CZ298250B6

CZ298250B6 - Modifikovaný faktor VIII a DNA, která ho kóduje

Info

Publication number: CZ298250B6
Application number: CZ20023346A
Authority: CZ
Inventors: S. Lollar@John
Original assignee: Emory University
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2007-08-01
Also published as: KR20020081426A; CN1191360C; SK286205B6; ME00601B; CY2016011I1; HK1051004A1; RS50364B; UA75064C2; DE60133541D1; BRPI0109131B8; US20030068785A1; NO20024296D0; RU2285724C2; NL300808I2; NO20024296L; EP1280540A1; NO2016007I1; EP1280540B1; LU93049I2; IL151371A

Abstract

Predkládané resení se týká modifikované formy prasecího faktoru VIII postrádající doménu B, DNA kódující tuto formu a jejich pouzití pri lécení hemofilie.

Description

Pittman, D,D. et al.: „Biochemical, immunological, and in vivo functional characterization of B-domain-deleted factor Vlil, Blood, Vol.81, Issue 11, pp. 2925-2935, 1993; Lind, P. et al.: „Novel forms of B-domain-deleted recombinant factor Vili molecules. Construction and biochemical characterization European Journal of Biochemistry, Vol. 232, no. 1, pp. 19-27,1995; Bihorcau, N. et al.: „Structural and functional characterization of factor VIII-DELTAII, s new recombinant factor VIII lacking most ofthe B-domain, Bichemical Journal, Vol. 277, no. 1, pp. 23-31,1991; Eaton, D.L. etal.: „Structural and functional characterization ofFactor VlII-delta II, a new recombinant Factor VIII lacking most ofthe B-domain“, Biochemistry, Vol. 25, no. 26, pp. 8343-8347, 1986; Mculien, P.: „A new recombinant procoagulant protein derived from the cDNA eneoding human factor Vílí, Protein Engineering Vol. 2, no. 4, pp. 301 *306, 1988; Sarvcr, N. et al.: „Stable expression of recombinant factor VIII molecules using a bovine papillomavirus vector“, DNA 6(6), 553-564,1987; Toolc, J.J, ct al.. ..A large region (approximately equal to 95 kDa) of human factor Vlil is dispensable for in vitro procoagulant activity“, PNAS 83(16): 5939-5942, 1986; Lubin, l.M. et al.: „Elimination of a major inhibitor epitope in factor Vili, J. Biol. Chem., Vol. 269, Issue 12, 8639*8641,1994, (73) Majitel patentu:

EMORY UNIVERSITY, Atlanta, GA, US .

(72) Původce:

Lollar John S., Decatur, GA, US (74) Zástupce:

Ing. Eduard Hakr, Přístavní 24, Praha 7,17000 (54) Název vynálezu:

Modifikovaný faktor Vlil a DNA, která ho kóduje (57) Anotace:

Předkládané řešení se týká modifikované formy prasečího faktoru VIII postrádající doménu B, DNA kódující tuto formu a jejich použití při léčení hemofilie.

CZ Z98Z5U Β6

Modifikovaný faktor VIII a DNA, která ho kóduje

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti krevní koagulace, zejména faktoru VIII, Konkrétné se vynález týká modifikované formy prasečího faktoru VIII postrádající doménu B, DNA kódující tuto formu a jejich použití v lékařství.

Dosavadní stav techniky

Koagulace (srážení) krve začíná tím, že destičky adherují k ploše řezu v poraněné krevní cévě v místě leze. Následně se v kaskádě enzymaticky regulovaných reakcí rozpustné molekuly fibrinogenu za účasti enzymu trombinu přeměňují na nerozpustná vlákna fibrinum, která drží destičky pohromadě v trombu. V každém kroku této kaskády je proteinový prekurzor přeměňován na proteázu, která štěpí následující proteinový prekurzor v řadě. Ve většině kroků jsou nutné kofaktory.

Faktor VIII cirkuluje jako inaktivní prekurzor v krvi, těsně a nekovalentně vázaný na von Willebrandův faktor. Faktor VIII je proteolyticky aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru a aktivuje jeho prokoagulační funkci v kaskádě. Ve své aktivní formě je proteinový faktor Vlila kofaktorem který zvyšuje katalytickou účinnost faktoru IXa pro aktivaci faktoru X až o několik řádů.

Lidé s deficiencí faktoru VIII nebo protilátkami proti faktoru VIII, kteří nejsou léčeni faktorem VIII, trpí nekontrolovaným vnitřním krvácením, které může způsobovat řadu vážných symptomů, od zánětlivých reakcí v kloubech až po předčasné úmrtí. Těžcí hemofilici, kterých je jen v USA přibližně 10 000, mohou být léčeni infuzemi humánního faktoru VIII, které obnoví normální koagulační schopnost krve, pokud je léčení prováděno v dostatečné frekvenci a koncentraci. Klasická definice faktoru VIII je ve skutečnosti taková, že ho definuje jako látku přítomnou v normální krevní plazmě, která koriguje defekty koagulace v plazmě pocházej ící z jedinců s hemofilií A.

Vytváření protilátek („inhibitorů“ nebo „inhibičních protilátek“), které inhibují aktivitu faktoru VIII, je vážnou komplikací při léčení pacientů s hemofitií. Autoprotilátky se vyvíjejí přibližně u 20 % pacientů s hemofilií A v reakci na terapeutickou infuzi faktoru VIII. U dříve neléčených pacientů s hemofilií A, kteří tvoří inhibiční protilátky, se obvykle inhibitor vyvine v průběhu jednoho roku léčení. Navíc autoprotilátky, které inaktivují faktor VIII, se příležitostně vyvíjejí u jedinců s dříve normální hladinou faktoru VIII. Když je titr inhibitorů dostatečně nízký, pacient může být léčen zvyšujícími se dávkami faktoru VIII. Avšak často je titr inhibitoru tak vysoký, že nemůže být překonán ani faktorem Vili. Alternativní strategií proto je obejít potřebu faktoru VIII v průběhu normální hemostázy užitím komplexních přípravků faktoru IX (například KONYNE®, Proplex®) nebo rekombinantního humánního faktoru VIÍá. Navic jelikož prasečí faktor Vílí má obvykle podstatně nižší reaktivitu s inhibiční protilátkou než humánní faktor VIII, byl užit i přípravek částečně purifikovaného prasečího faktoru VIII (HYATE:C®). Mnoho pacientů, u kterých se vyvinuly inhibiční protilátky k humánnímu faktoru VIII, bylo úspěšně léčeno prasečím faktorem VIII a tolerovalo toto léčení po dlouho dobu. Avšak podávání prasečího faktoru VIII není úplným řešením, neboť se u některých pacientů po jedné nebo více infuzích vyvinou protilátky proti prasečímu faktoru VIII.

Několik přípravků humánního, z plazmy pocházejícího faktoru VIII s různým stupněm čistoty je dostupných komerčně pro léčení hemofilie A. Patří k nim také částečně purifikovaný faktor Vlil pocházející ze sloučené krve mnoha dárců, která byla protivirově ošetřena působením tepla a detergentů, avšak obsahuje významnou hladinu antigenních proteinů, faktor VIII purifikovaný pomocí mnohoklonálních protilátek, který má nižší hladinu antigenních nečistot a virové konta-1CZ 298250 B6 minace, a rekombinantní humánní faktor VIII, který je zatím ve stadiu klinických zkoušek.

Naneštěstí humánní faktor VIII je nestabilní za fyziologických koncentrací a pH, je přítomen v krvi v mimořádně nízké koncentraci (0,2 pg/ml plazmy) a má velmi nízkou specificko koagulační aktivitu. Obavy ve zdravotnictví týkající se rizika virové infekce nebo jiné krví přenášené kontaminace omezují užitečnost prasečího faktoru Vlil purifikovaného z prasečí krve.

Hemofilici vyžadují denní doplňování faktoru VIH pro prevenci krvácení a v důsledku toho vznikající deformující hemofílní artropatie. Avšak dodávka je nedostatečná a terapeutické užití je problematické z důvodu obtížné izolace, imunogenicity, a také nutnosti odstranit riziko infekcí io AIDS a hepatitidy. Ani použití rekombinantního humánního faktoru VIII nebo částečně puriftkovaného prasečího faktoru VIII neřeší všechny výše uvedené problémy.

Problémy spojené s obecně užívaným, komerčně dostupným faktorem VIII pocházejícím z plazmy, stimulovaly významně zájem na vývoji lepšího přípravku faktoru VIII. Existuje potřeba 15 účinnějšího faktoru VIII, aby jednou molekulou mohlo být podáno více jednotek koagulační aktivity, stabilnějšího faktoru VIII, jehož molekula je stabilní ve vybraném pH a fyziologické koncentraci, faktoru VIII, jehož molekula je méně náchylná ktomu, aby vyvolávala tvorbu inhibičních protilátek, a nakonec faktor VIH, jehož molekula unikne imunitní detekci (rozpoznání) v organizmu pacienta, který již získal protilátky proti humánnímu faktoru VIII.

Proto bylo cílem vynálezu poskytnout faktor VIII, který léčí hemofilii u pacientů s deficitem faktoru VIII nebo s inhibiční protilátkou humánního faktoru VIII.

Dalším cílem vynálezu bylo poskytnout způsoby léčení hemofiliků.

Ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout faktor VIII, který je stabilní při vybraném pH a fyziologických koncentracích.

Ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout faktor VIII, který má větší koagulační aktivitu než 30 humánní faktor VIII.

A ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout faktor VIII, proti kterému se bude tvořit méně protilátek.

A ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout způsob výroby rekombinantního prasečího faktoru VIII a zejména specificky modifikovaného prasečího faktoru Vlil

Podstata vynálezu

Určení celé DNA sekvence kódující prasečí faktor Vlil, která je zde uvedena v seznamu sekvencí, umožnilo poprvé syntézu úplného prasečího faktoru VIII užitím exprese DNA kódující prasečí faktor Vili-ve vhodných hostitelskýchbuňkách. Purifikóvaný rekombinantní prasečí faktor VIII ^J '* je proto jedním aspektem předkládaného vynálezu. DNA kódující každou z domén prasečího fak45 toru VIII stejně tak jako jakýkoliv jeho specifický fragment mohou být obdobně exprimovány. A dále prasečí faktor VIII (iVIII) mající deletovanou (odstraněnou) část nebo celou doménu B (prasečí fVIII bez domény B) je dále poskytnut podle předkládaného vynálezu, a sice tím, že se exprimuje DNA kódující prasečí iVIII mající deleci jednoho nebo více kodonů v B doméně.

Předkládaný vynález dále poskytuje farmaceutické přípravky k léčení pacientů trpících deficiencí ’ * faktoru VIII a týká se léčení těchto pacientů tím, že se podává rekombinantní prasečí faktor VIII nebo modifikovaný rekombinantní prasečí faktor VIII, zejména prasečí faktor VIII postrádající doménu B.

CZ 29»25ϋ B6

Popis obrázků

Obrázky 1A-1H dohromady poskytují srovnání přiřazených sekvencí nukleové kyseliny humánního, prasečího a myšího faktoru VIII.

Podrobný popis vynálezu

Pokud není uvedeno jinak, zde užívaný termín „faktor VIII“ označuje jakoukoliv funkční molekulu proteinu faktoru VIII z jakéhokoliv savce.

Termín „savčí faktor VIII“, jak je zde užíván, zahrnuje faktor VIII, jehož aminokyselinová sekvence je odvozena zjakéhokoliv savce kromě člověka, pokud není konkrétně uvedeno jinak. Termín „zvíře“ nebo „živočich“ zde označuje např. prase a další savce s výjimkou člověka.

Termín „fúzní protein“ nebo „fúzní faktor VIII nebo jeho fragment“ v předkládaném popisu označuje produkt hybridního genu, kde kódující sekvence jednoho proteinu je změněna, například spojením s částí kódující sekvence druhého proteinu z jiného genu ve správném čtecí rámci, takže dochází k nepřerušené transkripci a translaci spojených segmentů, takže vzniku hydrid gen kódující fúzní protein.

Termín „odpovídající“ nukleová kyselina nebo aminokyselina, nebo jejich sekvence, označují nukleovou kyselinu nebo aminokyselinu přítomnou v místě molekuly faktoru VIII nebo jejího fragmentu, které má stejnou strukturu a/nebo funkci jako místo molekuly faktoru VIII jiného biologického druhu, i když počet bází nukleových kyselin nebo aminokyselin nemusí být identický. DNA sekvence „odpovídající“ jiné sekvenci faktoru VIII v podstatě odpovídá takové sekvenci a hybridizaci s takto označenou sekvencí za stringentních podmínek. DNA sekvence „odpovídající“ jiné sekvenci faktoru VIII také zahrnuje sekvenci, která je výsledkem exprese faktoru VIII nebo jeho fragmentu a hybridizovala by s označenou sekvencí nebýt redundance genetického kódu.

Termín Jedinečný“ aminokyselinový zbytek nebo sekvence označují jakýkoliv aminokyselinový zbytek nebo jakoukoliv sekvenci v molekule faktoru VIII jednoho biologického druhu, která je odlišná od homologického zbytku nebo sekvence molekuly faktoru Vílí jiného biologického druhu.

Termín „specifická aktivita“ jak se zde užívá, se týká aktivity, která napraví defekt koagulace v humánní plazmě deficientní na faktor VIII. Specifická aktivita je měřena v jednotkách srážlivé aktivity najeden miligram celkového proteinu faktoru VIII ve standardním testu, kdy je koagulační čas humánní plazmy deficientní na faktor VIII srovnáván s normální humánní plazmou. Jedna jednotka aktivity faktoru Vílí je aktivita přítomná v jednom mililitru normální humánní plazmy. V tomto testu čím kratší čas je potřebný pro vytvoření trombu, tím větší je aktivita testovaného faktoru VIII·. Prasečí· faktor VIII projevuje koagulačrií aktivitu v testu na humánní faktor VIII,

Termín „exprese“ se týká souboru procesů, ke kterým dochází, když se užívá genetické informace k tomu, aby poskytla produkt. DNA kódující aminokyselinovou sekvenci prasečího faktoru VIII může být „exprimována“ v prasečí hostitelské buňce, aby poskytla protein - prasečí faktor VIII. Materiály, genetické struktury, hostitelské buňky a podmínky, které umožňují expresi dané DNA sekvence jsou odborníkům dobře známy, a mohou být upraveny tak,a by se ovlivnila doba a množství exprese, stejně jako intra- nebo extracelulámí lokalizace exprimovaného proteinu. Například po vložení DNA kódující signální peptid na 5' konec DNA kódující prasečí faktor VIII (5' konec je konvencí konec DNA kódující NH₂ konec proteinu), je exprimovaný protein exportován zvnitřku hostitelské buňky do kultivačního média. Vytvoření kombinace DNA kódující signální peptid s DNA kódující prasečí faktor VIII je výhodné, protože exprimovaný faktor VIII

-3CZ 29»Ζ5ϋ B6 je exportován do kultivačního média, což zjednodušuje proces purifikace. Výhodný signální peptid je signální peptid savčího faktoru VIII.

Nukleotídová sekvence cDNA humánního faktoru VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde v seznamu sekvencí uvedeny jako SEKVENCE ID Č. 1 a 2, v uvedeném pořadí. Faktor VIII je syntetizován jako přibližně 300 kDa jednořetězcový protein s vnitřní sekvenční homologií, která definuje „doménovou“ sekvenci NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. V molekule faktoru VIII termín „doména“ označuje souvislou sekvenci aminokyselin, která je definovaná interní aminokyselinovou sekvenční identitou a místy proteolytického štěpení trombinem. Pokud není uvedeno jinak, domény faktoru VIII zahrnují následující aminokyselinové zbytky, když jsou přiřazeny („aligned“) s humánní aminokyselinovou sekvencí (SEKVENCE ID. Č. 2): Al, zbytky Alal - Arg372; A2, zbytky Ser373 - Arg740; B, zbytky Ser741-Argl648; A3, zbytky Ser1690 Ile2032; Cl, zbytky Arg2033 - A$n2172; C2, zbytky Ser2173 - Tyr2332. Zbývající segment, zahrnující zbytky Glul649 - ARgl689, je obvykle označován aktivační peptid lehkého řetězce faktoru VIII. Faktor VIII je proteolyticky aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru, vytváří se tak faktor Vlila, který má prokoagulační funkci. Biologická funkce faktoru Vlila je zvyšovat katalytickou účinnost faktoru IXa vůči aktivaci faktoru X až o několik řádů. Trombinem aktivovaný faktor Vlila je 160 dDa velký heterotrimer A1/A2/A3-C1-C2, který vytváří komplex s faktorem IXa a faktorem X na povrchu destiček nebo monocytů. „Částečná“ doména zde v testu označuje souvislou sekvenci aminokyselin tvořící část domény.

„Podjednotky“ humánního nebo zvířecího faktoru VIII označují těžké a lehké proteinové řetězce. Těžký řetězec faktoru VIII obsahuje tři domény, Al, A2 a B. Lehký řetězec faktoru VIII také obsahuje tři domény, a sice A3, Cl a C2.

Termíny „epitop“ „antigenní místo“ a „antigenní determinanta“ jsou zde textu užívány jako synonyma a jsou definovány jako část humánního nebo zvířecího faktoru VIII, nebo fragment, které jsou specificky rozpoznávány protilátkou. Může sestávat z libovolného počtu aminokyselinových zbytků a může záviset na primární, sekundární nebo terciární struktuře proteinu.

Termín „imunogenní místo“ je zde v textu definován jako úsek humánního nebo zvířecího faktoru VIII, nebo jeho fragmentu, kteiý specificky vyvolává tvorbu protilátek proti faktoru VIII, nebo fragment, u člověka nebo zvířete, který je detekován (měřen) rutinním postupem, jako je např. imunotest, např. ELIS A nebo tzv. Bethesda test, popsaný zde. Může sestávat z libovolného počtu aminokyselinových zbytků a může závist na primární, sekundární nebo terciární struktuře proteinu. V některých provedeních vynálezu není hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII nebo jeho fragment imunogenní nebo jeho méně imunogenní ve zvířeti nebo v člověku než humánní nebo prasečí faktor VIII.

„Deficit (deficience) faktoru VIII“ a případně „nedostatek faktoru VIII“ označují nedostatek koagulační aktivity způsobeny tvorbou defektního faktoru VIII, nedostatečnou nebo nulovou * tvorbou faktoru -Vílí, nebo částečnou neboúplnou inhibicí faktorů VIII vlivem inhibitoru. Hémofilie A je typ deficitu faktoru VIII, který je důsledkem defektu na X-vázaném genu a absence nebo nedostatku proteinu, který gen kóduje, tj, faktoru VIII.

Termín „diagnostický test“ se týká všech testů, které nějakým způsobem využívají interakce antigenu s protilátkou pro detekci a/nebo kvantifikaci množství sledované protilátky, která je přítomna v testovaném vzorku, jako pomoc při stanovení vhodné terapie. Odborníkům je známa celá řada takových testů. Je zřejmé, že humánní, prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII, DNA nebo její fragment a nebo z nich exprimovaný protein, celý nebo jeho část, může být využit k nahrazení odpovídající reagencie ve známých testech, takže pak takto modifikovaný test může být použit v detekci a/nebo kvantifikaci protilátek proti faktoru VIII. Je to právě použití těchto reagencií, DNA faktoru VIII nebo jejího fragmentu nebo z nich exprimovaného proteinu, co dovoluje modifikovat známé testy, aby byly vhodné pro detekci protilátek proti humánnímu nebo

-4CZ Z9825U B6 zvířecímu faktoru VIII. K takovým testům patří, aniž by výčet byl omezující, ELISA testy, imunodifuzní testy a imunopřenosové testy (imunobloty). Vhodné postupy pro realizaci těchto testů jsou odborníkům dobře známy. Faktor VIII nebo jeho fragment, který obsahuje al jeden epitop proteinů, může být použit jako diagnostická reagencie. K příkladům dalších testů, kde se může využít humánní, prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII nebo jeho fragment, je Bethesda test a antikoagulační test.

Termín „DNA kódující protein, jako prasečí faktor VIII“ znamená polydeoxynukleovou kyselinu, jejíž nukleotidová sekvence představuje kódující informaci pro hostitelskou buňku pro expresi aminokyselinové sekvence proteinu, tedy např. prasečího faktoru VIII, v souladu se známými vztahy genetického kódu.

Termín „expresní produkt“ DNA kódující humánní nebo zvířecí faktor Vílí nebo modifikovaný faktor VIII je produkt získaný expresí příslušné DNA ve vhodné hostitelské buňce, přičemž exprese zahrnuje i takové pre- nebo posttranslační modifikace proteinu kódovaného příslušnou DNA, jako je, aniž by však výčet byl omezující, glykosylace, proteolytické štěpení apod. Odborníkům je známo, že k takovým modifikacím dochází a mohou se mírně lišit v závislosti na typu hostitelské buňky a dalších faktorech, a v jejich důsledku dochází ke vzniku molekulárních izofo- . rem produktu, kteiý si však uchovává prokoagulační aktivitu. Viz např. publikace Lind, P. et al.,. Eur. J. Biochem. 232:1927 (1995), zahrnuta formou odkazu.

Termín „expresní vektor“ označuje DNA element, často s kruhovou strukturou, který má schopnost autonomně se replikovat v požadované hostitelské buňce nebo integrovat se do genu hostitelské buňky, a také má určité, odborníkům dobře známé, rysy, které umožňují expresi kódující DNA, která byla vložena do sekvence vektoru ve vhodném místě a ve vhodné orientaci. K těmto rysům patří, avšak bez omezení, přítomnost promotorové sekvence pro řízení iniciace transkripce kódující DNA a také další DNA elementy jako jsou např. enhancery, polyadenylační místa apod., což vseje odborníkům dobře známo. Termín „expresní vektor“ se užívá k označení jak vektorů, které mají DNA kódující sekvenci, která má být exprimována, vloženou do své sekvence, tak i vektorů, které mají potřebné elementy pro kontrolu exprese vzhledem k místu inzerce uspořádány tak, že mohou složit pro expresi jakékoliv sekvence DNA vložené do tohoto místa inzerce, což vseje v oboru dobře známo. Tak například vektor postrádající promotor se může stát expresním vektorem tak, že se do něho vloží promotor kombinovaný s kódující DNA.

Obecný popis metod

Patent US 5 364 771 popsal objev molekuly hybridního humánního/prasečího faktoru Vlil, která měla koagulační aktivitu, ve které byly elementy molekuly faktoru VIII jiných biologických druhů nahrazeny odpovídajícími elementy humánního nebo prasečího faktoru VIII. Patent US 5 663 060 popsal prokoagulační hybridní humánní/zvířecí a hybridní ekvivalent molekuly faktoru VIII, kde elementy v molekule faktoru VIII jednoho biologického druhu byly nahrazeny elementy molekuly faktoru VII jiného biologického druhu.

Jelikož současné informace naznačují, že B doména nemá žádný inhibiční epitop a nemá žádný známý účinek na funkci faktoru VIII, v některých provedeních vynálezu je B doména, celá nebo alespoň její část, deletována v aktivní hybridní molekule nebo hybridní ekvivalentní molekule faktoru VIII nebo jejich fragmentech („B(-) faktor VIII“), připravených kteroukoliv z metod zde popsaných.

Gen pro humánní faktor VIII byl izolován a exprimován v savčích buňkách, jak publikovali

Toule, J.J. et al. (1984) Nátuře 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J, et al., (1984)

Nátuře 312:326-330 (Genentech); Wood, W.I. et al., (1984) Nátuře 312:330-337 (Genentech);

Vehar, G.A. et al. (1984) Nátuře 312: 337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035;

WO 88/03558; Patent US 4 757 006, aminokyselinová sekvence byla dedukována z cDNA.

Patent US 4 965 199 (Capon et al.) popsal metodu rekombinantní DNA pro přípravu faktoru VII

-5CZ 298250 B6 v savčích hostitelských buňkách a purifikaci humánního faktoru Vlil. Byla také popsána exprese humánního faktoru VIII v buňkách CHO (ovaria čínského křečka, Chinese hamster ovary) a buňkách BHKC (ledvinné buňky novorozených křečků, baby hamster kidney cells). Humánní faktor VIII byl modifikován tím, že byla odstraněna B doména, buďto celá nebo její část (Patent US 4 868 112), a bylo vyzkoušeno nahrazení B domény humánního faktoru VIII B doménou humánního faktoru V (Patent US 5 004 803). cDNA sekvence kódující humánní faktor VII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID.Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2, v uvedeném pořadí. V SEKVENCI ID. Č. 1 začíná kódující úsek nukleotidem v poloze 208, přičemž triplet GCC je kodonem pro aminokyselinu číslo 1 (Ala) zralého proteinu, který je uvedeno jako SEKVENCE ID. Č. 2:

Prasečí faktor VIII byl izolován z plazmy [Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594], Částečná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII odpovídaj ící úsekům N-konce lehkého řetězce mající homologii s ceruloplazminem a koagulačním faktorem V byla popsána v publikaci Church et al. (1984) Proč, Natí Acad. Sel USA 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) Nátuře 312:342-347 popsal částečné sekvencování N-koncové části Čtyř aminokyselinových fragmentů prasečího faktoru VIII, avšak necharakterizoval fragmenty vzhledem k jejích pozici v molekule faktoru VIII. Aminokyselinová sekvence B domény a části A2 domény prasečího faktoru Vlil byly popsány v publikaci Toole, J.J, et al. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci, USA 81:5939-5942. cDNA sekvence kódující úplnou A2 doménu prasečího faktoru VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence, a také hybridní humánní/prasečí faktor VIII mající substituce všech domén, všech podjednotek, a specifických aminokyselinových sekvencí, byly popsány v patentu US 5 364 771 nazvaném „Hybridní humánní/prasečí faktor VIII“, který byl udělen 15. listopadu 1994, a také v mezinárodní přihlášce WO 93/20093 zveřejněné 14. října 1993. cDNA sekvence kódující A2 doménu prasečího faktoru VIII odpovídající aminokyselinovým zbytkům 373-740 zralého humánního faktoru VIII, jak je uveden v SEKVENCI ID. Č. 1, a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou uvedeny jako SEKVENCE ID Č. 3 a 4, Nedávno byla nukleotidová sekvence a odpovídající aminokyselinová sekvence části Al domény postrádající prvních 198 aminokyselin, a A2 domény prasečího faktoru VIII byly popsány v mezinárodní přihlášce WO 94/11503, zveřejněné 26. května 1994. Celá nukleotidová sekvence kódující prasečí faktor VIII, včetně úplné Al domény, aktivačního peptidu, domén A3, Cl a C2, a také kódovaná aminokyselinová sekvence, byly nakonec získány a popsány Lollarem v patentu US 5 859 204, uděleném 12. ledna 1999, a také v mezinárodní přihlášce WO 97/49725, zveřejněné 31. prosince 1997, přičemž obě publikace jsou zde zahrnuty formou odkazu.

Jak prasečí tak i humánní faktor Vlil byl izolován z plazmy jako protein složený ze dvou podjednotek. Podjednotky, známé jako těžký řetězec a lehký řetězec, jsou drženy pohromadě nekovalentní vazbou, která vyžaduje kalcium nebo jiný divalentní kovový iont. Těžký řetězec faktoru VIII obsahuje tři domény Al, A2 a B, které jsou spojeny kovalentně. Lehký řetězec faktoru VIII také obsahuje tři domény, označené A3, Cl a C2. B doména nemá žádnou známou biologickou funkci a může být tedy odstraněna, celá nebo její část, z molekuly proteolyticky nebo metodami rekombinantní DNA, aniž by se významně změnil jakýkoliv měřitelný parametr faktoru Vili. Humánní rekombinantní faktor Vílí má podobnou struktur a fuiikci jako faktor Vílí pocházející z plazmy, i když není glykosylován, pokud není exprimován v savčích buňkách.

Jak humánní tak i prasečí aktivovaný faktor Vílí („faktor Vlila“) má tři podjednotky, a to díky štěpení těžkého řetězce mezi doménami Al a A2. Tato struktura je označena jako A1/A2/A3C1-C2. Humánní faktor Vlila není stabilní v podmínkách, které stabilizují prasečí faktor Vlila, pravděpodobně proto, že je slabší asociace A2 podjednotky humánního faktoru Vlila. Disociace A2 podjednotky humánního a prasečího faktoru Vlila je spojena se ztrátou aktivity molekuly faktoru Vlila. Yakhyaev, A. et al. ((1997) Blood 90:Suppl. 1, Abstract # 126) popsali vazbu A2 domény proteinem příbuzným receptoru lipoproteinu s nízkou hustotou (Iow density lipoprotein receptor-related protein), což vede k domněnce, že A2 vazbou zprostředkovaný buněčný příjem působí k utlumení (down regulaci) aktivity faktoru VIII.

-6CZ Z9825U Β6

Exprese „faktoru VIII postrádajícího B doménu“ je zesilována vložením části B domény. Vložení části B domény označené „SQ“ vedlo, jak bylo publikováno [Lind, P. et al. (1995) supra}, k příznivé expresi, „SQ“ konstrukt postrádá celou humánní B doménu s výjimkou 5 aminokyselin N-konce B domény á 9 aminokyselin C-konce B domény. $

Purifikovaný hybridní faktor VIII nebo jeho fragment proto mohou být testovány na imunoreakti- s| vitu a koagulační aktivitu ve standardních testech, ke kterým patří například test s plazmou bez / faktoru VIII, jednofázový koagulační test a ELISA test s využitím puntíkovaného rekombinantního humánního faktoru VIII jako standardu.

Další vektory, které zahrnují jak plazmidy tak i eurokaryotické virové vektory, mohou být využity pro expresi rekombinantního genového konstruktu v eukaryotických buňkách v závislosti na požadavcích a posouzení odborníka (viz např. Sambrook et al„ kapitola 16). K dalším vektorům a expresním systémům, které mohou být užity, patří také bakteriální a kvasinkové systémy a systém hmyzích buněk, avšak nejsou výhodné, neboť poskytují odlišnou glykosylaci nebojí zcela postrádají.

Protein rekombinantního faktoru Vlil může být exprimován v celé řadě různých buněk obecně užívaných pro kultivace a expresi rekombinantních savčích proteinů. Zejména byla nalezena řada vhodných buněčných linií hlodavců, které jsou zvláště užitečnými hostitelskými systémy pro expresi velkých proteinů. *

Výhodné buněčné linie, které lze získat z Americké sbírky mikroorganismů (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD), jsou především ledvinné buňky novorozených křečků (BHK) a buňky ovarií čínského křečka (CHO), které se kultivují rutinním způsobem ve známých kultivačních médiích.

Základní příčinou vyšší koagulační aktivity prasečího faktoru VIII se zdá být rychlejší spontánní disociace humánní A2 podjednotky od humánního faktoru Vlila než prasečí A2 podjednotky od prasečího faktoru Vlila. Disociace A2 podjednotky vede ke ztrátě aktivity (Lollar, P. et al.( 1990) J Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652 23657; Fay, P.J, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250).

Molekuly faktoru VIII se sníženou imunoreaktivitou

Epitopy, které jsou imunoreaktivní s protilátkami, které inhibují koagulační aktivitu faktoru VIII („inhibitory“ nebo „inhibiční protilátky“), byly charakterizovány na základě známých vztahů struktura-funkce faktoru VIII, Inhibitory nejspíše působí tím, že poruší některou z makromolekulámích interakcí spojených s doménou strukturou faktoru VIII nebo s jeho navázáním na von Willebrandův faktor, trombin, faktor Xa, faktor IXa, nebo faktor X, Avšak většina inhibičních protilátek k humánnímu faktoru VIII působení tím, že se naváže na epitopy lokalizované na 40 kDa A2 doméně nebo 20 kDa C2 doméně faktoru VIII, a tím naruší specifické funkce spojené s těmito doménami, jak’to předpokládali Fulcher et ál’. (1985 Proč, Nati. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; a Scandella et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 85:6152-6156. Navíc k A2 aC2 epitopům, může zde být ještě třetí epitop vA3 nebo Cl doméně lehkého řetězce faktoru VIII, podle publikace Scandella et al. (1993) Blood 82:1767-1775. Význam domnělého třetího epitopu je neznámý, ale mohl by být zodpovědný za malou frakci epitopové reaktivity faktoru VIII,

Anti-A2 protilátky blokují aktivaci faktoru X, jak ukázali Lollar et al., (1994) J. Clin. Invest.

93:2497-2504. Předchozí mapovací studie deleční mutagenezí, popsané v Ware et al. (1992)

BloodCoagul. Fibrinolysis 3:703-716, lokalizovaly A2 epitop do 20 kDa úseku NH₂ koncového úseku 40 kDa A2 domény. Kompetiční imunoradiometrické testy ukázaly, že A2 inhibitory rozpoznávají buďto společný epitop nebo úzce nahloučené epitopy, jako popsali Scandella et al, (1992) Throm. Haemostas 67:665-671, a jak je také ukázáno v patentu US 5 859 204.

-7cz zyszsu B6

Zvířecí nebo modifikované zvířecí molekuly faktoru Vílí mohou být testovány u lidí na sníženou antigenicitu a/nebo imunogenicitu v příslušných klinických zkouškách. V jednom typu klinických zkoušek, navržených ke zjištění toho, zdaje faktor VIII imunoreaktivní s inhibičními protilátkami, se faktor VIII podává, výhodně intravenózní infuzí, přibližně 25 pacientům, kteří trpí deficitem faktoru VIII a mají protilátky, které Ínhibují koagulační aktivitu terapeutického humánního faktoru VIII. Dávky zvířecího nebo modifikovaného zvířecího faktoru VIII jsou v rozmezí 5 až 50jednotek/kg tělesné hmotnosti, výhodně 10 až 50jednotek/kg tělesné hmotnosti, a nej výhodněji 40 jednotek/kg tělesné hmotnosti. Přibližně 1 hodinu po každém podání je nové ustavení (zotavení) hladiny faktoru Vlil ve vzorcích krve měřené jednofázovým koagulačním testem. Vzorky se odebírají přibližně 5 hodin po infuzi, a měří se faktor VIII. Celkové hladiny a rychlost vymizení faktoru Vlil ve vzorcích slouží pro předpověď titru protilátky a inhibiční aktivity. Jestliže je titr protilátky vysoký, zotavení hladiny faktoru VIII nelze změřit. Výsledky měření se srovnávají s výsledky získanými s pacienty, kteří byli léčeni humánním faktorem VIII pocházejícím z plazmy, prasečím faktorem Vlil a nebo jinou obecně užívanou terapeutickou formou faktoru VIII nebo substituentu faktoru VIII.

Po identifikaci klinicky významných epitopů mohou být exprimovány takové rekombinantní molekuly faktoru VIII, které vykazují menší nebo stejnou zkříženou reaktivitu ve srovnání s prasečím faktorem VIII pocházejícím z plazmy, když jsou testovány v vitro proti celému spektru plazmy s inhibitory. Dodatečná mutageneze v úsecích epitopů může být provedena s cílem redukovat zkříženou reaktivitu. Snížená zkřížená reaktivita, přestože je žádoucí, není nezbytná k přípravě výsledného produktu, který i tak může mít výhody ve srovnání s existujícími koncentráty prasečího faktoru VIII získaného z plazmy, které mají řadu nežádoucích vedlejších příznaků v důsledku kontaminace prasečího proteinu nebo kontaminace infekčními agens jako jsou viry nebo priony. Rekombinantní prasečí nebo modifikované prasečí faktory VIII neobsahuje cizorodé prasečí proteiny.

Diagnostické testy cDNA faktoru VII a/nebo protein zní exprimovaný, buďto celé nebo jejich části, mohou být použity v testech jakožto diagnostické reagencie pro detekci inhibičních protilátek proti humánnímu nebo zvířecímu faktoru VIII nebo modifikovanému zvířecímu faktoru VIII v substrátech, ke kterým patří zejména sérum a tělní tekutiny pacientů trpících deficitem faktoru VIII. V takových proti látkovým testům patří zejména ELIS A testy, imunobloty, radioimunotesty, imunodifuzní testy, a testy biologické aktivity faktoru VIII (např. koagulační test). Techniky pro přípravu těchto reagencií a metody jejich použití jsou odborníkům dobře známy. Tak například imunotest pro detekci inhibičních protilátek ve vzorku séra pacienta může zahrnovat kroky, kdy šé nechá reagovat testovaný vzorek s dostatečným množstvím testovaného faktoru VIII, a když se vytvoří s inhibičními protilátkami detekovatelný komplex, testovaný faktor VIII je skutečně antigenní.

Sondy nukleových kyselin a aminokyselin mohou být připraveny na základě sekvencí cDNA hybridního faktoru VIII nebo proteinu nebo jejich fragmentů. V některých provedeních vynálezu mohou být tyto sondy označeny, buďto užitím barviva nebo enzymaticky, fluorescenčními, chemiluminiscenčními nebo radioaktivními značkami, které jsou komerčně dostupné. Aminokyselinové sondy mohou být užity pro screening například séra nebo jiných tělních tekutin podezřelých z přítomnosti inhibitorů humánního, zvířecího nebo hybridního humánního/zvířecího faktoru VIII. Hladiny inhibitorů mohou být kvantifikovány u pacientů a srovnány se zdravými kontrolami, a mohou být užity například ke stanovení, zda pacient s deficitem faktoru VIII může být léčen zvířecím nebo modifikovaným zvířecím faktorem VIII. cDNA sondy mohou být použity například ve výzkumu pro screening DNA knihoven.

-8(JZ 298250 B6

Farmaceutické přípravky

Farmaceutické přípravky obsahující rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor

VIII, samotný nebo v kombinaci s vhodnými farmaceutickými stabilizujícími látkami, nosič nebo prostředky pro podávání (vehikuly), mohou být připraveny odborníkům známými metodami,/;

např. jak byly popsány v příručce Remingtonů Pharmaceutical Science (E. W. Martin).''

V jednom výhodném provedení jsou vhodnými nosiči nebo prostředky pro podávání intravenózní infuzí fyziologický roztok soli nebo roztok soli pufrovaný fosfátem.

V jiném výhodném provedení je vhodným stabilizátorem, nosičem nebo prostředkem pro podávání, aniž by byl omezující, humánní nebo zvířecí protein jako je např. albumin.

Fosfolipidové vehikuly nebo lipozomové suspenze jsou také výhodnými farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo prostředky pro podávání. Lze je připravit standardními postupy, které jsou odborníkům známy, a obsahují například fosfatidylserin/fosfatidylcholín nebo jiné kompozice fosfolipidů nebo detergentů, které společně vytvářejí negativní náboj na povrchu, jelikož faktor VIII se váze na negativně nabité fosfolipidové membrány. Lipozomy mohou být připraveny roz20 puštěním vhodných lipidů (jako je např. stearoylfosfatidylethanolamin, stearoylfosfatidylcholin, arachadoylfosfatidylcholin a cholesterol) v anorganickém rozpouštědle, které se nechá odpařit, a zůstane tenký film vyschlého lipidu na povrchu použité nádoby. Do nádoby se pak vnese vodný roztok hybridního faktoru VIII. Nádobou se pak krouží, aby se uvolnil lipidový materiál ze stěn nádoby a lipidové agregáty dispergovaly, čímž se vytvoří lipozomová suspenze.

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII mohou být kombinovány s dalšími vhodnými stabilizujícími sloučeninami, prostředky pro podávání a/nebo nosiči, včetně na vitaminu K závislých koagulačních faktorů, tkáňových faktorů, a von Willebrandova faktoru (vWf) nebo fragmentu vWf, který obsahuje vazebné místo pro faktor VIII, a polysacharidů, jak je např.

such jako sacharóza.

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII může být také podáván metodami genové terapie stejným způsobem jako je podáván humánní faktor VIII, a sice užitím retrovirových vektorů. Tato metoda spočívá vtom že se konstrukt s požadovanou cDNA faktoru Vlil vnese do humánních buněk, které jsou pak přímo transplantovány pacientovi s deficitem faktoru VIII nebo jsou vloženy do implantovatelného zařízení, které je propustné pro molekuly faktoru VIII avšak nepropustné pro buňky, a toto zařízení je pak transplantováno. Výhodným způsobem je přenos genu zprostředkovaný retrovirovým vektorem. Při tomto způsobu je éxogenní gen (např. faktor VIII cDNA) klonován do genomu modifikovaného retroviru. Gen je pak vložen do genomu hostitelské buňky prostřednictvím virového mechanismu, kde je pak buňkou exprimován. Retrovirový vektor je modifikován tak, že neprodukuje virus, což zabraňuje virové infekci hostitele. Obecné principy genové terapie jsou odborníkům známy a byly publikovány v odborné literatuře (např. Kohn, D.B. etal.'(1989) Trahsfiision 29:812-820],

Prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII může být uchováván navázaný na vWf, což zvyšuje poločas a také dobu uskladnění hybridní molekuly. Navíc lyofilizaci faktoru VIII může být zlepšen výtěžek aktivních molekul v přítomnosti vWf. Současné metody uchovávání (uskladnění) humánního a zvířecího faktoru VIII užívané komerčními dodavateli, mohou být využity také pro uchování rekombinantního faktoru VIII. Tyto metody zahrnují: (1) lyofilizaci faktoru

Vílí v částečně puriftkovaném stavu (jako „koncentrát“ faktoru VIII, který může být užit pro infuzi bez další purifikace); (2) imunoafinitní purifikaci faktoru VIII Zimmerrnanovou metodou a lyofilizaci v přítomnosti albuminu, který stabilizuje faktor VIII; (3) lyofilizaci rekombinantního faktoru VIII v přítomnosti albuminu.

-9Navíc bylo zjištěno, že prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor Vlil je prakticky nekonečně dlouho stabilní při 4 °C v 0,6 M NaCl, 20 mM MES, a 5 mM CaCh a při pH 6,0 a může být také uchován zamražený v takových pufrech, přičemž po roztátí projevuje minimální ztrátu aktivity.

Léčení

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII se užívají k léčení spontánního krvácení způsobeného deficitem faktoru VIII (např. intraartikulámí, intrakraniální nebo gastrointestinální hemoragie) u hemofíliků s nebo bez inhibičních protilátek a také u pacientů se získaným deficitem faktoru VIII způsobeným rozvojem inhibičních protilátek. Účinné látky se podávají výhodně intravenózně.

Navíc může být rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII podáván transplantací buněk, které byly geneticky modifikovány tak, aby produkovaly tento protein, a nebo implantací zařízení, které obsahuje takové modifikované buňky, jak bylo již popsáno výše.

Ve výhodném provedení farmaceutické přípravky obsahující rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII, samotný nebo v kombinaci se stabilizátory, prostředky pro přenos a/nebo nosiči, jsou podávány pacientům intravenózně infuzí, tedy stejně jako se podávají přípravky humánního nebo zvířecího faktoru VIII.

Léčené dávky přípravku rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII, které je třeba podávat pacientům, kteří takové léčení potřebují, se velmi liší v závislosti na závažnosti deficitu faktoru VIII. Obecně se dávky, jejich frekvence, trvání a počet jednotek, určí tak, aby odpovídaly závažnosti a trvání krvácivých period u každého pacienta. Tudíž faktor VIII je vmíchán do farmaceuticky přijatelného nosiče, vehikula nebo stabilizátoru v takovém množství, které je postačující k tomu, aby bylo pacientovi podáno terapeuticky účinné množství proteinu, které zastaví krvácení, což se měří pomocí standardních koagulačních testů.

Faktor VIII je klasicky definován jako taková látka přítomná v normální krevní plazmě, která koriguje defekty koagulace v plazmě pocházející od jedinců s hemofilií A. Koagulační aktivity in vitro purifikované v částečně purifikované formy faktoru VIII jsou užívány k výpočtu dávky faktoru VIII pro infuzí pacientům v humánní medicíně, a jsou spolehlivým indikátorem aktivity získané z plazmy pacientů a in vivo korekce krvácivých poruch. Nebyly dosud popsány žádné neshody mezi standardním testem nových molekul faktoru VIII in vitro a jejich chování na infuzním modelu psa nebo u humánních pacientů, viz Lusher, J.M. et al. 328 New Engl. J, Med. 328:453—459; Pittman, D.D. et al. (1992) Blood 79:389-397; a Brinkhous et al. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. 82:8752-8755. ' '

Obvykle požadovaná plazmatická hladina aktivity faktoru VIII, která má být dosažena u pacientů podáváním rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII je v rozmezí 30 až 100 % normálních hodnot. Při výhodném způsobu podávání terapeutického faktoru Vílí je přípraven podáván intravenózně ve výhodných dávkách v rozsahu 5 až 50 jédnotek/kg tělesné hmotnosti, výhodněji 1,0 až 50 jednotek/kg tělesné hmotnost, a nejvýhodněji v rozsahu 20 až 40 jednotek/kg tělesné hmotnosti, v intervalu frekvence 8 až 2 hodin (u pacientů s těžko hemofilií) a trvání léčení v rozmezí 1 až 10 dnů nebo do zastavení epizody krvácení, viz např. Roberts, H.R., a M.R. Jones, „Hemophilia and Related Podmínky - Congenital Deficiencies of Protrombin (Factor III, Factor V, and Factors VII to XII),“ Ch. 153, 1453-1474, 1960, v Hematology, Williams, W.J., et ak, ed. (1990). Pacienti s inhibitory mohou vyžadovat odlišná množství rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII, než dostávali dosavadního faktoru VIII. Například pacient může vyžadovat méně rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII, protože má vyšší specifickou aktivitu než humánní faktor VIII a sníženou protilátkovou reaktivitu. Stejně jako při léčení humánním nebo z plazmy získaným prasečím faktorem VIII, množství terapeutického faktoru VIII podávané infuzí je definováno jednofázovým koagulačním testem faktoru VIII, a ve vybraných případech, in vivo

-10CZ 298250 B6 znovudosažená hladina je měřena stanovením faktoru VIII v plazmě pacientů po infuzi. Je však třeba chápat, že pro jakéhokoliv konkrétního pacienta by měl být stanoven vhodný dávkovači režim podle jeho individuálních potřeb a na základě úsudku odborníka, který ordinuje přípravek, a že tudíž dávky a koncentrace výše zmíněné jsou pouhé příklady a nijak neomezují rozsah před5 kládaného vynálezu.

Léčení může mít podobu jediného intravenózního podání přípravku nebo periodického nebo souvislého podávání po delší dobu, podle toho, jak je to potřebné. Alternativně může být terapeutický faktor VIII podáván subkutánně nebo perorálně s lipozomy v jedné nebo několika dávkách 10 v různých časových intervalech.

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII může být také použit k léčení spontánního krvácení způsobeného deficitem faktoru VIII u hemofiliků, u kterých se vyvinuly protilátky proti humánnímu faktoru VIII. V takovém případě není nutná koagulační aktivita, která 15 je vyšší než aktivita samotného humánního nebo zvířecího faktoru VIII. Koagulační aktivita, která je nižší než aktivita humánního faktoru VIII (tj. např. nižší než 3000 jednotek/mg) je užitečná, jestliže tato aktivita není neutralizována protilátkami v plazmě pacientů.

Bylo zde ukázáno, že rekombinantní prasečí a modifikovaný prasečí faktor VIII se mohou lišit ve 20 specifické aktivitě od humánního faktoru VIII. Proteiny faktoru VIII mající vyšší prokoagulační aktivitu než humánní faktor VIII jsou užitečné při léčení hemofiliků, protože jsou třeba nižší dávky, aby byl korigován deficit faktoru VIII u pacientů. Faktor VIII mající nižší prokoagulační aktivitu než humánní faktor VIII je také vhodný pro terapeutické použití za předpokladu, že. má alespoň 1 % specifické aktivity ve srovnání s normálním humánním faktorem VIII. Faktor VIII 25 podle předkládaného vynálezu maj ící prokoagulační aktivitu je tudíž definován jako faktor maj ící alespoň 1 % specifické aktivity humánního faktoru VIII.

Molekula rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII a způsob její izolace, charakterizace, přípravy a použití, obecně popsané výše, budou podrobněji vysvětleny 30 pomocí příkladů, popsaných dále.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Test prasečího faktoru VIII a hybridního humánního/prasečího faktoru VIII

Prasečí faktor VIII má vyšší koagulační aktivitu než humánní faktor VIII, pokud jde o specifickou aktivitu molekuly. Tento závěr je založen na použití vhodných standardních křivek, které umožňují provést správné srovnání humánního a prasečího faktoru VIII. Koagulační testy jsou založeny na schopnosti faktoru'VIII zkracovat koagulační čás plazmy pocházející od pacientů s hemofilií A. Byly použity dva typy testů: jednofázový a dvojfázový test,

V jednofázovém testu se 0,1 ml plazmy s hemofilií A (George King Biomedical, lne.) inkubuje s 0,1 ml činidla pro aktivovaný parciální tromboplastinový test (APTT) (Organon Teknika) a 0,01 ml vzorku nebo standardu, kterým je naředěná normální humánní plazma s citrátem, po dobu 5 minut při 37 °C ve vodní lázni. Po inkubaci se přidá 0,1 ml 20 mM CaCl₂, a čas potřebný 50 pro vývoj fibrinové sraženiny se stanoví vizuálním hodnocením vzorku.

Jednotka faktoru VIII je definována jako množství přítomné v 1 ml citrátem ošetřené normální humánní plazmy. S humánní plazmou jako standardem byly přímo srovnány aktivity prasečího a humánního faktoru VIII. Řešení plazmového standardu nebo purifikovaných proteinů bylo pro55 vedeno do 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pH 7,4. Standardní (kalibrační) křivka byla konstruo-11 CZ Z9S25U B6 vána pomocí 3 nebo 4 ředění plazmy, kdy největší řešení bylo 1/50, vynesení log_I0 koagulačního času proti logio koncentrace v plazmě, což poskytlo lineární závislost. Jednotky faktoru Vílí v neznámém vzorku byly stanoveny interpolací z této standardní křivky.

Jednofázový test spoléhá na endogenní aktivaci faktoru VIII pomocí aktivátorů, které jsou vytvářeny v plazmě s hemofilií A, zatímco dvojfázový test měří prokoagulační aktivitu preaktívovaného faktoru VIII, které byly ponechány reagovat s trombinem, přidány ke směsi aktivovaného částečného tromboplastinu a humánní plazmy s hemofilií A, která byla preinkubována 5 minut ve 37 °C. Výsledný koagulační čas je pak přepočten na jednotky/ml, a sice pomocí stejné standardní křivky, jaká byla popsána výše. Relativní aktivita ve dvojfázovém testuje vyšší než v jednorázovém testu, protože faktor VIII byl preaktivován.

Příklad 2

Charakterizace funkčních rozdílů mezi humánním a prasečím faktorem VIII

Izolace prasečího a humánního faktoru VIII pocházejícího z plazmy a humánního rekombinantního faktoru VIII byly již popsány v odborné literatuře, viz Fulcher C.A. et al. (1982) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:1648-1652; Toole et al. (1984) Nátuře 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier et al. (1984) Nátuře 312:326-330 (Genentech); Wood et al, (1984) Nátuře 312:330337 (Genentech); Vehar et al. Nátuře 312:337-342 (Genentech); Fass et al, (1982) Blood 59:594; Toole et al. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. Může se provádět různými způsoby. Všechny preparáty byly podobné svým podjednotkovým složením ačkoliv ve stabilitě byly funkční rozdíly mezi humánním a prasečím faktorem VIII.

Pro porovnání humánního rekombinantního a prasečího faktoru VIII byly preparáty vysoce purifikovaného humánního rekombinantního faktoru VII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) a prasečího faktoru VIII (imunopurifikovaného, jak bylo popsáno ve Faass et al. (1982) Blood 59:594) podrobeny analýze vysokotlakovou kapalinou chromátografií (HPLC) na aniontové iontoměničové koloně Mono Q™ (Pharmacia-LKB; Piscataway, NJ). Cílem tohoto kroku na Mono Q™ HPLC bylo eliminovat malé nečistoty pro převedení humánního a prasečího faktoru VIII do společného pufru pro účely porovnání. Viálky obsahující 1000 az 2000 jednotek faktoru VIII byly rekonstituovány 5 ml H₂O. Pak byl přidán Hepes (2 M s pH 7,4) na výslednou koncentraci 0,02 M. Faktor VIII byl nanesen na kolonu Mono Q™ HR 5/5 ekvilibrovanou v 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCI₂, při pH 7,4 (Pufr A plus 0,15 M NaCl); propláchnut 10 mL Pufru A + 0,15 M NaCl; a eluován 20 ml lineárního gradientu, 0,15 M až 0,90 M NaCl v pufru A při průtoku 1 ml/min,

Pro porovnání humánního faktoru VIII pocházejícího z plazmy (purifikovaného na Mono Q™ HPLC) a prasečího faktoru VIII (imunoafinitně purifikovaného) pocházejícího z plazmy byl prasečí faktor naředěn 1:4 pomocí 0,04 M Hepes, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4, a pak čištěn- Mono Q™-HPLC za- stejných podmínek jak bylo popsáno v předchozím odstavci pro humánní faktor VIII. Tyto postupy izolace humánního a prasečího faktoru VII jsou standardní a odborníkům jsou dobře známy.

Frakce z kolony byly testovány na aktivitu faktoru VIII jednofázovým koagulačním testem. Průměrné hodnoty výsledků testů vyjádřené v jednotkách aktivity na jednotku A₂₈₀ materiálu jsou uvedeny v tabulce II, a ukazují, že prasečí faktor VIII má přinejmenším šestkrát vyšší aktivitu než humánní faktor VIII při použití jednofázového testu.

-12CZ 298250 B6

Tabulka II

Srovnání koagulační aktivity humánního a prasečího faktoru VIII	<.
	Aktivita (U/A₂aó)	j
Prasečí	2130Ó
Humánní> pocházejicí z plazmy	3600
Humánní rekombíriántní	240.0

Příklad 3

Porovnání stability humánního a prasečího faktoru VIII

Výsledky jednofázového testu na faktor VIII odrážejí aktivaci faktoru VIII na faktor Vlila ve vzorku a možnou ztrátu aktivity vytvořeného faktoru Vlila. Bylo provedeno přímé porovnání stability humánního a prasečího faktoru VIII. Vzorky z Mono Q™ HPLC (Pharmacia, lne., Piscataway, N.J.) byly naředěny na stejnou koncentraci a stejným pufrem a byla provedena reakce s trombinem. V různých časech byly vzorky odebrány pro dvoj fázový koagulační test. Typicky vrchol aktivity (ve 2 minutách) byl 10 x vyšší pro prasečí faktor Vlila než humánní faktor Vlila, a aktivity jak prasečího tak i humánního faktoru Vlila postupně klesaly, přičemž aktivita humánního faktoru Vlila klesala rychleji.

Obecně lze říci, že pokusy izolovat stabilní humánní faktor Vlila nebyly úspěšné dokonce ani v podmínkách, kdy byly užity podmínky, které umožnily izolovat stabilní prasečí faktor Vlila. Pro demonstraci této skutečnosti humánní faktor Vlil purifíkovaný na Mono Q™ HPLC byl aktivován s trombinem a vystaven Mono S™ iontoměničové HPLC (Pharmacia, lne.) v podmínkách, které vedly k získání stabilního prasečího faktoru Vlila, jak to popsali Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666.

Humánní faktor VIII, 43 pg/ml (0,2 μΜ) v 0,2 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4 v lOml celkového objemu, se nechal reagovat s trombinem (0,036 μΜ po 10 minut, kdy se přidal RFP-CH2Cl-D-fenyl-prolyl-arginyl-chloromethylketon na koncentraci 0,2 μΜ pro ireverzibilní inaktivaci trombinu. Směs pak byla naředěna 1:1 s 40 mM 2-(N-morfolino)ethansulfonovou kyselinou (MES), 5 mM CaCl₂ pH 6,0, a nanesena průtokem 2 ml/min na kolonu Mono S™ HR5/5 HPLC (Pharmacia, lne.) ekvilibrovanou v 5 mM MED, 5 mM CaCl₂₎ pH 6,0 (Pufr B) Plus 0,1 M NaCl. Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony 20 ml gradientu 0,1 M NaCl až 0,9 M NaCl v pufru BI při průtoku 1 ml/min.

Frakce s koagulační aktivitou ve dvoufázovém testu byly eluované za těchto podmínek jako jediný vrchol. Specifická aktivita vrcholové frakce byla přibližně 7500 U/A₂₈o. Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) vrcholové frakce faktoru VIIla po Mono S™, doplněná barvením proteinu stříbrem, ukázala dva pásy odpovídající heterodimerickému (A3-CI-C2/A1) derivátu faktoru VIII, Ačkoli v těchto podmínkách fragment nebyl identifikován barvením stříbrem vhledem kjeho nízké koncentraci, byl identifikován jako stopová složka po značení pomocí ¹²⁵I.

-13CZ 298250 B6

V kontrastu s výsledky s humánním faktorem Vlil, prasečí faktor VIII izolovaný pomocí Mono S™ HPLC za stejných podmínek měl specifickou aktivitu 1,6 x 10⁶ U/A₂go· Analýza prasečího faktoru Vlila užitím SDS-PAGE odhalila 3 fragmenty odpovídající Al, A2, a A3-C1-C2 podjednotkám, což ukázalo, že prasečí faktor Vlil obsahuje tři podjednotky.

Výsledky analýzy užitím Mono S™ HPLC preparátů humánního trombinem aktivovaného faktoru VIII při pH 6,0 ukázaly, že humánní faktor Vlila je labilní v podmínkách, ve kterých lze získat stabilní prasečí faktor Vlila. Ačkoliv byla identifikována stopová množství A2 fragmentu ve vrcholové frakci, určení toho, zda koagulační aktivita vyplývající z malého množství heterotriio merického faktoru Vlila nebo z heterodimerického faktoru Vlila, která má nízkou specifickou aktivitu, by nebylo možné samotnou touto metodou.

Způsob, jak izolovat humánní faktor Vlila, ještě před tím, než ztratí svou A2 půdjednotku, je nutný k rozhodnutí této otázky. Pro tento účel byla provedena izolace postupem, který zahrnoval 15 redukce pH Mono S™ pufru a pH 5. Mono Q™ purifikovaný humánní faktor VIII (0,5 mg) byl naředěn vodou takže poskytl výslednou kompozici 0,25 mg/ml (1 pmM) faktoru VIII v 0,25 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, 0,005 % Tween 80, pH 7,4 (celkový objem 7,0 ml). Trombin byl přidán do výsledné koncentrace 0,072 μΜ a ponechán reagovat po 3 minuty. Trombin byl pak inaktivován s FPF-CH₂C1 (0,2 μΜ). Směs pak byla naředěna 1:1 s 40 mM 20 acetátem sodným, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 5,0, a nanesena průtokem 2 ml/min na kolonu Mono S™ HR5/5 HPLC ekvilibrovanou s 0,01 M acetátu sodného, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween 80, pH 5,0, plus 0,1 M NaCl. Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony s 20 ml gradientu 0,lM NaCl až 1,0 M NaCl ve stejném pufru průtokem 1 ml/min. Takto byla získána koagulační aktivita ve vrcholové frakci, která obsahovala detekovatelné množství A2 fragmentu, 25 jak bylo ukázáno pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Specifická aktivita vrcholové frakce byla desetkrát vyšší než aktivita izolovaná při pH 6,0 (75000 U/A₂₈₀ proti 7500 U/A₂₈o. Avšak v kontrastu s prasečím faktorem Vlila izolovaných při pH 6,0, který je prakticky nekonečně stabilní ve 4 °C, aktivita humánního faktoru VIII se trvale snižuje po dobu několika hodin po eluci z kolony Mono S™. Navíc specifická aktivita faktoru VIII purifikovaného při pH 5,0 atesto30 váného bezprostředně poté je pouze 5 % aktivity prasečího faktoru Vlila, což ukazuje na značnou . disociaci, ke které došlo před testem.

Tyto výsledky ukazují, že jak humánní tak i prasečí faktor Vlila jsou složeny ze tří podjednotek (Al, A2, a A3-C1-C2). Disociace A2 podjednotky je ztrátu aktivity jak u humánního tak 35 i prasečího faktoru Vlila za jistých podmínek, jako je např. -fyziologická iontová síla, pH a koncentrace. Relativní stabilita prasečího faktoru Vlila za určitých podmínek je lepší z důvodu silnější asociace A2 podjednotky.

Příklad 4

Izolace a sekvencování DNA kódující A2 doménu prasečího faktoru VIII.

Pouze nukleotidová sekvence kódující B doménu části A2 domény prasečího faktoru VIII byla 45 již dříve sekvencována [viz Toole et al. (1986) Proč Nati. Acad. Sci. USA 83:5939-5942]. cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvence (SEKVENCE ID Č. 3 a 4, v uvedeném pořadí) celé A2 domény prasečího faktoru VIII jsou poprvé popsány v předkládané přihlášce.

A2 doména prasečího faktoru VIII byla klonována reverzní transkripcí celkové RNA z prasečí sleziny a pak PCR amplifikací. Degenerované primery navržené podle známé cDNA sekvence humánního faktoru VIII a přesně prasečí primery založené na částečné sekvenci prasečího faktoru VIII byly užity, 1 kb PCR produkt byl izolován a amplifikován po vložení do fagemidového vektoru Bluescript™“ (Stratagen),

-14CZ Z9825U B6

Prasečí A2 doména byla zcela sekvencována dideoxysekvencovací metodou. cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID Č. 3 a

4, v uvedeném pořadí.

Příklad 5

Úplná sekvence DNA kódující prasečí faktor VIII

Klenowův fragment, fosforylované Clal linkeiy, Notl linkery, T4 ligáza a Taq DNA polymeráza byly zakoupeny od firmy Promega (Madison, Wisconsin). Polynukleotidylkináza byla koupena od firmy Life Technologies, lne., Gaithersburg, Maryland. v³²-ATP (Redivue, >5000Ci/mmol) byl koupen od firmy Amersham. pBluescript III KS- a buňky E. coli Epicurean XL1 Blue byly koupeny od firmy Stratagen (La Jolla, Califomia). Syntetické oligonukleotidy byly koupeny od firmy Life Technologies, lne. nebo Cruachem. Inc. 5-fosforylované primery byly použity při PCR, když byly produkty amplifikovány pro účely klonování. Číslování nukleotidů (nt) v oligonukleotidech použitých jako primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) pro amplifikaci prasečí fVIII cDNA nebo genomové DNA je na základě humánní fVIIl cDNA jakožto reference (Wood et al. (1984) supra).

Celková RNA z prasečí sleziny byla izolována kyselou extrakci užitím guanidinithiokyanátfenol-chloroformu [Chomczynski et al (1987) Anal. Biochem. 762:156-159] Prasečí cDNA byla připravena z celkové RNA ze sleziny užitím reverzní transkriptázy (RT) z Moloneyho myšího leukemického viru (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech), pokud není uvedeno jinak. RT reakce obsahovala 45 mM Tris-DCL pH 8,3; 68 mM KC1, 15 mM DTT, 9 mM MgCl₂, 0,08 mg/ml hovězího sérového albuminu a 1,8 mM deoxynukleotidtrifosfátu. Prasečí genomová DNA byla izolována ze sleziny standardním protokolem (Strauss, W.M. (1995) v Current Protocois in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., editors, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.:3). Izolace DNA zagarózových gelů byla provedena pomocí soupravy Genclean II (Bio 101) nebo Quiex II Gen Extraction Kit (Qiagen).

PCR reakce byla prováděna za pomoci termocykleru Hybaid OmniGen Pro PCR reakci prováděnou s Taq DNA polymerázou reakční směs obsahovala 0,6 mM MgCl₂ 0,2 mM dNTPs, 0,5 μΜ oligonukleotidové prímeiy, 50 U/ml polymerázy, a 0,1 objemu reakční směsi prvního řetězce cDNA. S výjimkou, kdy je uvedeno jinak, PCR produkty byly genově purifikovány, zatupeny Klenowovým fragmentem, precipitovány ethanolem a buďto ligovány do EcoRV místa defosforylovaného pBluescript II KS- nebo ligovány s fosforylovanými Clal linkery užitím T4 ligázy, naštěpeny Clal a purifikovány pomocí chromatografie na Sephacryl S400, a pak ligovány do Clal naštěpeného, defosforylovaného pBluescript II KS-, Ligace byly provedeny pomocí DNA ligáza (Rapid DNA ligation kit; Boehringer Mannheim) s výjimkou případů, kdy je specificky uvedeno jinak. Plazmidy pBluescript II KS- obsahující inzert byly použity pro transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-Blue.

Sekvencování plazmidové DNA bylo provedeno užitím automatického DNA sekvencéru Applied Biosystems 373a a barviví terminační soupravy PRISM, a nebo manuálně užitím kitu pro sekvencování Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation). Přímé sekvencování PCR produktů, obsahující ³²P-koncově značené oligonukleotidy, bylo provedeno užitím protokolu pro cyklování sekvencování (dsDNA Cycle Sequencing Systém, Life Technologies).

Izolace klonů prasečího cDNA pro ťVIII obsahujících sekvenci 5'UTR, signální peptid a doménu Al

5'-úsek prasečí řVIII cDNA až do doménu A2 byl amplifikován „hnízdovou“ („nested“) RTPCR z celkové RNA odebrané ze sleziny prasnice užitím metody 5' rychlé amplifikace cDNA

-15CZ 298250 B6 konců. (5-RACE) (Marathon cDNA Amplifícation, Clontech, Version PR55453). Metoda zahrnuje syntézu prvního řetězce cDNA užitím oligo(dT) „lock-docking“ primerů [Borson, N.D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2.144.-148], a druhého řetězce cDNA užitím E. coli DNA polymerázy I, ligace 5-prodlouženým dvouřetězcem adaptorem SEKVENCE ID Č. 5:

5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3 3'-H₂N-CCC GTC CA-PO₄-5' jehož krátký řetězec byl blokován na 3' konci aminoskupinou, aby se redukovalo nespecifické io nasedání primerů, a byl komplementární k 8 nukleotidům na 3'.-konci (Siebert, P.D., et al. (1995)

Nucleic. Acids. Res. 23: 1087-1088). První běh PCR byl proveden užitím adaptorově specifického oligonukleotidu, SEKVENCE ID Č. 6. 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC3' (označený API) jakožto „“sense““ primerů, a oligonukleotidu specifického pro A2 doménu prasečího fVIII SEKVENCE ID. Č. 7: 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' 15 (nt 2081-2104) jakožto „“antisense““ primerů. Druhý běh PCR byl proveden užitím „hnízdového“ („nested“), adaptorově specifického oligonukleotidu SEKVENCE ID Č. 8: 5-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (označen AP2) jakožto „sense“ primerů a hnízdového oligonukleotidu specifického pro prasečí doménu A2 SEKVENCE ID Č. 9: 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nt 1497-1520) jakožto „antisense“ primerů. PCR byly provedeny 20 užitím komerční soupravy (Advantage cDNA PCR core kit), která užívá protilátkami-zprostředkovaný postup horkého startu [Kellogg, D.E. et al.. (1994) BioTechniques 16:1134-1137].

Podmínky pro PCR byly následující: denaturace při 94 °C po 60 sekund, následovaná 34 cykly (první PCR) nebo 25 cykly (druhé PCR) denaturace po 30 sekund při 94 °C, nasednutí primerů 25 („annealing“) po 30 sekund při 60 °C a prodlužování (syntéza) po 4 minuty při 68 °C užitím kontroly teploty přímo ve zkumavce. Tento postup poskytl výlučný produkt přibližně velikost

1,6 kb, což bylo v souladu s amplifikací fragmentu zahrnujících přibližně úsek bp z 5' UTR. PCR produkt byl klonován do pBluescript užitím Clal linkerů. Inzerty čtyřech klonů byly sekvencovány v obou směrech.

..... .......

Tyto klony zahrnovaly úseky odpovídající 137 bp 5' UTR, signálnímu peptidu, Al doméně a části A2 domény. Shoda byla dosažena v alespoň 3 ze 4 míst. Avšak klony obsahovaly v průměru 4 mutace zjevně vnesené v průběhu PCR, zřejmě v důsledku více běhů PCR potřebných pro získání klonovatelného produktu. Tudíž byla užita sekvence získaná z úseku signálního peptidu 35 pro návrh „sense“ fosforylovaného PCR primerů, a sice SEKVENCE ID Č. 10 5'-CCT CTC

GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3T nazvaného RENEOPISP, pro syntézu dalšího PČR produktu pro potvrzení sekvence a pro klonování do expresního vektoru. Sekvence vyznačená tučně představuje start-kodon. Sekvence 5' směrem od něho představuje sekvenci identickou 5' inzerčního místa savčího expresního vektoru 40 ReNeo užitého pro expresi fVIII (Lubin et al. (1994) supra). Toto místo obsahuje Xhol štěpné místo (podtrženo). RENEOPIGSP a ntl 497-1520 oligonukleotid byly užity jako primery pro Taq. « DNA polymerázou zprostředkovanou PCR reakci, kde byla užita jako templát cDNA ze sleziny prasnice. DNA polymeráza od několika dalších výrobců neposkytla detekovatelný produkt. Podmínky pro PCR byly následující: denaturace při 94 °C po 4 minuty, následovaná 35 cykly denatu45 race při 94 °C po 1 minutu, nasednutí primerů při 55 °C po 2 minuty a prodlužování při 72 °C po minuty, následovaná konečná, prodlužovacím krokem 5 minut při 72 ;C. PCR produkt byl klonován do pBluescript užitím Clal linkerů. Inzerty ze dvou těchto klonů byly sekvenovány a v obou směrech byly shodné s kanonickou (konsenzní) sekvencí.

-16CZ 298250 B6

Izolace klonů prasečí fVIÍI cDNA obsahující kodony pro domény A3, Cl a 5'-polovinu C2 domény

Nejdříve byly dva produkty RT-PCR z prasečí sleziny, odpovídající fragmentu B-A3 domény (nt 4519-5571) a fragmentu C1-C2 domény (nt 6405-6990) klonovány. 3' konec C2 domény byl získán prodloužením do úseku exonu 26, který je terminálním exonem fVIII. B-A3 produkt byl připraven užitím primerů specifického pro prasečí B doménu, SEKVENCE ID Č. 11: 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3', kde podtržený úsek odpovídá úsek v prasečím fVIII, který nasedá na úsek nt 4519^15530 humánního řVIII. 5' úsek oligonukleotidu obsahuje Not I místo, které bylo původně zamýšleno pro účely klonování. „Antisense“ primer použitý pro generování B-A3 produktu SEKVENCE ID Č. 12: 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3' je založen na reverzním komplementu humánní řVIII cDNA sekvence zahrnujícího 5545-5571. PCR sekvence obsahovala 50 mM KC1, 10 mM Tris-CI, pH 9,0, 0,1 % Tween X-100, 1,5 mM MgCh, 2,5 mM dNTPs, 20 μΜ primery, 25 jednotek/ml Taq DNA polymerázy a 1/20 objemu RT reakční směsi. PCR podmínky byly denaturace při 94 °C po 3 minuty, následovaná 30 cykly denaturace po 1 minutu při 94 °C, nasednutí primerů po 2 minuty při 50 °C a prodlužování po 2 minuty při 72 °C. PCR produkty byly fosforylovány užitím T4 DNA kinázy, byly přidány linkery NotL Po naštěpení Notl byly PCR fragmenty klonovány do Notl místa plazmidů BlueScript II KS- a transformovány do buněk XLl-Blue.

C1-C2 produkt byl připraven užitím známé humánní cDNA sekvence pro syntézu „sense“ a „antisense“ primerů, SEKVENCE ID Č. 13: 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) a SEKVENCE ID Č. 14: 5U3TG GGG GTG AAŤ TCG AAG GTA GCG N-3' (reverzní kompiement k nt 6966-6990), v uvedeném pořadí. PCR podmínky byly identické s podmínkami užitými pro přípravu B-A2 produktu. Vzniklý fragment byl Iigován do pNOT klonovacího vektoru užitím soupravy Prime PCR Cloner Cloning Systém (5 Prime - 3 Prime, lne., Boulder, Colorado) a pěstován v buňkách JMI09.

Plazmidy B-A3 a C1-C2 byly částečně sekvencovány pro přípravu „sense“ a „antisense“ oligonukleotidů specifických pro prasečí sekvenci, a sice SEKVENCE ID Č. 15: 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4373), SEKVENCE ID Č. 16: 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564), v uvedeném pořadí. Tyto oligonukleotidy byly užity jako primery pro vytvoření 2013 bp RT-PCR produktu užitím soupravy Clontech Advantage cDNA PCR. Tento produkt, který představuje humánní úsek nt 4551-6564, obsahuje úsek obsahující aktivačnímu peptidu lehkého řetězce (nt 5002-5124), A3 doméně (nt 5125-6114) a většině Cl domény (nt 6115-6573). Sekvencováním C1-C2 klonu bylo stanoveno, že humánní a prasečí cDNA od nt 6565 až do 3' konce Cl domény jsou identické, PCR produkt byl klonován do EcoRV místa pBluescript II KS- Čtyři klony byly plně sekvencovány v obou směrech. Shora byla dosažena alespoň ve 3 ze čtyřech míst.

Izolace prasečích klonů fVIII cDNA obsahujících kodony pro 3' polovinu C2 domény

C2 doména humánního fVIII (nukleotidy 6574-7053) je obsažena uvnitř exonů 24 až 26 [Gitschier J. et al. (1984) Nátuře 312: 326-330]. Humánní exon 26 obsahuje 1958 bp, a odpovídá nukleotidům 6901-885. Zahrnuje také 1478 bp úsek 3' netrans lato vaně sekvence. Pokusy o klonování cDNA exonu 26 odpovídající 3' konci C2 domény 3' UTR metodou „3' RACE“ [Siebert et al. (1995) supra], inverzní PCR [Ochman, H, et al. (1990), Biotechnology (N.Y.) 5:759-760], PCR restrikčních míst [Sarkar, G, et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322], PCR s nepředvídatelnými primery („unpredictably primed“ PCR) [Dominguez, O. et al. (1994) Nucleic. Acids Res. 22:3247-3248] a nebo screeningem cDNA knihovny z prasečích jater zcela selhaly. Metoda 3' RACE byla s úspěchem užita se stejnou adaptory-ligovanou dvoj řetězcovou cDNA knihovnou ke klonování 5' konce prasečí ťVII cDNA. Takže neúspěch této metody nebyl důsledkem absence cDNA odpovídající exonu 26.

. 17CZ 298250 B6

Postup „cílené procházky po genu sPCR“ (Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids, Res. 79:3055-3060) byl užit pro klonování 3' poloviny C2 domény. „Sense“ primer specifický pro prasečí sekvenci, SEKVENCE ID Č. 17: 5 -TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924) 5 byl syntetizován na podkladě počáteční sekvence C2 domény a byl užit pro PCR reakce $ nespecifickými „walking“ primery vybranými z oligonukleotidu dostupných v laboratoři. PCR produkty byly pak zacíleny analýzou extenze primerů [Parker et al. (1991) BioTechniques 10:94-101] užitím ³²P-koncově značeného interního primerů specifického pro prasečí sekvenci, SEKVENCE ID Č. 18: 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952). Je zajímavé, že ze 40 testo10 váných nespecifických primerů pouze dva poskytly pozitivní produkty. V analýze extenze primerů tyto dva produkty odpovídají přesné a degenerované humánní sekvenci 3' konce C2 domény: SEKVENCE ID Č. 19. 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3', (nt 7030-7453) a SEKVENCE ID Č. 20. 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG 3', (nt 7027-7053). Tyto primery byl původně navrženy k získání produktu pomocí konvenční RT-PCR, ale nevedly 15 k získání dostatečného množství produktu, které by mohlo být vizualízováno vazbou ethidiumbromidového barviva. Avšak PCR produkt mohl být identifikován mnohem citlivější metodou extenze primerů. Tento produkt byl gelové purifikován a přímo sekvencován. To vedlo k extenzi sekvence prasečího fVHI 3' až k nt 7026.

Další sekvence byly získány analýzou extenze primerů produktů připravených v hnízdové PCR užitím adaptor-ligované dvojřetězcové cDNA knihovny postupem „5' RACE popsaným již dříve. První běh reakce užitím přesného prasečího primerů SEKVENCE ID Č. 21: 5'-CTTCGCCATGGAGTTGATGGCCTGT-3' (nt 6541-6564) a primerů API. Druhý běh reakce byl proveden užitím primerů SEKVENCE ID. Č. 22: 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913_t 25 6934) a AP2 primerů. Přímé PCR sekvencování prodloužilo sekvenci ke 3' konci C2 domény (nt

7053). Sekvence C2 domény byla jedinečná s výjimkou nt 7045 v blízkosti 3' konce C2 domény. Analýza opakovaných PCR reakcí poskytla buďto A, G nebo dokonce dvojité čtení A/G v této pozici.

Sekvencování byl prodlouženo do 3' UTR užitím dvou dalších primerů, a sice SEKVENCE IĎ Č, 23: 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-699T) a SEKVENCE ID Č. 24: 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031), Přibližně 15 bp fragment 3' UTR sekvence byl získán, ačkoliv sekvence byla v několika místech nejasná. Několik „antisense“ primerů pak bylo syntetizováno na základě co nej lepšího určení 3' netranslatované sek35 vence. Tyto primery zahrnovaly reverzní komplement TGA stop kodonu na jejich 3' konci. PCR produkty jak zgenomové DNA prasečí sleziny tak i zcDNA prasečí sleziny, vizualizované eléktřoforézou na agarózovém gelu a obarveny ethidiumbromidem, byly získány užitím specifického „sense“ primerů SEKVENCE ID. Č. 25: 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) a 3' UTR „antisense“ primerů SEKVENCE ID Č. 26: 5'CCTTGCAGGAA40 TTCGATTCA-3'. Pro získání dostatečného množství materiálu pro účely klonování, byl proveden druhý běh PCR užitím hnízdového „sense“ primerů SEKVENCE ID Č. 27: 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) a stejného „antisense“ primerů. PCR produkt velikosti 141 bp byl klonován do EcoRV naštěpeného pBluescript II KS- Sekvence tří klonů získaných z genomové DNA a tří klonů získaných z cDNA byla určena v obou směrech. Sekvence 45 byla jednoznačná s výjimkou polohy 7045, kde v genomové DNA byl vždy A, zatímco v cDNA byl vždy G.

Vícenásobné přiřazení sekvencí DNA humánního, prasečího a myšího fVII (viz obrázky 1A až IH)

Srovnání sekvencí signální peptidu a úseků Al, A2, A3, Cl a C2 úseku bylo provedeno užitím programu CLUSTALW [Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22:4673-4680], „Trestné“ body za mezery „gap open“ a „gap extensionů ve srovnávaných sekvencích byly 10

-18CZ 298250 B6 a 0,05 v uvedeném pořadí. Srovnání humánní, myší a prasečí sekvence B domény bylo již popsáno dříve [Elder et al. (1993) supra]. Humánní A2 sekvence odpovídá aminokyselinám 373740 v SEKVENCE ID Č. 2. Prasečí aminokyselinová sekvence A2 je zde uvedena jako

SEKVENCE ID Č. 4 a myší aminokyselinová sekvence A2 domény je zde uvedena jako sekvence id Č. 28, aminokyseliny 392-159.

Příklad 6

Exprese aktivního rekombinantního prasečího faktoru VIII postrádajícího doménu B (PB~)

Materiály

Citrátem ošetřená krev s hemofilii .A a normální sloučená humánní plazma byly zakoupeny od George King Biomedical, lne. Fetální hovězí sérum, geneticin, penicilín, streptomycin a média DMEM/FI2 médium a AIM-V byly zakoupeny od Life Technologies, lne. Taq DNA polymeráza byla zakoupena od firmy Promega. Vent DNA polymeráza byla zakoupena od firmy New England Biolabs. Pfu DNA polymeráza a fagemid pBlueScript II KS' byly zakoupeny od firmy Stratagen. Syntetické oligonukleotidy byly zakoupeny od firmy Life Technologie nebo Cruachem, lne. Restrikční enzymy byly od firmy New England Biolabs nebo Promega. 5-fosforyIováné primery byly užity, když byly PCR produkty připravovány pro účely klonování. Číslování nukleotidů (nt) v oligonukleotidech užitých jako primery pro amplifikaci prasečí IVIII cDNA nebo genomové dna v polymerázové řetězové reakci (PCR) vycházelo z humánní fVHI cDNA jako referenční sekvence [Wood et al. (1984) Nátuře 312:330-337], A fVHI expresní vektor nazvaný HBTReNeo, byl získán od firmy Biogen, lne. HB-/ReNeo obsahuje gen rezistence k ampicilinu a genticinu a humánní fVIII cDNA, které chybí celá B doména, definovaný jako štěpný fragment Ser741-Argl648 produkovaný trombinem. Pro usnadnění mutageneze cDNA fVIII C2 domény, která je na 3' konci inzertu fVIII v ReNeo, bylo místo Notl vneseno 2 báze od 3' stop kodonu HB7ReNeo užitím mutageneze typu ,.spricing-by-overlap extension“ (SOE) [Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217:270-279]. Tento konstrukt byl nazván HBReNeo/NotL

Celková RNA byla izolována metodou kyselé guanidinium thiokyanát-fenol-chloroformové extrakce [Chomczynski, P. et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159], cDNA byl syntetizována z MRNA užitím reverzní transkriptázy (RT) z Moloneyho myšího leukemického viru a náhodných hexamerů podle instrukcí výrobce soupravy (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Plazmidová DNA byla purifikována užitím soupravy Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiageri, lne,). PCR reakce byla provedena užitím termocyklovacího zařízení Hybaid OmníGen užitím Taq, Vent, nebo Pfu DNA polymerázy. PCR produkty byly purifikovány na gelu, precipitovány ethanolem, a ligovány do plazmidové DNA užitím T4 DNA ligázy (Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim). Inzerty obsahující plazmidy byly užity k transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-BIue buňky. Všechny nové fVIII DNA sekvence vytvořené pomocí PCR byly potvrzeny dideoxy-sekvencováním užitím automatického DNA sekvencéru (Applied Biosystems 373a) a soupravy terminačních barviv PRISM.

Konstrukce hybridního expresního vektoru fVIII HP20 obsahujícího prasečí C2 doménu

Prasečí fVIII cDNA odpovídající 3' konci Cl domény a celé C2 doméně byla klonována do pBluescript užitím RT PCR z celkové RNA ze sleziny užitím příměrů založených na známé prasečí fVIII cDNA sekvencí [Hearly J.F. et al. (1996) Blood 88:4209-4214], Tento konstrukt a konstrukt BBTReNco byly užity jako templáty pro konstrukci fúzního produktu „humánní Cl prasečí C2“ v pBlueScript mutagenezí SOE. C1-C2 fragment z tohoto plazmidů byl vyjmut sApal a Notl a ligován do Jprt//AW-naštěpeiiého HB /ReNeolNot] aby tak vznikl

HP20/ReNeo/NotI.

-19CZ 298250 B6

Konstrukce hybridního humánního/prasečího fVIII obsahujícího prasečí lehký řetězec (HP 18)Lehký řetězec humánního fVIII sestává z aminokyselinových zbytků Aspl649 až Tyr2332. Odpovídajícími zbytky prasečí fVIII cDNA byl tento usek nahrazen v HB-. Čímž byla připravena hybridní humánní/prasečí fVIII molekula nazvaná HP18. To bylo provedeno tak, že odpovídající úsek v HP20 byl nahrazen PCR produkty odpovídajícími prasečímu úseku A2, doméně A3, C1 a části C2 domény. Pro usnadnění konstrukce byly synonymní AvrlI místo SOE mutagenezí vneseno do nt 2273 na spojnici A2 a A3 domény v HP20.

Konstrukce hybridu humánního/prasečího fVIII postrádajícího B doménu a obsahujícího prasečí signální peptid, Al doménu a A2 doménu (HP22)‘

Signální peptid humánního fVIII s Al doménou a A2 doménou sestávající z aminokyselinových zbytků Met(-19)-Arg740. Tento úsek HB- byl nahrazen odpovídajícími zbytky prasečí fVIII cDNA a byla tak připravena molekula nazvaná HP22. Navíc bylo synonymní AvrlI místo SOE mutagenezí vneseno do nt 2273 na spojnici A2 a A3 domény v HP20. HP22 byl konstruován fúzí prasečího fragmentu signální peptid—AI—část A2 v pBlueScript [Haely et al. (1996 supra] s hybridním humánním/prasečím fVIII postrádajícím doménu B obsahujícím prasečí A2 doménu označeným HP1 [Lubin et al. (1994) supra]

Konstrukce prasečího fVIII bez B domény (PB)

SpelZNotl fragment HP18/BS (+AvrlI) byl naštěpen AvrlI/Notl a ligován do AvrII/NotI~ naštěpeného HP22BS (+AvrlI), čímž byl připraven konstrukt PB7BS (CávrlI), sestávající z prasečího fVIII postrádajícího celou B doménu. PB- byl klonován do ReNeo ligováním Xba/Notl fragmentu z PB7BS (+ AvrlI) do HP22/ReNeo/NotI (+AvrlI).

Exprese rekombinantních molekul fVIII

PB“/ReNeo/NotI (+ΛνΗΙ) a HP22/ReNeo/NotI (+AvrlI) byly tranzientně transfekovány do COS buněk a exprimovány jak bylo již dříve popsáno (Lubin, LM, et al. (1994) J.Biol. Chem. 269: 8639-8641], Jako kontroly byl provedeny transfekce HB-/ReNeo/NotI a bez dDNA.

Aktivita fVni PB- HP22 a HB- byly měřeny chromogenním testem následujícím způsobem. Vzorky fVIII v supematantech COS buněčných kultur byly aktivovány 40 nM trombinem v 0,15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4 v přítomnosti 10 mM faktoru IXa, 425 nM faktoru X, á 50 μΜ unilamelárních fosfatidylserin/fosfatidycholínových (25/75 hmotn.) vezikulú. Po 5 minutách byla reakce zastavena 0,05 M EDTA a 100 mM rekombinantního desulfatohirudinu a výsledný faktor Xa byl měřen testem s chromogenním substrátem. V testu s chromogenním substrátem bylo 0,4 mM Spectrozym Xa přidáno a bylo sledováno uvolňování paranitroanilidu měřením absorbance roztoku při 405 nm.

Výsledky ze supematantů dvou nezávisle transfekovaných buněčných kultur (absorbance 405 nm za 1 minutu) byly následující.

HB: 13,9

PB: 139

HP22: 100 „slepá“ kontrola: < 0,2

Tyto výsledky ukazují, že prasečí fVIII postrádající doménu B a fVIII postrádající doménu B sestávající z prasečí Al a A2 podjednotky jsou aktivní a vedou k předpokladu, že mají dokonce vyšší aktivitu než humánní fVIII postrádající doménu B,

PB- byl částečně purifikován a koncentrován z růstového média chromatografii na heparinSepharose. Heparin-Sepharose (10 ml) byla ekvilibrována s 0,075 M NaCl, lOmM HEPES,

2,5 mM CaCl₂, 0,005 % Tween-80, 0,02 % azid sodný, pH 7,4. Médium (100 až 200 ml) z expri- j mujících buněk bylo naneseno na heparin-Sepharose, která pak byla promyta 30 ml ekvilibrač- | ního pufru bez azidu sodného. PB- byl eluován 0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂,

0,01 % Tween-80, pH 7,4, a pak byl uskladněn při -80 °C. Výtěžek fVIII koagulační aktivity byl * typicky 50 až 75 %.

Stabilní exprese prasečího fVIII postrádajícího doménu Β (PB-)

Transfekované buněčné linie byly udržovány vDulbeccove Eaglem modifikovaném médiu F12 obsahujícím 10% fetální hovězí sérum, 50U/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomycinu. Fetální hovězí sérum bylo tepelně inaktivováno při 50 °C jednu hodinu před použitím. HB-/ReNeo a PB-ReNeo/Notl (+AvrII) byly stabilně transfekovány do buněk BHK a selektovány na rezistenci ke geneticinu užitím obecně známého postupu, který byl dříve publikován [Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269:86398641] s výjimkou toho, že exprimující buňky byly udržovány v růstovém médiu obsahujícím 600 pg/ml geneticinu. Buňky z kultivačních lahví Coming T-75 pěstované do konfluence byly přeneseny do trojhranných kultivačních lahví Nunc s médiem obsahujícím 600 pg/ml geneticinu a dále pěstováno až do konfluence. Médium bylo odebráno a nahrazeno AIM-V médiem bez séra (Life Technologies, lne.) a bez geneticinu. Exprese faktoru VIII byla monitorována jednofázovým testem koagulační aktivity faktoru VIII (viz výše) a 100 až 150 ml bylo odebíráno jedenkrát denně po dobu čtyřech až pěti dnů. Maximální hladiny exprese v médiu pro HB- a PB- byly 102 jednotek koagulační aktivity faktoru VIII najeden ml a 10 až 12 jednotek na ml, v uvedeném pořadí.

Purifikace PBPB- byl precipitován ze supematantu kultivačního média užitím 60% saturovaného roztoku síranu amonného a pak purifikován W3-3 imunoafinitní chromatografii na mono Q HPLC, jak bylo již dříve popsáno pro purifikaci z plazmy pocházejícího prasečího faktoru VIII [Lollar et ak (1993) Factor VIII/Factor Vlila. Methods EnzymoL 222:128-143]. Specifická koagulační aktivita PB-byla měřena jednofázovým koagulačním testem [Lollar et al. (1993) supra] a byla podobná aktivitě prasečího faktoru VIII pocházejícího z plazmy.

Když byl analyzován elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu, PB- preparát obsahoval tři pásy se zjevnou molekulovou hmotností 160 kDa, 82 kDa, a 76 kDa, 82 kDa a 76 kDa pásy byl již dříve popsány jako heterodimery obsahující A1-A2 a ap-A3-Cl-C2 domény (kde ap označuje aktivační peptíd) [viz Toole et al. (1984) Nátuře 312:342-347]. 160 kDa pás byl přenesen na polyvinylidenfluoridovou membránu a pak podroben NH₂-koncovému sekvencování, které poskytlo fragment Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (kde Xx představuje neurčenou polohu), což je NH₂-koncová sekvence jednořetězcové.molekuly faktoru VIII [Toole et al. (1984) supra]. Takže PB-je částečně opracováván štěpením mezi doménami A2 a A3, takže sestává ze dvou forem, a sice jednořetězcového proteinu Al-A2-ap-A3-Cl-C2 a heterodimeru Al-A2-ap-A3-Cl-C2. Podobné opracování rekombinantního HB- bylo také popsáno [Lind et al. (1995) Eur, J Biochem. 232:19-27]

Charakterizace prasečí faktoru VIII

Byla stanoven cDNA sekvence prasečího fVIII odpovídající 137 bp 5' UTR, úsek kódující signální peptid (57 bp), a Al (1119 bp), A3 (990 bp), Cl (456 bp) a C2 (483 bp) domény. Společně s drive publikovanou sekvencí B domény a úseků aktivačního peptidu lehkého řetězce [Toole et al. (1986) supra] a A2 domény (Lubin et al. (1994) supra), sekvence popsaná v předkládané přihlášce dokončuje stanovení úplné sekvence cDNA prasečího fVIII odpovídající trans-21CZ 298250 B6 latovanému produktu. Fragment, který zahrnuje cDNA pro 5' UTR úsek, signální peptid aAl doménu byl klonován užitím postupu 5-RACE RT PCR. Primer odvozený z humánní C2 sekvence úspěšně vedl k vytvoření RT PCR produktu, který pak umožnil klonování domén A3, Cl, a 5'—části C2 domény. cDNA odpovídající 3'-části C2 domény a 3' UTR cDNA se ukázaly jako velmi obtížné substráty pro klonování. Zbytek C2 domény byl nakonec klonován postupem „cílové procházky po genu s PCR“ [Parken et al. (1991) supra].

Sekvence popsaná zde v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID Č. 29 byla stanovena jednoznačně s výjimkou nukleotidu 7045 blízko 3' konce C2 domény, kde bylo buďto A nebo G, jak bylo již zmíněno výše. Odpovídající kodon je GAC (Asp) nebo AAC (Asn). Humánní a myší kodony jsou GAC a CAG (Gin), v uvedeném pořadí. Zda se v tomto případě jedná o polymorfismus nebo reprodukovatelný artefakt vnesený PCR je dosud neznámo. CDNA pro rekombinantní hybridní humánní/prasečí fVIII postrádající doménu B obsahující substituce prasečí C2 domény odpovídající jak GAC tak i AAC kodonu byly stabilně exprimovány bez detekovatelného rozdílu v prokoagulační aktivitě. Tento výsledek ukazuje, že zde není funkční rozdíl mezi dvěma variantami C2 domény.

Srovnání predíkované aminokyselinové sekvence úplného prasečího fVIII (SEKVENCE ID Č. 30) s publikovanou humánní sekvencí [Woid et al. (1984) supra] a myší sekvencí [Elder et al. (1993) supra] je ukázáno na obrázku Al až 1H, společně s místy pro post-translační modifikace, proteolytické štěpení, rozpoznávání jinými makromolekulami. Stupeň identity srovnaných/přiřazených sekvencí je uveden v tabulce VII. Jak bylo již dříve uvedeno, B domény těchto biologických druhů jsou více divergentní (více se odlišují) než A nebo C domény. To je ovšem v souladu s pozorováním, že B doména nemá žádnou známou funkci, bez ohledu na značnou velikost této domény. [Elder et al. (1993) supra, Toole et al. (1986) supra], Výsledky získané v předkládaném vynálezu potvrzují, že B doména prasečí řVIII není nezbytná pro jeho aktivitu. Na základě sekvenčních údajů popsaných zde byl syntetizován prasečí řVIII mající deletovanou (odstraněnou) buďto alespoň část nebo celou B-doménu a pak byl exprimován prasečí řVIIIa z kódující DNA mající deletované všechny nebo část kodonů prasečí B domény. Existuje zde také vyšší divergence v sekvencích odpovídajících štěpnému peptidu Al doména APC/faktor IXa (zbytky 337-372) aktivačnímu peptidu lehkého řetězce (tabulka VII). Trombinové štěpné místo v poloze 336 pro vytvoření peptid 337 - 372 je u myši zjevně ztraceno, neboť tento zbytek je glutamin místo argininu [Elder et al. (1993) supra], Relativně rychlá divergence trombinových štěpných peptidů (nebo u myšího fVIII možná zbytkového aktivačního peptidu 337-372) byly již dříve poznány u fibrinopeptidů [Creighton, T.E. (1993) Proteins: Structures a Molecular Proterties, W.H. Freeman, New York, pp. 105-138]. Nedostatek biologické funkce těchto peptidů, jakmile jsou jednou naštěpeny, byl citován jako jeden z možných, důvodů rychlé divergence. Arg562 v humánním fVIII byl navržen jako důležité štěpné místo pro aktivační protein C v průběhu inaktivace fVIII a fVIIIa [Fay, P.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145). Tato místa jsou konzervativní (jsou zachována) jak v humánní, tak i v prasečí a myší sekvenci fVIII.

Potenciální místa N-glykosylace (NXS/T, kde X není prolin) jsou vidět na obrázku 1A až IH. Je zde osm konzervativních N-vázaných glykosylačních míst: jedno je v Al doméně, jedno v A2 doméně, čtyři vB doméně, jedno v A3 doméně a jedno v Cl doméně. 19 cysteinových zbytků v A a C doméně je také zachováno, zatímco existuje divergence cysteinových zbytků v B doméně. Šest ze sedmi disulfidických vazeb v molekule fVIII jsou na homologních místech s faktorem V a ceruloplazminem, a obě disulfidické vazby C domény byly nalezeny také ve faktoru V [McMullen, B.A. et al. (1995) Protein Sci. 4: 740-746], Humánní fVIII obsahuje sulfatovaný tyrosin v pozicích 346, 718, 719, 723, 1664, a 1680 (Pitman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102], Tyto zbytky jsou zachovány i v myším a v prasečím íVÍH (obrázek 1), ačkoliv program CLUSTALW selhal v přiřazení tyrosinového zbytku v myší sekvencí odpovídajícímu Tyr346 v humánním fVIII.

-22CZ 29825« B6

Myší a prasečí plazma mohou korigovat defekty koagulace v humánní plazmě s hemofilií A, což je v souladu s hladinou konzervativním zbytků v doménách A a C těchto biologických druhů. Prokoagulační aktivita prasečího fVIII je vyšší než humánního fVIIl· [Lollar, P. et al. (1992) J Biol. Chem.267:23652-23657]. Rekombinantní prasečí faktor VIII (s deletovanou B doménou) exprimovaný a purifikovaný jak zde bylo popsáno, také vykazuje vyšší specifickou koagulační aktivitu než humánní fVIII, srovnatelnou s prasečím fVIII pocházejícím z plazmy. To by mohlo být způsobeno sníženou spontánní rychlostí disociace A2 podjednotky z aktivního heterotrimeru fVIIa: A1/A2/A3-C1-C2. Zda rozdíly v prokoagulační aktivitě odrážející evoluční změnu ve funkci jakožto příklad adaptace druhů [Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. 36:213 244] není známo. Nyní, když je prasečí cDNA fVIII sekvence odpovídající trans latovanému produktu úplná, homologní skenovací mutageneze [Cunningham, B.C., et al. (1989) Science 243:1330— 1336] může poskytnout cestu k identifikaci strukturních rozdílů mezi humánním a prasečím fVin, které jsou příčinou vyšší aktivity prasečího proteinu.

Prasečí fVIII je typicky méně reaktivní s inhibičními protilátkami, které se tvoří u hemofiliků, kterým byla podána transfuze s fVIII nebo které se tvoří jako autoprotilátky v obecné populaci. To představuje základ pro použití koncentrátu prasečího fVIII při léčení pacientů s inhibičními protilátkami [Hay a Lozier (1995) supra]. Většinou inhibičních protilátek je namířena proti epitopům lokalizovaným v doméně A2 nebo C2 [Fulcher C.A. et al. (1985) Proč. Nati. Acad Sci. USA 82:7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA: 85:6152-6156; Scandella, D.et al. (1989) Blood 74:1618-1626). Navíc byl identifikován epitop neznámého významu, který leží buďto v doméně A3 nebo Cl [Scandella et al. (1989) supra: Scandella, D. et al. (1993) Blood ^Τ.\Ί6Ί-\ΊΊ5’, Nakai, H. et al. (1994) Blood84:224a]. A2 epitop byl mapován do polohy zbytků 484 až 508 metodou homologní skenovací mutageneze (Healey et al. (1995) supra]. V tomto segmentu velikosti 25 aminokyselinových zbytků je relativně nízký podíl identických sekvencí (16/25 neboli 64 %). Je zajímavé, že tento úsek, který se zdá být funkčně důležitý, a to na základě faktu, že protilátky proti němu mají inhibiční účinek, byl zjevně vystaven relativně rychlejšímu genetickému driftu. Srovnání prasečí A2 domény a A3 domény ukazuje, že A2 epitop nesdílí řádkou detekovatelnou homologii s odpovídajícím úsekem v A3 doméně.

Pomocí delečního mapování byla lokalizace C2 inhibičního epitopu humánního ťVIII navržena do úseku zbytků 2248 až 2312 [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819]. Humánní a prasečí fVIII jsou z 83 % identické v tomto segmentu 65 aminokyselinových zbytků. Avšak homologní skenovací mutageneze tohoto úseku s cílem charakterizovat C2 epitop vedla k odhalení, že hlavní determinanta C2 epitopu je neočekávaně lokalizovaná v úseku odpovídajícímu aminokyselinám 2181 až 2243 (viz SEKVENCE ID. Č. 2 a obrázek 1H).

í

Byly připraveny proteiny hybridního humánního-prasečího faktoru VIII, ve kteiých různé úseky C2 domény humánního faktoru VIII byly nahrazeny odpovídajícími částmi prasečího faktoru VIII, a sice užitím strategie zde popsané (viz příklad 5). Syntéza různých C2 hybridních faktorů VIII byla provedena prostřednictvím konstrukce hybridní kódující sekvence DNA, s využitím nukleotidové sekvence kódující prasečí C2 úsek uvedené zde jako SEKVENCE ID Č. 30. Každá hybridní DNA byla exprimována v transfekovaných buňkách, takže hybridní faktory VIII mohly být částečně purifikovaný z růstového média. Aktivita, v nepřítomnosti inhibitorů, byla měřena jednofázovým koagulačním testem.

Panel pěti humánních inhibitorů byl užit k testování každého z hybridních faktorů VIII. Bylo již dříve prokázáno, že inhibiční plazmy obsahující protilátky anti-faktor VIII byly namířeny proti humánní C2 doméně, a sice na základě schopnosti rekombinantní humánní C2 domény neutralizovat inhibici. Ve všech testovaných plazmách byl titr inhibitorů neutralizován více než ze 79 % C2 doménou nebo lehkým řetězcem, avšak méně než z 10 % rekombinantní humánní A2 doménou. Navíc C2-hybridní faktory VIII byly testovány proti myším monoklonálním protilátkám, které se neváží na C2 doménu, a podobně jako humánní C2 inhibiční protilátky, inhibují vazbu faktoru na fosfolipid a na von Willebrandův faktor.

-23CZ 298250 B6

Srovnáním titrů inhibičních protilátek proti C2-hybridním faktorům VIII bylo ukázáno, že hlavní determinanta humánního C2 inhibičního epitopu leží v úseku aminokyselinových zbytků 2181 až 2243 (viz SEKVENCE ID Č. 2 a také obrázek IH). Anti-C2 protilátky namířené proti úseku směrem k COOH-konci od zbytku 2253 nebyly identifikovány ve čtyřech z pěti ser pacientů. Srovnáním hybridů majících prasečí sekvence odpovídající humánním aminokyselinovým zbytkům v polohách 2181 až 2199 a 2207 až 2243 se ukázalo, že oba úseky přispívají k vazbě proti-* látky. Prasečí aminokyselinová sekvence odpovídající humánním zbytkům 2181 až 2243 je číslována 1982 až 2044 v SEKVENCE ID Č. 30. Sekvence prasečí DNA kódující prasečí aminokyseliny očíslované 1982 až 2044 je sekvence nukleotidů 5944 až 6132 v SEKVENCE ID Č. 29.

S odkazem na obrázek IH je vidět, že v úseku 2181 až 2243, je 16 aminokyselinových rozdílů mezi humánní a prasečí sekvencí. Rozdíly byly nalezeny ve zbytcích 2181, 2182, 2188, 2195 až 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224 až 2227, 2234, 2238 a 2243. Nahrazení jednoho nebo více z těchto aminokyselinových zbytků může být provedeno, čímž se získá modifikovaný humánní faktor Vlil, kteiý je nereaktivní s humánními anti-C2 inhibičními protilátkami. Alaninová skenovací mutageneze poskytuje vhodný postup pro vytváření alan i nových substitucí přirozeně se vyskytujících zbytků, jak bylo dříve popsáno. Také aminokyseliny jiné než alanin mohou být nahrazovány. Alaninové substituce jednotlivých aminokyselin, zejména těch, které jsou odlišné v humanní/prasečí nebo humánní/myší sekvenci nebo které s největší pravděpodobností přispívají k vazbě protilátky, mohou poskytnout modifikovaný faktor VIII se sníženou reaktivitou s inhibičními protilátkami.

Obrázky 1A až IH dohromady ukazují přiřazené (srovnané) aminokyselinové sekvence humánního, prasečího a myšího faktoru VIII, Obrázek 1A srovnává úseky signálního peptidu (humánní SEKVENCE ID Č. 31; prasečí SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1 až 19; myší SEKVENCE ID Č. 28, aminokyseliny 1 až 19). Aminokyseliny na obrázcích 1A až IH jsou číslovány tak, že první alanin zralého proteinu je označen jako č. 1, a tudíž aminokyseliny signálního peptidu mají negativní čísla. Humánní fVIII sekvence v SEKVENCI ID Č. také začíná prvním alaninem zralého proteinu jakožto aminokyselinou č. 1. V aminokyselinové sekvenci myšího fVIII (SEKVENCE ID Č. 28) a prasečího fVIII (SEKVENCE ID. Č. 30) je první aminokyselina (alanin) zralého proteinu označena jako aminokyselina č. 20. Obrázky 1A až IH ukazují srovnání odpovídajících sekvencí humánního, myšího a prasečího fVIII, a to tak, že úseky s největší aminokyselinovou identitou leží vedle sebe. Číslování aminokyselin na obrázcích 1A až IH platí pouze pro humánní ÍVIIL Obrázek 1B ukazuje aminokyselinovou sekvenci humánní (SEKVENCE ID Č. 2, aminokyseliny 1 až 372), prasečí (SEKVENCE ID Č. 30, aminokyseliny 20 až 391), a myší (SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 20 až 391) A1 domény. Obrázek 1C ukazuje aminokyselinovou sekvenci humánní (SEKVENCE ID Č. 2, aminokyseliny 373 až 740), prasečí (SEKVENCE Č. Č. 30, aminokyseliny 392 až 759) a myší (SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 392 až 759) domény A2 faktoru VIII. Obrázek ID poskytuje aminokyselinovou sekvenci humánní (SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 760 až 1449) a myší (SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 760 až 1644) B domény faktoru VIII. Obrázek 1E srovnání aminokyselinové sekvence humánního, prasečího a myšího (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 1649 až 1689; SEK VENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1450 až 1490; a SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 1641 až 1678, v uvedeném pořadí) aktivačního peptidu lehkého řetězce faktoru VIII. Obrázek 1F poskytuje srovnání humánní, prasečí a myší sekvence (SEKVENCE ID. Č, 2, aminokyseliny 1690 až 2019; SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1491 až 1820; a SEKVENCE ID. Č. 28, amino-’ kyseliny 1679 až 2006, v uvedeném pořadí) A3 domény faktoru VIII. Obrázek IG ukazuje aminokyselinové sekvence Cl domény humánního, prasečího a myšího (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 202 až 2172; SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1821 až 1973; a SEKVENCE ID. C. 28, aminokyseliny 2007 až 2159, v uvedeném pořadí) faktoru VIII. Obrázek IH ukazuje sekvence C2 domény humánního, prasečího a myšího (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 2173 až 2332; SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1974 až 2133; a SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 2160 až 2319, v uvedeném pořadí) faktoru VIII.

-24CZ 298250 B6

Kosočtverce označují místa sulfatovaného tyrosinu, předpokládaná vazebná místa faktoru IXa_} fosfolipidu a proteinu C jsou dvojitě podtržena, a úseky podílející se na vazbě anti-A2 a anti-C2 inhibtčních protilátek jsou vyznačeny kurzívou. Hvězdičky vyznačují konzervativní aminokyselinové sekvence. Viz také SEKVENCE ID. Č. 29 (cDNA prasečího faktoru VIII) a SEKVENCE

ID. Č. 30 (dedukovaná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII). Je užit systém číslo- 4 vání humánní sekvence jako reference [Wood et al. (1994) supra}. Al, A2, a B domény jsou definovány trombinovými štěpnými místy v pozici 372 a 740 a štěpným místem neznámé proteázy v poloze 1648 jako segmenty zbytků 1 až 372, 373 až 740, a 741 až 1648, v uvedeném pořadí [Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 25: 8343-8347). A3, Cl, a C2 domény jsou definovány jako zbytky 1690 až 2019, 2020 až 2172, a 2173 až 2332, v uvedeném pořadí [Vehar et al. (1984) supra). Štěpná místa pro trombin (faktor Ha), faktor IXa, faktor Xa a APC [Fay et al: (1991) supra; Eaton, D. etl al. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. et al. (1992) Blood 80: 3120-3128] jsou ukázány tak, zeje jméno enzymu umístěno nad reaktivním argininem. Kyselý peptid je odštěpen od lehkého řetězce fVIII trombinem nebo faktorem Xa v poloze 1689. Předpokládaná vazebná místa pro faktor IXa [Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lentint, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), fosfolipid (Foster,

P.A. et al. (1990) Blood 75; 1999-2004) a protein C (Walker, F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1484-1489] jsou dvojitě podtrženy. Úseky zúčastněné ve vazbě anti- A2 [Lubin et al. (1994) supra; Healy et al, (1995) supra} a již dříve navržené pro anti-C2 inhibiční protilátky jsou vyznačena kurzívou. C2 inhibitory epitop identifikovaný jak zde bylo popsáno (aminokyseliny 2181 až 2243 v humánní sekvenci) je ukázán jako jedenkrát podtržený úsek na obrázku IH. Místa sulfatovaného tyrosinu (Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994) supra} jsou označena symbolem ♦.

Příklad 7

Konstrukce POLI22 a exprese v buňkách ledvin novorozených křečků

POLI212 je prasečí faktor VIII částečně bez domény B, mající B doménu deletovanou kromě., toho, že 12 aminokyselin NH₂ konce B domény a 12 aminokyselin -COOH konce jsou zachovány.

cDNA kódující sekvence pro domény Al, A2, ap-A3-Cl, a C2 prasečího fVIII byly získány, jak bylo popsáno v příkladu 5. Nukleotidová sekvence DNA a odvozená aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII jsou uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 29 a SEKVENCE ID. Č. 30, v uvedeném pořadí. Amplifikované fragmenty byly odděleně klonovány do plazmidu pBluescript IIK5' (pBS).

POLI212 se týká cDNA kódující prasečí fVIII postrádající většinu B domény, ale obsahující DNA sekvenci kódující 24-aminokyselinový linker mezi doménami A2 a apod. POL1212 byl konstruován v savčím expresním vektoru, ReNeo, který byl získán od firmy Biogen. ReNeo se může replikovat v bakteriích, může se replikovat jako epizom v buňkách COS pro přechodnou expresi faktoru VIII, nebo může být integrován do celé řady savčích buněk. Skládá se ze 1) sekvencí odvozených z plazmidu pBR322, které obsahují počátek replikace a gen rezistence na ampicilin, 2) gen rezistence na neomycin, jehož exprese je pod kontrolou SV40 promotoru/enhanceru, SV40 malého t intronu, a regulačního elementu SV40 polyadenylačního signálu, 3) místa pro inzerci fVIII a jeho signálního peptidu, jehož exprese je pod kontrolou SV40 enhanceru, hlavní pozdní promotor adenoviru typu 2, a tripartitní vedoucí sekvence adenoviru typu 2. Místo ReNeo vektoru může být užit každý vektor mající podobné funkční složky.

POL1212/ReNeo byl připraven v několika krocích. Nejdříve byly cDNA kódující těžký řetězec prasečího fVIII (A1-A2) a cDNA kódující lehký řetězec prasečího ťVIII (ap-A3-Cl-C2) odděleně sestaveny v pBS. Z těchto konstruktů byla DNA kódující prasečí fVIII bez domény B sesta-25CZ 298250 B6 vény v pBS (PB-/pBS). Tato forma prasečího fVIII postrádá celou B doménu, definováno jako aminokyseliny odpovídající zbytkům 741-1648 v humánním fVIII (nukleotidy 2278 - 5001 v humánní sekvenci). Dále byla humánní A2 doména v expresním vektoru ReNeo (HB/ReNeo) j s humánním fVIII postrádajícím doménu B substituována DNA kódující prasečí A2. Humánní Ji domény byly substituovány DNA kódující zbytek prasečího těžkého řetězce a DNA kódující prasečí lehký řetězec ve dvou dalších krocích s použitím konstruktů s prasečím těžkým řetězcem/pBS a PB/pBS vytvořených dříve. Fragment humánní B domény kódující 5 C-koncových I a 9 N-koncových aminokyselin byl vložen mezi A2 a A3 domény za vzniku konstruktu nazvaného PSQ/ReNeo [Healey et al., 1998 92: 37013709]. Zbytky Glu2181-Val2243 obsahují hlavní determinantu inhibičního epitopu vC2 doméně humánního faktoru Vlil. Tento konstrukt byl použit jako templát pro vytvoření fragmentu prasečí B domény kódujícího 12 C-koncový a 12 N-koncových aminokyselin. Tento fragment byl vložen mezi domény A2 a A3, což mělo za následek konečný konstrukt, POL12l2/ReNeo.

POL1212 linker se 24 aminokyselinami se skládá z prvních 12 a posledních 12 zbytků B domény prasečího fVIII. POL1212 linker má následující sekvenci:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (sekvence id. č. 32)

Nukleotidová sekvence odpovídající 1212 linkeru a sousedících aminokyselin je (SEKVENCE ÍD. Č. 33)

GTC ATTGAA ČCT AGG AGC TTT GCG CAG AAT TCA AGA CCC CCT AGT

V	IEP R S	F A Q	N 8	R	P P	S
GCG	AGC GČT CCA AAG CCT	CČG GTC ČTG	r CGA CGG	CAT	CAG AGG	GAC
A	S A P K P	P V L	R R	H	Q R	P
ATA AGC CIT CCT ACT
I	8 L P T

POL1212 linker byl syntetizován mutagenezí „splicing-byoverlap extension (SOE) takto:

PCR reakce použité pro vytváření SOE produktů byly tyto:

Reakce č. 1

Vnější primer: Rev 4, což je primer pro prasečí A2, nukleotidy 1742-1761. (SEKVENCE ID.

Č. 29). Sekvence je: 5'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (SEKVENCE ID. Č. 34).

Vnitřní primer: OL12, což je prasečí reverzní primer pokrývající prvních (5') 15 aminokyseliny

OL1212 a posledních (3') 5 aminokyselin prasečí A2. Sekvence je:

5'CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTCAATGAC-3' (SEKVENCE ID. Č. 35)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasečí DNA od nukleotidu 1742 a A2 doméně k 2322 v OL1212, 580 bp.

-26CZ 298250 B6

Reakce Č, 2

Vnější primer: P2949je prasečí reverzní A3 primer, nukleotidy 2998-3021 ze sekvence id. č. 29.

Sekvence je:

5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (viz SEKVENCE ID. Č. 29)

Vnitřní primer: OL12+, prasečí primer pokrývající posledních (3') 16 aminokyselin OL1212 a prvních (5') 6 aminokyselin aktivačního peptidu, nukleotidy 2302-2367 ze SEKVENCE ID.

C. 29. Sekvence je:

5'-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCTGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATAAGCCTTCCTACT-3' (SEKVENCE ID. Č. 36)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasečí od nukleotidu 2302 v OL 1212 do nukleotidu 3021 v doméně A3, 719 bp

SOE reakce

Primery: Rev 4, P2949Templáty: Fragment z reakce č. 1 (bp) a fragment s nízkou teplotou tání z reakce č. 2 (bp)

Produkt: prasečí DNA od nukleotidu 1742 v A2 doméně do nukleotidu 3021 v A3 doméně (SEKVENCE ID. Č. 29) včetně OL1212,1279 bp. Reakční produkt byl precipitován ethanolem.

1212 linker byl vložen do PSQ/ReNeo štěpením SOE produktu (inzertu) a PSQ/ReNeo (vektoru) sBsaBI. Vektor a inzert byly ligovány s použití T4 ligázy a produkt byl užit k transformaci 30 buněk E. coli XLl-Blue. Plazmtdová DNA byla připravena z několika kolonií a sekvence 1212 - - linkeru a další PCR generovaná sekvence byly ověřeny sekvenční analýzou DNA.

Pěstování buněk ledvin novorozených křečků (BHK) CRL-1632

Buněčná linie BHK byla získána ze sbírky ATCC, přístupová identifikace CRL-1632, a byla uložena zmražená v -20 °C až do dalšího použití. Buňky byly rozmraženy ve 37 °C a vloženy do 10 ml kompletního média, definovaného jak DMEM/F12, 50 U/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomyčinu plus 10% fetální hovězí sérum (FBS). FBS bylo zakoupeno o firmy Hyclone, Logan, Utah. Buňky byly stočeny po dobu 2 minut ve 300 RPM. Médium bylo odsáto v buňky byly 40 resuspendovány ve 2 ml kompletního média v láhvi T-75 obsahující 20 ml kompletního média,

POL1212 byl exprimován v buňkách jak ledvin novorozených křečků (BHK), tak v buňkách váječriíků čínského křečka (CHO). Byly použity dvě BHK linie, linie CRL-1632 z ATCC a další BHK linie získaná od R. Mcgillivray, University of British Columbia, [Funk et al. (1990) Bioche45 mistry, 29:1654-1660], Poslední zmíněné byly pěstovány bez selekce v laboratoři původců a nazvány BHK 1632 (Emory). CHO buněčná linie byla CHO-K1, ATCC přístupové č. CCL-61. Exprese průměrného klonu z buněčné linie Emory a z buněk CHO-K1 byla poněkud vyšší než z buněk CRL-1632, jak usuzována z aktivity v chromogenním testu.

Buňky pěstované v lahvích T-75 vytvořily konfluentní monovrstvu. Bylo připraveno 60 ml kultury buněk E. coli XLl-Blue nesoucí plazmid POL1212/ReNeo v médiu LB/ampicilin (50 mg/ml).

-27CZ 298250 B6

Transfekce buněk CRL-1632 BHK plazmidem POL1212/ReNeo

DNA z kultury buněk POL1212/ReNeo XLl-Blue pěstovaných přes noc byla připravena užitím soupravy pro minipreparaci Spin Miniprep kin (Qiagen, Valencia, CA). Jedna láhev buněk CRL-1632 byla rozdělena do zásobní lahve se 0,2 ml a do lahve pro transfekci s 0,3 ml z celkových 2 ml. Další láhev byla doplněna čerstvým médiem. Médium bylo DMEM/F12 + 10% Hyclone FSB + 50 U/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomycinu. Buňky CRL-1632 byly rozděleny do 6 jamkových destiček a po dosažení 50 až 90 % konfluence určeny pro transfekci (0,3 ml buněk z lahve T-75 ve 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] v každé jamce) užitím čerstvého média DMEM/F12 + 10 % Hyclone FBS + 50 U/ml penicilín, 50 pg/ml streptomycin.

Následující roztoky byly připraveny ve sterilních zkumavkách o objemu 1 až 2 ml:

A) 48 μΐ (10 μg) Miniprep POLl2l2/ReNeo DNA plus μΐ média bez séra (DMEM/F12) plus 10 μΐ Lipofectin™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) 10 μΐ Lipofectin plus 190 μΐ média („slepá“ transfekce) bylo jemně smícháno a DNA s Lipofectinem ponechány reagovat 15 minut při teplotě místnosti. Během tohoto času byly buňky promyty dvakrát se 2 ml DMEM/F12. 1,8 ml DMEM/F12 pak bylo přidáno k buňkám. Komplex DNA/Lipofectin byl přidán po kapkách k buňkám, a jemně protrepán, aby se promíchal. Buňky byly ponechány v inkubátoru přes noc. DNA/Lipofectin byl odebrán a přidány 3 ml média se sérem k buňkám. Buňky pak byly inkubovány 30 až 48 hodin. Geneticin byl zakoupen od firmy Life Technologie, Gaithersburg, MD. Buněčné kultury byly naředěny 1:20, 1:50 a 1:100, 1:250, 1:500 a naneseny na 10 cm misky v 10 ml média se sérem obsahujícím 535 pg/ml geneticinu. Za několik dnů buňky, které nepřijaly plazmid POL1212/ReNeo byly usmrceny působením geneticinu. Zbylé buňky pokračovaly v replikaci v médiu s geneticinem a vytvořily na miskách viditelné monovrstevné kolonie.

- Exprese a test POL1212 v buňkách BHK CRL-1632 ' ..........

Malé plastové kroužky byly umístěny kolem kolonií. Kolonie byly odsáty odděleně použitím kompletního média a přeneseny do zkumavek. Tyto kolonie jsou označovány jako „kruhově klonované kolonie“. Tyto kruhové klonované kolonie byly naneseny na 24 jamkové destičky a dále pěstovány v kompletním médiu.

Test s chromogennírn substrátem pro expresi faktoru VIII Pomocí buněk transfekovaných CRL-1632

Vzorky POL1212 ze supematantů buněčných kultur byly smíchány s 50 nM purifikovaného prasečího faktoru IXa a 0,05 mM fosfatidylcholin/fosfatidylserinových (PCPS) vezikulů v 0,15M NaCl, 20 m HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01 % Tween 80, pH 7,4. Jako kontrola bylo použito médium z buněčných kultur „slabě“ transfekovaných buněk, Trombín a faktor X byly přidány simultánně v konečné koncentraci 40 a 425 nM, v uvedeném pořadí. Trombin aktivuje faktor Vlil, který pak, spolu s PCPS, slouží jako kofaktor pro faktor IXa v průběhu aktivace faktoru X.

Po 5 minutách aktivace faktoru X pomocí faktoru IXa/faktoru VlIIa/PCPS byla zastaveny přidáním EDTA na konečnou koncentraci 50 mM. Ve stejném čase aktivace faktoru Vlil, trombinem byla zastavena přidáním inhibitoru trombinu, rekombinantního desulfatohirudinu, na konečnou koncentraci 100 nM. 25 μΐ vzorek reakční směs byl přenesen do jamky mikrotitrační destičky, kam bylo přidáno 74 μΐ Spectrozymu Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), což je chromogenní substrát pro faktor Xa. Konečná koncentrace Spectrozymu Xa byla 0,6 mM. Změna absorbance při 405 nm v důsledku štěpení Spectrozymu Xa faktorem Xa byla monitorována souvisle

-28CZ 298250 B6 po dobu 5 minut pomocí čtecího zařízení pro mikrotitrační destičky Vmax Kinetic Plate Reader (Molecular Devices, lne. Menlo Park, CA). Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnota A₄₀₅/min.

Chromogenní test na Faktor VIII deseti kruhově-klonovaných kolonií;

-i í

j

Poč.ét kolonií	Aíos/niin (x 10-)
Puf r	0,2
1	2,1.
2	8,4
3	6,4
4	ao,7
5	12,5.
6 '	7,6
7	51,3
8	139/5
9.......	3,8
10	8,4

Tyto výsledky ukazují, že všech deset kolonií, které byly vybrány, exprimují aktivitu faktoru VIII alespoň desetkrát vyšší než je hodnota pozadí.

Aktivita z média kolonie 8, která byla kolonie s nejvyšší expresí, byla dále zkoumána pomocí io...- jednofázového koagulačního-testu-faktoru VIII: V tomto testu bylo 50 ml plazmy déficieňcína faktoru VIII (George Ring Biomedical Overland Park, KA), 5 ml vzorku nebo standardu, a 50 ml reagencie pro aktivovaný parciální tromboplastinový test, APTT (Organon Teknika, Durham, NC) inkubováno 3 minuty ve 37 °C. Vzorky obsahovaly médium z kolonie 8 naředěné v 0,15 M naCl, Hepes, Ph 7,4 (HBS) nebo, jako kontrola, kompletní médium. Koagulace byla iniciována. 15 přidáním 50 ml 20 mM CaCh. Koagulační čas byl měřen použitím zařízení ST4 BIO Coagulation

Instrument (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ]. Standardní (kalibrační) křivka byla získána pomocí ředění sloučené, citrátem ošetřené normální humánní plazmy, šarže č. 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA). Koncentrace standardu faktoru VIII byla 0,9 jednotky na 1 ml.

Standardní (kalibrační) křivka

	Ředění	•U/ml. .	Koagulační čas
1)	neředěno	0,96	45,2;
2)	1/3 (HBS)	0,32	53,7
3)’	1/11 (HBS)	0,087	62/5
47	1/21 (HBS)	,0/0.46^;	68,9

-29CZ 298250 B6

Lineární regrese funkce koagulačního času proti logaritmu koncentrace standardu poskytla korelační koeficient 0,997.

Test látek poskytl následující koagulační čas, které byly převedeny na hodnoty jednotky/ml použitím standardní křivky:

Vzorek	Koagulační	U/ml
čas	(s)
1). Kolonie 8 (24h), 1/10 v	HBS	40,6	1,74 x 10 = 17,4
2) Kolonie 8 (24h), 1/10 v	HfiS	41,1	1,63 x 10 = 16,3
. 3) Kolonie, 8 (24h)·, 1/20 v	BBS	47 >7	0,69 x 20 - 1-3, 8
4) Kolonie 8 (24h) ·, 1/20 v	HBS	47,2	O,73 x 20. = 14,6
5) Úplné médium		82,9	0,007
6) Úplné médium		83,3	0,006

Tyto výsledky ukazují, že koagulační aktivita kolonie 8 je přibližně 2000krát vyšší než u kontrolního vzorku.

DNA sekvence kódující POL1212 je zde uvedena v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. C. 37. Kódovaná aminokyselinová sekvence POL1212 je uvedena v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 38. Další purifikace POLI212 mohou být prováděny použitím celé řady známých metod, jako je např. imunoafinitní chromatografie a HPLC chromatografie - viz příklady 2 a 3.

' Obecné poznámky ná závěr

Je třeba mít na zřeteli, že malé variace aminokyselinové sekvence nebo DNA sekvence kódující takovou aminokyselinovou sekvencí týkající se POL1212 mohou být vneseny, aniž by se podstatně změnila jejich základní funkce. Například délka sekvence B domény ponechané jako linker mezi A2 doménou a aktivačním peptidem může být větší nebo menší v rámci možností vyplývajících ze známého stavu techniky. Sekvenční varianty mohou být vneseny do úseku linkeru, přičemž se uchová ekvivalentně funkční POLI 212 a prasečí faktor VIII bez domény B, jak je ukázáno v tomto textu a jak je známo ve stavu techniky. Na základě porovnání známých aminokyselinových sekvencí faktorů VIJI majících koagulační aktivitu v humánní krvi, mohou být připraveny na základě aminokyselinové sekvence POLI 212 sekvenční varianty jak substitucemi jednotlivých aminokyselin, tak .i substitucemi peptidových segmentů známými funkčními variantami, kteréžto varianty si zachovávají své základní funkce. Zmíněné varianty nejsou nijak vyčerpávající a omezující, jsou uvedeny pouze jako příklad modifikací sekvence, které mohou být připraveny odborníkem na základě stavu techniky, aniž by se podstatně změnily vlastnosti proteinu. Všechny takové varianty a modifikace spadají do nároků předkládaného vynálezu nebo jejich ekvivalentů.

-30CZ 298250 B6

Přehled sekvencí uvedených v seznamu sekvencí:

SEKVENCE ID. Č;	Identifikace
1	cDNA humánního- faktoru VIII, kód pro aminokyselinu č. 1 zralého proteinu začíná nukleotidem č. 208.
2	Aminokyselinová sekvence humánního faktoru
3	cDNA A2 domény pras,ečího faktoru VIII
4	Aminokyselinová sekvence A2 domény prasečího faktoru VIII
5 až 27	Sekvence olígonukleotídových primerů ( viz; pří klád 5)
.28	Aminokyselinová sekvence myšího, faktoru Vili
29	cDNA prasečího faktoru VIII
30	Aminokyselinová sekvence prasečího faktoru. VIII
.31	Aminokyselinová sekvence signálního peptidu humánního 'faktoru Vili
32 až 36	Sekvence olígonukleotídových primerů (viz příklad 7)
37	DNA kódující POL1212·
3,8'	Aminokyselinová sekvence POLI212

-31CZ 298250 B6

SEZNAM SEKVENCÍ <151> 1996-06-26 <160> 38 <170>' Patentln Vfer. 2.0 <21Q> 1 <211> 9009 <2Í2> DNA <21.3> Jíómo šapiens <220>

<22T> GDS <222> (208)..(7203) <4Ó0> 1 ca.gtgggtaa .gttčcttaaa tgctct.gcáá. agaaáttggg actťttcatt aaáťcagaaa 60 ttttactťtť -ttctcčťcct gggagctaaa gaťatttt.ag ágaagaattá accttttgct 120: tctccágt-tg, aacatt.tg.ta gcaatáagtc^: atgcaaátag ágčtctccac ctgcttcttt 180 •ctgtgccttt tgcgattctg ctttagt gcc. _;acc aga ,aga tac tac _:ctg ggt gca 23.4

Ala Thr Arg Arg Tyr Ťýr Leu Gly Ala

5

gtg	g á a	ctg tca tgg' gáč	tát atg cáa. agt gat	íCt.C	ggt	.gág: ctg	cčtf	282
Val	Glů	Leu Sér Trp Asp.	Tyr Met Gin Sér Asp	Leu	'Gly'	Glu Leu	Pro
10		15	20				25
gťg	gác	'gca aga ť.t.ť. cct	cct' aga gtg: cca· aaa	tet'	ttt	cca ttč	áác.	330
Vál	.Asp	Ala Arg Phe Pro ...........30	Pr.ó. Ar.g. Val- Pro_; Lys ......35	,S'ér.	Phe	Pro Phé- 4íÓ	Asn;	. - -
acc	tca	gtc gtg tac aaa	aag act ctg ťtt gta	gaa	ttc	acg_: gtt	cac	370
Thr·	Ser	Vál Val Tyr Lys	Lys. Thr Leu Phe Val	Glu	Phe	Thr Val	His
		45	50			55
.ctt	tť.c	aac: atc- gct aag	cca agg cca ccc tgg	atg	ggt	ctg cta	ggt	426
Leů.	Phe	Asn- Ile Ala- Lys	Pro Arg Pro .Pro; Trp	Meť	Gly	Leu·'Leu	Gly
		60	65		70
cct	áČC	atc čag gct gag	gtt ťát gat ácá gtg	gtč	att	ácá. ctt	aag	474
Pro	Thr,	Ile Gin Ala Glu	Vál Tyr Asp Thr Val	Val	Ile	Thr Leu	Lys
	75		80	.85-
aač	atg	gct· tcc cat .cct	gtc .agt ctt cat, gct	gtt	g.gt	gta t.cc	tac·	522
A$n·	Mét	Ala -Ser Híá Pro	Val Sér Leu His Ala	Vál Gly	Val Ser	Tyr
.90		9.5	100				105
tgg	ááa	gct tet. igag gga	gct gáa tat gať §at	cag	acc	agt čaá	agg	570
Trp	Lys,	Ala Ser Glu.· Gly	Ala Glu. Tyr Asp Asp	G-ln	Thr	Šer Gin Arg
		' ’ 110	liš.....			120'

-32CZ 298250 B6

gag G1U

áaa Lyš

gáá gat gať

aaa. Lys

gtc Vál

ttc čet ggt gga Phe Pro Gly’Gly 130

age čat aca

tat gtc

618

Glu

Ašp Asp 12.5

Ser His

Thr 135

Tyr

Val

tgg

cag

gtč. ctg

aaa

gag

aat. ggt

čča atg

gcc

tet gac

čča

ctg

tgc

666'

Trp

Gin

Val

Leu

Lyš

Glu

Asn

Gly

Pro Met

Ala

Set Ašp

Pro

Leu

Cyš

140

145

150

ctt

acč

.ťač

tca

tát

ct.t

ťct

čát

gtg. gac

ctg

gta aaa

gac

ttg

aat

714

Leu

Thř

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

H'iS

Val Asp

Leu.

Val Lys

Asp

Leu

Asn·

155

160

165

tca

ggc

ctc.

att

gga

gcc

cta

gta *tgt

aga.

gaa ggg

agt

ctg

gcc

762

Ser

Gly

Leu.

Ile

'Gly

Ala

Leu

Val Cys Arg

Glu Gly

Ser

Leu

Ala

170

175

18.0

185-

aág

gaa

aág

ácá

cag

áčC

ttg

cac

aaa·. ttt

áť.a

cta čtt

.ttt,

get

gta

810

Lys

Glu

Lys'·

Thr

Gin

Thr

Leu

His

Lýš Phe.

Ile.

.Leu Leu

Pheí

Ala

Val

190'

1.9.5

*

.200

ttt

gať

gaa

555

’aaa·

ágt

tgg

čac

tca. -gáa

áca

aag aac

ťcc ttg

atg

858

Phe

Ašp

G-iu·

Gly

Lys'

Sér

Trp His

Ser ..Glu

Thr

Lys' Asn

Sér

Leu

Meť

205

110:

215;

cag-

gať

agg

gať

get

•gca

tet

get

cgg gcc

tgg

.cct aaa

atg'

cac

a ca.·

.906

Gin

Asp Arg 'Asp.

Ala

Ser

Ala-

Arg Ala.

Trp

Pro Lys

Met

'His.

Thr

220

225

230

gtc

a ať

ggt

tat

gta.

aac

agg

tet

ctg cca

ggt

ctg att

gga.

tgc

cac.

9.54

Val

Asn.

Glý

Týr

Val

Asn

Arg

'Ser

Leu Pro

Gly

Leu í.le

Gly- Cys

His

235=

•240

245-

agg

a,a 3;.

ťča

'gtc

tát

tgg

cát

gt.g:

att gga

átg

ggc.. ácč

ačt

c.čť

gáa

1002

Ar.£

Lýš:-

Sér

Vál

Tyr

Trp

His

Val.

Ile Gly' .Met

Gly- Thr,

Thr

Pró'

G1U

²⁵⁰

- -

.255

- -

-

. .... . .

260

.....-

--

265

.......

gtg

cac.

tca

a ta:

ttc

ctc^

gaa

ggt;

cac .a ca

ttt

ctt gtg

agg

aac

cat

1050,

Val

His=

Ser

Ile.

Phe

Leu·

Glu

Gly

His Thr

Phe

Leu Val

Arg Asn

His

2.7-0

275

280.

ego

cag- gcg

.tcc

ttg

gaa

atc

tcg

cca ata_;

act

tt.c ctt

ac.t-

get

ca a

10 98

Arg

Gin

Ala

Ser “Leu

Glu

Ile

Ser

Pro Ile

Ťhr

Phe Leu

Thr

Ala

Gin

285_:

290

295

a ca

čte

ttg

a tg..

gac

ctt

gga

cag

ttt cta. ctg

ttt tgt

cat

atc·

tet

1146

Thr·

Leu

Met Asp

Leu

Gly

Gin-

Phe Leu

Leu

Phe Cys

His

Ile.

Ser

300;

305

310

tcc

cac

ca a

čát

-gať

ggc

.atg

* ' gaa

get tát

gtc.

'aaa gta

gač

age

tgt

1194

'Ser

His

'Gin

His

Asp

Glý Meť

Glu

Ala Tyr

Val.

Lys Val

Asp

Ser

Cyš

3-15

32,0

32-5

cca’

gág

gaa'

cčC

<čáá

čta.

ega

atg·'

aaa aat

aat,.

gaa gáa

gčg

gáa

gáč

1.242

Pro-

Glu

.Glú·

ErP

Gin

Leu. Arg

Mét

Lys Ašri

Asn.

•Glu Glu

Ala_:

Glú

Asp

330·

335

340

345

-33CZ 29825U B6

gat :ga’t· gat ctt act Ťyr ' Asp: Asp Asp'Leu Thr	gat tet/gaa atg Asp Šer Glu Met 355	gat gtg’ gtc agg ttt gat :1290 Asp Val Váí Árg_: Phe,Asp 360'
	350
gat	gac.aac tet ccť·	tec	ttt atc caa aťt	c.gc tea gtt 'gcclaag aag	1338.
Asp	Asp/Ásn Ser^; Pro	Ser	Phe ‘ííe Gin ile	⁺ Árg';Šer Val Ala· Lys Lys
	365		370'	375
,ča.t	čet aaa· act v_kgg· gt.a	cat ťac. átť>· get;	get gaa gag gag gac tgg	ί 38 6
.His	Pgó Lys Thr Trp,	Vál	His Tyf Ile Álá	Ala 'Glu GluGi.u Asp Trp
	:380 ‘		385	390”
T	T t ... 1	1		i · t 1í‘ ! r.-ΐ	¹'
.gac.	tát· get ccc fctáí	gtc	ctě gcc cčc gat	. gac _yagá>agt ťat^a-áa» agť	1434
Asp-	'Tyr AÍa. Pro Leu·	Val	Leu Ala. Pro Asp	'Asp Arg .Ser*Tyr Lys Ser
	395		400	405 '
	- .. , . 1 1 ·	.3*	— * ^J ••♦'i - ·* _s - *	3;* . ....·£ tJ«? c* í	: * t
ca a.,	tat ttg aač aat		čet cág-čgg·aťt	ggť - agg - aag * tac^; aaa 1 aaa	1.4.82
Gin	-Tyr Leu, Asn‘ Ásn.	.Gly	Pro: Gin'· Arg Ile	• Gly. Arg -Lys Tyr Lys Lys
4'10		415		4'20 ’ ........ 4 25
	c* C \ . *	ί5	<J‘. * . * ;	^S t7 .A, i *X Ί -irt.
g.t.é\	ega· ttt atg gca	,tac	apa gat, -gaa acc	.· ttt a a.g 1 a cť c g t - g áa* g c t	1530.
val	'Arg Phe .Met Ala	Tyr.	Thr Asp Glu Thr·'	Phe Lys Thr-Arg Glu Ala
	4'30		4 35	4 40
	t * * ’ί	' V?	ti·'·'	Ct. \ t ^h ; tt tíh.	2.·
átt	cág: cat gaa tča	99á	a-tc l-'tg-;gga·· ^c.t	tta Ctt (tat:, ggg gaa < gtt	1578
Ile	Glh His Glu Ser	Gly	Tle Leu Gly Pro	Leu Leu Tyr- Glyp-Glu· Val
	445 ‘.....		4 5Ů	455
	, . ,. _r · .. ·			’ · . y V y A
gga	ghe' ača ctg .ťrg	att	ata ttt .áag áat	caa gca age ága/čpa:tat	162:6
Gly	Asp. Thr Leu Leu 4β0	Ile.	Tle Phe· 'Lys Asn 4 65	Gin Ala Sér Arg. Pro T.ýr 4 70·
. * _	' h n	r *	t ,	ⁿ * ; * e ,σ	* 1
aa.c	arcctac ccť ?cac	g.ga	.atc act gat- gtc	cgt cc.t ,_;ttg tat -tea agg	1674
Asn	Ile· Tyr Pro: -'His	Giy	Ile Thr Asp Val-	Arg Pro Leu Tyr Ser Arg
—	-4-75--------------	—	480	48 5 ’
a	* /t -re tet	tí.c	t · 7 '-.., ..·> UÍ	1 ... ' .t ,. · ., :·' t ’·	i !·
άζ a	tra cpa aaa gg.t	gta	aaa cat ttg aag	• gat .ttt 'cca .att-ícťgTcca	•1722'
Arg	Leu Pf.o Lys <Gly.	Val	Lys His Leu Lys	Asp: Phe Pro Il.e Leu Pro
4 90⁵		.495		500 ,505.
t 2	i; c u* ·. j ' '	!	— _É + - ; T	i ·. ’ .. ::	2F.r
994	gaa a ta· t.tc áaa	tat	aaa. ťgg áca gťg	.act gta gaa gat. ggg cca	Í770^:
čiy	Glu :I4é; Phe Lys	Tyr	Lys Trp Thf Val	Thr Val. Glu Asp. Gl-y íPro
	.......510:		515	520
*	- .·>. !?*·-;	r	*’ <X .. _v Γ	- - ► t.	r
ačť	aaa' <tc# ga.t cčt	999	tgc čtg acc čgc	tat tác tčt ^ca.gt ttč 'gtt;	1818
Thr	Lys Ser Asp Rró	Arg Cys Leu Thr Arg^:	Tyř Tyf Ser Ser'Phe Váí,
	525 '		530	535

aat atg gag -aga gat.	ctá	get tča gga ctc	át.t ggc. :cct ctě cťc*atč	1866
Asn_;	•Met Glu Arg Asp·	Léu·	Ala Ser Gly Leu	ííe Gly Píp Leu. _rLe,u Ile·
	54 Ó		545-......	550
	. i t:	·	' ' ·· f _τ í ; ’	H _; ctí?	.
tgc	t.ac· ááa gaa. tet	igta	gat caa aga gga	a a c c ág ať a 'a t g ť ca g a č	1914
Cys	Tyr Lys .Glu Ser Val	Asp Gin Arg Gly	Asn Gin Tle Met Ser Asp
	555		560	565

-34CZ 298250 B6

aag agg aat

gtc Val

atc Ilé:

ctg ttt.

tčt gta.

tt.ť .Phe

gat gag aac

ega Arg

agg· tgg

1962

Lýs Arg 570

Asn·

-Leu 575

Phe.

Sér

Val

Ašp 58.0

Glu Asn

Ser

Trp 585

tac ctc

aca gag

aat ata

ca a-

cgc

ttt

ctc

c'čc

aat -cca

get

gga

gtg

2010

Tyr Leu

Thr

Glu

Asn-

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn Pro Ala

Gly

Vál

5’90

595

600

'cag ctt

gag gat

cca_:

gag

ttc.

caa

gcc

tcc

aac

atc atg

cac

age

atc

2058

Gin Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile Meť

His

Ser

líe

605

610

615

á.át 'ggc

tat

gťt

tt.ť

gat-

agt

ťtg

cag

ťtg'

•tca

,gtť ,tgť

ttg

cať

gag

.2106

Asn Gly- Tyr

Val.

Phe

Asp Ser

Leu

Gin

Leu

.Ser.

Vál Cýš

Léu

His

Glu

620

625

630

gťg gčá

tač

tgg.

tác

att

čta

agč:

att.

gg.a

g.ca

cag a;c.t

gác

ttc

čtť

2154

Val Ala

Tyr

Trp

Tyr

Ile;

Leu

Sér

Ile

Gly Ala

Gin Thr

Asp

Phe

Leu

635^Ý

640

«45

tet gtc

ttc

tet

99*

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa atg

gtc

tat

gáá

2202

.Ser Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phé

Lyš

'HÍŠ

Lys Met·

Vál

Tyr

Glu

650

655

660:

665

•gac a ca.

ct.c

aCC;

c.ta

ťtc

cca

'ttc.

tca

gga

gaa

act: gtc

•ttc

atg

tcg.

2250

Asp Thr

Leu

Thr

Leu

:Phe

Pro.

Phe,^;

.Šer Gly

GLu

Thr. Val

Phe

:Met

Šer

6.7'0

675

680

atg gáa.

a ač

cca.

ggt

'.čta

tgg. att

ctg

ggg

tg.c

éěc asc

t.ca;

g.ac

ttt

2298

Met Glu

Ašh

Pro·

Gly

Leu,

Trp

ile

Leu;

Giý

Cys.

His Asn.

.Ser'

Asp

Phe

685

690

6,95

cgg aac

aga

.ggc atg.

.acc.gčč

ttá.

ctg'.

aag.

gťt

t..čť_r agt..

•-tgt.

gac

aag

2.34 6 .

Arg Asn

Arg Gly Met·

Thr Ala

Leu

Lýš

Val

Ser Ser

Cys Asp

Lys.

'700

705

71Q

aac -act

.ggt

gat

ťať

tac

gag

gac

agt

tat:

gaa

gat- att

tca.

gca

.tač

2394

nin1 fix^-

uxy“rtsp^-

iyr ijau

rrtsp’

ů'er^_ryrr“bi^:u^_

Asp-^l-re oerALa

Tyr

715

720

725

ťtg· ctg

agt

aáá

aácr

aat

gcc.

.-a t.t:

gaa

cca

aga

age ťtc

tcc

cag

aat

2442

Leu Leu

Ser

i Lys.

As η

Asn

Ala

Ile

Glu,

:Pro_:

Arg

Ser Phe

Ser Gin Asn

. 7 30

-

735

74.0

745

tca aga'

cac

CCt:

agč: act

á.gg.

čáá

aág

.č’a a

ttt

aat. gcc

acc

,áč_Lá

att

24 90

Sér· Arg

His

Pro.

Sér

Thr

Atg Gin

Lys

Glň

Phe

Ašn Ala

Thr

Thr’

Ile

7,50

755:

7 60_;

cca gaa.

áát

gac

átá,

gag

aag

act

gac

cct:

tgg

ttt gca:

cac

aga

ač a

.2538

Pro Glu

Asn Asp

Ile

Glu

Lys

Thr Ašp

:Pro· Trp

Phe Ala

His

Arg

Thr

'765

770

775

cct atg

cct

aaa

a-ta.

caa

aat

gtc tcc

tet

agt gat ttg, ttg

atg.

čte

2586

Pro Met:

Pro

Lys

Ile

Gin

Aáh

Vál

Ser

Šer

Sér.

Asp.Leu

Léu

Met-

Leu

7:80

785.

7 90·

*

-^;i .í

ttg ega cag agt

cct Pro

act Thr

cca Pro 800

čať -HIS

ggg čta Gly Léú

tčč. tta Sér- Leu. :805

tet gat ctc caa

2634

Leu

Arg 795

Gin

Ser

Asp Leu Gin

gaa

gcc

aaa

ta.t

gág:

act

t.tt-

tet

gat

cca .tea'

cct

gga

gca

ata_L

2682

Glu Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp, Asp

Pro Sér

Pro

Glý Ala

Ile

810

815

82°

825.

gac

agt

aat

aac.

age -ctg

tet

gaa

atg

aca

cac ttc

agg

cca

cag

ctc

2730

Asp

Sér Asn

Asn

Ser

Leu

Šer

Glu

Met

Thr

His Phe· Árg

Pro* Gin

Leu;

830

835

04Ό

cat

čac_;

ágt

g’gg

gac

atg gta

ťtť

acc

cct.

gag tea

ggc

ctc.

caa

tta

27.78

...His

His'

Sér

Glý·

Asp

Met.

Val

Phe:

Thr

Pro.

Glu Šer- ‘G.lý

Leu.

Gin

Leu

.84-5.-

850

855

aga

tta

£at

gag.

ááá

'.ctg ggg

áča.

acť

gca

gca· acá

gag

t.tg aag.

aaa

282'6

Atg

heiií

.Asn

Glu- Lys

Leu. Glý

Thr

Ala. Ala, Thr

Glu.

Leu

Lys

86'0

865

„870

'ctt

gat

ttc

aaa.

gtf

tet

agt.

áča

tea

áát

aát čtg att;

ťcá

acá·

att

287'4

Leu

.Asp··

Phe Lys

Val

Šer

Thr

Ser

Asn

Asn Leu

Ile.

Ser

Thr'

Ile

875

880

885

•cca,

t.ca

gac.

aa.t

'ttg_:

gca

agt

áct

gat

aat aca

ágt

tře

tta

gg'4

2922

?.řo·

Sér

Asp- .Asn

LeU;

Ala

Gly

Thr .Asp

Asn^; Thr

Ser

Ser·

Leu-

Gly

:9.90

8'95

:900·

905

ccď

cca

agt

atg

cca·

gtt

cat

tat

gat

agt

caa tta

gat

acc

act

cťa

2970

Prď

Pro

Sér

Met

Prď Vál

His_: Tyr Asp·

.Ser

Gin Leu

Asp

Thr

Leu

910::

915

920

ttt

ggc

aaa

áag.

.tea··

tet

ccc,

ctt

.act..

gag

ř.ct ggt

ggá

ccť

ctg

age·

3018

'Phe

Gly

Lys

Šer

Set

Pro

Leu

Thr

Glu

Seř Gly

Glý

-Pro

Leu

Ser

925

930

935

“ttg

•agt

gaa

aat

aat·

gat

tea

aag ttg

tta gaa

teá

g.gt

tťa

atg¹

3066

Leu

Šer

Glu

Asn

Ásn·

Asp

Šer

Lys

Leu

Leu GÍu

Ser

Gly

Leu

Met.

9'40

94 5‘

950

aat

age

čáá

gaa

agt

tea

t.gg gga

aaa

aat

gta tcg

teá

aca

gág

agt

3114’

Ašn

Sér

Gin

Glu.

Šer

Ser·

Trp

Gly Lys

Ásn·

Val Ser·

Ser

Ťhr

Glu

Ser

955

9.6,0

965

ggt

’ág.g

tta

ttt.

aaa

:ggg

aaa

aga

get

cat

:g.ga cct

:get·

ttg ttg

act

3162

Glý Arg Leu

Phe Lys

Glý

Lýs

Arg- Ala.

His,

^:Giy Pro

Al a

Leu

Ťhr

970.

9'7 ď

980,

985

aaa

gat

aat

gcc

tta

ttc

.aaa

gtt

a.gc

ať o

* tet ttg

tta

aag

aca

aa.c,

'3210

Lys ,AŠp

Asn Alá

Leu

Ph‘e. ;Lys

vál

Ser

Ile

_;Ser.· Leu

Leu

Lyš

Thr

Asn

990

995

1000'

aaa

acť

tec

aat

tea

gča

áct

aat

aga

áág act

cac

•att

gat.

ggc

3258

Lys Thr

Šer

Asn

Asp·

Ser

Ala

Thr

Asn Arg Lys; Thr

His

Ile Asp Gly

10C5

1010

1015

cca tca tta tta att Pro Ser Leu· Leu Ile 1020	gag áat agt	cca Pro	tca Ser	gtc tgg caa aát ata tta	3306
Glu	Asn. Ser. •1025	Vál Trp Gin .1030	Asn	Ile Leu·
gaa agt gac .act gag	ttť	aaa aaa	gtg ača	cč.t ttg att	cat	gac aga	33’54
Glu: Ser Asp Thr Glu -Phe	Lys Lys Val	Thr	Pro Leu íle	His	Asp Arg
1:035	1040			104 5
atg cťt atg gac aaa	aať	get aca	get ttg	agg cta aat	cat	atg tca	3402
Met Leu Met Asp Lys	Asn	Ál-a .Thr	Ala	Leu	Arg Leu Asn	His	Met Ser
1050	1'05’5			106Ó		1065
aát ;ááa act acť tca	tca	aaa aac	atg gaa	atg gtc caa	cag	aaa aaa	34 50
Asn Lys· Thř Thř Sér	Sér	Lys Asn	Met	Glú	Met_; Val .Gin	Gin	Lys Lys
1070			1075		1.08 Ol·
gag ggc ccc att· cca	cčá'	gat gca	čáá	aát	cčá gat áťg	t.cg	ttc. ttt	.34 9,8
Glu Gly Pro 'ííe. Pro	Pro·	Asp Ala	Gin·	Asn	Pro Asp Meť	Sér	Phe· Phe
1085/		1090		10.95
aag atg cta ttc ttg	cca	gaa tča	gca	agg	tgg ata Caa	agg	act Cáť	354 6
Lys Met- -Leu Phe Leu	Pro	Gl-ú Ser Ala Arg	Trp Ile Glň	Arg	Thr' jHis
1100		. 1105			' 1110
gga aág aac. tet ctg	aac	tet ggg	caa	ggc	Ccc cgt· cca	aag	cáa tta·	3594
Gly Lys .Asn Ser'.Leu	Ash	Ser Gly Gin' Gly	Pro 'Ser Pro;	Lys	Gin -Leu;
1115	1120			,1125·
gta tec tťá gga cca	gaa	aaá tet	gtg·	gaa	ggt cag. aat	ttc	ttg tet	364 2
Val. Ser Leu Gly Pro	Glu	Lys Ser	Val.	Glu	Glý Gin· Ásn	phe.	Leu Ser
1130 11.35			1140		1145
gag aaa aac’ aaa gtg·	gta.	g.tá gga	áág	ggt.	gaa ttť áca	aag gac gťa	3'69,0
Glu. Lys Ásn Lys Val	-Val	Val Gly	Lys	Gly	Glu Phe Thr	Lys	Asp Vál
1150			1155,	........._.	..11.60.
gga ctc aaa gag á.tg	gtť.	ťtt cca	ag‘c	agč	aga aac cta	ttt	ctt act	3738
Gly Leu Lys Glu Met-	Val.	Phe -Pro·	Šer	Ser	Arg Ásn Leu	Phe-	Leu Thr
li 65		1170		1175
aac ttg gát aať ťta	cat	gaa aat	aať	aca	cac aať caa	gaa	aaa aaa	3786
Asn, Letí Asp Asn Leu		Glu Ásn	Asn	Thr	His Ásn Gin	Glu	Lys Lys
1180		1.185.			1190			--
att cag gaa gáa ata	gaa	áag :áá.g-	gaa	acá	ttá á.tc cáa	gag	aať gta	3834
Ile Gin Glu Glu: Ile	Glu-	Lys Lys -Glu	Thr	Leu Ile Gin	Glu	Asn Vál

1195 ....... 1200 ' 1205 gtt ttg cct cag átá cat'· acá gtg· -ačť ggc áčť' áág aat' t.tc atg ,aag38 82

-Val Lea Pro Gin Ile His Thr Val. Thr Gly Thr Lys Asň Phe MetLys

Í21.0 1215: ' 1220122.5 aac cťt ttc ttactg $gc ačt agg caa áa.t· gta, gáá g.gt tča .tát gag3930

Asn Leu Phe Leu Leu Šer Thr Árg Gin Asn Val Glu Glý Ser Tyř Glu .1230 ’ 1235 ' ' 1240· ’

-37CZ 298250 B6

999 gca Glý Ala	tá't gčt Tyr Ala 12.4 5	cúa Pro.	gtá ctt cáa- gat Val Leu Gin Asp 1250	tťť agg Phe' Arg	tca ť.tá áat gát. tca	397Έ
Ser	Leu Asn Asp Set 1255 .
áca. aát	aga aca	aág-	aaa cac aca gct	cát ttc	ťčá.	aaa aaa ggg gag	4026
Thr Asn Arg Thr	Lys	Lys His Thr. Ala·	His Phe	Sér	Lys Lys Gly Glu
1260·		1265		1270
gaa. gaa	aac ttg	gaa	ggc ttg gga aat	caa acc	aag	caa att gta gag	4074
Glu Glu	Asn Leu	GÍu	Gly Leu Gly Asn	Gin Thr	Lys·	Gin Ile Val Glu
12.75.			1280.	Í285
aáá' tat	gca tgč	acc	aca agg· ata tct	cct aat	aca	agc cag cag aat	•4122
Lýš Tyr Ala Cys	.Thr-	Thr .Arg· Ile. Ser-	Pro Asn	Thr	Sér Gin Gin Asn
12'90		1295	1300		1-305
tt.t gtc' ačg cáa	čgt	ágt·. aagagá gčt	ttg aaa	caa	ttc, aga ctc cca	4170
Phe Val	Thr Gin	Arg	Ser Ly.s Arg Ala	Leu. .Lys:	Gin	Phě: .Arg Leu. Přó
	1310	1315·		1320.
čta’ gaa	gaa aca	gaá	ctt, gaa aaa agg	áta .att	gtg	gát gac ačc tca	4213.
Leu Glu	Glu Thr	Gly	Leu, Glu Lys Arg	Ile Ile	Val	Asp Asp Thr Ser
	13-25=		1330			1335
acc cag tgg tcc	aaa	aac atg aaa cat	ttg acc	ccg	agc acc. ctc aca	4,266
Thr Gin.	Trp· Ser	Lys	Asn,Met Lys:·: His	Leu Thr	Pr.o	Set Thr. Leu· Thr
	L3.4 0		13,45:-		1350
cag.. a t a	gač .tac	áat.	gag_: aag gag aaa	g.gg ggc	att	act cag tct ccc.	4314
.Glh Ile	Asp Tyř	Asn	Glu. Lys Glu, Lys	Gly Ala.	Ile	Thr Gin Ser Pro.
1355			1360	1365
tra tca	gat tgc ctt	acg agg_: ágt ca.t	ágč aťc	cct	caá gca· aat aga	4362
Leu Ser	Asp Cys	Leu	Thr Arg. Ser His	Sér. Ile	Pro	Glh. Ala: Asn Ařg
1370		Ί	L’37-5 '	1380;		' 1385
tct cca	fta: ccc	att	gca aag gta tca;	tca ,ttt	Qča	tct att aga čet'	.4410
Se'r Pr.o.	Leu. Pro	11 é	.Ala Lys Val Ser	Ser Phe	Pro	Ser .Ile Arg Pro'
	1390:	1395		1400
a'ta 'tat	ct.g; acc	agg	gtc -‘ctai ttc .caa	gac. aac: tct	tct cát ctt. cca:	4458
Tle Tyr	Leu·· Thr	Arg.	Val Leu Phe Gin Asp Asn Ser-.	Ser His Leu Pro·
	1405.		Í.4.10			1.4.15· . .
gca gcá	tct tat	aga	aag áaa gat tct_;	ggg gtc	caa	gaa agc agt cat	4506
Ala Ala.	Ser- Tyr Arg· Lys Lys: Asp Sér Glý Val	Gin	Glu Ser Ser His
1420		1425		14:30
ttc ,tta.	caá gga.	gcď-	.aaa' aaa -aat aac	ctt· tct	tta-	•gcc att cta áčď	4554
Phe Leu	Glr. Gly	Al'á.	Lys. Lys'.Asn Asn.	Leu. Set	Léu	Ala Ile Leu Thr
1435			1440·	1445
ttg gág	atg ačt	ggt	gat cáa aga gag	gtt ggc	tcc:	ctg ggg aca agt	4.602
Leu Glu.	Met Thr Glý Asp Gin Arg Glu	Vál Gly	Ser	Leu Gly Thr Ser
1.450		4	.4 55	1460		14 65

-38CZ 298250 B6

gcc a ca	aat	tca gtč	a ca	ta.c áág áaá gtt gag aáč act gtt	ctc_r	cčg	4650
Ala Thr	Asn	Séř Val	.Thr	Tyr Lys. Lys Vál Glu Asn	Thr Val	Leu	Pro
		1470		1475	1480
aaá cca	gac	ttg ccc	aá a.	ata tet ggč aaa gtt gaa	ťtg. ctt	ccá	aaa	4 698
Lys Pro Asp	Leu Pro	Lys·	Thř Ser Glý Lys Val Glu	Leu Leu	Pro	Lys
	1485		' 1,490	14 95
gtt cac	átt	.tat cag	aag	gac cta ttc cct acg gaa	act- age	aat	ggg	474 6
Val His	ile	Ťyr Gin	Lys	Asp Léu :fhe Pro Thr Glu	Thr Ser	Ašň	Gly
1.50.0			1505 :	1510,
t.ct cct	ggc	cát ctg,	gat	ctc gtg gaa ggg age ctt	ctt cag	gga-	aca	4794-
Ser Pro	Gly	H-is Leu	Asp	Leu Val Glu Gly Ser Leu	Leu Gin	Gly Thr
1515			1520 ,1525
gag; gga	gcg	átt aag	tgg	áát gaá gca áac aga cct	gga. aaa	gtt	ccc	4 842'.
Glu Gly.	A-lá-	Ile Lys	Trp	Asn Glu Ala. Asn Arg .Pro. Glý· Lys	Val	Pro
1530 '		1535	154Ό		154 5
tet. ctg	aga.	.gta gca'	ata	gaa ágc' tet gca aag act	cčc tče	aag	cta	48.9.0
Phe Leu	Arg-	Val Ala	Thr	Glu Ser Ser Ala. Lys Thr	Pro Ser	Lys	Leu
		1550		1'555	15.60
ttg :ga,t;	ech	ctt get	t-gg	gat aac cac tat ggt act	cag ata	cca	aaa·	4 938
Leu Ašp	?r..o	Leu Ala	Trp	Asp 'Asn· Eis Tyr Glý Thr	Gin Ile	Pro	tys
	15.65		1570	1575
gaa 'geg'	tgg	aaa teč	čaa	gag aag tca cca gaa aaa	aca get	ttt.	áag	4 986:
Glú Glu	Trp	Lys* Sér	Gin	Glu Lys, Ser Pro Glu Lys.	Thr Ala.	Phe	Lys
	15.80			1'585 :	L.590
aaa aág.	gat·	acč att	ttg	tec .ctg· aac' get tgt gaa	age aát	cat	géá	50.34
Lys Lys	Asp	Thr· Ile	Léu	Ser Leu. Asn- Alá, Cys Glú	Ser: Asn	His	Ala
15'95			1600 ' 1605
ata g.ca	gca	ata <aat	gag.	g.ga^: ca'a aat. aag' teč gaá	ata gaa	gtč	acc	5082
Ile Ala	Ala.	Ile^!. -Asn	Glu	Gly Gin·. Asn Lýs Pro Glu	Ile Glu	Val.	Thř
1610		]	.615	1620		1625
ťgg gča	aag	caa.-ggt	agg<	.act. gaa agg ctg tgc ttt	caa aac	cca	ccá	5130
Trp Ala	Lýs-	Gl^:n .Gly Arg	Thr Glu Arg. Leu Cys Ser	Gin Asn	Pro	Pro
		1630		1635	'1	1640
grc ttg	aáá	ege cat	ca a	cgg gaa ata act cgt act	act .ctt	cag.	tca	5178
Va.l Leu	Lys-	Arg His	Gin	Arg Glu Ile Thr Arg- Thr	Thr' Leu:	Gin	Ser
	]	.645		165.0-	1655:
gat cáa	gag	gaá aťt	gác	tat gat gat accafa tča_	gtt ..gaá.	átg.	aag.	522.6.
Asp”G'lň!	gíú;	'‘Glu Ile·’	'Asp	Tyr Ash Asp Thr Ile Ser	Val Glú·	Met	Lýs
1660			1665 1670
aag gaa	gat	ttt gac	átt	tat gat gag gat gaa aat	cag ágc	ccc	égc.	5274
Lys Glu. Asp	Phe Asp' Ile.	Týr Asp Glu Asp. Glu Asn	Gin Ser.	Pro Arg

1675 1680 1685

-39CZ 298250 B6

agc	ttt caa	aag aaa aca	ega cac tat	.ttt	att	gct	gca gtg	gag a'gg	5322
Ser	Phe _:GÍn	Lys Lys Thr'	Arg His^: Tyr	Phe	Ile	Ala	Ala Val	Glu Arg
1.6.90	1695		1700			1705.
ctc	tgg gat	tat· ggg atg	agt agc tcc	cca	cat	gtt	cta aga	aac agg	.5370
Leo	Trp Ásp	Ťyr Gly Met	Ser Ser Ser	Pro	His	Val	Leu Arg	Asn Arg
		1710	1715			172.0
gct	čag agť	ggc, ág.t gtc	čet cag ttc	aag	•ááa	gtt	gtt ttc	cag gaa	541.8
Ala	Gin- -Sér.	Gly' Ser Val	Pro Gin Phe	Lys	Lys	Val	Val Phe	Gin Glu
	1725	1730				1735
ttt	act gat	gg’C'-tcc ttt	act cag ,cfec	tta	tač	čgt	gga gáa	ct.á áat	54 66
Phe	Thr Ásp	Gly Ser Phě	Thr Gin Pr.oi	Leu	Tyr' Arg Gly Glu	Leu Asn

•1740 17-45 ' ' ' 17-50

gaa: cat Glu His 1755	ttg Leu	gga _;cťc	ctg ggg cca	tat- ata Tyr Ile	aga. ‘gčá< gaa	gtt Va.l	gaa gat Glu Asp	5514
Gly	Leu_;	Leu Gly 1760	Pro	Árg -Ala. 1765	Glu
aat átč	átg-	gta	a.ct-	ttc aga	aat	ca.g :gc.c	tet cgt	ccc	tat	tcc ttc	5562
Asn Ile	Met	Vál	Thr<·	Phe Arg Asn	Gin·' Ala	Ser Arg.	Pro	Tyr	-Se‘r Phe·
1 770:			1.775			L.7.8,0			1785
pat tep	agt	cťt	a 11:	tet tat.	gag	gáá .cat	cag ta.g.g·	čaa	gga	gca gaa	5610
Tyr Ser	Ser	Leu	•Ile-	Ser Tyr	Glu	Glu Asp	Gin Arg	•Glň	Gly	Ala Glu.
		17 90			1795:			’ 1,800
cct aga	aaa	aac	ttt	gtc aag	cct	aat gaa	acc aaa	ěct	tac	ttt- tgg	5_:65'B
Pro. Arg	Lys·;	Asn	Phe	Val Lýs	Pro	Asn .Glu	Thr Lys	Thr	Tyr	Phe Trp
	1805			1810		1815
aaa gtg	ca a	cat	cat	atg. gca	.ccc	act aaa.	gat gag	-ttf	gac	tgc aaa	5706
Lys Val	Gin	li s	His	Met Ala.	Pro	Thr Lys-	Ásp Glu.	Phe	Asjp-	Cys Lys
18.20			J	L825		18-30
gcc rgg	gct	tat	tt:Č	tet gat	.gtt	gac ctg·	gaa aaa	gat	gtg	cac. tea	5754
Ala Trp	Ala	Tyr-	Phe	Ser. Ásp	Val	Asp Leu-	Glu Lys	Asp Val	His Ser
1.8-35				184,0			18'45
ggc čťg.	att	g’ga	čeč	čtt ctg gtc	tgc cac·	ačt aac	a ca-	'čtg·	aač cct	.5802'
Gly Leu	I-ie	Gly	Pro	Leu Leu	Val.	Cys His	Thr Asri	Thr	Leu Asri; Pro
1850			.1855		1860.			1865 -
gct cať	99.9	aga-	caa	gtg a ca	.gta	cag, caá	ttt gct	ctg	ttt	ttc acč:	-58.50:
Ala His	Gly	Arg^:	Gl.ň	Val. Thr·	Val	Gin’ Glu	Phe Ala	Leu	Phe	Phe Thr
		]	L8.70.			1875			1880
atc ttt	gat	gag	acc	aaa agc	tcg	tac ttc	act gáa	a'at	atg	gaa ágá	,5898
Ile -Phe’ Asp	Glu-	Thr	Lys. Šer	Trp	Tyr Phe	Thr Glu	Ásn.	Met	Glu- Arg
	1835			1890:		1895
.aac, tgc	a:gg	gct ccc	tgc aat	atc	cag .atg	gaa gať	cčc	act	ttt.aaa	5946:
Asn- Cys ;Ar.g Ála	Pro	Cys Ásn	Ile	Gin· Met	Glu. Ásp	Pro	Thr.	Phe Lys
]	L90.0:			1905		1910

-40CZ 298250 B6

gag aat. tát

cgc. ttc

cát

gcá

átč-

.aat

ggc

tac

ata

atg

gat

aca cta

5994

Glu Asn. Tyr

Arg- Phe

His

Ala

Ile

Asn

Gly

Tyr

Ile

Met,

Asp

Thr Leu

1915

1920·

1925

cct ggc tta

gt'a at_tg

gct

cag

gát

cáá

agg

att

ega

tgg

tat

ctg ctc

6042

Pro Gly Leu

Val -Met·

Ala

Gin.

Asp

Gin

Ařg

Ilě.

Arg

Trp

Tyr

Leu Leu

1930

1935

1940:

1945

agc atg ggc

agc aat

gaa

aac

atc

cat

tet

att

cát

ttc

ágt

gga cat

6090

Ser Met Gly

Šer Asn

Glu

Asii

Ile.

Hi.Š

5 ér

Ile

'His,

Phe

Ser

Gly. His

Í9Šó:

'1955

1960

gtg ttc act

gta ega

aaa

gag.

gag

tat

aaa

atg

gca

ctg

tac aat

6138

Vál Phé Thr

Val. Arg

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala-

Leu

Tyr Asn

.1965.

L970

197'5-

ctc tat cca

ggt gtt .Glý Val

ttt

gag

áca

gtg

gaa

atg

tta

cca

tcc

•aaa gct

6186

Leu /Tyr Pria

Phe

Glu

Tht

^:Val

Glu·

Met

Leu

Pro

Ser

Lys .Ala

¹⁹⁸⁰

1985

19*9'0

gga att- t.gg

cgg gtg

gaa

tgč

ctt

att.

ggc

gág

cat

cta

cat

gct ggg

6234

Gly ile; Trp

Arg Val·

Glu;

Cyš

Leu

Tle

Gly-·

.Glu

His

Leu,

His

Ala Gly

19'95.

.200.0.

2005

atg agc aea

ctt ttt

ctg'

gřg,

t-ač‘

agc

aat

.aág

tgt

cag.

áčť

ccč ctg

6282

Máť Ser -Thr

Leu. Phe

Leu

Val

Tyr

Ser

Asn

Lys·

Cýá

Gin

Thr

Pro. Leu

2010

20'15

2020

2025

ggá· atg gct

tet gga

cac

att.

aga

gat-

ttt

cag'

aťt

aga

gct

tca gga

6336

Gly Met. Ala.

Ser Glý.

His

Ile

Arg

Asp

Phe

Gin

TÍe

Thr

Ala.

Ser Gly

2030'

2035

2040.

ca a tat gga·

cag tgg

gcc

cca-

áag

ctg

gcc

ag;a

ctt

cat

tat

tcc gga

6378

Gin Tyr Gly

Gin Trp.

.Ala

Pro

Lýs

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

Šer Gly

204‘5

2050

-

ZÓ.55

tca atc. aat

gcc t.gg

agc

ácc

.aag,

gag

;čcc

>ttt

tčt

tgg

atc.

aag gtg

6426

šer íle' Asn.

Ala Trp

išer

Thr

Lys-

Glu

Pro,

Phe

Séť

Trp

íl^;e^?

Lys, Val

2060

2065

2070.

gat ctg ttg

gca cca

atg

att

att.

cac

ggc;

.atc

aag’

acc

cag

ggt gcc

6474

Asp Leu Lěu

Ala Pro

Met

Ile

His

Glý

Ιΐθ,

Lys

Thr

Gin

Gly Ala

2075

>.C80

'08-5

čgt. Cag aág

.tře: tcc

agc,

;CtC

tac

atc,

tet

'cag:

ttt

atc

atg.. tat

65.22

Arg. Gin Lys

Phe Sex

Ser

Leu.

Tyr

Ile

Ser

Gin

Phe

ile·

11 é

Met Tyř

2090

2095

2100

2105

agt .ctt gát

ggg·. aag

aag-

Xgg:

cag

act

-tat

ega

gga

aat

tcc

act gga

6570

Ser Leu Asp

Glý Lys.

Lys

Trp-

Glri

Thr

Ťyr.

Arg:

Gly

Asn

Sér

Thr Gly

2110

2115

2120

acc tta atg

gtc ttc

ttt

ggc

'aat

gtg

gát

tca

^;tc.t

g.gg

aťa

aaa cac

6618

Thr’ Leu Mét

Vál Phe

Phé

Gly

Asn

Vál

Asp

Ser

Sér

Gly

Ile

Lys His

2125 2130 2135

-41 CZ 298250 B6

aat att ttt aac cct cca att att Asn Ile.. Phe Asn Pro Pro Ile Ile

get ega Ala Arg

tac Tyr

atc cgt ttg

cac cca His Pro

6666

Ile Arg 2150

JLeu

2140

2145

act cat

ťa.t

agč

att ege

age

act

ctt ege

atg.

gag ttg atg

ggc

tgt

671'4

Thz His

Tyr

Ser

Ile Arg

Ser

Thr

Leu Arg

Met

Glu Leu Met

Gly Cys

2155

2160.

2165

gát_; t.tá

ááť

agt

tgc age

átg

cca

ttg gga

atg

gag agt

aaa

gca

ata

6762

Asp Leu

A'sn

Ser

Cys Ser

Met.

Pro

Leu. Gly Met

Glu Ser

Lys

Ala

Ile

2170

2175

21.80

21.85

tca gat

gea

cag

att. act

get

teá

tcc tac

ttt

acc' aat

atg.

ttt

gcc

6810

Ser Asp

Ala

Gin

Ile Thr,

Ala

Ser

Sér Tyr.

Phe

Thr Asn

Met

Phe Ala

2190

2195'

2200

acc tgg

tet

.cct

tea, aaa·

gčt

ega

ctt cac^;

ctc

cáa. ggg

»gg

á.gt

aat

6858

Thr Trp

Ser

Pro

Ser“ .Lys

Ala Arg

Leu HíS.

Leu

Gin Gly Ařg

Ser

Asn

2205;

2210

2215

gcc tgg

aga

cct^:

cag· gtg aat

aat

cca aaa

gag

tgg ctg

caa

gtg

gac

69Ó6

Ala .Trp. Arg

Pro

Gin Val

Asn

Pro Lys

GÍu

Trp Leu

Gin

Val

.Asp

2.220

2225

2230

ttc cag

áag

a ca

atg aaa

g.tč

áca

.gga gta

a.ct

act cag

gga

gta·

.aaa:

6954

Phe Glň Lýs

Thr

Met Lys· Val,

Thr·

Gly Val

Thr

Thr Gin. Gly

Val

Lys

2235

>240

2245

tet ctg

ctt

acc:

a£c átg

tat

gtg

áá.g^;..gag

tt.C;

ctc atc,

tcc,

ago

agt:

7002

Ser Leu

Leu

Thr

Šer. Met

Tyr

Val

Lys Glu

Phe.

Leu Ilé

Ser

Sér

Sér;

2250.

2255

2260

2265

cáá gát·

ggc

cat

cag tgg

act-

ctc

ttt ttt

cag

aat ggc

áaa

gta'

aág.

7050

Gin Asp Gly

His

Gin Trp

Thr

LéU

Phe'· Phe·

Gln_;

Asn Gly Lys

Val

tys

227 0.

2275

2280

gťt ttt

cag;

gga

aat; ca a

gac

tcc

ttc. ^;ac‘a

cct

gtg gtg

aac

tet

cta

7098

Val .Phe:

Gln_:

Gly

Asii. Gin

Asp, Ser.

Phe ^: _;Thr;

Pro

Vál Val

Asn.

^:S'er

iieu-

2285

2290

2295.

gac cca.

ceg

tťa.

ctg act

cgc:

tac

čťt .ega· .a.tt

cac. ccc

cag· agt

tgg

7146

Asp. Pro

Píp

Leu

Leů·. Thr

Arg Tyr.

Leu Arg.

Ile

His Pro

Gin._;

Ser

Trp_:

2300

2305

2310

gtg cac

cag

att

gcc^: ctg

ag.g

atg

gag gtt

čtg

ggc tgc

gag

g.ca

Cag

7194:

Val His

Gin

.Ile.

Ála Leu

Arg Met. Glu Val.

Leu Gly Cys

Glu

Ala

Gin

2315.

2320

2325

gac ctc tac tgagggtggc cac.tgcágca.. cčtgccačttj čcgtcacctč 7.243'

Asp. Leu Tyr

2330 tccctčctca gctccagggc agtgtccctc cctggcttgc cttctacttt tgtgctaaát 7303.

ccťagčagác actgcct.tga agcctcctga attaactatc atcagtcctg catttctttg 7363 gtggggggcc ággagggtgc átccaattta actťaactct tacctatttt ctgcagctgc 7423

-42CZ 298250 B6 tcčcagatta ctccttcčtt ccaátataac taggčaáaaa. gaagtgagga gaaacctgca 7483 tgaaagcatjt čtťccčťgaa aagttagčjcc ťctcagagťc 'accacttcct ctgttgtaga 7543 aaaactatgt gatgaa.actt tgaaaaágat atttatgatg t.taacatttc ággttaagčc 7603 tcatacgttt aaáataaaac tctcagttgt ttattatččt gatcaagčát ggaačáaagc 7663 atgtttcagg atcagatcaa tácaatcttg gcaaaatgga gagaatacaa taactactac ágatataatt átgtťattta gtcattatga tet taía a c tg ag a.a 11 á t á g a t gg g g 11 c a ggcattctgt. aťáaátgcaa átgtgcáttt gagtcaáaag gcaaatčatt tggacaatct 7723 agťáaagtct gtttcťgctt ccttáfcacat. 7783 ggggcacatt ctťatctcca aaactagcat 7843' agaatcc.cta agtcccctga aattatataa 7903 ttc.tgacgag tgtccataga tataaagcca 79.63 ttggtcttáa tťcťgačcaá táaaaáaátá. ágtcaggagg átgcaattgt tgaaagcttt 8023 gaaataaaat·. aacatgtctť cttgaaattt gt.gátggcca agaaagaaaa tgatgátgac 8083 attaggcttc taaaggacat ačatttaata tttctgtgga aatátga.gga aaatccatgg 8143 ttatctgaga taggagatac aaactttgta atťctaataa tgčactcágt ttactctctc 8203. •cčtc-tač.taa; ťttcctgctg aaaataacac aacaaaaatg ťaáčagggga aáťtatatac 82'63· cgtgáctgáa aactagagtc ctacttacat agttgaaata tcaaggaggt cagaagaaaa 8323 ttggactggt gaaaacagaa aaaacáctcc agtctgccať atcaccacac aataggatcc 8383 cccttcttgc. c.ctCčacccc čaťaagattg tgaagg.gttt actg.ctcc.tt. ccatctgcct 8443

Á'^: gcaccccttc actátgáctá cacágaactc tcc.ťgatágt aaagggggc.t.-ggaggcaagg 8503 ataagttata gagcagttgg aggaagcátc caaágact.gc aácccagggcaaatggaaaá 8563 caggag.atcc taaťatgaaa gaaaaatgga tcccaatctg agaaaá^gca aaagaatggc 8623 tacttttttc tatgctggag tattttctaa taatcctgct tgacccttat ctgácctctt 8683 tggaaactať aacatagctg tcacagtata gtcacaatčc ačaaaťgátg caggtgcaaa 8743 tggtťtaťag cčctgtgaag ttcttaaag.t ttagaggcta acttacagaa aťgaa.taagt. .8803 tgttttgttt taťagcccgg tagaggagtt aaccccaaag gtgatatggt tttatttect 8863 .gttat.gttta ácttgatáat cttattttgg· caťtcttttc ccattgacťa 'tatacatetc 8923 táťttctcaa áťgttcatgg aa.ctagctct ttťaťfttč.Č tgctggtttc ttca.gtaatg 8983 agtťaaátaa. aacáttgača catača ;9009

-43CZ 298250 B6 <21Ό> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Konto sapiens <400> 2

Ala	Thr' Arg	Arg Tyr Tyr Leu	Gly	Alá	Val	Glu	Leu	Ser	Trp	Asp	Tyr
i		5			10					15
Wet	Gin Ser.	Asp Leu Gly Glu	Leu	Pro	Val	Asp	Ala	Arg	:Phe	Pro	Pro
		.20.		25:					30
Aťg.	Vál Pro 35	Lys Ser Phe 'Pro	Phe. 40	Asn	Thr	'Ser	Val	Val, 4'Š	Tyr.	Lys	Lys
'Thř	Leu .Phe,	Val Glu Phe. Thr	Vál	his.	Leu	Phe	Asn	Ile;	Ala.	Lýs	Pro·
	50	.55					60
Arg	Pro Pro	Trp Met Gly Leu	Leu	'Gly	Pro	Thr	;rie	Gin	Ala	Glu	Vál
65		70				7·^					80
Tyr	Asp· ^:Thr	Vál Vál Tle Thř	Leu	Lys	Asn	Met	Ala	Ser	His	Pró	Val
		85			?o					95
Sér·	Leu His.	Ala Val. Gly Val	Ser	Tyr	Trp	Lys	Ala	Šer	Glu	Gly	Ala.
		100		105..					110
Glu	Tyr 'Asp.	Ásp Gin Thr Šer	Gin	Arg	Glu	Lys	Glu	Asp	Asp-	Lys	Val.
	τη		120				125
Phe	?řo Gly	Gl.ý Ser His Thr	Tyr	Vál	Trp	Glh	Val	Léú	Lýs	Glu	Asn
	130	135					140
Gly.	Pr.o Met	Ala’ Sér Asp Pro	Leu	cýs	Leu	Thr	•Tyr	Sér	Tyr	Leu	Sér
14'5-		15P				155					160.
H-i s·	Val Asp	Leu vál. Lys· Asp	Leu	Asn	Šer	cly	Le’u	11,e	Gly	Ála	Leu
		1:65			170					175
Leu	Val Cys	.Arg. Glu Gly Šer	Leu	Áía	Lys	:G1U	Lys’	Thr	Gin	Thr	Leu:
		1.80		185					•190·
His	Lys Phe	ile Leu Leu Phe	Ala	Val	Phe	Ásp	Glu	:,Gly	Lys	Šer	Ťrp-
	195		200					:2.05
His	Ser Glu	Thr Lýš Asn Sér	Leu	.'Met.	Gin*	Asp	Arg	Asp	Álá	Ala	Šer
	210	215					22.0
,Alá	Arg Ala	Trp Pro· Lys: Met	His	Thr	Val	Asn	Gly	Tyr	Val	Ašh	Arg
225		230				235					240
Sér	Leu. Pro	Gly Leu Tle Gly	Cys	His	Arg	Lys	Ser	val	T,.yr	Trp	His
		245			25.0					255
Vál	Ile Gly	Met„ Gly Thr Thr	Pro	Glu	Vál·	His	Ser-	Ile	Phe	Léu	giu
		260		265					270

-44CZ 298250 B6

Gly

His

Thr

Phe. Leu

Val

Arg

Asn

His.

Arg

Gin Ala

Sér

Leu

Glu

Ile

2.75

280

285

Ser

Pro

l-le

Thr Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Leu Léu

Met

Ašp

Leu

cly

290

295

300

Gin

Phe

Leu

Leu· Phe

Cys^;

His

Ile·

Ser

Šeř

His Gin

His

Asp

Gly

Met

3Ó5

310

315

320

Glu

Ala

'Tyr

Val Lys

Val

Asp

Ser

Cys

Pro

Glu Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

325

330

335

Met

Lys

A’sn

Asn: Glu

Glui

Ala

Glu

Asp

Tyr

Asp Asp

Asp.

.Le.u

Thr

Asp.

34'3

345

350'

'Ser

Glu.

Met

Asp Val

Vál,

Arg.

Ph;e

Asp·

Asp

Asp^: Asn

Sér

PfO:

Sér

Phe·

355

3.60

365

'Ile

Gin 370

Ile

Arg- -Ser:

Vál·

Ala·

Lys

Lys‘

HÍŠ

Pro Lýš

Thr

Trp

Val

His

375

380

Tyr

Ile

’Alď

Aía. Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr Ala

Pro

Leu

Val

Léu

385

390

395

4.00

Ala

Pro

Asp

Asp Arg·

Ser·

Ťyr

Lys

Šer

^;Gln

Tyr Leu

Asn

Asn:

Gly

Pro

405'

410.

415

Gin;

Arg

Tle

Gly Afg

Lys

Tyr;

Lys

Val

Arg Phe

‘Met

Ala.

Tyr

Thr

420

425·.

430.

Asp

Glu

Thr

Phe Lýš

Thr

Arg

Glu

Ala.

.Ile

Gin His

Glu

Ser

Gly

Ile.

4 35

440

445

Leu

Gly

Pro

Leu Leu

Tyr.

Gly

G1.U

Val

••Gly

Asp Thr

Leu

Leú

Ile.·

Ile

450

'455

460

Phe

Lys

Asn

Gin Ala

Šer

Arg'

Pro

Tyr·

Asn

Ile Tyr

.-Pro

'His

Gly

lié

4'65

470

475

480

Thr

Asp

Val.

Arg Pro<

Leu

Tyr

Ser

Arg

Arg 490'

Leu Pro

Lys

Gly

Vál.

Lys

•48;5

4 95

His

Lev

Lys

Asp Phe.

Pro

Ile··

Leu

Pro

Gly

Glu Ile

Phe

Lys

Týr

Lys

500^:

505

510

Trp

Thr

Val

Thr Vál

Glu.

Asp

Gly

Prd

Thr-

Lys Sér

Asp

Pro

Arg

Cys

51.5

•

520.

- . .

525

Leu

Thr

Arg

Tyr Tyr

Ser

Sér

.Phe

val

Asn

Met Glu

Arg

Ašp

Leu

Alá

530

535

540

Šer

Gly

Leu

Ile Gly

.Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr Lys

Glu

Ser

Val

Asp

54 5

550

555

56.0

Gin

Arg·

Siy

Asr._: Gin

Ilě

Met

Sér

Asp

Lys

Arg Asn

Val

Ile

Leu

Phe

'565

570

575

-45CZ 298250 B6

Ser Val phe Asp Glu 580	Asn Arg Sér	Trp Tyr Leú Thr Glu Asn Ile	Gin
58,5	590
Arg	Phe LeU	Pro	Asn	Pro Ala Gly	Vál Gin	Leu	Gl.u Asp Pro	Glu	Phe
595			600			605
Gin	Ala Ser	Asn	Ile	Meť His Ser	llé Asn	Gly	Tyr Vál Phe	Asp	Šer
	'610			615			620
Leu.	Gin Leu	Ser	Val	Cys Leu His	Glu Val	Ála	Tyr Trp Tyr	Íle	Leu
625.				630		635.			640
Ser	llé Gly	Ala	Gin	Thr·Asp Phe	Leu Sér	Val	Phé Phe Ser	Gly Tyr
			645		650			655
Thr	Phe Lys’	His Lys Met Vál Týr	Glu Asp	Tlir	héii .Thr· 'Leu	Phě	Pro
		660			665		'670'
Phe	Ser Gly Glu	Thr	Val Phe Met	Sér Met	Glu·	Asn Pro Gly Leu Trp
	675			eéó			685
Ile·	Leu Gly Gys	His.	Asn Sér Asp	Phe Arg·	Asn	Arg ély Met	Thr	Ala
	690			695'			700
Leu.	Leu. Lys	Val	S,er	Ser Cys. Asp Lys Asn Thr	Gly Asp Tyr Tyr.	GIú
70,5				710.		715			720
Asp	Ser·' Týr	Glu	.Asp.	ilé Ser Ala	Tyr Leu> Leu	Ser Lys Ásň.Asn	Ála
			725		730'			7.35
I-íé	Glu Pro	Árg;	Ser	Phe Ser Gin.	.Asn Ser	Arg.	His :PrO Ser	Thr .Arg
		74 0			74 5		750
:Gln	Lys Gin	Pn'e·	Asn		.Ile' Pro.	^J Λ¹· í i a	Asn Ašp llé
Ala·, inr .Thr	Glu	uiu-nys
	755			' 760			765
.Thr	Asp^ Pro	Trp	Phe	Ala' His Arg	Thr Pro	Met	Pro Lys' Ile	Gin Asn
	7.7'0			775			780 ” ’
Val	Ser Ser	S„ér	Ašp	Leu Leu Met	Leu Leu	Arg	Gin Ser Pro	Thr	Pro
785:				790		795			800
.His	Gly Leu	.Ser··:	Leu	Ser Asp Leu	Gin Glu	Ala	Lys Tyr Glu	Thr	Phe
			505		810			815
Ser Asp Asp.	Pró	'Sér	Pro Gly Ala	llé- Asp	Sér	Asn Asn Ser	Leu	Šer
	-	820.		-	825- i		830·		*
G1U	Met Thr	His	Phe	Arg Pro.-Glh	Leu His	His-	Sér Gly- Asp	Met	Vál
	835			84Ό			845
Phe	Thr Pro	Glu	Ser Gly Leu Gin	Leu Arg Leu	Asn Glu Lyš	Leu	Gly
	350			855			860
Thr	Thr Ala	Ala	Thr Glu Leu' Lys	Lys· Leu	Asp	Phe Lys Val	Sér	Sér
865				870		875		880^;

- 46 CZ 298250 B6

Thr. Ser	Asn	Asn Léu Ile Ser. Thr 885.	Ile	Pro Ser Asp Asn 890	Leu	Ala 895	Ala
Gly Thr	Asp	Ašn Thr Ser. Sér Leu 900	Gly 905	,'Pró Pro Ser Met	Pro 910	Val	His
Tyr Asp	Ser 915	Glň Leu Asp Thr Thr. ' .920	Leu	Phe Gly Lys	Lys 925	Sér	ser	Pro
Leu Thr 930	Glu	Ser Gly ;Gly Prd Leu. 935	Sér	Leu Set Glu 94 Ó	Glu	Ašn	Asn Asp
Ser Lys 945	Leu	Leu Glu Ser Gly^! Leu: Met. Asň Ser Gin 950 955	Glu	Ser	Šer	Trp 960
Gly Lys	Ašh	Val Sér Ser Thr Glu 965	Šer	Gly Arg. Leu 970	Phe	Lys	Gly ^;Lys 975
Arg Ala-	:His	Gly Pro Ala Léu Leu 980	Thr 985	Lys Asp Asn	Ala	Leu 990;	Phe	Lys
Val Šer	Ile· 995	Ser Leu Leu Lys Thr 1000	Asn	Lys Thr Ser Asn 1005	Asn	Ser	Ala·.
Thr Asn 1010	Arg	Lys hr His Ile. Asp Gly 1015	Pro Sér Leu 1020:	Leu,	Ile Glu	Asn
Sér Pró 1025	Sér	Val Trp .Gin Asn· ile 103,0	Leu.	GÍ-u Ser Asp 1035	Thr	Glu·	Phé	Lys 104 0
Lys^: Val	Thr	Pro Leu.Ilé His Asp Arg Met Leu Met 1045 1050	Asp Lys Asn 105'5	Ala
Thr Ala	Leu .Arg. Leu. Asn.His .Mét Sér 1060 1.06.5	Asn? .-L.ys· Thr	Thr Ser 1070	Ser	Lyš
Asn Met. 1	Glu .075	Mét Val Glň; Gin Lys. .....1080	Lys	Glu Gly Pro	Ilé [08.5	Pro	Pro	Asp
Ala Gin Asn 1090	Pro- Asp Met Ser Phé 1095	Phe:	Lys Met Léu 1100	Phé.	Leu	PtP	Glu
Ser. Ala 11.05	Arg.	Trp .Ile Gin Arg Thr 1110	His	Gly Lys Asn 111'5	Ser	Leu	Asn	Ser Ϊ 12.0
Gly Gin	Gly	Pro .Sér Pro: Lys Gin . . .1125 -	Leu	Val Šer Leu 1130	<GÍy	Pró Glu ^J- 1135	Lýs
Ser Vál	Glu	Glý Gin Asn Phe Leu	Šer·	Glu Lys Asn.	Lys Vál	Vál	Val

11.40 1145 ' 1150

Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Vál Gly Leu Lys Glu Met Val Phe 1155 1160 1165

Pro Ser Ser Arg Ašň Leu Phe Leu Thr Asn· Léu Asp Asn Leu His Glu 1170 1175 1180

-47CZ 298250 B6

Asn Asn 1185	Thr His	Asn	Gln/Glu Lys Lys. Tle Gin Glu Glu Ile Glu Lys
1190	1195	1200
Lys Glu	Thr Leu	ile	Gin Glu Asri	Val Val Léu Pro	Gin Ile His Thr
	1205		121'0	1215
Val Thr	Gly Thr	Lys	Asn Phe Met	Lys Asn Léú Phe	Leu Lé.ú Sér Thr
	1220		12.25	1230
Arg: Gin	Asn Val	Glu	Gly Sér Tyr	Glu Gly Ala Tyr	Ala Přo Val Leu
	1235^;		1240	1245 -
Gin Asp	Phe' Arg	Ser	Leu Asn Asp.	Ser Thr Ášn Arg	Ťhr Lýs. Lys His
1250'			1255	1260	>
Thr Ala	His Phe	Šer	Lys Lys- Gly	Glu Glu¹ Glu Asn	Leu Glu Gly Leu
1265			127.0	1275	1280
Gly Asn	Gin, Thr	Lys.	Gin Ile Val	Glu Lys Tyr Ala	Cys Thr· Thr Ar.g
	1285.		1290	1295 '
I'1-ě S.er	Pro Asn	Thr	Ser 'Gin Gin	Asn Phe Val Thr	Glh Arg Ser Lyš
	:130,.0		13,05	1310
Arg Ala	Leu Lys	Gin..	Phe Arg Leu	Pro Leu. Glu Glu	Thr Glu Leu Glu
1315		Ϊ.320	1325.
Lys Arg	Ile Tle	Val.	Ášp As.p- Thr	'Šer Thr Gin Trp.	'Šer Lýš Asn Met
1330			1335	1340
Lys His	Leu Thr·	Pro.	Ser Ťhr Leu	Thr Gin Ile Asp Tyr Asn 'Glu Lys
1345			•1350	1355	136.0
Glu Lys	Gly Ala..	lie	Thr Gin Ser	Pro L-eu- .S.er Asp	Cys Leu Thr .Arg
	1365		1370	137’5'
Sér His	Ser Ile	Přp	Gin Ala Asn	Ařg Sér 'Pro Léu	Pro Ile Ala. -Lys
	1380.		1385	1390
val Ser	Sér Phe	Pro	Sér Ile Arg.	Pro Tle ’T.yr Leu	Thr Arg Val Leu
1395		1400.		L405
Phe Gin	-Asp Asn	Ser	Ser Hiš Leu:	Pro: Álá Ala: Set	Tyr Arg Lys Lys
14ΊΌ			1415	.........1420
Asp Ser	Gly Val	Gin	Glu Ser Ser	His Phé Leu^Gln	Gly Ala Lyš Lys
14.25 .		.. .	-143Λ	• -1435-	' 1440
Asn Asn	Xeu Ser	Leu	Ala. ile Leu	Thr Leu Glu -Met	Thr Gly Asp 'Gin
	.14.45		1450	1455
Arg Glu	Vál Gly-Ser	Leu. Gly Thr	Ser Ala Thr Asn	Šeř Val Thr .Tyr
	1460		14 65	1470
Lys Lys	Vál Glu Ašh	Thr' Vál Leu	PrO: Lýš Pro Asp	Léu Pro Lýš Thr

1475· .1480 14 85

-48CZ 298250 B6

Ser Gly	Lys	Val Glu	Leu Leu Pro	Lys,' Vál	His Ile	Tyř	Gin	Lys,	ASp
1490			14 95		1500
Leu Phe	Pro	Thr Glu	Thr Ser .Asn	Gly Ser	Pro Gly	His	Leu	Ašp	Leu
1505			Í510.		'1'515				15.20
Val Glu	Gly	Šer Leu	Leu Gin Gly	Thr Glu	Gly Ala	Ile	Lys	Trp	Asn
		1525		1530		1535
Glu Ala	Asn	Arg Pro	Gly Lys, Val	Pro Phe	Leu Arg	Val	Ala	Thr	Glu
	1540		1545		1550
Sér Ser	Ala	Lys Thr	Pro Sér Lys	Leu ;Léu	Ašp Pro	Leu	'Ala	Trp	Asp
1555		1560		1565
Asn His	Tyr	Gly Thr	Gin Ile Pro	Lys Glu	Glu Trp	Lys	Sér	Gin	Glu
1570			1575		1580
Lys Ser	Pro	Glu Lys	Thr. Ala Phe	Lys Lys	Lys Asp	Thr	Tle	Leu	Ser
1585			15.90		1595				1600
Leu Ásn	Ala	Čys Glu	Ser Asn His-	Ala Ile·	Ala Áía	Ile	Asn.	Giu	Gly
		1605		1.61Ó		1615
•Glh Asn·	Lys	Pro Glu	Ile Glu Val	Thr. Trp;	Ala Lys	Gin	Gly	Arg	Thr
		L620		1625.		1630
Glu Arg	/Leu	Cys Ser	Glh Asn Pro	'Pro Val	Leu Lys	Arg	His	Gin	Árg
1635		1:64 0¹		1'6'45
Glu Ile	Thr.	Arg- Thr	Thr Leu Gin	'Sér Asp	Gin Glu	Glu	Ile.	Asp.	Tyr
1650			1655 '		1660
Asp .Asp.	Thr	Ile Šer-	Val Glu Met	Lys Lys	Giu Asp	Phe.	A^:šp'	Ile	Tyř
1665,			1670		167 5.				1680
Asp Glu	Asp	Gíu Asn	Gin 'Ser. Pro	Arg Sér	Phe Gin	Lys	Lys	Thr	Arg
		1685:		1690		i	L695
His Tyř	Phe^:	Ile Ala.	Ala Val Glu	Arg Leu	Trp Asp	Tyr	Gly	•Mét	Ser
	1700	1705			L710,

Sér Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser. Gly Ser Val Pro 1715· ¹ '1720·1725

Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu Phe Thr Asp. Gly Ser PheThr

1730 1-73:5 - 174’0

Gin Pro: Leu Tyr Arg Gly Glu Leu ?Ašn Glu Hi s Leu, Glý Leu LéuGlý

1745 1750 ..... 1?551760

Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg 1765 17701775

Asn Gin. Ala Ser Arg Éro Tyr Šer Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Sér Tyr 1780. 17851790

-49CZ 298250 B6

Gl.u Glu Asp 1795	Gin Arg	Gin GÍy -Ala Glu 1800	Pro' Arg Lys Asn Phe Val Lys 1805
Pro Asii	Glu	Thr Lys	Thr Tyr· Phe	Trp	Lys Val Glň His	His Met Ala
1810			1815		1.820
Pró Thr	Lys Asp Glu	Phe Asp- Cys	Lys Ala Trp Ala, Tyr	Phe Ser Asp
1'825			183,0		.1815	1840
Val Asp	Leu	Glu Lys·	.Asp Val His	Sér	Gly Leu Ile Glý	Pro Leu Leu
-		184 5.			1850	1955
Val ‘Cys	HlS.	Thr Asn	Thr Leu Asn	Přo·	Ala His Gly Arg	Gin, Val Thr
	1860	1865	1870
Val. Gin	Glu	Phe Ala.	Leu 'Phe· Phe	Thr	Ile Phe Asp·.Gl.u	Thr 'Lys Šer
1875		1880		1885
Trp- Tyr	P.’he:	Thr Glu	Asn Met- Glu	Arg	Asn Cys Arg Ala	Pro Cys Asn
1890			1895		1900
Ile? Gin	Met	Glu Asp	Pro Thr Phě	Lys	Glu Asn Tyr Arg	Phe His Ala
1905			1910		1.91'5	1920
Ile Asn	Gly	Tyr Ile:	Met Asp Thr	Léu	Pro Gly Leu Val	Met Ala Gin
		' 1925			1930	1935
Asp Gin Arg	Ile Arg	Trp Tyr· Leů	:Leu	Šer Met Gly Šer	Asn Glu Asn
	]	.9'4 0	1945	o	1950
lie Eis	Ser	Ile His	Phe SerGly	His	Val Phe Thr Val	Arg Lys Lys
195y		1’960		1965
..Glu Gl.u	Tyr.	Lys Met-	Ala Leu. T.yr	Asn·	Leu Tyr- ^:Pr_;o. Gly	Vál 'Phe' Gl.u
19.7.0			1975·		1'980
Thr Val	Gíu-	Met Leu	Pro Ser Lys	Ala	Gly Ilé Třp Arg	Vál Glu Cys
1985:			1990		.1995	2000
Leu Ile	Glý.	Glu His	Leu His Ala	Gly	Meť Séř Thr Léu	Phe Leu Val
		.2005			2010	2015 .
Tyr Sér	Ašn	Lys Cys	Gin Thr Pro	Leu	Gly Met Ala Šer	Gly His Ile
	2020	2025	20’30'
Arg Ašp	fPhe	Gin ile	Thr Ala. Ser	Gly	Gin Tyr .GÍy Gin	Trp Ala Pró
2035		2040		204'5
Lys Leu	Ala	Arg Leu	His Tyr Ser	Gly	Ser Ile Asn Ala	Trp Ser Thr'
205Ό			2055		2060
Lys Glu	Pro	Phe Ser	Trp Ile Lys	Val	Asp Leu Leu Ala	Pró Meť Ile
ioss'			2.070		2’075	2080
Ile His	Gly	Ile Lys	Thr Gin Gly	Ala	Arg Gin, Lys Phe	Sér Ser Léu
		2085			.2090	2095

-50CZ 298250 B6

Tyr Ile	Ser Gin Phe	Ilé Ile·	Mét Tyr Ser	Leu Ašp Gly Lyš	Lys Tip
	21-00		2105·	2110
Gin Thr Tyr. Arg Gly	Asn Ser	Thr Gly Thr	Leu Met Val	Phe	Phe Gly
2115	2120	' 2125
Asn¹ Val	Asp Ser Ser	Gly Ile	Lys His Asn	Ile Phe Asn	Pro	Pro Ile.·
.2130		2135		214,0
Ile Ala	Arg Tyr Ile	Arg Leu	His Pro 'Thr	His Tyr Šer	-Ile,	Arg Ser
2145		2.15.Q		2155		21:60
Thr Leů	AřgýMéť Glu	:Lěu Met	Gly Cyš Asp	Leu Asn. Ser	Cys	Ser Mét,
	2 Γ65		2170	2175
Pro 'Leu	GÍyMe.t Gl-u.	Sér Ly's	Ala Ile Ser	Asp Ala. Glh	Ile,	Thr Ala.
	2iéo		2185		Ϊ19.0
Šer išer.·	Tyr Phé Thr	Asii Met	Phe· .Al’á -Thr	Trp Ser Pro	Ser	Lyš Ala
2*9.5	2200	..... 2205:
Arg -Leu-	His Leu- Gin	.Gly Arg	Sér .Asn Ala·	Trp Arg· Pro	Gin	val. Asn
' 221'0.		2215		2220
Asn Pro	.Lys Glu. Tr-p	Leu Gin	Vál Asp Phe	Oln. Lys „Thr	Met	Lys· Val
2225		2230		2235		2240
Thr Glý	Val Thr Thr	Gin 'Gly	Vál Lys Ser	^;Leu. Leu Thr	Sér	Med Tyr
	' ²²⁴5		2250		>255
V a1 Lys	Glu ,?h'e. Léu	Il'e. 'Sér	Set Ser Glh	Ašp Gly His Glh	Tip Thr.
	22 60		2265	, 2270
Leu Phe	:Phe Gin, A’s’n	Gly Lys	Val Lys: Vál	Phe Gin Glý	Asn	Gln._ Asp .
	’275	2280	2285.
Ser Phe	Thr. Pro Vál	Val Asn	Sér Leu Asp	Pro Pro¹ Leu	Leú	.Thr Aig
.2'29'0		2295		2300
Tyr Le.u	Arg: Ile ^:His	Pro Gin	Sér Trp.; Val	His Gin. íle	Ala	Leu Ar,g-
2.3C5'		231'0		2315		2320
Met Glu	Val Leu Gly	Cys Glu	Ala. Gin Asp	Leu 'Tyr

,2325 ,2330 <210>·- 3- · - * ......

<21 ί> 1130 <212 > DNA <213> Prase <<0Ó> -3 taagcaccct aagacgtggg ťgcactácať ctctgcagag gaggaggact gggactacgc 60 ccccgcggtc cccagcccca ctgacagaag ttataaďágt ctčtacttga aca.gtggtcc 120'

-51 CZ 298250'B6 tcagcgaatt ggtaggaaat acaaaaaagc tcgaťtcg.tc gcttacačgg atgtaacatt 180 taagactcgt áaagctáttc; cgtatgaatc aggaátčctg ggáčctttac tttatggaga 24.0 agttggagac acacttttga ttatattťaa gaaťaaagcg agccgaccat aťaacatčta. 300. ccctčaťgga ářcáctgatg tčágcgcttt gcacccággg. agacttctaa aággttggaa 360 acatttgáaa gacaXgccaa tt.ctgccagg agagáctttc aagtataaát ggacágtgac, 420' tgtggaagat gggccaacčá .agtcčgátcc. tcggtgčctg_; acccgctact actcgagctc 480 cat.taatcta gagaaagafc: tg.gcťtcg.gg actoattggc „cctct-ccfca tctgctacaa 54 0 agaaéctgta gaccaaagag. ..gaaaccagat gatgtcagac aagagaaacg tcatcctgtt 600 ttčtgfa-ttc .gaťgagaa.tc· aaagc,t.ggta cctcgcagag aatattcagc gcttcctcce :&60. caátccggať gga.ttáčagc cccaggatcc agagttccaá gčťtctaaca' tčatgcácag 720 catcaátggc .ťát.gtťťtťg atagcttgca. gcťgtcggťt tgtttgcacg aggtggcata 780 ctggtača.tT ctaagtgttg gagcacagac cgactťcctx. tčcgtcttct. tctctggcta .840 ča c c t ťča aá ca ca á á á t g g t c tat ga a g a ča c a c t ca c o· ··c t g 11 cccc t ť c t c a gg a g a 900 aacggtctfc atg.tcaatgg' 'ďaaracččagg. tctčtgggtc ctagggtgcc acaactcagá 960. ctrgcgg.aac a.gag.gga.tga..cagccttact gaaggtgtat agtt.g.tgaca gggacattgg 1020' tgattattat gacaacactt a.tgaagatat tccaggcťťc. ttgctgagtg gaaagaatgt· 1'080' ca.ťžgaácčc ágáagčtttg cccagaattc· aagacqccct :agtgcgagca. 1130· <210> 4 <211> -368 <212> PRT <213> Prase <4Ó0> 4

Ser.	Val Ala	Lys	Lys	His'.Pra	Lys	.Thr	Trp	Val His Tyr	Tle	Šer	Ala.
1			5				10.			15
Glu	Glu/Glu	Asp	Trp	Asp_: Tyr	.Ala	Pro	Ala	Val Pro Šer	Pro	Šer	Asp
		20				25:			30
Arg	Ser Tyr.	Lys	Šer	Leu.Tyr	Leu	Asn·	Ser	Gly .Pro. Gin	«· Arg	Ilé	Gly
	'35'				4’0			45
Ařg	lys Týř	Lys	Lys.	Ala Arg	Phé	Val	Ai.aⁱ	Tyr Thr Asp	Val	Thr	•Phe;
	50			55				,60^:
.Lys	Thr Arg'·	Lys	Ala	Ile Pro	Tyf	Glu.	:Seř	Gly'Ilé Léu	Gly	Pro	Léu
65				7-0				75		80

-52CZ 298250 B6

Leu

Tyr

Gly Glu Val Gly

Asp

Ťhr. Leu

:Leu.

Ile

Phe

Lys

Asn

Lys

.8.5:

90

95

Ala

Ser

Arg Pro Tyr Asn

Ile

Tyr Pro

His

'Gly

Ile,.

Thr

Asp.

Val

Sér

100

105

110

^1

Ala

Leu

His Pro; Gly' Arg

Leu

Leu Lýs

Gly

Trp

Lys

His.

Leu

Lys'

Asp

i í· .· ií

115

'12 Q

125

á

Met

Pro

Ile Leú Pró Gly

Glu

.Thr Phe

Lys·

Tyr

Lýs

Trp

Thr

Val

Thr

•130

135

140

Val

Glu

Asp Gly Pro Thr

Lýs

Šer Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Í45

'150.·

155

1.60

Tyr

Šer

Ser Šer. ile Asn

Leu

Glu; lys

Asp; .17:0

Leu

Ala.

Šer

Giy

Leu.

ile

1'65

,175<

Gly

Přó,.

Léu Léu Ilé pys-

Ťýr,

Lyš Glu

Sér^;

Vál.

Asp

Gin

Arg

Gl-y

Asň

180

185·

190

'Gin

Meť.

Met Šer Asp lys.

Arg

Ašn. vál

Ile·

'Léu;

Phé

Sér

Val

Phe-

Asp

195

200

.205

Glu

•Asn·

GÍn Sér Trp Tyr

:Léu

Ala' Glu

Asn

Tle

Gin

Arg

Ph^:é.

Leu

pro.

210

.215

220

Ásn

Pro^

Asp Gly Leu Gin.

Pro

GÍn Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

•Ala

Šér

Asň

225

230

235;

240

Ile

Met

His Ser Ile Asn

Gly

Tyr Val

Phe

Asp

Ser

Leu.

Gin

Leu

Ser.

'24 5

250

255

.Vál

Cys

Léu His.Glu Val

Ala:

Tyr Trp.

Tyr

Ile·

Leu

Ser

Val

Gly

Ala -

2Š0

265

270.

Gin

Thr

Asp Phé Léu Sér

Vál

Phe Phé

šeř

Gly

Tyr*

Thr

Phe:

Lýs

His

275

280

2.85

•

'Lys

Met

Vál Tyr Glu Asp

Thr.

Leu Thr

Leu

Phe

Pro

Ph;e

Sér

Gly

Glu;·

290

295

300;

-

Thr

Val

Phe ^:Met Šér Met

Glú

•Ašn Pro

Gly

LéU

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

305

310'

315

320·

His

Asn

Šer Asp Leu· Arg

Asn

Arg Gly*

Meť

Thr

Ala

Leu

^:Lys.

Vál.

325. ·. .

330

* -

335

Tyr

Šer.

Čys Asp Arg Asp

Ile

.Gly Asp

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr.

Glw

340

345

35Š

Asp

Ilé

Pró- Gly Phe_: Leu

Leu

:Ser Gly

Lyš:

Ašh

Vál

Ilé

Glu

Pró

Arg

355

360

365

-53CZ 298250 B6 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Umělá sékvenčé <220>

<223* Pópis umělé sekvence: oligonukleotidový primer <400> 5 ctaatacgae tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc ággt 4 4 <210* .6 <211> ^:27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <2'20>

<22 3> Popis umělé sekvence: oligonukleotidový primer <4.00> 6 ccatcctaať acgactcact aťagggc 27 <210* 7 <211? 2.4 <212* DNA <213> Umělá sekvence <220?

<223* Popiš umělé, sekvence: oligonukleotidový primer <400? 7 ččáttgacat gaagaccgtt tctc 24 <210* 8 <211* 23 <212* DNA <213* Umělá sekvence <220* <223? Popis umělé sekvence: oligonukleotidový primer.

<4 00* 8 ačtčactáta gggctcgágc ggc 23.

<210? 9 <211* 24 <212* DNA <213* Umělá sekvence

-54CZ 298250 B6 <220>

<223> Popis umělé sekvence; oligonukleotidový primer <400> 9 gggtgcaaag cgctgacatc a.gtg 2.4 <210> 10.

<211> 50 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotidový přimet <400> 10 cctctcg.agc caccaťgtcg· agccaccátg cagctágagc tctčcaččtg 50 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22Ó>

<223> Popis- umělé sekvence·: oligonukleotidový primer <400> 11 cgcgcggccg cgcatctggc aaagctgagt t 31

-•--<21Ό·> 12------ ------------ ------<211> 2.7· <212> DNA.

<21'3>· Umělá <sé'Rvěňcé:

<220>

<223> Popis umělé sekvence roligonukleotiďový primer <40Ó> 12 gaaataagcc caggčttťgc agtcraa 27 <210> 13 <2T1> .22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotidový primer <22Ó>

<221> Různé znaky, <222> (22)

-55CZ 298250 B6

22:

<223> N v poloze 22 jé A,₍ T>. G^nebo Č-.

<400> 13 ággaaattc.c actggaaccť tn <210> 14 <211> 25 <212> DNA <2'13> Umělá sekvence <220>

<223^> Popis umělé sekvence: olfgonuklpotljipvý primer· <22Ó>

<221> Růzrié 'zňaký <222> (25) <223> N v poloze 25 je A, T,. G nebo C, <400>. 14 ctgggggťga attcgaaggť ág.cgn <210> 15 <211> 23 <212> DNA .<••2'13> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: pligonukleotidový primer <400> 15 _______________________

- - gagtťcatcg -ggšágácct g tťg' <210> 16 <211> 24' <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popiš umělé sekvence:?. oligonukleptiďóyý primer <4 00> 16. , .

acagccca.tc áácťčcátgc gaag 24 <210> 17 <211> Í9 <212> DNA.

<213> Umělá, sekvence.

<220>

<223> Popis umělé sekvence: óligonukleotidový primer

-56CZ 298250 B6

<400> 17
tcagggcáát čággactcc	19

<21Ó> .18 <211> 21 <212> DNA.

<213> Umělá, sekvence <220>

<‘223> Popis, umělé sekvence: oligonukleotidový primer <4 0Ό>· 18 ccgtggtgaa cgcxctggac c <210>. 19 <211> 24 <212> DNA <213>’ Umělá sekvence <2-20>

<223> Popis umělé sekvence:: oligonukleotidový primer <400> 19 gtágagg,ť,cč; ťgtgčctcgc agcc <21 ó> 20.

<21 i> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence.. _ _ ,, . .... -....... -..... - - ...........

<22Q>

<223> Popiš, umělé·'- sekvence': ρΐιρόηύχϊβόίήο'νγ primer <400> 20

g.tagagstscj-t.gkgcctcrc akccyag 2.7.

<210>. 21 <211> 2'4 <212> DNA <213> Umělá, sekvence <22 0>.

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotidový přiměř <400> 2.1 ctťcgcatgg ágttgatggg ct.gt 24

-57CZ 298250 B6 <210> 22 <211> 21 <212} ,DNA <213} Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé; sekvence: oligonukleotídový primer <400> 22 aaťčaqgáct ččtčcacccc^: .g .21 <2l0> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 G>

<223> Popis umělé' sekvence: óligbnuklěótídový primer <400> 23' ggatcčácco cačgagctgg. 20 <210> 24 <211> 24 <2.i2> DNA <213>' Uměla sekvence.

<220>

<223> Popiš umělé sekvence:' oligonukleotidový primer

-----<4C0> 24,------ - - -------cgčccťgagg cťcgaggttc ťagg <210 25 <2il> 22 <212> DNA.

<213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: .óligónúkléptidový'primer <400> ·2·5 - ” aatcaggact cctccacccc cg <210> 26 <2U> 20 <212> DNA <213> Umělá- sekvence.

<220

-58CZ 298250 B6 <223> Popis umělé sekvence :.oligonukieotido.vý primer <400> 26 ccttgcagga attcgattca <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence

..<2'20>

<Ž23> Popiš umělé, sekvence: ollgoríukleótidóvý přiměř <4 00> .27 ecgtggtgaa cgctctggac, c

^210> 28 <2.11> 2319 <212> PRT <213> Mus, itiusculus <4Ó0> 28

Mét	Glň	Ile Ala	'Leu Phe	Ala' Cyš	Ph'ě Phe	Leu	'Sér	Leu	Phe Asn	Phe·
1			5		ϊα				’ 15
Cys	S.er	Sér Ala	Ile Arg	Arg· Ťyr	Tyr-Leu.	Gly	Ala:	Val	Glu Leu	Šer
		20		25			30.
Trp.	Asn	Tyr Ile	Gin Šer	Asp Leu	Leu Ser	Val_	Leu	His	Thr Asp	Ser- .
		•35’.....		40				45'
Arg	Phe	Leu Pro	Arg Mét	Sér -Thř	Ser 'Phe	Pro	PHe	Ašrt	Thr- Ser	Ile:
	'50·,			:55			60
Met	Tyr,	Lys· Lýs	Thr Val	Phe Val	Glu, 'Tyr.	Lys	Asp'	Gin	Leu .Phe	Asn
65			70			75				80
Ile·	Ala	Lys Pro	Arg Pro	Pro 'Trp	Met Gly	Léu	Leu	Gly	Pro Thr	Ile
			:65		9.0.				95
Trp;	Thr	Glu Val	His· Ašp	Thr Val	Val Ile	Thr	Leu-	Lys	Asn Met	Ala
		100 ^lh M			10'5				110	-
Ser	His;	Pro Val	Ser Leu	His Ala	vai Gly	Val	Šer	Ťyr	Trp. Lys	Ala
		lí-5		120·				125
Ser	Glu,	Gly Asp	Glu Tyr	Clu. Asp	Gin Thr·	Ser	Gin	Met:	Glu. Lys	Glu
	130'			.135			140
Asp	Asp	Lys Val	Phe Pro	Gly Glu	Šer His	Thr	Tyr	Val	Trp Gin	Val'
1.4.5			150.			155				160.

-59CZ 298250 B6

'Leu Lýš Glú	Asn.	Gly Pros Mét Ala 165	Ser	Asp Pro Pro Cýš Leu 170	Thr 175	Tyr
Sér	Tyr Met	Sér	His Val Asp Leu	Vál	Lys Ašp	Leu	Asn	Ser	Gly Leu
		180		'1-8'5'					190'
.•Ile	Gly Ala	Leu.	•Leu Val. .Cys Lys	Glu Gly Sér	Leu	Ser Lys	Glu. Arg
	í 95		200.					205
Ťhr	Gin. Met	Leu	Tyr Gin Phe Val	Leu	Leu	'Phe	Ala	Vál	Phe	Asp Glu
	210		215				220
Glý	Lys Sér Trp· His Ser Glu Ťhr	Ash Asp	Sér	Týt	Thr Gin	Ser	Mět_;
225			230			235					240
Asp	Ser Ala	Sér	Ala Arg Asp; Trp	_;Pro	Lýs	Mět_;	His	Thr	Val	Asn	Gly
			245		25Q					255
Tyr Val Asn	Arg	Sér Leu Pro· Gly	Lei».	Ilé	Gly Cys His	Arg	Lys	Ser
		260		2 65’					270
Val-	Tyr Trp	His	Val Ile Gly Me't	Gly Thr	Thr	Pro	Glu	Ilé	His	Ser
	.275·		2’80					285
Ile	Phe Leu	Glu	Gly His Thr Phe	Phe	Val	Arg¹ Asn	His	Arg .Gin	Ala
	290		295				30,0
Ser	Leu Glú	Ile	Ser Pro Ile Ťhr	Phe	Leu	Ťhr	Ala	Gin	Ťhr 'Leu	Leu
30,5			310 ’			315					320
Ile Asp Leu, Glý	Gin Phe Leu Leu	Phe_;	Cys	His	‘Ilé	Ser	Sér	:His	Lys
			325		330					335
His_	Asp.Gly	Met	Glu. .Ala. ..Tyr. Val Lys.	-Val.	Asp.	Seř-	Cýs-	Prg-	-G-l-u-	Glu_T
		340		345					350'
Ser	Gin Trp	Gin	Lys Lys Ásh Ásn	Ásn	Glu	Glu	Mét	Glú	Ásp. Tyr. Asp
	355		360					365
Asp Asp Leu Tyr	Ser -Glu Met Asp· Met	Phe	Thr	Leu Asp	Tyr Ásp	Ser
	370		375				380
Sér	Pro Phe	Ile	Gin ‘Ile Arg Sér	Vál	Ala	Lyš	Lyš Tyr	Pro	Lý^s	Thř
385			390			395					400
Trp	Ile .His	Tyr	Ile Ser Ala Glu	Glu	Glu Asp	Trp. 'Asp	Tyr	Alá	Pro
			405		410’				-	415
Sér	Val. Pro	.Thr	Ser Asp Asn :Gly	Sér	Týr	Lýs	Sér Gin	Týr	Leu	Sér
		42.0		425					430
Asn	Gly- Pro	Hiš’	Arg Ile Gly Arg Lys	Tyr .'.Lys¹	Lys Val	Arg	Phe.	Ile
	•435’		•4 4 0‘					445
Ala Tyr Thr	Asp	Glu Thr Phe Lys·	Thr	Arg_; Glu	Thr	Ilé	Gin	His. Glu
	450		455				460

-60CZ 298250 B6

_:.Ser	Gly Leu	Leu	Gly	Pro Leu	Leu	Tyr	Gly	Glu Val	Gly	Asp	Thr ;Leu
465				47.0'		475			480
Leu	Ile Ilě	Ph.e	Lys	Asn. Gin	Ala.	Sér	Arg	Pro Tyr	Asn.	Ile	Tyt Pró
			485				490	*			495
His	Gly Ilě	Thr	Asp	Val. Sér	Pro	Leu	His	Ala Arg	Arg	Leu	Pro· Arg
		500				505				510
Gly.	Ile Lyš	His	Vál	Lys Asp	Leu	Pro	Ile	His; Pro	Gly	Glu	Ile. Phe
	515-				520				525
Lys	Tyr Lys	Trp	Thr	Vál Thr	Vál.	Glu	Ásp	Gly Pro	Thr	LýS	Sér Asp
	530,			535				540
Pro	Arg Cys	Leu	‘Thr	Arg. Tyr	Tyr	Ser	Sér	Phe Ilě	Ášn	Pró	Glu Arg
545			5'50'				_:5·55;			5.60
Asp'	Letí Ala	Ser	Gly	Leu Ile	Gly	Pró	Leu	Leu Ile	Cýš	Tyr.	Lys Glu
			565				570				575
Ser	Vál Asp	Gin 580	Arg	Gly Asn	Gin	Meť	Met	Ser Asp	Lyš	Arg	Asn Val
					585				590
Ile.	Leu Phe	Ser	Ile	Phe: Ásp	Glu..	Asn	Gin	Sér' Trp	Tyr	Ile	Thr Glu
	595			600			605
Ásn	Met Glri	Arg	Phe	Leu· Pro	Ásn	Ala	Ala	Lys Thr	Gin	Pro	Gin Asp
	610			615				620
Pro	Gly :Phé^;	Gin	Ala	Sér Ášn	Ile.	Méť	His	Ser Ile	Ašn	Gly	Tyr Val
625				•630				635'			64P
_ Phé.	Asp. Sér	Leu..	.Glú.	-Leu.-Thr	-Val	Cys	•Lé.u·	His Glú	Val	Alá	Tyr Trp
			645				650				655
His.'	Ilě Leu	Ser	Val	Glý Ala	Gin	Thr	Asp	Phe Leu	Ser	ile	Phe Phe
		660				665				670
Sér;	Gly Tyr	Thř	Phe	Lys His	Lys	;Met	Vál	Tyr. Glu	Asp·	Thr	Leu Thr
	67-5				680				685
Letí	Phe Pro	Phe..	Ser	Gly Glu	Thr	Val	Phe	Met. Ser	Mét	Glu	Asn Pro
	690			695				700
Gly	Leu -Trp	Val	Leu	Gly Cyš	His	Asn	i Sér	Asp, Phe	Arg	Lyš	Arg. Glý
7.05				710				715			720
Met	Thr Ala	Leu.	Leu	Lys Val	Sér	Ser	Cys	^:Asp Lys	Sér	Thr	Sér Asp
			725			730				735
Týr	Tyr Glu	Glú	iié	Tyr Glú	Asp	Ilě	pró	Thr -G.ln	Leu	Val	Asn Glu
		740				745				750
Asn	Asn. Vál	Ile	Asp	Pro Arg	Sér	.Phě	Phe	Gin Asn	Thr	Asn	His Pro
	755				760				765

-61CZ 298250 B6

Asn Thr	Arg	Lýs Lys Lys Phe Lys	Asp. Sér	Thr Ile Pro 780	Lýs Asn Ásp	-i
770	775
Met Glu 785	Lys-	Ile Glu Pro Gin Phe 7.90	Glu Glu	Ile Ala Glu 795	Met Leu Lys 800	Ύ¹
Val Gin	'Ser	Val Šer Val Šer Asp 805	Met Leu 810	Met Leu Leu	Gly Gin Ser 815	\|
His Pro	Thr	Pro His’ ..Gly Leu. ‘.Phe 820	Leu Ser 825	Ásp Gly Glh	Glu Ala Ile 830.
Týr Glu	Ala 835	Ile His Asp Asp,. His .840	Ser Pro	Asn Ala Ile 8.45	Asp Sér Asa
Glu Oly 850:	Pro	'-Sér Lýs Val Thr :Glh 855	Leu Arg'	Pro Glu Šer 860	His His Ser
Glu Lys 865	Ile	Val- Phe· Thr Pro Gin 870	Pro .Glý'	.Leu Gin Leu 875	Arg Šer Ash 880
Lys Ser	LeU	Glu Thr Thr Ile Glu 885	Vál Lyš 8.90	Trp Lys Lýs	Leu Gly Leu 8.95
Gin Val	Šer	Ser Leu Pro Šer Asn' 9 00	Leu Met 905	Thr Thr Thr	Tl-é Leu’ Sér 910
Asp ASη	Leu 915	Lys; Alá Thr Phe. Glu 920	Lys: Thr	Ásp Ser Šer '925	Gly Phe Pro
Asp Met 930	Pro	Vál His Sér Ser Ser 935	Lys Léu	Ser Thr Thr 940	Alá Phe Gly
Lys Lýs 945 '	Ala	Tyr Ser Leu Val Gly ' 950' ' ' '	Seť His	Vál Pro Leu 955	.Asn. Ala ..Seř_r -------- 960
Glu. Glu	Ásn	Ser Asp Šer Asn' Ile .965	LéU Ašp 970	Ser Thr Leu	Met Tyr Seř 975
Gin Glu	Šer	Leu Pro Arg Asp: Asn 980	llé' Leu 985	Ser Ile Glu	Asn .Asp Arg 990
Leu Léu	Áxg- 995	Glu Lys Árg. Phe His 100,0	Gly Ile.	Ala Leu Leu 1005	Thr Lys Ásp
Asn, Thr 1010_;	Léu.	Phe Lys Asp Asn Val 1.0.15	Sér Leu	Met Lys Thr 1020	Asn Lys Thr
Tyr Asn 1.0,25	Hiš	Ser Th^;r Thr Asn Glu .103.0	Lýš Leu Hiš Thr Glu 1035.	Šeř Pro Thr 1040
Ser Ile	Glu	Asn Ser Thr Thr Asp 1045	Leu Gin 1050	Asp Alá Ile	Leu Lys Val 1055
Ásn Ser	G1U	Ile Gin Glď Val Thr	Ala Leu.	Ile His Asp	Glý Thr Leu

1060 ...... 1065 1070

-62CZ 298250 B6

Leu Gly	Lys Asn .Ser	Thr	Tyr Leu	Arg	Leu	Asn. His Met	Leu	Asn	Arg
1075		1030			1085
Thr Thr	Ser Thr Lys	Ásn	Lys Asp	Ile	Phe	His Arg Lys	Asp	Glu	Asp
1090			1095			ίιοσ
Pro Ile	Pro Gin Asp-	Glu	Glu Asn	Thr	Ile	Met Pro Phe	Ser	Lys	Met
.110.5.		11.10			1115			H20
Leů Phé	Leu Ser Glu	Ser	Sér Asn	Trp·	Phe	Lys Lys Thr	Asn	Gly	Asn
	1125			1130		1135.
Asn Ser	Leu. Ašri S'er·	Glu	Gin Glu	His	Ser	Pro Lys Gin	Leu.	Val	Tyr
	1140			L145		1150
Leu Met	Phe^r: Lys Lys.·	Tyr	Val Lys	Asn	Gl'n	Šer Phe Leů	Sér	Glu	Lýš
	1.15:5		1160.			1165
Asn. Lý-s'	Val Thr Val	Glu	Gin... Asp	Gly	Phe	Thr Lys Asn	Ile	Gly	Léu
1170		1175			1180
Lys Asp	.Met Ala Phe	Pro:	His Asn	Met·	Ser	Ile Phe Leu	Thr	Thr	Leu
UÉ5		I190^;			.119'5		1200·
Šer Asn	Val His Glu	Asn	Gly Arg	.His	Asn.	Gin Glu Lys	Asn	Il.e	Gin
	1205				1210		1215
Glu Glu	tle Glu. Lys	Glu	Ala Leu.·	η-e,	Glu	Glu .Lys Val	Vál	Leů	Pro
	Ϊ220		1225'		1230
Gin Val	His Glu Ala	Thr	Gly Šer	Lys:	Ásn	Phe Leů Lys	Asp	Tle	Leu
	L235		12’40			124.5
Ilé Leu.	Gly Thr· Arg..	Gin	Ásn Ile	Ser-	-Leu-	-Ťyr“Glu· Val	?Hiš	Vat	pro'···
125'0		1255			1260
Val Leu	'Gin· Asn Tle'	Thr	Ser Ile	Ásn	Asn	Ser Thr Ásn	Thr	Val	Gin
1265	1270			1275		1280:
Ile His	Met. Glu 'His	Phe	'.Phé Lys	Arg^:	Arg-	Lys Asp Lys	Glu:	Thr	Ašů
	1235			1290	,12.95,
Ser Glu	Gly .Leu Val	Asn	Lys. Thr	Arg^:	Glu.	Met Val Lys	Asn	Tyt	Pro
	130'0		1305		1310
Ser Gin	Lys Asn Ile	Thr	Thr GÍn	Arg	Sér’	Lýš Arg. Ala	Leu	Gly	Gin
	L.315		L3-2-O			’ '1325
Phe Árg,	Leu- Ser- Thr	Gin	Trp- Leu	Lys	Thr.·	lie Asň Cys	Ser	Thr	Gin·

1330: 1335 1340 (I li

Cys Ile Ile tys G’ln ile Asp His Sér Lys< Glu Met Lys: Lys Phě ile 1345 1350 1355 1360

Thř Lys; Ser Ser Leu Ser. Asp Ser Ser Val Ile Lys Ser· Thr Thr Gin

1365 1370 1375.

-63CZ 298250 B6

Thr Asn. Šer Ser- Asp- Ser His Ile¹ Val Lys Thr Ser Ala Phe Pro- Pro 1360 13851390 ile Asp· Leu Lys Arg Ser Pro Phe, Gin Ásn Lys Phe Šer His Val Gin 139,5 14001405;

Ala: Ser Sér Tyr tle Týr Asp Phe Lys^: Thr· Lýs Sér Ser- Arg Ile Gin 1410; 14151420

Glu Sér Ašn Asn Phe Léu Lýs Glu. Thr Lys IIé Asn Asn Pro Ser Leu 1425 1430 1435 1.4 4 0

Ala Iié Leu Proiřp Ašn. Měť Phe Ile Asp Gin’ Gly Lýs Phe: Thr 'Sér 14 45' ' ₁₄₅₀ ....... 3.4:55

Pro GÍ.yLys Ser'Asn Thr Asn Šer Vál Thr Tyr Lys- Lýs·: Arg. Glu: Asn 14 60· 14 65 ' 1470

I.le· Tle Phe. Leu,. Lys, Pro¹· Thr. Leu Pro iGlu Glu Ser GÍ.y Lys- Ile; Glu. 1475 1.48.01485

Leú Leu .Pro Gin Val Sér Ile Glh Glu.'Glu Glu. ile Leů Pro Thr Glu

14;9O		1495:			1500-
Thr Ser	His; Glý	^:,Sér Pťo	Glý	His	Leu¹' Asn	Leu Met Lýs	Glú' Vál Phé
1505		.....1510			......1	•515	1..520^r
Leu· Gin	Lys·' Ile	Gin: Gly	Pro'·	Thr.	Lys Trp.	Ašn Lys Ala	Lýs: Arg His?
	1525			1530		1535
Gl-y Glu	.Ser Ile	Lys: _;Gly	Lys	Thr	Glu Sér'	Ser Lys Ásn	Thr Arg Šer
	15'4.0				L54 5	15'50'
Lys Lěú	Leu Asn	His His_	_Ala_t	_Trp	Asp .Tyr.,	.His .Tyr:.Ala.	_AÍa:_GlnJIIe_

1555'......... ”1'560.....^: 1565

Pro Lýs. Asp Met: Trp Lys Ser· Lys Glu Lýs .Šer Pro, Glu Ile Ile. Ser 1.570 ” 15751580'

Ile Lys^: GÍň Glu Asp Thr Ile .Leu Ser Leu'Ař:g Pro. His Gly Asn Sér 1585 1590' 1595.1600

His Ser Ilé Gly Ala Asn Glu Lys ΌΪ·η Asn Trp Pro Gin Arg Glu Thr

1605 '' ' Í6ÍÓ1615·

Thr Trp Val Lys- Gin Gly Gin Thr' Gin Arg Thr- Cys Ser Gin· Ile Pro . 1'620 ,1625. ... . . Í.630..

Pro. Val. Leu Bys· ..Arg His .Gin Arg- Glu Leu.'Šer· Ala Phe Gin. Sér. Glu. 1635 164016’45

Gin Glu Ala Thr .Asp Týr Asp Asp Ala· Ile 'Thr. Ile Glu Thr .'Ile. Glu. 1650 1655'1.660

Asp Phe Asp Ile' Tyr 'Ser Glu Asp Ile; Lys Gin Glý Pro Arg Ser Phe

1665 1670' 1675 1680

-64CZ 298250 B6

Gin Gin. Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val. Glu Arg Leu Trp

1685 16901695

Asp Tyr Gly Met Šer Thr Sér His Vál Leu Arg Asn Arg Tyr Gin SerI

1700 1705: 1710.'j

Asp Asn- Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Vál Phe Gin Glu Phe Thr Asp.i

1715 1720 1725Jí

Gly Šer Phe Ser- _;Gln E>ro: Leu Týr Arg ’Glý Glu Leů Ašh Glu His Leu.j

1730 1735 1740s

Gly Leu .Leu. Gly Pro Tyr Ilé Arg Ala; Glu Val Glu Asp Asn Ile Met :1745 175Ó ' .17551760

Val· Thr Phe. Lys Asn GÍn Áía Šer Arg Pro Tyr Sér Phe Tyr Šer Ser

1765 ...........1.7701775

Leu Ile. Šer Tyt Lys Glu Asp Gin Arg Gly Glu Glu Pro Arg Arg Asn

1780 17851797

Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Ile Tyr Phe Trp Lys Vál. Gin Hiš

1795 1.8001805

His Met Ali Pro. Thr Glu Ašp Glu Phe Asp Cys Lys Ala .Trp Ala Tyr 1810 ,18151820.

Phe Sér Ašp Vál. Ašp Leu. Glu Arg Asp Met His Sér Gly Leu ilé Gly.

1825 1830 ..... 1835 ’ ’ ’ ’1840;

Pro Leu Leu Ile. Cys His Ala Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg

1845 18501855

..:Gln..Vaí...Šér. Val .Gin. Glu· Phe Al-a-LeurLeu-^Phe-Thr lle-Phe;·Asp-Glu -

1860 18651870

Thr Lys	•Šer	Trp	Tyr, phe·	Thr Glu	Asn Val	Lys	Arg AŠh Cys	Lys Thr
18,75			18.8.0			1885
Pro Cyš	Asn	Phe	Gin Met	Glu Asp	Pro Thr	Leu	Lys Glu Asn;	Tyr Arg
1890			1895		19Q0
Phe His	Ala	Ile	Asn Gly	Tyř Val	Met Asp	Thr	Léu Pro Gly	Leu Vál
7,905			1910			1915	1920
Met Ala.	Gin	Asp-	Gin Ařg	Ile Arg	Trp Tyr	Léu	Leu Ser -Met	Gly Asn
-		7925		1930		7935 '
Asn Glu,	Asn	Ilé.	Gin Sér	Ilé' His	Phe Ser	Gly	His Val Phe.	Thr Vál
	1940		194 5	1950
Arg Lys	Lys	Glu	Glu Tyr	Lys Met	Ala Val	Tyr	Asn Leu. Tyr	Pro Gly
	1955·			1960			1965
Val. Phe	Glu	Thr	•Leu Glu	Meť Ile	Pro Ser	Arg	Ala Gly .Ilé	Trp Arg
1970			1975.		i	L980

-65CZ 298250 B6

Val Glu Cýs Leu Ile Gly Glu Hiš Leu Gin Ála Gly Mét Ser Thr Leu· 1985 1990 1995,2000

Phe Leu Val Tyr Šer Lys Gin Cys Gin: Ile Pro: Leu Gly Met Ala Ser

2005 20102015

Gly Ser _:Ile; Arg Asp Phe Gin· Ile Thr Ala Ser Gly His Tyr Gly Gin:

2020 20252030

Trp Ala Pro Asn Leu Ala Arg^: Léú His Týr Ser Gly Sér Ilé Asn Ala

2035· '2040 ' 204 5

Trp Ser Thr Lys Glu¹ Frč Phe Ser Trp Ilé Lýs Vál. Asp Leu Leů Ala 2050 20552060

Pro Met Ile -Val His Gly Ile Lýs Thr Gin Gly Ala. Arg Glh. Lys Phe

2065 2070 20752080

Šer Šer Leu. Tyr.. Ile	Šer Gin. Phe Ile Ile	Met Ť.yr Sér Leu Asp Gly
208.5	2090.	20:95
Lýs Lys Trp Leu Sér	Tyr Gin Gly Asn Šer	Thr, Gly Thr. Leu Met Val
2100·	210.5	2110
Phe phe Gly Asn Vál	Asp Sér Sér Gly Ile	Lýs His Asn Sér Phe Asn
2115	212 q;	2125
Pro Pro Ile Ile Ala	Arg Týř Ilé Arg Leu	Hiš Přó Thr His Ser .Sér-
2130	'2135	214,0

Ile Arg Šer Thr Leu Árg Meť Glu Leu Met Gly. Cys Asp Leu Asn Sér

2145 2150 2155 ’ ' ’ ' 2160

Cys Ser il^Pra· Leu Gly_Met_Glu Šér^Lys. Val-.Jle. Ser.Asp -Thr-Gin,- --..........

— -2^5 21702175

Ile. Thr Ala Sér Sér Tyr Phe Thr Asn Met Phe’ Ala Thr Trp Ser Pro 2180 2185'2190

Sér' Glh Ala Arg Leů His Leu Gin Gly Arg Thr Asn Ala_: Trp Arg .Pró

	>195.		22 CO		2205
Gin Vál	Ášn As.p	Pro Lys	Gin Trp Leu;	Gin	Vál Asp	Leů	Glh Lýs	Thr
2210		r	?215		2220
Met Lys	Val Thr·	Gly Ile	Ile- Thr Gin,	Giy	Val Lys	Ser	Léu^: Phe	Thr
2225		2230.			Ϊ235.		2240
Ser Met	Phe Val	Lys Glu	Phe: Leu ile·	Ser	Ser· Ser	Glh	Asp; Gly	Hiš
	2245	2250			2255
His Trp	Thr Gin	ile Leu	Tyr Asn Gly	'Lys:	Val Lys	Val	Phe Gin	Gly
2260		2265			2270
Asn Gin·	Asp Ser	Šer Thr	Pro Mét Met	Asn:	Šer Leu	Asp	Pro· Pro	Leu

2275 2280 22:85

-66CZ 298250 B6

Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile .His Pro Gin Ile Trp Glu His Gin Ile 2290 2295 2300

Ala Leu Arg Leu Glu Ile Leu Gly Cys Glu Ala Gin Gin GÍn Tyr 2305^: 2310 2315

<210? 29 <211> 6402 <212> DNA
<213>	Prase
<220>

<221? CĎS <222> (1)..(6399) <400> 29 pj

atg cag;

cta

gag

ctc.

tcc. acc

tgt

gtc

ttt

ctg

tgt

ctc ttg

cca

ctc

48^:

Met Gin

Leu

Glu

Leu.

Ser Thr

Cys

Val

Phe

Leu

Cys

Leu 'Leu

Pro

Leu

1

’5

10·

15·

ggc ttt

ágt

gcč

atc.

agg aga

t ac-

tac

ctg

ggc.

gca

gtg, gaa

ctg,

tcc

96

Gly Phe

Ser

Ala

Ile

Arg Atg

Tyf

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val Glu

Léu'

Ser

2,0

2.5

3.0

tgg ga‘c_;

tác

cgg

caá

agt gaa

ctc'

cgt

‘•9*9

c.tg

cac gtg

gac

ácc

.14 4

Trp Asp'

Tyt

Arg

Glri

Ser Glu

Leu

Léu

Arg

Glú

*Leu

His 'Vál

Asp

Thr

35

40

45

aga ttt·

cct

gct

aca

gcg. cca

gga

gct

ctt

cúg_;

ttg

ggc ccg

tca.

gtc

192

Arg Phe

Pro

Ala

Thr

Ala: Pro

Gly

Ala-

Leu

Pro

'.'.Leu

Gly Pro

Ser

Val

⁵⁰

55

60

ctg tác·

áaá

aag

a.ct

gtg ttc

g.ta

gag

ttc

a cg

gat

caa ctt

ttc

agc

240

Leú Tyr

Lys

Lys;

Thr.

Val Phe

Val

Glu·

Phe

Thr

Asp

Gin.Leu

Phe

Ser

65

70

75·

80

gtt gčc

ag.g

ČČC

agg

cca.cca

tgg

atg

ggt

ctg

ggt čc.t

acc

atc

28.8-

Vál Ala

Arg

Pro

Arg

Pro Pró'

Trp

Met

Gly

Leu

Gly Pro

Thr

11 é

85

90

95

čág gct

gag

gťt

tac

gac· áčg

gtg

gtc:

gtt

ácč

ctg

aág a ač:

atg

gct

336

Gin Ala

Glu

Val

Tyr

Asp. Thr

Val

Thr

Leu·

Lyš Asn

Met

Ala

100

105

110

tcť cat

ccc

gtt

agt

ctt cac

gct

gtc·

ggc

gtc

tcc

ttc tgg

aaa

tet·

3.84

Šer His

Pro

Val

Šéf

Leu His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe Trp

Lya

Ser

115

Í2Ó

125

tcc gaa

ggc

gct

gaa

tat gag

gat

cac-

acc

agc

caa

agg gag

aag

gaa

4-32

Šer Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr Glu

Asp

Hís

Thr

Ser

Gin

Arg Glu

Lys

Glu

130

135'

140

gac gat

aaa

gtc

ctt

ccc ggt

aaa

agc

ca a

acc

tac

gtc tgg

cág

gtc

480

Asp Asp.

Lys

Val

Leu

Pro Gly

^:Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val Trp

Gin

Val

145

150

155

1'60:

í

ctg Leu

aaa gáá Lyš Glu

aát Asn

,ggt Gly 165:

cca aca Pro Thr.

g.cč Ala

tčt gac

cca cca

tgt ctc acc tac.

528

Sér

Asp 170

Pro

Cys,

Leu Thr Tyr 175

tca

tác ctg

tet

cac·

gtg .gac ctg gtg

aáá, gac

ctg aat

tcg

ggc

ctc

.576

Ser

Tyr Leu

Sér

His.

Val Asp. Leu Val

Lys Asp

Leu

Asn

Ser

Gly Leu

/130

165

190

att

gga gcc ctg

ctg

gtt tgt

ága·

gáa

ggg

.agt

ctg

acc

aga

gáá

agg

624

Ile

Gly Ala

Leu

Léu

Val Cys

Arg_; Glu

Gly:-Ser

Leu. Thr

Arg

Glu Arg

19'5.

200

205

acc

cag aac

Ctg

cac

gaa ttt

gta

cta

ctt

ttt

gct

gtc

ttt

gat

gaa

•672

Thr.

Gin Asn

Leu

His

Glu phe

Val

t.eu

Leu ’Phe

Ala

Val

Phe

Asp Glu

210.

2,15

220

999

aaa iag.t

tgg

cac

tca gca

aga;

a'a’t

gac.

tec

tgg

aca

cgg

gcc

atg

720

Glý.

Lys· Sér

Trp

His

Sér: Ala

Arg.

Asn Asp Sér

Trp.

Thr

Arg Ala

Mé.t

225.

230-

235:

240

g.at.

cčc 'gca

cet

.gcc

agg; gc.c

cag

cct

gcá.

arg

čác

aca. .gtč

áá.t

9.99

7’68·

-Asp

Pro Ala·

Pro

Ala 245

Arg Ala

Gin

Pro

Ala 250

Met

His

Thr

Val

Ašn 255'

Gly

'tat

gtc aac

agg

tet

ctg' .cca

9'gt

ctg

atc

gga^j

tgt

cat.

áág

aáá

tca,

816

Tyr

Val Asn

Arg

Šer

Leu Pro

Glý

'.Letí

•Ile Gly Cys

His·

Lys

Šer.

260

265

270

.gtc Vál

tác tgg

cac· .gtg

att gga

atg'

.ggc

acc

agc ccg

gaa gtg

cac

tcc

864

Tyr Třp His

Val

Ile Gly Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu Val

His

Ser

275

280

285

att

ttt ctt

gáa

ggc

čac acg

ttt

ctc. gtg

ágg.

cac

cát

cgc

cag

gct

912

Ile

.Phe Leu;

Glu

Glý

His Thr

P.hé

Leu.

Vál

Arg:

.His;

His

Atg

Gin

Ala

2,90’

______295

—

30 0.

.....

... . ,

-------

tcc

ttg gag

atc

tčg

cca ‘cta

act

ttc

ctc

áčt

gct

cag

aca

ttc

ctg

960.

S.er

Leu Glu; Ile

Šer

Pro Leu

Thr

:Phé

^:LéÚ

Thr·

Ala

Gin

•Thr

Phe

Leu

'3:05

310

315

320·

atg·

gac cťt

ggc

.cag.

ttc cta.

•ctg

ttt.

tgt

cat

atc

tet

tcc. cac

cac

1008

Met

•Asp Leu

Gly

Gin

Phe Leu

Leu

Phe :Cys

Hfs

Ile

Ser

His

3.25;

330

335

cát

ggt ggc.

atg

gag

gct cac

gtč

aga

gta

gaa

agc

tgc

gcc

gag

1056

His

Glý Gly Met

Glu

Ala· His

val

Arg

Val.

Glu

Šer

Cys

Ala

Glu

.3.40

345

356

cčc

cag ctg·

•.ega

ágg

aáá gct

gat

gáá

gag

gaa

gat-

tat

gat

gac

áát

1.Ϊ0.4;

Pró

Gin Leu

Arg Arg Lys· Ala..

Asp

Glu.

Glu Glu

Asp. Týt

Asp Asp Asn.,

3.55

.360

,365;

ttg

tác: gac

tčg

gac

áťg gá.c

gtg

gtc cgg.

čte

gat

ggt

gáč gac

gtg

1152;

Leu.

Tyf Ašp

Sér Asp

Met' Asp Vál.

Vál Arg

Leu

Asp Gly Asp Asp Vál

370·: 37.5 380

-68CZ 298250 B6

tet Šer 335

ccc Pro

ttt. atc Phe I.le

caa atc ege Gin Ile’ Arg 390

tcg Ser

gtt. Val-

gcc aag aag

cat ccc ááa acc

12.00

Alá

Lys395.

Lys

His

Pro Lys Thr 400

tgg

gt-g:

•;Cac tác

atc

:tCt

gca.

gag

gag gag

gac tgg

gac

tac

gcc

ccc

1248

Trp

Val

His- Tyr

Tle;

S.er

Ala

Glu

Asp Trp

Asp Tyr

Ala

Pro

405'

4-10

415

gcg

.gtc

ccc age

:ccc

agt

gac;

aga

ág.t; tat

aaa.

agt

ctc.

tac

ttg

aac

1296.

Ala.

Val

?ro Sér

Pro.

Sér Asp Arg

Ser Týr

Lýs

Sér

Leu Tyr

Leu

Asn

420

425

43Ό.

agt

ggt

cct cag

ega-

att

ggt..agg

a’aa

tac

aaa

get

ega.·

ttc

gtc

1.344

Šer

•Gly

Pro; Gir.

Atg

Ile·

Giý. Arg

Lyš

Tyt

Lys

Lýs, Ala Arg

Phe

vál

435

4 40.

44.5

get

tac

a cg· g at

gta

a'ca.

ttt

aag

act

cgt

áaá

get

át:t'

ccg_;

tát

gáá;

1392

Ala

Tyr·

Thr- Asp

Val

Thr

Phe·

Lys'.

Thr Arg

Lys

Ala

ile

Pro

Tyr

Glu

4 5.0.'

.4-55

4ťó

teá

g.Ó a

atc ctg·

gga

.cct

tta

ctt

tat

gga

gaa

gtt

gga

gac

a ca.

ctt

1440

Sér

Gly

Tle Leů

Gly

pro-

Leu Leu-

Ty_r

Gly

-Glu

Val Gly Asp

Thr

Leu

4 65

47Ό

475'

480

ttg

a t t

áťá ttt.

aág

aat

ááa·

gpg.'

age

cgá

cca

tat

aac

atc

tac

cct

1488;

Leu

Ile

Tle Fhe

Lys

Asn

Lýš

Alá>

Ser Arg

Přo

Týr Asn

Ile

Tyr

Pro

485

49,0>

4 95

cat

gga.

atc act

cat-

gtc

age

get

'ttg

cá.c·

Cca.

ggg

aga:

ctt

čta

aaa

1536

His

Gly

Ile Thr

Asp

Val

Šer

Ala

Leu

Hi.S

Pro Gly Arg'

Leu

Leu Lys

50'0

505

510

ggt,

tgg

aaa. cat

ttg

aaa

gac

atg

cca-

att

ctg.

cca

gga-.gag

.act

ttc

1584.

Gly

Trp

Lys His

.Leu

Lys

Asp.

Met

.Pro

Ile

Leu·

Pro·

Gly '.Glu-

Thr

Phe

515

520

523

____ 4- - .

......-

----- _

—

------

. ----

—----

, -------

áag

tat

aaa: tgg

ácá

gtg

act·.

gtg

.gaa.

gat

ggg

cca

acc: aag

tec.'.

•ga’ť

L632’

Lys

Týr

Lyši Trp

Thr

Val

Thr.

Vál

Glu Asp

Gly

Pro

Thr

Lys.

Šer Asp.

530

335

340

cct·

cgg

tec ctg

.ŠCC.

ege

táC;

Tác

tcg

agč

t;cc

‘att

aat

cta

gag

aaa

1680

Pró? -Arg

Cys Leu

Thr Arg Ίγϊ Tyr

Ser

,S,eř

Sér·

Ile

Asn

Leu

G1U

Lys

545-

550

555

.560'

gat

ctg_:

get tcg

gga-

’ct-;c

at.tí

ggg

cct

čte

ctc

.'atc

tgc

tac'

ááá

gaa

1728

Asp- Leu-

Ala Sér

Gly Leu

Ile.

Gly

Pro

Leu

Léu

Ile

cys

Tyt Lýs

Glu.

565

.570;

.575

tet

gta_:

gac caa'

aga

gga.

aac

cag.

atg

Cca

aag _

ága.

.aac.

gtc,:

177.6,

Šeř'

•Vál

Asp “Gin: Arg

Gly

Asn

Gin

Mét

Meť

Ser

Asp Lys Arg Asn

Vai

580

585

.590

atc

ctg,

ttt ,tc.t

gta

ttc

gat

gag

aat

caa

age

tgg

tac

ctc

gca

gag

í 8 24

Ile

Leu.

Phe Ser

Val

Phe' Asp

G1U

Asn

Gin.

.Šer

Trp_:

T.yr

Leu

Ala-

Glu

59.5

600'

60'5

-69CZ 298250 B6

aat	att cag cgc	ttc	ctc ccc	aat	ccg	gat aga	tta:	cag	.ccc	cag gat	1872
Asn	Ile Gin Arg	Phe	Leu Pro	Asn	Pro’	Asp Gly	Leu	Gin	Pro	Gin Asp
	610		-615’				620
cca	gag ttc. čáa	,gcť	tet aač	átc	atg·	cac ágc	atc aat	agc.	tat gtt	1920
Pro	Glu Phé Gin	Ala.	Ser Ašn	Ilé	Met	His Ser	.Ile: Ash	Gly	Tyr Vál.
.625.			630			'635				640
ttt.	gať ágc ttg	cag	ctg tcg	gtt	tgt.	t.tg các	gag- gtg	gca	tac tgg	1968
Phe	Asp Sér Leu	Gin	Léú -Ser	^V?i	Cýš^:	Leu Říš	Glu	Val	Ala.	Tyr Trp
		64 5'				650				655
'tac.	att cta .agt	gtt·	aga gca	cag	acg	gac ttc	ctc	tcc	gtc'	ttc ttc	• 2016
Tyr	Ile Leu'Šer	Val	Gly Ala Gin	Thr	Asp. Phe	Leu- .Ser	Val	Phe Phe
	660				665				670
t.ct	ggč tac acc	ttc-	,aaa cac	a'a a	atg	gtc tat	gaa	gac·	aca	ctc acc	2064
Sér	Gly Tyr· Thr	Phé	Lys His-	Lys	Met	•Val. Tyr	Glu	Ásp	Thr	Leu Thr
	675			680.				685
ctg	ttc CCC ttc	tca	gga' gáa	acg	gtc	ttc atg	tca.	atg	gaa	aac cca	21,12
Leu	Phe^: P.ró Phé	Ser	Gl.y Glu.	Thr	Val	Phe Met	Sér	Meť	Glu	Asn Pro
	690		.695				700
ggt	ctc. ťgg gtc	cta	ggg: tgc	tác	aáč	tca -gat ttg	cgg-	áác	aga ggg	21.60'
Gly	Léu Trp Val	Leu	Gly Cys	H;is	Ash	Sér Asp	Leu	Arg Asn	Arg Gly
705			71tf			71.5^:				72.0
.a tg	aca-;gcG tta	ctg	aag gtg	tat·	agt	tgt gac	agg	CůC	att	ggt· .gat-	22 C 8
Met	Thr Ála Leu	Leu	tys Val	.Tyr	Šer	Cys Asp	Arg	Ásp	Ile	Gly Asp
		725				73Š				735.
tat	tať _:gac áač.·	..act	tax· gaa	gat	att	cca ggc	ttc	ttg ctg	agt g.ga	2'256
T.ý.r_:	Tyr Asp Asn.	•Thř	.Tyr: Glu	Asp Lle.	Pro- Gly	Phe	Leu	Leu	Ser- Gly
	74Ό				745·				750
. . -	..............	—	— .. -------		““	-----—	---		—	---------------	—
áag	aat gtc att	gaá	ccc aga	agc ttt	gcc cag	aat	t.qá,	aga	ccc cct	2304
•Lys	Asn Vál Ile	Glu	Pro Atg	Ser	,Phé	Ala Gin	Ašn	Ser	Ařg	Pró Pro;
	..... 755			7G0				765
agt.	gcg agc caa	aag	caa. ttc	čáá.	acc	atc aca'·	agt	cca	gaa	gat gač-	2'352
Ser	Ala .Ser Gin	.Lys	Gin Phe	Gin	Thr·	Ile Thr	Ser	Pro	Glu	As.p Asp
	770		77'5				78 Ó
.gtg	gag ctt gac	'ccg	cag tet·	gga	gag	aga acc·	caa	gca	Ctg	gaa gaa	2400
Val.	Glu Leu Asp	Pro	Gin Ser	Gly	Glu·	Arg Thr	GÍn	Ala	Leu·	Glu Glu
785-			790			795				800
cta	agt^: gtc ccc	tet-	ggt gat-	gg.g	tcg	atg ctc	ttg.	gga	.cag.	aat cct	2.44 8
Léu	Šeř. Val' Pr.o	‘Sér	Gly Asp Gly	Šer	.Met Léu/	Leu	Gly	Gin	Asn Pro;
		8.05				810				815
gct	cca. cá.t -ggc	.tca	tcc tca-	tet.	gat.	.ctt caa	.gaa	gcc		.aat gag	24 9.6
Ala	Pro His- Gly	Ser	Ser ^:Ser·	Ser,	Asp·	Leu Gin	Glu	Ala	Arg	Asn Glu
	820				825				830

-70CZ 298250 B6

gct

gat

tat

tta

čet

gga

gca

agá_;

gáá

ega

ggc

acg

gcc:

cčá

tcc

2544

Ala

Asp

Tyt

Leu

Pro

Gly

Ala

Arg'

Glu

Arg

Gly

Thr

Ale

Pro

Ser

835

840

845

gca

gcg.

gca

cgt

Čt‘C

aga

cca

gag

ctg.

:cát

c'ac

agt

gcc

gaa.

aga

gta

2592

Ala

Arg

Leu

Arg

Pró

Glu

Leu:

His

Sér

Ala

Glu.

Arg

Val

850

855

860.

ctt

act

cct

gag

cca

gag

aaa

gag

ttg

aag

aaa

ctt

gat

tca:

aaa

atg

2640

Leu,

Ťhr

Pro..

Glu

Pro

Glu

Lys

Glu·

Leu.

Lys

Leu

Asp

Šer

L.ys

Met

865

.870

873

880'

tčť

agť

t-ča

tca

gac.

ctt

cta

aag

act

tcg

ccá

a.ca.

att

cca

•tca

gac

2688

Sér

Ser

Sér

Ser

Asp;

Xeu

Léu

Lys

Thr

Sér

Pro.

Thr

Ile

Pro

Ser

Ásp

885

830'

835

ačg

ttg

tca

gcg

gag

act

gaá

agg.

aca

cat

'teč.

ťtá.

ggc

čcc

Cca·

čác.

'2736

Thr

Léu

Sér

Ala

Glu.

Thr.

Glu

Arg_:

Thr

His

Sér

Leu

Gly

Pro

Pró.

His

•900

9Q5

910

ccg

cag

w

aat-

ttč

agg·.

agt

caa>

ttá

ggt

ggc

att

gta.

Ctt

ggc

áaá

2784

Pro

Gin.

Val

ÁSn

Phe

Arg

Sér

Gin;

Leu

ciý

Ala,.

ile

Vál,

Leu

GÍy

Lýs

915

920:

325

_;aat

tca,

tc.t

cac

ttt

att

ggg

gct

ggt

gtc

cct

ttg

ggc:

tcg

•act·

gag

2832

Ásn

Ser

His·

Phe

Ile

Gly

Ala·

Gly

Val

;p'ro·

Leu

'Gly

Šer

Thr

♦.Glu

93.0

9'35

940

gag

gat

cat·

gaa

;ágc

tcc

ctg.

gga

ga.a:

aat

gta.

tca

cca

gtg

gag

agt

2880

Glu

-Ašp

Hi®

Glu.

Sér

.Leu

Gly

Glu.

Asn

Val.

Sér.

Pro

Vál

Glu

Ser

945

95.0

355

960,

gac

ggg

a ta

ttt

gaá

aag

.gaá

aga

gct

cat

ggá.

cct

gct

tca

ctg

ec.č

292,8

'Ásp

Gly’

Ile

Phe

Glu

Lýs

Glu

Arg

Ala

His

Gly.

Pró

Ala

Sér

Léu

Thr

965

97,0

975

aaa

gac

gat

gtt

tta

ttt

aaa:

gtt

áat

atc

tet-

ttg

gta

aág

aca

aac

2976

Lys.

Asp

Val

.Leu

Phe

Lys-

Val

Ásn

Ile

'Sér

Leu

Val

Lys

Ťhr·

Asn

980

985.

930

áág.·

gca

ega;

gtt

tac

tta

aaa

act

aat

aga

aag.

att

cac

att·

gat

gac

3024

•Lýs.

Ala

Arg

Val

Týt

Leu

Lys,

•Thr

Ásn:-

Arg

Lys;

Ile

His

Ile.

Ásp

Asp

995,

]

LO’OÓ

1

.005

gcá

gct

ttá

act

gág

aat

.agg

gča

tet

gcá

ácg

ttt

atg

gac

:aaa

3072

Álá

Ala

Leu.

_;Léu

Thť

Glu

Asrij

Arg

Ala

Ser

Ala

•Thr

Phé

.Met;

Ásp

Lys

'1

010.

]

.015

1

;02'0

áat

act:

aca

gct

tcg:

ggá

tta.

'ááť

cat,

gig

ťcá

aat

tgg

áta

áaá

ggg.

312.0.

Asn

Thr

Ale

Sér

Gly

Leů··

Asn

His

Vál

Ser'¹'

Asn

Trp

Ile

Lýš

Giy-

1025

1

.030

]

.035

1

L040

CCC

.Ctt

ggc

aag

aac

Ccc

čta

agc

tcg

gag

ega

ggc

CCC

agt

ccá

gag

3168

P.řo

Leu

ciy

Lys

Asn;

i Pró

Léu.

Ser

Sér

Clu

Arg

Gly

£r.e>

'Sér

Pro

Glu

1045 1050 1055

-71 CZ 298250 B6

ctt

ctg, a ca

tet

tca

ggá teá

gga. aaa

tet.

gťg

ááá

ggt cag

agt tet

3216

Leu

LěU, Thr

Ser_:

Sér

Gly Ser

GÍy Lys

Sér

Vál

Lys

Gly Gin

Sér Ser

1

1.060

1.0.65

1070

ggg

cag ggg

aga

ata

cgg gtg

gca gtg

,gaa

gág

gaa

gaa ctg

age áaa

3264

,ř> 1 1

Glý

Gin Gly

Arg

Ile

Arg Val

Ala: Val

Glu,

Glu

Glu Leu

Ser Lys

1075

1080

1085

ggc’

áaa gag

atg

fctť ďéc

áac* ,ágč

gag

cťc

acc

ttť ctč

áčt aac

3312

Gly

Lys Glu

Met^;

Met

Leu Pro

Asn Šer

Glu:

Leu

Thr

Phe Leu

Thr Asn

1090

ÍÓ95

LI 00

ťcg

gc,t gat

:gtc:

caa

gga aac

gat ,aca

cac

agt

caa

gga aaa

aag tet

33.6.0

Ser¹

Ala Asp

Val

Gin

Gly Asn

Asp· Thr

His

Šer

Gin

Gly'Lys

Lys Ser

1105

li 10

1115

1120

cgg

gaá gág

atg·

gaá

agg aga

gaa. a a a

'tta

gtc

čáa

gaa áaa

gtc gác

3408

Arg

GIU Glu

Met

Glu

Arg Arg

Glu iLys

Leu

Vál

Gin

Glu Lys

Val Asp

1.130

1135

tw

cct; ca;g

•gtg

tat

acá gcg

act; -ggá

act

aag

áát

ttc -ctg

aga,- aac

'34 56

Leu

Pro' Gin

Val·

Tyr

•Thr· Ala

Thr' Gly

Thr

Vyš

Asn

Phe Leu

Arg Asn

1140

114 5

1150:

att

ťtt cac

caa

age

act. gag

ccc: agt

gta

gaa

ggg

ttt ;gat

ggg ggg

3504

ile

Phe His

Gin

Šer

Thr Glu

Pro? Ser

Val

Glu

Gly

Phe Asp

Gly Gly

115'5

1160'

1165

tca

cat gcg

ccg

g.t.g

cct caa

gac age

agg

tca

tta

aať gat

tcg gca

'3.552

Sér

His Alá

Pro,

vál

Pro ,Gln

Asp- Ser

Arg

Sér

Léu

Asn Ašp

Ser Ala

1

.170;

1175

1180

gag

aga gca

gag

act·

cac· -at;á

gčč_: cat

ttc

tca

gca

att agg

gaá gag

3600

Glu

Arg Ala

Glu

'Thr

His Ile

Ala His.

Phe

Sér

Ala

Ilé Arg

Glu Glu

1185

ligo:

1195

1200.

gca.

ccc ttg

gaa

g^cc

ccg'· gga

aát ega·

áca

ggt-

cča

ggt ccg

agg agt

364,8

Ala

Pro Leu

GlU·.

Ala

Pro Gly

Asn Arg'

Thr

Glý

Pro

Gly Pro

Arg Sér

Ί

^205

]

.210

' 1

.215

ggg

gtt ccc

ege·

ege

gtt aag

cag age

ttg

aaa

.cag

atc aga

ctc ccg

3696

Ala

Val Pro

Arg

Val Lys

Gin Sér

Leu

Lys

Gin

íle Arg

Leu Pro

1220

1'225

1230.

:cta

gaa gaa

ata

aag

ccť gaa

agg ggg

gtg

gtt

ctg

aat gcc

acc. tca

374 4

Leu

Glu ;Gl.u·

IIe„.

Lys

Pro^: Glu

Arg Gly

Val

Vál

Leu

Asn. Ala

Thr Ser

123.5'

1240

1245

acc'

cgg tgg

tet

gaá'

age agt.

cct átč

tta,..

caa

;gga

géc-aaa

aga . a;at- -

• 3792-

...

Thr,

Arg· Trp

Ser

Glu

Ser Sér

Pro Ile

,Léu

Glh

Glý

Ala Lys

Arg Asn

1

,250

.1255’

1

-260

i

aac

ctt tet

tta

čet

ttc. ctg

áéc ttq

gáá

átg

gcč

gga ggt

Čáa gga

3840

Ί

Asn'

Leu Sér·

Leu

Pro,

Phe Leu·

Thr Leú

:Glu

Meť

Ala

Glý Gly

Glh Gly

1265

1

-.270

1

:27·5

1280

-72CZ 298250 B6

aag Lys	átc, n.e.	ágc gcc ctg Ser Ala Leu 1285	ggg ááa á.gt	gcc gca< ggc ccg ctg gcg	tec ggg Ser Gly 1-295	3888
Gly Lýš	Ser	Ala Ala Gly Pro 1290	Leu Ala
aag	ctg	gag aag gct	gtt· ctč	tčt	tca gca. ggc	ttg	tet	gaa	gca. tet	3936
Lys	Leu	Glu Lys Ala	Val Leu	Ser	Ser Ala Gly	Leu	Sér Glu	Ala Ser
		1300		1305		1310
ggc	aaa.	gct gág. ttt	Ctt; gct	aaa	gtt čgá gtt	cat	cgg	gaa	gác· ctg,	.3984
Gly	Lys	AÍá Glu Phe	Leu Pro	Lys Val Arg Vál.	His	Arg- Glu Asp'· Leu
	'1315·		1320		1325
't-t.g	cct	caa aaa acc	age aat	gtt	tet. tgc gca	cac	ggg	gat	čte ggc	4 032
LéU:	Pro,	Gin Lys, Thr	Ser Asn	Val	Ser Cys Ala	Ais	Gly Asp Leu·. Gly
1330		1335		1340
cag	gag	atč ttc ctg	cag'aaa	áca.	cgg gga cct	gtt	aac ctg	aac aaa:	4 08Ό
Gin	Glu	Tle Phe Leu	Gin. Lys	Thr	Arg; Gly. Pro Vál	Ašn,.	Leu	Asn Lys.
1345	1350		13.55				1360
gta-	aat	ága; cct gga	agg act	ccc	tcc- áág ct.t	čťg'	ggt	ccc	ccg atg	412'8
Val	Asn	Arg: Prd Gly	Ar„g Thr	Přo	Ser Lys: Leu	Leu	Gly Pro	Pro Met
		1365			1.370			1375
ccc	aaa	gag ,tgg gaa	teč čta	gag	aag^:ťcá ččá	áaiá	agč	•ácá·	gct ctc	4176
Pro;	Lys	Glu Trp Glu	Ser Leu	Glu	Lys Ser Ptó	Lys·	Šer	Thí	Ala Leu:
		1380		138'5.		1390
°gg.	acg	aaa gac atc	atc .agt	t.ta	ccc, ctg gac	cgt	cac	gaa-	age aat	4224
Arg_:	Thr	Lys. Asp Ile	Ile Ser·	'Leu	^:Pro, Leu- Ásp	Arg „His	Gluř	Šer Asn
	13.95	1400		' 1.4 05.
cát	tca	atá,. gčá gta.	aaa aat.	:gaá	ggá caa gcc	.gag.	acc	caa	aga gaa	4Z.72
His	Ser	Ile Alá Ala-	Lyš Asn	Glú	Gly Gin, Ala	Glu,	Thr	Gin	Arg Glu
ϊ	.410		1.415		Τ42Ό				— - -!-
gcc	gcc	tgg acg aag'	cag gga	ggg	čet gga ágg	ctg·	tgc	gct	cca aag	4320
Ala	Alá Trp Thr Lys	G-ln Gly Gly	Pro Gly. Arg	Leu Cy’s, .Ala	Pro; Lys
14.25	14-30		14 35.				1440
cct	ccg	gtc čťg: ega	cgg cat	cag	ágg gac atá	agč	•ctt	ččt	act ttt	4368
Pro	Pro	Val Leu Arg	Árg. His	Gin-	Arg Asp^; Ile	Ser	Leu-	pro	Thr. Phe
		1445			1450			- i 45 5'
čág	ččg	gag gaa. gac	aaa- atg	gac·	tat gat gat	atc	ttc	tca	act. gaa·	4416
Gin	Pro-	.G1Ú Glu Asp	Lys Met Asp Tyr Asp: Asp	Ile	Phe	Šer	Thr Glu
		1460.		1.4 65		147.0
ačg'aag .gga gaa gat	ttt gac	átť	tac ggt gag gat	gaa	aat	cag gac.	4464
Thr Lys Gly Glu Asp	Phe Asp	Ile	Tyr. Gly Glu Asp	G1U.	Asn	Gin Asp
	1475	1480		1485
cct	čgč	agč ťťt cag	áág, ágá	acc. ega. cac tát	ttc	.aťt-	gct	gcg gtg,	451'2·
Pro· Arg	Sér Phe Gin Lys· Arg	Thr	Arg· His Tyf' Phe	Ile·	Alá	Ala. Val

1490 1495 1500

-73CZ 298250 B6

gag cag Glu Gin 1505

ctc tgg gat tac ggg

atg age

gaa tcc ccc cgg gcg cta aga Glu Ser Pro Arg Ala- Leu Arg

4560

Léu Trp

Asp Tyr Gly 1510

Met

Šer

1515

1520

aac agg

gcť. cag

aac

gga gag

.gtg

cct

Cgg ttc

aag

aag gtg

gtc

ťtc.

4 608

Ašn Arg

Ala

Gin

Asn

Glý Glu

Vál

Pró

Arg. .Phe

Lýš

Lýs Val

Val

Phe

1525

1530-

1535

cgg gaa-

ttt .get

gac

ggc tcc

ttc

ácg

cag ccg

tcg·

tač ege

ggg. gaa

4656

Arg Glu

Phe

Ala'·

Ásp Gly Ser

Phe

Thr

Gin. Pró

Ser

Tyr. Arg Gly

Glu

1540

1545

1550

ctc áac

aaa

cac

ttg

ggg ctc

ttg gga

ccc tac

atc

aga -gcg

gaa

gtt

4704

Lě'u Asii

Lys

His

Leu

Gly Leu

Líeu. Gly Pro Tyr

Ilě

Arg. Ála

Glu

Val

1555

L560

Í565,

gaa gác

ŠáČ

atc

•atg

gt-a-vact

ttc

aaa.

aac cag gcg

.tet. _:cgt

ccc

tat

4752

Glu Asp

Asii

Ile-

Met

Val -Thr

Phe

Lys ,Ásn Gin. Ala

Šer Arg

Pro Tyr

1570.

1575

_;158O

tcc ttc,. tág

tcg

ágc

ctt att

tet

tát

čcg gat

gát

čág gag

qaa

ggg

4800

Ger Phe Tyr

Ser'

Ser

Léu. 'Ile.

Ser

Tyr.

Pro Asp Asp

Glh- Glu

Gin. Gly

1-5 8 5

15'90

1595

.1600

•gc.a gaa

ccť.

c_:ga

cac

aac ttc. .gtc

cag

cca aat

,gáa

acc aga

act

tac

484 8

Ala Glu

Pro Arg

His

Asn. Phe'.

Val

Gin-

Pro Asn

;G1U

Thr Arg;

Thr

Tyr

1605’.

1'610

1615

ťtť ‘tgg

aáa

gtg

cag

cat .cac aťg

gca.

ccc aca

gaa

gác gag

ttt

gac

48‘96

Phe. Trp

Lys:¹

Vál

Gin'

His His

Meť

.Ala.

Pro Thr

Glu.

Asp Glu

Phe

Ásp

16-20

1’625

1630

tgc aaá

gcé

tgg

gčč.

tac ttt

tet.

gat

gťt gac

ctg

gaa, aaa

gat gtg

4944

Cys Lys

Ala.

Trp Ala,

Tyč Phe

Ser

Ásp

Val,. Asp

Leu

Glu Lys Ásp Val

1635

.1.640.

1645

cac^;tca

ggc

ttg atc

ggc čeč

ctt

ctg

atc tgc

čgó

gčé aac

acc

ctg

4 9.92

His 'Ser

Gly

Leu.

Ilě

Gly Pro

Leu

Ile.Cýš

Arg

Al á Ásn

Thr

Leu

1'650·

1655

1'660

aa.c get

get

ca.c.ggt

aga caa

gtg·

acc

gtg caa

gaa

ttt get

čtg

ttt

:5040

Asn Ala Ala

His· Gly

Ar.g. 'Glrt

Val.

Thr

Val Gin.

Glu

Phe Ala

Leu

Phe

1.665

.1670

1675

.1680

ttc act

-att

ttt

gat

gag aca

aag

age

tgg tac.

ttc

act gaa

aat gtg

5088

Phe Thr

Ile

Phe Ásp

Glu Thr

Lys

Ser

Trp Tyr

Phe

Thr Glú

Asn

Val

1685

1690

1695

gaa ágg

aac

tgc cgg

gcc. ccc

tgc cac

ctg cag

atg

gag gac

ccc

act.

5136..

‘Glu Arg

Ašn

čys

Arg

Ala Pro

Cys

His

Leu Gin

Met

Glu Asp

Pro

Thr

1700

1705

1710

étg aaa

gaa'

áač

tát

čgč ttc

cat

gča

atc aať

ggc

tat gtg

atg

gat

5184

Leu. Lyš

Glu ,Asn

Tyr

Arg Phe

His

Ala

Ile Asn Gly Tyr Vál Met

Asp

1715 1720 1725

-74CZ 298250 B6

aca ctc	ccť ggc	ťta gta aťg gct	cag aat caa	agg	atc	ega tgg tat.	5232
Thr Leu	Pro. Gly	Leu 'Val Mfet-	Ala	Gin. Asn Gin Arg	Ile	Arg¹ Trp Tyr
1730		17-35		1740
ctg ctc	agc: atg	ggc agc aat	gaa·	aat a.tc cat	tcg	att	cat_: ttt agc	5280
Leu Leu	Ser Met	Gly Ser Asn	Glu	Asn Ile His	Šer	Ile	His Phe Ser
1745		'.1750'		1755			í 7 60
gga cač	gťg- ťtc	agt gta čgg	aaa·	aag gag· gág	tát	aaa	átg gcc gtg	5328
Gly His	Val Phe;	Ser: Val Arg	Lýs	Lys Glu. Glú	Tyr	Lys	Met Ala Vál
	17 65		17.70;			1775?
tac aat	CtC tát	ccg cgt gtc	ťtt	gág ačá. gťg	gaá	átg	cta ccg tče	53-76
Tyr Asn	Lé.u .Tyr	Pro Gly Val	Phe_:	Glu Thr Val	Glu. Met	Leu Pro. Ser

17-80 ' 1785 ' 1790

aaa gtt gga	att	t.gg ega	ata	gaá tgč	ctg: att	ggc gag	cac	ctg	caá	5424
Lys Val Gly	Ile:	Trp Arg	ile	Glu Cys	Leu Ile	Gly Glu	His	Leu	Gin
1795		180.0		1805
gct gg.g- -atg	agc	acg act	tto	ctg gťg	tac -agc	aag gag	tgt	cag	gct	5472',
Ala Gly .Met	Ser	Thr thr	Phe	Leu. Val	Tyr Ser;	Lys Glu	Cys Gin	Ala
181.0		1815.		1.820
cca čtg gga	atg	gct tet	g$a	ege att	aga gat.	ttt cag	.atc	áca	gct	5520
Pro Leu Glý	Met	Ala Sér Gly Arg Ile	Arg· 'Asp	Phe Gin.	Ile	Thr·	Ala
1.82'5		18'30			1.835			184,0
tea- gga cag.	tat	gga cag	tgg	gcc-cca	aag ctg.	gcc aga	ctt	cat	tat:	5568
Šer- Gly Gin	Tyr	Gly Gin	Trp	AÍá· Pro	Lys -Leu	Ala Arg	Leu	His	Tyt
		18 4,5		1650		1.85'5
tcc gga .tca	atc	aat gcc	tgg·.	agc acc	aag gat-	ccc các	tcc	tgg-	atc.	5616
Ser Gly Ser.	Ile	Asn Ala	Trp	Ser Thr	Lys Asp	Pro His	Ser. Tr.p	Iie.
1.8,.60			18 65	1870
aág' gťg čat	ctg	ťtg. gca	cca	atg ,etc	att cac	ggc atc aťg	acc	cag	5664
Lys Val Asd	iLeu	Leu Ala	Pro	Met ile	Ile His_:	Gly íle	Met	Thr Gin
1875.			1.8:80		1885
ggt :g.cc cgt	cag	aág ťtt	tcc'	agc ctc	tac atc-	t.ČC cag	ttt'.	átč	átč	5712
Gl-.y Ala Arg. .Gin	Lys’- Phe	Sér'	Ser Leu	Tyr Ile	-Ser Gin	Phe·	Hě	Ile·
1.8 90'		1	1895		.1900,
atg tac agt	ctt	gac ggg	agg.	aat tgg cag. agt	tác ega	ggg	áa.t	tče	5760
Met Týt Sér	Leu	Asp Gly. Arg Asn Trp	Gin S.er	Tyr Arg Gly Asn	Ser
1905		1-9.10			19.15			1920
acg ggc. acc	-tťa· Ϊ	atg - “'gtc	tte-	tt-ť ggo	aat gťg	gáč gca	tet.-·	ggg'	' att	5808
Thr Gly. Thr'	Leu	Met 'Val	Phe	Phe Gly Asn Val	Asp .Ala	Ser Gly Ile
	1925		1930·		1935
aaa cac. aat-	'att·	ttt aac'	cct	ccg att	gtg gct	cgg tác	atc	cgt	^tt(3	5856
Lys His· Asn	Ilě	Phe Asn	Pro	'Pro; χχθ	Val- Ala	Arg'. -Tyr -Ile· Arg	Leu

1940 1945 1950

-75CZ 298250 B6

cac čďá aca čát His Pro Thr His	tac Tyr	ágč Sér	at'c- ege ágč Ile. Arg Ser 1960	act ctt ege atg gag ttg Thr Léu Arg Met GÍu Leu 1965	atg Me.t	59Ó.4
	1955
ggc	tgť	gat	'ttá	aac	agt	tgď age atg	ccc ctg gga	atg- cag aat.	aaa	5952
Gly Cys	Asp	Leu	Asn	Sér	‘Cys .Ser Mét	Pro Leu Gly	Met Gin	Asn	Lys
1970'				1.975	1580
gcg·	a ta	tca	gac	tca	cag	atc acg gcc	tcc tcc cac	cta age.	aat	ata	6000
Ala	Ile	Šer	Asp S.er Gin	Ile Ťhr. Ala	Šer Ser His	Leu Ser Asn	Tle
1.98*				1990		1995		,2000
ttt	gčd	ačc	tgg	ťct	cct	teá čaá. gcc	ega Ctt cac	ctc cag	ggg	cgg	6048
PHé	Ala·	Thr	T_;rp	Sér	Pro	Sér Gin. Ala	Arg Leu His	LéU Gin Gly Arg
				2.0.05		2010	20.15
atg	aať	gcc	tgg	ega	céč	cgg gtg ágč	ágc gčá .gag	gag tgg	Ctg	čág	€096
Thr	Ash.	Alá	Trp Arg	Prd.	Arg Val Ser	Ser Ala, Glu	Glu Trp	Leu	Gin
		2020			2025		2030
gtg	gac-	ctg	čag	aag	acg.	gtg aag gtc	aca ggc átč	ácc acc	cág	ggc	6Ϊ44:
Val	Asp Leu	Gin	Lys	Thr	'Val Lys' Val	Thr Gly Ile	Ťhr- Thr	Gin	Gly
		>035				2G-40	2045
gtg	a a g	tcc	cťg_;	ctc	age	age atg tat	gtg aag gag	ttc ctc	gtg.	tcc	6192
Val	Lys	Šer	Leu	Leu	Šer	Ser Met. Tyr	Val Lys: Glu	Phe Leu	Vál	Šer
2 0'5 a				'2055	2060
agt	agt	čág	.gac..	ggc	ege	ege tgg acc	ctg ttt ctt	cag gac	ggc	čac	.6240
-Ser	Ser	Gin	Asp	Gly	Arg Arg .Trp, Thr.	Léu Phe. Leu	Gin Asp Gly;	His
2065			2370.		2075		2080
'.acg	áag	r-t.	ttt·	cag	ggc	aat cag gác	tče teč acc	ccc' gtg.	gtg	aac	6288
Thr	Lys	Val.	Phe·	^:Glri GiyAšn Gin Asp	Sér Ser -Thr	Pro Val:	Vál	Asn
			2Ό85		2090	2095
------	—	--—-	—	*---	-------
get	ct.g	gac	ccc: .ccg	etg	ttc acg ege	tac ctg agg.	átc cac	ccc	acg	6336
Ala,	Leu	Asp	Prd Pro	Leu.	Phe Ťhr Arg	Tyr Leu; Arg	Ile His	Pro	Thr.
		21’00			2105		2110
ago,	^gg	gcg.	cag	..cac	a.tc	gcč ctg agg	ctc gag _:gt_:t	cta gga	tgt	gag_:	6384
Ser	Trp	Alá	Gi n -	His	Ile	Ala Leu Arg	Leu Glu Val	Léu,Gly Cys	Glu
	2115.				2120	2125
gca	čág	gat	čte	tac	t.gá						:6402
Ala	Gin Asp.	Leu	Týř

2130 <210> 30 <21.1> 2133 <212> PRT <21-3> Prase <4 00 30

-76CZ 29825(1 B6

Met

Gin

Leu

Glu

Leu·

Sér

Ťhr Cys'

Vál Phe

Leu

Cys

Leu

Pro

Leu

1

5

10

15

Glý

Phe

Ser

Ala

Ile

Arg

Arg Tyr

Tyr Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Šer

20

25

30

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu Leu

Leu Árg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pró Glý

Ala Leu

Pro

Léu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

Leu-

Tyr

Lýs

Thr.'

Val

Phe. Vál

Glu. Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

.80

Val

Ala

Afg

Pro

Arg

Pro

Pro Trp

Met Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

Tle

85

90

95:

Gin

Ala

Glu

Val

Tyt

Ásp

Ťhr Val

Vál· Val

Thr

‘Leu'

Lys

Asn

’_;Met·

Ala

100

105

110

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

.His- Ala

Val Gly

Val

Ser

phe

Trp

Lýs

Sér

115

12'0

125

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu Asp

His Ťhr

Ser

Gin

Arg

Glu.

Lys

Glu

130

135

14.0

Asp

Lýs·

Val

Léu

Pro

Glý Lýs

Ser Gin

Thr

Týr

Val

Trp“

Gin

Vál'

145

150

155

160-

Leii

Lys

Glu

Ash

Gly

Pro;

Ťhř Ala

Ser Ásp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

'165

170

175

Šer

Tyr_

.LéU

Šer

His_

Val.

.Asp_Le.u_

_Val_Lys_Ásp_Leu_

.Ásn.

.Ser

.Gly.

.•Lěu^;.

1SÓ

185.

190

Ile

Gly

Ala

Leu

Leu.

Val

Čys. Arg

Glu .Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

Thr

Gin

Ásri

Leu.

His.

Glu

Phe Vál

Leú Leu

Phe,

Ala

Vál

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly

Lýs

Sér

Trp

His

Sér

Ala Arg

Asii Asp

Set

Trp

Thr

Árg

Ala

Met

225

230

235

240

Asp

Prd

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala Gin

Přó Ala

Met

His

Ťhr

Val

Ásn.

Gly

245

250

255

Tyr

Val

Ašh

Arg

Ser

Leu

Pró Glý

Leu Ile

Gly

Cys.

His

Lys

Sér

'2.6.0'

265

270.

Vál

Tyr

Trp

His

Val

Ile

Gly Met

Gly Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Sér

275

280

285_;

Ile

Phě

Leu

Glu'

Gly

His

Thr Phe

Leu Val

Árg

His

Árg

Glri

Ala

290

295

300

-77CZ 298250 B6

Ser

Leu Glu tle

Sér

Pro

Leu

Ťhr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr Phe

Leu

305

310

315

320

Met

Asp Leu Gly

Gin

Phe

Leu.

Leu

Phe.

Cys

His

Ilé

Sér

Šer His

3 His 3

325

33.0.

335

His,

Gly Glý Meť

Glu

Ala

His

Val

Ařg

Vál.

Glu

Sér

Cýs

Ala Glu

i Glu. ;

340.

345

350’

Pro

Gin Leu Arg

Arg

Lýs

Alá·

Asp

Glu.

GÍ'ii’

Glu

Ašp^;

Týř

Asp. Asp

Asn

355.

360.

365

Leu

Týr

Asp'

Šer

Asp'

íieť

Asp:

Val

Arg

Leu

Asp:Gly· Asp

Asp

Vál

í

370'

375

380

Ser

Pro

:Phe··

Ile

Gin

Ile

Arg·

Šer.

Val

Ala·

Lys

Lys His Pro

Lys

Ťhr

385

3'90

395

400

Trp

Val

His_;

'Tyr

Ile

Ser

Ala

Glu

Asp

Trp. Ásp Týr

Ala

Pro-

405

41Q

415

Alá

Val

Pro

Sér 420

2·χο

Šer

Asp

Arg

Sér 425

Tyr

Lys.

Ser Leu Týr 430

Leu

Asn

Sér

Gly

Přó

GÍn

.Arg'

Ile

Glý

Arg

Lýs

Týř’

Lýs

Lys Ala Arg

Phe

Val

435

4 40

445 ...... .

Áia

Týr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

thr

Arg

Lys

Ala Ile Pro

Tyr

Glu

.450:

455

•45Ό·'

Ser

.Gly.

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val Gly Asp

Thr

Leu

4-65

470

4'75

480

Leu

He

Ilé

Phe.

Lýs

Asn

Lys.

Ala

Šer

Arq

Pro

Tyr.Asn 11e_

íýr

Pro

485

490

495

His:

Giy

Ile

Thr

Asp

Vál

S.er

Alá.

Leu

His

Pro':

Gly Arg: Leu

Léu^:

Lys

500'

505.

510

Gly

Trp

lýs

His

Leu

Lýs·

'Asp¹

Méť

Pro,

ne

Leu''

Pro Glý Glu

Thr

Phé

515

520

525

Lys-

Tyr

Lys:

trp;

Thr.

Val.

Thr

Val

Glu.

Ásp

Gly

Pro Thr Lys

Šer

Ásp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr.

Tyr

Sér:

Šer

Ser

Ile Ásn Leu

Glu

Lys

545

550 _

. -

- -

555,

—

.550^

-

Ásp

Leu

Ala

Šer

Gly

Leu.

Ile

Gly

:Pro:

Leu

Ile Cys Tyr.

Lys

Glu

565

570

575

;

Šeř

Vál

Asp^:-

Gin

Ařg.·

Gly

Asn.

Gin

Met-

,Me.t

Šeř

Asp Lýs'Ařg 590’

Asn

Vál

5.8’0

585.

i

Ile

Léu

:Phe:

Šeř

Vál

Phe

Asp.

Glu

Ásn.

Gin

Sér

Trp tyr Leu·

Ala

Glu

1

595’

6.00

605

-78CZ 298250 B6

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Vál

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr-

Trp

645

650

655

Tyr

jle

'Leů

Ser

Vál

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

660

665.

670

Sér

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lýs

His

Lys

Met.

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu.

Thr

675

68Q

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu.

Ťhr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Val

Léu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Ásp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

'Ala

Leu

Lys

Val,

Tyr

Ser

cys

Ásp

Arg

Ásp

.Ile

Gly

Ásp

725

730

735

Týr

Asp.

Asn

Thr

Tyr

Glu

AŠp

Ile

Pro

Gly

Phé

Leu

Léu

Seř

Gly

740

745.

750

Lys

Asn..

Val

I.le

Glu

Pro

Arg

Ser

Ph$

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg.

Pro

755

760

765

Ser

Ala

Ser

Gin

^:Lýs

Gin

^fPhe

Gin

Ťhr

ile

Ťhr

Sér

Prd

Glu

Asp

Ásp

77(j

775

780

Val

Glu_

Leu Asp_Pro_Gln_

Ser

,.Gly_

Gl.u Arg^Ťhr..

-GUL

-Ala-

-Leu-

;Giu-

-Glu,

785

790

795

800

Leu

Ser

Val

Pro

Šer

Gly

Asp

Gly

Šer

Met

Leu

ciy

Gln

Ásn

Pro

8,05.

8-10

815

Ala

Prd

:His

Gly

S'ér

Sér

Šéř

Ser

Asp

Leů

Gin

Glu

Ala

Arg

Ašri

Glu

320

825

,8.3,0

Ala

Asp

Týr

Leu

Pro

Gly-

Ala

Arg

Glu

Arg

Gly

Thr.

Ala

Pro

Ser

835

840

845

Ala

Alá

Ala

Arg

Leu

Arg

Pro

Glu

Leu

His

Ser

Ala

Glu

Arg

Val

,850

85,5

860

Leu

Thr

Pro-

Glu

Pro

Glu

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Asp.

Seř

Lys

Met

,865

870

875

880

Sér

Ser

Šer’

Šeř

Asp:

Leu

Lys

Thr

Ser

Pro

Thr

Ile;

Pro

Ser

Asp

885

890

895

Thr

Leu

Šer

Ala

Glu

Thr.

Gl.u

Arg.

Thr

His

Šer

Leu

Gly

Pro

His

900

905

910

-79CZ 298250 B6 i

Pro Gin	Val	Asn	Phe	Árg Ser	Gin Leu Gly	Ala	Ilé	Val Leu Gly Lys
	915				920			Š25^;
Asn Ser	Ser	His	Phe	Ile. Gly	Ala Gly Val	Pro	Leu	Gly Ser Thr Glu:
930				935			940
Glu Asp.	His	Glu	Ser	Šer Leu	Gly Glu Asn	Val.	Ser	Pro. Val Glu Ser·
9.45				950		955.		960;
Ásp Gly	Ile:	Phe	Glu	Lys Glú	Aig Ala His	Gly	Pro	Ala, Sěř Leu Thř
			965		970			975
Lýš; Asp	Asp	Val	Leu	Phe Lys	Vál Asn Ilé	Ser	Léu	Val. Lys Thr Ašh
		980			985			990
.Lýš Ala	Arg'	val	Tyr	Leu Lys	Thr Ásn- Árg	Lys·	Ile	His I-lé .Asp: Asp·
	•995				LOÓÓ		1005
Ala Ála	Leu	Leu	'Thr	Glu Ásn	Árg Ala Šer	Ala	Thr	Phe Met Ásp Lys;
101Ό				.1015		1020
Ásn Thr	Thr	Ala	Ser.	Gly Leu	Ásn, His Val	Ser	Ásn	Trp_;Ile Lys Gly
1025			1030	1035		T040
Pro Leu	Gly	Lýš	Asri	Pro Leů	Ser Ser Glu	Arg	Gly	Pro Ser Pro Glů.
		104 5'		1050			1055
Leu Leu	Thr	Set	Sér'	Gly Ser	Gly Lys Ser	Vál.	Lys	Gly Gin Sér Ser
	1Q.60			1065			1070
Gly. Gin	Gly.	Ářg	Ile	Arg Vál-	Ala Val Glú	Glu	Glu	Glu Leu Sér Lys
1075			1080		1085
Gly Lys	Glu.	Met	Met	Leu Pro	Asn_Ser_Glu_	Leu	Thr	-Phe-Lév-Thr-Ásn—
109,0				1095		1100
Ser Ala	Ásp	Val	Gin:	Gly Ásn:	Asp Thr His	Ser	Gin,	Gly Lys Lys Šer
1105.			1.110	1115		1120
Arg'Glu	Glu	Met	Glu	Arg Arg'	Glů Lys .Leu 1130	Val	Glh	Glu Lýš Val Asp.
		1125			1135
Leu Pro	Gin.	val	Tyr	Thř Ala	Thr Gly Thr	Lys	Asn	Phe Leu Arg Asn
	1	.140.			114S			1150
Ile Phe.	His	Gl-h	Ser·'	Thř Glu	Pro Šeř Vál	Glů	Gly	Phe Ásp Gly Gly
1155			' . b J	lIgq		1165
ser His^;	Ala	Pro	VaL	Pro Gin	Ásp šer Árg	šer	Leu	Ásn Asp, Sér Ala
1170				1175.		i	L18Ó
Glu Árg	Ala	Glu	Thr	His Ile	Ala His Phe	Šer	Ala	Ile Arg Glu Glu
1185			1	.190	1195		1200
Ala Pro	Leu	Glu,	Ala.	Pro GÍy	Asn Árg Thr	Gly	•Pra	Gly Pro Arg Šer
		1205		1210		1215

-80CZ 298250 B6

Ala Val	Pro Arg Arg. Vál Lys Gin	Ser Leu Lys Gin Ilé Arg	Leu	Pro
	1220			1225 :	1230-
Leu Glu.	Glu	Ile	Lys	Pro-	Glu Arg	Gly val' vál Leu Asn Ala	Thr	Ser
1235				1240	1245
Thr Arg Trp	Šeř	Glu.	Šer	Šer Pro	Ile ^;Leu Gin. Gly Ala Lys	Arg Asn
1250				1255.	1260
Ašh: Leu	Ser	Léú.	Pro'	Phe	Leů Thr	Leů Glu Met Ala Gly Gly	Glh .Gly·
,1265·			1270		1-275		1280
Lýs Ile	Ser	•Ala	Leu Glý	Lýs Ser	Ala Ala Gly ‘Pro· Léú	Ala	S.er	Gly
		1'285			:12-90	1295
Lys Leu	Glu Lýs	Ala-	Vál	Leů šer	Šer Ala. Gly Leu Ser	Glu·	Ala	’S‘er
	1.30'0			1305 :	L310^:
Gly· Lys	•Ala·	Glu	Ph'e‘	Leu	Pro. Lys	Vál Arg Val His Arg	Glu Asp	Leu-
L315·				13'20	1325
Leů Pro	Gin	Lys	Th-r	Sér	Asn Val-	Šer Cys, Ala His Gly Asp Leu	Gly
13.30				13,35.	1.340
Gin Glu	Ilé	Phe	Leu	Glh	Lýs Thr	Arg Gly Pro Val Asn	Leů	•Ašri	Lýs
1345·			1350	1355		136.0
Vál- Asn	Arg	Pro'	Gly	Arg	Thr Pro	Sér Lýs Leu Leů Gly	Ptó	Ptó	Met
			1365			.....1'3-70'	1375
Fro' Lys·	Glu-	Trp	Glu	Ser	Leů. Glu	Lys Set’ Pro Lys· Šer	Thr'·	Ala·	Leů

1.38Ó 138Š 139.0^r: Lys Asp ile ,.1'íe S'er 'Leu· Bro. Leu_Asp_Arg_ His_Gl.u_Se r._Á'sn_ ’ 139.5 14001405

His Sér Ile Ala Ala Lys Asn Glu. Gly Gin Ala Glu Thr Gin Arg Glu. 1410.: 1.4151420

Al”a Ala' Trp Thr. Lys Glh Gly Gly Pro G'lý.Á'rg_; Leu. Cys Ala Pro Lys 1425 1430- 14351440

Fro Pro Val Leu Arg Atg Hiš Gin .Arg Asp Ilé Ser Leu Pro Thr Phe 14/5 ” 14^:'5O' ¹Ϊ455

Gin Pro. Glu Glu Asp Lys Meť Asp' Týr Asp Asp' Ile Phe' Ser Thr.Glu

1460 ' “ ... 1465. . , 14.;7Q /. ·- - .

Thr Lys- Gly Glu Ášp Phe Asp' líé Týr. Gly Glu Asp.' Glu Asn GinAsp

147:5 ..........’ 1480 ' '1485.

Pro Arg Ser Phe Gln Lys. Arg Thr Arg Hiš Tyr Phe Ile Ala Ala Val 1490 14951500

Glu Gin Leu Trp Asp tyr¹ Gly Met Ser Glu Ser Pro Arg Ala Leu_:Arg

1505 1510 1515 1520

-81CZ 298250 B6

Asn Arg Alá Gin Asn Gly 1525

Glu Val Pro Arg Phe

1530'

Lys Lys Vál Vál 1535

Phe

Arg Glu Phe Ala Asp Gly

1540

Ser Phe Thr Gin Pro

1545

Ser Tyr Árg Gly

1550

Glu

Leu Gly

Ile Arg Ala Glu 1565

Val

Glu Ášp Asň Ile

15.70

Ala Ser Árg Pró

1580

His

Tyr

Leu lie

Gly

Ile Ser Tyr Pro Asp Asp' Gin Glu Gin

1595 1600

Phe

His

Phe

Asn Ala Ala

1665

Hísr

Phe Thr Ile

Val Gin pro Ašri Glú Thr. Arg Thr^: Tyr

1610 1615

Met Alá Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp 1625 1630

Gly. Pro Leu 1655;

Thr Leu f:

Thr

Ala

Sěr

Glu

Asn Val

1695

1710

Ala Ile

Met

Asp

Thr Leu Pro Gly .Leu Val Met Ala 1735

1730

Gin Asn

Gin Arg

1.74 0^:

Ilě Arg

Trp

Leu Leu

1745

Šer Met Giy Šer

1.750

Asn Glu

Asn Ile

Šer

Ile

His

Phe

Ser 1760

Gly Hiš

Arg

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met: Ala

1775

Val·

Val

Phe

Glu Thr 1785

Vál

Glu

Mét

Sér

Ile

Gin

Alá Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr .1810 1815

Ser

Lys Glu Cys Gin Ala 1Θ20

-82CZ Ζ9»Ζ5ϋ B6

Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg ile Arg Asp Phe Gin Ilé Thr AlaJ

182'5- 1830 1835 1840J

Šer Gly Gin· Tyr. Gly Gin Trp. Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu- His Tyr1

184 5 1'850 1855J

Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser. Thr Lys Asp Pro His Ser Trp Ile<

1860 1865 18701

Lyš Val Asp. Leu Léu Alá Přó 'Met Ile Hě Híš Gly Ilé Mét Thr Glh 1.875 19801885

Glý Ala Arg Glh Lyš phe Ser Ser Léu Tyr iíé Ser Gin Phé ;ile Ilé 1.890' 1895 ' '1900

Met Tyr. Ser Leu- Ašp Gly Arg Asn- Trp Gin Ser Tyr Arg Gly Asn Šer

1905 1910^: ' 1915 ' '1920 thr Gly Tht Leu Met Val Phe Phe Gly Ásn· Val Asp Ala Šer Gly Ile' Ϊ925 1930 .1935Lys His. Asn. ile Phe ,Asn Pro Pro íl'e Val Ala Arg Tyr Ile Árg· Leu

1940, 194'5 ’ 1950J

His Pro Thr -His:· Tyr Sér Ilé Arg. Ser Thr' Leů Arg Met Glu Leu'.Met

1955 1960 ' 1-965i

Glý Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Mét Pro· Leu Gly-Mét. Glh Asn Lys 1970 197-5 ''1980

Ála ile 'Ser Á'sp .Sér Gin: iie. Thr Ala Šer Ser His Leu' Šer Asn Ile

1985 1995 1995 '2000

Phe Ala thr trp' -Ser- Pro- Sér Gin Ala ÁrgjLeů-Hi.S-Leu-.Gln-‘GÍ .y~Á’rg-'2005 20102015

Thr Ásn Ala· trp Arg Pro' Árg. Val Ser Ser Ala Glu Glu Trp Leu Gin 2.020 2'0252030

Val. Asp Léu Gin. Lyš Thr· Val Lys Val Thr Gly Ilé Thr Thr Gin Gly 2035 20’402045

Val LýŠ Sér.· Leu Leů Ser 'Ser :Méť Týt Vál¹ Lys Glu Phe, Leů Val Ser 2050 20552060

Ser .S.ér	'.Gin, Asp Glý Arg Arg Trp Thr ..Leů	Phe	Leů	Gin Asp. Gly His
2065 .....		1070. ,. . .	.2075		.-2080,-
Thr >Lys	Val Phe Gin	Gly Asn. Gin Asp Ser	Ser	Thr	Pro Val Vál Ašh
	2085	2090			2095
Alá Léu	Asp Pro Pro	Léu ^:Éhé; Thr Árg Tyr.	íteur	Árg	Ile His Pro Thr
	2100	21’05' '			2110:
Šer trp	Ala Gin His	Ilé Áíá Leu Arg Leu	Glu- Val	Leu Gly Cys Glu
	>115	2120		2125

-83CZ 298250 B6

Ala Gin' Ašp Lfeu Tyr 2130 ' <210? 31, <211> .19 <212? PRT <213> Homo sapiens <400* 31

Met. Gin ,Jle Glú Leu: Ser Thr '.Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Árg Phe ' 5 1Ό 15

Cys Phé Šer^: <210* 32 <211* 24 <212* PRT <213? Umělá sekvence <220* <223? Popiš umělé sekvence: linker <4 00>: 32

Ser. Phe; Ala Gin Asn Sér Arg Pro Přo.Sěr Alá Sér· Ala Pró Lyš Pro.

5' 10 15

Pro Val Leu Árg Árg His Gin Árg _________.——--------<210* 33 <211? 105 <212? DNA-.

<213* Umělá' sekvence:

<220?

<223* Popis umělé sekvencet Tinkér <400? 33 gťcatťgaac cta.ggagctt tgccčagaat: tcaágácčcc ctágtgčgag cgctccaáag 60 cctccggtcc tgcgacggca tcagagggac atáagccttč ctáct 105 <210? 34 <211? 21 <212? DNA <2-13> Umělá sekvence

-84CZ ZV3Z50 B6 <2’205 <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotidový primer <4.005 34 gaggaaaacč agatgatgtc a •V

<210>- ·35 <2il> 60 <212> DNA <213>^:Umělá sekvence <2205 <22 3> Popis umělé sekvence: oligonukíeotíd.óvý primer <40,05 35.

ctttggagcg cťcgcačťag ggggtcttga attctgggca, aagctcctag gttcaatgac 60 <210> 36 <211> 66 <212> DNA <213> Umělá, sekvence <22 Ó5 <223> Popis umělé sekvence: .oligonukleotidový primer <40.05 36 cctagtgcga gcgctccaaa gcctccggtc ctgcgacggc atcagaggga cataagcctt 60 cct á c t ______________________________________ 6 fí<210> 37 <21'1> 4404 <212> DNA <2135 Prase <220>

<2215 ODS <222> (1) . , {4.401.)

- <4005 37 atg cag cta gag Met; din Leu Glu ,1..

ggč_: ttt agt gcc Gly Phe Ser· Ala

ctc	tcc	acc ťgt	gtt;	ttt	ctg tgt	ctc	ttg cca	Čt'C_;
Leu	Ser	Thr .Cys	Val	Phe	Leu Čys·	Leu	Leu Pro	Leu
.5'				10			15
atc		aga tac	tac	ctg	ggc gca	gtg	gaa ctg	tcc
Ile-	Arg	Arg. Tyr	tyr	Leu	Gly Ala	Val	Glu Leu	Ser

30

-85CZ 298250 B6

tgg

gac

tac

cgg

caa agt

gaa:

ctc

cgt

gag

ctg

cac

gtg.

gac

acc

14 4

Trp· Asp

Týr .Arg

Gin Ser

Glu

Leu

Leu Arg

Glu

Leu·

His

Vál

Ašp

Thr

35

4 0

45

áqa

ťtt

cct

get

aca gcg

cca

gga

get

čtt

ccg

ttg

ggc

ccg

tca

gtc

192

Arg

Phé

Pro.

Ala

Thr.· Ala

Pro· .Gly

Ala

Leu

Pro

Leu Gly

Pro

Sér

Val

50

55

6'0

ctg

ťač

áaa

aag

att gtg

tťč

gta

gag

ttc

a cg

gat

caa

ctt

ttc

age

24Ó

Leu

Tyr

Lys

Thr' val

Phé

Val.

Glu

Phé

Thr

Asp

Glri

Léu

Phe

Ser

65

70'

'75-

80

gt.t

gcc

agg

ccc

agg cca

Cca

tgg:

atg

ggt

čtg

c.ťg

ggt

cct

acc

atc

288

Val

Ala-

Arg

.Pro-

Arg 'Pro

Pro

Trp' Meť

Gly

:teu

Leu

Giy

Pro

Thr

ile

85

90

;95

cag

get

gag

gtt

tac gac

acg

gtg^:

g.fc

gťt-

acc

ctg

aág;

áác

'át g

get

336;

Gin'

Ala·:

Glú

Val

Tyr Ásp,

Thr

Val

Thr'

Leu

Lys<

Ašn

Met

Ala

10Ό

105;

110

tet

cat

ccc·

gtt

agt: ctt

čac

get

gtc'

ggc

gtc

tcc

ttc

tgg

aaa

tcť

384

.Ser

His

Pró

Vál

Ser Léu

His

Ala

Val·

Gly

Val

Ser.

Phe

Trp

Lys

•Šer

115

120

125

tcc

gaa

ggc¹

qct

gaa tat

gáq>

qáť.

čac

áčc

áq^!é

caa

agg

gag

aág

gaa

432

Ser:

Glu

Gly. Ala

Glú Týr

Glu' Asp

His

Thr

Ser

Gin.

Arg

Glú

Lys

Glu

130

155.

14 0

gac.

•gáť

aaa^

gtc

•Cťt; CCC

ggt.

áaa

ágc

caa

ácc

tac:

gtc

.tgg

cág

gtc·

480

Asp.

Asp

Lys;.

Vál

Leu. Pro

Gly Lys

Ser Glrí

Thť

Týr

Val

Trp

Gin

Val

14;5

15Q

155

160:

cťg

aaa

gaa.

aať

cjgť cca

aca

gcó:

ťct

gac

..cca

cca

tg.t

cťt

acc

tác

52 &

Leu

Lýš·

Gig

-Asn

Glý Pro

Thr

Ala·

Šer Asp

,Pro

Pró:

Cys

Leů.

'Thr.·

Týr

T65···

1 /0

175

rca

:táC.

čť_:g

Čet

các gtg

gác

ctg

gtg

áaa

gac

ctg

aa-t

tc.g

ggc

ctc

576

Šer

Tyr

Leu

šer

His Val

Asp

Leu

Val

Lýš

Asp

Léú

Ásn

Šer

Gly Leu

180

185

190

,a.t.t

gga. gcc

ctg.

ct.g gtt

^:tgt

aga.

gá'á

ggg

.agt,,

ctg,

acc.

aga

gaa:

agg

624

Ile

Gly .Ala

Leu

Leu Val.

Čys

Arg¹

Glu

Giy

Sér;

/Leu

Thr

Arg

Glú

Arg:

195

200

205-

,acč.

cag·

aac

ctg

cac gaa

ťťť

gta

cta

ctt

ttt

gtt

gtc:

ttt

gat

gáa

-672

Th-r.

Gín,

Asn

Leu

His Glu

Phe

'Val

Leu-

Leu

Ph'e.

Ala

Val

Phé

Asp

Glú

210

.215'

220

ggg

aaa

agt

t?gg

cac tca

gca

aga

aat·

gac

tcc

tgg

aca

cgg

gcc

^atg

720

Glý

.Lyš

Sér

Trp

'His; Ser

Ala

Arg

Asn Asp:

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

' 230

235

240

gat.

ccč

gca

čet

gcc agg

gcc

cag

cct

gca

atg

cac

aca

gtc

aat

ggc

768

Asp.

Pro

Ala

..Pró

Ala Arg Ala

Gin

Pro

Ala

Met

HIS':

Thr

Val Asn

Glý

245'

250;

255

-86CZ 298250 B6

tat

gtc

aac

agg

tct,

cťg

cca

• ggt

cťg.

atc·

gga

tgt

cat

aag

aaa

tca

816

Tyr

val

Ásn·

Arg

Ser

Leu

Pro.

Gly

Leu

Ile

Gly.

Cys

His

Lyš

Lys

Ser

260

.265

270

gtc

tac

tgg

cac

gtg.

att

gga

atg

ggc

acc:

agč

cčg

gaa

gtg

cac

tcc

864

Val·

T.yr

Trp

His

Val

Ile

Gly

Met

Gly

Thr

Séř

Pr.o

Glu

Val

His

Ser

27:5

2 8.0

285

att

ttt

ctt

gaa

ggc

cac

a cg

ttt-

ctc

gtg

^agg.

čac

cat

cgc

cag

gct

912.

Ilé

’Phě

Leu

Glu.

Glý-

His

Thr

Phe:

Leu

Val

Árg

His

Atg

GÍn

Ala

290

295

300

tcc

gag

cíťČ.

tcg

cča^r

cta

•acť.

tťc

ctc

:'act

gct

cag

aca

ttc

ctg

960

Ser¹

Leu

Glu

Ilé

S.er

Pro.

Léu

Ťhr

Phe

Leu

’Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310_:

3’1.5

320

atg

,gač·

ctt

.ggg

cag.

ttc,

ctá

gt'g

ttt

tgt

cat.·

,át.c

tct

tcc

cag

cac

1.0 Ó 8

Asp:

Leu

Gly

-Gin'

Phe

Leu

_TPhé

cýs

His

Ilé

Sér

His

325

330

335

cat

ggt

ggc

atg

gag.

gct

cac

gtc.

ága

gta

gaa.

agc

tgč

gcc

gag

1056’

His

Gly

Met

Glu

Ála

His

Val

Arg 345

'Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

Glu.

3'4'0

350

ccc

cag’

ctg

č.gg

agg

aaa

gct

gat

gea·'

gág

'gáa

.gat

fa-ť

.gat'

gac

áat

1104

Pro

Glri

Leu

Arg

Lys

Ala

Ásp

Glu-

Glu·

Glu

Asp

Tyr

Ásp

Asp

Ásn-

355

3’60

365

ttg

tác.

gac.

tcg

ga c:

aťg

gsc Asp·

gtg

gtc

cgg

ctc

gat

ggt

gac·

:gac

gtg

1’152

Leu'

Tyr

Ásp

Ser

^A'?P

Met

val

vál

Arg.

Leu

Asp

Gly

Asp

val

3'70

375

380

tct

ccc

ttt

atc

caa·.

atc

cgc·

t.čg

g,tť

gcc¹

.áág

áag>

,čat

ccc

aaa

a.cc

1200;

Ser

Pro:

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg·

Ser

val

Ala..

Lýs

Lys

His’

Pró

Lyš

Ťhr

tgg

gtg·.

cac

tac·

att

tct gca

gag

gég

gac

tgg

gac'

tac

CÍCC;

ččč

1248.

Trp

Vál

Hi?

Tyr:

Ile

Šer. Ala

Glu

Asp

Trp Asp.

Týr

Al^:a.

Pró

405

410

415

gc.g

gtc

ccc

agč:

čcč

agt gac

•a.gat

agt

tat

aaa

agt

ctc

^:tac

ttg..

aac

1296

Ala

Val

Pro

Ser

Prč

Ser Asp Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425.

43Ó'

agt

ggt

čet

cag

cgá

att ggt

agg

aaa

tác

aaa

gct

,cga

ttc.

gtc

134 4

.Ser

Gly'

Trp

Gin

Ar.g

Ile Gly Árg·

Lys-

Tyr

Lys,

Lys

Ala

Arg.

Phe

Val

4 35

4.4,0

445

-

gct

tac

acg

gát

'gta

aca ttt

aag

áci

čgt

aaa

gct.

att

ccg-

tát

gaa

1392

Ala

Tyr Ťhr

Asp

Val.

Thr Phe

Lys

Ťhr Arg'

Lyš Ala

Ile

Pr.o Tyr

Glu

450'

' 455

460

tca

gga

aťc

čtg

,gga^?

cct ,ttá·

ctt

tát.

gga·

gaa

gtt

gga

gac:

,aca

čit.

1440

Ser

Gly

Ile;

Leu

Gly

Pro Leu

Leu

Tyr Glý

Glu

Vál

Glý

Ásp.

Thr

Leu

4 65

47’0

4:75

4.80

-87CZ 298250 B6

ttg Leu

att Mé

aťa ,Xle

tťť Phe

aag aat Lyš Asn 4'85'

aaa Lys

gcg agč Ala Sér

ega cca tat

a ač Asn

atc tác cct- Ilé Tyr Pro 4 95

148.8

Arg 490

Přó: Tyr

cat

gga

a-tc

act

gat gtc

age

get

ttg.

cac

cca ggg:

aga

ctt

čta

aaa

1536

His

Gly

Ile

Ťhr

Ásp Val

šer

Ala

Leu

His

Pro. Gly Arg

Léu

Lys

500

5Ó5

510

ggt

tgg

aaa.

cat

ttg aaa

gač

atg

cca

att

ctg· cca

ggá

gag: áct

ttc.

1584

Gly

Trp

Lys-

His

Leu' Lys

Asp Met

Pro;

-Ile

Leu.· Pro.

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520:

525

aág

Aat

ááa.

tgg

ača gťg

ačt.

gtg.

gaa gat

ggg cca

acc

aag

tcc

gat

1632

Lys

Tyř

Lys

Trp

Thr Vál

Thr

Val

Glu.

Ásp

Gly pro

Thr

Lys' Ser'

Asp.

'530.

535

540

cčt

cgg

tgc

ctg

ácč čgč

tac:

tac

tcg

'age

tcc att.

aat

čta. gag

aaa

168.Q

Pro

Arg Čys

Leu

Thr Ar.g

Tyr Tyr.

Sér Sér

Ser Ile

Asn

Leu

Glú

Lys

545

550.

555

560

gat

ctg get

tcg.

gga cte

att

ggc

čet

cte

cte atč

tgc

tac:

aaa

gaa

172.8

Asp

Leu

Ala

Šer

Gly Leu:

Ile Gly

Pro

Léu

Léu Ilé

Cys

Tyr

Lyš

Glu

565

570

575

tet

gta. Vál

gac

ca a

aga gga

aac

cag· atg

atg

tea gac

aa^;g

aga

aac.

gt-c

1776'

Ser.

Ásp

Gin

Árg Gly Asn Gin

Met

Ser Asp Lys. Arg

Asn

Val

580

58.5

59.0

át.c

ctg·

tt-t

tet:

gta ttc

gat

gag

aat.

caá,

ágc tgg

tac

cťc

gca

gag

1824

Mé

Leu

Phe

Ser

Val Phe

Asp Glu Asn

Gin

Sér Trp

Tyr Leu

Ala

Glu.

5'95·

600

60,5.

aat

att

tag

čgč.

ttc 'ctě'

ccc

áat

cčg

gat

ggá'.' ťtá

cag

čec

cag

.gat

1872

Asn·

Ile

Gin

Arg

Phe Leu

.Pro

Asn.

Pro

Asp-

Gly Leú

Gin

Pro

Gin. Asp

—

610

—

_ -------

615

— ..

------

620

X.______

_____

______

_____

______

cca

gag

ťtC;

caa

g.ct. tet

áác

áťc: sťg

cac

age atc

aat

g-gc

tat

gtt

1920

Pro

Glu

Phe·

Gin

Ala Ser

Ásn

Ile

Met

His

Ser Ilé

Ásn· Gly Tyr Val.

625'

630

63’5.

640

ttt

gat

'age'·

ttg

cag ctg tcg

gtt

tgt.

ttg

cac gag

gtg

gca

tac

tgg

19.68

Phe; Asp

Sér

Leu

Gin Leu

Sér

Val

Cys

Leu

His Glu

Val

Ala

Tyr Trp

645;

6;50

655

tac

a t.t

čta·.

agt

gt.t ggá

gca

cag

áčg

gáč

ťtCř Atc

tcc

gtc

ttc

ttc:

2016

Tyr' Ile

Léu.

Sér

Val Gly Ala

Gin

Thr

Asp

Phé Leu’

Ser

Val

Phé

Phe.

660

.665;··

670

ťčt

ggč

tac

ačc

ťtc ááa

cac;

áa.á

atg gtc

tat :gáa;

' g.éc

acá

čte

acc;

2064

Ser Gly

Týr

Thr

Phe Lys

Hi’s'

Lys Met, Val

Tyr Glu Asp

Thr

Léu

Thr

675

680

685;

ctg

ttc·

ccc

ttc.

tca_; gga^;

gaa·

•acg:

gtc'

ttc

atg tča

_;aťg gaá

aáč

cca

'2112

Leu

Phe:

Fr.o

Phe

Šer Gly Glu·.

Ťhr.

val

.Phé·

Met Ser

Met

Glu

Ášň

Přo

690

695

700

-88CZ 298250 B6

ggt	ctc	tgg gtc	ctt. ggg	tgc cac aac	tca·	gac	ttg cgg aac	aga	ggg	2160
Gly	Leu	Trp Vál	Leu Gly Cys His Asn	Ser	Asp	Leu Arg Asn	Arg	Gly
705				710			715			720
atg	aca	gcc. tta	ctg	aag	gtg' tat ágť	tgt	gáč	á.gg gac att. ggt	gat	2208
Met	Thr	Ala Leu	Leu Lys Val Tyr Ser	Cýs Asp	Arg^r Asp Ue Gly Asp
			725			730			735
tat	tať	gáč aač	a;ct	tat	gaá gat att	cca:	ggc	ttc ttg cťg	ágť	ggá	2256
Tyr	Týt	Asp Asn	Thr Týt	Glu Asp. llé	Pró. Gly	Phe Leu Leu	Sér	Gly
		740						.750
aag	aa.ť.	gtc att	gaa.	cct	agg agc ttt	gcc	cag	aat tca aga	ccc	čet	23Ό4
Lys	Asn	Val Ile	Glu	;Pro	Arg Ser. Phe	Ala	Gin	Asn. Ser Arg	Pro.	Pro
		755			760'·			765
agt	gcg	agc gct'	éča	aag	cct ccg;-gtc ctg	•ega	cgg cat cag	agg gac	2352
Sér	Ala	S.e.r Ala.	Pró Lys	Pró .Pro Val	Leu Arg Arg His Gin	Arg Asp
	77,0				775			78.0
ata	agc	ctt- cct,	ačt	tťt	cag ccg gag	gaa	gác	ááa átg. gac	tát	gat	'2400
Ile	Ser·	Léu Pro	Thr	Phe	Glň Pro. 'Glu	Glu Asp Lys Met Asp Ťyř Asp
7Š5				790			795:			800'
gat	atc	ttc tca-	act·	gáá	acg áag^: gga'	gáá	gat.	ttt gac átt	tác	ggt	2448
Asp	Ile	The· Ser-	Thr	Glu·	Thr Lys· Gly	Glu	Asp	Phe Asp- Ile	Tyr	Gly
			80'5’			81'0			815
gag	gat	gaa aat	cag	gac	cct cgc agc	ttt	cag.	aag aga acc	ega	cac	24'96
'G1U-	Asp	Glu. Asn	Gin.	Asp·.	.Pro Arg Ser	Phe	Gin- Lys Arg Thr Ár.g	His
		820			.825			830
tat.	t.ťč	att gct	gcg	gtg	.gag cag ctě	tgg	gat	tac ggg atg	agc	gaa	25.4.4
Tyř	Phe	Ile Ala	Ala	Vál	Glu Gin Leu Trp Asp.? Týr Gly Met	Šer	Glu,
	--835----			------840.-------	.....	—	------9,4.5^—			—-----
tcc	ccč	Cgg gcg	ctá	aga	aac agg gct	cag	aač'	gga gag gtg	cčt	cgg·	25,92
Šer	Pró	Arg Ala	Leu Arg	Asn Arg Ala	Gin	Asn	Glý Glu Vál	Pró	Arg
	850				855'			860
ttc aag	aag gtg gtc	ttc	cgg gaa ttt	gčt‘	gac	ggc teč ttc	ácg	čág	2640
Phe	Lys	Lys Val	vál. Phe	Arg Glu Phe	Alá	Ásp	Gly Ser Phe·	Thr	Gin
865				8’7'0'			875			880
ccg	tcg	tac cgc	ggg. gaa	ctc. aac aaa	cac	ttg	ggg ctc ttg	gga	ccc	2688
Pró	Ser.	Tyr Arg	Gly	.Glu	Leu Asn Lys	His	Leu	Gly Leu Leu	Glý	Pro;
			885..·			'8-9.0			.895
tác	atc	ágá gcg	.gáá	gťt	gaa gac aac	atc	atg	gta act ttc.	aaa-	aac	2736
Tyt	Ile.	Arg Ala	GIU₍	Vál	Glu Asp A$h	Ile ''Met	Val Thr Phe Lys	Asn
		9Ό0.			905			91:0
cag	gcg	tet čgť	ccč	tat	teč t.ťč tác	tcg agc	ctt att tet	tat	ccg	2784
Gin	Ala	Ser Arg	Pro Tyr	Šer Phe Týt	Ser	Šer	Leu ile Sér Tyr Pro
		915			920			925

-89CZ 298250 B6

gat

gat cag gag

caa

ggg

gca

gaa cct

ega cac

aac

ttc

gtc

cag

cca.

2832

Asp

Ásp Glň Glu

Gin

Gly

Ala

Glu Pro

Arg His

Asn-

Phe

Vál

Gin

Pro

930

935

9'40

aat

gaá acc aga

act

tac

ttt

ťgg, ááá

gtg^: cag

cat

cac

atg'

gca

ccc

_:2B80

Asn

Glu Thr Arg

Thř

Týr

Phe

Trp Lys

Val. Glh

His

.Met

Ala

Pro

945

950

955

960

aca

gaa. gac gag-

ttt

gac

tgc

aaa gcq

tgg gcc

tác

ttt

tčt

gat

gtt

2928

Ťhr

Glu' Asp Glu

Phe

Ásp

Cys

Lýs' Álá

Trp Alá

Tyr

.Phe

Sér

Asp

Vál

965

970.

975

gac

ctg gaa aaa

gat

gtg

cac

tca ggc

ttg atc

ggc

ccc

ctt

ctg

atc

2976

_; Asp

Léu Glu Lys

Asp

Vál

His

Ser ;Gly.

Leu.Ile

Giy

Pro

Leu

Ile

9.80;

985

990

tgc

cgc gcc áa.ů

;acc

ctg·

aac

gct gct

cac ggť

aga

caa

gtg

acc

gtg

3024.

Cyš

Arg; Álá Ašrl

Thr

Leu,

Asii

Ala Ala

His Gly

Arg

Gin.

Val

Ťhr

Val

.995

1000

.1005.

•čáa

gáa ttt gct

ctg.

tťť

ttc

áčt att

ttt gat

gag

ácá-

aag

agc.

tgg

3072

Gin

Glu.Phe Ala

Leu

Phe

Thr Ile

Phe Asp'

Glu

Thr

Lys;

Ser

Trp

1010

1015

1020

tac

tťc act- gaa

aat

gtg

gáa

ágg aac.

tgc cgg

gcc

cčc

tgc

cat

ctg

312.0-

Týr

Phe Thr. Glu

Asn

'Val

Glu

.Arg Asn·

Cys. Arg

Ala

Pró

Cys

His

Léu.

1025

1030

1035

104Ό·

cag

atg gag gac

ccc

act

ctg

aaa gaa

aac tat

cgc

ttc

cat

gca

atc

3168

Gin

Met Glú Asp

Pro

Thr

Leu.

Lys Glu

Asn Ťyr

Arg

Phe

HÍS:

Ála

Ile

1

.045

]

.oso

1055

aat

ggc tat gtg

atg:

gat.

aca.

čte cct

ggc tta

gta

atg

gct

cag

aat

3216

Ašn

Gly Tyr· Val

Met

Asp

Thr

Leů Pro

^:Gly Léu

Val

Met

Ala

Gin

Asn

____

________1060-

__

___

___1065-

_n. t —— -

.....jroza

____

caa agg atc

“ega¹

tgg Trp

tať

cťg

•ctě

agc

atg ggc agc

áát·

gaa

áát

atc

32:6.4

Gin. Arg Ile

•Árg_;

Tyr;

Leů

Lé.u

Ser

Meť Gly Seř”

Asn

Glu

Asn

llé.

1075

1080-

1085

cat tcg átť

cat

ttt

agc

gga

cac

gtg

ťtď ágt gta

cgg

ááá

aag

9ag

3312

His Ser. íle

‘His

Phe

Sér

Gly

HÍS

Val

Phe Sex Vál

Arg

Lys

Glu

TO 90’..

1095

1100

gag tat aaa

atg

gcc

gtg

tac

aat

ctt

tať ccg ggt

gtc

ttt

gag

aca

-3360.

Glu Ťyr Xys

Meť.

Ála

vaL

Tyr

Ásn.

Leu

Ťyr Pro Gly

Val

Phe

Glu·

Thr

1105

1110.

1115

1120

gtg gaá atg

Cta

ccg

tec·

aaa

gtt

gga

aťt ťgg ega

a ta

gaa

tgc

cťg

' ^34:08:

Val Glu. Me.t

Leu

Pro

Ser·

Lys.

Val

Gly

Ile Trp Arg

Ile

Glu

Cys

Leu

1125

1130

1135

3456 atť ggc gag các ctg cáa gct ggg atg agc acg act ttc ctg gtg tac llé Gly Glu‘ His Leu Gin Ala Gly Meť Sér Thr Thr Phe. Leu Vál Tyr 114.0 11.45 1150

-90CZ 298250 B6

agc aag gag	tgt	cag get	cca	ctg gga	atg get tet	gga, ege att	aga	3504
Šer Lys Glu	Cys	Gin Ala	Pro	Leu Gly	Met Ala Set	Glý Ařg Ile	Arg
1155			1Γ60.	1165
gat ttt cag.	atc	aca get	tea	gga cag	tat gga cag	tgg gcc cca	aag	3552
Asp Phe Gin·	Ile	Thr Ala.	Šer	Gly Gin	Tyr Gly GÍn	Trp Ala. Pro	Lys.
1170		1175		1180
ctg gcc ágá	ctt	.cat. ťat	tčč	gga teá	atc aat .gcc	tgg agc acc	aa.g^:	3600
Leu. Ala Arg	Léú.	His Týr	Ser. Glý Ser	Ilé Asn Ala	Trp Ser Thr	Lys
1185		1.190			1195	1200.
gat ccc cac	tcc	tgg átc	aag gtg gat:	ctg ttg gčá	čcá atg: .átc	áťt	3648
Ásp Pro His:	Šer	Trp ile	Lys Vál Asp	Leu Le'u„ .Ala	Přó Met Ile'	Ile
	1205-		1210	1215
cac; ggc a.tc	atg	acc. cag	ggt.	gcc cgt	cág aag ttt	tcc agc ctc	tac	3696
His- Gly Ile·	Met	Thr .'Gin	Gly Ala- Arg	Gin Lys Phe	Ser Šer Leu	Tyr
1220			1225		1230
atc. tec cag’	ttt	atc átc	atg	tac, agt	ctť gac ggg	agg aac tgg	cag	3744
Ile Ser. Gin	Phé’	Ile. Ilé	Met	Tyr Ser	Leu. Asp Gly	Arg Asn Trp	Gin
.1235			1240	1245
a^!gt tac cgá	9.79	aat tcc	ácg	ggc. acc	tta atg gtc	ťťč ttt ggc	aat	3792
Ser Tyr. Arg	Gly	Asn .Ser	Thr	Glý Thr·	Leu Met Vál	Phé Phe Gly	Ásn
1250'·		1255		1260
g.tg gac. gca	tet	ggg 'att	aaá	cac aat	att ttt aač	ccť ccg att	gtg	3.84:0
Val Asp; Ala	Ser	Gly Ile	Lýs	His Ašn	•Ile· ’Phé .Asn	Pro Pro Ile	Val
12.65		1270'			1275	1280
get cg.g tac	atc	cgt ttg	cac	eea. aca	cat tac agc	atc· ege agc	act	38.88
Ala Ařg- Tyr	Ile	Arg, Leu.	His	Pro Thr	His Tyr Šer	Ilé-.Arg Ser	Thr.
- —.............		L-.2-B5------	—	- - - 1-290 ---—	----- 1295-	----
ctt cgč atg	gag-	ttg. atg	•ggc	tgt gat.	tta aac agt tgc-agc aťg	CČC'	3'936
Leu Arg Met	Glu.	Leu Met	Gly	Cys Ásp	Leu Ásn Ser	Cys Ser Met	Pro.
1300			1305		131Ó
ctg g.ga atg	cag	aat· aaa	gcg	ata tea	gac tea cag	átc acg. gcc	tcc.	3984
Ééu 'Gly Meť	Gin	Asn Lys	Ala	Ile Ser·	Ásp Sér Gin	Ilé Thr Ala	Šer
1315			1320	132.5
tec cac cta	agc	aat. átá	ttt	gcc ácc:	tgg tet ččt	ť.čá caa, gcč	čga	4032
Šer· .His Leu	Šer.	Ásri Ilé	Phé	Ala .Thr'	Trp Ser¹ Pro	šer Gin Ala Arg
133:0.		1.335		1340
ctt, cac ctc	•cag	ggg; cgg	acg	áát gcc-	tgg čga ccc.	cgg gtg agc	agc	’ 4 080
Leu His Leu	Gin·	Gly. Arg	Thr	Asn Ala	Trp Ar/g Pro	Arg Val, Sér-	Ser
1345		1350			1355	13'60
gca gag gag-	tgg	ctg cag gtg	gac ctg	cag aag acg;	gtg aag gtc	aca	4128
Ala Glu Glu ^:T.rp Leu. Gin'	Val	Asp Leu	GÍn Lys. Ťhr	Vál Lys Val.	Ťhr
	1355		1370'	.1375

-91 CZ 298250 B6

,gg_C	atc. acc	acc -cag ggc	gtg	aag	tcc ctg ctc age age	atg	tat	.gtg.	4176
Gly	Ile	Thr	Thr Gin Gly Val	Lys	Ser Leu Leu. Sér Ser	Met	Týr	Val.
		1380		1385 1390
áá.g	gag	:tt.C·	čte gtg tcc	:agt	agt	cag gac ggc .cgc- ege	tgg	acc	ctg	42'24
Lys	Glu	Ph&	Leu Val Sér	Sér	Šer	Gin, Asp Gly Arg Arg	Trp Thr.	Leu'
	1395		1400	1405
,ťtt	ctt	cag	gáč ggc čac	a cg.	aag	gtt tťť cag ggc aat	cag	gac	tcc	4272
phé	-Leu	Gin	Asp Gly His	Thr	Lys	Vál Phe Gin Gly Asn	Gin	Asp	Ser
;ϊ	-410		1415		1420·
tcc·	acc	CCC	gtg gtg .aac	get	ctg	gac 'ccc; ccg ctg ttc.	acg	cgč	tac	43.20
Ser	Thr	Pro.	Vál Val Ašn	Alá	Leu	Asp Pro Pro Leu.Phe	Thr	Arg-	Tyr
14 25		14 30			1435.		1440
cťg	agg·	atc	cac ccc: acg;	age	tgg	gcg ca'g^:-eac aťc- gcc	ctg	agg;	ctg	4368
Leu Arg	Ile	His. Pro Thr	Ser	Trp·	Ala Gin His ííe Ala	Leu	Arg	Leu
			M 4 5			Ϊ450	1	L455
dag	gtt.	cta	gga tgt gag.	gca	eag·	gat cťc tac- tga				44 04:
GÍu^r	Val.	'Leu	Gly Cys Glu	Ala	Gin	Asp Leu Tyr

14'60 1.,465 <210> 38 <21T> 1467PRŤ’ <:2·Ι3> P.rase_; <400> 38

Met ‘Gin ’ 1

Le,U‘

Glu Leu Sér 5.

Thr Cys

Val

Phe· io;

Leu

Cys

Leu

Leu Přo Leu· 15

GÍy

Phe

S.er

Ala; Ile

•Arg

Arg Tyf·

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

'ser'

20

2’5

. 3'0·

Trp

Asp

Tyr-

Arg' Gin

Šer

Glu, Leu

Leu Arg'

Glu

Leu

His'

Val

Asp

Thr

'35

4Ó

45

Arg

Phe.

Pro

Ala Thr

'Ala_;

Pro GÍy Ala

Leif

?ro

Leu

Gly

Pro

Ser

Vál

50'.

5'5

60

Leu

Tyr

'Lys

Lys· Thr

Vál-

Phe Vál.

:G1U

Phe

Thr Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70'

75

80

. ...Val

Ala

Arg

Pro-. Ar.g

Pr.o

Pr.o. .Trp._;

.Met

.Gly Leu.

Leu GÍy

Pro

Thr

Ile

85

90

95.

Gin:

.Alá

Glu,

Vál .Tyr Asp

Thr Val

Val

Thr-

Leu Lys

Asn

Met

Ala

100

105'.

Ho

'Ser

His

Pró.

'Val Ser

Leu

His Ala

.Val.. Gly.

Val

Ser

Phe

Trp Lys

Ser

115'

120

125

-92CZ 298250 B6

Ser

.Glu

Gly

Ala

Glu.

Tyr

Glu. -Asp

His

Thr

Šer

Gin

Arg

Glu

Lys

Glů

130

135

Γ40

Ásp

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

.15.0

155

160

Leu

Lys'

Glu

Ašn

Gly

Pro

Thr Ala

Ser

Asp

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

i 75

Sér

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp Leů

Vál

Lys

-Asp

Leu

Asn

Šer

Gly

Leu

180

185

190

Ile

Gly

•Ala

Leu

'Leu

Val

Čyš Arg

Glu

Glý

Ser

Leu

Thr

Ařg

Glu

Arg

195'

200

205

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe Val

Leu

Phe

:Alá

Val

Phe

Asp

Glů

210

215

220

Gly

tys

Ser

Trp

His

Šer

Ala Árg

'Ásn

Ásp

Ser

Trp

Thr

Árg

Ala

Met

.225

'230

235

24Ó

Asp·

Pro

Ala

Pro'

Ala.

Arg

Ala Gin

^;PrO:

Ala

Met

HÍS.

Thr

Val

Asn

Gly

24 5

.250.

255

Tyr

Vál

Asn

,Arg

Sér

Leu

Pro Gly

Leu

Xle

Glý

Cys

His

Lys

Šer

260

265

270

Vál

Tyr

.Trp

His

Vál

Ile

Gly -Met

Gly

Thr

Sér

Pro.

Glu

Val

His

Ser

275

28Q

285,

Ile

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr Phe

Leu

Vál

Arg

His

HiS'

Arg

GÍh

Ala

290

295.

300

.Sér/	-Le.u.	-Glů	_Il.e_S.er_	-?ro._Leů.	.Thr.	.Phe.	_Léů_	ÍThr_Ála_	_Gln_Thř_J?hé_	-Leu.
305				310,				315	320
ýet	Asp	Leu	Glý Gin	Phe· Leu	Leu	Phe	Cys	His ile	Sér Ser His	HiS
			325				330		335
His	Gly	Gly	Met' Glů	Ala' His	Val	Arg	Vál	'Glu Ser	Cys Ala Glu	Glů
			34 0^:			345			350
Pro	Gin.	Leu	Arg Árg	Lys’ Ala	Asp	Glů	Glů	Glu Asp	Tyr Asp Asp	Asn
		-355'			360				365
Leu	Ťvr	Asp	Š.er Asp	Met Ásp	Vfd	Val	Arg	Leů Asp	Gly Asp Asp	Val.
	.370.			2.75.		*	. ...	380
Ser	Pro·.	Phe	•Ile· Gin	Ile Árg	Ser	Val	Ala	Lys Lýš	His Pro Lys	Thr
385				390'				395		400
Trp	Vál	His-	Tyr Ile	Šer Ala	.Glů	Glu	Glu	Ásp Trp	Ásp Tyr- Ala	pro
			4:05				Ho		415
Ala	Val	Pro	Šer Pro.	Šer Asp.	Árg	Šer	Tyr	Lys Sér'	Leu Tyr Leu	Ásri
			420			425			430:

-93CZ 298250 B6

Ser Gly	Pró 435	Glri Arg Ile:	Gly* Ar.g Lys 440	Tyř	Lys Lys	Ala Arg Phe Val 445;
Ala Týr	Thr	Asp Val Thr	Phé Lys Thr Arg· Lys Ala	Ile, Pró Týr Glu
450			455		460
Ser Gly Ilé	Létl Gly Pró	'Leu Leú Týr_: Gly	Glu Val	Gly Asp Thr Leu
465		470			475	480
Leu Ile	ile	Phé Lys Ash	Lys Ala Ser Árg	Pro- Tyf	Asn ilé Týr Pro
		485		4'9.0		495
His Gly	Ilé	Thr Ásp Val	Ser Ala, Leu	His	Přo Gly	Arg Leu Leu Lys
		500	505			sio:
Gly Trp	Lys	His Leu Lýs	Ašp Met Pro	Ile	Leu' Přo	Glý Glu Thr Phe
	515		5^;20			525'
Lys Tyr	Lýs	Trp Thr Vál	Thr Val Glu	Ašp	Glý Pró	Thr Lýs· Sér Ašp
53Q			535		.540
Pro Arg	'Óýs	Léu Thr. Arg	Tyr Tyr Ser	Sér	.Ser Ile	Asn, Leu Glu Lýs:
54 5		550			555	560
Asp, Leu Ala¹	Šer Gly Leu	Ilé Gly Pro	Léu	Leu Ilé	Čýš Tyr Lýs Glu
		565^?		570		575
Ser Val	Ásp	Gin Ar.g; Gly	Asn Gin Meť	Meť	Ser· Asp	Lys Árg, Asn Vál
		580	585			590^;
Ilé léu	Phé	Ser Vál Phé	Asp: Glu Ašů	Gin	Séř Trp	Tyr Leu Ala Glu
	595		600.			605
Ašn/Ile	?ln.	Arg PheLeu	Pró Ašh Pro Asp Gly Leu	Gin Pro Gin Asp
' 6®			615		620
Pro Glu	Phe	Gin Ala Ser	Asn. Ilé Met	His	Šer tle	Ásn Gly Tyr. Val
625		630			635	640
Phe Ásp	Šer	Leu Gin. Leu	Šer Val Cys	Leu	His Glu.	Val Ala Tyr trp.
		645		650.		655
Tyr Ile	Léú	Šer Val Gly	Ala Gin Thr Ásp	Phe Leu	Ser Val Phe Phe
		66.0;	665			,670
Sér Gly	Tyr	Thr Phe Lyš	His Lys Mét	Vál	Týr Glu	Asp Thr Le.u Thr
	675		680'		-	685
Leu Phe	Pro	Phe Séř Gly	Glu Thr Val	.Phe;,	Met Sér	Met Glu Asn Přó
690			695		700
Gly Leu.	Trp	Val Léú Gly	Cys His- Ash	Ser Asp Leu	Arg· Ash Arg Gly
705		710			715	720
Meť Thr·	Ala	Leů Leu Lys	Val Tyr' Ser	Cys Ašp'; Arg* Asp Ilé Gly Asp

725 730 735

-94CZ 29825U BO

Tyr

Tyr Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile

Pro

Gly Phe

-Leu Leu

Ser

Gl.y

740

745

750

Lys

Asn: Val

Ile

Glu

Pró

Árg

Ser

Phe

Alá

Gin Asn

Šer Arg

Pro

755

760

7 65

Šer

Ala. Šer

Ala

Pro

Lys·

Pro

Pro,

Val

Leu

Arg Arg

His, Gin

Arg

Ašp

770;

775

' 78.0

Ile

Šer :Leu

Pró.

Thř

Phe

Gin

Pro

Glú

Asp^; Lys

Met, Asp

Týr

ASp

785

7.90.

795

800

Asp

Ile. Phe

Ser

Thr

Glu

Thr

Lys

Gly

Glu

Asp Phe

Asp ile

Tyr

Gly

805

810

815

Glu

Ásp^; Glu

Ásn.

Gin

Asp·

Pro

Árg-

Šer.

Phě

Gin Lys

Árg Thr

Arg

Hiš

820

825

.:830

Tyr

Phe- Tle

Áia.

Alá

Val

•Glu

Gin

Leu

írp

Asp Tyr

Gly Met

Ser

Glu

835

840

845

Ser

Prcr Árg

Ala

Leu

Árg

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn: Gly.

Glu Val

pro

Arg

850

855

>8.60

Phe

Lys Lys

Vál

Val

Phě

Arg

Glu

phě·

Ala

Ášp Gly

Ser’ Phé

Thr

Gin

:86.5.

8.70

875

880

Pro

Set Tyr

Arg

Oiy

Glu

.Léu

Asn

LýS;

His

L'éu Gly

Leu. Leu

Gly

Pro

885'

890

895

Tyr

ile Arg

.Alá

Glu

Val

Glu

AŠp

Asn

Tle

Met Val,

Thr Phe

Lys

Asn

900 905 '910

- G 1-n- Ala-Ser-Ar g-Pr o—Tyr-’ S e r-Phé —T-yr— Š e r— Š er—Le u-I-ϊe- Sér-Ťy r-^Pr o>.

	.915·			920	925
Asp Asp	Gin Glu	Gin Gly	Ala Glu	Pro. Árg His Ásn Phe	Val Gin	Pro
930				-935.	940:
Asn- Glú	Thr··	Arg	Thr Týr	Phé Trp	Lyě Val Gin Pis; His	Met. Ala	Pró
94 5:		Glu	950		955	Ser Asp	960
Thr Glu Asp	phé: Asp	Cýs. Lys	Ala Trp Ala Tyr Phé 970'	Val.
			965:		975
Asp Léu	Glu	Lys	Asp Vál	His¹ Sér	GÍy Léu Ile Gly Pro	Leu Leu	ílé
		980			985 - -	990-
Cys Arg	Ala	Asn	Thr -Leu	Asn. Alá	•Ala His Gly Árg Gin	Val Thr	Val
	995			1000	1005
Gln> Glu	Phé	Ala	Leu Phe	Phe Thr	ílé Phe Asp Glu Thr Lys. Ser	Trp
1010			1015	1020
Tyr’ Phe	Thr	Glu	Ašn Val	Glu Arg	Ásn Cýs Arg Ala Pro Cys His	Leu
1025			1030		1035	1040

Gin Met Glu	Asp. Pro Thr Leu 10.45	Lys	Glu Ásn Ťyr Arg Phe His Alá Ilé
1050	1055
Asn Gly Tyr	Val Meť Asp Thr	Leu	Pro Gly	Leu. Val	Met	Ala	Gin	Asn
1060	1065		1070.
Gin Arg Ile	Ařg Trp Tyř Leu	Leu	Ser Mét	Glý Sei	Ásn	Glu	Asn	Ile:
'1’07'5-	108,0		1085
His Sér Ilé	His- Phe Šeř' Gly	His	Val Phe	Šer Vál	Arg	Lys	Lys	GÍu
1090	1095.			1100
Glu Týr Lys	Met Ala Val- Tyr	Asn	Leu Ťyr	Pro Gly	Val	Phe·	GÍu	Thr
'1105'	lilo		1115			1120.
Val· GÍu Met	Leu -Pro Šer Lys	Val	Gly íle	Trp:· Arg	íle	.Glu-	Cys	Leu
	-1125		1130			1135
ííé Gly Glu	His Leu Gin Ala Gly-	Met Sér	Thr Thr	Phe	Leu	Vál	Tyr
114’0	114 5.		1150
'Sér. Lys Glu	Cys Glh Ala .Pro	Léu Gly' Met	Alá šeř, Gly Arg	Ile Arg
' 1155;	1.160		1165
Asp Phe Gin	Ile. Thr Alá Ser	Gly Gin Tyr	Gíy Glh	Tip Ala.	Pro Lys
ÍÍ7Q	1175			1180
Leu Ala Arg	Leu His Tyr Ser	Gly	Šeř íle.	Asn Ala	Trp. Šer	Thr Lys·
1165·	1190		1X95.				1200
Asp Pro His	Šer Ťr.p Ile Lys' Val	Asp Leu	Leu Ala	Pro	Met^:	Ile	,I.le.

1205 '1210 1215'

His~Gly“ ÍTer Met-Ťhr ” ’ Gi n - Gl-y^Ala- Arg·- G-l-n—Lýs-Ph e -S ér— Sér-LeÚ-T-y r--122.0 12251230:

Ilé Sér Glh. Phe Ilé Ile Meť Týr Sér Léu Asp Gly Ařg Asn Trp Gin

1235 12401245

Ser Tyr Ařg Gly Asn· Ser Thr Gly Thr Leu Met: Vál Phe Phe Gly Asn^:.1250..... ' 1255 ' . '1260

Val Asp Ála Šer. Gly Ile Lys His Asn. íle Phe Ash Pro Pro Ile Vál

1265 * 1270 12751280:

Ála Arg Tyr íle Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser íle Arg SérThr

........ _12S5. ... . . - 1290’ - · -- 1295

Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Čys Asp Leu Asn Sér Cys Šer MetPro

1300 13051310.

Leu Gly Met Gin Asn. Lys Ála íle Šer Asp Sér Glh Ilé Thr Ala Ser·

1315 13201325

Ser His Leu Ser Asn Ile Phe Ála Ťhr Trp Šeř Pro Ser Gin Alá Ařg ,

1330 1335 1340.

-96CZ 298250 B6

Leu His Leu Gin Glý.Arg Thr .Asn Alá. Trp Arg Pro Arg Yal Ser Ser 1345 1350 13551360

Ala Glu, Glu Trp Leu Gin Val Asp Leu Gin Lys Thr Vál Lys Val Thr .1365. 13701375 'Gly Ile Thr Thr Gin Gly Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val 1380 13851390

Lys -Glu íPhe’ Leu Val Ser Ser Šer Gin Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu 1395 14001405

Phe Leu Gin Asp Gly His Thr. Lýš Val phe Gin Gly Asn Glh Asp Ser 1410 14151420

Sér Thr Pro Val Val Asn Alá Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr 1425 1430 1435 1,44.0

Leu, Arg Tle His Pro Thr Sér Trp Ala Gin His Tle. Ala Leu Arg Leu· 1445: 14.50’1455

Glu Vál Leu Gly Cys Glu Alá Gin Asp Leu Tyr

T4601465

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

5 PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA kódující aminokyselinovou sekvenci POL1212 uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 38.

Ϊ0------------------------¹-----------
2. Expresní vektor obsahuj ící DNA podle nároku 1.
3. DNA podle nároku 1 mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 37.
4. Expresní vektor obsahující DNA podle nároku 3.
5. Modifikovaný prasečí faktor Vlil mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 38.
6. Terapeutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje modifikovaný prasečí faktor VIII podle nároku 5 a fyziologicky přijatelný nosič.
7. Způsob přípravy in vitro proteinu modifikovaného prasečího faktoru VIII, který má amino-

25 kyselinovou sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 38, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje krok, kdy se v hostitelské savčí buňce in vitro exprimuje DNA kódující protein mající aminokyselinovou sekvencí uvedenou zde jako SEKVENCE ID Č. 38, přičemž savčí hostitelská buňka není buňkou lidské zárodečné linie.

30
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že kódující aminokyselinovou SEKVENCI ID Č. 38 kóduje také signální peptid, prostřednictvím kterého je modifikovaný prasečí faktor VIII exportován ze savčí hostitelské buňky.

-97CZ 29825U B6
9. Způsob podle nároku ^vyznačující se tím, že signální peptid má sekvenci aminokyselin 1 až 19 ze SEKVENCE ID Č. 30.
10. Savčí buňka in vitro, která obsahuje a replikuje expresní vektor obsahující DNA kódující 5 aminokyselinovou sekvenci POLI 212 uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID Č. 38, přičemž savčí buňka není buňkou lidské zárodečné linie.
11. Savčí buňka podle nároku 10, kde vektor obsahuje DNA mající SEKVENCI ID. Č. 37.

10 12, Savčí buňka podle nároku 11, kde hostitelská buňka je BHK CRL-1632.

15 6 výkresů

-98CZ 29825U B6

Signální peptid

Člověk -19 MQIÉLSTCFF LČLLRFČFŠ Prase MQIELSTCVF LČLLPL'GFS Mvš MQTALFACFF LSLFNFCSS

Obr. 1A

Doména Al

ČlovŘk 1 AFRRYYLfiAV ELSWOYMQSD LG-ELPVDAR FPPRVPKSFP FKTSVVYKKT -f fc _o AIRRYYLGAV ELSWDYRQSE LLRELHVDTR FPATAPGALP LGPSVLYKKT ·· ^ΧΧ5 ^ťr?^se AIRRYYLGAV ELSWNYIQSD LLSVLHTDSR FLPRMSTSFP FNTSIMYKKT

Mys ********** **** ******** * * ****'

50. LFVERTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVI.TLK NMASHP.VSLH

VFVeFTDQLF SVARPRPPWM .GLLGPTIQAE VYDTVVVTLK NMASHPVSLH

VFVEYKDQLF NIAKPRPPWM GLLGPTIWTE VHDTVVITLK NMASHPVSLH *** * ** * ****** ******* * * **** *** **********

100 AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ VLKEŇGPMAS AVGVSFWKSS EGAEYEDHTS .QREKEDDKVL PGKSQTYVWQ VLKENGPTAS AVGVSYWKAS .EGDEYEDQTS QMEKEDDKVF PGESHTYVWQ VLKENGPMAS ***** ** * ** *#** ** * ******* ** * ***** ******* **

150 DPLCLTYSYL SHVDLVKÓLN SGLIGALLVC RÉGŠLÁKEKT QTLHKFILLF DPPCLTYSYL SHVDLVKDLŇ SGLIGALLVC REGSLTRERT QNLHĚFVLLF DPPCLTÝSÝM ŠHVDLVKDLN SGLIGALLVC KEGSLSKÉRT QMLYQFVLlF ********* ********** ********** **** * * * * * ***

200' AVFDEGKSWH ŠEŤKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN RŠLPGLIGCH AVFDEGKSWH SARNDŠWTRÁ MDPAPAŘAQP AMHTVNGYVN RŠLPGLIGCH AVFDEGKSWH SETNDSYTQS MOSÁSAROWP KMHTVNGYVN RŠLPGLIGCH ********** * * ***** ********* **********

250 RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS PITFLTAQTL RKSVYWHVIG MGTSPEVHSI FLEGHTFLVR HHRQASLEIS PLTFLTAQTF RKSVYWHVIG MGTTPEIHSÍ FLEGHTFFVR NHRQASLEIS PITFLTAQTL ********* *** ** *** ******* ** ********* *********

APC/IXa I

300 LMDLGQFLLF' CHISSHQHOG MEAYVKVOSC PEEPqLRMKN NEEAEDYDOO IMÓLGQFLtÉ CHISŠHHHGG MEAHVRVESC AEEPQLRRKA DE-EEDYODN LIDLGQFLLF CHÍSSHKHDG MEAY.VKVOSC PEESQWQKKN NN-EEMEDYD * ******** ****** *, * *** ******* * * *

Ila/Xa

350 LTQSEMDWR FDDDNSPSEI QIR.

LYDŠDMDVVR LDGDDVSPFI QIR DDLYSEMDMF TLDYDSSPFI QIR ** .***

-99CZ Z9HZ5U B6

Doména A2

Člověk 373 SVÁKKHPKTW VHÝIAÁEEED WOYAPLVLAP DDRSYKSQYL NNGPQRIGRK

Prase ' SVAKKHPkŤW VHYÍSAEÉÉD WDYAPAVPŠP SQRSÝKSLYL ŇSGPQRIGRK _Mvx SVAKKYPKTW IHÝISAEEED: WOYAPSVPTS DŇGSYKSQYL SNGPHRTGŘK ,423 YKKVRFMAYT OE-JEKTREAl QHESGXLGPt LYGÉVGOTLL IIFKNQASRP

YKKARFVÁYT. OVTFKTRKAI PYESGILGPL LYGÉVGOTLL IIFKNKASRP

YKKVRFIAYT DETFKTRETI QHESGLLÓPl LYGEVGDTLL ΪIFKNQASRP ik** **. *** * ****n* * ***. **** .********** ***** ****

A2 inhíbitorovyepítop .473 YNIYPHGITD WLYSRRLP KGVKHLKDFP^ Í1PGE7FKYK WTVTVEDGPT YNIYPHGITD VSALHPGRLL KGWKHLKDMP ILPGEŤFKÝK WTVTVEDGPT YNIYPHGIJD VSPLHARRLP RGIKHVKĎLP IHPGEIFKYK WTVTVEDGPT ,**********. * * ** ** **· ** * * *** **** **********

Vazba f . IXa

APC

523 KSDPRCLTRY YSSFVNMERD LASGLIGPLL ICYKESVDOR GNQIMSDKRN KSDPRCLTRY YSSSINLEKD LASGLIGPLL ICYKESVDQR GNQMMSDKRN KSOPRCLTRY YSSFÍNPERD LASGLIGPLL ICYKESVDQR GNQMMSDKRN *-********* *** * * * ********** ********** *** ******

573 VILFSVFDEN RSWYLTENIQ RFLPNPAGVQ LEDPEFQASN IMHSINGYVF VILFSVFDEN QSWYLAENIQ RFLPNPDGLQ PQDPEFQASN IMHSINGYVF VILFSIFOEN QSWYITENMQ^; RFLPNAAKTQ PQDP.GFQASN IMHSINGYVF ***** **** *** ** * * A*Λ* * ** '*'**** **********

Obr. 1C

623 dslqlsvclh evaywyilsi GAQTDFLŠVF FSGÝ.TFKHKM VYEDTLTLFP 'DSLQLSVCLH evaywyilsv GÁQTDFLSVF FSGYTFKHKM VYEDTLTLFP DŠLELTVGÍH EVAYWHILSV GAQTDFLSIF FSGYTFKHKM VYEDTLTLFP *** * ***·* ***** *** ******** * ********** ********** ♦ ♦

673 FŠGETVFMSM ÉNP'GLWlLGC“HŇŠDFRNRGM'TAL'LkVSSCO' KNTGDYYEDS' FŠGETVFMSM ENPGÍWVLGC HNSDLRNRGM TALLKVYSCD RDÍGDYYDNT FSGETVFMSM ENPGLWVLGC HNSDFRKRGM TALLKVSSCD KSTSDYYEEI ********** ********** i·*** * *** ********** * *** ♦ íla/YaíAPC

723 YEDISAYLLS KNNAIEPŘ

YEDIPGFLLS: GKNVIEPR

YEDIPTQLVN ENNVIDPR· ’7*l * * '4

- 100cl zvezsu tJó

Doména B

Člověk 741 ŠFŠQNŠRHPS TRQKQFNÁtT ÍPENĎIEkTD PWFAHRTPMP KIQNVSSSDL f)hr ΊΓ Prase SFAQNSRPPS ASqKQFQTJT SPEDDVE-LD PQSGERTQAL EELSVPSGD6 ^V ’

Mys SFFQNTNHPN TRKKKFKÓST IPKNDMEKIE PQFEEIAEML KVQSVSVSDM ** ** * -k * ***** * *.*

791. LMLLŘQS-PT: PHGLSfSDLQ EAKYE7FSDD PSPGAIDSNN ŠLSEM7HFRP

SMLLGQŇ-PÁ PHGSSSSDLQ ÉÁRNEA--00 YLPGARERNT APSAAARLRP

LMLLGQSHPT PHGLFLSŮGq EAIYEAIHDD HSPNAIDSNÉ GPSKVŤQLRP λ** *' *** * * X* 9c ** * * * *.**

840; QLHHSGOMVf TPÉSGLQLRL NEKLG77AAT ELKKLĎFKVS ŠT-SNNLIŠELHHŠAERVL TPEP------------EK ELKKLDSKMS SSSDLLKTSP

ESHHSEKIVF· TPQPGLQLRS NKŠLETTIEV KWKKLGLQVS SLPSŇLMT7*i* * *'* *·*** !^:83 TÍPŠDNLAAGT DNTSSLGPPS MPVIIYDSQI.D T7I-.FGKKSSP LTtŠGGPLSL TIPSDTLSAET I.RTHSLČPPH PQVNFRSQÍ6 ÁWLGKNSSH FIGAGVPLGS ilLSDNLKATF EKTÓSSGFPt) MPVHSSSKXS TTAFGKKAYS i.VGStlVPt.NA ** ** * * * *,** * * * irlč **

939 SEENNDSKLL E-SGLMNšQES SWGKNVSSTE' SGRLFKGKRÁ HGPALLTKON 7EED-----HES SLGENVSPVE SDGIFEKERA HGPASLTKDD SEENSOSNIL OSTLMYSQES LPRDNIESIE NDRLLREKRF HGIALLTKDN '#*. ** 'f, * * ** * ****

989 ALFKVSISLL KTNKTSNNSA TNRK7HIDGP SLLIENSPSV WQN1LESDTE

VLFKVNISLV KTNKARVYLK TNRKIHIOOA ALL7ENRAS- -.....—

TLFKDNVSLM KTNKTYNHST TNEKLHTESF TSIENŠTIDt QDAILKVNSE .1039 RKVTPLIRO -RMDKNATA LRLŇHMŠNKT TSSKNMÉMVQ’ QKKEGPIPPĎ

------- ATFMDKNTTA ŠGlNHVSN--: - -----............

IQEVTALIHD GTLLGKNSTY LRLNHMLNR7 TŠ7KNKDIFHRKOĚOPIPQO ___r_______* ***____** *** *___, __________,_________,__________,_________,________,__,____t .........

1089 AQNPDMSFFK MLFLPESARW. IQRTHGKNSL NSGQGPSPKQ LVSLGPEKSV

-----------------_w iKGPLGkNPL ŠSERGPSPEL LTSSGŠGKSV

EEMTIMPFŠk’ MLFLSESSNW FKKTNGNNSL. NSEqEHSPKQ LVYLMFKKYV * # *’'* ** * * *'í|

1-139 EgWŠEKN kvvvgkgeft kdvglkemvf pssrnlfltn LDNLHENKTH.?

KGQŠŠGQGRIRVAVEEEELS KG---KEMML PNSELTFL7N SADVQGNDTH

KNQŠFLSEKN OTVEQDGF7 KNIGLKDMAF PHNMSIFLT7 LSNVHENGRH;j * * ^J*; *: *** * * í

1189 NQEKKIQEEL EKKE.TLIAEN VVLPQIH7VT GTKNFMKNLF LLSTRQNVEG

SQGKKSREEM ERREKLVOEK VDLPQVYIAT G1KNFLRNIF HQSTEPSVEG

NQEKNIQEEI EK-EALIEEK VVLPQVHEAT 6SKNFLKDIE ILGTRQNI-*· ’ * ¹ * ₍ ·'.<» * *' ***^: '* * ***

1239 SYDGAYAPVL QDFRSLNDST NRTKKHTAHF SK--KGEEEN LEGLGNQ7KQ

FDGGSttAPVP QĎŠRSLNDSA ERAETHIAHF SAIR--EEAP LEAPGNRT-SLYEVHVPVL QŇITSINNST NTVQIHMEHF FKRRKDKETN SEGLVNKTRE ** * * * ' *' **' £ * ' * ’

- 101 ΌΔ íyOÍZJU ΒΟ

1287 IVEKYACTTR ISPNTSQQNF VTQRSKRALK QFRLPLĚETE LEKRIIVDDT .........- —GPGPRSA.VPRRVKQSLK qirlpleeik pérgvvínat MVKMYP---------SQKNÍ TTQRSKRALG '.QFRL-——- - — - 1337 STQWSKNMKH LTPSTLTQID ÝNEKEKGAIT QSPLSDCLTR SHSIPQAŇRS STRWS-.--......-...... ........- -.....—

STQWLKTINC STQCIIKQID HSKEMKKFIT KŠŠLŠDS-5V IKSTTQTŇSS **' *:

1387 PLPIAK.VSSF PSIRPIYLTR VIFQDNSSHL PÁASY—-R KKDSGVQESS —---------—ESS

DSHIVKTŠÁF P---PIOLKR SPFQNKFSHV QASSYIYDFK TKŠSRIQESN, **

1433 HFLQGÁKKNN LSLAÍLTLEM TGDQREVGSL. GTSATNSVTY KKVENTVLPK

PILQGAKRNN LSLPFLTLEM AGGQGKISAL GKŠAAGPLAS GKLEKAVLSS

ŇFLKETKíNfí PŠLA1LPWNM FIDQGKFTSP GKSNTN5VTY KKRENIIFLK * * ** .* ·* * * * *

1483 PDLPKTŠGKV ÉLLPKVHIYQ KDLFPTETSN GSPGHLDLVE GSLLQGTEGA ' AGLSEASGKA EFLPKVRVHR EDLLPQKTSN VSČAHGDLGQ EIFLQKTRGP PTLPEESGKI ELLPQVSIQE ÉEILPTETSH GSPGHLNLMK ÉVFLQKIQGP Á.W* * ** * ’*’*·** *

1533 ÍKWNEANRPG KVPFLRVATt SSAKTPSKÍL DPLAWONHYG TQIPKEEWKS VNLNKVNRPG -------- —RTPSKLL -------G PPMPKE-WES TKWNKAKRHG ESIKGKTES- -SKNTRSKLL NHHAWDYHYA AQIPKDMWKs * * * * **** * * *

1583 QEKSPEKTAF KKKDTI-LSLN ACESNHAIAA INEGQNKPÉI EVTWAKQGRT

LEKSPKSTAL RTKDIISLPLD RHESNHSIAA KNEGQAETQR ÉAAWTKQGGP

KEKSPEITSI KQEDTI-LSLR PHGNSHSIGA -NEKQNWPQR ETTWVKqGQT **** * lir skW ★ ýrif. i * Λ**

1533 ERÍCSONPPY LKRHQR GRÍCAPKPPV LRRHQR QRTCSQIPPV LKRHQR ♦ » ♦*,· *

Aktivační peptid lehkého řetězce

Člověk Prase Mys ♦ Ila/Xa

1649 EITRnLQSDQEEIOYDOnSVEMKKEDFÓIYÓEDENQSPR

DlSLPTFQPEEÓKMDYDOÍFSTÉTKGÉĎÉdlYGEOENQDPR EL-SAFQSEQEATDYDDAITIET-IEOFDIYSEDIKQGPR * - - * - ****. * -****+*, ** > *·*

Obr. ÍE

-102Doména

Člověk

Prase

Myš

IXa Xa

1690. SFQKKTRHYF íAAVEŘLWDÝ GMSSSPHVLR NRAQSGSVPQ FKKWFQEFT SFQKRTRHYF lAAVEQLWDY GMSESPRALŘ NRAQNGEVPR FKKWFREFA WDX 3VQQKTRHYF IAAVERLWDY GMSTS-HVLR NRYQSDNVPq. FKKWFQEFT * * ***** ***** **** *** * ** ** * **'

1F

1740 DGSFrílPLYR GELNEHLGLL gpyiraevěď nimvtfrnqa srpysfyšsl DSSFTQPSYR GÉLNKHLGLL GPYIRAEVED NIMVTFKNQA SRPYSFYSSL OGSFSOPLYR GELNEHLGLL GPYIRAEVED NIMVTFKNQA SRPYSFYSSL »*·· «« **** ***** ********** ****** *** **********

Vazba jf. ÍŽa

Í790 ISYĚEDOROG. AEPRKNFVKP HETXTYFWKV' OHHMAPTCDE FDCKMAYFS ISYPOOQEQG. AEPRHNFVQP' NETRTYFWKV’ QHHMAPTEDE FDCKAWFS ISYkÉĎqR-G EtPRRNFVKP NETKIYFXKV OHHMAPTFCE FDČKAWAYFS *** **; -*< *** *** ** *** ***** ********** **********

1840 DVDLEKDVHŠ GLIGPLLVCH TNTLNPAHGR QyTYQÉFALF FTIFDETKŠW DVOLEKDVHS GLIGPLLICR ANTLNAÁHGR QVTVQEFALF FTIFDETKŠW DVDLÉRĎMHS GLIGPLLICH ANTLNPAHGR. QVSVQEFALL FTIFDETKŠW ***** * ** ******* * ****. **** iř*: ****** **********

1890 YFTENMERNC rápcniqmed ptfkenyrfh aingyihdtl pglvháqdqr YFTENVERNC RAPCHLQMEO PTLKEMYRFH AINGYVMDTL PGLVMAQNQŘ YFTENVKRNC KTPCNFQMED PTLKENYRFH AINGWMDTL PGLVMAQDQR ***** *** ** ****: ** ******* ********** ******* *-*

1940 IRWYLLSMGS NENIHSIHFS GHVFTVRKKE EYKMACYNLY PGVFETVEML IRWYLLSMGS NENIHSIHFS GHVFSVRKKE EYKMAVYNLY PGVFETVEML IRWYLLSMGN NENI.QSIHFS GHVFTVRKKE EYKHAVYNLY PGVFETLEMI ********* **** ***** **** ***** ***** **** ****** **

Vazba proteinu C --------I99.0_:RSKAGiWRVE-(XKEHUjALMŠKÉ^YSN--~-----------—--------PSKVGIWRIE CÍJGEHIQAG MSTTÍlVYSK PSRAGIWŘVE CLIGEHLQAG MSTLFLVYSK **, **** .* ******* ** *** ******

-103Doména Cl

Člověk 2020 KCQTPLGMAS GHIRQFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFŠ Ak_r Ί p

Prase ECQAPLGMAS GRIROFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKDPHŠ

Myš .QCQIPLGMAS GSIRDFQÍTÁ SGHYGQWAPH LARLHYSGSI NAWSTKÉPFS ** ****** * ******** ** ****** ********** ****** .* *

2070 WIKYDLLAPH IIHGIKTQGÁ RQKFSŠLÝIŠ QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS

WÍKVDLLAPH IIHG-IMŤQGA RQKFŠSLYIS QFÍIMYSLDG RKWQSYRGNS

WIKVDLLAPM IVHGIKTQGA RQKFSSLY1S QFÍIMYSLDG KKWLSYQGříS ********** * *** ΑΑΛ* ********** ********** * * ;***

2120 TGTLMVFFGN VDŠSGIKHNI FNPPIIARYI RLHPTHYŠIŘ STLRMELMGCÓLŇ TGTLMVFFGN VDÁSGIKHNI FŇPPIVARYI RLHPTHÝSIR SJLRHELMGCDLN TGTLMVFFGN VDSSGIKHNS FNPP.IIAftYI RLHPTHŠSIR STLRMELMGGDLN ********** ** ****** ***** úh. ****** *** *************

Doména C2 člověk

Prase, .Myš

Inhibi torový epitop

2173 ŠČSMPL.GKES KAIŠOÁOÍ.tA SSYFTNMFAT WŠPSKÁRLHL QGRSNAWRPQ AUŠCŠMPLGMQN KArSDSQITA SSHLSNIFAT WSPSQARLHL QGRTNAWRPR ^υθΓ · ŠCSÍPLGMEŠ KVIŠDTQIŤA SSYFTNMFAT WSPŠQARLHL QGRTNAWRPQ *** ****.: * *** **** ** ★ *** **** ***** *** *****

C2

IH

2223 VNNPKEWLQV DFQK7MKVTG VTTOGWSU T5HYVKEFLI SSSQDGHQWT

VSSAEEWLQV OLQKTVKVTG ITTQGVKSLL SSMYVKEFLV SSSQOGRRWT

VNDPKQWLQV OLQKTMKVTG IITQGVKSLF TSMFVKEFLI SSSQOGHHWT * **** * *** **** ******** ** ***** ****** **

Vazba fosfolipidu 2273 LFFQNGKVKy FQGNQDSFTPVYNSLDPPLL / ΚΓ WVH01ALKML

LFLQDGKTKV FQGNQDSSTP VVNÁLDPPLF TRYLRIHPTS WAQÍÍIÁLRLÉ QILYNGKVKV FQGNQDSSTP MMNSLDPPLL TRYLRIHPQI WEHQIALRLE * ** **********' ***** ******** * **** *