc

ttt

caa

aag

aaa

aca

ega

cac

tat

ttt

att

get

gca

gtg

gag

agg

5322

Ser

Phe

Gin

Lys

Thr

Arg

His

Tyr

Phe

íle

Ala

Val

Glu

Arg

35

1690

1695

1700

1705

ctc

tgg

gat

tat

ggg

atg

agt

agc

tcc

cca

cat

gtt

cta

aga

aac

agg

5370

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

Ser

Pro

His

Val

Leu

Arg

Asn

Arg

4.0

1710

1715

1720

get

cag

agt

ggc

agt

gtc

cct

cag

ttc

aag

aaa

gtt

ttc

cag

gaa

5418

Ala

Gin

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Gin

Phe

Lys

Val

val

Phe

Gin

Glu

1725

1730

1735

45

ttt

act

gat

ggc

tcc

ttt

act

cag

CCC

tta

tac

cgt

gga

gaa

cta

aat

5466

Phe

Thr

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin

Pro

Leu

Tyr

Arg

Gly

Glu

Leu

Asn

1740

1745

1750

gaa

cat

ttg

gga

ctc

ctg

ggg

cca

tat

ata

aga

gca

gaa

gtt

gaa

gat

5514

50

Glu

His

Leu

Gly

Leu

Gly

Pro

Tyr

íle

Arg

Ala

Glu

Val

Glu

Asp

1755

1760

1765

aat

atc

atg

gta

act

ttc

aga

aat

cag

gcc

tet

cgt

CCC

tat

tcc

ttc

5562

Asn

íle

Met

Val

Thr

Phe

Arg

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe

55

1770

1775

1780

1785

tat

tet

agc

ctt

att

tet

tat

gag

gaa

gat

cag

agg

caa

gga

gca

gaa

5610

Tyr

Ser

Leu

íle

Ser

Tyr

Glu

Asp

Gin

Arg

Gin

Gly

Ala

Glu

60

1790

1795

1800

cct Pro

aga Arg

aaa Lys

aac Asn 1805

ttt Phe

gtc Val

aag Lys

cct Pro

aat Asn 1810

gaa Glu

acc Thr

aaa Lys

act Thr

tac Tyr 1815

ttt Phe

tgg Trp

5658

5

aaa

gtg

caa

cat

atg

gca

ccc

act

aaa

gat

gag

ttt

gac

tgc

aaa

5706

Lys

Val

Gin

His

Met

Ala

Pro

Thr

Lys

Asp

Glu

Phe

Asp

Cys

Lys

1820

1825

1830

gcc

tgg

get

tat

ttc

tet

gat

gtt

gac

ctg

gaa

aaa

gat

gtg

cac

tca

5754

10

Ala

Trp

Ala

Tyr

Phe

Ser

Asp

Val

Asp

Leu

Glu

Lys

Asp

Val

His

Ser

1835

1840

1845

ggc

ctg

att

gga

ccc

ctt

ctg

gtc

tgc

cac

act

aac

aca

ctg

aac

cct

5802

Gly Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

His

Thr

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

15

1850

1855

1860

1865

get

cat

ggg

aga

caa

gtg

aca

gta

cag

gaa

ttt

get

ctg

ttt

ttc

acc

5850

Ala

His

Gly

Arg

Gin

Val

Thr

Val

Gin

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe

Thr

1870

1875

1880

zu

atc

ttt

gat

gag

acc

aaa

age

tgg

tac

ttc

act

gaa

aat

atg

gaa

aga

5898

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Arg

1885

1890

1895

25

aac

tgc

agg

get

ccc

tgc

aat

atc

cag

atg

gaa

gat

CCC

act

ttt

aaa

5946

Asn

Cys

Arg

Ala

Pro

Cys

Asn

íle

Gin

Met

Glu

Asp

Pro

Thr

Phe

Lys

1900

1905

1910

gag

aat

tat

ege

ttc

cat

gca

atc

aat

ggc

tac

ata

atg

gat

aca

cta

5994

30

Glu

Asn

Tyr

Arg

Phe

His

Ala

íle

Asn

Gly

Tyr

íle

Met

Asp

Thr

Leu

1915

1920

1925

cct

ggc

tta

gta

atg

get

cag

gat

caa

agg

att

ega

tgg

tat

ctg

ctc

6042

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

Gin

Asp

Gin

Arg

íle

Arg

Trp

Tyr

Leu

35

1930

1935

1940

1945

age

atg

ggc

age

aat

gaa

aac

atc

cat

tet

att

cat

ttc

agt

gga

cat

6090

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu

Asn

íle

His

Ser

íle

His

Phe

Ser

Gly

His

1950

1955

1960

gtg

ttc

act

gta

ega

aaa

gag

tat

aaa

atg

gca

ctg

tac

aat

6138

Val

Phe

Thr

Val

Arg

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala

Leu

Tyr

Asn

1965

1970

1975

45

ctc

tat

cca

ggt

gtt

ttt

gag

aca

gtg

gaa

atg

tta

cca

tcc

aaa

get

6186

Leu

Tyr

Pro

Gly

Val

Phe

Glu

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Pro

Ser

Lys

Ala

1980

1985

1990

gga

att

tgg

cgg

gtg

gaa

tgc

ctt

att

ggc

gag

cat

cta

cat

get

ggg

6234

50

Gly

íle

Trp

Arg

Val

Glu

Cys

Leu

íle

Gly

Glu

His

Leu

His

Ala

Gly

1995

2000

2005

atg

age

aca

ctt

ttt

ctg

gtg

tac

age

aat

aag

tgt

cag

act

ccc

ctg

6282

Met

Ser

Thr

Leu

Phe

Leu

Val

Tyr

Ser

Asn

Lys

Cys

Gin

Thr

Pro

Leu

55

2010

2015

2020

2025

gga

atg

get

tet

gga

cac

att

aga

gat

ttt

cag

att

aca

get

tca

gga

6330

Gly Met

Ala

Ser

Gly

His

íle

Arg

Asp

Phe

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

Gly

2030 2035 2040

SK 286205 Β6

caa Gin

tat Tyr

gga cag Gly Gin 2045

tgg Trp

gcc Ala

cca Pro

aag ctg Lys Leu 2050

gcc Ala

aga Arg

ctt Leu

cat tat His Tyr 2055

tcc Ser

gga Gly

6378

5

tca

atc

aat

gcc

tgg

age

acc

aag

gag

CCC

ttt

tet

tgg

atc

aag

gtg

6426

Ser

íle

Asn

Ala

Trp

Ser

Thr

Lys

Glu

Pro

Phe

Ser

Trp

íle

Lys

Val

2060

2065

2070

gat

ctg

ttg

gca

cca

atg

att

cac

ggc

atc

aag

acc

cag

ggt

gcc

6474

10

Asp

Leu

Ala

Pro

Met

íle

His

Gly

íle

Lys

Thr

Gin

Gly

Ala

2075

2080

2085

cgt

cag

aag

ttc

tcc

age

ctc

tac

atc

tet

cag

ttt

atc

atg

tat

6522

Arg

Gin

Lys

Phe

Ser

Leu

Tyr

íle

Ser

Gin

Phe

íle

Met

Tyr

15

2090

2095

2100

2105

agt

ctt

gat

ggg

aag

tgg

cag

act

tat

ega

gga

aat

tcc

act

gga

6570

Ser

Leu

Asp

Gly

Lys

Trp

Gin

Thr

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

ΊΑ

2110

2115

2120

zu

acc

tta

atg

gtc

ttc

ttt

ggc

aat

gtg

gat

tca

tet

ggg

ata

aaa

cac

6618

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Gly

Asn

Val

Asp

Ser

Gly

íle

Lys

His

2125

2130

2135

25

aat

att

ttt

aac

cct

cca

att

get

ega

tac

atc

cgt

ttg

cac

cca

6666

Asn

íle

Phe

Asn

Pro

íle

Ala

Arg

Tyr

íle

Arg

Leu

His

Pro

2140

2145

2150

act

cat

tat

age

att

cgc

age

act

ctt

cgc

atg

gag

ttg

atg

ggc

tgt

6714

30

Thr

His

Tyr

Ser

íle

Arg

Ser

Thr

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

2155

2160

2165

gat

tta

aat

agt

tgc

age

atg

cca

ttg

gga

atg

gag

agt

aaa

gca

ata

6762

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

Met

Pro

Leu

Gly

Met

Glu

Ser

Lys

Ala

íle

35

2170

2175

2180

2185

tca

gat

gca

cag

att

act

get

tca

tcc

tac

ttt

acc

aat

atg

ttt

gcc

6810

Ser

Asp

Ala

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

Tyr

Phe

Thr

Asn

Met

Phe

Ala

zlfi

2190

2195

2200

acc

tgg

tet

cct

tca

aaa

get

ega

Ctt

cac

ctc

caa

ggg

agg

agt

aat

6858

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Ser

Asn

2205

2210

2215

45

gcc

tgg

aga

cct

cag

gtg

aat

cca

aaa

gag

tgg

ctg

caa

gtg

gac

6906

Ala

Trp

Arg

Pro

Gin

Val

Asn

Pro

Lys

Glu

Trp

Leu

Gin

Val

Asp

2220

2225

2230

ttc

cag

aag

aca

atg

aaa

gtc

aca

gga

gta

act

cag

gga

gta

aaa

6954

50

Phe

Gin

Lys

Thr

Met

Lys

Val

Thr

Gly

Val

Thr

Gin

Gly

Val

Lys

2235

2240

2245

tet

ctg

ctt

acc

age

atg

tat

gtg

aag

gag

ttc

ctc

atc

tcc

age

agt

7002

Ser

Leu

Thr

Ser

Met

Tyr

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

íle

Ser

55

2250

2255

2260

2265

caa

gat

ggc

cat

cag

tgg

act

ctc

ttt

cag

aat

ggc

aaa

gta

aag

7050

Gin

Asp

Gly

His

Gin

Trp

Thr

Leu

Phe

Gin

Asn

Gly

Lys

Val

Lys

60

2270

2275

2280

gtt Val

ttt Phe

cag gga Gin Gly 2285

aat Asn

caa Gin

gac Asp

tcc ttc Ser Phe 2290

aca Thr

cct Pro

gtg Val

gtg aac Val Asn 2295

tet Ser

cta Leu

7098

gac

cca

ccg

tta

ctg

act

cgc

tac

ctt

ega

att

cac

CCC

cag

agt

tgg

7146

Asp

Pro

Leu

Thr

Arg

Tyr

Leu

Arg

íle

His

Pro

Gin

Ser

Trp

2300

2305

2310

gtg

cac

cag

att

gcc

ctg

agg

atg

gag

gtt

ctg

ggc

tgc

gag

gca

cag

7194

Val

His

Gin

íle

Ala

Leu

Arg

Met

Glu

Val

Leu

Gly Cys

Glu

Ala

Gin

2315

2320

2325

gac

ctc

tac

tgagggtggc i

cactgcagca cctgccactg ccgtcacctc

7243

Asp Leu Tyr

2330

tccctcctca	gctccagggc	agtgtccctc	cctggcttgc	cttctacctt	tgtgctaaat	7303
cctagcagac	actgccttga	agcctcctga	attaactatc	atcagtcctg	catttctttg	7363
gtggggggcc	aggagggtgc	atccaattta	acttaactct	tacctatttt	ctgcagctgc	7423
tcccagatta	ctccttcctt	ccaatataac	taggcaaaaa	gaagtgagga	gaaacctgca	7483
tgaaagcatt	cttccctgaa	aagttaggcc	tctcagagtc	accacttcct	ctgttgtaga	7543
aaaactatgt	gatgaaactt	tgaaaaagat	atttatgatg	ttaacatttc	aggttaagcc	7603
tcatacgttt	aaaataaaac	tctcagttgt	ttattatcct	gatcaagcat	ggaacaaagc	7663
atgtttcagg	atcagatcaa	tacaatcttg	gagtcaaaag	gcaaatcatt	tggacaatct	7723
gcaaaatgga	gagaatacaa	taactactac	agtaaagtct	gtttctgctt	ccttacacat	7783
agatataatt	atgttattta	gtcattatga	ggggcacatt	cttatctcca	aaactagcat	7843
tcttaaactg	agaattatag	atggggttca	agaatcccta	agtcccctga	aattatataa	7903
ggcattctgt	ataaatgcaa	atgtgcattt	ttctgacgag	tgtccataga	tataaagcca	7963
ttggtcttaa	ttctgaccaa	taaaaaaata	agtcaggagg	atgcaattgt	tgaaagcttt	8023
gaaataaaat	aacatgtctt	cttgaaattt	gtgatggcca	agaaagaaaa	tgatgatgac	8083
attaggcttc	taaaggacat	acatttaata	tttctgtgga	aatatgagga	aaatccatgg	8143
ttatctgaga	taggagatac	aaactttgta	attctaataa	tgcactcagt	ttactctctc	8203
cctctactaa	tttcctgctg	aaaataacac	aacaaaaatg	taacagggga	aattatatac	8263
cgtgactgaa	aactagagtc	ctacttacat	agttgaaata	tcaaggaggt	cagaagaaaa	8323
ttggactggt	gaaaacagaa	aaaacactcc	agtctgccat	atcaccacac	aataggatcc	8383
cccttcttgc	cctccacccc	cataagattg	tgaagggttt	actgctcctt	ccatctgcct	8443
gcaccccttc	actatgacta	cacagaactc	tcctgatagt	aaagggggct	ggaggcaagg	8503
ataagttata	gagcagttgg	aggaagcatc	caaagactgc	aacccagggc	aaatggaaaa	8563
caggagatcc	taatatgaaa	gaaaaatgga	tcccaatctg	agaaaaggca	aaagaatggc	8623

tacttttttc	tatgctggag	tattttctaa	taatcctgct	tgacccttat	ctgacctctt	8683
tggaaactat	aacatagctg	tcacagtata	gtcacaatcc	acaaatgatg	caggtgcaaa	8743
tggtttatag	ccctgtgaag	ttcttaaagt	ttagaggcta	acttacagaa	atgaataagt	8803
tgttttgttt	tatagcccgg	tagaggagtt	aaccccaaag	gtgatatggt	tttatttcct	8863
gttatgttta	acttgataat	cttattttgg	cattcttttc	ccattgacta	tatacatctc	8923
tatttctcaa	atgttcatgg	aactagctct	tttattttcc	tgctggtttc	ttcagtaatg	8983
agttaaataa	aacattgaca	cataca				9009

<210> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ala Thr 1

Arg

Tyr 5

Tyr Leu Gly Ala

Val 10

Glu

Leu Ser

Trp

Asp 15

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

20

25

30

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

Thr

Ser

Val

Tyr

Lys

35

40

45

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Val

His

Leu

Phe

Asn

íle

Ala

Lys

Pro

50

55

60

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

Gin

Ala

Glu

Val

65

70

75

80

Tyr

Asp

Thr

Val

íle

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

85

90

95

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

100

105

110

Glu

Tyr

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp

Lys

Val

115

120

125

Phe

Pro

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Asn

130

135

140

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

145

150

155

160

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Ala

Leu

165

170

175

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr

Leu

180

185

190

His

Lys

Phe

íle

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Ser

Trp

195

200

205

His

Ser 210

Glu

Thr Lys

Asn

Ser Leu 215

Met

Gin Asp

Arg 220

Asp

Ala

Ser

Ala

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg

5

225

230

235

240

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Arg

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp

His

245

250

255

10

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Pro

Glu

Val

His

Ser

íle

Phe

Leu

Glu

260

265

270

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

Asn

His

Arg

Gin

Ala

Ser

Leu

Glu

íle

i ς

275

280

285

1 ?

Ser

Pro

íle

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Leu

Met

Asp

Leu

Gly

290

295

300

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

20

305

310

315

320

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

Pro

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

325

330

335

25

Met

^Lys

Asn

Glu

Ala

Glu

Asp

Tyr

Asp

Leu

Thr

Asp

340

345

350

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Arg

Phe

Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Phe

355

360

365

30

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

370

375

380

Tyr

íle

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

Leu

Val

Leu

35

385

390

395

400

Ala

Pro

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr

Leu

Asn

Gly

Pro

405

410

415

40

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

420

425

430

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

íle

Gin

His

Glu

Ser

Gly

íle

435

440

445

45

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

íle

450

455

460

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

His

Gly

íle

50

465

470

475

480

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Lys

485

490

495

55

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

íle

Phe

Lys

Tyr

Lys

500

505

510

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

515

520

525

Leu Thr 530

Arg Tyr

Tyr

Ser

Ser 535

Phe

Val

Asn

Met Glu 540

Arg Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

5

545

550

555

560

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

íle

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

íle

Leu

Phe

565

570

575

10

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

íle

Gin

580

585

590

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

Gin

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

595

600

605

15

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

610

615

620

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

íle

Leu

20

625

630

635

640

Ser

íle

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

645

650

655

25

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

660

665

670

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

675

680

685

30

íle

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

690

695

700

Leu

Lys

Val

Ser

Cys

Asp

Lys

Asn

Thr

Gly

Asp

Tyr

Glu

35

705

710

715

720

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

íle

Ser

Ala

Tyr

Leu

Ser

Lys

Asn

Ala

725

730

735

40

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

His

Pro

Ser

Thr

Arg

740

745

750

Gin

Lys

Gin

Phe

Asn

Ala

Thr

íle

Pro

Glu

Asn

Asp

íle

Glu

Lys

755

760

765

45

Thr

Asp

Pro

Trp

Phe

Ala

His

Arg

Thr

Pro

Met

Pro

Lys

íle

Gin

Asn

770

775

780

Val

Ser

Asp

Leu

Met

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Thr

Pro

50

785

790

795

800

His

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

Asp

Leu

Gin

Glu

Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr

Phe

805

810

815

55

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly

Ala

íle

Asp

Ser

Asn

Ser

Leu

Ser

820

825

830

Glu

Met

Thr

His

Phe

Arg

Pro

Gin

Leu

His

Ser

Gly

Asp

Met

Val

835

840

845

Phe

Thr 850

Pro Glu

Ser Gly Leu 855

Gin Leu Arg Leu

Asn 860

Glu

Lys

Leu

Gly

Thr

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

Leu

Asp

Phe

Lys

Val

Ser

5

365

870

875

880

Thr

Ser

Asn

Leu

íle

Ser

Thr

íle

Pro

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala

885

890

895

10

Gly

Thr

Asp

Asn

Thr

Ser

Leu

Gly

Pro

Ser

Met

Pro

Val

His

900

905

910

Tyr

Asp

Ser

Gin

Leu

Asp

Thr

Leu

Phe

Gly

Lys

Ser

Pro

915

920

925

15

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Pro

Leu

Ser

Leu

Ser

Glu

Asn

Asp

930

935

940

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Met

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Trp

20

945

950

955

960

Gly

Lys

Asn

Val

Ser

Thr

Glu

Ser

Gly

Arg

Leu

Phe

Lys

Gly

Lys

965

970

975

25

Arg

Ala

His

Gly

Pro

Ala

Leu

Thr

Lys

Asp

Asn

Ala

Leu

Phe

Lys

980

985

990

Val

Ser

íle

Ser

Leu

Lys

Thr

Asn

Lys

Thr

Ser

Asn

Ser

Ala

995

1000

1005

30

Thr

Asn

Arg

Lys

Thr

His

íle

Asp

Gly

Pro

Ser

Leu

íle

Glu

Asn

1010

1015

1020

Ser

Pro

Ser

Val

Trp

Gin

Asn

íle

Leu

Glu

Ser

Asp

Thr

Glu

Phe

Lys

35

1025

1030

1035

1040

Lys

Val

Thr

Pro

Leu

íle

His

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Asp

Lys

Asn

Ala

1045

1050

1055

40

Thr

Ala

Leu

Arg

Leu

Asn

His

Met

Ser

Asn

Lys

Thr

Ser

Lys

1060

1065

1070

Asn

Met

Glu

Met

Val

Gin

Lys

Glu

Gly

Pro

íle

Pro

Asp

1075

1080

1085

45

Ala

Gin

Asn

Pro

Asp

Met

Ser

Phe

Lys

Met

Leu

Phe

Leu

Pro

Glu

1090

1095

1100

Ser

Ala

Arg

Trp

íle

Gin

Arg

Thr

His

Gly

Lys

Asn

Ser

Leu

Asn

Ser

50

1105

1110

1115

1120

Gly

Gin

Gly

Pro

Ser

Pro

Lys

Gin

Leu

Val

Ser

Leu

Gly

Pro

Glu

Lys

1125

1130

1135

55

Ser

Val

Glu

Gly

Gin

Asn

Phe

Leu

Ser

Glu

Lys

Asn

Lys

Val

1140

1145

1150

Gly

Lys

Gly

Glu

Phe

Thr

Lys

Asp

Val

Gly

Leu

Lys

Glu

Met

Val

Phe

1155

1160

1165

60

	Pro Ser 1170	Ser	Arg Asn Leu Phe 1175	Leu Thr	Asn Leu Asp 1180	Asn	Leu	His	Glu
	Asn Asn	Thr	His Asn Gin Glu	Lys Lys	íle Gin Glu	Glu	íle	Glu	Lys
5	1185		1190		1195				1200
	Lys Glu	Thr	Leu íle Gin Glu	Asn Val	Val Leu Pro	Gin	íle	His	Thr
			1205		1210		1215
10	Val Thr	Gly	Thr Lys Asn Phe	Met Lys	Asn Leu Phe	Leu	Leu	Ser	Thr
		1220	1225		1230
	Arg Gin	Asn	Val Glu Gly Ser	Tyr Glu	Gly Ala Tyr	Ala	Pro	Val	Leu
	1235	1240	1245
15
	Gin Asp	Phe	Arg Ser Leu Asn	Asp Ser	Thr Asn Arg	Thr	Lys	Lys	His
	1250		1255		1260
	Thr Ala	His	Phe Ser Lys Lys	Gly Glu	Glu Glu Asn	Leu	Glu	Gly	Leu
20	1265		1270		1275				1280
	Gly Asn	Gin	Thr Lys Gin íle	Val Glu	Lys Tyr Ala	Cys	Thr	Thr	Arg
			1285		1290		1295
25	íle Ser	Pro	Asn Thr Ser Gin	Gin Asn	Phe Val Thr	Gin	Arg	Ser	Lys
		1300	1305		1310
	Arg Ala	Leu	Lys Gin Phe Arg	Leu Pro	Leu Glu Glu	Thr	Glu	Leu	Glu
	1315	1320	1325
30
	Lys Arg	íle	íle Val Asp Asp	Thr Ser	Thr Gin Trp	Ser	Lys	Asn	Met
	1330		1335		1340
	Lys His	Leu	Thr Pro Ser Thr	Leu Thr	Gin íle Asp	Tyr	Asn	Glu	Lys
35	1345		1350		1355				1360
	Glu Lys	Gly	Ala íle Thr Gin	Ser Pro	Leu Ser Asp	Cys	Leu	Thr	Arg
			1365		1370		1375
40	Ser His	Ser	íle Pro Gin Ala	Asn Arg	Ser Pro Leu	Pro	íle	Ala	Lys
		1380	1385		1390
	Val Ser	Ser	Phe Pro Ser íle	Arg Pro	íle Tyr Leu	Thr	Arg	Val	Leu
		1395	1400		1405
45
	Phe Gin	Asp	Asn Ser Ser His	Leu Pro	Ala Ala Ser	Tyr	Arg	Lys	Lys
	1410		1415		1420
	Asp Ser	Gly	Val Gin Glu Ser	Ser His	Phe Leu Gin	Gly	Ala	Lys	Lys
50	1425		1430		1435				1440
	Asn Asn	Leu	Ser Leu Ala íle	Leu Thr	Leu Glu Met	Thr	Gly	Asp	Gin
			1445		1450			1455
55	Arg Glu	Val	Gly Ser Leu Gly	Thr Ser	Ala Thr Asn	Ser	Val	Thr	Tyr
		1460	1465		1470
	Lys Lys	Val	Glu Asn Thr Val	Leu Pro	Lys Pro Asp	Leu	Pro	Lys	Thr
		1475	1480	1485
60

Ser Gly 1490	Lys	Val	Glu	Leu Leu Pro 1495	Lys	Val	His íle 1500	Tyr	Gin	Lys	Asp
Leu Phe	Pro	Thr	Glu	Thr Ser Asn	Gly	Ser	Pro Gly	His	Leu	Asp	Leu
1505				1510			1515				1520
Val Glu	Gly	Ser	Leu	Leu Gin Gly	Thr	Glu	Gly Ala	íle	Lys	Trp	Asn
			1525			1530		1535
Glu Ala	Asn	Arg	Pro	Gly Lys Val	Pro	Phe	Leu Arg	Val	Ala	Thr	Glu
	1540		1545			1550
Ser Ser	Ala	Lys	Thr	Pro Ser Lys	Leu	Leu	Asp Pro	Leu	Ala	Trp	Asp
1555			1560			1565
Asn His	Tyr	Gly	Thr	Gin íle Pro	Lys	Glu	Glu Trp	Lys	Ser	Gin	Glu
1570				1575			1580
Lys Ser	Pro	Glu	Lys	Thr Ala Phe	Lys	Lys	Lys Asp	Thr	íle	Leu	Ser
1585				1590			1595				1600
Leu Asn	Ala	Cys	Glu	Ser Asn His	Ala	íle	Ala Ala	íle	Asn	Glu	Gly
		1605			1610		1615
Gin Asn	Lys	Pro	Glu	íle Glu Val	Thr	Trp	Ala Lys	Gin	Gly	Arg	Thr
	1620		1625			1630
Glu Arg	Leu	Cys	Ser	Gin Asn Pro	Pro	Val	Leu Lys	Arg	His	Gin	Arg
1635			1640			1645
Glu íle	Thr	Arg	Thr	Thr Leu Gin	Ser	Asp	Gin Glu	Glu	íle	Asp	Tyr
1650				1655			1660
Asp Asp	Thr	íle	Ser	Val Glu Met	Lys	Lys	Glu Asp	Phe	Asp	íle	Tyr
1665				1670			1675				1680
Asp Glu	Asp	Glu	Asn	Gin Ser Pro	Arg	Ser	Phe Gin	Lys	Lys	Thr	Arg
		1685			1690		1695
His Tyr	Phe	íle	Ala	Ala Val Glu	Arg	Leu	Trp Asp	Tyr	Gly	Met	Ser
	1700		1705			1710
Ser Ser	Pro	His	Val	Leu Arg Asn	Arg	Ala	Gin Ser	Gly	Ser	Val	Pro
1715			1720			1725
Gin Phe	Lys	Lys	Val	Val Phe Gin	Glu	Phe	Thr Asp	Gly	Ser	Phe	Thr
1730				1735			1740
Gin Pro	Leu	Tyr	Arg	Gly Glu Leu	Asn	Glu	His Leu	Gly	Leu	Leu	Gly
1745				1750			1755				1760
Pro Tyr	íle	Arg	Ala	Glu Val Glu	Asp	Asn	íle Met	Val	Thr	Phe	Arg
		1765			1770		1775
Asn Gin	Ala	Ser	Arg	Pro Tyr Ser	Phe	Tyr	Ser Ser	Leu	íle	Ser	Tyr
	1780		1785			1790
Glu Glu	Asp	Gin	Arg	Gin Gly Ala	Glu	Pro	Arg Lys	Asn	Phe	Val	Lys

1795 1800 1805

Pro Asn 1810	Glu Thr	Lys	Thr Tyr 1815	Phe	Trp Lys Val Gin 1820	His	His	Met	Ala
Pro Thr	Lys Asp	Glu	Phe Asp	Cys	Lys Ala Trp Ala	Tyr	Phe	Ser	Asp
1825			1830		1835				1840
Val Asp	Leu Glu	Lys	Asp Val	His	Ser Gly Leu íle	Gly	Pro	Leu	Leu
	1845			1850		1855
Val Cys	His Thr	Asn	Thr Leu	Asn	Pro Ala His Gly	Arg	Gin	Val	Thr
	1860			1865	1870
Val Gin	Glu Phe	Ala	Leu Phe	Phe	Thr íle Phe Asp	Glu	Thr	Lys	Ser
1875		1880	1885
Trp Tyr	Phe Thr	Glu	Asn Met	Glu	Arg Asn Cys Arg	Ala	Pro	Cys	Asn
1890			1895		1900
íle Gin	Met Glu	Asp	Pro Thr	Phe	Lys Glu Asn Tyr	Arg	Phe	His	Ala
1905			1910		1915				1920
íle Asn	Gly Tyr	íle	Met Asp	Thr	Leu Pro Gly Leu	Val	Met	Ala	Gin
	1925			1930		1935
Asp Gin	Arg íle	Arg	Trp Tyr	Leu	Leu Ser Met Gly	Ser	Asn	Glu	Asn
	1940			1945	1950
íle His	Ser íle	His	Phe Ser	Gly	His Val Phe Thr	Val	Arg	Lys	Lys
1955		1960	1965
Glu Glu	Tyr Lys	Met	Ala Leu	Tyr	Asn Leu Tyr Pro	Gly	Val	Phe	Glu
1970			1975		1980
Thr Val	Glu Met	Leu	Pro Ser	Lys	Ala Gly íle Trp	Arg	Val	Glu	Cys
1985			1990		1995				2000
Leu íle	Gly Glu	His	Leu His	Ala	Gly Met Ser Thr	Leu	Phe	Leu	Val
	2005			2010		2015
Tyr Ser	Asn Lys	Cys	Gin Thr	Pro	Leu Gly Met Ala	Ser	Gly	His	íle
	2020			2025	2030
Arg Asp	Phe Gin	íle	Thr Ala	Ser	Gly Gin Tyr Gly	Gin	Trp	Ala	Pro
2035		2040	2045
Lys Leu	Ala Arg	Leu	His Tyr	Ser	Gly Ser íle Asn	Ala	Trp	Ser	Thr
2050			2055		2060
Lys Glu	Pro Phe	Ser	Trp íle	Lys	Val Asp Leu Leu	Ala	Pro	Met	íle
2065			2070		2075				2080
íle His	Gly íle	Lys	Thr Gin	Gly	Ala Arg Gin Lys	Phe	Ser	Ser	Leu
	2085			2090		2095
Tyr íle	Ser Gin	Phe	íle íle	Met	Tyr Ser Leu Asp	Gly	Lys	Lys	Trp
	2100			2105	2110
Gin Thr	Tyr Arg Gly	Asn Ser	Thr	Gly Thr Leu Met	Val	Phe	Phe	Gly

2115 2120 2125

Asn Val

A sp

Ser

Gly

íle

Lys

His

Asn

íle Phe

Asn

Pro

íle

2130

2135

2140

íle Ala

Arg

Tyr

íle

Arg

Leu

His

Pro

Thr

His Tyr

Ser

íle

Arg

Ser

2145

2150

2155

2160

Thr Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

Asp

Leu Asn

Ser

Cys

Ser

Met

2165

2170

2175

Pro Leu

Gly

Met

Glu

Ser

Lys

Ala

íle

Ser

Asp Ala

Gin

íle

Thr

Ala

2180

2185

2190

Ser Ser

Tyr

Phe

Thr

Asn

Met

Phe

Ala

Thr

Trp Ser

Pro

Ser

Lys

Ala

2195

2200

2205

Arg Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Ser

Asn

Ala

Trp Arg

Pro

Gin

Val

Asn

2210

2215

2220

Asn Pro

Lys

Glu

Trp

Leu

Gin

Val

Asp

Phe

Gin Lys

Thr

Met

Lys

Val

2225

2230

2235

2240

Thr Gly

Val

Thr

Gin

Gly

Val

Lys

Ser

Leu Leu

Thr

Ser

Met

Tyr

2245

2250

2255

Val Lys

Glu

Phe

Leu

íle

Ser

Gin

Asp Gly

His

Gin

Trp

Thr

2260

2265

2270

Leu Phe

Phe

Gin

Asn

Gly

Lys

Val

Lys

Val

Phe Gin

Gly

Asn

Gin

Asp

2275

2280

2285

Ser Phe

Thr

Pro

Val

Asn

Ser

Leu

Asp

Pro Pro

Leu

Thr

Arg

2290

2295

2300

Tyr Leu

Arg

íle

His

Pro

Gin

Ser

Trp

Val

His Gin

íle

Ala

Leu

Arg

2305

2310

2315

2320

Met Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gin

Asp

Leu Tyr

2325

2330

<210> 3 <211> 1130 <212> DNA <213> Prasa <400> 3 taagcaccct aagacgtggg tgcactacat ctctgcagag gaggaggact gggactacgc60 ccccgcggtc cccagcccca gtgacagaag ttataaaagt ctctacttga acagtggtcc120 tcagcgaatt ggtaggaaat acaaaaaagc tcgattcgtc gcttacacgg atgtaacatt180 taagactcgt aaagctattc cgtatgaatc aggaatcctg ggacctttac tttatggaga240 agttggagac acacttttga ttatatttaa gaataaagcg agccgaccat ataacatcta300 ccctcatgga atcactgatg tcagcgcttt gcacccaggg agacttctaa aaggttggaa360 acatttgaaa gacatgccaa ttctgccagg agagactttc aagtataaat ggacagtgac420 tgtggaagat gggccaacca agtccgatcc tcggtgcctg acccgctact actcgagctc480

cattaatcta	gagaaagatc	tggcttcggg	actcattggc	cctctcctca	tctgctacaa	540
agaatctgta	gaccaaagag	gaaaccagat	gatgtcagac	aagagaaacg	tcatcctgtt	600
ttctgtattc	gatgagaatc	aaagctggta	cctcgcagag	aatattcagc	gcttcctccc	660
caatccggat	ggattacagc	cccaggatcc	agagttccaa	gcttctaaca	tcatgcacag	720
catcaatggc	tatgtttttg	atagcttgca	gctgtcggtt	tgtttgcacg	aggtggcata	780
ctggtacatt	ctaagtgttg	gagcacagac	ggacttcctc	tccgtcttct	tctctggcta	840
caccttcaaa	cacaaaatgg	tctatgaaga	cacactcacc	ctgttcccct	tctcaggaga	900
aacggtcttc	atgtcaatgg	aaaacccagg	tctctgggtc	ctagggtgcc	acaactcaga	960
cttgcggaac	agagggatga	cagccttact	gaaggtgtat	agttgtgaca	gggacattgg	1020
tgattattat	gacaacactt	atgaagatat	tccaggcttc	ttgctgagtg	gaaagaatgt	1080
cattgaaccc	agaagctttg	cccagaattc	aagaccccct	agtgcgagca		1130

<210> 4 <211> 368 <212> PRT <213> Prasa <400> 4

Ser Val Ala 1

Lys

Lys 5

His

Pro Lys

Thr

Trp 10

Val

His

Tyr

íle

Ser 15

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

20

25

30

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

35

40

45

Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

50

55

60

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

65

70

75

80

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

85

90

95

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

100

105

110

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Lys

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

115

120

125

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

130

135

140

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

145

150

155

160

Tyr

Ser Ser

Ser

íle 165

Asn Leu Glu Lys

Asp Leu Ala 170

Ser

Gly

Leu 175

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

180

185

190

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

195

200

205

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

210

215

220

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

245

250

255

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

260

265

270

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

275

280

285

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

290

295

300

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

305

310

315

320

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

325

330

335

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

340

345

350

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

Gly

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

355

360

365

<210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 5 ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 6 ccatcctaat acgactcact atagggc <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 7 ccattgacat gaagaccgtt tete 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213 > Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 8 actcactata gggctcgagc ggc <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 9 gggtgcaaag cgctgacatc agtg <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 10 cctctcgagc caccatgtcg agccaccatg cagctagagc tctccacctg 50 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 11 cgcgcggccg cgcatctggc aaagctgagt t <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 12 gaaataagcc caggctttgc agtcraa <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <220>

<221> rôzne znaky <222> (22) <223> N v polohe 22 je A, T, G or C.

<400> 13 aggaaattcc actggaacct tn <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223 > Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <220>

<221> rôzne znaky <222> (25) <223> N v polohe 25 je A, T, G or C.

<400> 14 ctgggggtga attcgaaggt agcgn <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primár <400> 15 gagttcatcg ggaagacctg ttg 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotidový primér <400> 16 acagcccatc aactccatgc gaag 24 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 17 tcagggcaat caggactcc <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér

<400> 18
ccgtggtgaa cgctctggac c	21

<210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 19 gtagaggtcc tgtgcctcgc agcc <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér

15	<400> 20 gtagagstsc tgkgcctcrc akccyag	27
20	<210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
	<220> <223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér
25	<400> 21 cttcgcatgg agttgatggg ctgt	24

<210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 22 aatcaggact cctccacccc g

<210> 23 <211> 20
45	<212> <213>	DNA Umelá sekvencia
	<220>
50	<223>	Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér
	<400>	23
	ggatccaccc cacgagctgg	20

55
	<210>	24
	<211>	24
	<212>	DNA
	<213>	Umelá sekvencia
60
	<220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 24 cgccctgagg ctcgaggttc tagg <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 25 aatcaggact cctccacccc cg <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér

<400> 26
ccttgcagga attcgattca	20

<210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 27 ccgtggtgaa cgctctggac c <210> 28 <211> 2319 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 28	Cys
Met 1	Gin	íle	Ala	Leu 5	Phe	Ala
Cys	Ser	Ser	Ala 20	íle	Arg	Arg	Tyr
Trp	Asn	Tyr 35	íle	Gin	Ser	Asp	Leu 40

Phe	Phe 10	Leu	Ser	Leu	Phe	Asn 15	Phe
Tyr 25	Leu	Gly	Ala	Val	Glu 30	Leu	Ser
Leu	Ser	Val	Leu	His 45	Thr	Asp	Ser

Arg

Phe 50

Leu Pro

Arg

Met

Ser 55

Thr

Ser

Phe

Pro

Phe 60

Asn

Thr

Ser

íle

Met

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Tyr

Lys

Asp

Gin

Leu

Phe

Asn

5

65

70

75

80

íle

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

85

90

95

10

Trp

Thr

Glu

Val

His

Asp

Thr

Val

íle

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

Trp

Lys

Ala

115

120

125

15

Ser

Glu

Gly

Asp

Glu

Tyr

Glu

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Met

Glu

Lys

Glu

130

135

140

Asp

Lys

Val

Phe

Pro

Gly

Glu

Ser

His

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

20

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

25

Ser

Tyr

Met

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

íle

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Lys

Glu

Gly

Ser

Leu

Ser

Lys

Glu

Arg

195

200

205

30

Thr

Gin

Met

Leu

Tyr

Gin

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Glu

Thr

Asn

Asp

Ser

Tyr

Thr

Gin

Ser

Met

35

225

230

235

240

Asp

Ser

Ala

Ser

Ala

Arg

Asp

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

40

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Arg

Lys

Ser

260

265

270

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Pro

Glu

íle

His

Ser

275

280

285

45

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Val

Arg

Asn

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

íle

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Leu

50

305

310

315

320

íle

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

His

Lys

325

330

335

55

His

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

Pro

Glu

340

345

350

Ser

Gin

Trp

Gin

Lys

Asn

Glu

Met

Glu

Asp

Tyr

Asp

355 360 365

Asp Asp Leu Tyr 370

Ser

Glu

Met Asp 375

Met

Phe

Thr

Leu 380

Asp

Tyr

Asp

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Tyr

Pro

Lys

Thr

5

385

390

395

400

Trp

íle

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

10

Ser

Val

Pro

Thr

Ser

Asp

Asn

Gly

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr

Leu

Ser

420

425

430

Asn

Gly

Pro

His

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Val

Arg

Phe

íle

435

440

445

15

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Thr

íle

Gin

His

Glu

450

455

460

Ser

Gly

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

20

465

470

475

480

Leu

íle

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

485

490

495

25

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Pro

Leu

His

Ala

Arg

Leu

Pro

Arg

500

505

510

Gly

íle

Lys

His

Val

Lys

Asp

Leu

Pro

íle

His

Pro

Gly

Glu

íle

Phe

515

520

525

30

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Phe

íle

Asn

Pro

Glu

Arg

35

545

550

555

560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

40

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

íle

Leu

Phe

Ser

íle

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

íle

Thr

Glu

595

600

605

45

Asn

Met

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

Pro

Gly

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

50

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Glu

Leu

Thr

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

55

His

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

íle

Phe

660

665

670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

Leu

Phe 690

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu Thr Val 695

Phe Met

Ser 700

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

5

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Ser

Cys

Asp

Lys

Ser

Thr

Ser

Asp

725

730

735

10

Tyr

Glu

íle

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Thr

Gin

Leu

Val

Asn

Glu

740

745

750

Asn

Val

íle

Asp

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Asn

Thr

Asn

His

Pro

755

760

765

15

Asn

Thr

Arg

Lys

Phe

Lys

Asp

Ser

Thr

íle

Pro

Lys

Asn

Asp

770

775

780

Met

Glu

Lys

íle

Glu

Pro

Gin

Phe

Glu

íle

Ala

Glu

Met

Leu

Lys

20

785

790

795

800

Val

Gin

Ser

Val

Ser

Val

Ser

Asp

Met

Leu

Met

Leu

Gly

Gin

Ser

805

810

815

25

His

Pro

Thr

Pro

His

Gly

Leu

Phe

Leu

Ser

Asp

Gly

Gin

Glu

Ala

íle

820

825

830

Tyr

Glu

Ala

íle

His

Asp

His

Ser

Pro

Asn

Ala

íle

Asp

Ser

Asn

835

840

845

30

Glu

Gly

Pro

Ser

Lys

Val

Thr

Gin

Leu

Arg

Pro

Glu

Ser

His

Ser

850

855

860

Glu

Lys

íle

Val

Phe

Thr

Pro

Gin

Pro

Gly

Leu

Gin

Leu

Arg

Ser

Asn

35

865

870

875

880

Lys

Ser

Leu

Glu

Thr

íle

Glu

Val

Lys

Trp

Lys

Leu

Gly

Leu

885

890

895

40

Gin

Val

Ser

Leu

Pro

Ser

Asn

Leu

Met

Thr

íle

Leu

Ser

900

905

910

Asp

Asn

Leu

Lys

Ala

Thr

Phe

Glu

Lys

Thr

Asp

Ser

Gly

Phe

Pro

915

920

925

45

Asp

Met

Pro

Val

His

Ser

Lys

Leu

Ser

Thr

Ala

Phe

Gly

930

935

940

Lys

Ala

Tyr

Ser

Leu

Val

Gly

Ser

His

Val

Pro

Leu

Asn

Ala

Ser

50

945

950

955

960

Glu

Asn

Ser

Asp

Ser

Asn

íle

Leu

Asp

Ser

Thr

Leu

Met

Tyr

Ser

965

970

975

55

Gin

Glu

Ser

Leu

Pro

Arg

Asp

Asn

íle

Leu

Ser

íle

Glu

Asn

Asp

Arg

980

985

990

Leu

Arg

Glu

Lys

Arg

Phe

His

Gly

íle

Ala

Leu

Thr

Lys

Asp

995 1000 1005

Asn Thr Leu 1010

Phe

Lys

Asp Asn 1015

Val

Ser Leu

Met

Lys 1020

Thr

Asn

Lys

Thr

Tyr

Asn

His

Ser

Thr

Asn

Glu

Lys

Leu

His

Thr

Glu

Ser

Pro

Thr

5

1025

1030

1035

1040

Ser

íle

Glu

Asn

Ser

Thr

Asp

Leu

Gin

Asp

Ala

íle

Leu

Lys

Val

1045

1050

1055

10

Asn

Ser

Glu

íle

Gin

Glu

Val

Thr

Ala

Leu

íle

His

Asp

Gly

Thr

Leu

1060

1065

1070

Leu

Gly

Lys

Asn

Ser

Thr

Tyr

Leu

Arg

Leu

Asn

His

Met

Leu

Asn

Arg

1075

1080

1085

15

Thr

Ser

Thr

Lys

Asn

Lys

Asp

íle

Phe

His

Arg

Lys

Asp

Glu

Asp

1090

1095

1100

Pro

íle

Pro

Gin

Asp

Glu

Asn

Thr

íle

Met

Pro

Phe

Ser

Lys

Met

20

1105

1110

1115

1120

Leu

Phe

Leu

Ser

Glu

Ser

Asn

Trp

Phe

Lys

Thr

Asn

Gly

Asn

1125

1130

1135

25

Asn

Ser

Leu

Asn

Ser

Glu

Gin

Glu

His

Ser

Pro

Lys

Gin

Leu

Val

Tyr

1140

1145

1150

Leu

Met

Phe

Lys

Tyr

Val

Lys

Asn

Gin

Ser

Phe

Leu

Ser

Glu

Lys

1155

1160

1165

30

Asn

Lys

Val

Thr

Val

Glu

Gin

Asp

Gly

Phe

Thr

Lys

Asn

íle

Gly

Leu

1170

1175

1180

Lys

Asp

Met

Ala

Phe

Pro

His

Asn

Met

Ser

íle

Phe

Leu

Thr

Leu

35

1185

1190

1195

1200

Ser

Asn

Val

His

Glu

Asn

Gly

Arg

His

Asn

Gin

Glu

Lys

Asn

íle

Gin

1205

1210

1215

40

Glu

íle

Glu

Lys

Glu

Ala

Leu

íle

Glu

Lys

Val

Leu

Pro

1220

1225

1230

Gin

Val

His

Glu

Ala

Thr

Gly

Ser

Lys

Asn

Phe

Leu

Lys

Asp

íle

Leu

1235

1240

1245

45

íle

Leu

Gly

Thr

Arg

Gin

Asn

íle

Ser

Leu

Tyr

Glu

Val

His

Val

Pro

1250

1255

1260

Val

Leu

Gin

Asn

íle

Thr

Ser

íle

Asn

Ser

Thr

Asn

Thr

Val

Gin

50

1265

1270

1275

1280

íle

His

Met

Glu

His

Phe

Lys

Arg

Lys

Asp

Lys

Glu

Thr

Asn

1285

1290

1295

55

Ser

Glu

Gly

Leu

Val

Asn

Lys

Thr

Arg

Glu

Met

Val

Lys

Asn

Tyr

Pro

1300

1305

1310

Ser

Gin

Lys

Asn

íle

Thr

Gin Arg

Ser

Lys

Arg

Ala

Leu Gly

Gin

1315 1320 1325

	Phe Arg Leu 1330	Ser	Thr Gin Trp Leu Lys 1335	Thr	íle Asn 1340	Cys	Ser	Thr	Gin
	Cys íle íle	Lys	Gin íle Asp His Ser	Lys	Glu Met	Lys	Lys	Phe	íle
5	1345		1350		1355				1360
	Thr Lys Ser	Ser	Leu Ser Asp Ser Ser	Val	íle Lys	Ser	Thr	Thr	Gin
			1365	1370				1375
10	Thr Asn Ser	Ser	Asp Ser His íle Val	Lys	Thr Ser	Ala	Phe	Pro	Pro
	1380	1385			1390
	íle Asp Leu	Lys	Arg Ser Pro Phe Gin	Asn	Lys Phe	Ser	His	Val	Gin
	1395		1400		1405
15
	Ala Ser Ser	Tyr	íle Tyr Asp Phe Lys	Thr	Lys Ser	Ser	Arg	íle	Gin
	1410		1415		1420
	Glu Ser Asn	Asn	Phe Leu Lys Glu Thr	Lys	íle Asn	Asn	Pro	Ser	Leu
20	1425		1430	1435			1440
	Ala íle Leu	Pro	Trp Asn Met Phe íle	Asp	Gin Gly	Lys	Phe	Thr	Ser
		1445	1450			1455
25	Pro Gly Lys	Ser	Asn Thr Asn Ser Val	Thr	Tyr Lys	Lys	Arg	Glu	Asn
	1460	1465			1470
	íle íle Phe	Leu	Lys Pro Thr Leu Pro	Glu	Glu Ser	Gly	Lys	íle	Glu
	1475		1480		1485
30
	Leu Leu Pro	Gin	Val Ser íle Gin Glu	Glu	Glu íle	Leu	Pro	Thr	Glu
	1490		1495		1500
	Thr Ser His	Gly	Ser Pro Gly His Leu	Asn	Leu Met	Lys	Glu	Val	Phe
35	1505		1510	1515			1520
	Leu Gin Lys	íle	Gin Gly Pro Thr Lys	Trp	Asn Lys	Ala	Lys	Arg	His
		1525	1530			1535
40	Gly Glu Ser	íle	Lys Gly Lys Thr Glu	Ser	Ser Lys	Asn	Thr	Arg	Ser
	1540	1545			1550
	Lys Leu Leu	Asn	His His Ala Trp Asp	Tyr	His Tyr	Ala	Ala	Gin	íle
	1555		1560		1565
45
	Pro Lys Asp	Met	Trp Lys Ser Lys Glu	Lys	Ser Pro	Glu	íle	íle	Ser
	1570		1575		1580
	íle Lys Gin	Glu	Asp Thr íle Leu Ser	Leu	Arg Pro	His	Gly	Asn	Ser
50	1585		1590	1595			1600
	His Ser íle	Gly	Ala Asn Glu Lys Gin	Asn	Trp Pro	Gin	Arg	Glu	Thr
		1605 1610			1615
55	Thr Trp Val	Lys	Gin Gly Gin Thr Gin	Arg	Thr Cys	Ser	Gin	íle	Pro
	1620	1625			1630
	Pro Val Leu	Lys	Arg His Gin Arg Glu	Leu	Ser Ala	Phe	Gin	Ser	Glu

1635 1640 1645

	Gin Glu Ala Thr 1650	Asp Tyr Asp 1655	Asp	Ala	íle	Thr íle Glu 1660	Thr	íle	Glu
	Asp Phe Asp íle	Tyr Ser Glu	Asp	íle	Lys	Gin Gly Pro	Arg	Ser	Phe
5	1665	1670			1675		1680
	Gin Gin Lys Thr	Arg His Tyr	Phe	íle	Ala	Ala Val Glu	Arg	Leu	Trp
	1685		1690		1695
10	Asp Tyr Gly Met	Ser Thr Ser	His	Val	Leu	Arg Asn Arg	Tyr	Gin	Ser
	1700		1705		1710
	Asp Asn Val Pro	Gin Phe Lys	Lys	Val	Val	Phe Gin Glu	Phe	Thr	Asp
	1715	1720			1725
15
	Gly Ser Phe Ser	Gin Pro Leu	Tyr	Arg	Gly	Glu Leu Asn	Glu	His	Leu
	1730	1735				1740
	Gly Leu Leu Gly	Pro Tyr íle	Arg	Ala	Glu	Val Glu Asp	Asn	íle	Met
20	1745	1750			1755		1760
	Val Thr Phe Lys	Asn Gin Ala	Ser	Arg	Pro	Tyr Ser Phe	Tyr	Ser	Ser
	1765		1770		1775
25	Leu íle Ser Tyr	Lys Glu Asp	Gin	Arg	Gly	Glu Glu Pro	Arg	Arg	Asn
	1730		1785		1790
	Phe Val Lys Pro	Asn Glu Thr	Lys	íle	Tyr	Phe Trp Lys	Val	Gin	His
	1795	1800			1805
30
	His Met Ala Pro	Thr Glu Asp	Glu	Phe	Asp	Cys Lys Ala	Trp	Ala	Tyr
	1810	1815				1820
	Phe Ser Asp Val	Asp Leu Glu	Arg	Asp	Met	His Ser Gly	Leu	íle	Gly
35	1825	1830			1835		1840
	Pro Leu Leu íle	Cys His Ala	Asn	Thr	Leu	Asn Pro Ala	His	Gly	Arg
	1845		1850		1855
40	Gin Val Ser Val	Gin Glu Phe	Ala	Leu	Leu	Phe Thr íle	Phe	Asp	Glu
	1860		1865		1870
	Thr Lys Ser Trp	Tyr Phe Thr	Glu	Asn	Val	Lys Arg Asn	Cys	Lys	Thr
	1875	1880			1885
45
	Pro Cys Asn Phe	Gin Met Glu	Asp	Pro	Thr	Leu Lys Glu	Asn	Tyr	Arg
	1890	1895				1900
	Phe His Ala íle	Asn Gly Tyr	Val	Met	Asp	Thr Leu Pro	Gly	Leu	Val
50	1905	1910			1915		1920
	Met Ala Gin Asp	Gin Arg íle	Arg	Trp	Tyr	Leu Leu Ser	Met	Gly	Asn
	1925		1930		1935
55	Asn Glu Asn íle	Gin Ser íle	His	Phe	Ser	Gly His Val	Phe	Thr	Val
	1940		1945		1950
	Arg Lys Lys Glu	Glu Tyr Lys	Met	Ala	Val	Tyr Asn Leu	Tyr	Pro	Gly

1955 1960 1965

Val

Phe 1970

Glu Thr

Leu

Glu Met 1975

íle

Pro

Ser Arg Ala 1980

Gly

íle

Trp

Arg

Val

Glu

Cys

Leu

íle

Gly

Glu

His

Leu

Gin

Ala

Gly

Met

Ser

Thr

Leu

5

19B5

1990

1995

2000

Phe

Leu

Val

Tyr

Ser

Lys

Gin

Cys

Gin

íle

Pro

Leu

Gly

Met

Ala

Ser

2005

2010

2015

10

Gly

Ser

íle

Arg

Asp

Phe

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

Gly

His

Tyr

Gly

Gin

2020

2025

2030

Trp

Ala

Pro

Asn

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

íle

Asn

Ala

2035

2040

2045

15

Trp

Ser

Thr

Lys

Glu

Pro

Phe

Ser

Trp

íle

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

2050

2055

2060

Pro

Met

íle

Val

His

Gly

íle

Lys

Thr

Gin

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Phe

20

2065

2070

2075

2080

Ser

Leu

Tyr

íle

Ser

Gin

Phe

íle

Met

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly

2085

2090

2095

25

Lys

Trp

Leu

Ser

Tyr

Gin

Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

2100

2105

2110

Phe

Gly

Asn

Val

Asp

Ser

Gly

íle

Lys

His

Asn

Ser

Phe

Asn

2115

2120

2125

30

Pro

íle

Ala

Arg

Tyr

íle

Arg

Leu

His

Pro

Thr

His

Ser

2130

2135

2140

íle

Arg

Ser

Thr

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

35

2145

2150

2155

2160

Cys

Ser

íle

Pro

Leu

Gly

Met

Glu

Ser

Lys

Val

íle

Ser

Asp

Thr

Gin

2165

2170

2175

40

íle

Thr

Ala

Ser

Tyr

Phe

Thr

Asn

Met

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

2180

2185

2190

Ser

Gin

Ala

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

2195

2200

2205

45

Gin

Val

Asn

Asp

Pro

Lys

Gin

Trp

Leu

Gin

Val

Asp

Leu

Gin

Lys

Thr

2210

2215

2220

Met

Lys

Val

Thr

Gly

íle

Thr

Gin

Gly

Val

Lys

Ser

Leu

Phe

Thr

50

2225

2230

2235

2240

Ser

Met

Phe

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

íle

Ser

Gin

Asp

Gly

His

2245

2250

2255

55

His

Trp

Thr

Gin

íle

Leu

Tyr

Asn

Gly

Lys

Val

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

2260

2265

2270

Asn

Gin

Asp

Ser

Thr

Pro

Met

Asn

Ser

Leu

Asp

Pro

Leu

2275 2280 2285

Leu Thr Arg 2290

Tyr

Leu Arg

íle His 2295

Pro

Gin

íle

Trp 2300

Glu His

Gin íle

Ala Leu

Arg

Leu

Glu íle

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gin

Tyr

2305

2310

2315

<210> 29 <211> 6402 <212> DNA <213> Prasa <220>

<221> CDS <222> (1) .. (6399) <400> 29

atg Met 1

cag Gin

cta gag Leu Glu

ctc Leu 5

tcc Ser

acc Thr

tgt Cys

gtc Val

ttt Phe 10

ctg Leu

tgt Cys

ctc Leu

ttg Leu

cca Pro 15

ctc Leu

48

ggc

ttt

agt

gcc

atc

agg

aga

tac

ctg

ggc

gca

gtg

gaa

ctg

tcc

96

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

tgg

gac

tac

cgg

caa

agt

gaa

ctc

cgt

gag

ctg

cac

gtg

gac

acc

144

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

aga

ttt

cct

get

aca

gcg

cca

gga

get

ctt

ccg

ttg

ggc

ccg

tca

gtc

192

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

ctg

tac

aaa

aag

act

gtg

ttc

gta

gag

ttc

acg

gat

caa

ctt

ttc

agc

240

Leu

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

gtt

gcc

agg

ccc

agg

cca

tgg

atg

ggt

ctg

ggt

cct

acc

atc

288

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

85

90

95

cag

get

gag

gtt

tac

gac

acg

gtg

gtc

gtt

acc

ctg

aag

aac

atg

get

336

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

tct

cat

ccc

gtt

agt

ctt

cac

get

gtc

ggc

gtc

tcc

ttc

tgg

aaa

tct

384

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

tcc

gaa

ggc

get

gaa

tat

gag

gat

cac

acc

agc

caa

agg

gag

aag

gaa

432

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

gac

gat

aaa

gtc

ctt

ccc

ggt

aaa

agc

caa

acc

tac

gtc

tgg

cag

gtc

480

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

ctg

aaa

gaa

aat

ggt

cca

aca

gcc

tct

gac

cca

tgt

ctc

acc

tac

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

tca Ser

tac Tyr

ctg Leu

tet Ser 180

cac His

gtg gac

ctg Leu

gtg Val 185

aaa gac

ctg Leu

aat Asn

tcg ggc

ctc Leu

576

Val

Asp

Lys

Asp

Ser 190

Gly

5

att

gga

gcc

ctg

gtt

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

acc

aga

gaa

agg

624

íle

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

acc

cag

aac

ctg

cac

gaa

ttt

gta

cta

ctt

ttt

get

gtc

ttt

gat

gaa

672

10

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gca

aga

aat

gac

tcc

tgg

aca

cgg

gcc

atg

720

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

15

225

230

235

240

gat

ccc

gca

cct

gcc

agg

gcc

cag

cct

gca

atg

cac

aca

gtc

aat

ggc

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

τη

245

250

255

óU

tat

gtc

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

atc

gga

tgt

cat

aag

aaa

tca

816

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Lys

Ser

260

265

270

25

gtc

tac

tgg

cac

gtg

att

gga

atg

gg^c

acc

age

ccg

gaa

gtg

cac

tcc

864

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

att

ttt

ctt

gaa

ggc

cac

acg

ttt

ctc

gtg

agg

cac

cat

ege

cag

get

912

30

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

tcc

ttg

gag

atc

tcg

cca

cta

act

ttc

ctc

act

get

cag

aca

ttc

ctg

960

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

35

305

310

315

320

atg

gac

ctt

ggc

cag

ttc

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

tcc

cac

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

His

4Π

325

330

335

Η·υ

cat

ggt

ggc

atg

gag

get

cac

gtc

aga

gta

gaa

age

tgc

gcc

gag

1056

His

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

340

345

350

45

ccc

cag

ctg

cgg

agg

aaa

get

gat

gaa

gag

gaa

gat

tat

gat

gac

aat

1104

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asn

355

360

365

ttg

tac

gac

tcg

gac

atg

gac

gtg

gtc

cgg

ctc

gat

ggt

gac

gtg

1152

50

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

370

375

380

tet

ccc

ttt

atc

caa

atc

ege

tcg

gtt

gcc

aag

cat

ccc

aaa

acc

1200

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

55

385

390

395

400

tgg

gtg

cac

tac

atc

tet

gca

gag

gac

tgg

gac

tac

gcc

ccc

1248

Trp

Val

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405 410 415

gcg Ala

gtc Val

ccc Pro

age Ser 420

ccc Pro

agt Ser

gac Asp

aga Arg

agt Ser 425

tat Tyr

aaa Lys

agt Ser

ctc Leu

tac Tyr 430

ttg Leu

aac Asn

1296

5

agt

ggt

cct

cag

ega

att

ggt

agg

aaa

tac

aaa

get

ega

ttc

gtc

1344

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

get

tac

acg

gat

gta

aca

ttt

aag

act

cgt

aaa

get

att

ccg

tat

gaa

1392

10

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

tca

gga

atc

ctg

gga

cct

tta

ctt

tat

gga

gaa

gtt

gga

gac

aca

ctt

1440

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

15

465

470

475

480

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

aaa

gcg

age

ega

cca

tat

aac

atc

tac

cct

1488

Leu

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

485

490

495

ZU

cat

gga

atc

act

gat

gtc

age

get

ttg

cac

cca

ggg

aga

ctt

cta

aaa

1536

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Lys

500

505

510

25

ggt

tgg

aaa

cat

ttg

aaa

gac

atg

cca

att

ctg

cca

gga

gag

act

ttc

1584

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

aag

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gtg

gaa

gat

ggg

cca

acc

aag

tcc

gat

1632

30

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tac

tcg

age

tcc

att

aat

cta

gag

aaa

1680

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

35

545

550

555

560

gat

ctg

get

tcg

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

atc

tgc

tac

aaa

gaa

1728

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

40

565

570

575

tet

gta

gac

caa

aga

gga

aac

cag

atg

tca

gac

aag

aga

aac

gtc

1776

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

45

atc

ctg

ttt

tet

gta

ttc

gat

gag

aat

caa

age

tgg

tac

ctc

gca

gag

1824

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

aat

att

cag

ege

ttc

ctc

ccc

aat

ccg

gat

gga

tta

cag

ccc

cag

gat

1872

50

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

cca

gag

ttc

caa

get

tet

aac

atc

atg

cac

age

atc

aat

ggc

tat

gtt

1920

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

55

625

630

635

640

ttt

gat

age

ttg

cag

ctg

tcg

gtt

tgt

ttg

cac

gag

gtg

gca

tac

tgg

1968

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645 650 655

tac Tyr

att íle

cta Leu

agt Ser 660

gtt Val

gga Gly

gca Ala

cag Gin

acg Thr 665

gac Asp

ttc Phe

ctc Leu

tcc Ser

gtc Val 670

ttc Phe

2016

5

tct

ggc

tac

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

gac

aca

ctc

acc

2064

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

ctg

ttc

ccc

ttc

tca

gga

gaa

acg

gtc

ttc

atg

tca

atg

gaa

aac

cca

2112

10

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

ggt

ctc

tgg

gtc

cta

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttg

cgg

aac

aga

ggg

2160

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

15

705

710

715

720

atg

aca

gcc

tta

ctg

aag

gtg

tat

agt

tgt

gac

agg

gac

att

ggt

gat

2208

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

725

730

735

ZU

tat

gac

aac

act

tat

gaa

gat

att

cca

ggc

ttc

ttg

ctg

agt

gga

2256

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

Gly

740

745

750

25

aag

aat

gtc

att

gaa

ccc

aga

age

ttt

gcc

cag

aat

tca

aga

ccc

cct

2304

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

755

760

765

agt

gcg

age

caa

aag

caa

ttc

caa

acc

atc

aca

agt

cca

gaa

gat

gac

2352

30

Ser

Ala

Ser

Gin

Lys

Gin

Phe

Gin

Thr

íle

Thr

Ser

Pro

Glu

Asp

770

775

780

gtg

gag

ctt

gac

ccg

cag

tct

gga

gag

aga

acc

caa

gca

ctg

gaa

2400

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Glu

Arg

Thr

Gin

Ala

Leu

Glu

35

785

790

795

800

cta

agt

gtc

ccc

tct

ggt

gat

ggg

tcg

atg

ctc

ttg

gga

cag

aat

cct

2448

Leu

Ser

Val

Pro

Ser

Gly

Asp

Gly

Ser

Met

Leu

Gly

Gin

Asn

Pro

805

810

815

get

cca

cat

ggc

tca

tcc

tca

tct

gat

ctt

caa

gaa

gcc

agg

aat

gag

2496

Ala

Pro

His

Gly

Ser

Asp

Leu

Gin

Glu

Ala

Arg

Asn

Glu

820

825

830

45

get

gat

tat

tta

cct

gga

gca

aga

gaa

aga

ggc

acg

gcc

cca

tcc

2544

Ala

Asp

Tyr

Leu

Pro

Gly

Ala

Arg

Glu

Arg

Gly

Thr

Ala

Pro

Ser

835

840

845

gca

gcg

gca

cgt

ctc

aga

cca

gag

ctg

cat

cac

agt

gcc

gaa

aga

gta

2592

50

Ala

Arg

Leu

Arg

Pro

Glu

Leu

His

Ser

Ala

Glu

Arg

Val

850

855

860

ctt

act

cct

gag

cca

gag

aaa

gag

ttg

aag

aaa

ctt

gat

tca

aaa

atg

2640

Leu

Thr

Pro

Glu

Pro

Glu

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Asp

Ser

Lys

Met

55

865

870

875

880

tct

agt

tca

gac

ctt

cta

aag

act

tcg

cca

aca

att

cca

tca

gac

2688

Ser

Asp

Leu

Lys

Thr

Ser

Pro

Thr

íle

Pro

Ser

Asp

885 890 895

acg Thr

ttg Leu

tca Ser

gcg Ala 900

gag Glu

act Thr

gaa Glu

agg Arg

aca cat Thr His 905

tcc Ser

tta Leu

ggc Gly

ccc Pro 910

cca Pro

cac His

2736

5

ccg

cag

gtt

aat

ttc

agg

agt

caa

tta ggt

gcc

att

gta

ctt

ggc

aaa

2784

Pro

Gin

Val

Asn

Phe

Arg

Ser

Gin

Leu Gly

Ala

íle

Val

Leu

Gly

Lys

915

920

925

aat

tca

tet

cac

ttt

att

ggg

get

ggt gtc

cct

ttg

ggc

tcg

act

gag

2832

10

Asn

Ser

His

Phe

íle

Gly

Ala

Gly Val

Pro

Leu

Gly

Ser

Thr

Glu

930

935

940

gag

gat

cat

gaa

age

tcc

ctg

gga

gaa aat

gta

tca

cca

gtg

gag

agt

2880

Glu

Asp

His

Glu

Ser

Leu

Gly

Glu Asn

Val

Ser

Pro

Val

Glu

Ser

15

945

950

955

960

gac

ggg

ata

ttt

gaa

aag

gaa

aga

get cat

gga

cct

get

tca

ctg

acc

2928

Asp

Gly

íle

Phe

Glu

Lys

Glu

Arg

Ala His

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Thr

ΊΑ

965

970

975

aaa

gac

gat

gtt

tta

ttt

aaa

gtt

aat atc

tet

ttg

gta

aag

aca

aac

2976

Lys

Asp

Val

Leu

Phe

Lys

Val

Asn íle

Ser

Leu

Val

Lys

Thr

Asn

9Θ0

985

990

25

aag

gca

ega

gtt

tac

tta

aaa

act

aat aga

aag

att

cac

att

gat

gac

3024

Lys

Ala

Arg

Val

Tyr

Leu

Lys

Thr

Asn Arg

Lys

íle

His

íle

Asp

995

1000

1005

gca

get

tta

act

gag

aat

agg

gca tet

gca

acg

ttt

atg

gac

aaa

3072

30

Ala

Leu

Thr

Glu

Asn

Arg

Ala Ser

Ala

Thr

Phe

Met

Asp

Lys

1010

1015

1020

aat

act

aca

get

tcg

gga

tta

aat

cat gtg

tca

aat

tgg

ata

aaa

ggg

3120

Asn

Thr

Ala

Ser

Gly

Leu

Asn

His Val

Ser

Asn

Trp

íle

Lys

Gly

35

1025

1030

1035

1040

ccc

ctt

ggc

aag

aac

ccc

cta

age

tcg gag

ega

ggc

ccc

agt

cca

gag

3168

Pro

Leu

Gly

Lys

Asn

Pro

Leu

Ser

Ser Glu

Arg

Gly

Pro

Ser

Pro

Glu

1045

1050

1055

Hv

ctt

ctg

aca

tet

tca

gga

tca

gga

aaa tet

gtg

aaa

ggt

cag

agt

tet

3216

Leu

Thr

Ser

Gly

Ser

Gly

Lys Ser

Val

Lys

Gly

Gin

Ser

1060

1065

1070

45

ggg

cag

ggg

aga

ata

cgg

gtg

gca

gtg gaa

gag

gaa

ctg

age

aaa

3264

Gly

Gin

Gly

Arg

íle

Arg

Val

Ala

Val Glu

Glu

Leu

Ser

Lys

1075

1080

1085

ggc

aaa

gag

atg

ctt

ccc

aac

age gag

ctc

acc

ttt

ctc

act

aac

3312

50

Gly

Lys

Glu

Met

Leu

Pro

Asn

Ser Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Asn

1090

1095

1100

tcg

get

gat

gtc

caa

gga

aac

gat

aca cac

agt

caa

gga

aaa

aag

tet

3360

Ser

Ala

Asp

Val

Gin

Gly

Asn

Asp

Thr His

Ser

Gin

Gly

Lys

Ser

55

1105

1110

1115

1120

cgg

gaa

gag

atg

gaa

agg

aga

gaa

aaa tta

gtc

caa

gaa

aaa

gtc

gac

3408

Arg

Glu

Met

Glu

Arg

Glu

Lys Leu

Val

Gin

Glu

Lys

Val

Asp

1125 1130 1135

ttg Leu

cct Pro

cag gtg Gin Val 1140

tat Tyr

aca Thr

gcg Ala

act Thr

gga Gly 1145

act Thr

aag Lys

aat Asn

ttc Phe

ctg Leu 1150

aga Arg

aac Asn

3456

5

att

ttt

cac

caa

agc

act

gag

CCC

agt

gta

gaa

ggg

ttt

gat

ggg

3504

íle

Phe

His

Gin

Ser

Thr

Glu

Pro

Ser

Val

Glu

Gly

Phe

Asp

Gly

1155

1160

1165

tca

cat

gcg

ccg

gtg

cct

caa

gac

agc

agg

tca

tta

aat

gat

teg

gca

3552

10

Ser

His

Ala

Pro

Val

Pro

Gin

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Asn

Asp

Ser

Ala

1170

1175

1180

gag

aga

gca

gag

act

cac

ata

gcc

cat

ttc

tca

gca

att

agg

gaa

gag

3600

Glu

Arg

Ala

Glu

Thr

His

íle

Ala

His

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Glu

15

1185

1190

1195

1200

gca

CCC

ttg

gaa

gcc

ccg

gga

aat

ega

aca

ggt

cca

ggt

ccg

agg

agt

3648

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Pro

Gly

Asn

Arg

Thr

Gly

Pro

Gly

Pro

Arg

Ser

20

1205

1210

1215

gcg

gtt

CCC

ege

gtt

aag

cag

agc

ttg

aaa

cag

atc

aga

ctc

ccg

3696

Ala

Val

Pro

Arg

Val

Lys

Gin

Ser

Leu

Lys

Gin

íle

Arg

Leu

Pro

1220

1225

1230

25

cta

gaa

ata

aag

cct

gaa

agg

ggg

gtg

gtt

ctg

aat

gcc

acc

tca

3744

Leu

Glu

íle

Lys

Pro

Glu

Arg

Gly

Val

Leu

Asn

Ala

Thr

Ser

1235

1240

1245

acc

cgg

tgg

tct

gaa

agc

agt

cct

atc

tta

caa

gga

gcc

aaa

aga

aat

3792

30

Thr

Arg

Trp

Ser

Glu

Ser

Pro

íle

Leu

Gin

Gly

Ala

Lys

Arg

Asn

1250

1255

1260

aac

ctt

tct

tta

cct

ttc

ctg

acc

ttg

gaa

atg

gcc

gga

ggt

caa

gga

3840

Asn

Leu

Ser

Leu

Pro

Phe

Leu

Thr

Leu

Glu

Met

Ala

Gly

Gin

Gly

35

1265

1270

1275

1280

aag

atc

agc

gcc

ctg

ggg

aaa

agt

gcc

gca

ggc

ccg

ctg

gcg

tcc

ggg

3888

Lys

íle

Ser

Ala

Leu

Gly

Lys

Ser

Ala

Gly

Pro

Leu

Ala

Ser

Gly

40

1285

1290

1295

aag

ctg

gag

aag

get

gtt

ctc

tct

tca

gca

ggc

ttg

tct

gaa

gca

tct

3936

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Val

Leu

Ser

Ala

Gly

Leu

Ser

Glu

Ala

Ser

1300

1305

1310

45

ggc

aaa

get

gag

ttt

ctt

cct

aaa

gtt

ega

gtt

cat

cgg

gaa

gac

ctg

3984

Gly

Lys

Ala

Glu

Phe

Leu

Pro

Lys

Val

Arg

Val

His

Arg

Glu

Asp

Leu

1315

1320

1325

ttg

cct

caa

aaa

acc

agc

aat

gtt

tct

tgc

gca

cac

ggg

gat

ctc

ggc

4032

50

Leu

Pro

Gin

Lys

Thr

Ser

Asn

Val

Ser

Cys

Ala

His

Gly

Asp

Leu

Gly

1330

1335

1340

cag

gag

atc

ttc

ctg

cag

aaa

aca

cgg

gga

cct

gtt

aac

ctg

aac

aaa

4080

Gin

Glu

íle

Phe

Leu

Gin

Lys

Thr

Arg

Gly

Pro

Val

Asn

Leu

Asn

Lys

55

1345

1350

1355

1360

gta

aat

aga

cct

gga

agg

act

CCC

tcc

aag

ctt

ctg

ggt

CCC

ccg

atg

4128

Val

Asn

Arg

Pro

Gly Arg

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

Gly

Pro

Met

1365 1370 1375

ccc Pro

aaa Lys

gag tgg Glu Trp 1380

gaa Glu

tcc Ser

cta Leu

gag aag Glu Lys 1385

tca Ser

cca Pro

aaa Lys

agc aca Ser Thr 1390

get Ala

ctc Leu

4176

5

agg

acg

aaa

gac

atc

agt

tta

ccc

ctg

gac

cgt

cac

gaa

agc

aat

4224

Arg

Thr

Lys

Asp

íle

Ser

Leu

Pro

Leu

Asp

Arg

His

Glu

Ser

Asn

1395

1400

1405

cat

tca

ata

gca

aaa

aat

gaa

gga

caa

gcc

gag

acc

caa

aga

gaa

4272

10

His

Ser

íle

Ala

Lys

Asn

Glu

Gly

Gin

Ala

Glu

Thr

Gin

Arg

Glu

1410

1415

1420

gcc

tgg

acg

aag

cag

gga

ggg

cct

gga

agg

ctg

tgc

get

cca

aag

4320

Ala

Trp

Thr

Lys

Gin

Gly

Pro

Gly

Arg

Leu

Cys

Ala

Pro

Lys

15

1425

1430

1435

1440

cct

ccg

gtc

ctg

ega

cgg

cat

cag

agg

gac

ata

agc

ctt

cct

act

ttt

4368

Pro

Val

Leu

Arg

His

Gin

Arg

Asp

íle

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe

ΙΑ

1445

1450

1455

ZU

cag

ccg

gag

gaa

gac

aaa

atg

gac

tat

gat

atc

ttc

tca

act

gaa

4416

Gin

Pro

Glu

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp

íle

Phe

Ser

Thr

Glu

1460

1465

1470

25

acg

aag

gga

gaa

gat

ttt

gac

att

tac

ggt

gag

gat

gaa

aat

cag

gac

4464

Thr

Lys

Gly

Glu

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr

Gly

Glu

Asp

Glu

Asn

Gin

Asp

1475

1480

1485

cct

cgc

agc

ttt

cag

aag

aga

acc

ega

cac

tat

ttc

att

get

gcg

gtg

4512

30

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr

Arg

His

Tyr

Phe

íle

Ala

Val

1490

1495

1500

gag

cag

ctc

tgg

gat

tac

ggg

atg

agc

gaa

tcc

ccc

cgg

gcg

cta

aga

4560

Glu

Gin

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

Ser

Glu

Ser

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg

35

1505

1510

1515

1520

aac

agg

get

cag

aac

gga

gag

gtg

cct

cgg

ttc

aag

gtg

gtc

ttc

4608

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn

Gly

Glu

Val

Pro

Arg

Phe

Lys

Val

Phe

1525

1530

1535

‘τυ

cgg

gaa

ttt

get

gac

ggc

tcc

ttc

acg

cag

ccg

tcg

tac

cgc

ggg

gaa

4656

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin

Pro

Ser

Tyr

Arg

Gly

Glu

1540

1545

1550

45

ctc

aac

aaa

cac

ttg

ggg

ctc

ttg

gga

ccc

tac

atc

aga

gcg

gaa

gtt

4704

Leu

Asn

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Gly

Pro

Tyr

íle

Arg

Ala

Glu

Val

1555

1560

1565

gaa

gac

aac

atc

atg

gta

act

ttc

aaa

aac

cag

gcg

tet

cgt

ccc

tat

4752

50

Glu

Asp

Asn

íle

Met

Val

Thr

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

1570

1575

1580

tcc

ttc

tac

tcg

agc

ctt

att

tet

tat

ccg

gat

cag

gag

caa

ggg

4800

Ser

Phe

Tyr

Ser

Leu

íle

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gin

Glu

Gin

Gly

55

1585

1590

1595

1600

gca

gaa

cct

ega

cac

aac

ttc

gtc

cag

cca

aat

gaa

acc

aga

act

tac

4848

Ala

Glu

Pro

Arg

His

Asn

Phe

Val

Gin

Pro

Asn

Glu

Thr

Arg

Thr

Tyr

60

1605

1610

1615

ttt Phe

tgg Trp

aaa gtg Lys Val 1620

cag Gin

cat His

cac His

atg gca Met Ala 1625

CCC Pro

aca gaa

gac gag Asp Glu 1630

ttt Phe

gac Asp

4896

Thr

Glu

5

tgc

aaa

gcc

tgg

gcc

tac

ttt

tet

gat

gtt

gac

ctg

gaa

aaa

gat

gtg

4944

Cys

Lys

Ala

Trp

Ala

Tyr

Phe

Ser

Asp

Val

Asp

Leu

Glu

Lys

Asp

Val

1635

1640

1645

cac

tca

ggc

ttg

atc

ggc

CCC

ctt

ctg

atc

tgc

cgc

gcc

aac

acc

ctg

4992

10

His

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Arg

Ala

Asn

Thr

Leu

1650

1655

1660

aac

get

cac

ggt

aga

caa

gtg

acc

gtg

caa

gaa

ttt

get

ctg

ttt

5040

Asn

Ala

His

Gly

Arg

Gin

Val

Thr

Val

Gin

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe

15

1665

1670

1675

1680

ttc

act

att

ttt

gat

gag

aca

aag

age

tgg

tac

ttc

act

gaa

aat

gtg

5088

Phe

Thr

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Val

1685

1690

1695

ZrV

gaa

agg

aac

tgc

cgg

gcc

CCC

tgc

cac

ctg

cag

atg

gag

gac

CCC

act

5136

Glu

Arg

Asn

Cys

Arg

Ala

Pro

Cys

His

Leu

Gin

Met

Glu

Asp

Pro

Thr

1700

1705

1710

25

ctg

aaa

gaa

aac

tat

cgc

ttc

cat

gca

atc

aat

ggc

tat

gtg

atg

gat

5184

Leu

Lys

Glu

Asn

Tyr

Arg

Phe

His

Ala

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

Met

Asp

1715

1720

1725

aca

ctc

cct

ggc

tta

gta

atg

get

cag

aat

caa

agg

atc

ega

tgg

tat

5232

30

Thr

Leu

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

Gin

Asn

Gin

Arg

íle

Arg

Trp

Tyr

1730

1735

1740

ctg

ctc

age

atg

ggc

age

aat

gaa

aat

atc

cat

tcg

att

cat

ttt

age

5280

Leu

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu

Asn

íle

His

Ser

íle

His

Phe

Ser

35

1745

1750

1755

1760

gga

cac

gtg

ttc

agt

gta

cgg

aaa

aag

gag

tat

aaa

atg

gcc

gtg

5328

Gly

His

Val

Phe

Ser

Val

Arg

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala

Val

40

1765

1770

1775

H-U

tac

aat

ctc

tat

ccg

ggt

gtc

ttt

gag

aca

gtg

gaa

atg

cta

ccg

tcc

5376

Tyr

Asn

Leu

Tyr

Pro

Gly

Val

Phe

Glu

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Pro

Ser

1780

1785

1790

45

aaa

gtt

gga

att

tgg

ega

ata

gaa

tgc

ctg

att

ggc

gag

cac

ctg

caa

5424

Lys

Val

Gly

íle

Trp

Arg

íle

Glu

Cys

Leu

íle

Gly

Glu

His

Leu

Gin

1795

1800

1805

get

ggg

atg

age

acg

act

ttc

ctg

gtg

tac

age

aag

gag

tgt

cag

get

5472

50

Ala

Gly

Met

Ser

Thr

Phe

Leu

Val

Tyr

Ser

Lys

Glu

Cys

Gin

Ala

1810

1815

1820

cca

ctg

gga

atg

get

tet

gga

cgc

att

aga

gat

ttt

cag

atc

aca

get

5520

Pro

Leu

Gly

Met

Ala

Ser

Gly

Arg

íle

Arg

Asp

Phe

Gin

íle

Thr

Ala

55

1825

1830

1835

1840

tca

gga

cag

tat

gga

cag

tgg

gcc

cca

aag

ctg

gcc

aga

ctt

cat

tat

5568

Ser

Gly

Gin

Tyr

Gly Gin

Trp

Ala

Pro

Lys

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

60

1845

1850

1855

tcc Ser

gga Gly

tca atc Ser íle 1860

aat Asn

gcc Ala

tgg Trp

age acc Ser Thr 1865

aag Lys

gat Asp

ccc Pro

cac tcc His Ser 1870

tgg Trp

atc íle

5616

5

aag

gtg

gat

ctg

ttg

gca

cca

atg

atc

att

cac

ggc

atc

atg

acc

cag

5664

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

Pro

Met

íle

His

Gly

íle

Met

Thr

Gin

1875

1880

1885

ggt

gcc

cgt

cag

aag

ttt

tcc

age

ctc

tac

atc

tcc

cag

ttt

atc

5712

10

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Phe

Ser

Leu

Tyr

íle

Ser

Gin

Phe

íle

1890

1895

1900

atg

tac

agt

ctt

gac

ggg

agg

aac

tgg

cag

agt

tac

ega

ggg

aat

tcc

5760

Met

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

Asn

Trp

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser

15

1905

1910

1915

1920

acg

ggc

acc

tta

atg

gtc

ttc

ttt

ggc

aat

gtg

gac

gca

tct

ggg

att

5808

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Gly

Asn

Val

Asp

Ala

Ser

Gly

íle

1925

1930

1935

zu

aaa

cac

aat

att

ttt

aac

cct

ccg

att

gtg

get

cgg

tac

atc

cgt

ttg

5856

Lys

His

Asn

íle

Phe

Asn

Pro

íle

Val

Ala

Arg

Tyr

íle

Arg

Leu

1940

1945

1950

25

cac

cca

aca

cat

tac

age

atc

ege

age

act

ctt

ege

atg

gag

ttg

atg

5904

His

Pro

Thr

His

Tyr

Ser

íle

Arg

Ser

Thr

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

1955

1960

1965

ggc

tgt

gat

tta

aac

agt

tgc

age

atg

ccc

ctg

gga

atg

cag

aat

aaa

5952

30

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

Met

Pro

Leu

Gly

Met

Gin

Asn

Lys

1970

1975

1980

gcg

ata

tca

gac

tca

cag

atc

acg

gcc

tcc

cac

cta

age

aat

ata

6000

Ala

íle

Ser

Asp

Ser

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

His

Leu

Ser

Asn

íle

35

1985

1990

1995

2000

ttt

gcc

acc

tgg

tct

cct

tca

caa

gcc

ega

ctt

cac

ctc

cag

ggg

cgg

6048

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Gin

Ala

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

40

2005

2010

2015

acg

aat

gcc

tgg

ega

ccc

cgg

gtg

age

gca

gag

tgg

ctg

cag

6096

Thr

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Val

Ser

Ala

Glu

Trp

Leu

Gin

2020

2025

2030

45

gtg

gac

ctg

cag

aag

acg

gtg

aag

gtc

aca

ggc

atc

acc

cag

ggc

6144

Val

Asp

Leu

Gin

Lys

Thr

Val

Lys

Val

Thr

Gly

íle

Thr

Gin

Gly

2035

2040

2045

gtg

aag

tcc

ctg

ctc

age

atg

tat

gtg

aag

gag

ttc

ctc

gtg

tcc

6192

50

Val

Lys

Ser

Leu

Ser

Met

Tyr

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

2050

2055

2060

agt

cag

gac

ggc

ege

tgg

acc

ctg

ttt

ctt

cag

gac

ggc

cac

6240

Ser

Gin

Asp

Gly

Arg

Trp

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

His

55

2065

2070

2075

2080

acg

aag

gtt

ttt

cag

ggc

aat

cag

gac

tcc

acc

ccc

gtg

aac

6288

Thr

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn

Gin

Asp

Ser

Thr

Pro

Val

Asn

60

2085

2090

2095

	get Ala	ctg Leu	gac ccc Asp Pro 2100	ccg Pro	ctg Leu	ttc Phe	acg Thr
5	age	tgg	gcg	cag	cac	atc	gcc	ctg
	Ser	Trp	Ala	Gin	His	íle	Ala	Leu
		2115				2120
	gca	cag	gat	ctc	tac	tga
10	Ala	Gin Asp	Leu	Tyr
	2130
	<210> 30
15	<211> 2133
	<212> PRT
	<213> Prasa
	<400> 30
20	Met	Gin	Leu	Glu	Leu	Ser	Thr	Cys
	1				5
	Gly	Phe	Ser	Ala	íle	Arg	Arg	Tyr
				20
25
	Trp	Asp	Tyr	Arg	Gin	Ser	Glu	Leu
			35					40
	Arg	Phe	Pro	Ala	Thr	Ala	Pro	Gly
30		50					55
	Leu	Tyr	Lys	Lys	Thr	Val	Phe	Val
	65					70
35	Val	Ala	Arg	Pro	Arg	Pro	Pro	Trp
					85
	Gin	Ala	Glu	Val	Tyr	Asp	Thr	Val
				100
40
	Ser	His	Pro	Val	Ser	Leu	His	Ala
			115					120
	Ser	Glu	Gly	Ala	Glu	Tyr	Glu	Asp
45		130					135
	Asp	Asp	Lys	Val	Leu	Pro	Gly	Lys
	145					150
50	Leu	Lys	Glu	Asn	Gly	Pro	Thr	Ala
					165
	Ser	Tyr	Leu	Ser	His	Val	Asp	Leu
				180
55
	íle	Gly	Ala	Leu	Leu	Val	Cys	Arg
			195					200
	Thr	Gin	Asn	Leu	His	Glu	Phe	Val
60		210					215

ege	tac	ctg	agg atc cac	ccc	acg	6336
Arg	Tyr	Leu	Arg íle His	Pro	Thr
: 105			2110
agg	ctc	gag	gtt cta gga	tgt	gag	6384
Arg	Leu	Glu	Val Leu Gly	Cys	Glu
			2125

6402

Val	Phe 10	Leu	Cys	Leu	Leu	Pro 15	Leu
Tyr 25	Leu	Gly	Ala	Val	Glu 30	Leu	Ser
Leu	Arg	Glu	Leu	His 45	Val	Asp	Thr
Ala	Leu	Pro	Leu 60	Gly	Pro	Ser	Val
Glu	Phe	Thr 75	Asp	Gin	Leu	Phe	Ser 80
Met	Gly 90	Leu	Leu	Gly	Pro	Thr 95	íle
Val 105	Val	Thr	Leu	Lys	Asn 110	Met	Ala
Val	Gly	Val	Ser	Phe 125	Trp	Lys	Ser
His	Thr	Ser	Gin 140	Arg	Glu	Lys	Glu
Ser	Gin	Thr 155	Tyr	Val	Trp	Gin	Val 160
Ser	Asp 170	Pro	Pro	Cys	Leu	Thr 175	Tyr
Val 185	Lys	Asp	Leu	Asn	Ser 190	Gly	Leu
Glu	Gly	Ser	Leu	Thr 205	Arg	Glu	Arg
Leu	Leu	Phe	Ala 220	Val	Phe	Asp	Glu

Gly Lys 225

Ser Trp His

Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp

Thr

Arg

Ala

Met 240

230

235

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

5

245

250

255

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Lys

Ser

260

265

270

10

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

15

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

His

20

325

330

335

His

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

340

345

350

25

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asn

355

360

365

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

370

375

380

30

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

Trp

Val

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

35

405

410

415

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

40

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

45

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

Leu

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

50

485

490

495

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Lys

500

505

510

55

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530 535 540

Pro 545

Arg

Cys

Leu

Thr Arg Tyr 550

Tyr

Ser

Ser Ser 555

íle

Asn

Leu

Glu

Lys 560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

5

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

10

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

15

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

20

645

650

655

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665

670

25

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

30

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

35

725

730

735

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

Gly

740

745

750

40

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

755

760

765

Ser

Ala

Ser

Gin

Lys

Gin

Phe

Gin

Thr

íle

Thr

Ser

Pro

Glu

Asp

770

775

780

45

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Glu

Arg

Thr

Gin

Ala

Leu

Glu

785

790

795

800

Leu

Ser

Val

Pro

Ser

Gly

Asp

Gly

Ser

Met

Leu

Gly

Gin

Asn

Pro

50

805

810

815

Ala

Pro

His

Gly

Ser

Asp

Leu

Gin

Glu

Ala

Arg

Asn

Glu

820

825

830

55

Ala

Asp

Tyr

Leu

Pro

Gly

Ala

Arg

Glu

Arg

Gly

Thr

Ala

Pro

Ser

835

840

845

Ala

Arg

Leu

Arg

Pro

Glu

Leu

His

Ser

Ala

Glu

Arg

Val

850 855 860

Leu Thr 865

Pro

Glu

Pro

Glu 870

Lys

Glu Leu

Lys

Lys 875

Leu

Asp

Ser

Lys

Met 880

Ser

Asp

Leu

Lys

Thr

Ser

Pro

Thr

íle

Pro

Ser

Asp

5

885

890

895

Thr

Leu

Ser

Ala

Glu

Thr

Glu

Arg

Thr

His

Ser

Leu

Gly

Pro

His

900

905

910

10

Pro

Gin

Val

Asn

Phe

Arg

Ser

Gin

Leu

Gly

Ala

íle

Val

Leu

Gly

Lys

915

920

925

Asn

Ser

His

Phe

íle

Gly

Ala

Gly

Val

Pro

Leu

Gly

Ser

Thr

Glu

93 0

935

940

15

Glu

Asp

His

Glu

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Val

Ser

Pro

Val

Glu

Ser

945

950

955

960

Asp

Gly

íle

Phe

Glu

Lys

Glu

Arg

Ala

His

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Thr

20

965

970

975

Lys

Asp

Val

Leu

Phe

Lys

Val

Asn

íle

Ser

Leu

Val

Lys

Thr

Asn

980

985

990

25

Lys

Ala

Arg

Val

Tyr

Leu

Lys

Thr

Asn

Arg

Lys

íle

His

íle

Asp

995

1000

1005

Ala

Leu

Thr

Glu

Asn

Arg

Ala

Ser

Ala

Thr

Phe

Met

Asp

Lys

1010

1015

1020

30

Asn

Thr

Ala

Ser

Gly

Leu

Asn

His

Val

Ser

Asn

Trp

íle

Lys

Gly

1025

1030

1035

1040

Pro

Leu

Gly

Lys

Asn

Pro

Leu

Ser

Glu

Arg

Gly

Pro

Ser

Pro

Glu

35

1045

1050

1055

Leu

Thr

Ser

Gly

Ser

Gly

Lys

Ser

Val

Lys

Gly

Gin

Ser

1060

1065

1070

40

Gly

Gin

Gly

Arg

íle

Arg

Val

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

Lys

1075

1080

1085

Gly

Lys

Glu

Met

Leu

Pro

Asn

Ser

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Asn

1090

1095

1100

45

Ser

Ala

Asp

Val

Gin

Gly

Asn

Asp

Thr

His

Ser

Gin

Gly

Lys

Ser

1105

1110

1115

1120

Arg

Glu

Met

Glu

Arg

Glu

Lys

Leu

Val

Gin

Glu

Lys

Val

Asp

50

1125

1130

1135

Leu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Ala

Thr

Gly

Thr

Lys

Asn

Phe

Leu

Arg

Asn

1140

1145

1150

55

íle

Phe

His

Gin

Ser

Thr

Glu

Pro

Ser

Val

Glu

Gly

Phe

Asp

Gly

1155

1160

1165

Ser

His

Ala

Pro

Val

Pro

Gin

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Asn Asp

Ser

Ala

1170 1175 1180

Glu Arg Ala 1185

Glu

Thr His 1190

íle

Ala His

Phe

Ser 1195

Ala

íle

Arg

Glu Glu 1200

Ala

Pro

Leu

Glu

Ala

Pro

Gly

Asn

Arg

Thr

Gly

Pro

Gly

Pro

Arg

Ser

5

1205

1210

1215

Ala

Val

Pro

Arg

Val

Lys

Gin

Ser

Leu

Lys

Gin

íle

Arg

Leu

Pro

1220

1225

1230

10

Leu

Glu

íle

Lys

Pro

Glu

Arg

Gly

Val

Leu

Asn

Ala

Thr

Ser

1235

1240

1245

Thr

Arg

Trp

Ser

Glu

Ser

Pro

íle

Leu

Gin

Gly

Ala

Lys

Arg

Asn

1250

1255

1260

15

Asn

Leu

Ser

Leu

Pro

Phe

Leu

Thr

Leu

Glu

Met

Ala

Gly

Gin

Gly

1265

1270

1275

1280

Lys

íle

Ser

Ala

Leu

Gly

Lys

Ser

Ala

Gly

Pro

Leu

Ala

Ser

Gly

20

1285

1290

1295

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Val

Leu

Ser

Ala

Gly

Leu

Ser

Glu

Ala

Ser

1300

1305

1310

25

Gly

Lys

Ala

Glu

Phe

Leu

Pro

Lys

Val

Arg

Val

His

Arg

Glu

Asp

Leu

1315

1320

1325

Leu

Pro

Gin

Lys

Thr

Ser

Asn

Val

Ser

Cys

Ala

His

Gly

Asp

Leu

Gly

1330

1335

1340

30

Gin

Glu

íle

Phe

Leu

Gin

Lys

Thr

Arg

Gly

Pro

Val

Asn

Leu

Asn

Lys

1345

1350

1355

1360

Val

Asn

Arg

Pro

Gly

Arg

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

Gly

Pro

Met

35

1365

1370

1375

Pro

Lys

Glu

Trp

Glu

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser

Pro

Lys

Ser

Thr

Ala

Leu

1380

1385

1390

40

Arg

Thr

Lys

Asp

íle

Ser

Leu

Pro

Leu

Asp

Arg

His

Glu

Ser

Asn

1395

1400

1405

His

Ser

íle

Ala

Lys

Asn

Glu

Gly

Gin

Ala

Glu

Thr

Gin

Arg

Glu

1410

1415

1420

45

Ala

Trp

Thr

Lys

Gin

Gly

Pro

Gly

Arg

Leu

Cys

Ala

Pro

Lys

1425

1430

1435

1440

Pro

Val

Leu

Arg

His

Gin

Arg

Asp

íle

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe

50

1445

1450

1455

Gin

Pro

Glu

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp

íle

Phe

Ser

Thr

Glu

1460

1465

1470

55

Thr

Lys

Gly

Glu

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr

Gly

Glu

Asp

Glu

Asn

Gin

Asp

1475

1480

1485

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr

Arg

His

Tyr

Phe

íle

Ala

Val

1490 1495 1500

	Glu Gin Leu Trp 1505	Asp Tyr Gly 1510	Met	Ser	Glu Ser 1515	Pro	Arg	Ala	Leu Arg 1520
	Asn Arg Ala Gin	Asn Gly Glu	Val	Pro	Arg Phe	Lys	Lys	Val	Val Phe
5	1525		1530			1535
	Arg Glu Phe Ala	Asp Gly Ser	Phe	Thr	Gin Pro	Ser	Tyr	Arg	Gly Glu
	1540		1545			1550
10	Leu Asn Lys His	Leu Gly Leu	Leu	Gly	Pro Tyr	íle	Arg	Ala	Glu Val
	1555	1560			1565
	Glu Asp Asn íle	Met Val Thr	Phe	Lys	Asn Gin	Ala	Ser	Arg	Pro Tyr
i r	1570	1575			1580
1 Ď	Ser Phe Tyr Ser	Ser Leu íle	Ser	Tyr	Pro Asp	Asp	Gin	Glu	Gin Gly
	1585	1590			1595				1600
	Ala Glu Pro Arg	His Asn Phe	Val	Gin	Pro Asn	Glu	Thr	Arg	Thr Tyr
20	1605		1610			1615
	Phe Trp Lys Val	Gin His His	Met	Ala	Pro Thr	Glu	Asp	Glu	Phe Asp
	1620		1625			1630
25	Cys Lys Ala Trp	Ala Tyr Phe	Ser	Asp	Val Asp	Leu	Glu	Lys	Asp Val
	1635	1640			1645
	His Ser Gly Leu	íle Gly Pro	Leu	Leu	íle Cys	Arg	Ala	Asn	Thr Leu
	1650	1655			1660
30
	Asn Ala Ala His	Gly Arg Gin	Val	Thr	Val Gin	Glu	Phe	Ala	Leu Phe
	1665	1670			1675				1680
	Phe Thr íle Phe	Asp Glu Thr	Lys	Ser	Trp Tyr	Phe	Thr	Glu	Asn Val
35	1685		1690			1695
	Glu Arg Asn Cys	Arg Ala Pro	Cys	His	Leu Gin	Met	Glu	Asp	Pro Thr
	1700		1705			1710
40	Leu Lys Glu Asn	Tyr Arg Phe	His	Ala	íle Asn	Gly	Tyr	Val	Met Asp
	1715	1720			1725
	Thr Leu Pro Gly	Leu Val Met	Ala	Gin	Asn Gin	Arg	íle	Arg	Trp Tyr
	1730	1735			1740
45
	Leu Leu Ser Met	Gly Ser Asn	Glu	Asn	íle His	Ser	íle	His	Phe Ser
	1745	1750			1755				1760
	Gly His Val Phe	Ser Val Arg	Lys	Lys	Glu Glu	Tyr	Lys	Met	Ala Val
50	1765		1770			1775
	Tyr Asn Leu Tyr	Pro Gly Val	Phe	Glu	Thr Val	Glu	Met	Leu	Pro Ser
	1780		1785			1790
55	Lys Val Gly íle	Trp Arg íle	Glu	Cys	Leu íle	Gly	Glu	His	Leu Gin
	1795		1800			1805
	Ala Gly Met Ser	Thr Thr Phe	Leu	Val	Tyr Ser	Lys	Glu	Cys	Gin Ala

1810 1815 1820

Pro Leu 1825

Gly Met

Ala Ser 1830

Gly

Arg

íle

Arg Asp 1835

Phe

Gin

íle

Thr Ala 1840

Ser

Gly

Gin

Tyr

Gly

Gin

Trp

Ala

Pro

Lys

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

1845

1850

1855

Ser

Gly

Ser

íle

Asn

Ala

Trp

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

His

Ser

Trp

íle

1860

1865

1870

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

Pro

Met

íle

His

Gly

íle

Met

Thr

Gin

1875

1880

1885

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Phe

Ser

Leu

Tyr

íle

Ser

Gin

Phe

íle

1890

1895

1900

Met

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

Asn

Trp

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser

1905

1910

1915

1920

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Gly

Asn

Val

Asp

Ala

Ser

Gly

íle

1925

1930

1935

Lys

His

Asn

íle

Phe

Asn

Pro

íle

Val

Ala

Arg

Tyr

íle

Arg

Leu

1940

1945

1950

His

Pro

Thr

His

Tyr

Ser

íle

Arg

Ser

Thr

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

1955

1960

1965

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

Met

Pro

Leu

Gly

Met

Gin

Asn

Lys

1970

1975

1980

Ala

íle

Ser

Asp

Ser

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

His

Leu

Ser

Asn

íle

1985

1990

1995

2000

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Gin

Ala

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

2005

2010

2015

Thr

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Val

Ser

Ala

Glu

Trp

Leu

Gin

2020

2025

2030

Val

Asp

Leu

Gin

Lys

Thr

Val

Lys

Val

Thr

Gly

íle

Thr

Gin

Gly

2035

2040

2045

Val

Lys

Ser

Leu

Ser

Met

Tyr

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

2050

2055

2060

Ser

Gin

Asp

Gly

Arg

Trp

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

His

2065

2070

2075

2080

Thr

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn

Gin

Asp

Ser

Thr

Pro

Val

Asn

2085

2090

2095

Ala

Leu

Asp

Pro

Leu

Phe

Thr

Arg

Tyr

Leu

Arg

íle

His

Pro

Thr

2100

2105

2110

Ser

Trp

Ala

Gin

His

íle

Ala

Leu

Arg

Leu

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

2115 2120 2125

Ala Gin Asp Leu Tyr

2130 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Met Gin íle Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

10 15

Cys Phe Ser <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: linker

<400> 32 Ser Phe Ala 1	Gin	Asn 5	Ser	Arg	Pro Pro	Ser Ala Ser Ala 10	Pro Lys Pro 15
Pro Val Leu	Arg 20	Arg	His	Gin	Arg

<210> 33 <211> 105 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: linker <400> 33 gtcattgaac ctaggagctt tgcccagaat tcaagacccc ctagtgcgag cgctccaaag 60 cctccggtcc tgcgacggca tcagagggac ataagccttc ctact

105 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 34 gaggaaaacc agatgatgtc a <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 35 ctttggagcg ctcgcactag ggggtcttga attctgggca aagctcctag gttcaatgac 60 <210> 36 <211> 66 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 36 cctagtgcga gcgctccaaa gcctccggtc ctgcgacggc atcagaggga cataagcctt 60 cctact 66

<210>	37
<211>	4404
<212>	DNA
<213>	Prasa
<220>
<221>	CDS
<222>	(1) . . (4401)

<400> 37

atg Met 1

cag Gin

cta Leu

gag Glu

ctc Leu 5

tcc Ser

acc Thr

tgt Cys

gtc Val

ttt Phe 10

ctg Leu

tgt Cys

ctc Leu

ttg Leu

cca Pro 15

ctc Leu

48

ggc

ttt

agt

gcc

atc

agg

aga

tac

ctg

ggc

gca

gtg

gaa

ctg

tcc

96

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

tgg

gac

tac

cgg

caa

agt

gaa

ctc

cgt

gag

ctg

cac

gtg

gac

acc

144

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

aga

ttt

cct

get

aca

gcg

cca

gga

get

ctt

ccg

ttg

ggc

ccg

tca

gtc

192

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

ctg

tac

aaa

aag

act

gtg

ttc

gta

gag

ttc

acg

gat

caa

ctt

ttc

agc

240

Leu

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

gtt

gcc

agg

ccc

agg

cca

tgg

atg

ggt

ctg

ggt

cct

acc

atc

288

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

85

90

95

cag

get

gag

gtt

tac

gac

acg

gtg

gtc

gtt

acc

ctg

aag

aac

atg

get

336

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

tet Ser

cat His

ccc Pro 115

gtt Val

agt Ser

ctt Leu

cac His

get Ala 120

gtc Val

ggc Gly

gtc Val

tcc Ser

ttc Phe 125

tgg Trp

aaa Lys

tet Ser

384

5

tcc

gaa

ggc

get

gaa

tat

gag

gat

cac

acc

agc

caa

agg

gag

aag

gaa

432

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

gac

gat

aaa

gtc

ctt

ccc

ggt

aaa

agc

caa

acc

tac

gtc

tgg

cag

gtc

480

10

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

ctg

aaa

gaa

aat

ggt

cca

aca

gcc

tet

gac

cca

tgt

ctt

acc

tac

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

15

165

170

175

tca

tac

ctg

tet

cac

gtg

gac

ctg

gtg

aaa

gac

ctg

aat

tcg

ggc

ctc

576

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

Q Λ

180

185

190

att

gga

gcc

ctg

gtt

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

acc

aga

gaa

agg

624

íle

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

25

acc

cag

aac

ctg

cac

gaa

ttt

gta

cta

ctt

ttt

get

gtc

ttt

gat

gaa

672

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gca

aga

aat

gac

tcc

tgg

aca

cgg

gcc

atg

720

30

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

230

235

240

gat

CCC

gca

cct

gcc

agg

gcc

cag

cct

gca

atg

cac

aca

gtc

aat

ggc

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

35

245

250

255

tat

gtc

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

atc

gga

tgt

cat

aag

aaa

tca

816

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Lys

Ser

260

265

270

40

gtc

tac

tgg

cac

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

agc

ccg

gaa

gtg

cac

tcc

864

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

45

att

ttt

ctt

gaa

ggc

cac

acg

ttt

ctc

gtg

agg

cac

cat

ege

cag

get

912

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

tcc

ttg

gag

atc

tcg

cca

cta

act

ttc

ctc

act

get

cag

aca

ttc

ctg

960

50

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

atg

gac

ctt

ggc

cag

ttc

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

tcc

cac

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

His

55

325

330

335

cat

ggt

ggc

atg

gag

get

cac

gtc

aga

gta

gaa

agc

tgc

gcc

gag

1056

His

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

60

340

345

350

CCC

cag

ctg

cgg

agg

aaa

get

gat

gaa

gag

gaa

gat

tat

gat

gac

aat

1104

Pro

Gin

Leu 355

Arg Arg

Lys Ala

Asp 360

Glu

Glu Asp Tyr Asp Asp 365

Asn

ttg

tac

gac

tcg

gac

atg

gac

gtg

gtc

cgg

ctc

gat

ggt

gac

gtg

1152

5

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

370

375

380

tct

ccc

ttt

atc

caa

atc

ege

tcg

gtt

gcc

aag

cat

ccc

aaa

acc

1200

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

10

385

390

395

400

tgg

gtg

cac

tac

atc

tct

gca

gag

gac

tgg

gac

tac

gcc

ccc

1248

Trp

val

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

1 c

405

410

415

1 J

gcg

gtc

ccc

agc

ccc

agt

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

ctc

tac

ttg

aac

1296

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

20

agt

ggt

cct

cag

ega

att

ggt

agg

aaa

tac

aaa

get

ega

ttc

gtc

1344

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

get

tac

acg

gat

gta

aca

ttt

aag

act

cgt

aaa

get

att

ccg

tat

gaa

1392

25

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

tca

gga

atc

ctg

gga

cct

tta

Ctt

tat

gga

gaa

gtt

gga

gac

aca

ctt

1440

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

30

465

470

475

480

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

aaa

gcg

agc

ega

cca

tat

aac

atc

tac

cct

1488

Leu

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

K

485

490

495

J J

cat

gga

atc

act

gat

gtc

agc

get

ttg

cac

cca

ggg

aga

ctt

cta

aaa

1536

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Lys

500

505

510

40

ggt

tgg

aaa

cat

ttg

aaa

gac

atg

cca

att

ctg

cca

gga

gag

act

ttc

1584

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

aag

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gtg

gaa

gat

ggg

cca

acc

aag

tcc

gat

1632

45

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tac

tcg

agc

tcc

att

aat

cta

gag

aaa

1680

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

50

545

550

555

560

gat

ctg

get

tcg

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

atc

tgc

tac

aaa

gaa

1728

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

CC

565

570

575

J J

tct

gta

gac

caa

aga

gga

aac

cag

atg

tca

gac

aag

aga

aac

gtc

1776

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

atc íle

ctg Leu

ttt Phe 595

tct Ser

gta Val

ttc gat Phe Asp

gag aat

caa agc

tgg Trp

tac Tyr 605

ctc Leu

gca Ala

gag Glu

1824

Glu 600

Asn

Gin

Ser

5

aat

att

cag

cgc

ttc

ctc

ccc

aat

ccg

gat

gga

tta

cag

ccc

cag

gat

1872

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

cca

gag

ttc

caa

get

tct

aac

atc

atg

cac

agc

atc

aat

ggc

tat

gtt

1920

10

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

ttt

gat

agc

ttg

cag

ctg

tcg

gtt

tgt

ttg

cac

gag

gtg

gca

tac

tgg

1968

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

15

645

650

655

tac

att

cta

agt

gtt

gga

gca

cag

acg

gac

ttc

ctc

tcc

gtc

ttc

2016

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665

670

ZO

tct

ggc

tac

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

gac

aca

ctc

acc

2064

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

25

ctg

ttc

ccc

ttc

tca

gga

gaa

acg

gtc

ttc

atg

tca

atg

gaa

aac

cca

2112

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

ggt

ctc

tgg

gtc

ctt

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttg

cgg

aac

aga

ggg

2160

30

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

atg

aca

gcc

tta

ctg

aag

gtg

tat

agt

tgt

gac

agg

gac

att

ggt

gat

2208

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

35

725

730

735

tat

gac

aac

act

tat

gaa

gat

att

cca

ggc

ttc

ttg

ctg

agt

gga

2256

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

Gly

740

745

750

aag

aat

gtc

att

gaa

cct

agg

agc

ttt

gcc

cag

aat

tca

aga

ccc

cct

2304

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

755

760

765

45

agt

gcg

agc

get

cca

aag

cct

ccg

gtc

ctg

ega

cgg

cat

cag

agg

gac

2352

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Lys

Pro

Val

Leu

Arg

His

Gin

Arg

Asp

770

775

780

ata

agc

ctt

cct

act

ttt

cag

ccg

gag

gaa

gac

aaa

atg

gac

tat

gat

2400

50

íle

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe

Gin

Pro

Glu

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp

785

790

795

800

gat

atc

ttc

tca

act

gaa

acg

aag

gga

gaa

gat

ttt

gac

att

tac

ggt

2448

Asp

íle

Phe

Ser

Thr

Glu

Thr

Lys

Gly

Glu

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr

Gly

55

805

810

815

gag

gat

gaa

aat

cag

gac

cct

cgc

agc

ttt

cag

aag

aga

acc

ega

cac

2496

Glu

Asp

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr

Arg

His

820 825 830

tat Tyr

ttc Phe

att get

gcg gtg

gag Glu

cag Gin 840

ctc Leu

tgg Trp

gat Asp

tac Tyr

ggg atg

age Ser

gaa Glu

2544

íle 835

Ala

Val

Gly 845

Met

5

tcc

ccc

cgg

gcg

cta

aga

aac

agg

get

cag

aac

gga

gag

gtg

cct

cgg

2592

Ser

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn

Gly

Glu

Val

Pro

Arg

850

855

860

ttc

aag

gtg

gtc

ttc

cgg

gaa

ttt

get

gac

ggc

tcc

ttc

acg

cag

2640

10

Phe

Lys

Val

Phe

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin

865

870

875

880

ccg

tcg

tac

cgc

ggg

gaa

ctc

aac

aaa

cac

ttg

ggg

ctc

ttg

gga

ccc

2688

Pro

Ser

Tyr

Arg

Gly

Glu

Leu

Asn

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Gly

Pro

15

885

890

895

tac

atc

aga

gcg

gaa

gtt

gaa

gac

aac

atc

atg

gta

act

ttc

aaa

aac

2736

Tyr

íle

Arg

Ala

Glu

Val

Glu

Asp

Asn

íle

Met

Val

Thr

Phe

Lys

Asn

900

905

910

Zr V

cag

gcg

tet

cgt

ccc

tat

tcc

ttc

tac

tcg

age

ctt

att

tet

tat

ccg

2784

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ser

Leu

íle

Ser

Tyr

Pro

915

920

925

25

gat

cag

gag

caa

ggg

gca

gaa

cct

ega

cac

aac

ttc

gtc

cag

cca

2832

Asp

Gin

Glu

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro

Arg

His

Asn

Phe

Val

Gin

Pro

930

935

940

aat

gaa

acc

aga

act

tac

ttt

tgg

aaa

gtg

cag

cat

cac

atg

gca

ccc

2880

30

Asn

Glu

Thr

Arg

Thr

Tyr

Phe

Trp

Lys

Val

Gin

His

Met

Ala

Pro

945

950

955

960

aca

gaa

gac

gag

ttt

gac

tgc

aaa

gcc

tgg

gcc

tac

ttt

tet

gat

gtt

2928

Thr

Glu

Asp

Glu

Phe

Asp

Cys

Lys

Ala

Trp

Ala

Tyr

Phe

Ser

Asp

Val

35

965

970

975

gac

ctg

gaa

aaa

gat

gtg

cac

tca

ggc

ttg

atc

ggc

ccc

ctt

ctg

atc

2976

Asp

Leu

Glu

Lys

Asp

Val

His

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

980

985

990

4V

tgc

cgc

gcc

aac

acc

ctg

aac

get

cac

ggt

aga

caa

gtg

acc

gtg

3024

Cys

Arg

Ala

Asn

Thr

Leu

Asn

Ala

His

Gly

Arg

Gin

Val

Thr

Val

995

1000

1005

45

caa

gaa

ttt

get

ctg

ttt

ttc

act

att

ttt

gat

gag

aca

aag

age

tgg

3072

Gin

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe

Thr

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

1010

1015

1020

tac

ttc

act

gaa

aat

gtg

gaa

agg

aac

tgc

cgg

gcc

ccc

tgc

cat

ctg

3120

50

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Val

Glu

Arg

Asn

Cys

Arg

Ala

Pro

Cys

His

Leu

1025

1030

1035

1040

cag

atg

gag

gac

CCC

act

ctg

aaa

gaa

aac

tat

cgc

ttc

cat

gca

atc

3168

Gin

Met

Glu

Asp

Pro

Thr

Leu

Lys

Glu

Asn

Tyr

Arg

Phe

His

Ala

íle

55

1045

1050

1055

aat

ggc

tat

gtg

atg

gat

aca

ctc

cct

ggc

tta

gta

atg

get

cag

aat

3216

Asn

Gly

Tyr

Val

Met

Asp

Thr

Leu

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

Gin

Asn

1060 1065 1070

caa Gin

agg atc Arg íle 1075

ega Arg

tgg Trp

tat Tyr

ctg ctc Leu Leu 1080

age Ser

atg Met

ggc Gly

age aat Ser Asn 1085

gaa Glu

aat Asn

atc íle

3264

5

cat

tcg

att

cat

ttt

age

gga

cac

gtg

ttc

agt

gta

cgg

aaa

aag

gag

3312

His

Ser

íle

His

Phe

Ser

Gly

His

Val

Phe

Ser

Val

Arg

Lys

Glu

1090

1095

1100

gag

tat

aaa

atg

gcc

gtg

tac

aat

ctc

tat

ccg

ggt

gtc

ttt

gag

aca

3360

10

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala

Val

Tyr

Asn

Leu

Tyr

Pro

Gly

Val

Phe

Glu

Thr

1105

1110

1115

1120

gtg

gaa

atg

cta

ccg

tcc

aaa

gtt

gga

att

tgg

ega

ata

gaa

tgc

ctg

3408

Val

Glu

Met

Leu

Pro

Ser

Lys

Val

Gly

íle

Trp

Arg

íle

Glu

Cys

Leu

15

1125

1130

1135

att

ggc

gag

cac

ctg

caa

get

ggg

atg

age

acg

act

ttc

ctg

gtg

tac

3456

íle

Gly

Glu

His

Leu

Gin

Ala

Gly

Met

Ser

Thr

Phe

Leu

Val

Tyr

ΊΑ

1140

1145

1150

zu

age

aag

gag

tgt

cag

get

cca

ctg

gga

atg

get

tet

gga

ege

att

aga

3504

Ser

Lys

Glu

Cys

Gin

Ala

Pro

Leu

Gly

Met

Ala

Ser

Gly

Arg

íle

Arg

1155

1160

1165

25

gat

ttt

cag

atc

aca

get

tca

gga

cag

tat

gga

cag

tgg

gcc

cca

aag

3552

Asp

Phe

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

Gly

Gin

Tyr

Gly

Gin

Trp

Ala

Pro

Lys

1170

1175

1180

ctg

gcc

aga

ctt

cat

tat

tcc

gga

tca

atc

aat

gcc

tgg

age

acc

aag

3600

30

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

íle

Asn

Ala

Trp

Ser

Thr

Lys

1185

1190

1195

1200

gat

ccc

cac

tcc

tgg

atc

aag

gtg

gat

ctg

ttg

gca

cca

atg

atc

att

3648

Asp

Pro

His

Ser

Trp

íle

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

Pro

Met

íle

35

1205

1210

1215

cac

ggc

atc

atg

acc

cag

ggt

gcc

cgt

cag

aag

ttt

tcc

age

ctc

tac

3696

His

Gly

íle

Met

Thr

Gin

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Phe

Ser

Leu

Tyr

ΑΠ

1220

1225

1230

4-V

atc

tcc

cag

ttt

atc

atg

tac

agt

ctt

gac

ggg

agg

aac

tgg

cag

3744

íle

Ser

Gin

Phe

íle

Met

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

Asn

Trp

Gin

1235

1240

1245

45

agt

tac

ega

ggg

aat

tcc

acg

ggc

acc

tta

atg

gtc

ttc

ttt

ggc

aat

3792

Ser

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Gly

Asn

1250

1255

1260

gtg

gac

gca

tet

ggg

att

aaa

cac

aat

att

ttt

aac

cct

ccg

att

gtg

3840

50

Val

Asp

Ala

Ser

Gly

íle

Lys

His

Asn

íle

Phe

Asn

Pro

íle

Val

1265

1270

1275

1280

get

cgg

tac

atc

cgt

ttg

cac

cca

aca

cat

tac

age

atc

ege

age

act

3888

Ala

Arg

Tyr

íle

Arg

Leu

His

Pro

Thr

His

Tyr

Ser

íle

Arg

Ser

Thr

55

1285

1290

1295

ctt

ege

atg

gag

ttg

atg

ggc

tgt

gat

tta

aac

agt

tgc

age

atg

ccc

3936

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

Met

Pro

1300

1305

1310

ctg gga

atg Met 1315

cag aat Gin Asn

aaa Lys

gcg ata Ala íle 1320

tca Ser

gac Asp

tca Ser

cag atc Gin íle 1325

acg Thr

gcc Ala

tcc Ser

3984

Leu

Gly

tcc

cac

cta

age

aat

ata

ttt

gcc

acc

tgg

tet

cct

tca

caa

gcc

ega

4032

Ser

His

Leu

Ser

Asn

íle

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Gin

Ala

Arg

1330

1335

1340

ctt

cac

ctc

cag

ggg

cgg

acg

aat

gcc

tgg

ega

CCC

cgg

gtg

age

4080

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Val

Ser

1345

1350

1355

1360

gca

gag

tgg

ctg

cag

gtg

gac

ctg

cag

aag

acg

gtg

aag

gtc

aca

4128

Ala

Glu

Trp

Leu

Gin

Val

Asp

Leu

Gin

Lys

Thr

Val

Lys

Val

Thr

1365

1370

1375

ggc

atc

acc

cag

ggc

gtg

aag

tcc

ctg

ctc

age

atg

tat

gtg

4176

Gly

íle

Thr

Gin

Gly

Val

Lys

Ser

Leu

Ser

Met

Tyr

Val

1380

1385

1390

aag

gag

ttc

ctc

gtg

tcc

agt

cag

gac

ggc

ege

tgg

acc

ctg

4224

Lys

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

Gin

Asp

Gly

Arg

Trp

Thr

Leu

1395

1400

1405

ttt

ctt

cag

gac

ggc

cac

acg

aag

gtt

ttt

cag

ggc

aat

cag

gac

tcc

4272

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

His

Thr

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn

Gin

Asp

Ser

1410

1415

1420

tcc

acc

ccc

gtg

aac

get

ctg

gac

ccc

ccg

ctg

ttc

acg

ege

tac

4320

Ser

Thr

Pro

Val

Asn

Ala

Leu

Asp

Pro

Leu

Phe

Thr

Arg

Tyr

1425

1430

1435

1440

ctg

agg

atc

cac

ccc

acg

age

tgg

gcg

cag

cac

atc

gcc

ctg

agg

ctc

4368

Leu

Arg

íle

His

Pro

Thr

Ser

Trp

Ala

Gin

His

íle

Ala

Leu

Arg

Leu

1445

1450

1455

gag

gtt

cta

gga

tgt

gag

gca

cag

gat

ctc

tac

tga

4404

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gin

Asp

Leu

Tyr

1460

1465

<210> 38 <211> 1467 <212> PRT <213> Prasa <400> 38

Met 1

Gin

Leu

Glu

Leu 5

Ser

Thr Cys Val

Phe Leu 10

Cys

Leu Leu

Pro 15

Leu

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

Leu

Tyr

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

Val Ala

Arg Pro

Arg 85

Pro

Trp

Met

Gly 90

Leu

Gly

Pro

Thr 95

íle

5

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

10

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

14 0

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

15

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

20

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

íle

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

25

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

30

225

230

235

240

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

35

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Lys

Ser

2S0

265

270

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

40

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

45

305

310

315

320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

His

325

330

335

50

His

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

340

345

350

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asn

355

360

365

55

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

370

375

380

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

60

385

390

395

400

Trp

Val

His

Tyr

íle 405

Ser

Ala

Glu Glu

Glu Asp 410

Trp

Asp

Tyr

Ala 415

Pro

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

5

420

425

430

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

10

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

15

Leu

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

485

490

495

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Lys

20

500

505

510

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

25

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

30

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

35

580

585

590

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

40

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

45

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

50

660

665

670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

55

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

Met Thr Ala Leu

Leu 725

Lys Val

Tyr

Ser

Cys 730

Asp Arg

Asp

íle

Gly 735

Asp

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Ser

Gly

5

740

745

750

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

755

760

765

10

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Lys

Pro

Val

Leu

Arg

His

Gin

Arg

Asp

770

775

780

íle

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe

Gin

Pro

Glu

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp

785

790

795

800

15

Asp

íle

Phe

Ser

Thr

Glu

Thr

Lys

Gly

Glu

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr

Gly

805

810

815

Glu

Asp

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr

Arg

His

20

820

825

830

Tyr

Phe

íle

Ala

Val

Glu

Gin

Leu

Trp

Asp

Tyr

Giy

Met

Ser

Glu

835

840

845

25

Ser

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn

Gly

Glu

Val

Pro

Arg

850

855

860

Phe

Lys

Val

Phe

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin

865

870

875

880

30

Pro

Ser

Tyr

Arg

Gly

Glu

Leu

Asn

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Gly

Pro

885

890

895

Tyr

íle

Arg

Ala

Glu

Val

Glu

Asp

Asn

íle

Met

Val

Thr

Phe

Lys

Asn

35

900

905

910

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ser

Leu

íle

Ser

Tyr

Pro

915

920

925

40

Asp

Gin

Glu

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro

Arg

His

Asn

Phe

Val

Gin

Pro

930

935

940

Asn

Glu

Thr

Arg

Thr

Tyr

Phe

Trp

Lys

Val

Gin

His

Met

Ala

Pro

945

950

955

960

45

Thr

Glu

Asp

Glu

Phe

Asp

Cys

Lys

Ala

Trp

Ala

Tyr

Phe

Ser

Asp

Val

965

970

975

Asp

Leu

Glu

Lys

Asp

Val

His

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

íle

50

980

985

990

Cys

Arg

Ala

Asn

Thr

Leu

Asn

Ala

His

Gly

Arg

Gin

Val

Thr

Val

995

1000

1005

55

Gin

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe

Thr

íle

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

1010

1015

1020

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Val

Glu Arg

Asn

Cys

Arg Ala

Pro

Cys

His

Leu

1025 1030 1035 1040

Gin Met

Glu

Asp

Pro 1045

Thr

Leu

Lys

Glu Asn 1050

Tyr

Arg Phe

His Ala 1055

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

Met

Asp

Thr

Leu

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

Gin

Asn

5

1060

1065

1070

Gin

Arg

íle

Arg

Trp

Tyr

Leu

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu

Asn

íle

1075

1080

1085

10

His

Ser

íle

His

Phe

Ser

Gly

His

Val

Phe

Ser

Val

Arg

Lys

Glu

1090

1095

1100

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala

Val

Tyr

Asn

Leu

Tyr

Pro

Gly

Val

Phe

Glu

Thr

1105

1110

1115

1120

15

Val

Glu

Met

Leu

Pro

Ser

Lys

Val

Gly

íle

Trp

Arg

íle

Glu

Cys

Leu

1125

1130

1135

íle

Gly

Glu

His

Leu

Gin

Ala

Gly

Met

Ser

Thr

Phe

Leu

Val

Tyr

20

1140

1145

1150

Ser

Lys

Glu

Cys

Gin

Ala

Pro

Leu

Gly

Met

Ala

Ser

Gly

Arg

íle

Arg

1155

1160

1165

25

Asp

Phe

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

Gly

Gin

Tyr

Gly

Gin

Trp

Ala

Pro

Lys

1170

1175

1180

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

íle

Asn

Ala

Trp

Ser

Thr

Lys

1185

1190

1195

1200

30

Asp

Pro

His

Ser

Trp

íle

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

Pro

Met

íle

1205

1210

1215

His

Gly

íle

Met

Thr

Gin

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Phe

Ser

Leu

Tyr

35

1220

1225

1230

íle

Ser

Gin

Phe

íle

Met

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

Asn

Trp

Gin

1235

1240

1245

40

Ser

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Gly

Asn

1250

1255

1260

Val

Asp

Ala

Ser

Gly

íle

Lys

His

Asn

íle

Phe

Asn

Pro

íle

Val

1265

1270

1275

1280

45

Ala

Arg

Tyr

íle

Arg

Leu

His

Pro

Thr

His

Tyr

Ser

íle

Arg

Ser

Thr

1285

1290

1295

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

Met

Pro

50

1300

1305

1310

Leu

Gly

Met

Gin

Asn

Lys

Ala

íle

Ser

Asp

Ser

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

1315

1320

1325

55

Ser

His

Leu

Ser

Asn

íle

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Gin

Ala

Arg

1330

1335

1340

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

Arg

Val

Ser

1345 1350 1355 1360

Ala Glu

Glu

Trp Leu Gin 1365

Val

Asp

Leu Gin 1370

Lys

Thr

Val

Lys Val 1375

Thr

Gly

íle

Thr

Gin

Gly

Val

Lys

Ser

Leu

Ser

Met

Tyr

Val

1380

1385

1390

Lys

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

Gin

Asp

Gly

Arg

Trp

Thr

Leu

1395

1400

1405

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

His

Thr

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn

Gin

Asp

Ser

1410

1415

1420

Ser

Thr

Pro

Val

Asn

Ala

Leu

Asp

Pro

Leu

Phe

Thr

Arg

Tyr

1425

1430

1435

1440

Leu

Arg

íle

His

Pro

Thr

Ser

Trp

Ala

Gin

His

íle

Ala

Leu

Arg

Leu

1445

1450

1455

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gin

Asp

Leu

Tyr

1460 1465

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu POL1212 uvedenú v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 38.
2. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA podľa nároku 1.
3. DNA podľa nároku 1, ktorá má nukleotidovú sekvenciu uvedenú v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 37.
4. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA podľa nároku 3.
5. Modifikovaný prasačí faktor VIII, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ IDNO: 38.
6. Terapeutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje modifikovaný prasačí faktor VIII podľa nároku 5 a fyziologicky prijateľný nosič.
7. Spôsob prípravy proteínu modifikovaného prasačieho faktora VIII in vitro, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 38, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok, keď sa v cicavčej hostiteľskej bunke exprimuje DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 38.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že DNA kódujúca aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 38 kóduje tiež signálny peptid, prostredníctvom ktorého je proteín modifikovaného prasačieho faktora VIII exportovaný z cicavčej hostiteľskej bunky.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že signálny peptid má sekvenciu aminokyselín 1 až 19 zo sekvencie SEQ ID NO: 30.
10. Cicavčia bunka, ktorou nie je ľudská bunka, ktorá obsahuje a replikuje expresný vektor zahrnujúci DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu POL1212 uvedenú v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 38.
11. Cicavčia bunka podľa nároku 10, kde vektor obsahuje DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 37.
12. Bunka podľa nároku 11, kde hostiteľská bunka je BHK CRL-1632.