NO331935B1

NO331935B1 - Modifisert faktor VIII, DNA, ekspresjonsvektor, terapeutisk preparat, metode for a produsere modifisert svin-faktor VIII-protein, samt vertcelle

Info

Publication number: NO331935B1
Application number: NO20024296A
Authority: NO
Inventors: John S Lollar
Original assignee: Univ Emory
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2002-09-09
Publication date: 2012-05-07
Also published as: NZ520799A; EP1280540A4; EP1280540B1; RS50364B; BR122013026957A2; LU93049I2; US6458563B1; SI1280540T1; MXPA02008798A; LTC1280540I2; HUS1600020I1; HUP0300586A3; NL300808I1; HK1051004A1; RU2002124123A; UA75064C2; CA2400295C; HU227804B1; JP2003526358A; BE2016C024I2

Abstract

Oppfinnelsen angår en modifisert B-domeneløs form av svinfaktor VIII, DNA som koder for denne og anvendelse derav for behandling av hemofili.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører DNA, ekspresjonsvektor, modifisert svin-faktor VIII, terapeutisk preparat, metode for å produsere modifisert svin-faktor VIIl-protein som har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:38, samt vertcelle.

Blodkoagulering begynner når blodplater adherer til en kuttet vegg i et skadet blodkar på et skadested. Deretter blir, i en kaskade av enzymatisk regulerte reaksjoner, oppløselige fibrinogenmolekyler omdannet av enzymet trombin til uoppløselige tråder av fibrin som holder blodplatene sammen i en trombe. Ved hvert trinn i kaskaden blir en proteinforløper omdannet til en protease som spalter neste proteinforløper i serien. Kofaktorer er nødvendig ved mesteparten av trinnene.

Faktor VIII sirkulerer som en inaktiv forløper i blod, bundet fast og ikke-kovalent til von Willebrand faktor. Faktor VIII blir proteolytisk aktivert av trombin eller faktor Xa, som dissosierer den fra von Willebrand faktor og aktiverer dens prokoagulerende funksjon i kaskaden. I dens aktive form er proteinet faktor Villa en kofaktor som øker den katalytiske effektivitet av faktor IXa mot faktor X-aktivering med mange størrelsesordener.

Folk med defekter i faktor VIII eller antistoffer mot faktor VIII som ikke blir behandlet med faktor VIII, lider av ukontrollert indre blødning som kan forårsake en rekke alvorlige symptomer, fra inflammatoriske reaksjoner i ledd til tidlig død. Pasienter med alvorlig hemofili, som er ca. 10,000 i USA, kan behandles ved infusjon av human faktor VIII, som vil gjenopprette blodets normale koaguleringsevne hvis administrert med tilstrekkelig hyppighet og konsentrasjon. Den klassiske definisjon av faktor VIII, er den substans til stede i normalt blodplasma som korrigerer koaguleringsdefekten i plasma tatt fra individer med hemofili A.

Utvikling av antistoffer ("inhibitorer" eller "hemmende antistoffer") som hemmer aktiviteten til faktor VIII er en alvorlig komplikasjon ved behandling av pasienter med hemofili. Autoantistoffer utvikles hos omtrent 20% av pasienter med hemofili A som respons på terapeutiske infusjoner av faktor VIII. Hos tidligere ubehandlede pasienter med hemofili A som utvikler inhibitorer, utvikles inhibitoren vanligvis innen ett år med behandling. I tillegg vil autoantistoffer som inaktiverer faktor VIII av og til utvikles hos individer med tidligere normale faktor Vlll-nivåer. Hvis inhibitor-titeren er lav nok kan pasienter behandles ved å øke dosen av faktor VIII. Imidlertid er ofte inhibitor-titeren så høy at den ikke kan overvinnes med faktor VIII. En alternativ strategi er å omgå behovet for faktor VIII ved normal hemostase ved anvendelse av faktor IX-kompleks-preparater (for eksempel KONYNE<®>, Proplex<®>) eller rekombinant human faktor Vila. I tillegg, ettersom svin-faktor VIII vanligvis har vesentlig mindre reaktivitet med inhibitorer enn human faktor VIII, har et delvis renset svin-faktor VIII-preparat (HYATE:C<®>) vært anvendt. Mange pasienter som har utviklet hemmende antistoffer mot human faktor VIII er med hell behandlet med svin-faktor VIII og har tolerert slik behandling over lange tidsperioder. Imidlertid er administrering av svin-faktor VIII ikke en fullstendig løsning fordi inhibitorer kan utvikles mot svin-faktor VIII etter én eller flere infusjoner hos noen pasienter.

Mange preparater av human plasma-avledet faktor VIII med varierende grader av renhet er tilgjengelige kommersielt for behandling av hemofili A. Disse omfatter en delvis renset faktor VIII avledet fra samlet blod fra mange donorer som er varme- og detergent-behandlet for virus, men inneholder et betydelig nivå av antigene proteiner; en monoklonalt antistoff-renset faktor VIII som har lavere nivåer av antigene urenheter og viral forurensning; og rekombinant human faktor VIII, for hvilke kliniske forsøk er igang. Uheldigvis er human faktor VIII ustabil i fysiologiske konsentrasjoner og pH, er til stede i blod i en ekstremt lav konsentrasjon (0,2 ug/ml plasma) og har lav spesifikk koaguleringsaktivitet. Offentlige helsehensyn angående risiko for virus eller andre blodbårede forurensninger har begrenset anvendeligheten av svin-faktor VIII renset fra svineblod.

Hemofilipasienter krever daglig tilføring av faktor VIII for å forhindre blødning og resulterende deformerende hemofil artropati. Imidlertid er forsyninger utilstrekkelige og problemer ved terapeutisk anvendelse forekommer på grunn av vanskelighet med isolering og rensning, immunogenisitet og nødvendigheten av fjerning av AIDS- og hepatitt-infektivitetsrisiko. Anvendelse av rekombinant human faktor VIII eller delvis renset svin-faktor VIII vil ikke løse alle problemene.

Problemene forbundet med den vanlig anvendte, kommersielt tilgjengelige, plasma-avledede faktor VIII har betydelig stimulert interessen for utvikling av et bedre faktor Vlll-produkt. Det er et behov for et kraftigere faktor Vlll-molekyl slik at flere enheter av koaguleringsaktivitet kan leveres pr. molekyl; et faktor Vlll-molekyl som er stabilt ved en valgt pH og fysiologisk konsentrasjon; et faktor Vlll-molekyl som er mindre tilbøyelig til å forårsake produksjon av hemmende antistoffer; og et faktor Vlll-molekyl som unngår immundeteksjon hos pasienter som allerede har fått antistoffer mot human faktor VIII.

Det er derfor et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en modifisert svin-faktor VIII.

Denne modifiserte svin-faktor VIII korrigerer hemofili hos en pasient som mangler faktor VIII eller som har inhibitorer mot human faktor VIII,den er stabil ved en valgt pH og fysiologisk konsentrasjon, den har større koagulerende aktivitet enn human faktor VIII, og mindre antistoff blir produsert mot denne faktor.

Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en metode for fremstilling av rekombinant svin-faktor VIII og spesifikt modifisert svin-faktor VIII.

Bestemmelsen av hele DNA-sekvensen som koder for svin-faktor VIII angitt her har tillatt, for første gang, syntese av full-lengde svin-faktor VIII ved å uttrykke DNA som koder for svin-faktor VIII i en egnet vertscelle. Renset rekombinant svin-faktor VIII er beskrevet. DNA som koder for hvert domene av svin-faktor VIII så vel som hvilket som helst spesifisert fragment derav, kan uttrykkes tilsvarende. Videre er svin-fVIII som har hele eller en del av B-domenet deletert (B-domeneløs svin-fVIII) gjort tilgjengelig som del av foreliggende oppfinnelse, ved ekspresjon av DNA som koder for svin-fVIII som har en delesjon av én eller flere kodoner i B-domenet.

Det tilveiebringes også farmasøytiske preparater. Behandling av pasienter som har faktor Vlll-defekt omfatter administrering av rekombinant svin-faktor VIII eller en modifisert rekombinant svin-faktor VIII, spesielt en B-domeneløs svin-faktor VIII.

Oppfinnelsen vedrører således en DNA, som er kjennetegnet ved at den koder for aminosyresekvensen av POL1212 som angitt i SEKV ID NR:38.

Videre vedrører oppfinnelsen en ekspresjonsvektor, som er kjennetegnet ved at den omfatter DNA ifølge krav 1 eller krav 2.

Oppfinnelsen vedrører også en modifisert svin-faktor VIII, som er kjennetegnet ved at den har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:38.

Oppfinnelsen vedrører også et farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved at det omfatter modifisert svin-faktor VIII ifølge krav 4 og en fysiologisk akseptabel bærer.

Oppfinnelsen vedrører også en metode for å produsere modifisert svin-faktor Vlll-protein som har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:38, som er kjennetegnet ved at den omfatter å uttrykke i en pattedyr-vertcelle DNA ifølge krav 1.

Endelig vedrører oppfinnelsen en vertcelle, som er kjennetegnet ved at den inneholder og replikerer en ekspresjonsvektor omfattende DNA ifølge krav 1.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig.1A-1H gir sammen en oppstilt sekvenssammenligning av human-, svin- og mus-faktor Vlll-syresekvenser.

Hvis ikke på annen måte spesifisert eller angitt betyr "faktor VIM" som anvendt her, hvilket som helst funksjonelt faktor VIIl-proteinmolekyl fra hvilket som helst pattedyr.

Som anvendt her omfatter "pattedyr-faktor VIM" faktor VIII med en aminosyresekvens avledet fra hvilket som helst ikke-humant pattedyr, hvis ikke på annen måte spesifisert. "Dyr", som anvendt her, angir svin og andre ikke-humane pattedyr.

Et "fusjonsprotein" eller "fusjons-faktor VIII eller fragment derav", som anvendt her, er produktet av et hybridgen hvor den kodende sekvensen for ett protein er endret, for eksempel ved å koble en del av den til den kodende sekvensen for et annet protein fra et forskjellig gen i korrekt leserammeregister slik at uavbrutt transkripsjon og translasjon av de koblede segmenter kan skje, for å produsere et hybridgen som koder for fusjonsproteinet.

En "tilsvarende" nukleinsyre eller aminosyre eller sekvens av hver, som anvendt her, er én som er til stede ved et sete i et faktor Vlll-molekyl eller fragment derav som har samme struktur og/eller funksjon som et sete i faktor Vlll-molekylet fra en annen art, selv om nukleinsyre- eller aminosyre-tall ikke er identiske. En DNA-sekvens "svarende til" en annen faktor Vlll-sekvens svarer hovedsakelig til en slik sekvens og hybridiserer til sekvensen av den angitte SEKV ID NR. under stringente betingelser. En DNA-sekvens "svarende til" en annen faktor Vlll-sekvens omfatter også en sekvens som resulterer i ekspresjon av en faktor VIII eller fragment derav og ville hybridisere til den angitte SEKV ID NR. bortsett fra overfloden av den genetiske koden.

En "unik" aminosyrerest eller sekvens, som anvendt her, angir en aminosyresekvens eller -rest i faktor Vlll-molekylet til én art som er forskjellig fra den homologe rest eller sekvens i faktor Vlll-molekylet til en annen art.

"Spesifikk aktivitet," som anvendt her, angir aktiviteten som vil korrigere koaguleringsdefekten i human faktor VIIl-defekt plasma. Spesifikk aktivitet blir målt i enheter av koaguleringsaktivitet pr. milligram totalt faktor Vlll-protein i et standardforsøk hvor koaguleringstiden for human faktor Vlll-defekt plasma blir sammenlignet med den for normalt humant plasma. Én enhet av faktor VIII-aktivitet er aktiviteten til stede i én milliliter normalt humant plasma. Jo kortere tiden for klumpdannelse er i forsøket, desto større er aktiviteten til faktor VIII som blir undersøkt. Svin-faktor VIII har koaguleringsaktivitet i et human faktor Vlll-forsøk.

"Ekspresjon" angir det sett av prosesser som skjer hvorved genetisk informasjon blir anvendt for å gi et produkt. DNA som koder for aminosyresekvensen av svin-faktor VIII kan "uttrykkes" i en pattedyr-vertscelle for å gi svin-faktor Vlll-protein. Materialene, de genetiske strukturer, vertsceller og betingelser som tillater at ekspresjon av en gitt DNA-sekvens skjer er velkjent på området og kan manipuleres for å påvirke tiden og mengden av ekspresjon, så vel som intra- eller ekstra-cellulær lokasjon av det uttrykte protein. Ved for eksempel å inkludere DNA som koder for et signalpeptid ved 5-enden av DNA som koder for svin-faktor VIII (idet 5-enden, ved konvensjon, er den enden som koder for NH2-terminus av proteinet) blir det uttrykte protein eksportert fra det indre av vertscellen til dyrkningsmediet. Å tilveiebringe et

signalpeptid-kodende DNA i kombinasjon med det svin-faktor VIIl-kodende DNA er fordelaktig fordi den uttrykte faktor VIII blir eksportert til dyrkningsmediet, hvilket forenkler renseprosessen. Et foretrukket signalpeptid er et pattedyr-faktor Vlll-signalpeptid.

Human faktor VIII cDNA-nukleotid og antatte aminosyresekvenser er vist i henholdsvis SEKV ID NR:1 og 2. Faktor VIII blir syntetisert som et omtrent 300 kDa enkelkjede protein med indre sekvenshomologi som definerer "domene"-sekvensen NH2-A1-A2-B-A3-CI-C2-COOH. I et faktor Vlll-molekyl er et "domene", som anvendt her, en kontinuerlig sekvens av aminosyrer som er definert av indre aminosyresekvensidentitet og seter for proteolytisk spaltning med trombin. Hvis ikke på annen måte spesifisert, omfatter faktor VIII-domener de følgende aminosyrerester, når sekvensene er oppstilt med den humane aminosyresekvens (SEKV ID NR:2): A1, rester Ala1-Arg372; A2, rester Ser373-Arg740; B, rester Ser741-Arg1648; A3, rester Ser1690-lle2032; C1, rester Arg2033-Asn2172; C2, rester Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2-sekvensen omfatter rester Ser1690-Tyr2332. Det resterende segment, rester Glu1649-Arg1689, blir vanligvis referert til som faktor VIII lettkjede-aktiveringspeptid. Faktor VIII blir proteolytisk aktivert av trombin eller faktor Xa, som dissosierer den fra von Willebrand faktor, og danner faktor Villa, som har en prokoagulerende funksjon. Den biologiske funksjonen av faktor Villa er å øke den katalytiske effektivitet av faktor IXa mot faktor X-aktivering med mange størrelsesordener. Trombin-aktivert faktor Villa er en 160 kDa A1/A2/A3-C1-C2 heterotrimer som danner et kompleks med faktor IXa og faktor X på overflaten av blodplater eller monocytter. Et "partielt domene" som anvendt her er en kontinuerlig sekvens av aminosyrer som utgjør del av et domene.

"Subenheter" av faktor VIII fra mennesker eller dyr, som anvendt her, er tung- og lett-kjeder av proteinet. Tungkjeden av faktor VIII inneholder tre domener, A1, A2 og B. Lettkjeden av faktor VIII inneholder også tre domener, A3, C1 og C2.

Betegnelsene "epitop," "antigensete," og "antigendeterminant," som anvendt her, blir anvendt synonymt og er definert som en del av menneske-eller dyr-faktor VIII eller fragment derav som spesifikt blir gjenkjent av et antistoff. Det kan bestå av hvilket som helst antall aminosyrerester og kan være avhengig av den primære, sekundære eller tertiære struktur av proteinet.

Betegnelsen "immunogent sete," som anvendt her, er definert som en region av menneske- eller dyr-faktor VIII eller fragment derav, som spesifikt fremkaller produksjon av antistoff mot faktor VIII eller fragment, hos et menneske eller dyr, som målt ved rutineprotokoller, så som immunoassay, f.eks. ELISA- eller Bethesda-assay, beskrevet her. Det kan bestå av hvilket som helst antall aminosyrerester og det kan være avhengig av den primære, sekundære eller tertiære struktur av proteinet. I noen utførelsesformer er hybrid eller hybridekvivalent faktor VIII eller fragment derav ikke-immunogent eller mindre immunogent for et dyr eller menneske enn human- eller svin-faktor

VIII.

"Faktor VIIl-defekt," som anvendt her, omfatter mangel på koaguleringsaktivitet forårsaket av produksjon av defekt faktor VIII, av utilstrekkelig eller ingen produksjon av faktor VIII eller av delvis eller total hemning av faktor VIII av inhibitorer. Hemofili A er en type av faktor Vlll-defekt som er et resultat av en defekt i et X-bundet gen og fravær eller defekt ved faktor Vlll-proteinet det koder for.

Som anvendt her omfatter "diagnostisk forsøk" forsøk som på noen måte anvender antigen-antistoff-interaksjon for å detektere og/eller kvantifisere mengden av et spesielt antistoff som er til stede i en testprøve for å assistere i seleksjon av medisinske terapier. Mange slike forsøk er kjent for fagfolk på området. Som anvendt her kan human-, svin- eller modifisert svin-faktor VIII DNA eller fragment derav og protein uttrykt derfra, helt eller delvis erstatte de tilsvarende reagenser i ellers kjente forsøk, hvorved det modifiserte forsøket kan anvendes for å detektere og/eller kvantifisere antistoffer mot faktor VIII. Det er anvendelse av disse reagenser, faktor VIII DNA eller fragment derav eller protein uttrykt derfra, som tillater modifikasjon av kjente forsøk for deteksjon av antistoffer mot menneske- eller dyr-faktor VIII. Slike forsøk omfatter, men er ikke begrenset til ELISA, immunodiffussjonsforsøk og immunoblot. Egnede metoder for å praktisere hvilket som helst av disse forsøk er kjent for fagfolk på området. Som anvendt her kan faktor VIII eller fragmentet derav som omfatter minst én epitop av proteinet, anvendes som diagnostisk reagens. Eksempler på andre forsøk hvor human-, svin- eller modifisert svin-faktor VIII eller et fragment derav kan anvendes, omfatter Bethesda-forsøk og antikoaguleringsforsøk.

Betegnelsen "DNA som koder for et protein, så som svin-faktor VIM" betyr en polydeoksynukleinsyre hvis nukleotidsekvens omfatter kodende informasjon til en vertscelle for aminosyresekvensen av proteinet, f.eks. svin-faktor VIII, i henhold til de kjente relasjoner av den genetiske kode.

"Ekspresjonsproduktet" av DNA som koder for en menneske- eller dyr-faktor VIII eller en modifisert faktor VIII er produktet oppnådd fra ekspresjon av det angitte DNA i en egnet vertscelle, omfattende slike trekk som pre- eller post-translasjonell modifikasjon av protein kodet for av det angitte DNA, omfattende men ikke begrenset til glykosylering, proteolytisk spaltning og lignende. Det er kjent på området at slike modifikasjoner kan forekomme og kan avvike noe avhengig av vertscelletype og andre faktorer og kan resultere i molekylære isoformer av produktet, med bibehold av prokoagulerende aktivitet. Se f.eks. Lind, P. et al., Eur. J. Biochem. 232:1927 (1995).

En "ekspresjonsvektor" er et DNA-element, ofte med sirkulær struktur, som har evnen til å replikere autonomt i en ønsket vertscelle eller til å integrere inn i et vertscelle-genom og som også har visse velkjente trekk som tillater ekspresjon av kodende DNA innsatt i vektorsekvensen ved korrekt sete og i korrekt orientering. Slike trekk kan omfatte, men er ikke begrenset til, én eller flere promoter-sekvenser for å dirigere transkripsjonsinitiering av det kodende DNA og andre DNA-elementer så som enhancere, polyadenyleringsseter og lignende, alle velkjent på området. Betegnelsen "ekspresjonsvektor" blir anvendt for å betegne både en vektor som har en DNA-kodende sekvens som skal uttrykkes innsatt i dens sekvens og en vektor som har de ønskede ekspresjonskontroll-elementer slik arrangert med hensyn til et insersjonssete at det kan tjene til å uttrykke hvilken som helst kodende DNA innsatt i setet, alt som velkjent på området. Således kan for eksempel en vektor som mangler en promoter bli en ekspresjonsvektor ved insersjon av en promoter kombinert med kodende DNA.

U.S. patent 5,364,771 har beskrevet oppdagelse av hybride human/svin-faktor VIM-molekyler som har koagulerende aktivitet, hvor elementer av faktor

Vlll-molekylet fra menneske eller gris erstatter tilsvarende elementer av faktor Vlll-molekylet fra andre arter. U.S. patent 5,663,060 beskriver prokoagulerende hybride menneske/dyr og hybride ekvivalente faktor VIII-molekyler, hvor elementer av faktor Vlll-molekylet fra én art er erstattet med tilsvarende elementer av faktor Vlll-molekylet fra andre arter.

Siden aktuell informasjon indikerer at B-domenet ikke har noen hemmende epitop og har ingen kjent effekt på faktor Vlll-funksjon, blir i noen utførelsesformer B-domenet helt eller delvis deletert i de aktive hybrid- eller hybridekvivalent-faktor Vlll-molekyler eller fragmenter derav ("B(-) faktor VIM") fremstilt ved hvilken som helst av metodene beskrevet her.

Det humane faktor VIIl-genet ble isolert og uttrykt i pattedyrceller, som angitt av Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. et al.(1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood, W.l. et al.

(1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. et al. (1984) Nature 312:337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; U.S. patent nr. 4,757,006 og aminosyresekvensen ble utledet fra cDNA. U.S. patent nr. 4,965,199 til Capon et al. beskriver en rekombinant DNA-metode for produksjon av faktor VIII i pattedyr-vertsceller og rensning av human faktor VIII. Human faktor VIM-ekspresjon i CHO (Kinesisk hamster eggstokk) celler og BHKC (babyhamster nyreceller) er rapportert. Human faktor VIII er modifisert for å deletere en del av eller hele B-domenet (U.S. patent nr. 4,868,112) og erstatning av human faktor VIll-B-domene med human faktor V-B domene er forsøkt (U.S. patent nr. 5,004,803). cDNA-sekvensen som koder for human faktor VIII og antatt aminosyresekvens er vist i henholdsvis SEKV ID NR:1 og 2. I SEKV ID NR:1 begynner den kodende region ved nukleotid-posisjon 208, idet tripletten GCC er kodonet for aminosyrenummer 1 (Ala) av det modne protein som gitt i SEKV ID NR:2.

Svin-faktor VIII er isolert fra plasma [Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:5941. Partiell aminosyresekvens av svin-faktor VIII svarende til deler av den N-terminale lettkjedesekvens som har homologi med ceruloplasmin og koaguleringsfaktor V er beskrevet av Church et al. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312:342-347 har beskrevet partiell sekvensering av den N-terminale ende av fire aminosyrefragmenter av svin-faktor VIII, men karakteriserte ikke fragmentene når det gjaldt deres posisjoner i faktor Vlll-molekylet. Aminosyresekvensen av B- og del av A2-domenene i svin-faktor VIII er angitt av Toole, J.J. et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei, USA 83:5939-5942. cDNA-sekvensen som koder for det fullstendige A2-domene av svin-faktor VIII og antatt aminosyresekvens og hybrid human/svin-faktor VIII som har substitusjoner i alle domener, alle subenheter og spesifikke aminosyresekvenser er beskrevet i U.S. patent 5,364,771 betegnet "Hybrid Human/Porcine factor VIM" bevilget 15. november 1994 og i WO 93/20093 publisert 14. oktober 1993. cDNA-sekvensen som koder for A2-domenet av svin-faktor VIII svarende til rester 373-740 i moden human faktor VIII, som vist i SEKV ID NR:1 og den antatte aminosyresekvens er vist i henholdsvis SEKV ID NR: 3 og 4. Senere er nukleotidet og tilsvarende aminosyresekvenser av del av A1 -domenet som mangler de første 198 aminosyrer og A2-domenet av svin-faktor VIII angitt i WO 94/11503, publisert 26. mai 1994. Hele nukleotidsekvensen som koder for svin-faktor VIII, omfattende det fullstendige A1-domenet, aktiveringspeptid, A3-, C1- og C2-domener, så vel som den kodede aminosyresekvens, ble til slutt oppnådd av Lollar, som beskrevet i U.S. patent 5,859,204, bevilget 12. januar 1999 og i WO 97/49725, publisert 31. desember 1997.

Både svin- og human-faktor VIII blir isolert fra plasma som et to-subenhet protein. Subenhetene, kjent som tungkjeden og lettkjeden, blir holdt sammen av en ikke-kovalent binding som krever kalsium eller andre divalente metallioner. Tungkjeden av faktor VIII inneholder tre domener, A1, A2 og B, som er bundet kovalent. Lettkjeden av faktor VIII inneholder også tre domener, betegnet A3, C1 og C2. B-domenet har ingen kjent biologisk funksjon og kan fjernes eller delvis fjernes fra molekylet proteolytisk eller ved rekombinante DNA-teknologimetoder uten noen betydelig endring i noen målbar parameter av faktor VIII. Human rekombinant faktor VIII har en lignende struktur og funksjon som plasma-avledet faktor VIII, selv om det ikke blir glykosylert hvis ikke uttrykt i pattedyrceller.

Både human og svin aktivert faktor VIII ("faktor Villa") har tre subenheter på grunn av spaltning av tungkjeden mellom A1- og A2-domenene. Denne struktur er betegnet A1/A2/A3-C1-C2. Human faktor Villa er ikke stabil under betingelsene som stabiliserer svin-faktor Villa, antagelig på grunn av den svakere assosiering av A2-subenheten av human faktor Villa. Dissosiering av A2-subenheten av human- og svin-faktor Villa er forbundet med tap av aktivitet i faktor VIIIa-molekylet. Yakhyæv, A. et al. (1997) Blood 90:Suppl. 1, Abstract #126, anga binding av A2-domenet med lavdensitet lipoprotein-reseptor-beslektet protein, hvilket indikerer at cellulært opptak av A2 mediert av slik binding virker til å nedregulere faktor Vlll-aktivitet.

Ekspresjon av "B-domeneløs faktor VIM" blir forbedret ved å inkludere deler av B-domenet. Inklusjon av de deler av B-domenet betegnet "SQ" [Lind, P. et al. (1995) supra] ble angitt å resultere i fordelaktig ekspresjon. "SQ"-konstruksjoner mangler alle det humane B-domene bortsett fra 5 aminosyrer av B-domene N-terminus og 9 aminosyrer av B-domene C-terminus.

Den rensede hybride faktor VIII eller et fragment derav kan undersøkes for immunoreaktivitet og koaguleringsaktivitet ved standard forsøk omfattende for eksempel det plasmafrie faktor Vlll-forsøk, ett-trinns koaguleringsforsøk og enzym-bundet immunosorbent-forsøk ved anvendelse av renset rekombinant human faktor VIII som en standard.

Andre vektorer, omfattende både plasmid og eukariote virale vektorer, kan anvendes for å uttrykke en rekombinant genkonstruksjon i eukariote celler avhengig av preferansen og bedømmelsen til en fagmann (se for eksempel Sambrook et al., kap. 16). Andre vektorer og ekspresjonssystemer, omfattende bakterie-, gjær- og insekt-celle-systemer, kan anvendes, men er ikke foretrukket på grunn av forskjeller i eller mangel på, glykosylering.

Rekombinant faktor Vlll-protein kan uttrykkes i en rekke celler vanlig anvendt for kultur og rekombinant pattedyr-proteinekspresjon. Spesielt er flere gnager-cellelinjer funnet å være spesielt anvendelige verter for ekspresjon av store proteiner. Foretrukne cellelinjer, tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, omfatter babyhamster-nyreceller og kinesisk hamster eggstokk- (CHO) celler som blir dyrket ved anvendelse av rutinemessige prosedyrer og medier.

Basis for den større koagulerende aktivitet til svin-faktor VIII synes å være den raskere spontane dissosiering av den humane A2-subenhet fra human faktor Villa enn svin A2-subenheten fra svin-faktor Villa. Dissosiering av A2-subenheten fører til tap av aktivitet, [Lollar, P. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, P.J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-132501.

Faktor VIIl- molekvler med redusert immunoreaktivitet:

Epitoper som er immunoreaktive med antistoffer som hemmer den koagulerende aktiviteten til faktor VIII ("inhibitorer" eller "hemmende antistoffer") erkarakterisertbasert på kjente struktur-funksjon-relasjoner i faktor VIII. Antagelig kunne inhibitorer virke ved å avbryte hvilke som helst av de makromolekylære interaksjoner forbundet med domenestrukturen av faktor VIII eller dens assosieringer med von Willebrand faktor, trombin, faktor Xa, faktor IXa eller faktor X. Imidlertid virker de fleste hemmende antistoffer mot human faktor VIII, ved å binde til epitoper lokalisert i 40 kDa A2-domenet eller 20 kDa C2-domenet av faktor VIII, og avbryte spesifikke funksjoner assosiert med disse domener, som beskrevet av Fulcher et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei USA 82:7728-7732; og Scandella et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6152-6156. I tillegg til A2- og C2-epitoper kan det være en tredje epitop i A3- eller C1-domenet av lettkjeden i faktor VIII, i henhold til Scandella et al.

(1993) Blood 82:1767-1775. Betydningen av denne antatte tredje epitop er ukjent, men den synes å forklare en mindre fraksjon av epitopreaktiviteten i faktor VIII.

Anti-A2-antistoffer blokkerer faktor X-aktivering, som vist av Lollar et al.

(1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Tidligere kartleggingsundersøkelser ved delesjonsmutagenese beskrevet av Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3:703-716, lokaliserte A2-epitopen til en 20 kDa region av den NH2-terminale ende av 40 kDa A2-domenet. Kompetitive immunoradiometriske forsøk har vist at A2-inhibitorer gjenkjenner enten en vanlig epitop eller tett clustrede epitoper, som beskrevet av Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67:665-671 og som demonstrert i U.S. patent 5,859,204.

Dyr- eller modifiserte dyr-faktor Vlll-molekyler kan testes på mennesker for deres reduserte antigenisitet og/eller immunogenisitet i kliniske forsøk. I én type forsøk, utformet for å bestemme hvorvidt faktor VIII er immunoreaktiv med hemmende antistoffer, blir faktor VIII administrert, fortrinnsvis ved intravenøs infusjon, til omtrent 25 pasienter som har faktor Vlll-defekt som har antistoffer som hemmer den koagulerende aktiviteten til terapeutisk human faktor VIII. Dosen av dyr- eller modifisert dyr-faktor VIII er i et område mellom 5 og 50 enheter/kg kroppsvekt, fortrinnsvis 10-50 enheter/kg og mest foretrukket 40 enheter/kg kroppsvekt. Omtrent 1 time etter hver administrering blir gjenvinning av faktor VIII fra blodprøver målt i et ett-trinns koaguleringsforsøk. Prøver blir tatt igjen omtrent 5 timer etter infusjon og gjenvinning blir målt. Total gjenvinning og hastigheten for forsvinning av faktor VIII fra prøvene er forutsigende for antistoff-titeren og hemmende aktivitet. Hvis antistoff-titeren er høy kan faktor Vlll-gjenvinning vanligvis ikke måles. Gjenvinningsresultatene blir sammenlignet med gjenvinningsresultatene hos pasienter behandlet med plasma-avledet human faktor VIII, rekombinant human faktor VIII, plasma-avledet svin-faktor VIII og andre vanlig anvendte terapeutiske former av faktor VIII eller faktor Vlll-substitutter.

Etter identifikasjon av klinisk betydningsfulle epitoper kan rekombinante faktor Vlll-molekyler uttrykkes som har mindre enn eller lik kryss-reaktivitet sammenlignet med plasma-avledet svin-faktor VIII når testet in vitro mot et bredt omfang av inhibitor-plasma. Ytterligere mutagenese i epitopregioner kan utføres for å redusere kryssreaktivitet. Redusert kryssreaktivitet, selv om ønskelig, er ikke nødvendig for å produsere et produkt som kan ha fordeler over eksisterende plasma-avledet svin-faktor VIIl-konsentrat, som kan gi bivirkninger på grunn av forurensende svineproteiner eller forurensende infeksiøse agenser så som virus eller prioner. Et rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor Vlll-molekyl vil ikke inneholde fremmede svineproteiner.

Diagnostiske forsøk.

Faktor VIII-cDNA og/eller protein uttrykt derfra kan, helt eller delvis, anvendes i forsøk som diagnostiske reagenser for deteksjonen av hemmende antistoffer for menneske- eller dyr-faktor VIII eller modifiserte dyr VIII i substrater, omfattende for eksempel prøver av serum og kroppsvæsker fra humane pasienter med faktor Vlll-defekt. Disse antistoff-forsøk omfatter forsøk så som ELISA-assay, immunoblot, radioimmunoforsøk, immunodiffusjonsforsøk og forsøk på faktor VIII biologisk aktivitet (f.eks. ved koaguleringsforsøk). Teknikker for fremstilling av disse reagenser og metoder for anvendelse derav er kjent for fagfolk på området. For eksempel kan en immunoassay for deteksjon av hemmende antistoffer i en pasient-serumprøve omfatte reaksjon av testprøven med en tilstrekkelig mengde av faktor VIII som skal testes til at et detekterbart kompleks kan dannes med de hemmende antistoffer i prøven at test-faktor VIII virkelig er antigen.

Nukleinsyre- og aminosyre-prober kan fremstilles basert på sekvensen av det hybride faktor VIII-cDNA eller proteinmolekyl eller fragmenter derav. I noen utførelsesformer kan disse merkes ved anvendelse av fargestoffer eller enzymatiske, fluorescerende, kjemiluminescerende eller radioaktive merker som er kommersielt tilgjengelige. Aminosyre-probene kan anvendes, for eksempel for screening av sera eller andre kroppsvæsker hvor tilstedeværelse av inhibitorer for human-, dyr- eller hybrid human/dyr-faktor VIII er mistenkt. Nivåer av inhibitorer kan kvantifiseres hos pasienter og sammenlignes med friske kontroller og kan anvendes, for eksempel til å bestemme hvorvidt en pasient med en faktor Vlll-defekt kan behandles med en dyr- eller modifisert dyr-faktor VIII. cDNA-probene kan anvendes for eksempel for forsknings-formål ved screening av DNA-biblioteker.

Farmasøytiske preparater.

Farmasøytiske preparater inneholdende rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII, alene eller i kombinasjon med passende farmasøytiske stabiliseringsforbindelser, leveringskonstituenter og/eller bærerkonstituenter, blir fremstilt i henhold til kjente metoder, som beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin.

De foretrukne bærere eller leverings-konstituenter for intravenøs infusjon er fysiologisk saltvann eller fosfatbufret saltvann.

Egnede stabiliserings-forbindelser, leveringskonstituenter og bærerkonstituenter inkluderer, men er ikke begrenset til, andre menneske- eller dyreproteiner så som albumin.

Fosfolipid-vesikler eller liposomale suspensjoner er også foretrukket som farmasøytisk akseptable bærere eller leveringskonstituenter. Disse kan fremstilles i henhold til metoder kjent for fagfolk på området og kan inneholde, for eksempel fosfatidylserin/-fosfatidylcholin eller andre preparater av fosfolipider eller detergenter som sammen gir en negativ ladning til overflaten, siden faktor VIII binder til negativt ladede fosfolipidmembraner. Liposomer kan fremstilles ved oppløsning av passende lipid(er) (så som stearoylfosfatidyl-etanolamin, stearoylfosfatidyl-cholin, arachadoylfosfatidyl-cholin og kolesterol) i et uorganisk løsningsmiddel som deretter blir inndampet, og etterlater en tynn film av tørket lipid på overflaten av beholderen. En vandig løsning av den hybride faktor VIII blir deretter innført i beholderen. Beholderen blir deretter virvlet manuelt for å frigjøre lipid materiale fra sidene av beholderen og for å dispergere lipidaggregater og derved danne den liposomale suspensjon.

Rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII kan kombineres med andre egnede stabiliseringsforbindelser, leveringskonstituenter og/eller bærerkonstituenter, omfattende vitamin K-avhengig koaguleringsfaktorer, vevfaktor og von Willebrand faktor (vWf) eller et fragment av vWf som inneholder faktor Vlll-bindingssetet og polysakkarider så som sukrose.

Rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII kan også leveres ved genterapi på samme måte som human faktor VIII kan leveres, ved anvendelse av leveringsmidler så som retrovirale vektorer. Denne metoden består av innføring av det ønskede faktor VIIl-konstruksjon cDNA i humane celler som er transplantert direkte inn i en faktor Vlll-defekt pasient eller som blir plassert i en implanterbar anordning, permeabel for faktor VIIl-molekylene, men impermeable for celler, som deretter blir transplantert. Den foretrukne metode vil være retroviral-mediert genoverføring. Ved denne metoden blir et eksogent gen (f.eks. et faktor VIII-cDNA) klonet inn i genomet til et modifisert retrovirus. Genet blir innsatt i genomet til vertscellen ved viralt maskineri hvor det vil bli uttrykt av cellen. Den retrovirale vektor blir modifisert slik at den ikke vil produsere virus, for å forhindre viral infeksjon hos verten. De generelle prinsipper for denne type terapi er kjent for fagfolk på området og er gjennomgått i litteraturen [f.eks. Kohn, D.B. et al. (1989) Transufusion 29:812-820].

Svin- eller modifisert svin-faktor VIII kan lagres bundet til vWf for å øke halveringstiden og lagringstiden for det hybride molekyl. I tillegg kan lyofilisering av faktor VIII forbedre utbyttene av aktive molekyler i nærvær av vWf. Gjeldende metoder for lagring av human- og dyr-faktor VIII anvendt av kommersielle leverandører kan anvendes for lagring av rekombinant faktor VIII. Disse metoder omfatter: (1) lyofilisering av faktor VIII i en delvis renset tilstand (som et faktor VIII-"konsentrat" som blir infusert uten ytterligere rensning); (2) immunoaffinitetsrensning av faktor VIII ved Zimmerman-metoden og lyofilisering i nærvær av albumin, som stabiliserer faktor VIII; (3) lyofilisering av rekombinant faktor VIII i nærvær av albumin.

I tillegg er svin- eller modifisert svin-faktor VIII funnet å være stabil i det uendelige ved 4°C i 0,6 M NaCI, 20 mM MES og 5 mM CaCI2ved pH 6,0 og kan også lagres frosset i disse buffere og tines med minimalt tap av aktivitet.

Metoder for behandling.

Rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII blir anvendt for å behandle ukontrollert blødning på grunn av faktor Vlll-defekt (f.eks. intraartikulær, intrakraniell eller gastrointestinal blødning) hos hemofilipasienter med og uten hemmende antistoffer og hos pasienter med ervervet faktor Vlll-defekt på grunn av utvikling av hemmende antistoffer. De aktive materialer blir fortrinnsvis administrert intravenøst.

I tillegg kan rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII administreres ved transplantasjon av celler genetisk konstruert for å produsere proteinet ved implantasjon av en anordning inneholdende slike celler, som beskrevet ovenfor.

Foretrukket blir farmasøytiske preparater av rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII alene eller i kombinasjon med stabiliseringsmidler, leveringskonstituenter og/eller bærere, infusert til pasienter intravenøst i henhold til samme prosedyre som blir anvendt for infusjon av human- eller dyr-faktor VIII.

Behandlingsdosene av rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII-preparat som skal administreres til en pasient med behov for slik behandling, vil variere avhengig av alvorlighetsgraden av faktor Vlll-defekten. Generelt blir dosenivå regulert i hyppighet, varighet og enheter i henhold til alvorlighetsgraden og varigheten av hver pasients blødningsepisode. Følgelig blir faktor VIII inkludert i en farmasøytisk akseptabel bærer, leveringskonstituent eller stabilisator i en mengde tilstrekkelig til å levere til en pasient, en terapeutisk effektiv mengde av proteinet til å stanse blødningen, som målt ved standard koaguleringsforsøk.

Faktor VIII er klassisk definert som den substans som er til stede i normalt blodplasma som korrigerer koaguleringsdefekten i plasma avledet fra individer med hemofili A. Den koagulerende aktiviteten in vitro av rensede og delvis-rensede former av faktor VIII blir anvendt for å beregne dosen av faktor VIII for infusjoner til humane pasienter og er en pålitelig indikator for aktivitet gjenvunnet fra pasientplasma og for korreksjon av in vivo blødningsdefekt. Det er ingen angitte avvik mellom standardforsøk med nye faktor Vlll-molekyler in vitro og deres oppførsel i hunde-infusjonsmodell eller i humane pasienter, i henhold til Lusher, J.M. et al. 328 New Engl. J. Med. 328:453-459; Pittman, D.D. et al. (1992) Blood 79:389-397; og Brinkhous et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. 82:8752-8755.

Vanligvis er det ønskede plasma-faktor Vlll-aktivitetsnivå som skal oppnås hos pasienten gjennom administrering av den rekombinante svin- eller modifisert svin-faktor VIII, i området 30-100% av normalt. Ved en foretrukket administreringsmetode av den terapeutiske faktor VIII blir preparatet gitt intravenøst i en foretrukket dose i området fra ca. 5 til 50 enheter/kg kroppsvekt, mer foretrukket i et område på 10-50 enheter/kg kroppsvekt og mest foretrukket i en dose på 20-40 enheter/kg kroppsvekt; idet intervall-hyppigheten er i området fra ca. 8 til 24 timer (for alvorlig rammede hemofilipasienter); og varigheten av behandling i dager er i området fra 1 til 10 dager eller inntil blødningsepisode er stanset. Se, f. eks. Roberts, H.R. og M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions - Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V and Factors VII to XII)," Ch. 153, 1453-1474, 1460, i Hematology, Williams, W. J., et al., ed. (1990). Pasienter med inhibitorer kan trenge en annen mengde av rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII enn deres tidligere form av faktor VIII. For eksempel kan pasienter trenge mindre rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII på grunn av dens høyere spesifikke aktivitet enn human faktor VIII og dens reduserte antistoff-reaktivitet. Som ved behandling med human- eller plasma- avledet svin-faktor VIII blir mengden av terapeutisk faktor VIII infusert bestemt ved ett-trinns faktor Vlll-koaguleringsforsøk og, i valgte tilfeller, in vivo gjenvinning blir bestemt ved å måle faktor VIII i pasientens plasma etter infusjon. Det skal forstås at for hvilken som helst spesiell pasient, må spesifikke doseregimer reguleres over tid i henhold til de individuelle behov og den profesjonelle bedømmelse av personen som administrerer eller overvåker administrering av preparatene og at konsentrasjonsområdene angitt her bare er eksempler og er ikke ment å begrense omfanget eller anvendelsen av det krevede preparat.

Behandling kan være i form av en enkel intravenøs administrering av preparatet eller periodisk eller kontinuerlig administrering over en forlenget tidsperiode, som nødvendig. Alternativt kan terapeutisk faktor VIII administreres subkutant eller oralt med liposomer i én eller flere doser med varierende tidsintervaller.

Rekombinant svin- eller modifisert svin-faktor VIII kan også anvendes for å behandle ukontrollert blødning på grunn av faktor Vlll-defekt hos hemofilipasienter som har utviklet antistoffer mot human faktor VIII. I dette tilfellet er koagulerende aktivitet som er bedre enn den til human- eller dyr-faktor VIII alene ikke nødvendig. Koagulerende aktivitet som er mindre enn den til human faktor VIII (dvs. mindre enn 3,000 enheter/mg) vil være anvendelige hvis den aktiviteten ikke blir nøytralisert av antistoffer i pasientens plasma.

Det har vært demonstrert her at rekombinant svin- og modifisert svin-faktor VIII kan avvike i spesifikk aktivitet fra human faktor VIII. Faktor VIII-proteiner som har større prokoagulerende aktivitet fra human faktor VIII er anvendelige for behandling av hemofili fordi lavere doser vil være nødvendige for å korrigere en pasients faktor Vlll-defekt. Faktor VIII som har lavere prokoagulerende aktivitet enn human faktor VIII er også egnet for terapeutisk anvendelse gitt at de har minst 1% av spesifikk aktivitet sammenlignet med normal human faktor VIII. En faktor VIII ifølge foreliggende oppfinnelse som har prokoagulerende aktivitet er derfor definert å ha minst 1 % av den spesifikke aktiviteten til human faktor VIII.

Det rekombinante svin- eller modifisert svin-faktor Vlll-molekyl og metodene for isolering, karakterisering, fremstilling og anvendelse av det generelt beskrevet ovenfor, vil forstås bedre med referanse til de følgende eksempler.

Eksempel 1: Forsøk med svin- faktor VIII og hybrid human/ svin- faktor VIII.

Svin-faktor VIII har større koagulerende aktivitet enn human faktor VIII, basert på spesifikk aktivitet til molekylet. Denne konklusjonen er basert på anvendelse av passende standardkurver som lar human svin-faktor VIII sammenlignes rettferdig. Koaguleringsforsøk er basert på evnen til faktor VIII til å korte ned koaguleringstiden for plasma tatt fra en pasient med hemofili A. To typer forsøk ble anvendt: ett-trinns og to-trinns forsøk.

I ett-trinns-forsøket ble 0,1 ml hemofili A-plasma (George King Biomedical, Inc.) inkubert med 0,1 ml aktivert partielt tromboplastin-reagens (APTT) (Organon Teknika) og 0,01 ml prøve eller standard, bestående av fortynnet, citrert normalt humant plasma, i 5 min ved 37°C i et vannbad. Inkubering ble fulgt av tilsetning av 0,1 ml 20 mM CaCb og tiden for utvikling av en fibrin-klump ble bestemt ved visuell inspeksjon.

En enhet av faktor VIII er definert som mengden til stede i 1 ml citrert normalt humant plasma. Med humant plasma som standard, ble svin- og human-faktor Vlll-aktivitet sammenlignet direkte. Fortynninger av plasma standard eller rensede proteiner ble utført i 0,15 M NaCI, 0,02 M HEPES, pH 7,4. Standardkurven ble konstruert basert på 3 eller 4 fortynninger av plasma, idet den høyeste fortynning var 1/50 og logiokoaguleringstid plottet mot logioplasmakonsentrasjon, hvilket resulterer i et lineært plot. Enhetene av faktor VIII i en ukjent prøve ble bestemt ved interpolasjon fra standardkurven.

Ett-trinns-forsøket er basert på endogenaktivering av faktor VIII med aktivatorer dannet i hemofili A-plasma, mens totrinns-forsøket måler den prokoagulerende aktivitet til preaktivert faktor VIII. I totrinns-forsøket ble prøver inneholdende faktor VIII som var reagert med trombin satt til en blanding av aktivert partiell tromboplastin og humant hemofili A-plasma som var preinkubert i 5 min. ved 37°C. De resulterende koaguleringstider ble deretter omdannet til enheter/ml, basert på samme humane standardkurve beskrevet ovenfor. Den relative aktivitet i totrinns-forsøket var høyere enn i ett-trinns-forsøket fordi faktor VIII var preaktivert.

Eksempel 2: Karakterisering av den funksjonelle forskjell mellom human- og svin- faktor VIII.

Isolering av svin- og human-plasma-avledet faktor VIII og human rekombinant faktor VIII er beskrevet i litteraturen i Fulcher, CA. et al. (1982) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:1648-1652; Toole et al. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier et al. (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar et al. 312 Nature 312:337-342 (Genentech); Fass et al. (1982) B/ood 59:594; Toole et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:5939-5942. Dette kan gjennomføres på mange måter. Alle disse preparater har lignende subenhet-sammensetning, selv om det er en funksjonell forskjell i stabilitet mellom human- og svin-faktor VIII.

For sammenligning av human rekombinant og svin-faktor VIII, ble preparater av godt renset human rekombinant faktor VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) og svin-faktor VIII [immunorenset som beskrevet i Fass et al.

(1982) B/ood 59:594] underkastet høytrykks-væskekromatografi (HPLC) over en Mono Q™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) anionebytterkolonne (Pharmacia, Inc.). Formålet med Mono Q™ HPLC-trinnet var eliminering av mindre urenheter ved utveksling av human- og svin-faktor VIII i en felles buffer for sammenligningsformål. Medisinglass inneholdende 1000-2000 enheter av faktor VIII ble rekonstituert med 5 ml H20. Hepes (2 M ved pH 7,4) ble deretter tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,02 M. Faktor VIII ble påført på en Mono Q™ HR 5/5 kolonne ekvilibrert i 0,15 M NaCI, 0,02 M Hepes, 5mM CaCI2, ved pH 7,4 (Buffer A pluss 0,15 M NaCI); vasket med 10 ml av Buffer A + 0,15 M NaCI; og eluert med en 20 ml lineær gradient, 0,15 M til 0,90 M NaCI i Buffer A med en strømningshastighet på 1 ml/min.

For sammenligning av human plasma-avledet faktor VIII (renset ved Mono Q™ HPLC) og svin-faktor VIII, ble immunoaffinitetsrenset, plasma-avledet svin-faktor VIII fortynnet 1:4 med 0,04 M Hepes, 5 mM CaCI2, 0,01% Tween-80, ved pH 7,4 og underkastet Mono Q™ HPLC under samme betingelser som beskrevet i forrige avsnitt for human faktor VIII. Disse prosedyrer for isolering av human- og svin-faktor VIII er standard for fagfolk på området.

Kolonnefraksjoner ble undersøkt for faktor Vlll-aktivitet ved et ett-trinns koaguleringsforsøk. Gjennomsnittsresultatene av forsøkene, uttrykt i enheter av aktivitet pr. A2somateriale, er gitt i Tabell II og indikerer at svin-faktor VIII har minst seks ganger større aktivitet enn human-faktor VIII når ett-trinns-forsøket blir anvendt.

Eksempel 3: Sammenligning av stabiliteten til human- og svin- faktor VIII.

Resultatene av ett-trinns-forsøket for faktor VIII reflekterer aktivering av faktor VIII til faktor Villa i prøven og muligens tap av dannet faktor Vllla-aktivitet. En direkte sammenligning av stabiliteten til human- og svin-faktor VIII ble utført. Prøver fra Mono Q™ HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) ble fortynnet til samme konsentrasjon og buffersammensetning og omsatt med trombin. På forskjellige tider ble prøver fjernet for totrinns koaguleringsforsøk. Typisk var topp-aktivitet (etter 2 min.) 10 ganger større for svin- enn human-faktor Villa og aktivitetene til både svin- og human-faktor Villa ble deretter redusert, idet human faktor Vllla-aktivitet minket raskere.

Generelt er forsøk på å isolere stabil human faktor Villa ikke vellykket, selv når betingelser som produserer stabil svin-faktor Villa blir anvendt. For å demonstrere dette ble Mono Q™ HPLC-renset human faktor VIII aktivert med trombin og underkastet Mono S™ kationebytter- (Pharmacia, Inc.) HPLC under betingelser som produserer stabil svin-faktor Villa, som beskrevet av Lollar et al. (1989) Biochemistry28:666.

Human faktor VIII, 43 ug/ml (0,2 uM) i 0,2 M NaCI, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCI2, ved pH 7,4, i 10 ml totalt volum, ble omsatt med trombin (0,036 uM) i 10 min, på hvilket tidspunkt FPR-CH2CI D-fenyl-prolyl-arginyl-klormetylketon ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,2 uM for irreversibel inaktivering av trombin. Blandingen ble deretter fortynnet 1:1 med 40 mM 2-(N-morfolino)-etansulfonsyre (MES), 5 mM CaCI2, ved pH 6,0 og fylt med 2 ml/min på en Mono S™ HF 5/5 HPLC-kolonne (Pharmacia, Inc.) ekvilibrert i 5 mM MES, 5 mM CaCI2, ved pH 6,0 (Buffer B) pluss 0,1 M NaCI. Faktor Villa ble eluert uten kolonnevasking med en 20 ml gradient fra 0,1 M NaCI til 0,9 M NaCI i Buffer B med 1 ml/min.

Fraksjonen med koagulerende aktivitet i totrinns-forsøket eluerte som en enkel topp under disse betingelsene. Den spesifikke aktiviteten til topp-fraksjonen var omtrent 7.500 U/A2ao- Natrium-dodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) av Mono S™ faktor VIIla-topp, fulgt av sølv-merking av proteinet, avslørte to bånd svarende til et heterodimert (A3-C1-C2/A1) derivat av faktor VIII. Selv om A2-fragmentet ikke ble identifisert ved sølv-merking under disse betingelsene på grunn av dets lave konsentrasjon, ble det identifisert som en spor-konstituent ved<125>l-merking.

I motsetning til resultatene med human faktor VIII, hadde svin-faktor Villa isolert ved Mono S™ HPLC under samme betingelser spesifikk aktivitet på 1,6 x 106 U/A28o- Analyse av svin-faktor Villa ved SDS-PAGE avslørte 3 fragmenter svarende til A1-, A2- og A3-C1-C2 subenheter, hvilket demonstrerer at svin-faktor Villa har tre subenheter.

Resultatene av Mono S™ HPLC av human trombin-aktivert faktor VIII-preparater ved pH 6,0 indikerer at human faktor Villa er labil under betingelser som gir stabil svin-faktor Villa. Selv om spormengder av A2-fragment ble identifisert i topp-fraksjonen, var imidlertid bestemmelse av hvorvidt den koagulerende aktiviteten resulterte fra små mengder av heterotrimer faktor Villa eller fra heterodimer faktor Villa som har lav spesifikk aktivitet, ikke mulig ved denne metoden alene.

En metode for å isolere human faktor Villa før den taper dens A2-subenhet er ønskelig for å løse dette spørsmål. For dette formål ble isolering oppnådd ved en prosedyre som involverer reduksjon av pH i Mono S™ buffere til pH 5. Mono Q™-renset human faktor VIII (0,5 mg) ble fortynnet med H20, hvilket ga et endelig preparat av 0,25 mg/ml (1 um) faktor VIII i 0,25 M NaCI, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCI2, 0,005% Tween-80, ved pH 7,4 (totalt volum 7,0 ml). Trombin ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,072 um og fikk reagere i 3 min. Trombin ble deretter inaktivert med FPR-CH2CI (0,2 um). Blandingen ble deretter fortynnet 1:1 med 40 mM natriumacetat, 5 mM CaCI2, 0,01% Tween-80, ved pH 5,0 og fylt med 2 ml/min på en Mono S™ HR 5/5 HPLC-kolonne ekvilibrert i 0,01 M natriumacetat, 5 mM CaCI2, 0,01% Tween-80, ved pH 5,0, pluss 0,1 M NaCI. Faktor Villa ble eluert uten kolonnevasking med en 20 ml gradient fra 0,1 M NaCI til 1,0 M NaCI i samme buffer med 1 ml/min. Dette resulterte i gjenvinning av koagulerende aktivitet i en topp som inneholdt detekterbare mengder av A2-fragmentet som vist ved SDS-PAGE og sølvmerking. Den spesifikke aktiviteten til toppfraksjonen var ti ganger større enn den oppnådd ved pH 6,0 (75,000 U/A28ov. 7,500 U/A28o)- I motsetning til svin-faktor Villa isolert ved pH 6,0, som er stabil ved 4<*>C i det uendelige, blir imidlertid human faktor Vllla-aktivitet redusert jevnt over en periode på flere timer etter eluering fra Mono S™. I tillegg er den spesifikke aktiviteten til faktor Villa renset ved pH 5,0 og undersøkt umiddelbart, bare 5% til den til svin-faktor Villa, hvilket indikerer at vesentlig dissosiering skjedde før forsøket.

Disse resultater demonstrerer at både human- og svin-faktor Villa er sammensatt av tre subenheter (A1, A2 og A3-C1-C2). Dissosiering av A2-subenheten er ansvarlig for tap av aktivitet for både human- og svin-faktor Villa undervisse betingelser, så som fysiologisk ionestyrke, pH og konsentrasjon. Den relative stabiliteten av svin-faktor Villa under visse betingelser er på grunn av sterkere assosiering av A2-subenheten.

Eksempel 4: Isolering og sekvensering av DNA som koder for A2- domenet av svin- faktor VIII.

Bare nukleotidsekvensen som koder for B-domenet og del av A2-domenet av svin-faktor VIII er sekvensert tidligere [Toole et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:5939-5942]. cDNA og antatte aminosyresekvenser (henholdsvis SEKV ID NR: 3 og 4) for hele svin-faktor VIII A2-domenet er beskrevet her.

Svin-faktor VIIl-A2-domenet ble klonet ved revers transkripsjon av svinemilt totalt RNA og PCR-amplifisering; idet degenererte primere basert på den kjente humane faktor VIIl-cDNA-sekvens og en nøyaktig svineprimer basert på en del av svin-faktor VIIl-sekvensen ble anvendt. Et 1 kb PCR-produkt ble isolert og amplifisert ved insersjon i en Bluescript™ (Stratagene) fagemid-vektor.

Svin-A2-domenet ble fullstendig sekvensert ved dideoksy-sekvensering. cDNA og antatte aminosyresekvenser er som beskrevet i henholdsvis SEKV ID NR: 3 og 4.

Eksempel 5: Fullstendig sekvens av DNA som koder for svin- faktor VIII.

Klenow-fragment, fosforylert Clal-linkere, Notl-linkere, T4-ligase og Taq DNA-polymerase ble anskaffet fra Promega (Madison, Wisconsin). Polynukleotid-kinase ble anskaffet fra Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. y<32>P-ATP (Redivue, >5000Ci/mmol) ble anskaffet fra Amersham. pBluescript II KS- og E. coli Epicurean XL1-Blue celler ble anskaffet fra Stratagene (La Jolla, California). Syntetiske oligonukleotider ble anskaffet fra Life Technologies, Inc. eller Cruachem, Inc. 5'-fosforylerte primere ble anvendt når PCR-produkter ble produsert for kloningsformål. Nukleotid- (nt) nummerering av oligonukleotider anvendt som primere for polymerasekjedereaksjon- (PCR) amplifisering av svin-fVIII cDNA eller genomisk DNA anvender human fVIII cDNA som referanse (Wood et al. (1984) supra).

Svinemilt total RNA ble isolert ved syre-guanidinium-tiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon [Chomczynski et al. (1987)<y>Ana/. Biochem. 162:156-1591. Svin-cDNA ble fremstilt fra total milt RNA ved anvendelse av Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (RT) og random heksamerer for å prime reaksjonen (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech) hvis ikke annet er angitt. RT-reaksjoner inneholdt 45 mM Tris-CI, pH 8,3, 68 mM KCI, 15 mM DTT, 9 mM MgCfe, 0,08 mg/ml bovint serumalbumin og 1,8 mM deoksynukleotid-trifosfat (dNTP). Svin-genomisk DNA ble isolert fra milt ved anvendelse av en standard prosedyre (Strauss, W.M. (1995) I Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, s. 2,2,1-2,2,3). Isolering av DNA fra agarosegeler ble utført ved anvendelse av Geneclean II (Bio 101) eller Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av en Hybaid OmniGene termocykler. For PCR-reaksjoner ved anvendelse av Taq DNA-polymerase, omfattet reaksjonsblandingene 0,6 mM MgCI2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 uM oligonukleotid-primere, 50 U/ml polymerase og 0,1 volum av første tråd cDNA reaksjonsblanding. Bortsett fra hvis angitt på annen måte, ble PCR-produkter gelrenset, gjort butt-endet med Klenow-frag ment, utfelt med etanol og enten ligert til EcoRV-setet av defosforylert pBluescript II KS- eller ligert med fosforylert Clal-linkere ved anvendelse av T4-ligase, fordøyet med Gal, renset ved Sephacryl S400 kromatografi og ligert til Clal-kuttet, defosforylert pBluescript II KS-. Ligeringer ble utført ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim) bortsett fra hvis annet er angitt. Insersjon-inneholdende pBluescript II KS-plasmider ble anvendt for å transformere E. coli Epicurean XL1-Blue celler.

Sekvensering av plasmid-DNA ble utført ved anvendelse av en Applied Biosystems 373a automatisert DNA-sekvenser og PRISM fargeterminator-sett eller manuelt ved anvendelse av Sequenase v. 2,0 sekvenseringssett (Amersham Corporation). Direkte sekvensering av PCR-produkter, omfattende<32>P-ende merking av oligonukleotider ble utført ved anvendelse av en cyklus-sekvenseringsprotokoll (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies).

Isolering av svin- fVIII cDNA- kloner inneholdende 5' UTR- sekvens, signalpeptid og A1 - domene- kodoner.

Svin-fVIII cDNA 5' for A2-domenet ble amplifisert ved nestet RT-PCR av hunngrismilt totalt RNA ved anvendelse av en 5' rask amplifisering av cDNA-ender (5-RACE) protokoll (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Versjon PR55453). Dette omfattet første tråd cDNA-syntese ved anvendelse av en "lock-docking" oligo(dT)-primer [Borson, N.D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2:144-148], andre tråd cDNA-syntese ved anvendelse av E. coli DNA polymerase I og ligering med en 5-forlenget dobbeltrådet adaptor, SEKV ID NR:5

5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3

S^HzN-CCCGTCCA-PCvS'

hvis korte tråd var blokkert ved 3'-enden med en aminogruppe for å redusere ikke-spesifikk PCR-priming og som var komplementær med de 8 nukleotider ved 3'-enden (Siebert, P.D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23:1087-1088). Den første runde med PCR ble utført ved anvendelse av et adaptor-spesifikt oligonukleotid, SEKV ID NR:6 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (betegnet AP1) som sense-primer, og et svin-fVIII-A2-domene-spesifikt oligonukleotid SEKV ID NR:7 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081-2104) som antisense-primer. Den andre runde med PCR ble utført ved anvendelse av et nestet, adaptor-spesifikt oligonukleotid, SEKV ID NR:8 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (betegnet AP2) som sense-primer og et nestet, svin-A2-domene-spesifikt oligonukleotid SEKV ID NR:9 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nt 1497-1520) som antisense-primer. PCR ble utført ved anvendelse av et kommersielt sett

(Advantage cDNA PCR core kit) som anvender en antistoff-mediert varm start-protokoll [Kellogg, D.E. et al. (1994) BioTechniques 16:1134-1137]. PCR-betingelser omfattet denaturering ved 94°C i 60 sek., fulgt av 30 cykler (første PCR) eller 25 cykler (andre PCR) denaturering i 30 sek. ved 94°C, hybridisering i 30 sek. ved 60°C og forlengelse i 4 min ved 68°C ved anvendelse av rør-temperaturkontroll. Denne prosedyren ga et prominent «1,6 kb produkt som var i samsvar med amplifisering av et fragment som strekker seg omtrent 150 bp inn i 5' UTR. PCR-produktet ble klonet inn i pBluescript ved anvendelse av Clal-linkere. Insersjonene av fire kloner ble sekvensert i begge retninger.

Sekvensen av disse kloner omfattet regioner svarende til 137 bp av 5'-UTR, signalpeptidet, A1-domenet og del av A2-domenet. En konsensus ble nådd i minst 3 av 4 seter. Imidlertid inneholdt klonene et gjennomsnitt på 4 tydelige PCR-dannede mutasjoner, antagelig på grunn av de multiple runder av PCR nødvendig for å danne et klonbart produkt. Derfor anvendte vi en sekvens oppnådd fra signalpeptid-regionen for å utforme en sense-tråd fosforylert PCR-primer, SEKV ID NR: 10 5-CCT CTC GAG CCA CCATGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', betegnet RENEOPIGSP, for syntese av et annet PCR-produkt for å bekrefte sekvensen og for kloning inn i en ekspresjonsvektor. Sekvensen med fete typer representerer startkodonet. Sekvensen 5' for dette representerer sekvensen identisk med den 5' for insersjonssetet i pattedyr-ekspresjonsvektor ReNeo anvendt for ekspresjon av fVIII (Lubin et al. (1994) supra). Dette sete omfatter et Xho1-spaltningssete (understreket). RENEOPIGSP og nt 1497-1520 oligonukleotidet ble anvendt for å prime en Taq DNA polymerase-mediert PCR-reaksjon ved anvendelse av hunngrismilt cDNA som templat. DNA-polymeraser fra mange andre produsenter mislyktes i å gi et detekterbart produkt. PCR-betingelser omfattet denaturering ved 94°C i fire min., fulgt av 35 cykler med denaturering i 1 min. ved 94°C, hybridisering i 2 min. ved 55°C og forlengelse i 2 min. ved 72°C, fulgt av et endelig forlengelsestrinn i 5 min. ved 72°C. PCR-produktet ble klonet inn i pBluescript ved anvendelse av Clal-linkere. Insersjonene av to av disse kloner ble sekvensert i begge retninger og matchet konsensus-sekvensen.

Isolering av svin- fVIII cDNA- kloner inneholdende A3, C1 og 5'- halvparten av C2- domene- kodonene.

Initielt ble to svinemilt RT-PCR-produkter, svarende til et B-A3-domene-fragment (nt 4519-5571) og et C1-C2-domene-fragment (nt 6405-6990) klonet. 3-enden av C2-domenet som ble oppnådd strakk seg inn i exon 26 regionen, som er det terminale exon i fVIII. B-A3-produktet ble fremstilt ved anvendelse av den svin-spesifikke B-domene-primer, SEKV ID NR:11 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG G CA AAG CTG AGT T 3', hvor den understrekede region svarer til en region i svin-fVIII som er på linje med nt 4519-4530 i human fVIII. 5-regionen av oligonukleotidet omfatter et Notl-sete som opprinnelig var ment for kloningsformål. Antisense-primeren anvendt for å danne B-A3-produktet, SEKV ID NR:12 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3' var basert på det reverse komplement av human fVIII cDNA-sekvensen ved nt 5545-5571. PCR-reaksjonen inneholdt 50 mM KCI, 10 mM Tris-CI, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCI2, 2,5 mM dNTPs, 20 uM primere, 25 enheter/ml Taq DNA polymerase og 1/20 volum av RT-reaksjonsblanding. PCR-betingelser var denaturering ved 94°C i 3 min, fulgt av 30 cykler med denaturering i 1 min ved 94°C, hybridisering i 2 min. ved 50°C og forlengelse i 2 min. ved 72°C. PCR-produktene ble fosforylert ved anvendelse av T4 DNA-kinase og Notl-linkere ble tilsatt. Etter kutting med Noti ble PCR-fragmentene klonet inn i Notl-setet av BlueScript II KS- og transformert i XL1-Blue celler.

C1-C2-produktet ble fremstilt ved anvendelse av den kjente humane cDNA-sekvens for å syntetisere sense- og antisense-primere, henholdsvis SEKV ID NR:13 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) og SEKV ID NR: 14 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (revers komplement av nt 6966-6990). PCR-betingelser var identiske med de anvendt for å danne B-A2-produktet. Det resulterende fragment ble ligert til pNOT-kloningsvektor ved anvendelse av Prime PCR Cloner kloningssystem (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) og dyrket i JM109 celler.

B-A3- og C1-C2-plasmidene ble delvis sekvensert for å fremstille de svin-spesifikke sense- og antisense-oligonukleotider, henholdsvis SEKV ID

NR:15 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) og SEKV ID NR:16 5-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564). Disse oligonukleotider ble anvendt som primere for å danne et 2013 bp RT-PCR-produkt ved anvendelse av et Clontech Advantage cDNA PCR-sett. Dette produktet, som svarer til human nt 4551-6564, omfatter regionen svarende til lettkjede aktiveringspeptid (nt 5002-5124), A3-domene (nt 5125-6114) og mesteparten av C1-domenet (nt 6115-6573). Sekvensen av C1-C2-klonen hadde etablert at human- og svin-cDNA fra nt 6565 til 3-enden av C1 -domenet var identiske. PCR-produktet klonet inn i EcoRV-setet av pBluescript II KS-. Fire kloner ble fullstendig sekvensert i begge retninger. En konsensus ble nådd i minst 3 av 4 seter.

Isolering av svin- fVIII cDNA- kloner inneholdende 3'- halvparten av C2- domene-kodonene.

C2-domenet av human fVIII (nukleotider 6574-7053) er inneholdt innen exoner 24-26 [Gitschier J. et al. (1984) Nature 312:326-330]. Human exon 26 inneholder 1958 bp, svarende til nukleotider 6901-8858. Den omfatter 1478 bp av 3' utranslatert sekvens. Forsøk på å klone exon 26 cDNA svarende til 3'-enden av C2-domenet og 3'UTR ved 3' RACE [Siebert et al. (1995) supra], invers PCR [Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology ( N. Y). 8:759-760], restriksjonssete-PCR [Sårkar, G. et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322], "unpredictably primed" PCR [Dominguez, O. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:3247-3248] og ved screening av svinelever-cDNA-bibliotek mislyktes. 3' RACE ble forsøkt ved anvendelse av samme adaptor-ligerte dobbeltrådete cDNA-bibliotek som ble anvendt med hell for å klone 5-enden av svin-fVIII cDNA. Således var svikt av denne metoden ikke på grunn av fravær av cDNA svarende til exon 26.

En målrettet gen "walking" (genspasering) PCR-prosedyre [Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055-3060] ble anvendt for å klone 3'-halvparten av C2-domenet. En svin-spesifikk sense-primer, SEKV ID NR:17 5-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924) ble syntetisert basert på den innledende C2-domene-sekvens og ble anvendt i en PCR-reaksjon med ikke-spesifikke "walking" primere valgt fra oligonukleotider tilgjengelige i laboratoriet. PCR-produktene ble deretter målrettet ved primer-utvidelse-analyse [Parker et al. (1991) BioTechnigues 10:94-1011 ved anvendelse av en<32>P-ende-merket svin-spesifikk indre primer, SEKV ID NR: 18 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952). Det var interessant at av de 40 ikke-spesifikke primere testet, ga bare to positive produkter ved primer-utvidelse-analyse og disse to svarte til en nøyaktig og en degenerert human sekvens ved 3'-enden av C2-domenet: SEKV ID NR: 19 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) og SEKV ID NR:20 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3', (nt 7027-7053). Disse primere var initielt utformet for å gi et produkt ved konvensjonell RT-PCR, men mislyktes i å gi et tilstrekkelig produkt til å kunne visualiseres ved etidiumbromid-fargebinding. Imidlertid kunne et PCR-produkt identifiseres ved den mer sensitive primer-utvidelse-metode. Dette produktet ble gelrenset og direkte sekvensert. Dette forlenget sekvensen av svin-fVIII 3' til nt 7026.

Ytterligere sekvens ble oppnådd ved primer-ekspansjonsanalyse av et nestet PCR-produkt dannet ved anvendelse av det adaptor-ligerte dobbeltrådete cDNA-bibliotek anvendt i 5'-RACE-protokollen beskrevet tidligere. Første runde reaksjonen anvendte svin-nøyaktig primer SEKV ID NR:21 5-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (nt 6541-6564) og AP1-primer. Andre runde reaksjonen anvendte SEKV ID NR:22 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) og AP2-primer. Direkte PCR-sekvensering forlenget sekvensen 3' til slutten av C2-domenet (nt 7053). C2-domene-sekvensen var unik bortsett fra ved nt 7045 nær 3-enden av C2-domenet. Analyse av gjentatte PCR-reaksjoner ga enten A, G eller en dobbel lesing av A/G ved dette sete.

Sekvensering ble forlenget inn i 3'UTR ved anvendelse av to ytterligere primere, SEKV ID NR:23 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) og SEKV ID NR:24 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031). Omtrent 15 bp av 3' UTR-sekvens ble oppnådd, selv om sekvensen var uklar ved mange seter. Mange antisense-primere ble deretter syntetisert basert på de beste estimater av den 3' utranslaterte sekvens. Disse primere omfattet det reverse komplement av TGA-stoppkodon ved deres 3'- termini. PCR-produkter ble oppnådd fra både svinemilt genomisk DNA og svinemilt cDNA som ble visualisert ved agarosegelelektroforese og etidiumbromid-merking ved anvendelse av en spesifikk sense-primer SEKV ID NR:25 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) og 3' UTR-antisense-primer, SEKV ID NR:26 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. For å oppnå tilstrekkelige mengder av materiale for kloningsformål ble en andre runde med PCR utført ved anvendelse av en nestet sense-primer, SEKV ID NR:27 5-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) og samme antisense-primer. 141 bp PCR-produktet ble klonet inn i EcoRV-kuttet pBluescript II KS-. Sekvensen av tre kloner avledet fra genomisk DNA og tre kloner avledet fra cDNA ble oppnådd i begge retninger. Sekvensen var entydig bortsett fra ved nt 7045, hvor genomisk DNA alltid var A og cDNA alltid var G.

Multiple DNA- sekvensoppstillinger av human-, svin- og mus- fVIII ( Fig. 1A- 1H).

Oppstillinger av signalpeptidet, A1-, A2-, A3-, C1- og C2-regioner ble utført ved anvendelse av CLUSTALW-programmet [Thompson, J.D. et al.

(1994) Nucleic. Acids. Res. 22:4673-4680]. Gap open og gap extension penalties var henholdsvis 10 og 0,05. Oppstillingene av human-, mus og gris-B-domener er beskrevet tidligere [Elder et al. (1993) supra]. Den humane A2-sekvens svarer til aminosyrer 373-740 i SEKV ID NR:2. Svin-A2-aminosyresekvensen er gitt i SEKV ID NR:4 og mus-A2-domene-aminosyresekvensen er gitt i SEKV ID NR:28, aminosyrer 392-759.

Eksempel 6: Ekspresjon av aktiv, rekombinant B- domeneløs svin- faktor VIII

( PB).

Materialer

Citratbehandlede hemofili A og normale samlede humane plasmaer ble anskaffet fra George King Biomedical, Inc. Føtalt bovint serum, geneticin, penicillin, streptomycin, DMEM/F12-medium og AIM-V-medium ble anskaffet fra Life Technologies, Inc. Taq DNA-polymerase ble anskaffet fra Promega. Vent DNA-polymerase ble anskaffet fra New England Biolabs. Pfu DNA-polymerase og fagemidet pBlueScript II KS" ble anskaffet fra Stratagene. Syntetiske oligonukleotider ble anskaffet fra Life Technologies eller Cruachem, Inc. Restriksjonsenzymer ble anskaffet fra New England Biolabs eller Promega. 5'-fosforylerte primere ble anvendt når PCR-produkter ble produsert for klonings-formål. Nukleotid- (nt) nummerering av oligonukleotider anvendt som primere for polymerasekjedereaksjon- (PCR) amplifisering av svin-fVIII cDNA eller genomisk DNA anvender human fVIII cDNA som referanse [Wood et al.

(1984) Nature 312:330-337]. En fVIII-ekspresjonsvektor, betegnet HBVReNeo, ble oppnådd fra Biogen, Inc. HBVReNeo inneholder ampicillin og geneticin resistensgener og human fVIII cDNA som mangler hele B-domenet, definert som Ser741-Arg1648 spaltningsfragment produsert av trombin. For å forenkle mutagenese avfVIII C2-domene cDNA, som er ved 3-enden avfVIII-insersjonen i ReNeo, ble et Notl- sete innført to baser 3' for stoppkodonet av HBVReNeo ved spleising-ved-overlapping-utvidelse (SOE) mutagenese [Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217:270-279]. Denne konstruksjonen er betegnet HB<R>eNeo/A/of/.

Total RNA ble isolert ved syre-guanidinium-tiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon [Chomczynski, P. et al. (1987)<y>4na/. Biochem. 162:156-1591. cDNA ble syntetisert fra mRNA ved anvendelse av Moloney murint leukemivirus revers transkriptase (RT) og tilfeldige heksamerer i henhold til instruksjoner levert av produsenten (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Plasmid-DNA ble renset ved anvendelse av et Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Inc.). PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av en Hybaid OmniGene termocykler ved anvendelse av Taq, Vent eller Pfu DNA-polymeraser. PCR-produkter ble gelrenset, utfelt med etanol og ligert inn i plasmid-DNA ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Rapid DNA ligation kit, Boehringer Mannheim). Insersjons-inneholdende plasmider ble anvendt for å transformere E. coli Epicurean XL1-Blue celler. Alle nye fVIII DNA-sekvenser dannet ved PCR ble bekreftet ved dideoksy-sekvensering ved anvendelse av en Applied Biosystems 373a automatisert DNA-sekvenser og PRISM fargeterminator-sett. Konstruksjon av en hybrid fVIII- ekspresionsvektor, HP20, inneholdende svin-C2- domenet.

Svin-fVIII cDNA svarende til<3->enden av C1 -domenet og hele C2-domenet ble klonet inn i pBluescript ved RT-PCR fra milt total RNA ved anvendelse av primere basert på kjent svin-fVIII cDNA-sekvens [Healey, J.F. et al. (1996) Blood 88:4209-4214]. Denne konstruksjonen og HBVReNeo ble anvendt som templater for konstruksjon av et human-C1-svin-C2-fusjonsprodukt i pBlueScript ved SOE-mutagenese. C1-C2-fragmentet i dette plasmid ble fjernet med Apal og Noti og ligert inn i Apal/ Notl- kuttet HB" /ReNeo/A/or/for å produsere HP20/ReNeo/A/or/.

Konstruksjon av B- domene- deletert hybrid human/ svin- fVIII inneholdende svin-lettkiede ( HP18)-

Den humane fVIII-lettkjede består av aminosyrerester Asp 1649-Tyr2332. De tilsvarende rester i svin-fVIII cDNA ble erstattet for denne region av HB" for å produsere et hybrid human/svin-fVIII-molekyl betegnet HP18. Dette ble utført ved å substituere et PCR-produkt svarende til svin-A2-region, A3-domenet, C1-domenet og del av C2-domenet for den tilsvarende region i HP20. For å lette konstruksjoner ble et synonymt Avrll- sete innført i nt 2273 ved forbindelsespunktet av A2- og A3-domenene av HP20 ved SOE-mutagenese.

Konstruksjon av B- domene- deletert hybrid human/ svin- fVIII inneholdende svin-signalpeptidet, A1- domenet og A2- domenet ( HP22)-

Det humane fVIII-signalpeptid, A1-domenet og A2-domenet består av aminosyrerester Met(-19)-Arg740. De tilsvarende rester i svin-fVIII cDNA ble substituert for denne region av HB" for å produsere et molekyl betegnet HP22.1 tillegg ble et synonymt Avrll- sete innført i nt 2273 ved forbindelsespunktet av A2- og A3-domener av HP22 ved SOE mutagenese. HP22 ble konstruert ved fusjon av et svin-signalpeptid-A1-partielt A2-fragment i pBlueScript [Healy et al.

(1996) supra] med en B-domeneløs hybrid human/svin-fVIII inneholdende svin-A2-domenet, betegnet HP1 [Lubin et al. (1994) supra].

Konstruksjon av svin- B- domeneløs fVIIMPB")

Et Spel/Notl-fragment av HP18/BS (+ Avrll) ble kuttet med Avrll/ Notl og ligert inn i AvrlllA/of/-kuttet HP22/BS (+ Avrll) for å produsere en konstruksjon PB7BS (+ Avrll), som består av svin-fVIII som mangler hele B-domenet. PB-ble klonet inn i ReNeo ved ligering av et Xba//vbf/-fragment av PB7BS (+ Avrll) inn i HP22/ReNeo//Vof/ (+ Avrll).

Ekspresjon av rekombinante fVI 11- mole kyle r

PB<7>ReNeo//Vor/ (+ Avrll) og HP22/ReNeo/Notl (+Avrll) ble transient transfektert til COS-celler og uttrykt som beskrevet tidligere [Lubin, I.M. et al.

(1994) J. Biol. Chem. 269:8639-8641]. HB /ReNeo/Notl og intet DNA (falsk) ble transfektert som kontroll.

fVIII-aktivitet til PB", HP22 og HB" ble målt ved et kromogenforsøk som følger. Prøver av fVIII i COS-cellekultur-supernatanter ble aktivert med 40 nM trombin i en 0,15 M NaCI, 20 mM HEPES, 5Mm cAC12, 0,01% Tween-80, pH 7,4 i nærvær av 10 nM faktor IXa, 425 nM faktor X og 50 uM unilamellære fosfatidylserin-fosfatidycholin (25/75 vekt/vekt) vesikler. Etter 5 min. ble reaksjonen stanset med 0,05 M EDTA og 100 nM rekombinant desulfatohirudin og den resulterende faktor Xa ble målt ved kromogent substratforsøk. I det kromogene substratforsøk ble 0,4 mM Spectrozyme Xa tilsatt og hastigheten av para-nitroanilid-frigjøring ble målt ved å måle absorbansen av løsningen ved 405 nm.

Resultater av uavhengig transfekterte duplikate cellekultur-supernatanter (absorbans ved 405 nm pr. minutt)

HB": 13,9

PB": 139

HP22: 100

falsk: <0,2

Disse resultater indikerer at svin-B-domeneløs fVIII og en B-domeneløs fVIII bestående av svin-A1- og A2-subenheter er aktive og indikerer at de har overlegen aktivitet over human B-domeneløs fVIII.

PB" ble delvis renset og konsentrert fra vekstmediet ved heparin-Sepharose-kromatografi. Heparin-Sepharose (10 ml) ble ekvilibrert med 0,075 M NaCI, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCI2, 0,005% Tween-80, 0,02% natriumazid, pH 7,40. Medium (100-200 ml) fra uttrykkende celler ble påført på heparin-Sepharose, som deretter ble vasket med 30 ml ekvilibreringsbuffer uten natriumazid. PB" ble eluert med 0,65 M NaCI, 20 mM HEPES, 5 mM CaCI2, 0,01% Tween-80, pH 7,40 og ble lagret ved -80°C. Utbyttet av fVIII koagulerende aktivitet var typisk 50-75%.

Stabil ekspresjon av svin- B- domeneløs fVIII ( PB )

Transfekterte cellelinjer ble holdt i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium-F12 inneholdende 10% føtalt bovint serum, 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin. Føtalt bovint serum ble varmeinaktivert ved 50°C i én time før anvendelse. HBVReNeo og PB"ReNeo//Vof/ (+ Avrll) ble stabilt transfektert til BHK-celler og selektert for geneticin-resistens ved anvendelse av en generell protokoll som er beskrevet tidligere [Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269:8639-8641] bortsett fra at uttrykkende celler ble holdt i vekstmedium inneholdende 600Mg/ml geneticin. Celler fra Corning T-75-kolber dyrket til sammenflyting ble overført til Nunc-trippelkolber i medium inneholdende 600 ug/ml geneticin og dyrket til sammenflyting. Mediet ble fjernet og erstattet med serum-fritt, AIM-V-medium (Life Technologies, Inc.) uten geneticin. Faktor VIIl-ekspresjon ble overvåket for ett-trinns faktor VIII koagulerende aktivitet (se ovenfor) og 100-150 ml medium ble oppsamlet én gang daglig i fire til fem dager. Maksimum ekspresjonsnivåer i medium for HB" og PB" var henholdsvis 102 enheter pr. ml og 10-12 enheter pr. ml faktor VIII koagulerende aktivitet.

Rensning av PB"

PB" ble utfelt fra kultur-supernatant ved anvendelse av 60% mettet ammoniumsulfat og deretter renset ved W3-3 immunoaffinitetskromatografi og mono Q høytrykks-væskekromatografi som beskrevet tidligere for rensing av plasma-avledet svin-faktor VIII [Lollar et al. (1993) Factor Vlll/factor Villa. Methods Enzymol. 222:128-143]. Den spesifikke koagulerende aktivitet til PB" ble målt ved et ett-trinns koaguleringsforsøk [Lollar et al. (1993) ovenfor] og var lignende plasma-avledet svin-faktor VIII.

Når analysert ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese, inneholdt PB" - preparatet tre bånd med tilsynelatende molekylære masser 160 kDa, 82 kDa og 76 kDa. 82 kDa- og 76 kDa-bånd er tidligere beskrevet som heterodimer inneholdende A1-A2- og ap-A3-CI-C2-domenene (hvor ap angir et aktiveringspeptid) [Toole et al. (1984) Nature 312:342-347]. 160 kDa-båndet ble overført til en polyvinylidenfluorid-membran og underkastet NH2-terminal sekvensering, som ga Arg-lle-Xx-Xx-Tyr (hvor Xx representerer underminert) som er NH2-terminal sekvens av enkelkjede faktor VIII [Toole et al. (1984) supra]. Således blir PB" delvis prosessert ved spaltning mellom A2- og A3-domenene, slik at det består av to former, et enkelkjede A1-A2-ap-A3-CI-C2-protein og en A1-A2/ap-A3-CI-C2-heterodimer. Lignende prosessering av rekombinant HB" er rapportert [Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:19-271.

Karakterisering av svin- faktor VIII

Vi har bestemt cDNA-sekvensen av svin-fVIII svarende til 137 bp av 5'-UTR, den signalpeptid-kodende region (57 bp), og A1- (1119 bp), A3- (990 bp), C1- (456 bp) og C2- (483 bp) domenene. Sammen med tidligere publisert sekvens av B-domenet og lettkjede-aktiveringspeptidregioner [Toole et al.

(1986) ovenfor] og A2-domenet [Lubin et al. (1994) ovenfor], fullfører sekvensen angitt her bestemmelse av svin-fVIII-cDNA svarende til det translaterte produkt. Et fragment som omfattet 5-UTR-region, signalpeptid og A1-domene cDNA ble klonet ved anvendelse av en 5-RACE RT-PCR-protokoll. En primer basert på human C2-sekvens var vellykket for å produsere et RT-PCR-produkt som førte til kloning av A3, C1 og 5-halvparten av C2-domenet. cDNA svarende til 3-halvparten av C2-domenet og 3-UTR cDNA viste seg vanskelig å klone. Resten av C2-domenet ble til slutt klonet ved en målrettet gen-"walking" PCR-prosedyre [Parker et al. (1991) ovenfor]. Sekvensen angitt her i SEKV ID NR:29 var entydig, bortsett fra at nt 7045 nær 3-enden av C2-domenet, er enten A eller G som beskrevet ovenfor. Det tilsvarende kodon er GAC (Asp) eller AAC (Asn). Human- og mus-kodoner er henholdsvis GAC og CAG (Gin). Hvorvidt dette representerer en polymorfisme eller en reproduserbar PCR-artefakt er ukjent. Rekombinant hybrid human/svin B-domeneløse fVIII-cDNA inneholdende svin-C2-domene-substitusjoner svarende til både GAC- og AAC-kodoner er stabilt uttrykt med ingen detekterbar forskjell i prokoagulerende aktivitet. Dette indikerer at det ikke er en funksjonell forskjell mellom disse to C2-domene-varianter. Oppstilling av den antatte aminosyresekvens av full-lengde svin-fVIII SEKV ID NR:30 med publiserte humane [Wood et al. (1984) ovenfor] og murine [Elder et al. (1993) ovenfor] sekvenser er vist i Fig. 1A-1H sammen med seter for post-translasjonell modifikasjon, proteolytisk spaltning og gjenkjennelse av andre makromolekyler. Graden av identitet av de oppstilte sekvenser er vist i Tabell VII. Som angitt tidligere er B-domenene fra disse arter mer divergente enn A- eller C-domenene. Dette er i overensstemmelse med observasjonen at B-domenet har ingen kjent funksjon, til tross for dens store størrelse [Elder et al. (1993) ovenfor; Toole et al. (1986) ovenfor]. Resultatene ifølge foreliggende oppfinnelse bekrefter at B-domenet av svin-fVIII ikke er nødvendig for aktivitet. Basert på sekvensdataene presentert her, kan svin-fVIII som har hele eller del av B-domenet deletert, syntetiseres ved ekspresjon av det svin-MII-kodende DNA som har deletert derfra hele eller del av kodoner fra svin-B-domenet. Det er også mer divergens av sekvenser svarende til A1- domene APC/faktor IXa spaltningspeptid (rester 337-372) og lettkjede- aktiveringspeptidet (Tabell VII). Trombin-spaltningssetet i posisjon 336 for å danne 337-372-peptidet er tilsynelatende mistet i musen siden denne rest er glutamin istedenfor arginin [Elder et al. (1993) ovenfor]. Den relativt raske divergens av trombin-spaltningspeptider (eller i mus-fVIII et muligens gjenværende 337-372 aktiveringspeptid) er tidligere notert for fibrinopeptider [Creighton, T. E. (1993) i Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman, New York, s. 105-138]. Mangel på biologisk funksjon avdisse peptider når de er spaltet er angitt som en mulig grunn for den raske divergens. Arg562 i human fVIII er foreslått å være det mer viktige spaltningssete for aktivert protein C under inaktivering avfVIII og fVllla [Fay, P.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145]. Dette sete er konservert i human-, svin- og mus-fVIII. Potensielle N-bundede glykosyleringsseter (NXS/T hvor X ikke er prolin) kan sees i Fig. 1A-1H. Det er åtte konserverte N-bundede glykosyleringsseter: ett i A1-domenet, ett i A2-domenet, fire i B-domenet, ett i A3-domenet og ett i C1-domenet. De 19 A- og C-domene-cysteiner er konservert, mens det er divergens av B-domene-cysteiner. Seks av de syv disulfidbindinger i fVIII er funnet ved homologe seter i faktor V og ceruloplasmin og begge C-domene-disulfidbindinger er funnet i faktor V [McMullen, B.A. et al. (1995) Protein Sei. 4:740-746]. Human fVIII inneholder sulfaterte tyrosiner i posisjoner 346, 718, 719, 723, 1664 og 1680 [Pittman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-201021. Disse rester er konservert i mus-fVIII og svin-fVIII (Fig. 1), selv om CLUSTALW-programmet mislyktes i å stille opp mus-tyrosin svarende til Tyr346 i human fVIII. Muse- og grise-plasma kan korrigere koaguleringsdefekten i humant hemofili A-plasma, som er i overensstemmelse med nivået av konservering av rester i A- og C-domenene til disse arter. Den prokoagulerende aktivitet til svin-fVIII er bedre enn den til human fVIII [Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657]. Den rekombinante svin-faktor VIII (B-domene-deletert) uttrykt og renset som her beskrevet viser også større spesifikk koagulerende aktivitet enn human fVIII, som er sammenlignbar med plasma-avledet svin-fVIII. Dette kan være på grunn av redusert spontan dissosieringshastighet av A2-subenhet fra den aktive A1/A2/A3-C1-C2 fVllla heterotrimer. Hvorvidt denne forskjell i prokoagulerende aktivitet reflekterer en evolusjonsforandring i funksjon som et eksempel på artstilpasning [Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. 36:213-2441 er ukjent. Nå som svin-fVIII cDNA-sekvensen svarende til det translaterte produkt er fullstendig, kan homolog scanning-mutagenese [Cunningham, B.C., et al. (1989) Science 243:1330-13361 gi en metode for å identifisere strukturelle forskjeller mellom human- og svin-fVIII som er ansvarlig for den overlegne aktivitet til den sistnevnte. Svin-fVIII er typisk mindre reaktiv med hemmende antistoffer som oppstår hos hemofilipasienter som er transfusert med fVIII eller som oppstår som autoantistoffer hos den generelle populasjon. Dette er basis for anvendelse av svin-MII-konsentrat for behandling av pasienter med hemmende antistoffer [Hay og Lozier (1995) ovenfor]. De fleste inhibitorer er rettet mot epitoper lokalisert i A2-domenet eller C2-domenet [Fulcher, CA. et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74:1618-1626]. I tillegg er en epitop av ukjent betydning identifisert, som er i enten A3- eller C1-domenet [Scandella et al. (1989) ovenfor; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84:224a]. A2-epitopen er kartlagt til rester 484-508 ved homolog scanning mutagenese [Healey et al. (1995) ovenfor]. I dette 25 rest-segment er det relativt lav andel av identisk sekvens (16/25 eller 64%). Det er interessant at denne region, som synes å være funksjonelt viktig basert på det faktum at antistoffer til den er hemmende, tilsynelatende blir underkastet relativt raskere genetisk drift. Oppstilling av svin-A2-domene og A3-domene indikerer at A2-epitopen ikke har noen detekterbar homologi med den tilsvarende region i A3-domenet. C2-inhibitorepitop av human fVIII er foreslått å være lokalisert innen rester 2248-2312 ved delesjonskartlegging [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819]. Human- og svin-fVIII er 83% identisk i dette 65 rest-segment. Imidlertid har homolog scanning mutagenese av denne region for å karakterisere C2-epitopen, vist at en vesentlig determinant av C2-epitopen uventet ble lokalisert i regionen svarende til humane aminosyrer 2181-2243 (SEKV ID NR:2)og Fig. 1H. Human-svin hybride faktor Vlll-proteiner ble fremstilt hvor forskjellige deler av C2-domenet av human faktor VIII ble erstattet av de tilsvarende deler av svin-faktor VIII, ved anvendelse av strategien beskrevet her. (Eksempel 5) Syntesen av de forskjellige C2-hybrid faktor VIII ble oppnådd ved konstruksjon av hybrid kodende DNA, ved anvendelse av nukleotidsekvensen som koder for svin-C2-regionen gitt i SEKV ID NR:30. Hver hybrid DNA ble uttrykt i transfekterte celler, slik at de hybride faktor VIII delvis kunne renses fra vekstmediet. Aktivitet i fravær av hvilken som helst inhibitor, ble målt ved ett-trinns koaguleringsforsøk. En rekke på fem humane inhibitorer ble anvendt for å teste hver hybride faktor VIII. Inhibitor-plasma inneholdende anti-faktor Vlll-antistoff var tidligere vist å være rettet mot humant C2-domene, basert på evnen til rekombinant humant C2-domene til å nøytralisere hemningen. I alle testplasmaene ble inhibitor-titeren nøytralisert mer enn 79% av C2-domene eller lettkjede, men mindre enn 10% av rekombinant humant A2-domene. I tillegg ble C2-hybrid faktor VIII testet mot et murint monoklonalt antistoff, som binder C2-domenet og som humane C2-inhibitor-antistoffer, hemmet det binding av faktor VIII til fosfolipid og til von Willebrand-faktor. Ved å sammenligne antistoff-inhibitor-titere mot C2-hybrid faktor VIII, ble den vesentlige determinant av human C2-inhibitor-epitop vist å være regionen av rester 2181-2243 (SEKV ID NR:2, se også Fig. 1H). Anti-C2-antistoffer rettet mot en region COOH-terminalt til rest 2253 ble ikke identifisert i fire av de fem pasientsera. Ved sammenligning av hybrider som har svin-sekvens svarende til humane aminosyrerester nummer 2181-2199 og 2207-2243, ble det klart at begge regioner bidrar til antistoffbinding. Svin-aminosyresekvensen svarende til humane rester 2181-2243 er nummerert 1982-2044 i SEKV ID NR:30. Sekvensen av svin-DNA som koder for svin-aminosyrer nummerert 1982-2044 er nukleotider nummerert 5944-6132 i SEKV ID NR:29. Med henvisning til Fig. 1H kan det sees at i regionen 2181-2243 er det 16 aminosyre-forskjeller mellom human- og svin-sekvenser. Forskjellene er funnet ved rester 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 og 2243. Aminosyre-erstatning ved én eller flere av disse nummererte rester kan utføres for å fremstille modifisert human faktor VIII som er ikke-reaktiv for humane anti-C2-inhibitor-antistoffer. Alanin-scanning mutagenese gir en hensiktsmessig metode for generering av alanin-substitusjoner for naturlig forekommende rester, som tidligere beskrevet. Aminosyrer forskjellig fra alanin kan også være substituert, som beskrevet her. Alanin-substitusjoner for individuelle aminosyrer, spesielt de som er ikke- identiske mellom human/svin eller human/mus eller som er mest sannsynlige å bidra til antistoffbinding, kan gi en modifisert faktor VIII med redusert reaktivitet for hemmende antistoffer. Fig. 1A-1H sammen gir en oppstilt sekvenssammenligning av human-, svin- og mus-faktor Vlll-aminosyre-sekvenser. Fig. 1A sammenligner signalpeptid-regioner (human, SEKV ID NR: 31; svin, SEKV ID NR: 30, aminosyrer 1-19; murin, SEKV ID NR: 28, aminosyrer 1-19). Bemerk at aminosyrene i Fig. 1A-1H er nummerert ved det første alanin av det modne protein som nummer 1, idet aminosyrer i signalpeptidet er gitt negative nummere. Den humane fVIII-sekvens i SEKV ID NR:2 begynner også med det første alanin av det modne protein som aminosyrenummer 1. I aminosyresekvensene til mus-fVIII (SEKV ID NR:28) og svin-fVIII (SEKV ID NR:30), er den første aminosyre (alanin) av den modne sekvens aminosyre nummer 20. Fig. 1A-1H viser en oppstilling av de tilsvarende sekvenser av human-, mus- og svin-fVIII, slik at regionene med størst aminosyre-identitet er sidestilt. Aminosyrenummerene i Fig. 1A-1H gjelder bare human fVIII. Fig. 1B gir aminosyresekvensene for A1-domenet fra menneske (SEKV ID NR:2, aminosyrer 1-372), svin (SEKV ID NR:30, aminosyrer 20-391) og mus (SEKV ID NR:28, aminosyrer 20-391). Fig. 1C gir aminosyresekvenser for Faktor VIIIA2-domener fra menneske (SEKV ID NR:2, aminosyrer 373-740), gris (SEKV ID NR:30, aminosyrer 392-759) og mus (SEKV ID NR:28, aminosyrer 392-759). Fig. 1D gir aminosyresekvensene av B-domener fra human faktor VIII (SEKV ID NR:2, aminosyrer 741-1648), gris (SEKV ID NR:30, aminosyrer 760-1449) og mus (SEKV ID NR:28, aminosyrer 760-1640). Fig. 1E sammenligner aminosyresekvensene av Faktor Vlll-lettkjede aktiveringspeptider fra menneske, gris og mus (henholdsvis SEKV ID NR:2, aminosyrer 1649-1689; SEKV ID NR:30, aminosyrer 1450-1490; og SEKV ID NR:28, aminosyrer 1641-1678). Fig. 1F gir sekvenssammenligning for human-, svin- og mus-Faktor VIII-A3-domener (henholdsvis SEKV ID NR:2, aminosyrer 1690-2019; SEKV ID NR:30, aminosyrer 1491-1820; og SEKV ID NR:28, aminosyrer 1679-2006). Fig. 1 G gir aminosyresekvensene av Faktor VIII-C1-domenet fra menneske, gris og mus (henholdsvis SEKV ID NR:2, aminosyrer 2020-2172; SEKV ID NR:30, aminosyrer 1821-1973; og SEKV ID NR:28, aminosyrer 2007-2159). Fig. 1H gir sekvensdata for C2-domenene av Faktor VIII-C2-domener fra menneske, gris og mus (henholdsvis SEKV ID NR:2, aminosyrer 2173-2332; SEKV ID NR:30, aminosyrer 1974-2133; og SEKV ID NR:28, aminosyrer 2160-2319). Rutene representerer tyrosin-sulfateringsseter, foreslåtte bindingsseter for Faktor IXa, fosfolipid og Protein C er dobbelt-understreket og regioner involvert i binding av anti-A2- og anti-C2-hemmende antistoffer er i kursiv. Stjerner fremhever aminosyresekvenser som er konservert. Se også SEKV ID NR:29 (svin-faktor VIII-cDNA) og SEKV ID NR:30 (utledet aminosyresekvens av svin-faktor VIII). Det humane nummereringsystem blir anvendt som referanse [Wood et al. (1984) ovenfor]. A1-, A2- og B-domener er definert ved trombin-spaltningsseter ved posisjoner 372 og 740 og et ukjent protease-spaltningssete ved 1648 som henholdsvis rester 1-372, 373-740 og 741-1648 [Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347]. A3-, C1- og C2-domenene er definert som henholdsvis rester 1690-2019, 2020-2172 og 2173-2332 [Vehar et al. (1984) ovenfor]. Spaltningsseter for trombin (faktor Ila), faktor IXa, faktor Xa og APC [Fay et al. (1991) ovenfor; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. et al. (1992) Blood 80:3120-3128] er vist ved å plassere enzymnavnet over det reaktive arginin. Et surt peptid blir spaltet fra fVIII-lettkjede med trombin eller faktor Xa i posisjon 1689. Foreslåtte bindingsseter for faktor IXa [Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), fosfolipid (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004) og protein C (Walker, F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1484-1489] er dobbelt understreket. Regioner involvert i binding av anti-A2 [Lubin et al. (1994) ovenfor; Healey et al. (1995) ovenfor]; og tidligere foreslått for anti-C2-hemmende antistoffer er i kursiv. C2-inhibitorepitop identifisert som her beskrevet (humane aminosyrer 2181-2243) er vist ved en enkel understrekning i Fig. 1H. Tyrosin-sulfateringsseter [Pittman et al. (1992) ovenfor; Michnick et al. (1994) ovenfor] er vist ved Eksempel 7: Konstruksjon av POL1212 og ekspresjon i babyhamster-nyreceller. POL1212 er en delvis B-domeneløs svin-faktor VIII, som har B-domenet deletert bortsett fra at 12 aminosyrer av NH2-terminus av B-domenet og 12 aminosyrer av -COOH-terminus er beholdt. cDNA som koder for sekvensene for svin-fVIII-domener A1, A2, ap-A3-C1 og C2 ble oppnådd som beskrevet i Eksempel 5. DNA-nukleotidsekvens og avledet aminosyresekvens av svin-faktor VIII er presentert som henholdsvis SEKV ID NR:29 og SEKV ID NR:30. De amplifiserte fragmenter ble separat klonet inn i plasmidet pBluescript II KS" (pBS). POL1212 angir cDNA som koder for svin-fVIII som mangler mesteparten av B-domenet, men inneholder DNA-sekvens som koder for en 24 aminosyre-linker mellom A2- og ap-domener. POL1212 ble konstruert i en pattedyr-ekspresjonsvektor, ReNeo, som ble oppnådd fra Biogen. ReNeo kan replikere i bakterier, replikere som en episom i COS-celler for transient ekspresjon av faktor VIII eller være stabilt integrert i en rekke pattedyrceller. Den består av 1) sekvenser avledet fra plasmid pBR322 som omfatter et replikasjonsorigo og ampicillin-resistensgen, 2) et neomycin-resistensgen hvis ekspresjon er under kontroll av SV40 promoter/enhancer, SV40 lite t intron og SV40 polyadenyleringssignal regulatoriske elementer, 3) et sete for insersjon av fVIII og dens signalpeptid, hvis ekspresjon er under kontroll av SV40-enhancer, adenovirus type 2 hoved sen promoter og adenovirus type 2 tredelt ledersekvens. Hvilken som helst vektor som har lignende funksjonelle komponenter kan anvendes istedenfor ReNeo-vektoren. POL1212/ReNeo ble fremstilt i mange trinn. Først ble cDNA som koder for svin-fVIII-tungkjede (A1-A2) og cDNA som koder for svin-fVIII-lettkjede (ap-A3-C1-C2) separat sammensatt i pBS. Fra disse konstruksjoner ble DNA som koder for svin-B-domeneløs fVIII sammensatt i pBS (PB-/pBS). Denne form av svin-fVIII mangler hele B-domenet, definert som aminosyrer svarende til rester 741 - 1648 i human fVIII (humane nukleotider 2278 - 5001). Deretter ble DNA som koder for svin-A2 substituert for det humane A2-domene i human B-domeneløs fVIII-ekspresjonsvektor ReNeo (HB-/ReNeo). DNA som koder for resten av svin-tungkjeden og DNA som koder for svin-lettkjeden ble substituert for de humane domener i to ytterligere trinn ved anvendelse av svin-tungkjede/pBS- og PB-/pBS-konstruksjoner utført tidligere. Et fragment av det humane B-domene som koder for 5 C-terminale og 9 N-terminale aminosyrer ble innsatt mellom A2- og A3-domenene for å produsere en konstruksjon betegnet PSQ/ReNeo [Healey et al. (1998)_92:3701-3709]. Rester Glu2181-Val2243 inneholder en hoveddeterminant av den hemmende epitop i C2-domenet av human faktor VIII). Denne konstruksjonen ble anvendt som en templat for å lage et fragment av svin-B-domenet som koder for de 12 C-terminale og 12 N-terminale aminosyrer. Dette fragmentet ble innsatt mellom A2- og A3-domenene, hvilket resulterte i den endelige konstruksjon, POL1212/ReNeo.

POL1212 24 aminosyre-linker består av de første 12 og siste 12 rester av svin-fVIII-B-domenet. POL1212-linkeren har den følgende sekvens:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR. (SEKV ID NR:32)

Nukleotidsekvensen svarende til 1212-linkeren og som omgir aminosyrene er:

POL1212-linkeren ble syntetisert ved spleising-ved-overlapping-utvidelse (SOE) mutagenese, som følger: PCR-reaksjoner anvendt for å fremstille SOE-produkter var som følger:

REAKSJON #1

Utside primer: Rev 4, som er en svin-A2-primer, nukleotider 1742-1761.

(SEKV ID NR:29) Sekvensen er: 5-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3'

(SEKV ID NR:34)

Innside primer: OL12, som er en svin revers primer som dekker de første (5') 15 aminosyrer av OL1212 og siste (3') 5 aminosyrer av svin-A2. Sekvensen er:

Templat: PSQ/ReNeo

Produkt: svin-DNA fra nukleotid 1742 i A2-domenet til 2322 i OL1212, 580 bp

REAKSJON #2

Utside primer: P2949 er en svin revers A3-primer, nukleotider 2998-3021 av SEKV ID NR:29. Sekvensen er:

Innside primer: OL12+, en svin-primer som dekker siste (3') 16 aminosyrer av OL1212 og de første (5') 6 aminosyrer av aktiveringspeptidet, nukleotid 2302-2367 av SEKV ID NR:29. Sekvensen er:

Templat: PSQ/ReNeo

Produkt: svin fra nukleotid 2302 i OL1212 til nukleotid 3021 i A3-domenet, 719 bp

SOE-REAKSJON

Primere: Rev 4, P2949-

Tem<p>later: Fragment fra rxn #1 (bp) og lavsmelte-fragment fra rxn #2

(bp)

Produkt: svin-DNAfra nukleotid 1742 i A2-domenet til nukleotid 3021 i A3-domenet (SEKV ID NR:29) omfattende OL1212,1279 bp. Reaksjonsproduktet ble etanolutfelt.

1212-linkeren ble innsatt i PSQ/ReNeo ved kutting av SOE-produktet (insersjon) og PSQ/ReNeo (vektor) med BsaB I. Vektoren og insersjonen ble ligert ved anvendelse av T4-ligase og produktet ble anvendt for å transformere E. coli XL1-Blue-celler. Plasmid-DNA ble fremstilt fra mange kolonier og sekvensen av 1212-linkeren og annen PCR-dannet sekvens ble verifisert ved DNA-sekvensanalyse.

KULTUR AV BABYHAMSTERNYRE (BHK) CRL-1632 CELLER

En BHK-cellelinje ble oppnådd fra ATCC, aksesjonsidentifikasjon CRL-1632 og ble lagret frosset ved -20°C inntil videre anvendelse. Cellene ble tint ved 37°C og satt til 10 ml komplett medium, definert som DMEM/F12, 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin pluss 10% føtalt bovint serum (FBS). FBS ble anskaffet fra Hyclone, Logan Utah. Cellene ble sentrifugert i 2 minutter ved 300 RPM. Mediet ble aspirert og cellene ble resuspendert i to ml komplett medium i en T-75-kolbe inneholdende 20 ml komplett medium.

POL1212 er uttrykt i både babyhamsternyre- (BHK) og kinesisk hamster eggstokk- (CHO) celler. To BHK-linjer ble anvendt, CRL-1632-linjen fra ATCC og en annen BHK-linje anskaffet fra R. Mcgillivray, University of British Columbia, [Funk, et al. (1990) Biochemistry 29:1654-1660]. Den sistnevnte ble subdyrket uten seleksjon i oppfinnerenes laboratorium og betegnet BHK1632 (Emory). CHO-cellelinjen var CHO-K1, ATCC aksesjon CCL-61. Ekspresjonen av gjennomsnittsklon fra Emory-cellelinje og fra CHO-K1 -celler var noe høyere enn fra CRL-1632-celler som bedømt ved kromogen forsøksaktivitet.

Cellene dyrket i T-75-kolben dannet et sammenflytende monolag. En 60 ml kultur av E. coli XL1-Blue-celler i LB/ampicillin (50 mg/ml) som bærer POL1212/ReNeo-plasmidet ble fremstilt.

TRANSFEKSJON AV CRL-1632 BHK-CELLER MED POL1212/ReNeo

DNA fra overnatt kultur av POL1212/ReNeo XL1-Blue-celler ble fremstilt ved anvendelse av et Qiagen, Valencia, CA Spin Miniprep sett. Én kolbe av CRL-1632-celler ble delt i en lagerkolbe med 0,2 ml og en kolbe for transfeksjon med 0,3 ml fra 2 ml total. Den andre kolben ble tilført friskt medium. Medium var DMEM/F12 + 10% Hyclone FBS + 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin. CRL-1632-celler ble delt i 6-brønn plater for 50-90% sammenflyting for transfeksjon (0,3 ml celler fra T-75-kolben i 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] i hver brønn) ved anvendelse av frisk DMEM/F12 + 10% Hyclone FBS + 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin.

De følgende løsninger ble fremstilt i sterile 1-2 ml testrør; A) 48 ul (10 ug) Miniprep POL1212/ReNeo DNA pluss |xl medium uten serum (DMEM/F12) pluss 10 jxl Lipofectin™ (Life Technologies, Gaithersburg,

MD).

B) 10 ul Lipofectin pluss 190 |xl medium (falsk transfeksjon) ble forsiktig blandet og DNA og Lipofectin fikk reagere i 15 minutter ved romtemperatur. I løpet av denne tid ble cellene vasket to ganger med 2 ml DMEM/F12. 1,8 ml DMEM/F12 ble deretter satt til cellene. DNA/Lipofectin-komplekset ble satt dråpevis til cellene og virvlet forsiktig for blanding. Cellene ble i inkubatoren natten over. DNA/Lipofectin ble fjernet og 3 ml medium med serum ble satt til cellene. Cellene ble inkubert 30 - 48 timer. Geneticin ble anskaffet fra Life Technologies, Gaithersburg, MD. Cellekulturene ble delt i 1:20,1:50 og 1:100, 1:250,1:500 på 10 cm skåler i 10 ml medium med serum inneholdende 535 ug/ml geneticin. Over de neste mange dager ble celler som ikke tok opp POL1212/ReNeo-plasmid drept på grunn av tilstedeværelsen av geneticin. De gjenværende celler fortsatte å replikere i geneticin, og dannet synlige monolag-kolonier på skålene.

EKSPRESJON OG FORSØK MED POL1212 FRA BHK CRL-1632 CELLER

Små sylindriske ringer av plast ble plassert rundt koloniene. Koloniene ble aspirert separat ved anvendelse av komplett medium og overført til testrør. Disse kolonier er referert til som ringklonede kolonier. Ringklonede kolonier ble platet separat ut på 24-brønn plater og dyrket i komplett medium.

KROMOGENT SUBSTRAT-FORSØK FOR FAKTOR VIII-EKSPRESJON AV

TRANSFEKTERTE CRL-1632-CELLER

Prøver av POL1212 fra cellekultur-supernatanter ble blandet med 50 nM renset svin-faktor IXa og 0,05 mM fosftidylcholin/fosfatidylserin- (PCPS) vesikler i 0,15M NaCI, 20 m HEPES, 5mM CaCI2, 0,01% Tween 80, pH 7,4. Som kontroll ble celledyrkningsmedium fra falsk-transfekterte celler anvendt. Trombin og faktor X ble tilsatt samtidig til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 40 og 425 nM. Trombin aktiverer faktor VIII, som deretter sammen med PCPS, tjener som en kofaktor for faktor IXa i løpet av aktivering av faktor X.

Etter 5 min. ble aktivering av faktor X med faktor IXa/faktor Vllla/PCPS stanset ved tilsetning av EDTA til en endelig konsentrasjon på 50 mM. Samtidig aktivering av faktor VIII med trombin ble stanset ved tilsetning av trombin-inhibitoren, rekombinant desulfatohirudin, til en endelig konsentrasjon på 100 nM. En 25 ul prøve av reaksjonsblandingen ble overført til en mikrotiter-brønn, til hvilken ble satt 74 ul Spectrozyme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), som er et kromogent substrat for faktor Xa. Den endelige konsentrasjon av Spectrozyme Xa var 0,6 mM. Absorbansen ved 405 nm på grunn av spaltningen av Spectrozyme Xa med faktor Xa ble overvåket kontinuerlig i 5 minutter med en Vmaks kinetisk plateleser (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA). Resultatene er uttrykt som A405/min.

Faktor VIII kromogent forsøk med ti ring-klonede kolonier:

Disse resultater viser at alle ti kolonier som ble valgt uttrykker faktor VIII-aktivitet som er minst ti ganger større enn bakgrunn.

Aktiviteten fra medium av koloni 8, som var den høyest uttrykkende koloni, ble videre undersøkt ved ett-trinns faktor VIII koaguleringsforsøk. I dette forsøket ble 50 ml av faktor Vlll-defekt plasma (George King Biomedical Overland Park, KA), 5 ml prøve eller standard og 50 ml aktivert partikkelformig tromboplastin tid reagens (Organon Teknika, Durham, NC) inkubert i 3 min. ved 37°C. Prøver omfatter koloni 8-medium fortynnet i 0,15 M NaCI, mM hepes, pH 7,4 (HBS) eller, som en kontroll, komplett medium. Koagulering ble initiert ved tilsetning av 50 ml av 20 mM CaCI2. Koaguleringstiden ble målt ved anvendelse av et ST4 BIO koaguleringsinstrument (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). En standardkurve ble oppnådd ved å lage fortynninger av samlet, citrert normalt humant plasma, lot 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA). Faktor Vlll-konsentrasjonen av standarden var 0,9 enheter pr. ml.

Standardkurve:

Lineær regresjon av koaguleringstider versus logaritmen av konsentrasjonen av standard ga en korrelasjonskoeffisient på 0,997.

Testsubstanser ga de følgende koaguleringstider, som ble konvertert til enheter pr. ml ved anvendelse av standardkurven:

Disse resultater viser en koloni 8 koaguleringsaktivitet som er omtrent 2000 ganger høyere enn kontrollprøven.

DNA-sekvensen som koder for POL1212 er angitt som SEKV ID NR:37. Den kodede aminosyresekvens av POL1212 er angitt som SEKV ID NR:38. Ytterligere rensning av POL1212 kan utføres ved anvendelse av en rekke kjente metoder så som immunoaffinitetskromatografi og HPLC-kromatografi - se Eksempler 2 og 3.

Sekvens- ID- liste:

Claims

1. DNA,karakterisert vedat den koder for aminosyresekvensen av POL1212 som angitt i SEKV ID NR:38.

2. DNA ifølge krav 1 som har nukleotidsekvensen i SEKV ID NR:37.

3. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter DNA ifølge krav 1 eller krav 2.

4. Modifisert svin-faktor VIII,karakterisert vedat den har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:38.

5. Terapeutisk preparat,karakterisert vedat det omfatter modifisert svin-faktor VIII ifølge krav 4 og en fysiologisk akseptabel bærer.

6. Metode for å produsere modifisert svin-faktor Vlll-protein som har aminosyresekvensen i SEKV ID NR:38,karakterisert vedat den omfatter å uttrykke i en pattedyr-vertscelle DNA ifølge krav 1.

7. Metode ifølge krav 6 hvor DNA som koder for aminosyresekvensen i SEKV ID NR:38 også koder for et signalpeptid, hvorved det modifiserte svin-faktor Vlll-protein blir eksportert fra pattedyr-vertscellen.

8. Metode ifølge krav 7 hvor signalpeptidet har sekvensen av aminosyrer 1-19iSEKVIDNR:30.

9. Vertscelle,karakterisert vedat den inneholder og replikerer en ekspresjonsvektor omfattende DNA ifølge krav 1.

10. Vertscelle ifølge krav 9 hvor vektoren omfattende DNA har nukleotidsekvensen i SEKV ID NR:37.

11. Vertcelle ifølge krav 10 hvor vertscellen er BHK CRL-1632.