UA128304C2 - Мультиспецифічне антитіло до cd40 і cd137 - Google Patents

Мультиспецифічне антитіло до cd40 і cd137 Download PDF

Info

Publication number
UA128304C2
UA128304C2 UAA201901470A UAA201901470A UA128304C2 UA 128304 C2 UA128304 C2 UA 128304C2 UA A201901470 A UAA201901470 A UA A201901470A UA A201901470 A UAA201901470 A UA A201901470A UA 128304 C2 UA128304 C2 UA 128304C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sequence
heavy chain
antibody
antigen
binding
Prior art date
Application number
UAA201901470A
Other languages
English (en)
Inventor
Ізіл Алтінтас
Изил Алтинтас
Давід Сатейн
Давид Сатейн
Рік Радемакер
Рик Радемакер
Паул Паррен
Фредеріке Ґісеке
Фредерике Гисеке
Уґур Сахін
Угур САХИН
Original Assignee
Ґенмаб А/С
Генмаб А/С
Біонтех Се
Бионтех Се
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ґенмаб А/С, Генмаб А/С, Біонтех Се, Бионтех Се filed Critical Ґенмаб А/С
Publication of UA128304C2 publication Critical patent/UA128304C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

Винахід стосується мультиспецифічного антитіла, яке зв'язується з CD40 людини і CD137 людини, а також способу отримання такого мультиспецифічного антитіла і способу застосування такого мультиспецифічного антитіла для терапевтичного застосування.

Description

(54) МУЛЬТИСПЕЦИФІЧНЕ АНТИТІЛО ДО С040 І СО137 (57) Реферат:
Винахід стосується мультиспецифічного антитіла, яке зв'язується з СО40 людини і СО137 людини, а також способу отримання такого мультиспецифічного антитіла і способу застосування такого мультиспецифічного антитіла для терапевтичного застосування.
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Винахід стосується мультиспецифічних антитіл, які зв'язуються з СО40 і СО137 та до застосування таких мультиспецифічних антитіл, зокрема, до застосування для лікування онкологічних захворювань.
Попередній рівень техніки
СбО40 є членом родини рецепторів фактора некрозу пухлин (ТМЕ) і відомий як костимулюючий білок, виявлений на різних типах клітин. СО40 постійно експресується антигенпрезентуючими клітинами (АРС), які включають дендритні клітини (ОС), В-клітини і макрофаги. Він також може експресуватися ендотеліальними клітинами, тромбоцитами, гладком'язовими клітинами, фібробластами і епітеліальними клітинами. Відповідно до його широко поширеної експресії в нормальних клітинах, СО40 також експресується в широкому діапазоні пухлинних клітин.
Презентування пептидних антигенів в контексті молекул МНС класу ІЇ антиген-специфічними
Са з Т-клітинами разом з костимулюючими сигналами (від СЮО80О і/або СО86) призводить до активації СО4 ї- Т-клітин і до позитивної регуляції факторів ліцензування ОС (ОС Іісепвіпо): ліганда СО40 (СО401І) і лімфотоксин-а1ф82 (І Та1ф82). Експресія СО40Ї. і Ії Та1р2 на активованих антиген-специфічних СО4 я Т-клітинах індукує передачу сигналів через СО40 і І Тр-рецептор (ВК), ї це ліцензує ОС на індукцію СО8 ж Т-клітинних відповідей. Передача сигналів СО40 призводить до продукування інтерлейкіну-12 (1/-12) і до позитивної регуляції ліганда СО70,
Сорв6б, 4-188 (4-1881І), ліганда ОХ40 (ОХ401І) і СІТЕК (СІТКІ), тоді як передача сигналів ТВ призводить до продукування інтерферонів типу | (ІЕМ). Система сигналізації, яка контролює діяльність ядерного фактора каппа В (МЕ-КВ), реагує практично на всі члени суперродини ТМЕК.
Пов'язані з патогеном молекулярні структури (РАМР) і пов'язані з пошкодженнями молекулярні структури (ФАМР) також сприяють цим подіям. Прімірування СО8 - Т-клітин пептидами, рестриктованими за МНС класом І, призводить до позитивної регуляції СО27, 4-188, ОХ40 і глюкокортикоїд-індукованого ТМЕК-пов'язаного білка (СІТК). Стимуляція цих рецепторів на СО8 - Т-клітинах їх спорідненими лігандами суперродини ТМЕ в комбінації з 1-12 і ІРМ типу призводить до стійкої активації СО8 я Т-клітин, проліферації і ефекторних функції, а також до утворення і підтримування СО8 ї- Т-клітинної пам'яті. Антитіла проти СО40 можуть діяти по різному, вбивати пухлинні клітини, які експресують СО40, шляхом індукції антитілозалежної клітиноопосерекованої цитотоксичності (АДОСС), комплементзалежної цитотоксичності (СОС) або антитілозалежного клітиноопосерекованого фагоцитозу (АОСР), шляхом індукції клітинного сигналу, викликаючи прямий апоптоз або зупинку росту, але також, незалежно від експресії
СО040 на пухлинних клітинах, за допомогою ліцензування АРС для стимуляції протипухлинної імунної відповіді. Антитіла, які зв'язуються з СО40, можуть запускати СО40 на АРС для стимулювання ефекторних цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ) ії індукування вивільнення 1-2 цими клітинами і побічно активувати МК-клітини. Антитіла, які ссимулюють СО40, були описані в попередньому рівні техніки і включають СР-870,893, людське антитіло Їде2 (МО 2003/0401790); дацетузумаб, гуманізоване антитіло Їдое1 (МО 2000/075348) і Спі І об 7/4, химерне антитіло Їдс1 (05 2009/0074711). Крім того, було розкрите антагоністичне антитіло до СО40, люкатумумаб, людське антитіло Їде (МО 2002/028481).
СО0137 (4-188) також є членом родини ТМЕК. СО137 є костимулюючою молекулою на СО8 х і Сб04 я Т-клітинах, регуляторних Т-клітинах (Тгед), натуральних кілерних Т-клітинах (МК (Т)- клітини), В-клітинах і нейтрофілах. На Т-клітинах СО137 конститутивно не експресується, але активується при активації Т-клітинного рецептора (ТСК) (наприклад, на лімфоцитах, інфільтруючих пухлинах (ТІЇ) (Сто5 еї аї., у. Сіїп Іпмезі 2014; 124 (5): 2246 - 59)). Стимулювання його природним лігандом 4-18ВІ або антитілами-агоністами призводить до сигналізації з використанням ТКАБЕ-2 і ТКАРК-1 як адаптерів. Рання передача сигналів СО137 включає реакції поліубіквітінування К-63, які в кінцевому підсумку призводять до активації шляхів ядерного фактора (МЕ)-КВ ї мітоген-активованої протеїн (МАР)-кінази. Сигналізація призводить до посилення Т-клітинної костимуляції, проліферації, продукування цитокінів, дозрівання і тривалого виживання СО8 ж Т-клітин. Було показано, що агоністичні антитіла проти СО137 сприяють протипухлинному контролю Т-клітинами в різних доклінічних моделях (Митгійо еї аї.,
Сіїпй Сапсег Без 2008; 14 (21): 6895-906). Антитіла, які стимулюють СО137, можуть індукувати виживання і проліферацію Т клітин, тим самим посилюючи протипухлинну імунну відповідь.
Антитіла, які стимулюють СО137, були описані в попередньому рівні техніки і включають урелумаб, людське антитіло Ідс54 (АО2004279877) і утомілумаб, людське антитіло Їдс2 (Різпег еї ах. 2012 Сапсег Іттипо)ї. ІттипоїНег. 61: 1721-1733).
УМезімооса А, єї аї., еникетіа Кезеагсп 38 (2014 року), 948-954 розкривають "Комбіновану 60 терапію анти-СО137 і анти-СО40 антитілами в мишачій моделі тус-опосередкованих гемобластозів".
О05Б20090074711 розкриває "Лікування людини за допомогою химерного агоністічного антитіла проти СО40 людини".
Однак, незважаючи на ці та інші досягнення в цій галузі техніки, існує потреба в мультиспецифічних антитілах, які можуть зв'язуватися як з СО40, так і з СО137, одночасно зв'язуючись з СО40-експресуючими АРС і СО137-експресуючими Т-клітинами, тим самим приводячи ці типи клітин в тісний контакт. Це, в свою чергу, може призводити до активації обох типів клітин і ефективної індукції протипухлинного імунітету.
Сутність винаходу
Автори винаходу ідентифікували мультиспецифічні антитіла, які можуть зв'язуватися як з
С040, так і з СО137 і викликати активацію Т-клітин і АРС.
Отже, в одному аспекті винахід відноситься до мультиспецифічного антитіла, яке містить (І) першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40, і (ії) другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СО137 людини.
У деяких втіленнях винахід відноситься до такого мультиспецифічного антитіла, де перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельну область важкого і легкого ланцюга, які містять специфічні амінокислотні послідовності, необов'язково з мутаціями, або амінокислотні послідовності антитіла, яке конкурує або має специфічність антитіла, що містить такі специфічні амінокислотні послідовності. У конкретних втіленнях перша антигензв'язувальна область включає варіабельні послідовності важкого і легкого ланцюга, які містять СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 001 проти СО40, або антитіла, яке конкурує або має специфічність такого антитіла.
У деяких втіленнях винахід відноситься до такого мультиспецифічного антитіла, в якому друга антигензв'язувальна область включає варіабельні послідовності важкого і легкого ланцюга, де СОКІ, СОК2 і СОКЗ містять специфічні амінокислотні послідовності або мають специфічні амінокислотні послідовності, необов'язково з мутаціями, або містять амінокислотні послідовності антитіла, яке конкурує або має специфічність антитіла, що містить такі специфічні амінокислотні послідовності. У конкретних втіленнях друга антигензв'язувальна область включає варіабельні послідовності важкого і легкого ланцюга, що містять СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 001, 002, 003, 004, 005, 006, 007, 008, 009, 010, 011 або 012 проти СО137, або антитіла, яке конкурує або має специфічність будь-якого такого антитіла.
Ці та інші аспекти і втілення, включаючи нуклеїнові кислоти, що кодують амінокислотні послідовності таких мультиспецифічних антитіл; експресують вектори, що містять такі нуклеїнові кислоти; клітини-хазяїни, які містять такі нуклеїнові кислоти або експресують вектори; композиції, що містять такі мультиспецифічні антитіла; такі композиції для застосування при лікуванні онкологічних або інших захворювань; способи отримання таких мультиспецифічних антитіл; і діагностичні способи і набори, на основі таких мультиспецифічних антитіл, більш детально описані нижче.
Короткий опис креслень
Фігура 1: Вирівнювання послідовностей для СЮО137 людини, африканського слона і кабана.
Амінокислоти СО137 у африканського слона або дикого кабана, які відрізняються від таких в людській послідовності, виділені чорним.
Фігура 2: Змішані конструкції СО137, які включають СО137 домени африканського слона (перемішування-5) або дикого кабана (перемішування-1-4, б).
Фігура 3: Експресія змішаних конструкцій СО137 на клітинах НЕК293-117. Клітини НЕК293-
Т17 трансфіковані за допомогою змішаних конструкцій СО137. Експресію конструкцій на клітинній поверхні вимірювали способом проточної цитометрії, використовуючи поліклональне антитіло проти СО137, яке розпізнає СО137 людини, дикого кабана та африканського слона.
Фігура 4: Зв'язування клонів антитіла проти СО137 з змішаними конструкціями СО137, експресованими на клітинах НЕК293-117. Клітини НЕК293-117 трансфікованих змішаними конструкціями СО137 і СО137 людини (пПСО137 дикого типу), СО137 африканського слона або дикого кабана, як зазначено. Зв'язування різних клонів антитіл СО137 з цими конструкціями, експресованими на клітинах НЕК293-117, вимірювали способом проточної цитометрії. Як контроль показано фарбування поліклональних антитіл проти СО137.
Фігура 5: Матричні сітки для змішування (Маїйгіх-ІКе тіхіпд дгіав5), які використовуються для автоматичного виявлення біспецифічних антитіл. Батьківські антитіла можуть бути нанесені відповідно до вказівок. Потім батьківські антитіла можуть бути об'єднані для отримання біспецифічних антитіл з використанням простої матричної сітки для змішування. Потім можна здійснювати контрольований обмін Рар-плечей для одержання біспецифічних антитіл. 60 Фігура 6: Експресія СО40 і СО137 на клітинній поверхні стабільно трансдукованих клітин
НЕК293-МЕК-дір-ЇІис і К562. Клітини МЕ-кВ/293/5ЕР-Ї цс (А) і К562 (В) стабільно трансдуковані с0р40 або СО137. Поверхневу експресію СО40 (ліві панелі) і СО137 (праві панелі) визначали способом проточної цитометрії (білі криві: контроль без антитіла; сірі криві: фарбування антитілами).
Фігура 7: Аналіз біспецифічних антитіл, одночасно націлених на СО40 і С0137 (бра40хоср137). Біспецифічні антитіла, націлені на СО40 ії СО137 (СО40-РЕЕАЇ хСО137-ЕЕАВ), тестували в репортерному аналізі в двох повторностях (А-Ї: з СО40-001х20137-001 до СО40- 001х20137-012). Активацію СО137 вимірювали за активністю люциферази (відносні одиниці люмінесценції, КІ) МЕ-кВ/293/5ЕР-І ис, трансдуковані СО137 (НЕК293 МЕК СО137 аїр Іс) при інкубації з зазначеними біспецифічними антитілами і клітинами К562, трансдукованими сор40 (К562 С040) для трансактивації або клітинами К562 дикого типу (К562 м/) як контроль.
Активацію СО40 вимірювали за активністю олюциферази (КІ) МЕ-кВ/293/СЕР-Ї ис, трансфікованих СО40 (НЕК293 МЕК СО40 ор Іс) при інкубації з зазначеними біспецифічними антитілами, і К562, трансдукованих СО137 (К562 СО137) для транс-активації, або клітинами
К562 дикого типу (К562 м/) як контроль. Два моноспецифічних одновалентних антитіл з одним нерелевантних плечем (612-РЕАЇхСО0137-РЕАВ, 6Б12-ЕЕА! хСО40-РЕАК) використовували як контроль для біспецифічних антитіл проти СО40хСО137.
Фігура 8: Індукція проліферації СО8 я Т-клітин біспецифічними антитілами СО4О0хСО137 в антиген-неспецифічному аналізі Т-клітин. РВМС, мічені СЕЗЕ, інкубували з біспецифічними антитілами СО40хСО137 або моноспецифічними одновалентними контрольними антитілами протягом чотирьох днів. Проліферацію СО8 ї- клітин вимірювали за допомогою проточної цитометрії. Наведені дані є графіками СЕБЕ, що показують проліферацію СО8 ж Т-клітин, індуковану зазначеними біспецифічними і контрольними антитілами при 0,02 мкг/мл (А), процентний вміст клітин, що діляться і індекси проліферації для СО40-001-ЕЕАЇ хСО137-005-
ЕЕАВ (В), СО40-001-ЕЕАЇ хСО137-009-РЕАВ (С), СО40-001-РЕАЇ хСО137-003-ЕРЕАК (0) і СО040- 001-РГЕАЇ хСО137-011-РЕАК (Е), розраховані з використанням програмного забезпечення
Ніомо.
Фігура 9: Посилення проліферації СО8 «я Т-клітин біспецифічними антитілами СО4О0хСО137 в антигенспецифічному аналізі Т-клітин. Т-клітини, трансфіковані клаудин-б-специфічним ТОК і помічені СЕЗЕ, інкубували з незрілими ОС, електропорованими ІМТ-РНК клаудину-б, в присутності або за відсутності біспецифічних антитіл СО40хСО0137 або контрольних антитіл протягом п'яти днів. Проліферацію СО8 я Т-клітин вимірювали способом проточної цитометрії.
Наведені дані представлені у вигляді графіків СЕЗЕ, що показують проліферацію СО8 ж Т- клітин, індуковану зазначеними біспецифічними антитілами, і контролів при 0,02 мкг/мл (А), процентний вміст клітин, що діляться та індекси проліферації для зазначених біспецифічних антитіл (В) і для СО40- 001-РЕАЇ хСО137-005-РЕАК і контрольних антитіл (С) і СО40-001-
ЕЕАЇхСО0137-009-ЕЕАК і контрольних антитіл (0) в зазначених концентраціях, розраховані з використанням програмного забезпечення Ріом/)о. Також показані криві індексу проліферації для зазначених біспецифічних антитіл при серійних розведеннях в діапазоні від 6,4х107 до 5 мкг/мл (Е). Криві аналізували нелінійною регресією (сигмоїдальний дозозалежний ефект зі змінним нахилом) з використанням програмного забезпечення ОСгарпРай Ргізт 5 (СтарпРайд зоймаге, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Значення ЕСвхо для індукції проліферації Т-клітин для
СО40-001-РЕАЇ хСО137-005-РЕАК і СО40-001-ЕЕАЇ хСО137-009-ЕЕАК становили 0,005 і 0,030 мкг/мл, відповідно.
Фігура 10: Індукція проліферації СЮО8 я Т-клітин гуманізованим біспецифічним антитілом ср4б0хСО137 в не антигенспецифічному аналізі Т-клітин. Мічені СЕЗЕ РВМС інкубували з гуманізованим біспецифічним антитілом СО40хСО137, батьківським біспецифічним антитілом або контрольним антитілом Їд51 протягом чотирьох днів. Проліферацію СО8 ж- Т-клітин вимірювали способом проточної цитометрії. Показанні дані представляють процентний вміст клітин, що діляться та індекс проліферації, розрахований за допомогою програмного забезпечення БіІомлуо. (ма - не визначено)
Фігура 11: Посилення проліферації СО8 «я Т-клітин гуманізованим біспецифічним антитілом сбр40хСО0137 в антигенспецифічному аналізі Т-клітин. Т-клітини, трансфіковані клаудин-6- специфічним ТОК і помічені СЕЗЕ, інкубували з незрілими ОС, електропорованими ІМТ-РНК клаудину-б, в присутності або за відсутності гуманізованого біспецифічного антитіла
Срабхобр137 (Візх201-20040-001-НбІ С1-РЕАЇ хСО137- 009-НС7Ї 02 -БЕАК), батьківського біспецифічного антитіла або контрольного антитіла ЇдО1 протягом чотирьох днів. Проліферацію
СО8 ж- Т-клітин вимірювали способом проточної цитометрії. Показані дані представляють процентний вміст клітин, що діляться та індекси проліферації для зазначених антитіл, 60 розраховані з використанням програмного забезпечення ЕіІом/)о. (Ма « не визначено)
Фігура 12: ех мімо напрацювання Ті! з резекції тканини меланоми людини за допомогою біспецифічного антитіла СЮО40хСО137. Шматочки пухлини з резектованої тканини культивували з 100 од./мл 1-2 і зазначеною концентрацією біспецифічного антитіла СО40хСО137 (Ві5с1-
СО40-001-РЕАЇ хСО137-009-РЕАК). Після 14 днів культивування клітини збирали та аналізували способом проточної цитометрії. Показана відносна кількість життєздатних ТіЇ на зразок (нормалізували до 1000 виміряних гранул). Кожна точка даних відноситься до однієї комірки, що є напрацюванням ТІЇ. з двох шматочків пухлини, проаналізованих в одній пробірці ЕАС5. Лінія вказує середнє з п'яти виміряних зразків.
Фігура 13: Ех мімо напрацювання ТІЇ з резекції тканини недрібноклітинного раку легені людини (М5СІ С) за допомогою біспецифічного антитіла СО40хСО137. Шматочки пухлини з резектованої тканини МЗСІС культивували з 10 од./Мл 1-2 і зазначеною концентрацією біспецифічного антитіла СО4О0хСО137 (Віз1-С040-001 -РГЕАЇ хСО137-009-ЕЕАК). Через 10 днів культивування клітини збирали та аналізували способом проточної цитометрії. Показана відносна кількість життєздатних ТІЇ. на зразок (нормалізували до 1000 виміряних гранул). Кожна точка даних відноситься до однієї комірки, що представляє напрацювання ТІЇ. з двох шматочків пухлини, проаналізованих в одній пробірці ЕАС5. Лінія вказує середнє з п'яти виміряних зразків.
Таблиця 1
Послідовності послідовності (миша) 11111111 фУнсСова2г ////// ПРММОСТЇ 0 |ЇЗЕОЮМОг 7777777.7юрю фУНсСОВЗ // ТвВВЕУМОВМУУАСОУ // |ІЗЕОЮ МОЗ 11111111 фМ6соВі дл осіМММ 7777777 |ЇЗЕОюЮМОЯ Б: 111110 0Мсовна м Ї11111111 77111111. |М6соВз ///// ООУ5МІРУТ 0 |ЇЗЕОЮМО5
УН ЕМОГ ООБОРОЇ УКРОАБУКІЗВ | БЕО І МО:6 ско
СУТЕТЕМІМНУУКОЗНОКБІ Е
МО
СПРММОСТЗУМОКЕКОКАТМ ток
З5ЗГТОУМЕЇ В5І Т5ЕОБАМУМУУ
СТАВЕ ууавмМмУумАІ руусяоаті мм 5
М РІОМТОТТ55І 5АБІ СОВМТІТ | БЕО І МОГ
СА
ЗзОСІМММІ МУМООКРєраТУКИ мм тТ55І НБСОМРОВЕЗОЗОЗОТОУ 5І ТІ
МГЕРЕБПІАТУУСООМЗМІ РУТЕ сват
КІ ЕК
001 (кролик) 11111110 0УНСОоВа2 /////// М/ММсбАТ 0/0 |ЗЕ0ОЮМО9 71111111... И |УНСОВЗ ///// АНЗАМОАМУ5ТУВО / |ЗЕОЮМОлЛО у 11111111 фМсоВі 0 отІмМУ 777777 |Ї9ЗЕОюМОлЛ: 090 11111100 0Мсовна 7 КАБ/11111111Ї1111111111111 11111111 фМ6совнз 0 дОоМУУууо555ОУсСРУ 0 |ЗЕО0юЮМОле
Таблиця 1
Послідовності послідовності
УН ОБМЕЕБВОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | 5ЕО І МОЗ тТУБаЕ5
І 5БМАУ5МУВОАРОКИЇ ЕММІ ,МІМ/М
МОАТНУАТУАКОВЕТІЗКАЗТ
ТтУпІК
МТ5РТТЕОТАТУЕСАВЗАМОА
М5ТУ5 р'исоатіУТУ5о
М РІММТОТРАБМЕААМССТУТІК| БЕО ІС МО 714
СОАБО
ТІТММГ БУМ МООКРИОИОРРКІ СМ
КА5ТІ Т 5аУ5ЗВЕКОаБОаЗОИТтЕНТІ ТІ
РІГЕБОВБА
АТУУХСОМУУУС,аСЗЗБаМОЕМЕ аваоТЕУМУК клон 002 (кролик) 11111111 0УНСоВа2 МО МбАТ 0/0 |ЗЕОЮМОлв/З 11111111. И |УНСОВЗ ////// АНЗАММАМУ5ТУВМ / |ЗЕОЮ МОЛ 11111111 ДМЕСОВІ 7 ЕСІЗМ /////////////////// |Ї98ЕОЮМОлв 9 11111110 0Мсовна 7 КА Ї11111111111111 71171111..7.юрюЮ |М6совнз ///// о5УУБОаБІЗОУСЕМ 0 |ЗЕ0ОЮ МОЛ З
УН ОБМЕЕБОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | 5ЕО ІЮ МО С20 тТУБаЕ5
ГТУУАУТМУВОРРОКОИЇ ЕМЛИ
МОМ
САТАРАТУМАКОаВЕТМ5КМ5ТТ
УА КУ
Т5РТТЕОТАТУЕСАНЗАММАМУ
ЗзГУЗМ г мУсОстТІМТУ55
М РІММТОТРБУОБУБААМОИСТМТІМІ 5ЕО ІЮ МО 21
СОА5
ЕРІББМІ БМУМООКІ СОРРКИГІ
УКА5Т
ГЕЗБОУМРБЗАЕКОаЗО5ОИтТЕМТІ ТІ
ЗО Е5
ВрААТУУСОБМУУВОВІЗИМОЕ
Уугасат вУУМУК 003 (кролик) 11111111 фУнсСоВа2г 1 убОтТАТТ 0 |ЗЕОЮМОг3 711111111717.7.юИюИюИШ |УНСОВЗ ///// АВАВУЗООБЗУАМУУєМІ |ЗЕОЮМОгА 4 4- 11111111 фМ6соВі 7 0о5555.7.ЙюЮюююю777ю юю юю / |ЇЗЕОЮМОг5 1111100 0Мсовна 77777851 Її 11111111 0М6совнз /// досУрмуб55МНУрмМмт // |ЗЕ0ОЮМО2в
Таблиця 1
Послідовності послідовності
УН ОБМЕЕБОСОВІ МТРОТРІ ТІ ТО | БЕО ІЮ МОС27
ТА5
СЕТІБ5БУНМІМУНОАРОБЕСІ Е
М асрімастАТТОМАБУАКОСНЕТ
ІБ
КТ5ТТМОІ КМТ5І ТТЕОТАТМЕ
СА
ВАНУБОаСЗМАМУМЕМІ МИ,ОС
ТІМ
ТУ55
М. РІММТОТРАБМЕААМОИТМТІКІ| 5ЕО ІЮ МОС28
СО
АБОБІЗОМІ АМУООКРООРРК
І
МАТ5ТІ ЕБОУРЗНЕКОИа5ИТ
ЕН.
ТІБОГЕБАВСВААТУУСОСУПМ5 55М вУОоМТгасатТЕУМУК 004 (кролик) 11111111 фмнсова п Б5550ОТ 7 5БОЮМОоЗ0о 4 11111111 ЇМНсовВЗ 7 (АВЕООУМОРМ / 5БОЮМОоЗІ 4-9 11111111 фмесоВт //// О5ІЄМ 50 МОЗе 111 фмМесова.////// 1бА6СС7/С/С/777777777777111711 11111111 ЇМесСоВЗ / (АСОРРОГОТМАА.д/ 0 5ЕБОЮМОЗЗ
ЕЕ
ТАБ
95І ЗАХО М5МУВОАРОКаЇ ЕІ
СМІ5 55ЗастМУАМУАКОВАЕТІЗКТ5
Мо
ЇКІТРТТЕОТАТУЕСАНЕСО У
М/ОЕМ
ІМОаРОТІ УТУ55
ЕЕ
МСОА
ЗОБІЗМІ Г АММООКРООРРКІ.
Пма
АБ5ТІ АБМРОНЕБОБОБОТЕБЕ
ТІ ТІ5
ОГЕБОСААТУУСАССЕРОЇ ОТ
МААЕ сСОСТЕАММТ 005 (кролик) 11111111 |Мнсова ЛП Т5А5ТТ 0 5БОЮМОоЗз; 4 71111111 ЇМНсоВЗ /// дАВБТУТОТ5ОУУРОЄ, 0 5БОЮ МОЗ 11111111 фмМесоВт // О5БУМаМА 7 50 МОз39 111 фмМесова. 7 5А6ССС7777717771111111111 77771111 фМ6сояЗ // ПОБУОСОБАОСРА З 05БОЮМО40 4 4- б
Таблиця 1
Послідовності послідовності
УН ОБМЕЕБаОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | БЕО ІЮ МО:
ТАБОа
ЕТІБОЕНУТМУВОАРОКИаЇ ЕМУ
ІСТІ
ІТФАЗТТАМАТМ АВС ВЕТІЗКО
ЗГТУ
МКІМБРТТЕОТАТУЕСАН5ЗТУ тТОт5 сУУгогРмаості УТУ55
М АОМІ ТОТАБРУБААМСИИТМІІМ | БЕО ІЮ МО 42
СОо55
ОБІММОаМАІ БМ МООКРИОаОРР
КО ШУ
АБ5БТІ АБСУЗЗНЕКОЗОБИаТОГ
ТАІБО
МОБОРААТУМСІ СЗУОСОБА
ОСЕАБО ватЕММУМУЕ 006 (кролик) 11111111 фУнсоваг ///// 8т5ОІТ 7/7 |Ї9ЗЕОюЮМОмА 771111117177.7.7юЮюЮШ |УНсСОВЗ ///// АВІМОРООУУВУРОЄ, / |ЗЕОЮМОм5 11111111 ЇМесСОВІ 7 ЕЗІАБМ ////////// |Ї9ЗЕОЮМОяв 11111110 0Мсовна 7 Аа Її 11111111. ЇМ-СОВЗ ///// ОЗАРУУЗ5Б5ОМА 0/0 |ЗЕОЮМОм,
УН ОБМЕЕБаОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | БЕО ІЮ МО:48 тТУБаЕ5
І 5БМАМ5УУВОАРИКИаЇ ЕМ ато ,іІТУМАБУАКОаВЕТІЗКТЗТММУ
ОІГКІТ
ЗРІТТЕОТАТУЕСАВІ МСОБГОВУ
УВУБОгЕ маг сті МТУ
М АІЕГТОТРУБУБААМСИТУМТІМ | БЕО ІЮ МО 49
СОАБЕ
ЗІАЗМІ АМУМООКРООРРКІ СМ
ААУ
АБОУРБАЕК,аБЗОа5ЗаИтЕМТІ ТІ
ЗамовБА рААТУУСОБАЕєМУ5ЗО5ЗОМАБИ аватЕМУмМм
УК
007 (кролик) 11111111 фУнсова2г ///// оБ50О5А. 77777777 ІЗЕОЮМОві 11111111. фУНсСОВІ ///// АВОМ/МОУММАНОЇ 0 |ЗЕОЮ Мова 11111111 ЇМеСОВІ ЛО МТ5КБА 0 |ЗЕОЮМО5З 11111110 0Мсовна 7 КАС Її 11111111 0М6совз /// дАлосУУМБоріМР) 0 |ЗЕ0ОЮ Мов
Таблиця 1
Послідовності послідовності
УН О5І ЕЕЗБОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | 5ЕО ІЮ МО:55
ТАБОЕ5
І 5520У5МУВОАРОКОИЇ ЕМІС гаБо аБАНУАТУМУКОВЕТІ5КТ5ТТ
МОГКІТ
ЗРІТЕОТАТУЕЄСАВОМ/ МОУ
АНОГМ/ сРОаТтІ МТУ55
М АОМІ ТОТТ5РУБААМСИТМТІМ| 5ЕО І МО:56
СОА5
ОЇМТ5КБАЇ БМУМООКРООРРА
ГУК
АБ5ТІ АБСУМРОНЕЗОаЗОБИаТОГ
ТІ ТІ
ОГЕЗБОрААТУУСАСОИМУМИ
РІ МРЕ аваоТЕУМУК 008 (кролик) 11111111 фУнсова2г 8550 МТ 0 |9ЗЕОЮМО58 7711717171717171717.7.7юИюЮИШ |УНСОВЗ ///// АВЕСОУМОРМ! 0 |ЗЕ0ОЮ Мов 11111111 фМ6соВі 0 о5ІЗМ 0 |Ї9ЗЕОЮ Моб 11111110 0Мсовна 777 ВАЗ Її 11111111 ЇМСОВЗ ///// АОСЕРОІОТОАТ 0/0 |ЗЕОЮ Моб
УН О5І ЕЕЗБОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | 5ЕО ІЮ МО:62
ТАБОЕ5І.
З5ХОМ5УМУВОАРОКИаЇ ЕМІС
УЗ5Б5а
МТУМАБУУАКЗАЕТІЗКТОТТУЮ
/КІТ5
РІТТЕОТАТУЕСАВЕСОУМ/ ОЕМ
Їжа РО
ТІ МТУ55
М АОМІ ТОТРУБУБААМСИаИТУМТІ | БЕО І МО:6З
МСОА5
ОБІЗМІИ АМУМООКРООВРАГІ.
ІУВА5
ТП АБИаУРБЗАЕКОаБОа5ИатТЕНТІ
ТІБОЇГ Е
ЗЕВААТУУСАСаЕРОЇ ЮОТаАТ гассат
ЕАУМТ
009 (кролик) 11111111 фУнсоваг ///// рувоВ //////////// |9ЗЕОЮМО65 11111111. фУНнсСОовВІ АОС ТУСРОЇ 0 |ЗЕОЮМОбв 11111111 ДМЕСОВІ 7 ЕСІЗЗМ //////////////// |98ЕОЮ Моб; 11111111 фМсовна 7 бАБ77111 Її 11111111 |М6совЗ // 1НУУАТІЗОІСУА 0 (ЗБОЮ Моб
Таблиця 1
Послідовності послідовності
УН О5І ЕЕЗБОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | 5ЕО ІЮ МО:69 тТУуза
ЕБІМО УМ МБУУМВОАРИКаЇ Е
МО
УруУОБІ УХАБУМАКОСВЕТІВ вет
ТУМОІ КМТ5І ТТЕОТАТУЕСАН ааІт
УусгріжмаРрРатімутУзо
М РІММТОТРАБУБЕРУСИТУТІМІ БЕО І МО:70
СОА
ЗЕВІЗБМІ АММООКРООВРКА
Па
АБОЇ АБЕУРЗАЕБАЗОБИаТЕМУ
АЇІ ТІ5
ОГЕЗБАВААТУУСНУМАТІЗИЇ С
УАга ваТтЕУМУУК 010 (кролик) 11111111 фУнсоваг ///// УУрмМоМі 0 |9ЗЕ0ОЮМО72 711111111177.7.юИюИ |УНсСОВЗ ///// АВЗАРОБМУЗТУЄМ / |ЗЕ0ОЮ МОЗ 11111111 фМ6соВі 0 ЕЗІЗММ 0 |8Е0ОЮМО74 4 4- 11111110 0Мсовна 7 КА Ї111111111111 11111111... |М-сСОВЗ ОТ МУСО5З5ЗОМОРА 0 |ЗЕ0ОЮМО75
УН ОБМЕЕБаОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | 5ЕО ІЮ МО:76
ТУБаЕ5І.
ЗГУАМІМУВОАРОКаИЇГ ЕМ М
УчоМО
МІЗНАТМУКОВЕТІЗКТОТТУС
І ЕІТ5Р
ТТЕОТАТУЕСАВНЗАРИЗМ5ТУ
ЕМІ МС
ОоатТіУТУ55
М РІММТОТРАБМЕААМССТУТІК| БЕО ІЮ МО:77
СОА5
ЕБІБЗММІ АМ/МООКРОСРРКИ І
УКАБ5
ТП АБОУБЗАЕКаБаЗОТЕНТІ
ТІБОЇ.
ЕЗАВААТУМСОТМУСС55БОМ
СЕАБ аваоТЕУМУК 011 (кролик) 11111111 фУнСоВа2г ////// лАМООМТ ЗБОЮ МО79 71111111111717.7.ИюИюЮИ |УНСОВЗ ///// АВСУЗЕОБУМС // |ЗЕОЮ Мово 11111111 фМ6соВі ////// ОМЕММ 0 |Ї9ЗЕОЮ МОВ 1111100 0Мсовна 77777 01511111 11111111 фМ6совнз // ООоУспРУМоМі 0 |Ї8Е0ОЮМОв2
Таблиця 1
Послідовності послідовності
УН О5І ЕЕЗОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | 5ЕО ІЮ МО:83
ТУ.
З5УНМСМУВОАРОКИЇ ЕМІС
УлЛАУС,СО
МТУМАМУАКОаВЕТІЗКТОТТМ
РІ ВІТ5
РІТТЕОТАТУЕСАНОИМ5ЕОБУМУ сжмар ст МТУ55
М АМОМТОТРАБУЕААМСИтТмтТІі | БЕО ІЮ МО:84
КСОА5
ОМІЕММГ АММОСОКРООРРКИЇ
ІМОоТ5 кі т5амМмРЗАЕЗОЗОЗаТОЕТІ. тІЗОМО
ЗВОААТУУСОООВМСПЕМОМІЕ аАваотЕ
УМУК
012 (кролик) 11111111 фУнсова2г 0 м5о5о5Т //0/0//0/0/000 |9ЗЕОЮМОв8в 711111111717.7.7юИюЮИШ |УНсСОВЗ ///// АВОСОМУАСМУСУАТОАРОР (ЗБОЮ МОВ ( 11111111 фМ6соВі ом 0 |98Е0ОЮМОв88 11111100 0Мсовна 7 5АВ1111111111111 Її 11111111 |М6совз 0 тТОвУМ5ОТОТЕМ 0/0 |ЗЕОЮМОв895
УН ОБМЕЕБаОСВІ МТРОТРІ ТІ ТО | БЕО ІЮ МО:90
ТУБаЕ5І.
ЗВУУМ ТМ УВОАРОКИЇ ЕМІСІ м5авза
ЗГУХАБМАКОВЕТІЗКТООІТІ.
ЕКІТ5
РТТЕОТАІМЕСАНОС ОМАСМ С
УАТОАЕ рРєРУСРСТІ МУТУ55
М ААМІ ТОТРОРУБААМОСИТУМТІВІ| 5ЕО ІЮ МОС91
СОАБО
ЗУМУОМ5І І ЗМ гОККРООРРКІ.
ПУБА5
АББааМРОВЕКОЗОЗаТОЕТтІ.
ТІБОГ Е5
ВрААТУУСТОаВуУМЗОТОТЕМЕ авастЕМ
УК
Таблиця 1
Послідовності послідовності
СО0137 людини МОаМ5СУМІМАТИ І МІ МЕРЕВТАЇ| 5ЕО 1 МО:92 (ТМАЗУ Нитап) ЗІ ООРСЗМСРАСТЕСОММАМ
ОІС5БРСРРМЗБЕЗБАСОЯОВТСО
ІСВОСКОУРАТАКЕС55ТЗМА
ЕСОСТРОЕНСІ ЧаАлаС5МСЕО роскоОсСоОєІ! ТККасСКоСсСРатТт
ЕМООКАСІСАРМТМСО5І ВОСК
ЗМІ МУМОТКЕВНОУМСОРБРАПВІ.
ЗРОАБЗББОМТРРАРАНЕРОН5УРО
ПЗЕРГАГТ5ТАТІ РІГ ЕРІ ТІ ВЕ
ЗМУКАОВАККІ І МІЕКОРЕМАР
МОТТОЕЕООС5СВЕРЕЕЕЕС
СС.
СО137 людини МОаМ5СУМІМАТИ І МІ МЕРЕВТА| 5ЕО 10 МО:93 перемішування-б ЗМРОРСБМОБАСТЕСОКМОЕ (амінокислоти 24-47, ГСМРСОРРМБЕЗЗАСИаОВТООІ заміна СЮО137 дикого СВОСКОМЕВТАКЕС5З5ТОМА кабана) ЕСОСТРОЕНСІ ЧОХОСЗМСЕО роскоОсСоОєІ! ТККасСКоСсСРатТт
ЕМООКАСІСАРМТМСО5І ВОСК
ЗМІ МУМОТКЕВНОУМСОРБРАПВІ.
ЗРОАБЗББОМТРРАРАНЕРОН5УРО
ПЗЕРГАСТОТАС саТсеї.
СО137 людини МОаМ5СУМІМАТИ І МІ МЕЕВТА| 5ЕО 1О МО:94 перемішування-5 ЗГООРСЗМСРАССТЕСОММАМ (амінокислоти 48-88, ОІС5РОРІ МЗЕЗБЗЇ ТОСОММСО заміна СО137 МОСВКСЕСУЕКТКВАС5ЗРТАО африканского слона) АЕСЕСТРОЕНСЇ аААССЗМСЕ
ООСКОСОЕІ ТККОСКОССЕО
ТЕМПООКАСІСАРМУТМОБІ ОССК
ЗМІ МУМОТКЕВНОУМСОРБРАПВІ.
ЗРОАБЗББОМТРРАРАНЕРОН5УРО
ПЗЕРГАГТ5ТАТІ РІГ ЕРІ ТІ ВЕ
ЗМУКАОВАККІ І МІЕКОРЕМАР
МОТТОЕЕООС5СВЕРЕЕЕЕС
СС.
СО137 людини МОаМ5СУМІМАТИ І МІ МЕЕВТА| 5ЕО 1 МО:95 перемішування-4 ЗГООРСЗМСРАССТЕСОММАМ (амінокислоти 89- ОІС5РСОРРМБЕЗЗАСССОВТОСО 114, заміна СО137 ІСВОСКОУРАТАКЕС55ТЗМА дикого кабана) ЕСОСМРОЕВСІ ОАССАМСЕЕ
УсоОовОЕ ТОКаскосСсРатТ
ЕМООКАСІСАРМТМСО5І ВОСК
ЗМІ МУМОТКЕВНОУМСОРБРАПВІ.
ЗРОАБЗББОМТРРАРАНЕРОН5УРО
ПЗЕРГАГТ5ТАТІ РІГ ЕРІ ТІ ВЕ
ЗМУКАОВАККІ І МІЕКОРЕМАР
МОТТОЕЕООС5СВЕРЕЕЕЕС
СС.
Таблиця 1
Послідовності послідовності
СО0137 людини МОаМ5СУМІМАТИ І МІ МЕЕВТА| 5ЕО 10 МО:96 перемішування-3 ЗГООРСЗМСРАССТЕСОММАМ (амінокислоти 115- ОІС5РСОРРМБЕЗЗАСССОВТОСО 138, заміна СО137 ІСВОСКОУРАТАКЕС55ТЗМА дикого кабана) ЕСОСТРОЕНСІ ЧОАОС5МСЕО
РСКОСОБ!І ТКЕССКОС5ЕСТ
ЕМОЕЕНОУМСАРМТОС5І ССЯК
ЗМІ МУМОТКЕВНОУМСОРБРАПВІ.
ЗРОАБЗББОМТРРАРАНЕРОН5УРО
ПЗЕРГАГТ5ТАТІ РІГ ЕРІ ТІ ВЕ
ЗМУКАОВАККІ І МІЕКОРЕМАР
МОТТОЕЕООС5СВЕРЕЕЕЕС
СС.
СО137 людини МОаМ5СУМІМАТИ І МІ МЕЕВТА| 5ЕО 10 МО:97 перемішування-2 ЗГООРСЗМСРАССТЕСОММАМ (амінокислоти 139- ОІС5РСОРРМБЕЗЗАСССОВТОСО 161, заміна СО137 ІСВОСКОУРАТАКЕС55ТЗМА дикого кабана) ЕСОСТРОЕНСІ ЧОАОС5МСЕО роскоОсСоОєІ! ТККасСКоСсСРатТт
ЕМООКАСІСАРМТМСО5БІ ДОКР
МММаТкКАВОУМСОРАРАПВІ.
ЗРОАБЗББОМТРРАРАНЕРОН5УРО
ПЗЕРГАГТ5ТАТІ РІГ ЕРІ ТІ ВЕ
ЗМУКАОВАККІ І МІЕКОРЕМАР
МОТТОЕЕООС5СВЕРЕЕЕЕС
СС.
СО137 людини МОаМ5СУМІМАТИ І МІ МЕРЕВТА| 5ЕО 10 МО:98 перемішування-1 ЗГООРСЗМСРАССТЕСОММАМ (амінокислоти 162- ОІС5РСОРРМБЕЗЗАСССОВТОСО 186, заміна СО137 ІСВОСКОУРАТАКЕС55ТЗМА дикого кабана) ЕСОСТРОЕНСІ ЧОАОС5МСЕО роскоОсСоОєІ! ТККасСКоСсСРатТт
ЕМООКАСІСАРМТМСО5І ВОСК
ЗМІ МУМОТКЕНОУУМСОРОРТОЄ
ЗРОТРОТТМРУРОСЕРОНТ5
НІ5ЕРГАГТ5ТАГІ НЕБІ ТІ В
ЕБМУКВСОАККИ МІЕЄКОРЕМА
РУМОТТОЕЕРОаСЗСВАЕРЕЕЕЕ
СОС. 11111111 0МнсСова2 ///// МРУМОМК 0 |5ЕОЮ моло 11111111 дМНсСОВЗ3 ///// АВУСРУБМООБРООМУУМОМ|5ЕОІЮ МОЛОЇ 11111111 рмесові 0 нБІВБВАЇГ//////////////// (50 МмОлог 11111 дрмесона. 68111111 11111111 0М6сСоВЗ //// ОМУСАЗБУТ 0 |5ЕОЮМОлоз
УН ОМОГ МОБСОАЕМККРОАБУКМУ |5ЕО ІЮ МО:104
ЗСОАБОУАЕ5МЕМІНУУВОАР
СОВЕЕММОУЛМРУМОМКЕБ5
АКРООВУТЕТАОТ5АМТАУМЕ
ІАБІ ВБАОТАМУУСАНМО РУБ
М ОО5РООЮМУУМОУУМСКИТТ
МІм55
Таблиця 1
Послідовності послідовності
МІ. ЕІМГТО5РОТІ 5І 5РОЕВАТЕЗ5 | БЕО І МО:105
САЗ5ЗН5ЗІВБАВМАМ УОНКРО
ОАРВІ МІНОМ5МААБИІ5ОВЕ5 аБабБатТОгЕТІТІТАМЕРЕОРАЇ.
УУСОМУСАБЗББУТЕРООСТКІ ЕВ
К
ІДС т(а) область СОРРЕЕРОММУТІ РРЗАОЕГЇТКМІ ЗЕО І МО:106
СснЗ ОМ5І ТС УКОЕУРБОІАМЕМ/Е
ЗМООРЕММУКТТРРМ ОБО
ЕР МК ТМОКЗ НУМО СС ММ
С5УМНЕАЇІ НМНУТОКБІ 5І Р ок
Ідс1т(О область СОРРЕЕРОММУТІ РРОВЕЄЕМТК |5ЕО І МО:107
СснЗ МОМБІ ТОЇ МКОЕМРБЗОІАМЕМУ
ЕБМСООРЕММУКТТРРМІ О5ОС
ЗЕРГ УК ТМОКБАУМОС,ММЕ
ЗСБУМНЕАЇІ НМНУТОКЗБІ 51 5
РОК
ІДС1 т(ах) область СОРЕЕРОММТІ РРЗАВОЕЇ ТКМІ 5ЕО І МО:108
СснЗ ОМ5І ТС УКОЕУРБОІАМЕМ/Е
ЗМООРЕММУКТТРРМ ОБО
ЕР МК ТМОКЗ НУМО СС ММ
С5УМНЕІ НМНУТОКОБІ 5І 5Р ок константна область АБТКОРБОМУЕРІ АРЗОБКЗТИС | БЕО І МО109 важкого ланцюга ТААГасСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ/М
Іде - МТ" БВОАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О5511 У 5І 55ММТУРБББІ СТОТМІСММ
МНКРОУЬМТКМОКАМЕРКОСОКТ
НТОРРСОРАРЕГ І СОРБМБІ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМОМ
ЗНЕОРЕМКЕМУ УУМрРИаМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУ5МІ Т
МІНОУЛ МОКЕУКСКУЗМКА
ІГРАРІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУ
ТГРРОЬВЕЕМТКМОМ5І ТС УК
СЕМРБЗБОІАМЕЖМ ЕБМСООРЕМММ
КТТРРМІ'ОБОО5ЕРІ У5КІ ТО
КЗАУ.МОССМУЕ5С5УМНЕАЇ Н
МНУТОКБІ БІ ЗРхгак
Таблиця 1
Послідовності послідовності константна область АБТКОРБМЕРІ АРЗБК5ОТ5ОИ | БЕО ІЮ МО:110 важкого ланцюга ТААГасСІ МКОМЕРЕРУТУБМ/М
Іде - Г405І" ЗОАЇ ТЗОУНТЕРАМІ О5551 У
ЗІ 55ММТУРБББІ ТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКВСОКТ
НТСРРСОРАРЕЇГІ СОРБМБЕЇ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСМУМОМ
ЗНЕОРЕМКЕММ УУрамМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМОТУВМУУ5МІ Т
МЕНОСОМІ МОКЕУКСКУВМКА
ІГРАРІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУ
ТГРРОЕВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УК
СЕМРБЗОІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУ
КТТРРМ'О5БрОБЕРШ УК ТМ
К5АУМОССМУЕЗС5УМНЕАІ Н
МНМУТОКБІ 5І Рак константна область АБТКОРБМЕРІ АРЗБК5ОТ5ОИ | БЕО ІЮ МО:111 важкого ланцюга ТААГасСІ МКОМЕРЕРУТУБМ/М
Іст - К409в" ЗОАЇ ТЗОУНТЕРАМІ О5551 У
ЗІ 55ММТУРБББІ ТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКВСОКТ
НТСРРСОРАРЕЇГІ СОРБМБЕЇ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСМУМОМ
ЗНЕОРЕМКЕММ УУрамМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМОТУВМУУ5МІ Т
МЕНОСОМІ МОКЕУКСКУВМКА
ІГРАРІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУ
ТГРРОЕВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УК
СЕМРБЗОІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУ
КТТРРМ'ОБОО5ЕРІ ЗВІТУ
К5АУМОССМУЕЗС5УМНЕАІ Н
МНМУТОКБІ 5І Рак константна АБТКОРБМЕРІ АРЗБК5ОТ5ОИ | БЕО ІЮ МО:112 послідовність ТААГ ЯаСІ МКОМЕРЕРУТУБУУМ важкого ланцюга ЗА Т5СУНТЕРАМІ О55О1. У
ЇІДСО1 людини с ЗІ 55 ТУРУ А ТОГМІСММ
ЕЕАВ" МНКРОМТКМОКАМЕРКВСОКТ
НТСОРРСРАРЕЕЕСОРБУРБІ ЕР
РКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУММАМ
ЗНЕОРЕМКЕММ УУрамМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМОТУВМУУ5МІ Т
МЕНОСОМІ МОКЕУКСКУВМКА
ІГРАРІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУ
ТГРРОЕВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УК
СЕМРБЗОІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУ
КТТРРМ'ОБОО5ЕРІ ЗВІТУ
К5АУМОССМУЕЗС5УМНЕАІ Н
МНМУТОКБІ 5І Рак
Таблиця 1
Послідовності послідовності константна АБТКОРБОМЕРІ АРЗБКОТ5ИС | БЕО ІЮ МО:113 послідовність ТААГ ЯаСІ МКОМЕРЕРУТУБУУМ важкого ланцюга ЗА Т5СУНТЕРАМІ О55О1. У
ІдО1 людини с РЕА" 5І 55ММТМРБУББІ ЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКВСОКТ
НТОРРСОРАРЕЕЕСОРБМГІ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМАМ
ЗНЕОРЕМКЕММ УУрамМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМОТУНУМ5МІ Т
МЕНОСОМІ МОКЕУКСКУВМКА
І РАРІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУ
ТГРРОЕВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УК
СЕМРБЗОІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУ
КТТРРМ'О5БрОБЕРШ УК ТМ
КО5АУМООСМУЕ5СЗ5УМНЕАН
МНМУТОКБІ 5І Рак константна АТУМААРБЗМЕЇЕРРБОЕОЇІ КБОИТІ 5ЕО ІЮ МО:114 послідовністьлегкого АБУМСІ І ММЕМРАЕАКМОМ КУ ланцюга каппа РОМА О5БаМЗОЕЗУТЕООБКО людини ЗУБІ 55ТІ ТІ БКАОМЕКНКМУУ
АСЕМТНОСІ 55РУТК5ЕМВОЕ
С
С040 людини МУВІ РГОСМІ М/С І ТАМНРЕ | 5ЕО ІЮ МО 115
РРТАСВЕКОМІИ ІМ5БОСС5І СО
РООКІ МБОСТЕЕТЕТЕСІ РСО
ЕБЕР ОТМУ/МАЕТНСНОНКМУС
ОРМ'С АУСОКаТтЕТОТІСТ
СЕЕСМ/НСТО5ЕАСЕБСМІ НА5
С5РОРОУКОІЇІАТОМ5ОТІСЕРС
РУСЕРЕЗММ55АРЕКСНРМТ5О
ЕТКОЇ УМООСОАДОТМКТОУУСа Р
ОЮОВІ ВАГ УМІРІИЕИЇІ БА І МІ М
ЕІККМАККРІТМКАРНРКОЕРО
ЕІМЕРООЇ РОБМТААРМОЕТІ Н
ССОРМТОЕРОКЕЗНІЗМОЕН о константна АБТКОРБОБМУЕРІ АРОБКОТ5ИС | 5ЕО ІО МО: 116 послідовністьважкого ТААГ ЯаСІ МКОМЕРЕРУТУБУУМ ланцюга ІдсС1 ЗА Т5СУНТЕРАМІ О55О1. У людини с РЕА" 5І 55ММТМРБУББІ ЕТОТМІСММ
МНКРОМТКМОКАМЕРКВСОКТ
НТОРРСОРАРЕЕЕСОРБМГІ ЕР
РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМАМ
ЗНЕОРЕМКЕММ УУрамМЕМНМ
АКТКРАЕЕОУМОТУНУМ5МІ Т
МЕНОСОМІ МОКЕУКСКУВМКА
І РАРІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУ
ТГРРОЕВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УК
СЕМРБЗОІАМЕМ ЕЄМСОРЕММУ
КТТРРМІ ОБОС5БЕРІ У5КІ ТО
КО5АУМООСМУЕ5СЗ5УМНЕАН
МНМУТОКБІ 5І Рак
Таблиця 1
Послідовності послідовності
Ун-С040-001-НОб УН ЕМО МОБСОАЕУККРОАБМУКМ5І 5ЕО І МО:117
СКТ5аУТЕТтТЕМІМНУУНОАРО
ОСІ ЕМИМОСІПРМИМОСТОММО
КЕОаАМТМТУОКОТОТамМЕїг. 55І ВБЕОТАМУМСТАНЕУХУОа В
МУМАГ УМ аОСстІ МУЗ
Ср40-001-НОб НО, да ЕМО МОБСОАЕУККРОАБМУКМ5І 5ЕО ІЮ МО:118
СКТ5аУТЕТтТЕМІМНУУНОАРО
ОСІ ЕМИМОСІПРМИМОСТОММО
КЕОаАМТМТУОКТОТамМЕїГ. 55І ВБЕОТАМУМСТАНЕУХУОа В
МУМАГ ОМ СОСТІ МТМ55А5Т
КОРБОМЕРІ АРОБКОТООСИТАА гасі мМкоОМЕРЕРУТУБУМ5ОА
І Т5аУНТЕРАМІ 0551 51 5
ЗММТУРБББІ ТОТМІСМММН
КРОЬМТКУОКАМЕРКЗСОКТНТ
СРРСОРАРЕЇЇ СОРБМРІ ЕРРК
РКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМОУ5
НЕОРЕУКЕМУ МУССМЕМНМА
КТКРЕЕЕОУМ5ТУВУУ5М ТМ
ГНОБУЛІ МОКЕУКСКМУ5МКАЇГ.
РАРІЕКТІЗКАКИаОРАВЕРОМУТ
ГРРОВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УКа
ЕМРЗПІАМЕМЖМЕЗБМООРЕММУК
ТТРРМ'ЮБРОаБЕРІ М5КІ ТОК
ЗВУМОСОММЕ5СВМУМНЕАЇ НМ
НУТОКОБІ 5І 5РОК
СОр40-001-НОб6-ЕЕАЇ | НС, ІДС РЕА. ЕМО МОБСОАЕУККРОАБМУКМ5І 5ЕО ІЮ МО:119
СКТ5аУТЕТтТЕМІМНУУНОАРО
ОСІ ЕМИМОСІПРМИМОСТОММО
КЕОаАМТМТУОКТОТамМЕїГ. 55І ВБЕОТАМУМСТАНЕУХУОа В
МУМАГ ОМ СОСТІ МТМ55А5Т
КОРБОМЕРІ АРОБКОТООСИТАА гасі мУкКоОМЕРЕРУТУБУУМ5ОА
І Т5амНтТЕРАМІ 0551 51 5
ЗММТУРБББІ ТОТМІСМММН
КРОЬМТКУОКАМЕРКЗСОКТНТ
СРРОРАРЕЕЕСОРБМУРБІЕРРК
РКОТІ МІЗВАВТРЕУТСУУМАМУ5
НЕОРЕУКЕМУ МУССМЕМНМА
КТКРЕЕЕОУМ5ТУВУУ5М ТМ
ГНОБУЛІ МОКЕУКСКМУ5МКАЇГ.
РАРІЕКТІЗКАКИаОРАВЕРОМУТ
ГРРОВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УКа
ЕМРЗПІАМЕМЖМЕЗБМООРЕММУК
ТТРРИ ОЗОССЯБЕБШІ КІСТОК
ЗВУМОСОММЕЗСОУМНЕА НМ
НУТОКБІ 5І 5РОК
Таблиця 1
Послідовності послідовності
СОр40-001-НОС6-ЕЕАВІ НС, ІДС! ГЕАВ ЕМО МОБСОАЕУККРОАБМУКМ5І 5ЕО ІЮ МО:120
СКТ5аУТЕТтТЕМІМНУУНОАРО
ОСІ ЕМИМОСІПРМИМОСТОММО
КЕОаАМТМТУОКТОТамМЕїГ. 55І ВБЕОТАМУМСТАНЕУХУОа В
МУМАГ ОМ СОСТІ МТМ55А5Т
КОРБОМЕРІ АРОБКОТООСИТАА гасі мУкКоОМЕРЕРУТУБУУМ5ОА
І Т5аУНТЕРАМІ 0551 51 5
ЗММТУРБББІ ТОТМІСМММН
КРОЬМТКУОКАМЕРКЗСОКТНТ
СРРОРАРЕЕЕСОРБМУРБІЕРРК
РКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМАМУ5
НЕОРЕУКЕМУ МУССМЕМНМА
КТКРЕЕЕОУМ5ТУВУУ5М ТМ
ГНОБУЛІ МОКЕУКСКМУ5МКАЇГ.
РАРІЕКТІЗКАКИаОРАВЕРОМУТ
ГРРОВЕЕМТКМОМ5БІ ТС УКа
ЕМРЗПІАМЕМЖМЕЗБМООРЕММУК
ТТРРМ'ОБравзеЕРІ МВ ТУОК
ЗВУМОСОММЕЗСВМУМНЕАЇ НМ
НУТОКБІ 5І 5РОК
МІ-2040-001-І С1 М. РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТІ| 5ЕО ІЮ МО 121
СБАБОСІМММІ МУ МООКРаК
АУКІ /ПІМУТ551І НБОМРОЗАЕБО
БаБаТОМТЕТІЗБІ ОРЕОІАТУ
УСООУ5МІ РИТЕОССОТКМЕК
Ср40-001-І 01 І С, каппа РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТІ| 5ЕО ІЮ МО: 122
СБАБОСІМММІ МУ МООКРаК
АУКІ /ПІМУТ551І НБОМРОЗАЕБО
БаБаТОМТЕТІ5БІ ОРЕОІАТУ
МУСООУ5МІ РУТЕРОСОТКМЕЇїК
ВАВТУААРБЗМЕІЕРРБОЕОЇІ Кат
АБУМСІ І ММЕМРАЕАКМОМ КУ
РМАГОБОМ5ОЕВМТЕООБКО
ЗТУ5І 55ТІ ТІ БКАОМЕКНКМУУ
АСЕМТНОСІ 55РУТК5ЕМАОЕ
С
УнН-С0137-009-НС7 | УН ЕМОЇ МЕБОСОЇ МОРОНВБІ НІ 51 5ЕО ІЮ МО:123
СТАБОЕБ5І МОМУМУМ5БУМУВОАР ока ЕМУМа МІС МОаС5І ММАА5
МКОаВЕТІБАВОБКОІАМІ ОММО
І КТЕОТАМУМСАНОСІ Та
Гм сОСстТІ УТУ55
Таблиця 1
Послідовності послідовності
Сбр137-009-НС7 НО, да ЕМОЇ МЕБОСОЇ МОРОНВБІ НІ 51 5ЕО І МО:124
СТАБОЕБ5І МОМУМУМ5БУМУНОАР ока ЕМУМа МІС МОаС5І ММАА5
МКОаВЕТІБАВОБКОІАМІ ОММО
І КТЕОТАМУМСАНОСІ Та
ГМСОСТІ МУТУ55АЗТКОаРБМЕ
РІГ АРОБКОТ5ОСТАА ОСІ УК
ОМЕРЕРМУТУБУМ/М5ОАІ Т5ИаУН
ТЕРАМ О55021І М5І 55 ТУР аТОТМІСМММНКРУіМТКМУ
ОКАМЕРКЗСОКТНТСРРСРАР
ЕП 'ЯОСОРБЗМЕЇ ЕРРКРКОТІ МІБ
ВАВТРЕМТСУУМОУМ5НЕОРЕМКЕ
МУ МУрамЕМНМАКТКРАЕЕО
ММЗ МАМУ5БМІ ТМ НОСОМ МО
КЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗК
АКОСОРЕЕРОУМТІ РРОНЕЕМТ
КМОМ5І ТС УКаОЕМРБОІАМЕ
МЕБМООРЕММУКТТРРМІ 05 рРабБЕР МК ТМОКАУмООа
ММЕ5С5УМНЕАЇ НМНУТОКОЇ. 9І 5РОК
Ср137-009-НС7- НО, 401 ГЕАВ ЕМОЇ МЕБОСОЇ МОРОНВБІ НІ 51 5ЕО ІЮ МО:125
ЕЕАВ СТАБОЕ5І МОММ/ МУ УВОАР ока ЕМУМа МІС МОаС5І ММАА5
МКОаВЕТІБАВОБКОІАМІ ОММО
І КТЕОТАМУМСАНОСІ Та
ГМСОСТІ МУТУ55АЗТКОаРБМЕ
РІГ АРОБ5БКОТ5ОСТАА ОСІ УК
ОМЕРЕРМУТУБУМ/М5ОАІ Т5ИаУН
ТЕРАМ О55021І М5І 55 ТУР 5 аТОТМІСМММНКРУіМТКМУ
ОКАМЕРКЗСОКТНТСРРСРАР
ЕЕЕСОРБУРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗ
АТРЕМТСУММАМЗ5НЕОРЕМКЕ
МУ МУрамЕМНМАКТКРАЕЕО
ММЗ МАМУ5БМІ ТМ НОСОМ МО
КЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗК
АКОСОРЕЕРОУМТІ РРОНЕЕМТ
КМОМ5І ТС УКаОЕМРБОІАМЕ
МЕБМООРЕММУКТТРРМІ 05 разЕг ВІ ТМОКЗВУМООСс
ММЕ5С5УМНЕАЇ НМНУТОКОЇ. 9І 5РОК
Таблиця 1
Послідовності послідовності
СОр137-009-НС7- НО, 1921 ЕЕАГ ЕМОІЇ МЕЗО СОЇ МОРОВБІ ВІ 5) 5ЕО ІВ МО 126
ЕЕАЇ. СТАБОБЕ5І МОУ МОУ УВОАР акагєМммУамІрУцваБі УУАА5
УКОаВЕТІЗБАВОБКОІАМІ ОММ5
ІЇКТЕОТАМУУУСАНОСІ ТМОаБО
ГУСОСТІ МУТУ55АВТКаРОЗМУЕ
РЕ АРЗБЗКоОТЗОСТАА ас Ук
ОМЕРЕРУТУБУМЗОАІ ТЗИУН
ТЕРАМО55ИЦІ М5І 55БУМ ТУР
ЗОЗ ЯТОТМІСМУМНКРОМТКУ
ОКАМЕРКЗСОКТНТСРРОРАР
ЕЕЕСОРБУРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗ
АТРЕМТСУММАМЗ5НЕОРЕМКЕ
ММ УУраТмЕМНМАКТКРВАЕЕО
УМЗТУВУУБМІ ТМ НОБУМІ МО
КЕУКСКУ5ЗМКАЇ РАРІЕКТІЗК
АКОСОРВЕРОМУУТІ РРОВЕЕМТ
КМОМУБІ ТС УКОЕУРБОІАМЕ
МЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ 05 разРЕцУЗкІі гркЗАМмООС
МУМЕ5СЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ.
ЗІ Рак
МІ-60137-009-і0б2 ІМ РІММТО5РББІ БАЗУМООВМТІТ | БЕО ІЮ МО727
СОАБЕВІЗЗМІ АМ/МООКРОКА
РКВАІИІМОАБОЇ АБИУМРЗАЕЗА5 аватомТЕТІЗБІ ОРЕПІАТУУ
СНУМАТІЗа! аМАРОСаИтКкМЕЇ
К
СОр137-009-І С2 І С, каппа РІММТО5РББІ БАЗУСОВМТІТ | БЕО І МО728
СОАБЕВІЗЗМІ АМ/МООКРОаКА
РКВАІИІМОАБОЇ АБИУМРЗАЕЗА5 аватомТЕТІЗБІ ОРЕПІАТУУ
СНУМАТІЗа! аМАРОСаИтКкМЕЇ
КАТМААРБУРІЕРРБОЕОЇ КО
ТАБМУСІ І ММЕМРАЕАКМОМУК
МОМАГ ОБОМБОЕЗУТЕСОБК
О5ТУБІ 557 ТІ ЗКАОМЕКНКМ
МАСЕМТНОВІ 55РУТКЗЕМАС
ЕС перемішування-6б СО137 людини СР перемішування-5 СО0137 людини КаМЕАТАКЕСЗЗТЗМАЕСОС перемішування-4 114 20137 людини |ЗОЄЕЇ ТК перемішування-3 138 СО137 людини |М/ТМ перемішування-2 161 СО0137 людини | Р5 перемішування-1 186 СО0137 людини | НБРО
Таблиця 1
Послідовності послідовності
СО0137 дикого кабана МОМОамУмУМІМАТМІ І УММЕЕНВТ | 5ЕО І МО:135
В5МРОРОБМОБАСаТЕСаТКкмМІО
ЕГСОМРОРБОМЗЕБ5ТЗООКАС
МУСАКСЕСМЕАТККЕС55Т5М
АУСЕСУРОЕНСІ ОМХОСАМСЕ
ЕМСООСОБ! ТОЕОСКОСЕО
ТЕМОЕЕНОМСАРМТОС5І АС
КРМ ММаТКкКАВОУМСОРАРТ
РЕБРОТРОТТМРУРОСЕРОН
Т5НМПЕНБІ АГ М5ОТАМЕМІ ММ.
АЇ ВЕБММООССАККИ ЇЇ МІМКОРЕ
ІЇКРАОТМОЕЕВСАСОЗСВЕРЕЕЕ
ЕСЕСЕЇ.
СО0137 африканского МамМмамУМММАТМІУММЕЕНВ | 5ЕО ІЮ МО:136 слона ТОАМОО5БСАОСІ АСТУСУКМ
ЕБОІС5РОСРІ М5Е55ТИаСОММ
СОМСАКСЕСУРКТКААС5РТ
ВОАЕСЕСУБОЕНСЇ С0ЬОаСТМ
СОООСКОСОБІ ТКЕОСКОСО
ГатЕМмрокМаіСсАРУТМОБІ Е
СОКОМ АМОТККАОУМСОРРАД
О5ЕРОТ55УТУМРАРЕВКРОНН
РОПТЕНАГ І5ААГІ Б МЕРБІ УМ
ВЕБМАКМОВККІИ І МІЕКОРЕЇІК
РМОТАОЕЕРОСЗСВЕРЕЕЕЕ
СОС. х положення амінокислот 118-447 відповідно до нумерації ЕЮ
Детальний опис винаходу
Визначення
Термін "С040", як він використовується в даному описі, відноситься до СО40, який також згадується як член суперродини рецепторів фактора некрозу пухлин 5 (ТМЕКЗЕ5), який є рецептором ліганда ТМЕБЗЕ5/СО40Ї. Відомо, що СО40 трансдукує ТНАБб- і МАРЗК8- опосередковані сигнали, які активують ЕКК в макрофагах і В-клітинах, що призводить до індукції секреції імуноглобуліну В-клітинами. Інші синоніми, які застовуються до СО40, включають, не обмежуючись названим, поверхневий антиген В-клітин СО40, Вро5о, рецептор
СО40І і СОм/а40. В одному втіленні СО40 є СО40 людини, який має реєстраційний номер ОпіРгої
Р2г5942. Послідовність СО40 людини також представлена в 5ЕО ІЮ МО: 115. Амінокислоти 1-20
ЗЕО ІО МО: 115 відповідають сигнальному пептиду СО40 людини; тоді як амінокислоти 21-193 послідовності ЗЕО ІО МО: 115 відповідають позаклітинного домену СО40 людини; і залишок білка; тобто амінокислоти 194-215 і 216-277 5БО ІЮО МО: 115, є трансмембраним і цитоплазматичним доменом, відповідно.
Термін "С0137", який використовується в даному описі, відноситься до СЮО137 (4-188), який також згадується як 9-й представник суперродини рецепторів фактора некрозу пухлини (ТМЕКЗЕ9), який є рецептором ліганда ТМЕ5Е9/4-188І. Вважається, що СО137 (4-188) бере участь в активації Т-клітин. Інші синоніми до СЮО137 включають, не обмежуючись названим, рецептор ліганда 4-188, СОм/137, гомолог Т-клітинного антигену 4-188 їі Т-клітинний антиген
І А. В одному втіленні СО137 (4-188) є СО137 людини (4-188), який має реєстраційний номер
МОпіРтої 007011. Послідовність СО137 людини також представлена в 5ЕО ІЮО МО: 92.
Амінокислоти 1-23 5ЕО ІО МО: 92 відповідають сигнальному пептиду СЮО137 людини; тоді як амінокислоти 24-186 послідовності ЕС ІЮ МО: 92 відповідають позаклітинного домену СО137 людини; і залишок білка, тобто з амінокислот 187-213 і 214-255 5БЕО ІЮО МО: 92, є трансмембраним і цитоплазматичним доменом, відповідно.
Термін "химерне антитіло", який використовується в даному описі, відноситься до антитіла, в якому варіабельна область отримана від виду, відмінного від людини (наприклад, від гризунів), а константна область отримана від іншого виду, такого як людина. Химерні антитіла можуть бути отримані за допомогою конструювання антитіл. "Конструювання антитіл" - це термін, який використовується в загальних рисах для різних видів модифікацій антитіл, і способи конструювання антитіл добре відомі фахівцеві в даній галузі. Зокрема, химерне антитіло може бути отримане з використанням стандартних методів ДНК, як описано в затбгоок еї аї., 1989, МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїту Мапиа!ї, Мем Моїк: Соїй 5ргіпд Нагрог
Іарогаїогу Ргез5, Си. 15. Таким чином, химерне антитіло може бути генетично або ферментативно сконструйованим рекомбінантним антитілом. Фахівцю в даній галузі зрозуміло, як створити химерне антитіло, і, таким чином, отримання химерного антитіла може бути виконано способами, відмінними від тих, які описані в цьому документі. Химерні моноклональні антитіла для терапевтичного застосування у людей розроблені для зниження прогнозованої імуногенності антитіл, відмінних від людських, наприклад, антитіл гризунів. Як правило, вони можуть містити варіабельні області, відмінні від людських (наприклад, мишачі або кролячі), які є специфічними для даного антигену, і людські константні області важкого і легкого ланцюга антитіла. Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен", який використовується в контексті химерних антитіл, відноситься до області, яка включає СОК і каркасні області як важкого, так і легкого ланцюгів імуноглобуліну, як описано нижче.
Використовуваний в даному описі термін "гуманізоване антитіло" відноситься до генетично сконструйованого антитіла, відмінного від людського, яке включає константні домени людського антитіла і відмінні від людських варіабельні домени, модифіковані для забезпечення високого рівня гомології послідовності з людськими варіабельними доменами. Це може бути досягнуто шляхом трансплантації шести СОК антитіл, відмінних від людських, які разом утворюють антигензв'язувальний сайт, на гомологічну людську акцепторну каркасну область (ЕК) (див.
МО92/22653 і ЕРОб29240). Щоб повністю відновити афінність зв'язування і специфічність батьківського антитіла, може бути потрібна заміна каркасних залишків з батьківського антитіла (тобто антитіла, яке не є людським) в каркасних областях людини (зворотні мутації).
Моделювання структурної гомології може допомогти ідентифікувати амінокислотні залишки в каркасних областях, які важливі для властивостей зв'язування антитіла. Таким чином, гуманізоване антитіло може містити послідовності СОК, відмінні від людських, в основному каркасні області людини, які необов'язково містять одну або більше амінокислотних зворотних мутацій в амінокислотній послідовності, відмінній від людської, і повністю людські константні області. Необов'язково, додаткові амінокислотні модифікації, які необов'язково є зворотними мутаціями, можуть застосовуватися для отримання гуманізованого антитіла з кращими характеристиками, такими як афінність і біохімічні властивості, і/або додаткові амінокислотні мутації можуть бути введені в константну область.
Термін "білок, який отриманий із" іншого білка, який використовується в даному описі, наприклад, з батьківського білка, означає, що одна або більше амінокислотних послідовностей білка є ідентичними або подібними до однієї або більше амінокислотних послідовностей іншого або батьківського білку. Наприклад, в антитілі, зв'язувальному плечі, антигензв'язувальній області, константній області тощо, що походить від іншого або батьківського антитіла, зв'язувального плеча, антигензв'язувальної області або константної області, одна або більше амінокислотних послідовностей є ідентичними або подібними до таких іншого або батьківського антитіла, зв'язувального плеча, антигензв'язувальної області або константної області. Приклади такої однієї або більше амінокислотних послідовностей включають, не обмежуючись названим, послідовності СОК МН і МІ. і/або одну чи більше або всі каркасні області, області МН, МІ, С, шарнір або СН. Наприклад, гуманізоване антитіло може бути описане в цьому документі як "отримане із" батьківського антитіла, відмінного від людського, це означає, що, щонайменше, послідовності СО МІ. їі МН є ідентичними або аналогічними до послідовностей МН і М СО зазначеного батьківського антитіла. Химерне антитіло може бути описане в цьому документі як "отримане із" батьківського антитіла, яка не є людським, це означає, що зазвичай послідовності
МН ї МІ. можуть бути ідентичними або подібними до послідовностей батьківського антитіла, яке не є людським. Іншим прикладом є зв'язувальне плече або антигензв'язувальна область, яка може бути описана в даному документі як "отримана із" конкретного батьківського антитіла, це означає, що вказане зв'язуване плече або антигензв'язувальна область зазвичай включає ідентичні або подібні СОК МН і/або МІ, або послідовності УН і/або МІ. до зв'язуваного плеча або антигензв'язувальної області зазначеного батьківського антитіла. Однак, як описано в іншому 60 місці цього документа, амінокислотні модифікації, такі як мутації, можуть бути зроблені в СОК,
константних областях або в інших місцях антитіла, зв'язувального плеча, антигензв'язувальної області тощо, для введення потрібних характеристик. При використанні в контексті однієї або більшої кількості послідовностей, отриманих з першого або батьківського білка, "подібна" амінокислотна послідовність бажано має ідентичність послідовності, щонайменше, близько 50 уо, наприклад, щонайменше, близько 60 95, щонайменше, близько 70 95, щонайменше, близько 80 95, щонайменше, близько 90 95, щонайменше, близько 95 95 або, щонайменше, близько 97 90, 98 95 або 99 95.
Антитіла, які не є людськими, можуть продукуватися рядом різних видів, таких як миша, кролик, курка, морська свинка, лама і коза.
Моноклональні антитіла можуть бути отримані різними способами, включаючи звичайну методологію моноклональних антитіл, наприклад, стандартну методику гібридизації соматичних клітин Копіег апа Міївієїп, Маїшге 256: 495 (1975). Можуть бути використані інші методи отримання моноклональних антитіл, наприклад, вірусна або онкогенна трансформація В- лімфоцитів або методи фагового дисплея з використанням бібліотек генів антитіл, і такі методи добре відомі фахівцеві в даній галузі.
Створення гібридом в таких, відмінних від людини, видах є дуже добре розробленою процедурою. Протоколи і способи імунізації для виділення спленоцитів імунізованих тварин/видів, відмінних від людини, для злиття відомі в даній галузі. Партнери по злиттю (наприклад, клітини мієломи миші) і процедури злиття також відомі.
Термін "людське антитіло", яке використовується в даному описі, відноситься до антитіл, які мають варіабельні і константні області, отримані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Людські антитіла можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються послідовностями людського імуноглобуліну зародкової лінії (наприклад, мутації, введені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом іп міго або соматичною мутацією іп мімо). Однак термін "людське антитіло", який використовується в даному описі, не повинен охоплювати антитіла, в яких послідовності СОК, отримані з зародкової лінії інших видів ссавців, таких як миша, були трансплантовані на каркасні послідовності людини.
Людські моноклональні антитіла можуть бути отримані з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, які несуть більше частин імунної системи людини, замість мишачої системи.
Термін "імуноглобулін" відноситься до класу структурно споріднених глікопротеїнів, які складаються з двох пар поліпептидних ланцюгів, однієї пари легких (І) ланцюгів з низькою молекулярною масою і однієї пари важких (Н) ланцюгів, причому всі чотири пов'язані між собою дисульфідними зв'язками. Структура імуноглобулінів була добре охарактеризована. Див., наприклад, Рипдатепга! Іттипоїіоду Сп. 7 (Раші, МУ., ед., 2па ей. Рамеп Ргев55, МУ (1989)). Якщо коротко, кожний важкий ланцюг (скорочено "НС") зазвичай складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено позначається в цьому документі як Ун або МН) і константної області важкого ланцюга (скорочено позначається в цьому документі як Сн або СН). Константна область важкого ланцюга зазвичай складається з трьох доменів, Сні, Сн2 і Сн3. Важкий ланцюг зазвичай може додатково містити шарнірну область. Кожний легкий ланцюг (скорочено "І С") зазвичай складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено позначається в цьому документі як Мі або МІ) і константної області легкого ланцюга (скорочено позначається в цьому документі як Сі або СІ). Константна область легкого ланцюга зазвичай складається з одного домену, СІ. Області МН і МІ можуть бути додатково підрозділені на області гіперваріабельні (або гіперваріабельні області, які можуть бути гіперваріабельними за послідовністю і/або формою структурно визначених петель), які також називаються областями, що визначають комплементарність (СОК), перемежованими з областями, які є більш консервативними, які позначаються каркасними областями (ЕК). Кожен МН і МІ. зазвичай складається з трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від М-кінця до С-кінця в такому порядку: ЕКТ, СОКІ, ЕК2, СОМ,
ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА (див. Також Споїпіа апа І! е5кК у). Мої., Віо!. 196, 901-917 (1987). Якщо інше не зазначено або якщо це не суперечить контексту, послідовності СОК в цьому документі ідентифікуються відповідно до правил ІМОТ з використанням ЮотаїіпСарАЇїїдп (версія програми: 4.9.1; 2013-12-19) (І еїгапс МР., Мисівїс Асід5 Резеагсі 1999; 27: 209 -212, і Епгептапп Е., Кааб5
О. ії Гемтапс М.-Р. Мисівїс Асідв Кезеагсп 2010 року; 38, Ю301-307; див. також за веб-адресою млмм.ітаї.огд/).
Якщо інше не зазначено або якщо це не суперечить контексту, посилання на амінокислотні положення в константних областях в цьому винаході відповідає нумерації БЮ (Еадеїтап еї аї.,
Ргос Майї! Асай сі О5 А. 1969 Мау; 63 (1): 78 -85; Кабаї єї аі ., бЗедиепсе5 ої Ргоївїій5 ої
Ітітипо!одісаї Іпіегеві, БА Еайіоп.1991 МІН Публікація Мо 91-3242). 60 Термін "антитіло" (АБ) в контексті даного винаходу відноситься до молекули, яка містить,
щонайменше, один варіабельний домен антитіла, такий як варіабельна область важкого ланцюга імуноглобуліну або варіабельна область важкого ланцюга імуноглобуліну і варіабельна область легкого ланцюга, або його фрагмент або похідне будь-кого з них, яке має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном, як наприклад, за типових фізіологічних умов з періодом напіввиведення, який становить значні періоди часу, такі як, щонайменше, близько 30 хвилин, щонайменше, близько 45 хвилин, щонайменше, близько однієї години, щонайменше, біля двох годин, щонайменше, близько 4 годин, щонайменше, близько 8 годин, щонайменше, близько 12 години, близько 24 годин або більше, близько 48 годин або більше, близько 3, 4, 5,6, 7 або більше днів тощо, або будь-який інший відповідний функціонально визначений період (такий як час, достатній для того, щоб індукувати, стимулювати, посилити і/або модулювати фізіологічну відповідь, пов'язану зі зв'язуванням антитіла з антигеном і/або час, достатній для антитіла, щоб рекрутувати ефекторну активність). Зокрема, антитіло може бути молекулою імуноглобуліну, фрагментом молекули імуноглобуліну або його похідним. Варіабельні області важкого і легкого ланцюгів молекули імуноглобуліну містять домен зв'язування, який взаємодіє з антигеном.
Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (такі як ефекторні клітини) і компоненти системи комплементу, такі як С14, перший компонент в класичному шляху активації комплементу. Як зазначено вище, термін антитіло в цьому документі, якщо не вказано іншого або це явно не суперечить контексту, включає фрагменти антитіла, які є антигензв'язувальними фрагментами, тобто зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може виконуватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади антигензв'язувальних фрагментів, які охоплюються терміном "антитіло", включають (ї) фрагмент Раб" або Раб, одновалентний фрагмент, який складається з доменів МІ,
МН, СІ ї СНІ, або одновалентне антитіло, як описано в М/О2007059782 (СептарБ); (її) Кар) 2- фрагменти, двовалентні фрагменти, які містять два РГаб-фрагмента, пов'язаних дисульфідним містком в шарнірній області; (ії) фрагмент Ед, який складається власне з доменів МН і СНІ; (ім) фрагмент Ем, який складається власне з доменів Мі. і МН одного плеча антитіла, (м) фрагмент адр (Мага еї аї!., Майте 341, 544- 546 (1989)), який складається власне з домену МН, і так звані доменні антитіла (Ноїї еї а! .; Тгепавз ВіоїесппоЇ.2003 Мом; 21 (11): 484-90); (мі) верблюжі або нанотіла (Кемеїв еї аї!; Ехрегі Оріп Віо! Тег. 2005 дап; 5 (1): 111-24) і (мії) виділена область, яка визначає компліментарність (СОН). Крім того, хоча два домена фрагмента Ем, МІ ії МН, кодуються окремими генами, вони можуть бути об'єднані, використовуючи рекомбінантні методи, синтетичним лінкером, який дозволяє отримати їх у вигляді єдиного білкового ланцюга, в якій області МІ і МН спаровуються з утворенням одновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Ем (зсЕм), Див., наприклад, Віга еї аї., Зсіеєпсе 242, 423-426 (1988) і Нивіюоп еї аІ., РМАБ5 О5А 85, 5879 - 5883 (1988)). Такі одноланцюгові антитіла охоплюються терміном антитіло, якщо не вказано іншого або чітко не вказано в контексті. Хоча такі фрагменти, як правило, охоплюються смисловим значенням терміна антитіло, вони разом і кожен незалежно є унікальними ознаками винаходу, проявляючи різні біологічні властивості і придатність. Ці та інші корисні фрагменти антитіл в контексті даного винаходу, а також біспецифічні формати таких фрагментів обговорюються в даному документі далі. Також слід розуміти, що термін антитіло, якщо не вказано іншого, також включає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (тАбБ), антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла і гуманізовані антитіла, і фрагменти антитіл, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (антигензв'язувальні фрагменти), одержані будь-яким відомим методом, таким як ферментативне розщеплення, пептидний синтез і рекомбінантні методи. Отримане антитіло може відноситися до будь-якого ізотипу і/або підкласу.
Звичайні антитіла, наприклад, антитіла, виділені з будь-яких видів, зазвичай є моноспецифічними, двовалентними антитілами, що означає, що вони містять дві антигензв'язувальні області, які зв'язуються з одним і тим же епітопом.
Термін "мультиспецифічне антитіло" в контексті даного винаходу відноситься до антитіла, яке має різні антигензв'язувальні області, визначені різними послідовностями антитіл. Таким чином, мультиспецифічне антитіло може мати дві, три, чотири, п'ять або більше різних антигензв'язувальних областей. Приклади мультиспецифічних антитіл включають антитіла, які мають дві різні антигензв'язувальних області; тобто біспецифічні антитіла.
Приклади мультиспецифічних антитіл, які містять три або більше різних антигензв'язувальних областей, включають, не обмежуючись названим, (і) біспецифічні антитіла, пов'язані з додатковим одноланцюговим варіабельним фрагментом (з5сЕм) в їх Ес- частині (УУеїадіе еї аІ., Сапсег Сепотісв Ргоїеотісв.2013 дап- Бер; 10 (1): 1-18), (ії) злиті білки, які 60 складаються з трьох або більше 5сЕм (триатіло, тетратіло; Спатев еї а). РЕМ5 Місгобіо!
І ен.2000 Аца 1; 189 (1): 1-8) і (ії) злиті білки, пов'язані з 5сЕм (Кептег еї.аІ. Мої Сапсег ТНег. 2014 дап; 13 (1): 112-21).
Термін "біспецифічне антитіло" в контексті даного винаходу відноситься до антитіла, яке має дві різні антигензв'язувальні області, визначені різними послідовностями антитіл.
Термін "Раб-плече" або "плече", як він використовується в даному описі, якщо це не суперечить контексту, відноситься до однієї пари важкий ланцюг-легкий ланцюг і використовується в даному описі як взаємозамінний з "половинними молекулами".
Термін "зв'язувальне плече, яке включає антигензв'язувальну область", означає молекулу або фрагмент антитіла, який включає антигензв'язувальну область. Таким чином, зв'язувальне плече може містити, наприклад, шість послідовностей СОК МН і МІ, послідовності МН і Мі, фрагмент Раб або Раб'або Рар-плече.
Термін "область Ес", як він використовується в даному описі, якщо це не суперечить контексту, відноситься до області антитіла, яка містить, щонайменше, шарнірну область, домен
СН? і домен СНЗ.
Термін "ізотип", як він використовується в даному описі, відноситься до специфічного типу імуноглобуліну, який кодується генами НС (наприклад, Ідс, дО, ІдА, І9ЧЕ і І9М) або І С (каппа, к або лямобда, ЛХ). Усередині кожного ізотипа може існувати кілька підкласів, таких як Ідс1, Ідса2,
ІЧОЗ, Ід04, ІДА1, ІдДА2 тощо.
Термін "одновалентне антитіло" означає в контексті даного винаходу, що молекула антитіла здатна зв'язувати одну молекулу антигену і, отже, не здатна до перехресного зв'язування антигену. "Антитіло проти СО40" або "анти-СО40 антитіло" є антитілом, як описано вище, яке специфічно зв'язується з антигеном СО40. "Антитіло проти СО137" або "анти-СО137 антитіло" є антитілом, як описано вище, яке специфічно зв'язується з антигеном СО137. "Антитіло проти СО40хС0137" або "анти-СО40хСО137 антитіло" є біспецифічним антитілом, яке включає дві різні антигензв'язувальні області, одна з яких специфічно зв'язується з антигеном СО40, а інша специфічно зв'язується з антигеном СО137.
Терміни "специфічно зв'язується", "специфічно зв'язувальний", "специфічне зв'язування" або інші подібні формулювання відносяться до здатності антитіла зв'язуватися переважно з конкретним антигеном в порівнянні з іншими антигенами або з певною частиною (епітопом) антигену в порівнянні з іншими частинами того ж антигену.
Термін "зв'язування", як він використовується в даному описі, в контексті зв'язування антитіла з наперед визначеним антигеном або епітопом, як правило, є зв'язуванням з афінністю, яка відповідає КО, який дорівнює близько 107 М або менше, наприклад близько 1038
М або менше, наприклад, близько 109 М або менше, близько 10-79 М або менше, або близько 10-
ПОМ або навіть менше, якщо це визначається, наприклад, за допомогою технології поверхневого плазмонного резонансу (5РК) приладом ВіАсоге 3000 з використанням антитіла як ліганда і антигену як аналіту (або навпаки), і зв'язується з наперед визначеним антигеном з афінністю, яка відповідає КО, який, щонайменше, в десять разів нижче, наприклад, щонайменше, в 100 разів нижче щонайменше, в 1000 разів нижче, наприклад, щонайменше, в 10000 разів нижче, наприклад, щонайменше, в 100000 раз нижче, ніж КО для зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, ВЗА, казеїном), відмінним від попередньо визначеного антигену або спорідненого антигену. Кількість, при якій афінність вища, залежить від Ко антитіла, тому, коли Ко антитіла є дуже низьким (тобто антитіло є високоспецифічним), тоді кількість, при якій афінність до антигену може бути вищою, ніж афінність до неспецифічного антигену, щонайменше, в 10000 разів.
Термін "Ка" (с), який використовується в даному описі, відноситься до константи швидкості дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. Вказане значення також згадується як значення Кок.
Термін "Ко" (М), який використовується в даному описі, відноситься до константи рівноваги дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген.
Два антитіла мають "однакову специфічність", якщо вони зв'язуються з одним і тим же антигеном і одним і тим же епітопом. Чи розпізнає досліджуване антитіло той же самий епітоп, що і певне антигензв'язувальне антитіло, тобто антитіло зв'язуються з одним і тим же епітопом, може бути перевірено різними методами, добре відомими фахівцеві в даній галузі.
Конкуренція між антитілами може бути виявлена за допомогою аналізу перехресного блокування. Наприклад, як аналіз перехресного блокування може використовуватися конкурентний аналіз ІФА. Наприклад, цільовий антиген може бути нанесений у вигляді покриття 60 на комірки мікропланшетів і можуть бути додані антигензв'язувальне антитіло і кандидат конкуруючого досліджуваного антитіла. Кількість антигензв'язувального антитіла, пов'язаного з антигеном в комірці, опосередковано корелює зі здатністю до зв'язування потенційного конкуруючого досліджуваного антитіла, яке конкурує з ним за зв'язування з тим же епітопом.
Зокрема, чим більшою є афінність кандидата конкуруючого досліджуваного антитіла до того ж епітопа, тим меншою є кількість антигензв'язувального антитіла, пов'язаного з коміркою, покритою антигеном. Кількість антигензв'язувального антитіла, пов'язаного з коміркою, можна виміряти шляхом мічення антитіла придатними для вимірювання детектованими або поміченими речовинами.
Антитіло, яке конкурує за зв'язування з антигеном з іншим антитілом, наприклад, антитіло, яке містить варіабельні області важкого і легкого ланцюгів, як описано в цьому документі, або антитіло, яке має специфічність до антигену іншого антитіла, наприклад, антитіло, яке містить варіабельні області важкого і легкого ланцюга, як описано в цьому документі, може бути антитілом, яке містить варіанти зазначених варіабельних областей важкого і/або легкого ланцюга, як описано в цьому документі, наприклад, модифікації СОК і/або визначену ступінь ідентичності, як описано в цьому документі. "Виділене мультиспецифічне антитіло" в контексті даного опису відноситься до мультиспецифічного антитіла, яке власне не включає інших антитіл, що мають різну антигенну специфічність (наприклад, виділене біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з СО40 і
СО0137, власне не включає моноспецифічних антитіл, які специфічно зв'язуються з СО40 або
СО0137).
Термін "епітоп" означає детермінанту білка, здатну специфічно зв'язуватися з антитілом.
Епітопи зазвичай складаються з поверхневих груп молекул, таких як бічні ланцюги амінокислот або цукрів, і зазвичай мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні і неконформаційні епітопи, відрізняються тим, що зв'язування з першим, але не останнім, відсутнє в присутності денатуруючих розчинників. Епітоп може містити амінокислотні залишки, які беруть безпосередню участь в зв'язуванні, та інші амінокислотні залишки, які безпосередньо не беруть участі у зв'язуванні, такі як амінокислотні залишки, які ефективно заблоковані або покриті специфічним антигензв'язувальним пептидом (іншими словами, амінокислотний залишок знаходиться в області розпізнавання специфічного антигензв'язувального пептиду).
Термін "моноклональне антитіло", який використовується в даному описі, відноситься до препарату молекул антитіла одного молекулярного складу. Композиція моноклонального антитіла проявляє єдину специфічність зв'язування і афінність до конкретного епітопа.
Термін "гетеродимерна взаємодія між першою і другою областями СНЗ", який використовується в даному описі, відноситься до взаємодії між першою областю СНЗ і другою областю СНЗ в гетеродимерному антитілі з першою-СНЗ/другою-СНЗ.
Термін "гомодимерна взаємодія першої та другої областей СНЗ", який використовується в даному описі, відноситься до взаємодії між першою областю СНЗ та іншою першою областю
СНЗ в гомодимерному антитілі з першою-СНЗ/першою-СНЗ і взаємодії між другою областю СНЗ та іншою другою областю СНЗ в гомодимерному антитілі з другою СНЗ/другою СНЗ.
Термін "гомодимерне антитіло", який використовується в даному описі, відноситься до антитіла, яке містить два перших Рар-плеча або напівмолекули, де амінокислотна послідовність зазначених Раб-плечей або напівмолекули є однаковою.
Термін "гетеродимерне антитіло", який використовується в даному описі, відноситься до антитіла, яке містить перше і друге Раб-плече або напівмолекулу, де амінокислотна послідовність зазначених першого і другого Гар-плечей або напівмолекул є різною. Зокрема, область СНЗ, або антигензв'язувальна область, або область СНЗ і антигензв'язувальна область зазначених першого і другого Гар-плечей/напівмолекул є різними.
Термін "відновлювальні умови" або "відновлювальне середовище" стосується умов або середовища, в яких субстрат, такий як залишок цистеїну в шарнірній області антитіла, з більшою ймовірністю стане відновленим, ніж окисленим.
Цей винахід також відноситься до мультиспецифічних антитіл, таких як біспецифічні антитіла, які містять функціональні варіанти областей МІ, областей УН, або одну або більше
СОК біспецифічних антитіл із прикладів. Функціональний варіант МІ, МН або СОК, який використовується в контексті біспецифічного антитіла, як і раніше дозволяє кожній антигензв'язувальній області біспецифічного антитіла зберігати, щонайменше, істотну частку (щонайменше, близько 50 95, бО 95, 70 95.80 95, 90 95, 95 95 або більше) афінності та/або специфічності/селективності батьківського біспецифічного антитіла, і в деяких випадках таке біспецифічне антитіло може зв'язуватися з більшою афінністю, селективністю і/або 60 специфічністю, ніж батьківське біспецифічне антитіло.
Такі функціональні варіанти зазвичай зберігають значну ідентичність послідовності з батьківським біспецифічним антитілом. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних положень, які спільно використовуються послідовностями (тобто,
Фо гомології «- кількість ідентичних положень/загальна кількість положень х 100), беручи до уваги кількість пробілів і довжину кожного пробілу, які необхідно ввести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями може бути, наприклад, визначений з використанням алгоритму Е. Меуєгз апа М/. Мійег, Сотриї. Аррі. Віозсі 4, 11-17 (1988), який був включений в програму АСОМ (версія 2.0), використовуючи таблицю мас залишків РАМ120О, штраф за довжину прогалини 12 і штраф за прогалину 4. Крім того, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями може бути визначений з використанням алгоритму
МеєаІетап апа У/ипзси, у). Мо!.Віо!. 48, 444 - 453 (1970).
У контексті даного винаходу, якщо не вказано іншого, для опису мутації використовуються такі позначення: назва амінокислоти, яка зазнала мутації, потім номер положення, яке зазнало мутації, після чого зазначення обсягу мутації. Таким чином, якщо мутація є заміною, подається назва амінокислоти, яка замінює попередню амінокислоту, якщо амінокислота делетується, це позначається ", якщо мутація є вставкою, то вставлена амінокислота включається після початкової амінокислоти. Назви амінокислот можуть складатися з одно- або трибуквених кодів.
Так наприклад; заміна лізину в положенні 409 аргиніном позначена як К409К, заміна лізину в положенні 409 будь-якою амінокислотою позначається як К409Х, делеція лізину в положенні 409 позначається як К409 ", і вставка Р після лізину в положенні К.409 позначається як К4О9КР.
Ілюстративні варіанти включають варіанти, які відрізняються від МН і/або МІ і/або СОК батьківських послідовностей в основному консервативними замінами; наприклад, заміна 12, такими як 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 в варіанті, є консервативними амінокислотними замінами.
У контексті даного винаходу консервативні заміни можуть бути визначені замінами в межах класів амінокислот, відображених наступним:
Класи амінокислотних залишків для консервативних замін:
Кислотні залишки: Ар (0) і Сім (Е)
Основні залишки: ГІ уз (К), Ага (К) і Ніз (Н)
Гідрофільні незаряджені залишки: Зег (5), ТАг (Т), Авп (М) і СіІп (0)
Аліфатичні незаряджені залишки: Су (С), Аа (А), Ма! (М), Гей () ї Пе (І)
Полярні незаряджені залишки: Суз (С), Меї (М) і Рго (Р)
Ароматичні залишки: Ре (Р), Туг (ХУ) ії Тгтр (ММ)
Перша і/або друга антигензв'язувальна область, відповідно до даного винаходу, також може бути варіантом першої та/або другої антигензв'язувальної області, відповідно, розкритої в даному описі.
Фахівцю в даній галузі добре відомо, як вводити модифікації, і що деякі амінокислоти послідовностей СОК можуть бути модифіковані; наприклад, шляхом заміни амінокислот, наприклад, для збільшення афінності антитіла до його цільового антигену, для зниження потенційної імуногенності антитіл, які не є людськими, для застосування у людей, і/або для збільшення виходу антитіл, експресованих клітиною-хазяїном. Такі модифікації можуть бути введені не впливаючи на епітоп цільового антигену, з яким зв'язується антитіло.
Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн" або "клітина"), який використовується в даному описі, призначений для позначення клітини, в яку була введена нуклеїнова кислота, така як експресуючий вектор, наприклад, нуклеїнова кислота, така як експресуючий вектор, який кодує мультиспецифічне антитіло відповідно до даного винаходу.
Рекомбінантні клітини-хазяїни включають, наприклад, трансфектоми, такі як клітини СНО, СНО- 5, НЕК, НЕК293, НЕК-293Е, Ехрі293Е, РЕК.Сб або М50, та лімфоцитарні клітини.
Термін "лікування" відноситься до введення ефективної кількості терапевтично активного мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом з метою ослаблення, поліпшення, припинення або усунення (лікування) симптомів або хворобливих станів.
Термін "ефективна кількість"? або "терапевтично ефективна кількість", відноситься до кількості, ефективної в дозуваннях і протягом періодів часу, необхідних для досягнення цільового терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість мультиспецифічного антитіла може варіюватися залежно від таких факторів, як хворобливий стан, вік, стать і маса індивідуума, а також здатності мультиспецифічного антитіла викликати цільову відповідь у індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також є кількістю, в якій над будь-якими токсичними або шкідливими ефектами мультиспецифічного антитіла або його фрагмента бо переважають терапевтично корисні ефекти.
Термін "антиїдіотипове антитіло" відноситься до антитіла, яке розпізнає унікальні детермінанти, зазвичай пов'язані з антигензв'язувальним сайтом антитіла.
У контексті даного винаходу вираз "індукує Ес-опосередковану ефекторну функцію меншою мірою", який використовується щодо антитіла, включаючи мультиспецифічне антитіло, означає, що антитіло індукує Ес-опосередковану ефекторну функцію, причому така функція, зокрема, вибирається зі списку зв'язування Ес-рецептора дес (Гсдаттак, ЕсукК), зв'язування С1д, АОС або СОС, меншою мірою в порівнянні з людським антитілом ЇдС1, яке містить (ії) такі ж послідовності СОК, зокрема, містить такі ж першу і другу антигензв'язувальну область як і зазначене антитіло, і (ії) два важкі ланцюги, які містять шарнір Ї(Дс1 людини, області СН2 і СНЗ.
Ес-опосередкована ефекторна функція може бути визначена відносно зв'язування з Есук, зв'язування з С14 або індукції Ес-опосередкованого перехресного зв'язування через Есук.
Додаткові аспекти та втілення винаходу
Винахід стосується молекул, які містить дві різні антигензв'язувальні області, одна з яких має специфічність до СО40 людини, а інша - специфічність до СО137 людини.
У конкретному втіленні зазначена молекула може бути мультиспецифічним антитілом.
Таким чином, даний винахід відноситься до мультиспецифічного антитіла, який містить (Її) першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40; і (ії) другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СЮО137 людини.
Як показано авторами винаходу, біспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом може індукувати внутрішньоклітинну передачу сигналів при зв'язуванні з СО40, експресованим в одній клітині, і зв'язуванні з СО137, експресованим в іншій клітині. Таким чином, мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом здатне трансактивувати дві різні клітини. У людей СО40 експресується у ряді клітин, включаючи антигенпрезентуючі клітини (АРС), такі як дендритні клітини, тоді як СО137 експресується у Т-клітинах та інших клітинах.
Таким чином, мультиспецифічні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, які, відповідно до даного винаходу, зв'язуються з СО40 і СО137, здатні зв'язуватися одночасно з АРС і Т-клітинами, які експресують дані рецептори. Безвідносно до теорії, мультиспецифічні антитіла, такі як біспецифічні антитіла запропоновані даним винаходом можуть, таким чином, (Її) опосередковувати міжклітинну взаємодію між АРС і Т-клітинами за допомогою зв'язування рецептора і (її) активувати одночасно обидва СО40 і СО137, що, в першу чергу, індукується перехресним зв'язуванням і кластеризацією рецепторів при міжклітинній взаємодії і необов'язково залежить від агоністичної активності батьківських моноспецифічних двовалентних антитіл. Таким чином, ці транс-активуючі мультиспецифічні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, проявляють костимулюючу активність в контексті взаємодій АРС: Т- клітини і можуть викликати Т-клітинну відповідь проти пухлинних клітин. Як такий, цей механізм дії може відображати природну активацію Т-клітин за допомогою презентації антигену активованими АРС, що дозволяє презентувати з допомогою АРС різні пухлиноспецифічні антигени Т-клітинам. Безвідносно до теорії костимулююча активність може передбачати активацію одного або більшої кількості з поміж (ї) тільки специфічних активованих Т-клітин (тобто тих, які знаходяться в контакті з АРС) на відміну від будь-якої Т-клітини і (її) повторної активації виснажених Т-клітин шляхом сильної костимуляції через активоване АРС і запуск
СО0137 ії (ії) преміювання Т-клітин шляхом індукції презентації антигену активованими АРС і одночасного запуску СО137.
Таким чином, мультиспецифічне, таке як біспецифічне, антитіло запропоноване даним винаходом, може використовуватися для лікування захворювання, на яке позитивно впливає активація Т-клітин, такого як онкологічне захворювання.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає (І) першу антигензв'язувальну область, яка зв'язується з людським СО40, де зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 3, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 3, і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, яка має послідовність, наведену в ЗЕО ІО МО: 5, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в хЕО ІЮО МО: 5; і
Б) СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яка (і) конкурує за зв'язування СО40 людини з антитілом, що містить СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) і/або (її), має специфічність до СО40 антитіла, яке містить СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а), і 60 (І) другу антигензв'язувальну область, яка зв'язується з СЮО137 людини.
В наступному втіленні перша антигензв'язувальна область може додатково містити СОК!1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 1, або послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 1, і/або СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, вказану в ЗЕО ІЮ МО: 2, або послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 2; і/або СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО: 4, або послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 4, і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність УТ5 або послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в УТ5.
Таким чином, в одному втіленні даний винахід відноситься до мультиспецифічного антитіла, яке містить (І) першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40, де зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОНВІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 1, 2 і 3, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в хЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно; р) СО, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга згідно а) які, що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; і с) СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО40 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б) і/або (ії) а) має специфічність до СЮО40 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б), і (ІЇ) другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СО137 людини.
У наступному втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ), причому зазначена друга антигензв'язувальна область включає варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МГ), де кожна із зазначених варіабельних послідовностей МН і МІ. включає, відповідно, три послідовності СОК, СОКІ, СОК2 і СОКЗ ї чотири каркасні послідовності, ЕКТ, ЕК2, ЕКЗ і
ЕКА, відповідно.
У додатковому втіленні вказане мультиспецифічне антитіло включає (І) перше зв'язує плече, яке включає вказану першу антигензв'язувальну область, і (ІЇ) друге зв'язує плече, яке включає зазначену другу антигензв'язувальну область.
В одному втіленні перше зв'язувальне плече включає зазначену першу антигензв'язувальну область і константну послідовність першого важкого ланцюга, а друге зв'язувальне плече включає зазначену другу антигензв'язувальну область і константну послідовність другого важкого ланцюга.
У додатковому втіленні () вказане перше зв'язувальне плече включає зазначену першу антигензв'язувальну область, де перше зв'язувальне плече включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ), і (ї) вказане друге зв'язувальне плече включає зазначену другу антигензв'язувальну область, де друге зв'язувальне плече включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (УН), і константну послідовність (СН) другого важкого ланцюга, і другий легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ).
У додатковому втіленні зазначена перший легкий ланцюг додатково включає константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), а зазначена другий легкий ланцюг додатково включає константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ).
В одному втіленні, перше зв'язувальне плече включає перше Рар-плече, яке містить зазначену першу антигензв'язувальну область, і друге зв'язувальне плече включає друге Еар- плече, яке містить зазначену другу антигензв'язувальну область.
В одному втіленні зазначені перша і друга антигензв'язувальні області мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом отримані з гуманізованого антитіла. В одному втіленні перше і друге зв'язувальні плечі можуть бути отримані з гуманізованого антитіла.
В одному втіленні перше і друге зв'язувальні плечі мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом отримані з повнорозмірного антитіла.
В одному втіленні перше і друге зв'язувальні плечі мультиспецифічного антитіла 60 запропонованого даним винаходом отримують з повнорозмірного антитіла Їдс1, А (лямбда) або
ІДО1, к (каппа).
В одному втіленні перше і друге зв'язувальні плечі отримують з моноклонального антитіла.
В одному втіленні перший і зазначений другий важкі ланцюги мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом відносяться до ізотипу дб. Підклас першого і другого важких ланцюгів може, наприклад, бути індивідуально вибраний з групи, яка складається з Їдс1,
ІЧо2, ІдОЗ і Ід4. В одному втіленні перший і другий важкі ланцюги відносяться до одного і того ж підкласу Ідс, такого як ІдДсС1.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом є виділеним антитілом.
У додатковому втіленні кожна із зазначеного першого і другого важких ланцюгів включає, щонайменше, шарнірну область, область СН2 і СНЗ. У додатковому втіленні області СНЗ зазначених першого і другого важких ланцюгів містять асиметричні мутації.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом є біспецифічним антитілом.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом може перехресно зв'язуватися з однією клітиною, яка експресує людський СО40, наприклад, з першою клітиною і з іншою клітиною, яка експресує СО137 людини, наприклад, з другою клітиною.
В одному втіленні вказане перехресне зв'язування визначають за допомогою аналізу з використанням першої клітинної лінії, яка експресує людський СО40, і другої клітинної лінії, яка експресує СО137 людини, і де або перша, або друга клітинна лінія включає репортерну структуру, яка утворюється в результаті продукування вимірюваного репортера при активації
МЕ-кВ.
В одному втіленні зазначена перша клітина може бути антиген-презентуючу клітину, а зазначена друга клітина може бути Т-клітиною, такою як СО4 4 або СО8 -- Т-клітина.
Можуть використовуватися різні методи для визначення перехресного зв'язування першої клітини, яка експресує СО40, і другої клітини, яка експресує СО137, і даний винахід не обмежується будь-яким конкретним способом.
В одному втіленні вказане перехресне зв'язування може бути визначене за допомогою репортерного аналізу, наприклад, як описано в Прикладі 4. Якщо коротко, вказаний аналіз включає спільне культивування репортерної клітинної лінії, яка експресує перший цільовий антиген і трансдукованої репортерним геномом (наприклад, люциферази), керованим респонсивними елементами МЕ-кВ, з другою клітинною лінією, яка експресує другий цільової антиген, додавання мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом в концентраціях від 100 нг/мл до 10000 нг/мл для спільного культивування клітин і вимірювання експресії репортерного гена, наприклад, генерації люоциферази, де вказаний перший цільовий антиген є людським СО40, а зазначений другий цільовий антиген є СО137 людини або навпаки.
Мультиспецифічне антитіло, здатне індукувати перехресне зв'язування СО40 і СО137, які експресуються на різних клітинах, в цьому аналізі призводить до помітної активації першого цільового антигену на основі експресії репортерного гена при активації шляху МЕ-кВ.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом може бути здатне індукувати експресію репортерного гена, який виділяється при активації МЕ-кВ, тільки після додавання другої клітинної лінії, яка експресує другий цільовий антиген без репортерного гена МЕ-кВ.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом може бути здатне індукувати більш високу експресію репортерного гена, який виділяється при активації
МЕ-КВ, коли додається друга клітинна лінія, яка експресує другий цільовий антиген без репортерного гена МЕ-кВ, в порівнянні з додаванням другої клітинної лінії, яка не експресує другий цільовий антиген.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло є біспецифічним антитілом, і вказане біспецифічне антитіло може в одному втіленні: () індукувати експресію репортерного гена при додаванні до спільної культури репортерної клітинної лінії, яка експресує СО137, і другої клітинної лінії, яка експресує СО40, або (ї) індукувати більш високу ступінь експресії репортерного гена при додаванні до спільної культури репортерної клітинної лінії, яка експресує СО137, і другої клітинної лінії, яка експресує
СО40, в порівнянні з еталонним біспецифічним оантитілом, яка містить ту ж другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СЮО137 людини, але де перша антигензв'язувальна область еталонного біспецифічного антитіла зв'язується з нерелевантним антигеном-мішенню, наприклад, де перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної бо області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО І МО: 99, 100 ії 101,
відповідно, і СОКІ, СОМК2 і СОМКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в «ЖЕО ІЮ МО: 102, СУБ і 103, відповідно.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло є біспецифічним антитілом, і вказане біспецифічне антитіло може в одному втіленні: () індукувати експресію репортерного гена при додаванні до спільної культури репортерної клітинної лінії, яка експресує СО40, і другої клітинної лінії, яка експресує СО137, або (ї) індукувати більш високу ступінь експресії репортерного гена при додаванні до спільної культури репортерної клітинної лінії, яка експресує СО40, і другої клітинної лінії, яка експресує
СО137, в порівнянні з еталонним біспецифічним антитілом, що містить ту ж першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40, але де друга антигензв'язувальна область еталонного біспецифічного антитіла включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 99, 100 ї 101, відповідно, і
СОВІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в
ЗЕО ІЮО МО: 102, УЗ і 103, відповідно.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом індукує і/або посилює проліферацію Т-клітин, наприклад, де зазначені Т-клітини є СО4 - і/або СО8 « Т- клітини.
Можуть бути використані різні способи визначення або вимірювання проліферації Т-клітин, і даний винахід не обмежується будь-яким конкретним способом.
В одному втіленні зазначену індукцію або посилення проліферації Т-клітин визначають за допомогою неантигенспецифічного аналізу проліферації Т-клітин, наприклад, як описано в
Прикладі 5. Таким чином, індукція і/або посилення проліферації Т-клітин можуть бути визначені субоптимальною активацією Т-клітин в пулі РВМС (мононуклеарні лімфоцити периферійної крові). Субоптимальна активація може бути визначена шляхом титрування концентрації антитіла проти СОЗ, який додається в пул РВМС, вимірювання проліферації Т-клітин і вибору концентрації антитіла проти СОЗ, яка призводить до низької проліферації Т-клітин, але дозволяє додатково посилювати проліферацію Т-клітин. Ця концентрація залежить від донора
РВМС і визначається для кожного донора до проведення аналізу.
В одному втіленні зазначену індукцію або посилення проліферації Т-клітин визначають шляхом активації Т-клітин в РВМС з вказаною субоптимальною концентрацією антитіла проти
СО3, зв'язування РВМС з мультиспецифічним антитілом і визначення проліферації Т-клітин. У додатковому втіленні РВМС можуть бути позначені СЕБЕ, контакт РВМС з мультиспецифічним антитілом може бути виконаний шляхом інкубації протягом 4 днів, а проліферація Т-клітин може бути визначена за допомогою проточної цитометрії.
Індукування певної реакції або ефекту, такого як "індукція проліферації Т-клітин", може означати, що не було такої реакції або ефекту, такого як проліферація Т-клітин, до індукції, але це також може означати, що був визначений рівень реакції або ефекту, такого як проліферація
Т-клітин до індукції, і після індукції посилюється зазначена реакція або ефект, такий як проліферація Т-клітин. Таким чином, "індукція" також включає "посилення".
Проліферація Т-клітин також може бути виміряна за допомогою антиген-специфічного аналізу проліферації Т-клітин, наприклад, як описано в Прикладі б, з використанням досліджуваного антигену, який представляє інтерес. Таким чином, індукцію і/або посилення проліферації Т-клітин можна визначити шляхом спільного культивування Т-клітин, які експресують ТСК, специфічний для пептиду досліджуваного антигену, представленого в основному комплексі гістосумісності (МНС), і ОС, які презентують відповідний пептид в МНС, який потім розпізнається ТОК. Наприклад, Т-клітини можуть бути СО8 ї- Т-клітинами, а МНС може бути МНС класу І, або Т-клітини можуть бути СО4 « Т-клітинами, а МНС може бути МНС класу Ії. Т-клітини, які експресують специфічний ТОК, можуть бути отримані шляхом трансдукції
МРНК, яка кодує ТОК. ОС, які презентують відповідний пептид, можуть бути отримані шляхом трансдукції ОС за допомогою мРНК, яка кодує антиген. Спільне культивування ТСК-позитивних
Т-клітин з антиген-презентуючими клітинами індукує проліферацію Т-клітин; ступінь проліферації може залежати від щільності антигену, презентованого ОС, і/або від сили костимулюючого сигналу. В одному втіленні проліферація Т-клітин може бути виміряна таким антиген-специфічним аналізом Т-клітин з використанням мічених СЕБЕ Т-клітин, з додаванням досліджуваних антитіл і через 4 дні шляхом вимірювання проліферації Т-клітин за допомогою проточної цитометрії.
В одному втіленні зазначену індукцію або посилення проліферації Т-клітин визначають з використанням інфільтруючих пухлину лімфоцитів (ТІ) в аналізі вироблення ех мімо, наприклад, як описано в Прикладі 11. Вплив мультиспецифічного антитіла запропонованого 60 винаходом на індукцію або посилення проліферації ТІЇ. можна оцінити шляхом інкубації зразка
Зо пухлини людини з інтерлейкіном-2 (ІІ -2) і зазначеним антитілом, а також шляхом виділення і підрахунку життєздатних ТІЇ. після інкубації протягом періоду від близько 10 до близько 14 днів.
Потім можна визначити індукцію або посилення проліферації ТІ шляхом порівняння з відповідним контролем, наприклад, зразком пухлини людини, інкубованим без будь-якого мультиспецифічного антитіла або з еталонним (контрольним) мультиспецифічним антитілом.
Наприклад, може бути виділений зразок пухлинної тканини людини, наприклад, за допомогою біопсії або з хірургічного зразка, промитий в безсиворотковому середовищі і шматочки пухлини діаметром близько 1-2 мм поміщені в чашки для культивування або комірки, наприклад, поміщають 1 або 2 шматочки пухлини в 1 мл придатного середовища і інкубують при 37 "с.
Придатним середовищем може бути, наприклад, безсивороткове середовище (наприклад, Х-
МІМО 15), доповнене 10 95 людським сироватковим альбуміном, 1 95 пен./стреп., 1 95 фунгізоном і 1-2 в концентрації в діапазоні від 10 до 100 Од./мл, наприклад, 10 Од./мл або 100 Од./мл. мультиспецифічне антитіло потім може бути додане в придатній концентрації в середовищі ТІЇ...
Після загального періоду культивування, що становить 10-14 днів, необов'язкового розділення клітинної культури за необхідності протягом цього періоду, ТІЇ. можна збирати і підраховувати, наприклад, шляхом проточної цитометрії, використовуючи, наприклад, антитіла проти СОЗ, проти СО4, проти СО8, проти СО56 і 7-ААб, які дозволяють детектувати життєздатні СО4 чі
СО8 «з Т-клітини, а також МК-клітини.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло є біспецифічним антитілом, яке більше індукує і/або посилює проліферацію Т-клітин в порівнянні з еталонним біспецифічним антитілом, яке містить другу антигензв'язувальну область відповідно до будь-яким аспектом або втіленням, описаним в цьому документі, але де перша антигензв'язувальна область включає
СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в
ЗБЕО ІЮО МО: 99, 100 ї 101, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 102, МУ і 103, відповідно.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло є біспецифічним антитілом, яке більше індукує і/або посилює проліферацію Т-клітин в порівнянні з еталонним біспецифічним антитілом, яке містить першу антигензв'язувальну область відповідно до будь-якого аспекту або втілення, описаного в цьому документі, але де друга антигензв'язувальна область включає СОК1, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 99, 100 і 101, відповідно, і СОМК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в «ЖЕО ІЮ МО: 102, УЗ і 103, відповідно.
Зв'язування з СО40
Як описано вище, мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40, де зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, обрану з групи, яка складається з: а) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 3, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковано в ЗЕО ІЮО МО: 3, і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга СОКЗ, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 5, або послідовність, де до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІО МО: 5,
Б) СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, що (ї) конкурує за зв'язування СО40 людини з антитілом, яке містить СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) і/або (ії), має специфічність до СО40 антитіла, яке містить СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а).
У додатковому втіленні перша антигензв'язувальна область може додатково містити СОК1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 1, або
БО послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в 5ЕО ІО МО: 1, і/або СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 2, або послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 2; і/або СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО: 4, або послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 4, і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність УТ5 або послідовність, в якій до 2 амінокислот модифіковані в УТ5.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40, де зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: 60 а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності,
наведені в ЗЕО ІЮО МО: 1, 2 і 3, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в зХЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно,
Б) СОК1, СО і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга згідно а), які мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; і с) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО40 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б) і/або (ії) а) має специфічність до СО40 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б).
В одному втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (М), де кожна із зазначених варіабельних послідовностей включає три послідовності
СОК, СОКІ1, СО2 і СОКУ, відповідно.
В одному втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає першу варіабельну послідовність (УН) важкого ланцюга і першу варіабельну послідовність (МІ) легкого ланцюга, причому кожна із зазначених варіабельних послідовностей включає три послідовності
СО, СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, відповідно і чотири каркасні послідовності, ЕК!, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4, відповідно.
В одному втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає варіабельну область важкого ланцюга СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що має послідовності, наведені в зХЕО ІЮО МО: 1, 2 ії 3, відповідно, і СОК!І, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕБЕО ІО МО: 4, МТ5 їі 5, відповідно. Таким чином, перша антигензв'язувальна область може включати СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, що має послідовності антитіла проти СО40, як зазначено в таблиці 1.
Прикладом антитіла, що містить таку першу антигензв'язувальну область, є химерне антитіло Сті І об 7/4 ії СО0О40-001, розкрите в даному документі.
В іншому втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 ії 3, відповідно, і СОК!І, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 4, УТ5 ії 5, відповідно, мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій, наприклад, від однієї до одинадцяти мутацій, від однієї до десяти мутацій, від однієї до восьми мутацій, від однієї до семи мутацій, від однієї до шести мутацій від однієї до п'яти мутацій, від однієї до чотирьох мутацій, від однієї до трьох мутацій або від однієї до двох мутацій.
В одному втіленні зазначена мутація може бути амінокислотною заміною, такою як консервативна амінокислотна заміна.
В одному втіленні зазначені мутації можуть бути розподілені за СОК1,2іЗзУні СОК1,2і3
МІ, так що кожен з поміж СОКЗ УН і МІ включає не більше трьох мутацій і кожна з поміж СОК2 і
СОК'І МН і МІ. включає не більше двох амінокислотних мутацій.
У додатковому втіленні перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5З2ЕО І МО:1,2, 3,4, 5 Іі 5, відповідно, мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій і де МН і МІ СОКЗ кожна включає до трьох амінокислотних мутацій, а МН і мМ СОКІ! ії СОК?2 кожна включає до двох амінокислотних мутацій.
У додатковому втіленні перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 52ЕО І МО: 1,2, 3,4, 5 Іі 5, відповідно, мають в цілому від однієї до десяти мутацій, наприклад, від однієї до восьми, і де
СО, СОК2 і СОКЗ з МН і МІ, кожна, містять до двох амінокислотних мутацій.
У додатковому втіленні перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5«ЕОІО МО: 1,2, 3,4, УТ5 Іі 5, відповідно, мають в цілому від однієї до шести мутацій, і де СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ з МН і МІ. кожна включає не більше однієї амінокислотної мутації.
Фахівцю в даній галузі добре відомо, як вводити мутації і що певні амінокислотні послідовності СОК можуть бути мутувати; наприклад, за рахунок амінокислотних замін, наприклад, для збільшення афінності антитіла до його антигену-мішені, зниження потенційної імуногенності нелюдських антитіл, для застосування на людях, і/або для збільшення виходу антитіл, експресованих клітиною-хазяїном. Такі мутації можуть бути введені без впливу на епітоп мішені, з якою пов'язується антитіло.
В іншому втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і 60 СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (ї) конкурує за зв'язування
СО040 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, відповідно до а ) або Б) і/або (ії) має специфічність до СО40 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або б).
У додатковому втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (ї) конкурує за зв'язування СО40 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б) і/або (її) має специфічність до СО40 антитіла, що містить СОК1, СОМ і
СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або б).
Термін "конкурує" в даному контексті відноситься до конкуренції між двома антитілами за зв'язування з антигеном-мішенню. Якщо два антитіла не блокують одне одного для зв'язування з антигеном-мішенню, такі антитіла не є конкуруючими, і це вказує на те, що зазначені антитіла не зв'язуються з однією і тієї ж частиною, тобто епітопом антигену-мішені. Фахівцю в даній галузі добре відомо, як тестувати конкуренцію антитіл за зв'язування з антигеном-мішенню.
Прикладом такого методу є так званий аналіз перехресної конкуренції, який може, наприклад, бути виконаний у вигляді тІФА або за допомогою проточної цитометрії.
Наприклад, аналіз на основі ІА можна проводити шляхом нанесення на комірки тіФА- планшета покриття у вигляді кожного з антитіл; додавання конкуруючого антитіла і Ніз-міченого позаклітинного домену цільового антигену та інкубування; шляхом детектування того, чи пригнічує додане антитіло зв'язування Ніз-міченого білка з антитілом, нанесеним у вигляді покриття, може бути виконаний шляхом додавання біотинільованого анти-Ніз-антитіла з подальшим додаванням стрептавідин-поліі--КР і подальшої реакції проявлення з АВТ: і вимірювання поглинання при 405 нм. Наприклад, аналіз проточної цитометрії може бути виконаний шляхом інкубації клітин, які експресують цільовий антиген, з надлишком немічених антитіла, інкубації клітин з субоптимальною концентрацією міченого біотин антитіла з подальшою інкубацією з флуоресцентно міченим стрептавідином і аналізом за допомогою проточної цитометрії.
В одному втіленні зазначена послідовність МН першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з, щонайменше, однією з 5БЕО І МО: 117 ії БЕО ІЮ МО: 6, наприклад, з 526010 МО: 117.
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з, щонайменше, однією з з«ЕО ІЮ МО: 121 ї 5ЕО І МО: 7, наприклад, з 5ЕО ІЮО МО: 121.
В одному втіленні кожна із зазначених послідовностей МН і МІ. першої антигензв'язувальної області включає послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 9565, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з БЕО ІЮО МО: б і 5ЕО ІО МО: 7, відповідно.
В одному втіленні кожна із зазначених послідовностей УН і МІ. першої антигензв'язувальної області включає послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 9565, щонайменше, 85 956, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 90, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з 5ЗЕО ІЮО МО: 117 і 5ЕО ІО МО: 121, відповідно.
В одному втіленні послідовності МН і МІ. відрізняються тільки в не-СОВ-послідовності, наведених в 5ЕО ІО МО: 6 і 7, відповідно.
В одному втіленні послідовності МН і Мі. відрізняються тільки в не-СОВ-послідовності, наведених в 5ЕО ІЮО МО: 117 і 121, відповідно.
В одному втіленні послідовності МН і МІ. відрізняються тільки в каркасних послідовностях.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4А послідовностей МН і
МІ. першої антигензв'язувальної області на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентичні до амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕКЗ ії ЕКА4 зазначених послідовностей МН і МІ.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. першої антигензв'язувальної області на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 9бо, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, при, щонайменше, 90 96, щонайменше, 95 90, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентичні до амінокислотної послідовності з 60 відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4 послідовності УН, наведеної в
5ЗЕО ІО МО: 6, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІО МО: 7.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. першої антигензв'язувальної області на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, при, щонайменше, 90 96, щонайменше, 95 90, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентичні до амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4 послідовності МН, наведеної в
ЗЕО ІО МО: 6, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 7, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга першої антигензв'язувальної області, які мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій в порівнянні з СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельних областей важкого і легкого ланцюга, що мають послідовності, наведені в ХЕО ІО МО: 1,2, 3,4, ТІ 5, відповідно. У додатковому втіленні зазначені мутації можуть бути такими, як описано вище.
У ще одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ ії ЕК4 послідовностей
МН ї МІ. першої антигензв'язувальної області на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 96 або, щонайменше, 99 95 ідентичні до амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 6, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 7, і перша антигензв'язувальна область включає
СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ХЕО ІЮО МО: 1,2, 3,4, У Т5 і 5, відповідно.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. першої антигензв'язувальної області на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 956, при щонайменше, 90 96, щонайменше, 95 90, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентичні до амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4 послідовності УН, наведеної в
ЗЕБЕО ІЮО МО: 117, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 121, і СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга першої антигензв'язувальної області, що має в цілому від однієї до дванадцяти мутацій в порівнянні з СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, приведені в 5ХЕО ІЮО МО: 1, 2, 3, 4, ут і 5, відповідно. У додатковому втіленні зазначені мутації можуть бути такими, як описано вище.
У ще одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕКТ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4 послідовностей
МН ї МІ. першої антигензв'язувальної області на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентичні до амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕКЗ ї ЕК4 послідовності МН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 117, ії послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 121, і перша антигензв'язувальна область включає СОМКІ, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в «ЖЕО ІЮ МО: 1,2,3,4, У5 і 5, відповідно.
В одному втіленні зазначена послідовність МН першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 117.
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 121.
У додатковому втіленні зазначені послідовності МН і МІ. першої антигензв'язувальної області містять амінокислотні послідовності «ЖЕО ІО МО: 117 ї 5ЕО ІЮО МО: 121, відповідно.
В одному втіленні зазначена послідовність МН першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 6.
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 7.
У додатковому втіленні зазначені послідовності МН і МІ. першої антигензв'язувальної області
БО містять амінокислотні послідовності «БО ІЮ МО: бі 5ЕО ІЮО МО: 7, відповідно.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом може включати перше зв'язувальне плече, яке включає вказану першу антигензв'язувальну область будь-якого аспекту або втілення цього винаходу.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає перше зв'язувальне плече, яке включає вказану першу антигензв'язувальну область і константну послідовність першого важкого ланцюга.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає перше зв'язувальне плече, яке включає вказану першу антигензв'язувальну область, де перше зв'язувальне плече включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність 60 першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, що містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ).
В одному втіленні зазначений перший легкий ланцюг додатково включає константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ).
У додатковому втіленні зазначений перший важкий ланцюг включає, щонайменше, шарнірну область, область СН2 і СНЗ.
У конкретному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає перше Раб-плече, що містить зазначену першу антигензв'язувальну область.
В одному втіленні перша антигензв'язувальна область може бути отримана з мишачого антитіла.
В одному втіленні перша антигензв'язувальна область може бути отримана з химерного антитіла, такого як Спі І ор 7/4.
В одному втіленні перша антигензв'язувальна область може бути отримана з гуманізованого антитіла.
В одному втіленні перше зв'язувальне плече може бути отримане з повнорозмірного антитіла.
В одному втіленні перше зв'язувальне плече може бути отримане з повнорозмірного антитіла Ідс1, А (лямбда) або ІдсСІ1, к (каппа).
В одному втіленні перше зв'язувальне плече може бути отримане з моноклонального антитіла.
В одному втіленні зазначений перший важкий ланцюг може мати ізотип Їдс, необов'язково вибраний з групи, яка складається з Ідс1, Ід02, ІДОЗ і ІдО4.
В одному втіленні перше зв'язувальне плече може бути отримане з антитіла, яке включає
НС, що містить 5ЕО ІО МО: 118, і ІС, що містить ЗЕО ІЮО МО: 122, необов'язково з однією або більше мутаціями в константній області НС, як, наприклад, від 1 до 10, наприклад від 1 до 5, наприклад 1, 2, 3, 4 або 5 мутацій.
В одному втіленні перше зв'язувальне плече включає НС, що містить 5ХЕО ІО МО: 118, 119 або 120, і І С, що містить 5ЕО ІЮ МО: 122.
Зв'язування з СЮО137
Мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СО137 людини.
У додатковому втіленні друга антигензв'язувальна область також зв'язується з СО137 яванського макака.
В одному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, обрану з групи, яка складається з: а) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 10, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО І МО: 10, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 12, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІО МО: 12 (клон 001
СО0137),
Б) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 17, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІЮО МО: 17, |і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга СОКЗ, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 19, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО І МО: 19 (СО0137 клон 002), с) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 24, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 24, їі
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮ МО: 26, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ХЕО ІЮ МО: 26 (СО0137 клон 003), а) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 31, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 31, Її
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮ МО: 33, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ХЕО ІЮ МО: 33 (СО137 клон 004), е) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 38, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО І МО: 38, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮО МО: 40 або послідовність, в якій аж до чотирьох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІЮ МО: 40 (СО137 клон 005), 60 У СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 45, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 45, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮО МО: 47 або послідовність, де до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО 10 МО: 47 (СО137 клон 006), 9) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 52, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 52, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІО МО: 54 або послідовність, в якій аж до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 54 (СО137, клон 007), п) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 59, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО І МО: 59, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 61 або послідовність, де до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО 10 МО: 61 (СО137 клон 008), її СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 66, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 66, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІО МО: 68 або послідовність, де до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО 10 МО: 68 (СО137 клон 009),
Ї) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 73, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 73, |і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІО МО: 75 або послідовність, де до чотирьох амінокислот модифіковані в ЗЕО І МО: 75 (СО0137 клон 010),
КЮ СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 80, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО І МО: 80, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮО МО: 82 або послідовність, в якій аж до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 82 (клон 011
СО0137),
І) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 87, або послідовність, в якій до чотирьох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 87, і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІО МО: 89 або послідовність, де до чотирьох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 89 (С0137 клон 012), і т) СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (ї) конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до будь-якого з пунктів від а) до Ї) і/або (ії), має специфічність до СЮО137 антитіла, яке містить СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга за допомогою одного з а) -Ї).
У додатковому втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область додатково включає
СОК'І ї СОК2 області важкого і/або легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 8, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в зХЕО ІЮО МО: 8, і/або СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО: 9, або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІЮО МО: 9, і/або СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 11, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІО МО: 11, (або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність КАБ, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в КА5 (СО137 клон 001),
Б) СОК'І варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 15, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в зЗЕО ІЮ МО: 15, і/або СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 16 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІО МО: 16, і/або СОК1
БО варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 18, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 18 і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність КА5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в КА5 (СО137 клон 002), с) СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 22, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в ХЕО ІЮ МО: 22, і/або СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 23 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 23, і/або СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 25, або послідовність, в якій до двох амінокислот є модифіковані в ЗЕО ІЮ МО: 25 і/або СОК2 60 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність КТ5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в КТ5 (СО137 клон 003), а) СОК1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 29, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в зЕО ІЮО МО: 29, і/або СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 30 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 30, і/або СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 32, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 32 і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність СА5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в зА5 (СО137 клон 004), е) СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 36, або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ХЕО ІЮО МО: 36, і/або
СОКЗ2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 37 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 37, і/або СОМ! варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 39, або послідовність, в якій до двох амінокислот є модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 39/або СОМК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність БАЗ або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в ЗА5 (СО137 клон 005),
У СОК'І варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 43, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в зЕО ІЮО МО: 43, і/або СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 44 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 44, і/або СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 46, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 46 і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність АА5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в АА5 (СО137 клон 006), 9) СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 50, або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ХЕО ІЮО МО: 50, і/або
СОКЗ2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в зЕО ІО МО: 51 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ХЕО ІЮ МО: 51, і/або СОК!1
Зо варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 53, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в ХЕО ІЮО МО: 53/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність КАБ або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в КА5 (СО137 клон 007),
Р) СОК варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 57, або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 57, і/або
СОКЗ2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 58 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ХЕО ІЮ МО: 58, і/або СОК!1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 60, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в ЗЕО 10 МО: 60, і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність КА5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в КА5 (СО137 клон 008), ї) СОК!І варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ
МО: 64, або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 64, і/або
СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в зЕО ІЮО МО: 65 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ХЕО ІЮ МО: 65, і/або СОК!1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 67, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в ЗЕБЕО 10 МО: 67, і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність СА5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в ЗА5 (СО137 клон 009),
Ї) СОК! варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 71, або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 71, і/або
СОКЗ2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 72 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ХЕО ІЮ МО: 72, і/або СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 74, або послідовність, в якій до двох амінокислот є модифіковані в 5ЕО ІЮ МО: 74/або СОМК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність КА5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в КА5 (СО137 клон 010),
КЮ СОК варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 78, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в ХЕО ІО МО: 78, і/або СОК2 бо варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 79 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІО МО: 79, і/або СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 81, або послідовність, в якій до двох амінокислот є модифіковані в ЗЕО ІЮ МО: 81 і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність ОТ5 або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в ОТ5 (СО137 клон 011), і
І) СОК1 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 85, або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІЮО МО: 85, і/або
СОКЗ2 варіабельної області важкого ланцюга, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮ МО: 86 або послідовність, в якій аж до двох амінокислот модифіковані в ЗЕО ІЮ МО: 86, і/або СОК!1 варіабельної області легкого ланцюга, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 88, або послідовність, в якій до двох амінокислот модифіковані в 5ЕО ІО МО: 88, і/або СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, який має послідовність ЗАЗ або послідовність, де до двох амінокислот модифіковані в 5А5 (клон 012 СО137).
В одному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОН? і
СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 8, 9 і 10, відповідно, і СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 11, КАЗ і 12, відповідно (СО137 клон 0О1), в) СОК1, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 15, 16 і 17, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 18, КАБ і 19, відповідно (СО0137 клон 002), с) СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 22, 23 і 24, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 25, КТ5 і 26, відповідно (СО137 клон 003), а) СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 29, 30 ї 31, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 32, АБ і 33, відповідно (СО137 клон 004), е) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 39, 5А5 і 40, відповідно (СО137 клон 005),
У СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 43, 44 і 45, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 46, ДАА5 і 47, відповідно (СО0137 клон 006), 9) СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 50, 51 їі 52, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 53, КАБ і 54, відповідно (СО137 клон 007), п) сСОК1, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 57, 58 і 59, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 60, КАБ і 61, відповідно (СО137 клон 008), ї СОкК1, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 67, АБ і 68, відповідно (СО137 клон 009), ) СОК1, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 71, 72 і 73, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 74, КАБ і 75, відповідно (СО137 клон 010),
Ю СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 78, 79 і 80, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 81, ОТ5 і 82, відповідно (СО137 клон 011), 60 ) СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності,
наведені в 5ЕО ІЮ МО: 85, 86 і 87, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 88, 5АБ5 і 89, відповідно (СО0137 клон 012), т) СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюгів згідно будь-якого з пунктів а) - Ї), що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій, і п) СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга за допомогою одного з пунктів а) -т) і/або (ії) має специфічність до СО137 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга за одним з пунктів а) -т).
Таким чином, друга антигензв'язувальна область може містити послідовності СОКІ1, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла СО137, як зазначено в таблиці 1; тобто СО137 клон 001, СО137 клон 002, СО137 клон 003, СО137 клон 004, СО137 клон 005,
СО0137 клон 006, СО0О137 клон 007, СО137 клон 008, СО137 клон 009, СО137 клон 010, СО137 клон 011 або СО137 клон 012. зокрема, друга антигензв'язувальна область може містити послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга з одного і того ж клону антитіла СО137, необов'язково, де каркасні області бажано є каркасними областями людини, які необов'язково містять одну або більше амінокислотних зворотних мутацій амінокислотної послідовності, відмінних від людської.
У додатковому втіленні друга антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (ї) конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до будь-яким з а) - т) і/або (ії) має специфічністю до СО137 антитіла, що містить СОКІ, СОМ і
СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга згідно будь-якого з а) -т).
В одному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область зв'язується з СО137 людини (5ЕО ІО МО: 92) більшою мірою, ніж вона зв'язується з мутантним СО137 людини (5ЕО
І МО: 93). Мутантний СО137 людини 5ЕБО І МО: 93 також згадується в цьому описі як тасування 6.
В іншому втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область зв'язується з СЮО137 людини (ЗЕО ІО МО: 92) більшою мірою, ніж вона зв'язується з мутантним СО137 людини (5ЕО ІЮО МО: 94). Мутантний СО137 людини 5ЕО ІО МО: 94 також згадується в цьому описі як тасування 5.
У додатковому втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область зв'язується з СО137 людини (5ЕО ІО МО: 92) в такій же мірі, в якій вона зв'язується з мутантним СО137 людини (ЗЕО ІО МО: 95). Мутантний СО137 людини 5ЕО ІЮ МО: 95 також згадується в цьому описі як тасування 4.
У контексті даного винаходу "в більшій мірі" означає, що афінність другої антигензв'язувальної області вища для СО137 людини (5ЕО ІЮ МО: 92), ніж для мутантного
СО0137 людини (ЗЕО ІО МО: 93 і 94, тасування 6 і 5, відповідно). Якщо немає зв'язування з мутантним СО137, афінність до людського СО137 буде незрівнянно вищою, ніж до зазначеного мутантного СО137. Однак у випадку зв'язування з зазначеним мутантом СО137 афінність може бути в 2 рази, наприклад, в 3, 4, 5 або 6 разів вища для СО137 людини, ніж для відповідного мутантного СО137.
У контексті даного винаходу "в тій же мірі" означає, що афінність другої антигензв'язувальної області подібна для СЮО137 людини (5ЕО І МО: 92) і для мутантного
СО0137 людини (5ЕО ІО МО: 95, тасування 4). Зокрема, "подібний" в даному контексті може означати, що афінність до людського СО137 і до зазначеного мутантного СО137 відрізняється максимально в 2,5 рази, наприклад в 2,2 рази, або в 2,0, або в 1,8 разів, або в 1,75 разів або в 1,5 рази.
Мутантний СО137 людини в 5ЕО ІЮ МО: 93 відповідає амінокислотній послідовності СО137 людини, де амінокислоти 24-47 (тасування-б) були замінені відповідними амінокислотами з
СО137 дикого кабана.
Таким чином, в одному втіленні друга антигензв'язувальна область зв'язується з епітопом
СО0137 людини, який включає або для якого потрібна одна або більше амінокислот |, 0, 0, Р, С, 5,М, С, Р, А, 0, Т, Е, С.О, М, М, К, М, О, І, С, 5 і Р в положеннях 24-47 5ЕО ІЮО МО: 92 (відповідає
ЗЕО ІО МО: 129).
Мутантний СО137 людини в 5ЕО ІЮ МО: 94 відповідає амінокислотній послідовності СО137 людини, де амінокислоти 48-88 (тасування-5) були замінені відповідними амінокислотами з
СО0137 африканського слона.
Таким чином, в одному втіленні друга антигензв'язувальна область зв'язується з епітопом 60 СО0137 людини, який включає або для якого потрібна одна або більше амінокислот С, Р, Р, М, 5,
Е,5,5,А, 0, 0,0, 8, Т,С,0,І,С,К, ОО, С,К, О.М, ЕК, Т,Е,К,Е, С, 5,5,1,5,М А, Е,С, Обі С в положеннях 48-88 5ЕО ІЮ МО: 92 (відповідає 5Е0 ІЮО МО: 130).
Мутантний СО137 людини в 5ЕО ІЮО МО: 95 відповідає амінокислотної послідовності СО137 людини, де амінокислоти 59-114 (тасування-4) були замінені відповідними амінокислотами з
СО0137 африканського слона.
Таким чином, в одному втіленні друга антигензв'язувальна область не зв'язується з епітопом СО137 людини, який включає або яким потрібно одна або більше амінокислот Т, Р, б,
Е,Н, С, б, А, 0,С,5,М,С,Е, 0,0, С,К, ОО, 0, ОО, Е, І Т і К 89-114 в положеннях 5ЕО ІЮ МО: 92 (відповідає 5ЕО ІО МО: 131).
В одному втіленні зв'язування з мутантом і СО137 людини може бути виконано у вигляді аналізу з тасування, описаного в Прикладі 2. Таким чином, зв'язування з СО137 людини (ЗЕО І
МО: 92) і мутантом СО137 людини (5ЕО І МО: 93, 94 і 95) може бути визначено шляхом приготування змішаних конструкцій, отриманих з СО137 людини, в яких білкові домени СО137 людини замінені відповідним доменом СО137 з різних видів, використовуючи СО137 людини і
СО137 різних видів як еталонних конструкцій; шляхом трансдукції клітин плазмідами, що кодують еталонну конструкцію або змішані конструкції, відповідно, і шляхом вимірювання зв'язування антитіла з кожної з цих конструкцій СО137 за допомогою проточної цитометрії, такий як ЕАС5.
Втрата зв'язування з деякими змішаними конструкціями вказує на те, що відповідна область, ймовірно, залучена в епітоп антитіла. Таким чином, білкові домени СЮО137 людини, що вносять вклад в епітоп антитіл проти СЮО137 людини, можуть, таким чином, бути визначені за допомогою аналізу з тасування. Різні види СО137, використовувані для створення змішаних конструкцій, слід вибирати таким чином, щоб моноклональні антитіла проти СО137 людини не зв'язувалися з цільним білком СО137 з цих різних видів (еталонна конструкція).
Визначення зв'язування з СО137 людини і його мутантами, зокрема, може бути виконано за допомогою моноклонального антитіла, що містить дві другі антигензв'язувальних області відповідно до даного винаходу.
В одному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК?2 і
СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 8, 9 і 10, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 11, КАЗ і 12, відповідно (СО137 клон 0О1), в) СОК1, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 15, 16 ії 17, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 18, КАБ і 19, відповідно (СО0137 клон 002), с) СОВІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 39, 5А5 і 40, відповідно (СО137 клон 005), а) СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 43, 44 і 45, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 46, ДАА5 і 47, відповідно (СО137 клон 006), е) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 67, БАЗ і 68, відповідно (СО137 клон 009),
У СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 71, 72 і 73, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 74, КАБ і 75, відповідно (СО137 клон 010), 9) СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 85, 86 і 87, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 88, 5А5 і 89, відповідно (СО0137 клон 012), п) СО, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга за одним з пунктів а) - 9), що має в цілому від однієї до дванадцяти мутацій, і 60 ї) СОКІ!, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її)
конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга за одним з пунктів а) -й) і/або (ії) має специфічністю до СО137 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга за одним з пунктів а) -П).
Отже, в одному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 67, АБ і 68, відповідно (СО137 клон 009), р) СОК1, СОКО2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга згідно а), що має в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; с) СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (і) конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б) і/або (ії)) має специфічність до СЮО137 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або б).
В іншому втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОВІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 39, 5А5 і 40, відповідно (СО0137 клон 005), р) СОК1, СОКО2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга згідно а), що має в цілому від однієї до дванадцяти мутацій, і с) СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або б) і/або (ії)) має специфічність до СЮО137 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або б).
У конкретному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ1, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 67, САБ5 і 68, відповідно. Приклад такого антитіла включає, не обмежуючись названим, антитіло, згадане в цьому описі як клон 0013 СО137.
В іншому втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОН і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 36, 37 і 38, відповідно, ії СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 39, 5А5б і 40, відповідно. Приклад такого антитіла включає, не обмежуючись названим, антитіло, згадане в цьому описі як клон 005 СО137.
В іншому втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 67, БАЗ і 68, відповідно (СО137 клон 009), що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій, як наприклад від однієї до десяти мутацій, або від однієї до восьми мутацій, або від однієї до шести мутацій, або від однієї до чотирьох мутацій, або до двох мутацій.
В іншому втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОН? і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 36, 37 і 38, відповідно, ії СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в зЕО ІЮ МО: 39, 5А5 і 40, відповідно (СО137, клон 005), що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій, як наприклад від однієї до десяти мутацій, або від однієї до восьми мутацій, або від однієї до шести мутацій, або від однієї до чотирьох мутацій, або від однієї до двох мутацій .
В одному втіленні зазначена мутація може бути амінокислотну заміну, таку як консервативна амінокислотна заміна.
В одному втіленні зазначені мутації можуть бути розподілені по СОК1,2ізУнісСсок1,2і3
МІ, так що кожна з СОКЗ МН і МІ. включає не більше трьох мутацій, і кожна з СОК2 і СОКІ МНі
МІ. включає не більше двох модифікацій амінокислот. 60 Отже, в додатковому втіленні друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК?2 і
СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 64, 65, 66, 67,
САБ і 68, відповідно (клон СО137 009), що мають в загальній складності від однієї до дванадцяти мутацій і в яких СОКЗ МН і МІ. кожна включає до трьох амінокислотних модифікацій, а СОКІ ї СОКО2 МН і Мі кожна включає до двох амінокислотних модифікацій.
У додатковому втіленні друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮО МО: 64, 65, 66, 67, СА5 і 68, відповідно (клон 009 СО137), що мають в цілому від однієї до десяти мутацій, як, наприклад, від однієї до восьми, і де СОКІ, СОК2 ії СОКЗ МН їі МІ. кожна включає до двох амінокислотних модифікацій.
У додатковому втіленні друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮО МО: 64, 65, 66, 67, СА5 і 68, відповідно (клон 009 СО137), що мають в цілому від однієї до шести мутацій, і де СОК'І,
СОК2 і СОКЗ МН і МІ, кожна містить, по більшій мірі, одну амінокислотну модифікацію.
В іншому втіленні друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 36, 37, 38, 39, 5А5 і 40, відповідно (СО137, клон 005), що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій, і в яких
СОМКЗ МН їі Мі кожна включає до трьох амінокислотних модифікацій, а СОКІ і СОКІ2 МН і Мі, кожна включає до двох амінокислотних модифікацій.
У наступному втіленні друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОМК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮО МО: 36, 37, 38, 39, З5А5 і 40, відповідно (клон 005 СО137), що мають в цілому від однієї до десяти мутацій, як наприклад від однієї до восьми, і де СОКІ, СОК2 і СОКЗ МН і МГ, кожна включає до двох амінокислотних модифікацій.
У наступному втіленні друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮО МО: Зб, 37, 38, 39, 5А5 і 40, відповідно (клон 005 СО137), що мають в цілому від однієї до шести мутацій, і де СОК'І,
СО2 і СОКЗ МН і МІ, кожна включає по більшій мірі одну амінокислотну модифікацію.
У додатковому втіленні може бути в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; як, наприклад, від однієї до десяти мутацій, або від однієї до восьми мутацій, або від однієї до шести мутацій, або від однієї до чотирьох мутацій, або від однієї до двох мутацій; і кожна послідовність СОК включає не більше двох амінокислотних замін.
Фахівцю в даній галузі добре відомо, як вводити мутації і що певні амінокислоти послідовностей СОК можуть бути піддані мутацій; наприклад, за рахунок амінокислотних замін, наприклад, для збільшення афінності антитіла до його цільовим антигену або зниження імуногенності для антитіл, які не є людськими, при використанні для лікування людей. Такі мутації можуть бути введені без впливу на епітоп цільового антигену, з яким зв'язується антитіло.
В одному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), причому кожна із зазначених варіабельних послідовностей включає три послідовності СОК, СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ, відповідно.
В одному втіленні зазначена друга антигензв'язувальна область включає варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), причому кожна із зазначених варіабельних послідовностей включає три послідовності СОК, СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, відповідно, і чотири каркасні послідовності, ЕК1, ЕК2,
ЕКЗ ї ЕКАЯ4, відповідно.
В одному втіленні зазначена послідовність МН другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з амінокислотною послідовністю, обраною з групи, яка складається з: а) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 123 (гуманізоване СО137 клон 009) р) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 13 (СО0137 клон 001) с) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 20 (СО137, клон 002) а) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 27 (СО137, клон 003) е) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 34 (СО137, клон 004)
І) послідовності МН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 41 (СО0137, клон 005) 9) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 48 (СО137, клон 006)
Р) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 55 (СО137, клон 007) бо ії) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 62 (С0137, клон 008)
)) послідовності МН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 69 (СО137, клон 009)
К) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 76 (СО137, клон 010 СО137)
І) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 83 (СО137, клон 011) т) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 90 (СО137, клон 012)
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності, обраної з групи, яка складається з: а) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 127 (гуманізоване СО137, клон 009) р) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІО МО: 14 (СО137, клон 001) с) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 21 (СО0137, клон 002) а) послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 28 (СО137, клон 003) е) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 35 (СО0137, клон 004)
У послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 42 (СО0137, клон 005) 9д) послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 49 (СО137, клон 006)
Р) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІО МО: 56 (СО137, клон 007) ії) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 63 (СО137, клон 008) )) послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 70 (СО0137, клон 009)
К) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІО МО: 77 (СО137, клон 010)
І) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 84 (СО137, клон 011) т) послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ОО МО: 91 (СО137, клон 012)
В одному втіленні кожна із зазначених послідовностей МН і Мі. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 у95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності, обраної з групи, яка складається з: а) послідовності МН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 123, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ
МО: 127 (гуманізоване СО137, клон 009)
Зо р) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 13, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 14 (С0137, клон 001) с) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 20, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 21 (С20137, клон 002) а) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 27, і послідовності МІ, наведеної в 5ХЕО ІЮО МО: 28 (С0137, клон 003) е) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 34, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 35 (С0137, клон 004)
І) послідовності МН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 41, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 42 (20137, клон 005) 9) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 48, і послідовності МІ, наведеної в 5ХЕО ІЮО МО: 49 (20137, клон 006)
Р) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 55, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 56 (СО137, клон 007) ії) послідовності МН, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 62, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 63 (СО137, клон 008) ) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 69, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 70 (С0137, клон 009)
К) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 76, і послідовності МІ, наведеної в 5ХЕО ІЮО МО: 77 (60137, клон 010)
БО І) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 83, і послідовності МІ, наведеної в 5ХЕО ІЮО МО: 84 (С0137, клон 011) т) послідовність УН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 90, і послідовність МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 91 (С0137, клон 012).
В одному втіленні зазначена послідовність МН другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності, обраної з групи, яка складається з: а) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 123 (гуманізоване СО137, клон 009) бо р) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 41 (СО0137, клон 005)
с) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 69 (СО137, клон 009)
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності, обраної з групи, яка складається з: а) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 127 (гуманізоване СО137, клон 009) р) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 42 (СО137, клон 005) с) послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 70 (СО137, клон 009)
В одному втіленні кожна із зазначених послідовностей МН і МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 90, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 96, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 у95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності, обраної з групи, яка складається з: а) послідовності МН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 123, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ
МО: 127 (гуманізоване СО137, клон 009) р) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 41, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 42 (20137, клон 005) с) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 69, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 70 (20137, клон 009).
В одному втіленні зазначена послідовність МН другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 о, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична з 5ЕО ІЮО МО: 41 (СО137, клон 005).
В одному втіленні зазначена послідовність УН другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 уо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 956, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична з 5ЕО ІЮ МО: 69 (СО137, клон 009).
В одному втіленні зазначена послідовність МН другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з 5ЗЕО ІО МО: 123 (гуманізоване СО137, клон 009).
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 о, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична з 5ЕО ІЮО МО: 42 (СО137, клон 005).
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 о, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична з 5ЕО ІЮ МО: 70 (СО137, клон 009).
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 бо, щонайменше, 85 96, щонайменше, 90 965, щонайменше, 95 95, при, щонайменше, 97 90, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з 5ЕО ІО МО: 127 (гуманізоване СО137, клон 009).
В одному втіленні зазначена МН і зазначена МІ. послідовність другої антигензв'язувальної області, кожна, містять амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 у6, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 9565, щонайменше, 90 95, при, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична з 5ЕО ІЮ МО: 41; і БЕО ІЮ МО: 42 (СО137, клон 005), відповідно.
В одному втіленні кожна із зазначених послідовностей МН і МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 90, щонайменше, 80 9565, щонайменше, 85 96, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 956, щонайменше, 97 У6 або, щонайменше, 99 95 ідентична з ЗЕО ІЮ МО: 69 ії 5ЕО ІЮ МО: 70 (СО0137, клон 009), відповідно.
В одному втіленні кожна із зазначених послідовностей МН і МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 У, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична з ФЕО ІЮО МО: 123 ії 5ЕО ІЮО МО: 127, відповідно (гуманізоване СО137, клон 009). 60 В одному втіленні зазначені послідовності МН і Мі відрізняються тільки в каркасних послідовностях.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. першої та/або другої антигензв'язувальних області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 96, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕЕЗ і ЕК4 зазначених послідовностей МН і
МІ.
В одному втіленні послідовності УН ії МІ. відрізняються тільки в послідовності, які не є СОК, наведених в 5ЕО ІО МО: 41 і 42, відповідно (СО137, клон 005).
В одному втіленні послідовності УН і МІ. відрізняються тільки в послідовності, які не є СОК, наведених в 5ЕО ІО МО: 69 і 70, відповідно (СО137, клон 009).
В одному втіленні послідовності УН ії МІ. відрізняються тільки в послідовності, які не є СОК, наведених в 5ЕО ІЮО МО: 123 і 127, відповідно (гуманізоване СО137, клон 009).
В одному втіленні послідовності МН і МІ. відрізняються тільки в каркасних послідовностях.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. першої та/або другої антигензв'язувальних області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 96, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕЕЗ і ЕКА4 зазначених послідовностей МН і
МІ.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, при, щонайменше, 90 96, щонайменше, 95 90, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4 послідовності УН, наведеної в
ЗЕО ІО МО: 41, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 42.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕКТ, ЕК2, ЕКЗ їі ЕКА4 послідовностей МН і
МІ. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, при, щонайменше, 90 96, щонайменше, 95 90, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4 послідовності УН, наведеної в
ЗБЕО ІЮО МО: 41, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 42, і СОК1І, СОК2 ії сок варіабельної області важкого і легкого ланцюга другої антигензв'язувальної області мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій в порівнянні з СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 36, 37, 38, 39, ЗАБ5 і 40, відповідно . У додатковому втіленні зазначені мутації можуть бути такими, як описано вище.
Ще в одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕКТ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4 послідовностей
МН ї Мі. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 9565, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична амінокислотній послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовності УН, наведеній в 5ЕО ІЮО МО: 41, і послідовності МІ, наведеній в ЗЕО ІЮО МО: 42, і друга антигензв'язувальна область включає
СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 36, 37, 38, 39, АБ і 40, відповідно.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 69, і послідовності МІ, наведеної в ЗХЕО ІЮО МО: 70.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК!Т, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4 послідовностей МН і
МІ. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 69, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 70, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга другої антигензв'язувальної області мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій в порівнянні з СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого 60 ланцюга, мають послідовності, наведені в зЕО ІЮО МО: 64, 65, 66, 67, САЗ і 68, відповідно. У додатковому втіленні зазначені мутації можуть бути такими, як описано вище.
Ще в одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕКТ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4 послідовностей
МН ї Мі. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 69, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 70, і друга антигензв'язувальна область включає
СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 64, 65, 66, 67, САЗ і 68, відповідно.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ ії ЕКА4А послідовностей МН і
МІ. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, при, щонайменше, 90 96, щонайменше, 95 90, щонайменше, 97 96, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4 послідовності УН, наведеної в
ЗЕО ІЮО МО: 123 і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО І МО: 127.
В одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА послідовностей МН і
МІ. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 У, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕКЗ ї ЕК4 послідовності МН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 123, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 127, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюгів другої антигензв'язувальної області мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій в порівнянні з СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮО МО: 64, 65, 66, 67, САЗ і 68, відповідно. У додатковому втіленні зазначені мутації можуть бути такими, як описано вище.
У ще одному втіленні відповідні каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕЕЗ ї ЕКА4 послідовностей
МН ї Мі. другої антигензв'язувальної області мають, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 У, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотної послідовності з відповідними каркасними послідовностями ЕК, ЕК2, ЕКЗ ї ЕК4 послідовності МН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 123, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 127, і друга антигензв'язувальна область включає СОМКІ, СОМК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЖЕО ІЮО МО: 64, 65, 66 67, САЗ і 68, відповідно.
В одному втіленні зазначена послідовність УН другої антигензв'язувальної області включає
ЗБЕО ІЮО МО: 123 (клон 009 гуманізовані СО137).
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає
ЗБОЮ МО: 127 (клон 009 гуманізовані СО137).
В одному втіленні зазначені послідовності МН і Мі другої антигензв'язувальної області містять 5ЕО ІО МО: 1231 5ЕО ІЮО МО: 127, відповідно.
В одному втіленні зазначена послідовність УН другої антигензв'язувальної області включає послідовність УН, обрану з групи, яка складається з: а) ЗЕО ІЮО МО: 41 (СО137, клон 005)
Б) ЗЕО ІЮ МО: 69 (СО0137, клон 009)
В одному втіленні зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає послідовність МІ., обрану з групи, яка складається з: а) ЗЕО ІЮ МО: 42 (СО137, клон 005)
Б) ЗЕО ІЮ МО: 70 (СО0137, клон 009)
В одному втіленні зазначені послідовності МН і МІ. другої антигензв'язувальної області обрані з групи, яка складається з:
БО а) послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 41, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 42 (С0137, клон 005), р) послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІО МО: 69, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 70 (20137, клон 009).
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає другу зв'язувальне плече, яке включає вказану другу антигензв'язувальну область.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає другу зв'язувальне плече, яке включає вказану другу антигензв'язувальну область і другу константну послідовність важкого ланцюга.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає 60 другу зв'язувальне плече, яке включає вказану другу антигензв'язувальну область, причому друге зв'язувальне плече включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг, що містить варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МУ.
В одному втіленні зазначена другий легкий ланцюг додатково включає константну послідовність другого легкого ланцюга.
У додатковому втіленні зазначена другий важкий ланцюг включає, щонайменше, шарнірну область, область СН2 і СНЗ.
У конкретному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає другу РГаб-плече, що містить зазначену другу антигензв'язувальну область.
В одному втіленні друга антигензв'язувальна область отримана з кролячого антитіла, як наприклад, будь-якого з клонів 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ї 12 антитіла проти СО137, зокрема, будь-якого з клонів 5 і 9 антитіла проти СО137, розкритих в даному описі.
В одному втіленні друга антигензв'язувальна область отримана з химерного антитіла, такого як антитіло, яке містить варіабельну ділянку з будь-якого з клонів 1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,11Її 12 антитіла проти СО137, зокрема, будь-якого з клонів 5 і 9 антитіла проти СО137, розкритих в даному описі.
В одному втіленні друга антигензв'язувальна область отримана з гуманізовані антитіла.
В одному втіленні друге зв'язувальне плече отримано з повнорозмірного антитіла.
В одному втіленні друге зв'язувальне плече отримано з повнорозмірного антитіла Їдс1, А (лямбда) або ІдсСІ1, к (каппа).
В одному втіленні друге зв'язувальне плече отримано з моноклонального антитіла.
В одному втіленні зазначений другий важкий ланцюг відноситься до ізотипу Ідо, необов'язково підкласу, вибраного з групи, яка складається з Ідс1, Ідс2, Ід і Ідо4.
В одному втіленні перше зв'язувальне плече може бути отримане з антитіла, що включає
НС, що містить 5ЕО ІО МО: 124, і ІС, що містить ЗЕО ІЮО МО: 128, необов'язково з однією або більше мутаціями в константній області НС, як наприклад, з 1-10, наприклад з 1-5, наприклад з 1, 2, 3, 4 або 5 мутаціями.
В одному втіленні перше зв'язувальне плече включає НС, що містить 5ЕО ІЮО МО: 124, 125
Зо або 126, і І С, що містить 5ЕО ІЮ МО: 128.
Зв'язування з СО40 і СО137
У деяких втіленнях даний винахід відноситься до мультиспецифічного антитіла, яке містить: (І) першу антигензв'язувальну область, пов'язану з СО40 людини, де зазначена перша антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 1, 2 і 3, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в зХЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно, в) СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга згідно а), що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; і с) СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО40 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б) і/або (ії) а) має специфічність до СЮО40 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б), і (І) другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СЮО137 людини, де зазначена друга антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: х) СОКІ, СОК2 ї СОКУ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності,
БО наведені в 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 67, АБ і 68, відповідно (СО0137, клон 009), у) СОКІ1, СО і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до х), Що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; і 7) СОК1, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до х) або у) і/або (ії)) має специфічність до СЮО137 антитіла, що містить СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до х) або у). 60 В іншому втіленні даний винахід відноситься до мультиспецифічному антитілу, який містить:
(І) першу антигензв'язувальну область, пов'язану з СО40 людини, де зазначена перша антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 1, 2 і 3, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в зХЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно, в) СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга згідно а), що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; і с) СОКІ, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО40 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б) і/або (ії) має специфічністю до СО40 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до а) або Б), і (І) другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СЮО137 людини, де зазначена друга антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого і легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: х) СОКІ, СОК2 ї СОКУ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 39, 5АБ5 і 40, відповідно (СО137, клон 005), у) СОКІ1, СО і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до х), Що мають в цілому від однієї до дванадцяти мутацій; і 7) СОВІ, СОВ2 ї СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга антитіла, яке (Її) конкурує за зв'язування СО137 людини з антитілом, що містить СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до х) або у) і/або (ії)) має специфічність до СЮО137 антитіла, що містить СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого і легкого ланцюга відповідно до х) або у).
Отже, в одному втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ1,
СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності,
Зо наведені в ЗЕО ІЮО МО: 1, 2 і 3, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності, наведені в 5260 ІЮО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно; і зазначена друга антигензв'язувальна область містить а) СОКІ, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІО МО: 67, САЗ і 68, відповідно (СО136, клон 009), або в) СОК1, СОК2 ї СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 52ЕО ІЮО МО: 39, БА5 і 40 (С0137, клон 005), відповідно.
В іншому втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 ії 3, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕБЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно; і зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 66, відповідно, і варіабельну область легкого ланцюга СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮ МО: 67, САЗ і 68, відповідно (СО137, клон 009).
В іншому втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 ії 3, відповідно, і СОК!І, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕБЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідної і зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОМК2 і СОМКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ХЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, ії СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ХЕО ІЮ МО: 39,
ЗА5Б і 40, відповідно (СО137, клон 005).
У додатковому втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом включає варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (УН) і варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МГ), а зазначена 60 друга антигензв'язувальна область мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом включає варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), причому кожна із зазначених варіабельних послідовностей включає три послідовності СОК, СОКІ, СОК2 і СОКЗ, відповідно, і чотири каркасні послідовності ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4, відповідно.
У додатковому втіленні кожна зазначена послідовність МН і МІ. першої антигензв'язувальної області включає послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 965, щонайменше, 85 96, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична до амінокислотної послідовності МН, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 6, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІО МО: 7, відповідно, і кожна зазначена послідовність МН і МІ. другої антигензв'язувальної області включає послідовність, яка на, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 96, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 956 або щонайменше, 99 95 ідентична до амінокислотної послідовності
МН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 41, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 42, відповідно (СО137, клон 005).
В іншому додатковому втіленні кожна зазначена послідовність МН і МІ першої антигензв'язувальної області включає послідовність, яка на, щонайменше, 70 965, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95 або, щонайменше, 99 95 ідентична до амінокислотної послідовності МН, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 6, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 7, відповідно, і кожна зазначена послідовність УН і МІ. друга антигензв'язувальна область і включає послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 96 або щонайменше, 99 95 ідентична до амінокислотної послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІО МО: 69, і послідовності МІ, наведеної в
ЗЕО ІО МО: 70, відповідно (СО137, клон 009).
В іншому додатковому втіленні кожна зазначена послідовність МН і МІ першої антигензв'язувальної області включає послідовність, яка на, щонайменше, 70 965, щонайменше, 75 96, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 96, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності
МН, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 117, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 121, відповідно, і кожна зазначена послідовність МН і Мі другої антигензв'язувальної області включає послідовність, що містить, щонайменше, 70 95, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 96, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 96, щонайменше, 97 956, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності УН, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 123, і послідовності МІ, наведеної в 5ЕО ІО МО: 127, відповідно (гуманізоване СО137, клон 009).
У конкретному втіленні даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, який містить (І) перше зв'язувальне плече, яке включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ) і константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), і де зазначена варіабельна послідовність першого важкого ланцюга включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 1, 2 і З, відповідно, і зазначена послідовність першого легкого ланцюга включає СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 52ЕО ІЮО МО: 4, УтТ5 і 5, відповідно, і (ІЇ) друге зв'язувальне плече, яке включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг додатково включає константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ), і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), де зазначена варіабельна послідовність другого важкого ланцюга включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІО МО: 64, 65 і 66, відповідно, і зазначена послідовність другого легкого ланцюга включає СОКІ СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 67, САЗ і 68, відповідно (СО137, клон 009); де перший і другий важкі ланцюги мають відносяться до ізотипу ЇдО1 людини, і де перший і другий легкі ланцюги відносяться до Ідс1, к, і де положення, які відповідають положенням 1 234, 235 ії 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ як константної послідовності першій, так і другій важкого ланцюга є РЕ, Е і А, відповідно, і де (а) положення, яке відповідає 405 важкого ланцюга Ід51 людини, відповідно до нумерації ЄЮ константної послідовності першого важкого ланцюга, є І, і положення, яке відповідає К 409 важкого ланцюга
ІдО1 людини, відповідно до нумерації БО константної послідовності другого важкого ланцюга, є
КЕ; або (Б) положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга їдс!1 людини, відповідно до 60 нумерації БО константної послідовності першого важкого ланцюга, К, і положення, що відповідає 405 важкого ланцюга Ід51 людини, відповідно до нумерації ЄЮ константної послідовності другого важкого ланцюга є Ї.
У додатковому конкретному втіленні даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, який містить (І) перше зв'язувальне плече, яке включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ) і константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), і де зазначена варіабельна послідовність першого важкого ланцюга включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 1, 2 ії З, відповідно, і зазначена послідовність першого легкого ланцюга включає СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 52ЕО ІЮО МО: 4, УтТ5 і 5, відповідно, і (ІЇ) друге зв'язувальне плече, яке включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (УН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг додатково включає другу послідовність константної (СІ) легкого ланцюга, і другу варіабельну послідовність легкого ланцюга (МІ), де зазначена варіабельна послідовність другого важкого ланцюга включає СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, і зазначена послідовність другого легкого ланцюга включає СОКІ СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності, наведені в ЗЕО ІО МО: 39, ЗАЗ і 40, відповідно (СО137, клон 005); і де перший і другий важкі ланцюги відносяться до ізотипу ЇДС1 людини і де перший і другий легкі ланцюги відносяться до ІдО1, к, і де положення, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БО як константної послідовності першого, так і другого важкого ланцюга є Е, ЕЕ і А, відповідно, і де (а) положення, яке відповідає
Е405 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕЮ константної послідовності першого важкого ланцюга, є ГЇ, і положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації БЮ константної послідовності другого важкого ланцюга, є К; або (Б) положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЕО константної послідовності першого важкого ланцюги, є К, і положення, що відповідає Е405 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БЮ константної послідовності другого важкого ланцюга є Ї.
У конкретному втіленні даний винахід відноситься до біспецифічного антитіла, яке включає (І) перше зв'язувальне плече, яке включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ) і константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), причому кожна з зазначених перших послідовностей УН і МІ. включають послідовність, яка на, щонайменше, 70 о, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 117, і послідовності МІ, наведеної в
ЗЕО ІЮО МО: 121, відповідно, і (ІЇ) друге зв'язувальне плече, яке включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (УН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг додатково ЗЕО ІЮО МО: 127, відповідно включає константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ), і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), де зазначені другі послідовності МН і Мі. містять послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 У6, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 96, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, п про щонайменше, 97 95, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності УН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 123, і послідовності МІ, наведеної в (гуманізоване СО137, клон 009).
У додатковому конкретному втіленні даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, що включає (І) перше зв'язувальне плече, яке включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ) і константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), причому зазначена перша послідовність МН включає 5ЕО ІЮО МО: 117, а зазначена перша послідовність МІ. включає
ЗБЕО ІО МО: 121, та (ІЇ) друге зв'язувальне плече, яке включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну 60 послідовність другого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність другого важкого ланцюга 5О0
(СН), і другий легкий ланцюг додатково включає константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ), і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), де зазначена друга послідовність МН включає 5ЕО ІО МО: 123, а зазначена друга послідовність МІ включає 5ЕО ІЮ
МО: 127 (гуманізоване СО137, клон 009).
У конкретному втіленні даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, що включає (І) перше зв'язувальне плече, яке включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ) і константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), і де зазначені перші послідовності МН і МІ. містять послідовність, яка на, щонайменше, 70 96, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 956, щонайменше, 85 965, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, щонайменше, на 97 95, щонайменше, на 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності МН, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 117, і послідовності МІ, наведеної в ЗЕО ІО МО: 121, відповідно, і (ІЇ) друге зв'язувальне плече, яке включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг додатково включає константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ), і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), де зазначені другі послідовності МН і МІ. містять послідовність, яка на, щонайменше, 70 9565, щонайменше, 75 95, щонайменше, 80 95, щонайменше, 85 95, щонайменше, 90 95, щонайменше, 95 95, п про щонайменше, 97 96, щонайменше, 99 95 або 100 95 ідентична до амінокислотної послідовності
МН, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 123, і послідовності МІ, наведеної в зХЕО ІЮО МО: 127, відповідно (гуманізоване СО137, клон 009), де перший і другий важкі ланцюги відносяться до ізотипу ЇДС1 людини і де перший і другий легкі ланцюги відносяться до ІдО1, к, і де положення, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БО як константної послідовності першого, так і другого важкого ланцюга є Е, ЕЕ і А, відповідно, і де (а) положення, яке відповідає
Е405 важкого ланцюга Їд51 людини, відповідно до нумерації ЕЮ константної послідовності першого важкого ланцюга, є ГІ, і положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга ІЇдсС1 людини, відповідно до нумерації БЮ константної послідовності другого важкого ланцюга, є К; або (Б) положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЄЮ константної послідовності першого важкого ланцюга, К, і положення, що відповідає Е405 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БЮ константної послідовності другого важкого ланцюга є Ї.
У додатковому конкретному втіленні даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, що включає (І) перше зв'язувальне плече, яке включає перший важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ) і константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), причому зазначена перша послідовність МН включає 5ЕО ІЮО МО: 117, а зазначена перша послідовність МІ включає
ЗБЕО ІО МО: 121, та (ІЇ) друге зв'язувальне плече, яке включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (УН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг додатково включає константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ), і варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ), де зазначена друга послідовність МН включає 5ЕО ІО МО: 123, а зазначена друга послідовність МІ включає 5ЕО ІЮ
МО: 127 (гуманізоване СО137, клон 009), де перший і другий важкі ланцюги відносяться до ізотипу ЇДО1 людини і де перший і другий легкі ланцюги відносяться до ІдО1, к, і де положення, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БО як константної послідовності першого, так і другого важкого ланцюга є Е, Е і А, відповідно, і де (а) положення, яке відповідає
Е405 важкого ланцюга Їд51 людини, відповідно до нумерації ЕЮ константної послідовності першого важкого ланцюга, є ГЇ, і положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації БЮ константної послідовності другого важкого ланцюга, є К; або (Б) положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЄЮ константної послідовності першого важкого ланцюга, К, і положення, що відповідає Е405 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БЮ константної послідовності другого важкого ланцюга є Ї.
В іншому аспекті даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, містить перші 60 зв'язувальне плече, зв'язується з людським СО40, і друге зв'язувальне плече, зв'язується з
СО0137 людини, де () вказані першими зв'язувальне плече включає амінокислотну послідовність важкого ланцюга (НС), що містить або складається з ЗЕО ІЮ МО: 118, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга (І С), що містить або складається з 5ЕО ІО МО: 122, та (ї) вказане друге зв'язувальне плече включає амінокислотну послідовність НС, що містить або складається з 5ЕО ІЮ МО: 124, і амінокислотну послідовність С, що містить або складається з 5ЕО ІЮО МО: 128, необов'язково, де 5ЕО ІЮ МО: 118, 5ЕО ІЮО МО: 124 або обидві містять одну або більше мутацій в константної області НС, як наприклад 1-10, як наприклад 1-5, як наприклад 1, 2, 3, 4 або 5 мутацій .
В іншому аспекті даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, містить перші зв'язувальне плече, зв'язується з людським СО40, і друге зв'язувальне плече, зв'язується з
СО0137 людини, де () вказані першими зв'язувальне плече включає амінокислотну послідовність НС, що містить або складається з ЗЕО ІЮ МО: 119, ії амінокислотну послідовність С, що містить або складається з 5ЕО ІЮО МО: 122, та (і) вказане друге зв'язувальне плече включає амінокислотну послідовність НС, що містить або складається з ЗЕО ІЮ МО: 125, і амінокислотну послідовність С, що містить або складається з 5ЕО ІЮ МО: 128.
В іншому аспекті даний винахід відноситься до біспецифічному антитілу, містить перші зв'язувальне плече, зв'язується з людським СО40, і друге зв'язувальне плече, зв'язується з
СО0137 людини, де () вказані першими зв'язувальне плече включає амінокислотну послідовність НС, що містить або складається з ЗЕО ІЮ МО: 120, і амінокислотну послідовність С, що містить або складається з 5ЕО ІЮО МО: 122, та (і) вказане друге зв'язувальне плече включає амінокислотну послідовність НС, що містить або складається з ЗЕО ІЮ МО: 126, і амінокислотну послідовність С, що містить або складається з 5ЕО ІЮО МО: 128.
Біспецифічні формати
У конкретному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом є біспецифічне антитіло.
Винахід стосується біспецифічним антитіл проти СО40хСО137, які здатні перехресно зв'язуватися з клітинами, експресуючими СО40, і клітинами, експресуючими СО137; такими як антиген-презентують клітини і Т-клітини, відповідно. Залежно від цільових функціональних властивостей для конкретного застосування конкретні антигензв'язувальні області можуть бути обрані з набору антитіл або антигензв'язувальних областей, передбачених цим винаходом.
Багато різних форматів і застосувань біспецифічних антитіл відомі в даній галузі і розглянуті
Копіеппапп; Ога Оізсом Тодау, 2015 ди; 20 (7): 838-47; М АБз, 2012 Маг-Арг; 4 (2): 182-97.
Біспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом не обмежена будь-яким конкретним біспецифічним форматом або способом його отримання.
Приклади молекул біспецифічних антитіл, які можуть бути використані в даному винаході, включають (ї) одне антитіло, яке має два зв'язуючі плеча, що містять різні антигензв'язувальні області; (Ії) одноланцюгове антитіло, яке має специфічність до двох різних епітопів, наприклад, за допомогою двох 5сСЕм, пов'язаних тандемом за допомогою додаткового пептидного лінкера; (Ії) антитіло з двома варіабельними доменами (0МО-І9), де кожен легкий ланцюг і важкий ланцюг містять два варіабельних домени в тандемі через короткий пептидний зв'язок (М/и вї аї.,
Сепегаїйоп апа СНагасівгігайоп ої а Оца! Магіаріє ботаїп Іттиподіобиїп (0ОМО-Ід 7") Моїесшціе, Іп:
Апіїбоду Епдіпеегіпдо, Зргіпдег Вегіїп НеїдеїЇрегд (2010)); (Ім) хімічно пов'язаний біспецифічний (Раб) 2-фрагмент; (У) Тападаб, який представляє собою злиття двох одноланцюгових антитіл, з отриманням чотирьохвалентного біспецифічного антитіла, яке має два сайти зв'язування для кожного з антигенів-мішеней; (Мі) флексітіло, яке представляє собою комбінацію 5сЕм з диатілом з отриманням полівалентної молекули; (Мії) так звана молекула "докінгу і блокування" на основі "домену димеризації і докінгу" в Протеїнкінази А, за допомогою якої при застосуванні до Бар можна отримати тривалентний біспецифічний зв'язуючий білок, що складається з двох ідентичних фрагментів Бар, пов'язаних з іншим Рар-фрагментом ; (Мії) так звана молекула
Зсогріоп, яка містить, наприклад, два 5сЕм, злитих з обома кінцями Рар-плеча людини; і (їх) диатіло.
В одному втіленні біспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом є диатіло, крос- тіло або біспецифічне антитіло, отримане за допомогою контрольованого обміну Габ-плечима 60 (такого як описано в УМО2011131746 (Септаб)).
Б2
Приклади різних класів біспецифічних антитіл включають, не обмежуючись названим, (Її)
Ідс-подібні молекули з комплементарними доменами СНЗ для прискорення гетеродимерізації; (ї) рекомбінантні Ідб-подібні молекули з подвійним націлюванням, де кожна з двох сторін молекули включає Раб-фрагмент або частина ЕРаб-фрагмента, щонайменше, двох різних антитіл; (ії) злиті молекули дО, де повнорозмірні антитіла дб злиті з додатковим Еабр- фрагментом або частинами Раб-фрагмента; (ім) Ес-злиті молекули, де одноланцюгові молекули
Ем або стабілізовані діатіла злиті з константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами; (у) Раб-злиті молекули, де різні Еар-фрагменти злиті разом, злиті з константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами; і (мі) антитіла на основі 5сЕм і діатіла і антитіла, що складаються з важких ланцюгів (наприклад, доменні антитіла, нанотіла), де різні одноланцюгові молекули Ем або різні діатіла або різні антитіла, що складаються з важких ланцюгів (наприклад, доменні антитіла, нанотіла) злиті один з одним, або з іншим білком або молекулою-носієм, що злиться з константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами.
Приклади ІдС-подібних молекул з комплементарними молекулами з СНЗ-доменами включають, не обмежуючись названим, молекули Тріомаб/Квадрома (Топ РПагта/Егезепій5
Віоїесп; Коспе, УМО2011069104), так звані молекули "Виступи-в-поглиблення" ((зепепіесп,
М09850431), Сто55МАБ (Коспе, УМО2011117329) і електростатично поєднуються молекули (Атдеп, ЕР1Т870459 ії УУО2009089004; Спидаі, О5201000155133; Опсотеа, УУО2010129304), молекули ГШО2-М (Сепепієсй, МУгтапік еї аїЇ. У. Віої. Спет. 2012 287 (52): 43331-9, дої: 10.1074/рс.М112.397869. Ериб 2012 Мом 1), молекули ОіІО-тіла і Ріб-тіла (РпагтаБбсіпе,
МО2010134666, УМО2014081202), молекули доменних тіл, сконструйовані обміном ланцюгів (ЗЕЕ»;Боду) (ЕМО бБегопо, УМ/О2007110205), молекули Вісіопісв (Меги5, УО2013157953), молекули ЕсдАдр. (Кедепегоп, УМО201015792), біспецифічні молекули Ідс1 і Ідс2 (Ріїгег/Кіпаї,
УМО011143545), азиметричні каркасні молекули (7утемогк5/Метск, УМО2012058768), молекули тАБ-Рм (Хепсог, ММО2011028952), бівалентні біспецифічні антитіла (МУО2009080254) і молекули
ВОиоВодуфФ (Септаб А/5, УМО2011131746).
Приклади рекомбінантних ІдС-подібних молекул з подвійним націлюванням включають, не обмежуючись названим, молекули з подвійним націлюванням (ОТ) -І4 (У/О2009058383), антитіло два-в-одному (Сепепіесйи; Вовігот еї а! 2009). Зсіепсе 323, 1610-1614), Поперечно пов'язані Маб (Каптапоз Сапсег Сепіе), тАБр2 (Б--їгаг, М/О2008003116), молекули 2убоду (/упдепіа; ГанБієиг еї аі.МАБ5. 2013 Маг-Арг; 5 (2): 208- 18), підходи із загальною легкого ланцюгом (СтисеПй/Меги5, О5 7 262 028), кАТіла (Моміттипе, М/О02012023053) і СомхХ-тіло (СоухХ/Рії2ег; борраїарцаї, УРН, еї аї. 2007. Вісогуд. Мед. Спет. Гей. 17,501-506.).
Приклади злитих молекул ЇдДО включають, не обмежуючись названим, молекули з подвійним варіабельності доменом (0МО) -Ід (Аррой, 5 7,612,181), дводоменні, двосторонні антитіла (Опіемег; Запоїї Амепіїз, УУМО20100226923), ІдДа-подібні біспецифічні молекули (ІтпСіопе/Еїї І Шу,
Ї емгі5 вї аІ.Маї Віоїесппої. 2014 Реб; 32 (2): 191-8), Т52АБ (Медіттипе/А7; Оітаві еї аї. У Мої Віої. 2009 Осі 30; 393 (3): 672-92) і молекули В5АБ (7утодепеїїс5, УМО2010111625), молекули
НЕКСИГ Е5З (Віодеп Ідес, О05007951918), злиті молекули зсЕм (Момапів), злиті молекули 5сЕм (Спапдалои Адат Віоїеспй Іпс, СМ 102250246) і молекули ТУАБ (Коспе, УМО2012025525,
МО2012025530).
Приклади злитих молекул Ес включають, не обмежуючись названим, злиття ЗСЕмМ/Ес (Реагсе еї аї,, Віоспет Мо! Віо! Іпі. 1997 бер; 42 (6): 1179-88), молекули 5СОКРІОМ (Етегдепі
ВіобоІшіопз/Ттибіоп, ВіапКепзПір) УМ, еї а, ААСА 1001 Аппиаї! тевеїйїпа 2009 (Абзігасі й 5465); гутодепеїісв/ВМ5, М/О2010111625), молекули за технологією повторного націлювання з подвійною афінністю (Ес-ОАКТ) (МастгосСепісв, УМО2008157 379, ММО2010080538) і подвійні (ЗсЕм) 2-Еаб молекули (Національний дослідницький центр з медицини антитіл - Китай).
Приклади Рар-злитих біспецифічних антитіл включають, не обмежуючись названим, молекули Е (аб) 2 (Медагех/"АМОЕМ; Оео еї аї. 9. Іттипої.1998 Рер 15; 160 (4): 1677-86.),
Молекули подвійної дії або Віз-Раб (Сепепіесн, Вовігот, еї ан! 2009. бсіепсе 323, 1610-1614), молекули Юоск-апа-оск (ОМ) (ттипоМеадісв, УМО2003074569, ММО2005004809), двовалентні біспецифічні молекули (Віоїеспої, Зспоопіапе, У. Іттипо!ї. 2000 ЮОес 15; 165 (12): 7050-7.) і молекули Бар-Ем (0СВ-СеїМКеси, УХО 2009040562 АТ).
Приклади антитіл на основі 5сЕу-, диатіл і доменних антитіл включають, не обмежуючись названим, молекули біспецифічні активатори Т-клітин (ВіТЕ) (Місготеї, УМ/О2005061547), молекули тандемних диатіл (ТапаАбБ) (Айтеа) Ге Ссаї! еї аІ., Ргоївіп Епд Оеєз Зеї.2004 Ар; 17 (4): 357-66), молекули технології переорієнтації з подвійною афінністю (ОАКТ) (Масгосепісв,
МО2008157379, МО2010080538), одноланцюгові молекули диатіл (І аутепсе, РЕВ5З Гей. 1998 60 Арг 3; 425 (3): 479-84), ТОВ-подібні антитіла (АІТ, Кесеріогі одісв), злиті білки людського сироваткового альбуміну та ЗсЕм (Мегітаск, М/О2010059315) і молекули СОМВООЮУ (Ерідеп
Віоїеснй, 2Мпи еї аїЇ. Іттипо! Се Віої. 2010 Ацо; 88 (6): 667-75), нанотіла з подвійним націлюванням (Абіупх, Нтіїа еї аЇ., РЕАБЕВ у. 2010) і антитіла з подвійним націлюванням, що містять тільки домени важких ланцюгів.
В одному втіленні кожна із зазначених першого і другого важких ланцюгів містить, щонайменше, шарнірну область, СН2- і СНЗ-область.
У додатковому втіленні СНЗ-області першої та другої важких ланцюгів містять асиметричні мутації, такі як асиметричні мутації (також звані в даному документі модифікаціями), що призводять до отримання стабільного гетеродимерного антитіла.
В одному втіленні біспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає перший важкий ланцюг, який містить першу СНЗ-область, і другий важкий ланцюг, який містить другу
СНЗ-область, де послідовності першої та другої областями СНЗ різні і є такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеною першою і другою СНЗ -областю є більш сильною, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої і другої областями СНЗ. Більш детальна інформація про ці взаємодії і про те, як вони можуть бути досягнуті, представлена, наприклад, в
МО 2011/1131746 і УМО 2013/060867 (Септарб), які тим самим включені посиланням.
Як описано далі в цьому документі, стабільне біспецифічне антитіло проти СО40хС0137 може бути отримано з високим виходом з використанням певного способу на основі одного гомодимерного батьківського антитіла проти СО40 ії одного гомодимерного батьківського антитіла проти СО137, що містить тільки декілька досить консервативних асиметричних мутацій в СНЗ-областях. Асиметричні мутації означають, що послідовності зазначених першої і другої областями СНЗ містять амінокислотні заміни в неідентичних положеннях.
Відповідно, в одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, послідовності зазначених першої і другої областями СНЗ важкого ланцюга містять асиметричні мутації, наприклад мутацію в положенні, яке відповідає положенню 405 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЕО в одній з СНЗ- областей, і мутацію в положенні, яке відповідає положенню 409 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації ЄО в інший СНЗ-області.
В одному аспекті біспецифічне антитіло, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, включає першу і другу важкі ланцюги, де у зазначеному першому важкому ланцюзі, щонайменше, одна з амінокислот в положенні, яке відповідає положенню, обраному з групи, яка складається з 71366, 1368, К370, 0399, 405, 407 і К409 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕЮО, замінена, і в зазначеній другого важкого ланцюга, щонайменше, одна з амінокислот в положенні, яке відповідає положенню, обраному з групи, яка складається з 7366, 1368, К370, 0399, 405, 407 і К409 важкого ланцюга Ідс1і людини, відповідно до нумерації ЄЮ, замінена, і де в зазначеній першої та у зазначеному другому важкому ланцюзі немає замін в однакових положеннях.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 368, 370, 399, 405, 407 і 409 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ, а другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з 366, 368, 370, 399, 405, 407 і 409 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМО, і де в першій і в другій важкого ланцюга немає замін в однакових положеннях.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні 366, і зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 368, 370, 399, 405, 407 і 409. в одному втіленні амінокислота в положенні 366 обрана з Аа, Ар, Сім, Ні, Азп, Маї або Сіп.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні 368, а зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 370, 399, 405, 407 і 409.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні 370, і зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 368, 399, 405, 407 і 409.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні 399, і 60 зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 368, 370, 405, 407 і 409.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні 405, і зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 368, 370, 399, 407 і 409.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні 407, і зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 368, 370, 399, 405 і 409.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні 409, а зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 368, 370, 399, 405 і 407.
Відповідно, в одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, послідовності зазначених першої і другої областей СНЗ містять асиметричні мутації, тобто мутації в різних положеннях в двох областях СНЗ, наприклад мутацію в положенні 405 в одній з областей СНЗ і мутація в положенні 409 в інший області СНЗ.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в даному документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Гуз, Ге або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Ріє, Аго, Ні, Азр, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має амінокислотну заміну в положенні, обраному з групи, яка складається з: 366, 368, 370, 399 405 і 407. В одному такому втіленні зазначений перший важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Гуз, І ей або Меї, наприклад,
Су, Аа, Маї, Пе, бег, Тпг, Ре, Ага, Ні, Авр, Авп, Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Рпе, наприклад Су, Аа, Маї,
Пе, Зег, ТНг, Гуз, Аго, Ні, Ар, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг, Сувз, Гуз або І еп, в положенні 405. у додатковому втіленні цього винаходу зазначений перший важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Гуз, Гей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, бег, ТНиг, Ре, Аго, Нів, Авр, Авп, СІМ,
Сп, Рго Тгр, Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Рпе, Агд або Су, наприклад Г/ еи, Аа, Маї, Пе, 5ег, ТНг, Меї, Гуз, Нів, Авр, Авзп (Си,
Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 405.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає Ре в положенні 405 і амінокислоту, відмінну від І ув, І еи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Аго, Нів,
Азр, Авп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Су, в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від Рпе, наприклад Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТАг, Гуз, Аго, Нів, Авр,
Азп, Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг, Ге, Меї або Суз, в положенні 405 і Гуз в положенні 409. у додатковому втіленні цього винаходу зазначений перший важкий ланцюг включає Рпе в положенні 405 і амінокислоту, відмінну від І уз, Ї ей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег,
Тиг, Ріє, Ага, Ні, Азр, Азп Сім, Сіп, Рго, Тгр, Туг або Су в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від Ріє, Агд або Су, наприклад І! єни, Аа, Маї, Пе, зБег, Тпг, Меї, Гуз Ні, Авр, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 405 і | уз в положенні 409.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає Ре в положенні 405 і амінокислоту, відмінну від І ув, І еи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Аго, Нів,
Азр, Авп, Сім, СіІп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає Геи в положенні 405 і Губ в положенні 409. у додатковому втіленні цього винаходу зазначений перший важкий ланцюг включає Рпе в положенні 405 і Агд в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від Ре, Агд або су, наприклад ГІ еи, Аа, Маї, Пе, Зег, ТПг, Гуз, Меї, Нів, Азр, Авп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 405 і Гуз в положенні 409. в іншому втіленні зазначений перший важкий ланцюг включає Рпе в положенні 405 і Агд в положенні 409, а другий важкий ланцюг включає і еи в положенні 405 і Гуз в положенні 409.
У додатковому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від
Гуз, Геи або Меї, наприклад, СУ, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рне, Ага Ні, Азр, Азп, Спи, Сп, Рго, Тгр,
Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає Гуз в положенні 409,
ТНиг в положенні 370 і Гей в положенні 405. у додатковому втіленні зазначений перший важкий 60 ланцюг включає Агуд в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає Гу в положенні 409, Тиг в положенні 370 і І еи в положенні 4 05.
Ще в одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає І уз в положенні 370, Рпе в положенні 405 і Агд в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає Гуз в положенні 409, ТНг в положенні 370 і Ї еи в положенні 405.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від Гуз,
Ї ем або Меї, наприклад, СУ, Аа, Маї, Пе, бег, ТНг, Ріє, Аго, Ні, Азр, Азп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає Гуз в положенні 409 і: а) Пе в положенні 350 і І еи в положенні 405, або Б) ТНг в положенні 370 і лей в положенні 405.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає Агд в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає Гуз в положенні 409 і: а) Пе в положенні 350 і І еи в положенні 405 або Б) Тнг в положенні 370 і І еи в положенні 405.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає ТПг в положенні 350, І ув в положенні 370, Рпе в положенні 405 і Агуд в положенні 409 і зазначена другий важкий ланцюг включає Гуз в положенні 409 і: а) Пе в положенні 350 і Їеи в положенні 405, або Б) ТНг в положенні 370 і І еи в положенні 405.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає ТПг в положенні 350, І ув в положенні 370, Рпе в положенні 405 і Агуд в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає Пе в положенні 350, ТНг в положенні 370, І еи в положенні 405 і Гуз в положенні 409.
В одному втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від Гуз,
Ї ем або Меї, в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від Рпе, в положенні 405, таку як Ріє, Агд або СіІу в положенні 405; або зазначена перша область СНЗ включає амінокислоту, відмінну від І ув, І еи або Меї, в положенні 409, і зазначена друга область СНЗ включає амінокислоту, відмінну від Туг, Азр, Сім, Рпеє, Гуз, СіІп, Агу, Зег або
ТНг, в положенні 407.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, як визначено в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає перший важкий ланцюг, що має амінокислоту, відмінну від Гуз, І ей або Меї, в положенні 409, і другий важкий ланцюг, що має амінокислоту, відмінну від Туг, Авр,
Сім, Ріє, Гуз, Сп, Аго, Зег або Тпг в положенні 407.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, як визначено в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає перший важкий ланцюг, що має Туг в положенні 407, і амінокислоту, відмінну від Гуз, І еи або Меї, в положенні 409, і другий важкий ланцюг, що має амінокислоту крім Туг, Азр, Сім, Ре, Гуз, Сп, Агоу, Зег або ТНг в положенні 407 і Гуз в положенні 409.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, як визначено в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає перший важкий ланцюг, що має Туг в положенні 407 і Агд в положенні 409, і другий важкий ланцюг, що має амінокислоту, відмінну від Туг, Авр, Сім, РПе, Г ув, Сп, Ага, 5ег або ТНг в положенні 407 і Гуз в положенні 409.
В іншому втіленні зазначений перший важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Г ув, І еи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Ре, Аго, Нів, Авр, Авп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або
Суз, в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає амінокислоту, відмінну від Туг,
Азр, Сім, Ріє, Гуз, Сп, Аго, Зег або ТНг, наприклад І ем, Меї, Су, Аа, Маї, Пе Ні, Авзп, Рго, Тгтр або Суз в положенні 407. в іншому втіленні зазначений перший важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від І ув, І еи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Ре, Ага, Нів,
Азр, Азп, Сім, СіІп, Рго, Тгр Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має
Аа, Су, Нів, Пе, І ем, Меї, Азп, У аї або Тгр в положенні 407.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в даному документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Гуз, Гей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, Тиг, Ре, Аго, Нів, Авр, Авп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або
Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має Су, Гей, Меї, Азп або Тгр в положенні 407.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг має Туг в положенні 407 і амінокислоту, відмінну від Гуз, Гей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, бег, ТНиг, Ре, Аго, Нів, Авр, Авп, СІМ,
СіІп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг включає 60 амінокислоту, відмінну від Туг, Азр, Сім, Ріє, Гуз, СіІп Аго, Зег або ТПпг, наприклад ГІ еи, Меї, Су,
Аа, Маї, Пе, Ні, Азп, Рго, Тгр або Сув, в положенні 407 і Гуз в положенні 409.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг має Туг в положенні 407 і амінокислоту, відмінну від Гуз, Гей або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, бег, ТНиг, Ре, Аго, Нів, Авр, Авп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг або Су, в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має Аа, Су, Нів,
Ме, І єи, Меї, Азп, Маї або Тгр в положенні 407 і Гуз в положенні 409.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг має Туг в положенні 407 і амінокислоту, відмінну від Гуз, Ге або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпе, Аго, Нів, Авр, Авп, СІМ,
Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має Су, І еи, Меї,
Азп або Тгр в положенні 407 і Гуз в положенні 409.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг має Туг в положенні 407 і Агд в положенні 409, а зазначена другий важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Туг, Авр, Сім, Ре, Гуз,
Сіп, Агду, Зег або Тиг, наприклад І еи, Меї, Су, Аа, Маї, Пе, Ніх, Азп, Рго, Тгр або Сух, в положенні 407 і Гуз в положенні 409.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг має Туг в положенні 407 і Агд в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має АїЇа, Су, Ніх, Пе, Гей, Меї, Азп, Ма! або Тгр в положенні 407 і Гуз в положенні 409.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, зазначений перший важкий ланцюг має Туг в положенні 407 і Агд в положенні 409, і зазначена другий важкий ланцюг має Су, І ем, Меї, Азп або Тгр в положення 407 і І уз в положенні 409.
В іншому втіленні біспецифічного антитіла, як визначено в будь-якому з розкритих в даному документі втілень, перший важкий ланцюг має амінокислоту, відмінну від Гуз, Їеи або Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, Зег, ТНг, Рпеє, Аго, Ні, Ар, Авп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз, в положенні 409, а другий важкий ланцюг має (І) амінокислоту, відмінну від РНе, Гени і Меї, наприклад, Су, Аа, Маї, Пе, зег, ТНг, Гув, Агод,
Ні, Азр, Авп, Сім, Сп, Рго, Тгр, Туг або Суз, в положенні 368 або (Ії) Ттр в положенні 370 або (Ії) амінокислоту, відмінну від Ар, Сув, Рго, Сім або Сіп, наприклад, Ре, І еи, Меї, Су, Аїа,
Маї, Ме, Зег, ТНг, Гуз, Ага, Нів, Авп, Тгр, Туг або Сувз, в положенні 399 або (м) амінокислоту, відмінну від І ув, Агуд, 5ег, Тиг або Тгр, наприклад Ре, І ем, Меї, Аїа, Маї,
Спу, Пе, Азп, Ні, Авр, Сім, СіІп, Рго, Туг або Су в положенні 366.
В одному втіленні перший важкий ланцюг має Ага, Аа, Ні або Су в положенні 409, а другий важкий ланцюг має (І) Сув, Сп, Аа, Азр, Сім, Су, Ні, Пе, Азп, Ага, Зег, ТНг, Ма! або Тгр в положенні 368, або (І) Тгр в положенні 370 або (Іїї) АІа, Су, Пе, І ем, Меї, Авзп, Зег, ТНг, Тгр, Ре, Ні, Гуз, Агуд або Туг в положенні 399 або (Ім) Аа, Ар, Сіи, Ні, Азп, Маї, СіІп, Ріє, Су, Пе, І еи, Меї або Туг в положенні 366.
В одному втіленні перший важкий ланцюг має Агд в положенні 409, а другий важкий ланцюг має (І) А5р, Сім, Су, Азп, Аго, 5ег, ТПг, Ма! або Тгр в положенні 368 або (І) Ттр в положенні 370 або (Ії) Ре, Ні, Гуз, Агд або Туг в положенні 399 або (Ім) Аа, Авр, Си, Ні, Азп, Маї, СіІп в положенні 366.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу і другу важкі ланцюги, де (ії) амінокислота в положенні, яке відповідає Е405 важкого ланцюга ІдС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є І. у зазначеній першій важкій ланцюга, і амінокислота в положенні, яке відповідає К409 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ, є К в другому важкому ланцюзі, або (ії) амінокислота в положенні, яке відповідає К409 важкого ланцюга Ідс1 людини відповідно до нумерації ЄШ є К у зазначеному першому важкому ланцюзі, а амінокислота в положенні, яке відповідає Е405 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації Е), є Г. у зазначеному другому важкому ланцюзі.
У додатковому втіленні зазначені перший і другий важкі ланцюги відносяться до ізотипу Їдс1 людини.
В іншому додатковому втіленні зазначені перший і другий важкі ланцюги відносяться до 60 ізотипу ЇДб2 людини.
В іншому додатковому втіленні зазначені перший і другий важкі ланцюги відносяться до ізотипу ЇЧОЗ людини.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу і другу важкі ланцюги ізотипа людського Ідс4, де (ії) амінокислота в положенні, яке відповідає 5228 важкого ланцюга людського Ідс4 відповідно до
ЕО нумерації є Р у зазначеному першому важкому ланцюзі, а амінокислота в положенні, яке відповідає 5228, Е405 і К409 важкого ланцюга Ідс4 людини відповідно до ЕМ, нумерація є Р, ГІ і
К, відповідно у зазначеному другому важкому ланцюзі, або (Ії) амінокислота в положенні, яке відповідає 5228, Е405 і К409 важкого ланцюга людського Ідо4 відповідно до нумерації ЕМ, є Р,
Ї ї К, відповідно у зазначеному першому важкому ланцюзі, і амінокислота в положенні, яке відповідає 5228 важкого ланцюга людського ІдО4 відповідно до нумерації ЕІ є Р в зазначеній другого важкого ланцюга.
Якщо в даному документі робиться посилання на амінокислоти в певних положеннях першого важкого ланцюга і/або амінокислоти в певних положеннях другого важкого ланцюга, слід розуміти, що таке посилання включає втілення, в яких амінокислоти в певних положеннях першого важкого ланцюга присутні у відповідних положеннях другого важкого ланцюга, а не в першій важкій ланцюга, і/або амінокислоти в певних положеннях другого важкого ланцюга присутні у відповідних положеннях першого важкого ланцюга, а не другого важкого ланцюга.
На додаток до зазначених вище амінокислотним замін зазначені перший і другий важкі ланцюги можуть містити додаткові амінокислотні заміни, делеції або вставки щодо послідовностей важких ланцюгів дикого типу.
У додатковому втіленні зазначені перше і друге Рар-плечі (або константні домени важких ланцюгів), що містяться в першій і другій важких ланцюгах, містять, крім зазначених мутацій, послідовність СНЗ, незалежно обрану з наступного: (дсб1т (а)) (ЗЕО ІЮ МО: 106), (901 т (7) (ЗЕО ОО МО: 107) і ((до1т (ах) (ЗЕО ІО МО: 108).
В одному втіленні ні зазначена перша, ні зазначена другий важкий ланцюг не містять послідовність Сувз-Рго-5е1-Суз в (основний) шарнірної області.
У додатковому втіленні як зазначена перша, так і зазначена другий важкий ланцюг містять послідовність Сувз-Рго-Рго-Суз в (основний) шарнірної області.
В окремих і конкретних втіленнях одне або обидва Рар-плеча містять послідовність константної області важкого ланцюга, незалежно обрану з 5ЕО ІО МО: 109, 110, 111, 112, 113 ї 116 (див. Таблицю 1).
Способи отримання біспецифічних антитіл
Традиційні способи, такі як міжвидова Гібридома і способи хімічної кон'югації (Магміп апа пи (2005) Асіа Ріаптасої! 5біп 26: 649), можуть бути використані при отриманні біспецифічних антитіл даного винаходу. Спільна експресія в клітині-хазяїні двох антитіл, що складаються з різних важких і легких ланцюгів, призводить до суміші можливих продуктів антитіл на додаток до шуканого біспецифічному антитілу, яке потім може бути виділено, наприклад, афінною хроматографією або подібними способами.
Стратегії, що сприяють утворенню функціонального біспецифічного продукту при спільній експресії різних конструкцій антитіл, також можуть бути використані, наприклад, способом, описаним Гіпапогег еї аї. (1995 У Іттипої! 155: 219). Злиття гідридом щури і миші, які продукують різні антитіла, призводить до обмеженої кількості гетеродимерних білків через спарювання переважно видових важких і легких ланцюгів. Другою стратегією, стимулюючої утворення гетеродимери щодо гомодимер, є стратегія "виступ-в-поглиблення", в якій опуклість вводиться в перший поліпептид важкого ланцюга і відповідна порожнину в другій поліпептид важкого ланцюга, так що опуклість може бути розташована в порожнині на кордоні розділу цих двох важких ланцюгів, сприяючи утворенню гетеродимера і перешкоджаючи утворенню гомодимеру."Опуклості" конструюються шляхом заміни невеликих амінокислотних бічних ланцюгів на кордоні розділу першого поліпептиду на більші бічні ланцюги. Компенсаторні "порожнини" ідентичного або схожого розміру з виступами створюються на кордоні розділу другого поліпептиду шляхом заміни великих амінокислотних бічних ланцюгів на більш дрібні (патент США 5731168). ЕР1870459 (Спидаї) ії УМО 2009/089004 (Атдеп) описують інші стратегії на користь освіти гетеродимери при спільній експресії різних доменівЕР1870459 (Спидаї) і МО 2009/089004 (Атдеп) описують інші стратегії на користь освіти гетеродимери при спільній експресії різних доменівЕР1870459 (Спидаї) і М/О 2009/089004 (Атдеп) описують інші стратегії на користь освіти гетеродимери при спільній експресії різних доменів антитіл в клітині-хазяїні. У цих способах один або кілька залишків, які складають інтерфейс СНЗ-СНЗ в обох доменах СНЗ, замінюються зарядженої амінокислотою, так що освіта гомодимеру електростатично 60 несприятливо, а гетеродимерізація електростатично вигідна. У УМО2007110205 (МегсК) описана ще одна стратегія, в якій відмінності між доменами СНЗ з ІдДА ії дб використовуються для прискорення гетеродимерізації.
Переважний спосіб отримання біспецифічних антитіл проти СО40хСО137 даного винаходу включає способи, описані в М/О 2011/131746 і УМО 2013/060867 (Септар), що включають наступні стадії: а) забезпечення першого антитіла, що містить область Ес, причому зазначена область Ес включає першу область СНЗ; р) забезпечення другого антитіла, що містить другу область Ес, причому зазначена область
Ес включає другу область СНЗ, де перше антитіло є антитіло проти СО40, що містить дві перші антигензв'язувальних області, як описано в цьому документі, і друге антитіло є антитіло проти СО137, що містить дві другі антигензв'язувальних області, як описано в даному документі, або навпаки; і де послідовності зазначених першої і другої областей СНЗ є різними і є такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою областями СНЗ є більш сильною, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої і другої областей СНЗ; с) інкубування зазначеного першого антитіла разом із зазначеним другим антитілом в відновлюючих умовах; і а) отримання зазначеного біспецифічного антитіла проти СО40хСО137.
В одному втіленні вказане перше антитіло інкубують разом із зазначеним другим антитілом в відновлюючих умовах, достатніх для того, щоб цистеїни в шарнірній області піддавалися ізомеризації дисульфідного зв'язку, де гетеродимерна взаємодія між вказаними першим і другим антитілами в отримують гетеродимерном антитілі є таким, що ніякої заміни Раб -Плечі не відбувається при 0,5 мМ О5Н через 24 години при 37 " С.
Безвідносно до теорії, на стадії с) дисульфідні зв'язки важких ланцюгів в шарнірних областях батьківських антитіл (перше і друге антитіла на стадіях а) і Б5)) відновлюються, і отримані цистеїну потім можуть утворювати дисульфидний зв'язок важкого ланцюга із залишками цистеїну іншої молекули батьківського антитіла (спочатку з іншого специфічністю). В одному втіленні цього способу, умови відновлення на стадії с) включають додавання відновника, наприклад відновника, вибраного з групи, яка складається з 2-меркаптоетіламін (2-МЕА), дітіотреїтолу (ОТ), дітіоерітрітола (ОТЕ), глутатіону, трис (2 карбоксіетіл)у фосфіну (ТСЕР), 1 - цистеїну і бета-меркаптоетанол, переважно відновника, вибраного з групи, яка складається з 2- меркаптоетіламін, дітіотреїтолу і трис (2-карбоксіетіл) фосфіну.У додатковому втіленні стадія с) включає відновлення умов, з тим щоб вони стали невідновлювальних-менш відновлюють, наприклад, шляхом видалення відновника, наприклад, шляхом знесолення. В одному конкретному втіленні біспецифічні антитіла отримували наступним чином: два батьківських комплементарних антитіла, обидва в однаковій кількості, інкубували з 75 мМ 2- меркаптоетіламін-НСЇІ (2-МЕА) в буфері (наприклад, РВ5 або Тріс-ЕОТА) при 31 "С в протягом 5 годин; реакцію відновлення зупиняли, видаляючи відновлює агент 2-МЕА з використанням центрифуг (наприклад, центрифужних фільтрів Місгосоп, ЗОК, МіПроге) (Іабгі)п еї аї. Майшге
Ргоїосої!в, Мої 9 Мо 10, р2450-2463; 2014 року). В іншому конкретному втіленні спосібнаприклад, шляхом видалення відновника, наприклад, шляхом знесолення. В одному конкретному втіленні біспецифічні антитіла отримували наступним чином: два батьківських комплементарних антитіла, обидва в однаковій кількості, інкубували з 75 мМ 2-меркаптоетіламін-НСЇІ (2-МЕА) в буфері (наприклад, РВ5 або Тріс-ЕОТА) при 31 "С в протягом 5 годин; реакцію відновлення зупиняли, видаляючи відновлює агент 2-МЕА з використанням центрифуг (наприклад, центрифужних фільтрів Місгосоп, ЗОК, МійПроге) (ІГабгі)п еї а. Маїйге РгоїосоЇї5, МоЇ 9 Мо 10, ра450-2463; 2014 року). В іншому конкретному втіленні спосібнаприклад, шляхом видалення відновника, наприклад, шляхом знесолення. В одному конкретному втіленні біспецифічні антитіла отримували наступним чином: два батьківських комплементарних антитіла, обидва в однаковій кількості, інкубували з 75 мМ 2-меркаптоетіламін-НСЇІ (2-МЕА) в буфері (наприклад,
РВ5 або Тріс-ЕОТА) при 31 "С в протягом 5 годин; реакцію відновлення зупиняли, видаляючи відновлює агент 2-МЕА з використанням центрифуг (наприклад, центрифужних фільтрів
Містосоп, ЗОК, МіПіроге) (Іаргі)п еї а. Маїшге Ргоїосої5, Мо! 9 Мо 10, р2450-2463; 2014 року). В іншому конкретному втіленні спосібінкубували з 75 мМ 2-меркаптоетіламін-НСЇІ (2-МЕА) в буфері (наприклад, РВ5 або Тріс-ЕОТА) при 31 "С протягом 5 годин; реакцію відновлення зупиняли, видаляючи відновлює агент 2-МЕА з використанням центрифуг (наприклад, центрифужних фільтрів Місгосоп, ЗОК, Мійроге) (Іабгі)п еї аЇ. Маїшге Ргоїосоі5, Мої 9 Мо 10, р2450-2463; 2014 року). В іншому конкретному втіленні спосібінкубували з 75 мМ 2-меркаптоетіламін-НСЇІ (2-МЕА) в буфері (наприклад, РВ5 або Тріс-ЕОТА) при 31 "С протягом 5 годин; реакцію відновлення 60 зупиняли, видаляючи відновлює агент 2-МЕА з використанням центрифуг (наприклад,
центрифужних фільтрів Місгосоп, ЗОК, МіПроге) (Іарбг|п еї аіІ. Маїште Ргоїосої5, Мо! 9 Мо 10, ра450-2463; 2014 року). В іншому конкретному втіленні спосіб є способом из Приклада 3.
Для цього способу можна використовувати будь-який з антитіл проти СО40 і СО137, описаних в даному документі. У конкретному втіленні перше і друге антитіло, які зв'язуються з людськими СО40 ії СО137, відповідно, можуть бити вибраними так, щоб отримати біспеціфічне антітіло, як описано в цьому документі.
В одному втіленні даного способу вказані перше і/або друге антитіло є повнорозмірними антітілами.
Області Ес першого і другого антитіл можуть мати будь-який ізотип, включаючи, але не обмежуючись зазначеним, ізотип Їдс, який має підклас, вибраний з групи, яка складається з
І9С1, Ідс2, ІдсЗ і Ідс4. В одному втіленні цього способу області Ес обох зазначених першого і зазначеного друге антитіл мають ізотип Ідс1. В іншому втіленні одна з областей Ес зазначених антитіл має ізотип ІДдС1, а інша - ізотип Їд04. В останньому втіленні отримане біспецифічне антитіло включає область Ес з ЇдО1 і область Ес з ЇдО4.
У додатковому втіленні одне з батьківських антитіл було сконструйовано так, щоб не пов'язувати протеїн А, що дозволяє відокремити гетеродимерное антитіло від зазначених батьківських гомодимерних антитіл шляхом пропускання продукту через колонку з протеїном А.
Як описано вище, послідовності першої та другої областей СНЗ гомодимерних батьківських антитіл відрізняються і є такими, що гетеродимерное взаємодія між зазначеними першої і другої областями СНЗ є більш сильним, ніж кожне з гомодимерних взаємодій зазначених першої і другої областями СНЗ. Більш детальна інформація про ці взаємодіях і про те, як вони можуть бути досягнуті, представлена в М/О 2011/131746 і УМО 2013/060867 (СептарБб), які повністю включені в даний опис посиланням.
Зокрема, стабільне біспецифічне антитіло СО40хСО137 може бути отримано з високим виходом з використанням вищевказаного способу за винаходом на основі двох гомодимерних антитіл, які зв'язують СО40 ії СО137, відповідно і містять тільки кілька досить консервативних асиметричних мутацій в областях СНЗ. Асиметричні мутації означають, що послідовності зазначених першої і другої областями СНЗ містять амінокислотні заміни в неідентичних положеннях.
Біспецифічні антитіла запропоновані даним винаходом також можуть бути отримані шляхом спільної експресії конструкцій, що кодують перший і другий поліпептиди в одній клітині. Таким чином, в додатковому аспекті винахід відноситься до способу отримання біспецифічногоантітіла, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: а) забезпечення першої нуклеотидні конструкції, що кодує перший поліпептид, що містить першу область Ес і першу антигензв'язувальну область, пов'язану з СО40 людини, відповідно до будь-аспектом або втіленням в цьому документі, причому зазначена перша область Ес включає першу область СНЗ, р) забезпечення другий нуклеотидні конструкції, що кодує другий поліпептид, що містить другу область Ес і другу антигензв'язувальну область, пов'язану з СО137 людини відповідно до будь-аспектом або втіленням цього винаходу, причому зазначена друга область Ес включає другу область Ес, де послідовності зазначених першої і другої областей СНЗ є різними і є такими, що гетеродимерное взаємодія між зазначеними першої і другої областями СНЗ є більш сильним, ніж кожне з гомодимерних взаємодій зазначених першої і другої областями СНЗ, їі де в зазначеній першої області СНЗ, щонайменше, одна з амінокислот в положеннях, які відповідають положенням, відповідно до заданої з групи, яка складається з 7366, І 368, КЗ370, р399, г405, 407 і К409 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації Є, була заміщена, і в зазначеній другий області СНЗ3, щонайменше, одна з амінокислот в положеннях, які відповідають положенням, відповідно до заданої з групи, яка складається з 7366, І 368, КЗ370, 0399, Г405, 407 ії К409 важкого ланцюга 901 людини, відповідно до нумерації ЕЄО, була заміщена і де зазначені перша і зазначена другі важкі кола не заміщені в однакових положеннях, необов'язково, де зазначені перша і друга нуклеотидні конструкції кодують послідовності легкого ланцюга зазначеного першого і другого антитіл, с) коекспрессія зазначених першої і другої нуклеотидних конструкцій в клітині-хазятна і а) отримання зазначеного гетеродимерного білка з клітинної культури.
Таким чином, даний винахід також відноситься до рекомбінантних еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, яка продукує біспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом. 60 В одному втіленні цього винаходу біспецифічне антитіло отримують будь-яким із способів відповідно до даного винаходу.
Відповідні експресуючі вектори, що включають промотори, енхансери тощо, і відповідні клітини-хазяїни для продукування антитіл добре відомі в даній галузі. Приклади клітин-хазяїнів включають клітини дріжджів, бактерій і ссавців, такі як клітини СНО або НЕК.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу і другу області СНЗ, за винятком зазначених мутацій, що включають послідовність ЗЕО ІЮО МО: 107 (дс1т (0).
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу область Ес і другу область Ес, де ні зазначена перша, ні зазначена друга область Ес не містять послідовність Суз-Рго-Зег-Суз в шарнірній області.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу область Ес і другу область Ес, де як зазначена перша, такі зазначена друга область Ес містять послідовність Суз-Рго-Рго-Суз в шарнірній області.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу область Ес і другу область Ес, де перша і друга області Ес є областями Ес антитіла людини.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу область Ес і другу область Ес, де зазначена перша і друга області Ес, за винятком зазначених мутацій, містять послідовність, незалежно обрану з групи, яка складається з 5Е0 ІЮ МО: 109, 110, 111, 112, 1131 116.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу область Ес і другу область Ес, де перша і друга антигензв'язувальних області походять з антитіл важкого ланцюга.
В одному втіленні біспецифічне антитіло, визначене в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу область Ес і другу область Ес, де перша і друга антигензв'язувальних області містять перший і другий легкий ланцюг.
В інших втіленнях спосіб спільної експресії відповідно до даного винаходу включає будь-які з додаткових ознак, описаних вище в способі іп міго.
Інертний формат
Ефекторні функції, опосередковані областю Ес антитіла, дозволяють знищувати чужорідні об'єкти, наприклад, вбивати патогени і виводити і деградувати антигени. Антитілозалежна клітиноопосерекована цитотоксичність (АЮСС) і антитілозалежний клітиноопосерекований фагоцитоз (АЮСР) ініціюються зв'язуванням області Ес з Ес-рецептор-несучими (ЕсК) клітинами, тоді як комплементзалежна цитотоксичність (СОС) і комплементзалежна клітиноопосерекована цитотоксичність (СОСС) ініціюється зв'язуванням області Ес з С1д, що ініціює класичний шлях активації комплементу.
Передбачається, що Ес-опосередкована ефекторна функція, така як АОСС і активація комплементу, сприяє терапевтичної ефективності моноклональних антитіл, які використовуються для лікування злоякісних новоутворень (М/еіпег еї аїЇ. СеїЇ 2012 148: 1081- 1084).
Мультиспецифічне антитіло, таке як біспецифічне антитіло, відповідно до даного винаходу зв'язується з СО137, який експресується на Т-клітинах, наприклад, Т-клітинах СО4 «з і/або СО8 в. За допомогою супутнього зв'язування антитіла з СО40, який експресується, наприклад, на антигенпрезентуючих клітинах (АРС), забезпечується стимуляція як АРС, які експресують СО40, так і Т-клітин, які експресують СО137, і, таким чином, наприклад, може бути збільшена проліферація Т-клітин.
Загалом, зв'язування антитіла з антигеном-мішенню, експресованим клітиною, може привести до взаємодій з ефекторними молекулами, такими як Ес-рецептори або білки комплементу, які можуть індукувати Ес-опосередковані ефекторні функції, такі як АОСС або активація комплементу, що може привести до загибелі клітини, яка експресує зазначений антиген-мішень.
Застосування мультиспецифічного антитіла, такого як біспецифічне антитіло, відповідно до даного винаходу засноване на його здатності забезпечувати костимуляцію АРС і Т-клітин.
У конкретному втіленні бажано, щоб мультиспецифічне антитіло не зв'язувалось з ЕСЕ, наприклад Есук, і, отже, не індукувало ЕсК-опосередковане перехресне зшивання.
У додатковому втіленні є бажаним, щоб мультиспецифічне антитіло не входило б ефекторні функції, щоб уникнути загибелі клітин, що експресують СО40 і/або СО137.
В одному аспекті цього винаходу мультиспецифічне антитілло СО40хСО137 відповідно до даного винаходу включає (|) перший зв'язувальний елемент, який містить перший важкий 60 ланцюг і першу антигензв'язувальну область, і (її) другий зв'язувальний елемент, який містить другий важкий ланцюг і другу антигензв'язувальну область відповідно до будь-якого аспекта або втілення, описаного в цьому документі.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає перший і другий важкий ланцюг, де вказане антитіло індукує і/або посилює Ес-опосередковану ефекторну функцію меншою мірою в порівнянні з мультиспецифічним антитілом, яке містить одні й ті ж перші і другі антигензв'язувальні області, як в зазначеному антитілі, і містить два важкі ланцюги, що включають шарнір ЇДО1 людини, області СН2 і СНЗ.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом включає першу і другу антигензв'язувальну область і перший і другий важкий ланцюг, причому кожний із першого і другого важких ланцюгів включає шарнір (9051 людини, області СН2 ії СНЗ, де щонайменше, один з поміж першого і другого важкого ланцюгів включає модифікацію, щоб індукувати і/або посилювати Ес-опосередковану ефекторну функцію меншою мірою в порівнянні з еталонним мультиспецифічним антитілом, яке містить такі ж першу і другу антигензв'язувальних області, що й вказане антитіло, і містить два важкі ланцюги, що включають шарнір ЇдДС1 людини, області СН2 і СНЗ, без зазначеної модифікації.
В одному втіленні зазначені перший і другий важкі ланцюги модифіковані таким чином, що мультиспецифічне антитіло індукує і/або посилює Ес-опосередковану ефекторну функцію меншою мірою в порівнянні з мультиспецифічним антитілом, яке є ідентичним, за винятком того, що вкдючає немодифіковані перший і другий важкий ланцюг.
В одному втіленні зазначена Ес-опосередкована ефекторна функція може бути визначена відносно зв'язування з Есу-рецепторами, зв'язування з С14 або індукції Ес-опосередкованого зшивання Еск.
В одному втіленні зазначену Ес-опосередковану ефекторну функцію визначають відносно зв'язування з С14.
В одному втіленні зазначені перша і друга константні послідовності важкого і легкого ланцюга були модифіковані таким чином, що зв'язування Сід із зазначеним мультиспецифічним антитілом знижується в порівнянні з мультиспецифічним антитілом дикого типу, щонайменше, на 70 965, щонайменше, на 80 95, щонайменше, на 90 95, щонайменше, на 95 уо, щонайменше, на 97 95 або на 100 95, де зв'язування з С14 визначають за допомогою тіФА.
ІдД01 людини відомий своєю здатністю індукувати Ес-опосередковані ефекторні функції, тоді як інші людські ізотипи, такі як 954, менш здатні індукувати Ес-опосередковані ефекторні функції.
Кожний з поміж першого і другого важких ланцюгів може мати будь-який ізотип, включаючи, але не обмежуючись зазначеним, ізотип ЇдДо1, обраний з груп, що складаються з Ідс1, Ідса2,
ІДОЗ і Ід04, і може необов'язково містити одну або кілька мутацій або модифікацій. В одному втіленні кожний з поміж першого і другого важких ланцюгів має ізотип Їдс54 або походить від нього, необов'язково, з однією або декількома мутаціями або модифікаціями. В одному втіленні кожний з поміж першого і другого важких ланцюгів має ізотип ЇдС1 або походить з нього, необов'язково, з однією або декількома мутаціями або модифікаціями. В іншому втіленні один із важких ланцюгів має ізотип Їдс1, а іншаий - ізотип Їдс4, або походить з таких відповідних ізотипів, необов'язково з однією або декількома мутаціями або модифікаціями.
В одному втіленні один або обидва з поміж першого і другого важких ланцюгів такі, що антитіло, яке містить два перших або два других важких ланцюгів, буде дефіцитним за ефекторними функціями. Наприклад, перший і другий важкі ланцюги можуть мати ізотип Їдс4 або тип не-Ід54, наприклад, ІдсС1, Ід952 або ІдсЗ3, який омутував так, що здатність опосередковувати ефекторні функції, такі як АОСС, була знижена або навіть втрачена в порівнянні з немутантними важкими ланцюгами. Такі мутації були описані, наприклад, в ра!"Асдиа МУР еї аї., у. Іттипої. 177 (2): 1129-1138 (2006) і Негагей М, У Мігої! .; 75 (24): 12161- 12168 (2001). Мультиспецифічні антитіла в відповідно до даного винаходу можуть містити модифікації в перших і других важких ланцюгах в порівнянні з послідовністю дикого типу Їдс1 людини. Мультиспецифічне антитіло, яке містить такі модифікації в області Ес антитіла може стати інертним, або не активується, мультиспецифічним антитілом. Використовуваний в даному документі термін "інертність", "інертний" або "неактивуючий" відноситься до області Ес, яка, щонайменше, не здатна зв'язувати будь-які Есу (гамма) рецептори, зв'язувати з Сід або індукувати Ес-опосередковане перехресне зв'язування ЕсК. Інертність області Ес або першого і/або другого важкого ланцюга мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом можна перевірити за допомогою двовалентного моноспецифічного антитіла, яке містить зазначену область Ес, або два перших важких ланцюгів або два других важких ланцюгів. Вона також може бути протестована з мультиспецифічним антитілом, що містить перший і другий 60 важкий ланцюг.
Для розробки терапевтичного антитіла можна створити кілька варіантів, щоб зробити область Ес антитіла неактивною для взаємодій з рецепторами Есу і С1д. Даний винахід не обмежується будь-якою конкретної мутацією, релевантною для зниження Ес-опосередкованих ефекторних функцій. Приклади таких варіантів описані в даному документі.
Таким чином, можуть бути модифіковані амінокислоти в області Ес, які відіграють домінуючу роль у взаємодіях з С14 і рецепторами Есу. Приклади положень амінокислот, які можуть бути модифіковані, включають положення 1 234, І 235 і РЗЗ1.
Отже, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота, щонайменше, в одному положенні, відповідному І/ 234, 1235 і РЗ331 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації Е), може бути А, А і 5, відповідно. (Хи єї а!., 2000., СеїЇ Пттипої. 200 (1): 16-26; Одапезуап евї а!., 2008, Асіа Стувзі. (064): 700-4). Крім того, амінокислотні заміни 234 і І235Е можуть призводити до ділянок Ес з порушеними взаємодіями з рецепторами Есу і С14 (Сапіеїйа еї а!., 1991, 93. Ехр.Меа. (173): 1483-91; Оипсап еї а!., 1988, Машге (332): 738-40). Отже, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають 1234 і 1235 важкого ланцюга ЇдДС1 людини, відповідно до нумерації ЄО,можуть бути Е і Е, відповідно.
Амінокислотна заміна Ю0265А може зменшити зв'язування з усіма Ес гамма рецепторами і запобігти АОСС (ЗпПієїЇд» еї аї., 2001., 9. Віої. Спет. (276): 6591-604). Отже, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає 0265 важкого ланцюга їД01 людини, відповідно до нумерації ЕО, може бути А. Зв'язування з С14 може бути анульоване за допомогою мутації в положеннях р270, К322, РЗ329 і РЗ331. Мутація цих положень або в О0270А, або в КЗ322А, або в РЗ329А, або в
РЗЗІА може зробити антитіло дефіцитним за активністю СОС, Ідизодіє ЕЕ, еї аї., 2000., 9.
Іттипої. 164: 4178-84). Отже, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених з поміж першого і другого важких ланцюгах амінокислоти, щонайменше, в одному положенні, яке відповідає 0270, КЗ322, РЗ329 і РЗ331 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації Є), можутьбути А, А, А і А, відповідно.
Альтернативний підхід до мінімізації взаємодії області Ес з рецепторами Есу і С14 полягає у видаленні сайту глікозилювання антитіла. Мутація положення М297, наприклад, О, А або Е, видаляє сайт глікозилювання, який є критичним для взаємодії Ідб- Есу-рецептор. Отже, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає М297, може бути С, О, А або Е важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БО (Геабтап еї аї . аї!., 2013, МАбБв»; 5 (6): 896-903). Інший альтернативний підхід для мінімізації взаємодії області Ес з рецепторами Есу може бути отриманий за допомогою наступних мутацій; Р2З8А, АЗ270, РЗ29А або
Е2ЗЗР/Л 234М/ 235А/с:236авеї! (5Нієаз еї аї., 20 01, 9. Віої. Спет. (276): 6591-6004).
В іншому випадку, людські підкласи Ідс2 і Ї3054 вважаються природно скомпрометовані в їх взаємодіях з С1і4 і Ес гамма-рецепторами, хоча повідомлялося про взаємодію з Есу- рецепторами (Раїтеп еї аї., 1992, 9. Сііп Іпмев5і. 90: 1537-1546; Вгипп5 еї а! .. 2009, Віоса 113: 3716-3725). Мутації, що скасовують ці залишкові взаємодії можуть бути здійснені в обох ізотипів, що призводить до зменшення небажаних побічних ефектів, пов'язаних зі зв'язуванням
Еск. Для Ід02 вони включають М234А і 5237А, а для Ідс4 - | 235Е. Отже, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першому і другому важкому ланцюзі, такому як в зазначені перший і другий важкий ланцюг, амінокислота в положенні, яке відповідає М234 і 5237 важкого ланцюга людського Ідс2 відповідно до нумерації БО, може бути А і А, відповідно. В одному втіленні амінокислота в положенні, яке відповідає І 235 важкого ланцюга Ідс4 людини, відповідно до нумерації ЕО, може бути Е.
Інші підходи для подальшої мінімізації взаємодії з рецепторами Есу і С14 в антитіла Ідо2 включають ті, які описані в М/О2011066501 ї Гідне 5., ега!., 2010 Ргоївіп бсіепсе (19): 753-62.
Шарнірна область антитіла також може бути важливою для взаємодій з рецепторами і комплементом Есу (Вг еККе еї а!., 2006, У Іттипої. 177: 1129-1138; СаІгАсдпа М/Р, еї аї!., 2006, у.
Іттипої. 177: 1129-1138). Відповідно, мутації або делеція шарнірної області можуть впливати на ефекторні функції антитіла.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло включає перший і другий важкий ланцюг, де, щонайменше, в одному із зазначених першому і другому важкому ланцюзі імуноглобуліну одна або кілька амінокислот знаходяться в положеннях, що відповідають положенням 1234, І 235, 0265, М297 і РЗЗ31 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕО неєГ,1,0, МІ Р, відповідно.
В одному втіленні як в першому, так і в другому важкому ланцюзі одна або кілька 60 амінокислот в положенні, яке відповідає положенням 1234, 1235, 0265, М297 і РЗ31 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕО, неє ГГ, Г, 0, М і Р, відповідно.
В іншому втіленні, щонайменше, в одному з першого і другого важких ланцюгів одна або кілька амінокислот в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ІдС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, не є Г, Її О, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають М297 і РЗЗ1 важкого ланцюга ІдсС1ї людини, відповідно до нумерації ЕМ, є М і Р, відповідно.
В одному втіленні одна або обидва важкі ланцюги містять мутацію, що видаляє акцепторний сайт для Азп-пов'язаного глікозилювання, або іншим чином дозволяє проводити маніпуляції для зміни властивостей глікозилювання. Наприклад, в області Ес (ДС! мутація М2970О може бути використана для видалення Азп-пов'язаного сайту глікозилювання. Відповідно, в конкретному втіленні одна або обидва важкі ланцюги містять послідовність дикого типу ЇДС1 з мутацією
М2970О.
Використовуваний в даному документі термін "амінокислота, що відповідає положенню" відноситься до номеру положення амінокислоти важкого ланцюга їд951 людини. Відповідні положення амінокислот в інших імуноглобулінах можуть бути виявлені шляхом вирівнювання з людським ЇдДС1. Якщо інше не зазначено або ніяк не суперечить контексту, амінокислоти послідовностей константної області в даному документі пронумеровані відповідно до індексу нумерації БО (описано в Кабаї, ЕА еїаї., 1991, Зедпепсез ої ргоївіп5 ої іттипо!одісаї іпіегеві. Бій
Еайіоп - 05 ЮОераптепі ої Неайй апа Нитап 5егмісе5, МІН рибіїсайоп Мо. 91-3242, рр 662, 680, 689). Таким чином, амінокислота або сегмент в одній послідовності, яка "відповідає" амінокислоті або сегменту в іншій послідовності, є амінокислотою, яка вирівнюється з іншою амінокислотою або сегментом з використанням стандартної програми вирівнювання послідовності, такої як АСОМ, СіІцеїамМ або аналогічної, зазвичай з настройками по замовчуванням і на, щонайменше, 50 956, щонайменше, 80 95, щонайменше, 90 95 або, щонайменше, 95 95 є ідентичною з важким ланцюгом Ідс51 людини. У даній галузі техніки вважається добре відомим, як вирівняти послідовність або сегмент в послідовності і тим самим визначити відповідне положення в послідовності з амінокислотним положенням відповідно до даного винаходу.
У контексті даного винаходу амінокислотне положення може бути визначено, як описано вище.
Термін "амінокислота не є" або аналогічне формулювання стосовно амінокислот важкого ланцюга слід розуміти так, що амінокислота є будь-яку іншу амінокислотою, крім зазначеної конкретної амінокислоти. Наприклад, амінокислота в положенні, яке відповідає І 234 важкого ланцюга ІдсС1і людини, не є Ї, означає, що амінокислота може бути будь-який з інших зустрічаються в природі або не зустрічаються в природі амінокислот, відмінних від Ї.
В одному втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 9051 людини, відповідно до нумерації МО, неє 0.
В одному втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації Є, не є
О, а амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням М297 і РЗЗ1 важкого ланцюга
ІдО1 людини, відповідно до нумерації ЕІ є М і Р, відповідно.
В одному втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 0265 важкого ланцюга ІдДс1 людини, відповідно до нумерації Є, є гідрофобні або полярні амінокислоти.
Термін "гідрофобний", який використовується в даному описі відносно амінокислотного залишку, відноситься до амінокислотного залишку, вибраного з групи, яка складається з: А, С,
Е,с, Н.І, М, Е, Т, М. ММ і М.
Таким чином, в одному втіленні в зазначених першому і другому важких ланцюгах амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи амінокислот, що складається з: А, С, ГЕ, б, Н.І, І, М,
Е,Т,М, Мі.
Термін "полярний", який використовується в даному документі щодо амінокислотних залишків відноситься до будь-якого амінокислотного залишку, вибраного з групи, яка складається з: С, ОО, Е, Н, К, М, О, К, 5 ї Т. Таким чином, в одному втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга Ід! людини, відповідно до нумерації БО, обрана з групи, яка складається з СІ Е,Н,К, М, О, БК, 51.
В іншому втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в 60 положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 9051 людини, відповідно до нумерації ЕОМ, є аліратичною незарядженою, ароматичною або кислою амінокіслотою.
Термін "аліратичний незаряджений", який використовується в даному документі щодо амінокислотних залишків, відноситься до будь-якого амінокислотним залишком, вибраним з групи, яка складається з: А, б, Гі М.
Таким чином, в одному втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається 3: А, б, І, Г і М.
Термін "ароматичний", який використовується в цьому документі щодо амінокислотних залишків, відноситься до будь-якого амінокислотного залишку, вибраного з групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Таким чином, в одному втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Термін "кислий", який використовується в даному документі відносно амінокислотних залишків, відноситься до будь-якого амінокислотного залишку, вибраного з групи, яка складається з: О і Е.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга
ІдОе1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з: О і Е.
Таким чином, в одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ЇдсС1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з: Ю і Е.
У конкретному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи, яка складається з: А, Е, ГЕ, 0,1, 1, т, Мі М.
У конкретному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ЇдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи, яка складається з: А,Е, Б, б, І, ЇЇ, Т, М і МУ.
В одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ЇдсС1 людини, відповідно до нумерації БО, не є 0.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 901 людини, відповідно до нумерації ВО, неє 0.
В одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає 0265 важкого ланцюга Ідс!ї людини, відповідно до нумерації ЕМ, не є 0, а амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням
М297 і РЗ331 у важкій ланцюга ІдО1 людини, відповідно до нумерації Еи є М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає 0265 важкого ланцюга Ідо1 людини, відповідно до нумерації ЕО, не є о, а амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням М297 і РЗЗ31 в важка ланцюг Ідо1 людини відповідно до нумерацією ЄО є М і Р, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації Еи, є гідрофобною або полярної амінокислотою.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 9051 людини, відповідно до нумерації ЕО, є гідрофобною або полярної амінокислотою.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга
Іде1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи амінокислот, що складається з: А, С,
Е,сб, Н.І, М, ЕК, Т.М, Мі М.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з: С,Е, Н,К, М, О,К, 5 і Т. в одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 9051 людини, відповідно до нумерації ЕОМ, обрана з групи амінокислот, що складаються з: А, С, БЕ, б, Н.І, Ї, М, К, Т, М М і У.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в 60 положеннях, які відповідають положенням 0265 важкого ланцюга людини, відповідно до нумерації ЕО, обрані з групи, яка складається з: СЕ, Н,К, М, О, К, 5 і Т.
В іншому втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації Є), є аліфатичні незаряджені, ароматичні або кислі амінокислоти.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга
ІдО1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з: А, б, і М.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга
ІдО1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з: ГЕ, Ті М.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга
ІдОе1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з: О і Е.
У конкретному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи, яка складається з: А, Е, ГЕ, 0,1, ЇЇ, Т, М і МУ.
В іншому втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 9051 людини, відповідно до нумерації Є), є аліфатичні незаряджені, ароматичні або кислі амінокислоти.
Таким чином, в одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається 3: А, б, І, І і М.
Таким чином, в одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Таким чином, в одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з: Ю і Е.
У конкретному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ДС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи, яка складається з: А,Е, Б, б, І, ЇЇ, Т, М і МУ.
У додатковому втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню М297 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, не є М.
В одному втіленні, щонайменше, в одному з першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає М297 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕМО, не є М, а амінокислота в положенні, яке відповідає положенню РЗЗ1 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕЄШ є Р.
В одному втіленні в зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенням М297 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЕУ, не є М.
В одному втіленні і в першій, і в другій важкій ланцюгах амінокислота в положенні, яке відповідає М297 важкого ланцюга Ід! людини, відповідно до нумерації ЕМО, не є М, а амінокислота в положенні, яке відповідає положенню РЗЗ1 важкого ланцюга їдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Р.
У додатковому втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, не є |! і Ї, відповідно.
В одному втіленні щонайменше, в одному з першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають І 234 і 1235 важкого ланцюга ІдС1ї людини, відповідно до нумерації ЕИ, не є Г і Ї, відповідно, і амінокислоти в положення, які відповідають положенням М297 і РЗ3З1 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕО, є Мі Р, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти, які відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації Еи, обрані з групи, яка складається з: А,С,О,Е, Б, б, Н.І, К, М, М, Р, 0,
В, 5,Т,М, М.
В одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 60 людини, відповідно до нумерації Є), є гідрофобні або полярні амінокислоти.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234 і І 235 важкого ланцюга ІдО1 людини, відповідно до нумерації Б), кожна обрана з групи, яка складається з: А,
С,БЕ,б, Н.І, М, КЕ, Т.М, Мі У.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234 і 1235 важкого ланцюга Їдб1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ, кожна обрана з групи амінокислот, що складається з С.О, Е, НК, М, ОО, КК, 51 Т.
У конкретному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ЇдОС1 людини, відповідно до нумерації Є), вибирають з групи, яка складається з: А, С,
СБ,Е,Б,,Н,ІК,М,М, О.К, 5, ТТ, М, Мі М.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕОМ, не є Г і Ї,, відповідно.
В одному втіленні як в першому, так і в другому важкому ланцюзі амінокислоти в положеннях, які відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕОМ, не є ГІ ії, відповідно, і амінокислоти в положеннях, які відповідають у положеннях
М297 і РЗ31 важкого ланцюга Ідо1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕО, є гідрофобні або полярні амінокислоти.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи, яка складається 3: А, С, БЕ, б, Н.І, М, В, Т, М,
Мі.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи амінокислот, що складається з: С, Ю, Е, Н, К,
Зо М О,К, ІТ.
У конкретному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи, яка складається з: А, С, 0, Е, Е, б,
Н.І,К,М,М,0, Кк, 5, ГТ, М, Мі У.
В іншому втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БО, є аліфатичні незаряджені, ароматичні або кислі амінокислоти.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ЇдОС1 людини, відповідно до нумерації Б), кожна обрана з групи, яка складається з: А,
С, М.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ЇдО1 людини, відповідно до нумерації ЕІ, кожна обрана з групи, яка складається з: Е, Т і М.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи, яка складається з; О і
Е.
У конкретному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають 1234 і 1235, кожна обрана з групи, яка складається 3: А, О, Е, Б, С.І, Т, М і МУ.
В одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1/234 і 1235 важкого ланцюга ЇдО1 людини, відповідно до нумерації ЕО, є ГЕ і Е; або А і А, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, у одному з поміж пешого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають / 234 і 1235 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е ї Е; або А і А, відповідно, і амінокислоти в положеннях, що 60 відповідають положенням М297 і РЗ31 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації
ЕЦО, є М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕО, є ГЕ і Е; або А і А, відповідно.
В одному втіленні як в першому, так і в другому важкому ланцюзі амінокислоти в положеннях, які відповідають 234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є ЕЕ ї Е; або А ії А, відповідно, і амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням М297 і РЗ3З1 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕО, є Мі Р, відповідно.
У конкретному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234 і І 235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е і Е, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е і Е, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів, щонайменше, амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдДО1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є А і А, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів, щонайменше, амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є А і А, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕО, неє ГГ, І. і О, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, у одному з поміж пешого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають 1 234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ІдС1 людини, відповідно до нумерації ЕЮ, не є І, Її ї О, відповідно, і амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням М297 і РЗ31 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації
ЕЦО, є М і Р, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти, які відповідають положенням 1 234 і І 235 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації Еи, обрані з групи, яка складається з: А, С,О,Е, Б, о, Н.І, К, М, М, Р, о,
КЕ, 5, Т, М, М ї М, ії амінокислота, що відповідає положенню 0265, обрана з групи, яка складається з: А,С,Е, Б, ОО, Н.І, К.Г М, М, Р, О, Б, 5, Т, М, М і МУ.
В одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації Б, є гідрофобними або полярними амінокислотами.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ІдС1 людини, відповідно до нумерації ЕО, обрана з групи амінокислот, що складається
З:А, С, ЕЕ, б, Н.І, Ї, М, ЕК, Т, М, М/ ї У ї амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 234 і 1235 важкого ланцюга ЇдС1 людини, відповідно до нумерації БО, кожен вибирають з групи, яка складається з: А, С, Е, б, Н.І, М, К, Т, М, Мі Х.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 їі 1235 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕЄО, кожна обрана з групи амінокислот, що складається з: С, О, Е, Н, К, М, 0, К, 5 ї Т, амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга людини, відповідно до нумерації ЄЮ, обрана з групи, яка
БО складається з С, Е,Н,К, М, О, Б, 51 т.
У конкретному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234 і І 235 важкого ланцюга ЇдО1 людини, відповідно до нумерації Є), вибирають з групи, яка складається з: А, С,
ОС,Е,Б, Б, Н,І,К, М, М, О, К, 5, Т, М, УМ ї У, і амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ІдО1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ обрана з групи, яка складається 3: А, С,Е, Б, о, Н.І, К.Г. М, М ОО, Б, 5, Т, М, Мі У.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ІЇдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕО, є гідрофобні або полярні амінокислоти. 60 В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 9051 людини, відповідно до нумерації ЕМ, обрана з групи амінокислот, що складається з: А, С, Б, б, Н.І, 1, М, К, Т, М, Мі М, а також амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і | 235 важкого ланцюга
ІдОе1 людини, відповідно до нумерації Є), вибирають з групи, яка складається 3: А, С, Е, б, Н.І, М,
К,Т,М Мі Х.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи амінокислот, що складається з: С, О, Е, Н, К,
М, 0, К, 5 Її Т, амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається з. СЕ, Н,К, М, О,К, 5 і т.
У конкретному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи, яка складається 3: А, С, О, Е, Е, б,
Н,І,К, М, М, О, К, 5, Т, М, М ії М ї амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації БО обрана з групи, яка складається з: А,
С,Е, Б, б, Н.І, К, СМ, М, ОЙ, К, 5, Т, М, МІ У.
В іншому втіленні, щонайменше, у одному з зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕО, є аліфатичними незарядженими, ароматичними або кислими амінокислотами.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ЇдС1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається 3: А, С,1, | і
М, і амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234 і І 235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи, яка складається з: А, б, | і М.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 важкого ланцюга ЇдС1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ, вибирають з групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Таким чином, в одному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 важкого ланцюга ЇдС1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ, вибирають з групи, яка складається з: О і Е.
У конкретному втіленні, щонайменше, у одному із зазначених першому і другому з поміж важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга
ІдОе1 людини, відповідно до нумерації Є), обрана з групи, яка складається 3: А, Е, ГЕ, б,1І, І, Т, М і М/ і амінокислоти в положеннях, які відповідають 234 і 1235, кожна обрана з групи, яка складається 3: А, ОО, Е, Б, б, І, Т, М, і М.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга дО1 людини, відповідно до нумерації ЕО, неє І і О, відповідно.
В одному втіленні як в першому, так і в другому важкому ланцюзі амінокислоти в положеннях, які відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ІЇдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕО, не є ГГ, Її ї О, відповідно, і амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ31 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕЮ, є Мі Р, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ІЇдсС1 людини, відповідно до нумерації Є), є аліфатичні незаряджені, ароматичні або кислі амінокислоти.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга ІДС1 людини, відповідно до нумерації ЕО, обрана з групи, яка складається з; А, б, І, Ї ї М ї амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Їд01 людини, відповідно до нумерації
Е), кожна обрана з групи, яка складається з; А, б, | і М.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга дО1 людини, відповідно до нумерації Є), кожна обрана з групи, яка складається з; О і Е.
У конкретному втіленні в обох із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до 60 нумерації ЕО, обрана з групи, яка складається з: А, Е, Е, б, І, Т, М ї М/ ії амінокислоти в положеннях, які відповідають І 234 і | 235, кожна обрана з групи, яка складається з: А, ОЮ, Е, Е, б,
І, Т,Мі м.
В одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга
ІдО1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е,Е і А; або А, А і А, відповідно.
В одному втіленні щонайменше, в одному з першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і 0265 важкого ланцюга ІдС1 людини, відповідно до нумерації Є, є Е,Е і А; або А, А і А, відповідно, і амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням М297 і РЗ31 важкого ланцюга ЇдсС1 людини, відповідно до нумерації
ЕО, є М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга дО1 людини, відповідно до нумерації ЕО, ЄР, Е і А; або А, А і А, відповідно.
В одному втіленні як в першому, так і в другому важкому ланцюзі амінокислоти в положеннях, які відповідають 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ІЇдсС1 людини, відповідно до нумерації РО, ЄЕ, Е і А; абод, А і А, відповідно, і амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням М297 і РЗ31 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕЮ, є Мі Р, відповідно.
У конкретному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е, Е і А, відповідно.
В особливо кращому втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга
ІдО1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е, Е і А, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга
ІдО1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є А, А і А, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга їдс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є А, А і А, відповідно.
В іншому втіленні, щонайменше, в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235, 0265, М297 і РЗЗ31 важкого ланцюга ІдДО1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є ЕР, Е, А, О і 5, відповідно.
В одному втіленні в обох із зазначених першому і другому із важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1 234, 1235, 0265, М297 і РЗЗ31 важкого ланцюга ІдСИ1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е, Е, А, 9 і 5, відповідно.
У конкретному втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 1,2 ї 3, відповідно, і СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕБЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно; і зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОМК2 і СОМКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 52ЕО ІО МО: 64, 65 і 66, відповідно, і СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ХЕО ІЮ МО: 67,
САБ5 і 68, відповідно (СО137, клон 009) і, щонайменше, в одному з поміж першого і другого важких ланцюгів, таких як зазначений перший і другий важкі ланцюги, амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини є Е,
Е ї А, відповідно.
В іншому втіленні зазначена перша антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 ії 3, відповідно, і СОК!І, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в 5ЕБЕО ІО МО: 4, УТ5 і 5, відповідно; і зазначена друга антигензв'язувальна область включає СОКІ, СОМК2 і СОМКЗ варіабельної області важкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ХЕО ІЮО МО: 36, 37 і 38, відповідно, ії СОКІ, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, які мають послідовності, наведені в ХЕО ІЮО МО: 39,
ЗА5 і 40, відповідно (СО137, клон 005) і, щонайменше, в одному з першого і другого важких ланцюгів, таких як зазначений перший і другий важкі ланцюги, амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням 1234, І 235 ії 0265 важкого ланцюга ІдсС1 людини є Е, ЕЕ і А, відповідно.
Неактивуюча область Ес перешкоджає взаємодії антитіла з Ес-рецепторами, присутніми в клітинах крові, такими як моноцити, або з С14д для активації класичного шляху комплементу. 60 Зниження активності Ес було перевірене на варіантах антитіл, які містять різні комбінації амінокислотних замін в області Ес. Три амінокислотні заміни були введені в батьківські антитіла запропоновані даним винаходом, які включають мутації /234Е, 1235Е і 0265А. Заміни в цих трьох положеннях амінокислот були введені в основний ланцюг К409К і/або Е405І. з Ідс1.
Отриманий варіант неактивуючого антитіла позначається суфіксом "БЕАНВ" або "РЕАЇ", відповідно. Зазначені батьківські антитіла були використані для отримання біспецифічних антитіл даного винаходу, як описано в прикладах.
В одному аспекті мультиспецифічні антитіла запропоновані даним винаходом можуть бути модифіковані в легкому ланцюзі і/або важкому ланцюзі для підвищення рівня експресії та/або виходу продукування. В одному втіленні антитіла запропоновані даним винаходом можуть бути модифіковані в легкому ланцюзі. Такі модифікації відомі в даній галузі техніки і можуть бути виконані відповідно до способів, описаних, наприклад, в 2Пепо, Г., содаага, .-Р., Ваштапи, Ш., «Реутопаі, 9.-І. (2004). Ехргезвзіоп ітргометепі апа теспНапівіїс зішау ої Ше геїйо-ОівІ5-АІдегазе саїауїс апіїбоду ТОЕ11 ру 5пе-дігесієй тиїадепевів. Чуоитаї ої Моїесшіаг Віоіоду, 341 (3), 807-14.
У додатковому втіленні винаходу одне або обидва з антитіл, які є складовими мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом, були сконструйовані для зменшення або збільшення зв'язування з неонатальним Ес-рецептором (ЕРсКп), щоб маніпулювати періодом напіввиведення з сироватки мультиспецифічного антитіла. Методи збільшення або зменшення періоду напіврозпаду в сироватці добре відомі в даній галузі. Див.,
Наприклад, ВОаїІГАсдпа еї аї. 2006, 9. ВіоІ!. Спет., 281: 23514-24; Ніпюп еї аї. 2006, 9. Іттипої., 176: 346-56; і /аІєувкКу еї а. 2010 Маї. Віоїтеснпої., 28: 157-9.
В одному аспекті мультиспецифічне антитіло, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, включає першу константну область важкого ланцюга (НС) і першу константну область легкого ланцюга (ІС), де положення, які відповідають положенням 1234, 235 і 0265 важкого ланцюга Ідс1 людини з послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 109 як першого важкого ланцюга, так і другого важкого ланцюга є Е, Е і А, відповідно.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло, як визначено в будь-якому з втілень, розкритих в цьому документі, включає першу і другу константну область важкого ланцюга (НС) і першу і другу константну область легкого ланцюга (ІС), де положення, які відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга Їде1 людини з послідовністю ЗЕО ІО МО: 109 як першого важкого ланцюга, так і другого важкого ланцюга є Е і Е, відповідно.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло включає перший і другий важкий ланцюг, де положення, які відповідають положенням 1234 і І 235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БО як першого важкого ланцюга, так і другого важкого ланцюга, є Е і Е, відповідно і де (ї) положення, яке відповідає Е405 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БЮ першого важкого ланцюга, є ГЇ, і положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга ЇдДО1 людини, відповідно до нумерації БО другий важкий ланцюг є К, або (ії) положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга ЇдО1 людини, відповідно до нумерації ЕЮ першого важкого ланцюга, є К, а положення, яке відповідає Е405 важкого ланцюга ЇдО1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ для другої важкого ланцюга є Ї.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло включає перший і другий важкий ланцюг, де положення, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ЇдС1 людини, відповідно до нумерації БО як першого, так і другого важкого ланцюга, є Е, Е і А, відповідно, і де положення, яке відповідає Е405 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЄЮ першого важкого ланцюга, є ГЇ, і положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЕО другого важкого ланцюга є К. Таким чином, в додатковому втіленні зазначений перший важкий ланцюг включає константну послідовність важкого ланцюга, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО: 113; і другий важий ланцюг включає константну послідовність важкого ланцюга, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО: 112.
В одному втіленні мультиспецифічне антитіло включає перший і другий важкий ланцюг, де положення, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ЇдС1 людини, відповідно до нумерації БО як першого, так і другого важкого ланцюга, є Е, Е і А, відповідно, і де положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЄЮ першого важкого ланцюга, є К, і положення, що відповідає Е405 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації БО другого важкого ланцюга є Ї. Таким чином, в додатковому втіленні зазначений перший важкий ланцюг включає константну послідовність важкого ланцюга, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО: 112; і другий важий ланцюг включає константну послідовність важкого ланцюга, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО: 113.
Нуклеїнові кислоти
Даний винахід також відноситься до нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або кілька 60 амінокислотних послідовностей відповідно до будь-яких аспектів або втілень, розкритих в даному документі.
Даний винахід також відноситься до нуклеїнової кислоти, яка кодує мультиспецифічне антитіло, як визначено в будь-якому аспекті або втіленні, розкритому в даному документі.
Даний винахід також відноситься до експресуючого вектору, який містить нуклеїнову кислоту даного винаходу.
Даний винахід також відноситься до клітини-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту або експресуючий вектор запропонований даним винаходом.
В одному втіленні зазначена клітина-хазяїн є рекомбінантною еукаріотичною, рекомбінантною прокаріотичний або рекомбінантную мікробну клітину-хазятна.
У додатковому втіленні експресуючий вектор додатково включає нуклеотидну послідовність, що кодує константну область легкого ланцюга, важкого ланцюга або як легкого, так і важкого ланцюгів антитіла, наприклад антитіла людини.
Експресуючий вектор в контексті даного винаходу може бути будь-яким придатним вектором, включаючи хромосомні, нехромосомні синтетичні нуклеотидні вектори (нуклеотидні послідовності, що містять відповідний набір елементів контролю експресії). Приклади таких векторів включають похідні 540, бактеріальні плазміди, фагів ДНК, бакуловірусів, дріжджові плазміди, вектори, отримані з комбінацій плазмід і фагової ДНК, і вектори вірусної нуклеїнової кислоти (РНК або ДНК). В одному втіленні нуклеїнова кислота міститься в голому векторі ДНК або РНК, включаючи, наприклад, елемент лінійної експресії (як описано, наприклад, в зуке5 апа
ЧоНпв5іоп, Маї Віоїесй 17, 355 59 (1997)), вектор з щільноупакованою нуклеїновою кислотою (як описано, наприклад, в З 6077835 і/або МО 00/70087), плазмідний вектор, такий як рВК322, рис 19/18 або рус 118/119, нуклеотідний вектор мінімального розміру "тідде" (Як описано, наприклад, в Зспакому»екі еї аї., Мої Тег 3, 793 800 (2001)) або у вигляді векторної конструкції обложеної нуклеїнової кислоти, такої як конструкція, обложена СаРозх (як описано, наприклад, в
МО200046147, Вепмепівіу апа Везпеї, РМА5). ОСОБА 83, 9551 55 (1986), М/ідіег єї аї!., Сеї! 14, 725 (1978) і Согаго апа Реагзоп, 5отаїйс Сеї! Сепеїїсз 7, 603 (1981)). Такі вектори нуклеїнових кислот і їх застосування добре відомі в даній галузі (Див., Наприклад, О5 5,589,466 і 05 5,973,972).
В одному втіленні вектор придатний для експресії антитіла СО40 і/або антитіла СО137 в бактеріальної клітині. Приклади таких векторів включають експресуючі вектори, такі як
ВІсезстірі (5ігатадепе), вектори ріМ (Мап НееКе «5спивіег, У Віої Спет 264, 5503 5509 (1989), вектори рЕТ (Момадеп, Маадізоп М/І) тощо).
Експресуючий вектор може також або альтернативно бути вектором, придатним для експресії в дріжджовій системі. Можна використовувати будь-який вектор, придатний для експресії в дріжджовий системі. Придатні вектори включають, наприклад, вектори, що містять конститутивні або індуцібельні промотори, такі як альфа-фактор, алкогольоксидази і РОН (див.
Е. А!йзибре! еї аїЇ., Ей. Сцтепі Ргоїосоіє іп МоїІесшаг Віоіоду, Стеепе Рибіїзніпя апа Уміеу
Іп'егосіепсе Мем Хогк (1987 ) і Огапі еїг аїЇ., Меїйодз іп Еп7гутої 153, 516 544 (1987)).
Експресуючий вектор може також або альтернативно бути вектором, придатним для експресії в клітинах ссавців, наприклад, вектором, що містить глутамінсінтетазу як селектований маркер, такий як вектори, описані в Вербіпдіоп (1992) ВіоїесппоЇІоду (МУ) 10: 169-175.
Нуклеїнова кислота і/або вектор також можуть містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність секреції/локалізації яка може направляти поліпептид, такий як синтезований поліпептидний ланцюг, в периплазматичний простір або в середовище для культивування клітин. Такі послідовності відомі в даній галузі і включають лідер секреції або сигнальні пептиди.
Експресуючий вектор може включати або бути пов'язаний з будь-яким придатним промотором, енхансером та іншими елементами, які полегшують експресію. Приклади таких елементів включають сильні промотори експресії (наприклад, промотор/енхансер ІЇЕ СММ людини, а також промотори К5М, 5М40, 513 3, ММТМ і НІМ ІТК), ефективні полі (А) термінальної послідовності, точка початку реплікації для плазмідного продукту в Б.соїї, ген стійкості до антибіотика як селективного маркера і/або зручний сайт клонування (наприклад, полілінкера). Нуклеїнові кислоти можуть також включати індуцібельний промотор, на відміну від конститутивного промотора, такого як СММ ІЕ.
В одному втіленні експресуючий вектор, який кодує антитіло до СО40 і/або СО137, може бути розташований і/або доставлений в клітину-хазяїн або тварину-хазяїн через вірусний вектор.
У ще одному аспекті винахід відноситься до клітини-хазяїна, що містить першу і другу нуклеотидні конструкції, зазначені в даному документі вище.
Таким чином, даний винахід також відноситься до рекомбінантних еєукаріотичної або бо прокаріотичної клітини-хазяїна, яка продукує мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом, така як трансфектома.
Перше СО40-специфічне антитіло може експресуватися в рекомбінантній еукаріотичній або прокаріотичній клітині-хазяїні, такій як трансфектома, яка продукує антитіло, як визначено в даному документі. Друге, СО137-специфічне антитіло може також експресуватися в рекомбінантній еукаріотичній або прокаріотичній клітині-хазяїні, такій як трансфектома, яка продукує антитіло. Такі антитіла можуть бути використані для отримання мультиспецифічних антитіл запропонованих даним винаходом. Моноспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом може також експресуватися в рекомбінантній еукаріотичній або прокаріотичній клітині-хазяїні, такій як трансфектома.
Приклади клітин-хазяїнів включають клітини дріжджів, бактерій, рослин і ссавців, такі як клітини СНО, СНО-5, НЕК, НЕК293, НЕК-293Е, Ехрі293Е, РЕК.Сб або М50 або лімфоцитарні клітини. Наприклад, в одному втіленні клітина-хазяїн може містити першу і другу нуклеотидні конструкції, стабільно інтегровані в клітинний геном. В іншому втіленні даний винахід відноситься до клітини, що містить неінтегровані нуклеїнові кислоти, такі як плазміда, косміда, фагеміда або елемент лінійної експресії, які включають описані вище першу та другу нуклеотидні конструкції.
У ще одному додатковому аспекті винахід відноситься до трансгенної тварини або рослини, відмінних від людини, які містить нуклеїнові кислоти, що кодують один або два набори важкого ланцюга людини і легкого ланцюга людини, де тварина або рослина продукує мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом.
Перше СО40-специфічне антитіло і/або друге СО137-специфічне антитіло також може продукуватися гібридомою, відмінною від людини трансгенною твариною чи рослиною, яка містить нуклеїнові кислоти, що кодують один або два набори важкого ланцюга людини і легкого ланцюга людини, де тварина або рослина продукують антитіло для застосування в мультиспецифічному антитілі або мультиспецифічному антитілі запропонованому винаходом.
В одному аспекті винахід відноситься до нуклеїнової кислоти, що кодує одну або кілька амінокислотних послідовностей, наведених в таблиці 1.
В одному аспекті винахід відноситься до експресуючого вектора, який включає (І) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність важкого ланцюга першого зв'язувального плеча відповідно до будь-якого з розкритих в даному документі втілень; (ії) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність легкого ланцюга першого зв'язувального плеча відповідно до будь-якого з розкритих в даному документі втілень; (ії) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність важкого ланцюга другого зв'язувального плеча відповідно до будь-якого з розкритих в даному документі втілень; (м) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність легкого ланцюга другого зв'язувального плеча відповідно до будь-якого з розкритих в даному документі втілень; (М) нуклеїнову кислоту, у (і), і нуклеїнову кислоту, зазначену в (Її); (Мі) нуклеїнову кислоту, зазначену в (ії), і нуклеїнову кислоту, зазначену в (ім). (Мії) нуклеїнову кислоту, зазначену в (Її), (Ії), «іїї) ї (ім).
У конкретному втіленні нуклеїнова кислота може кодувати варіабельну область важкого ланцюга, що включає МН СОКІ1, СОК2 і СОКЗ антитіла проти СО40, зазначеного в таблиці 1, і яка кодує важкий ланцюг ЇдДС1 людини, який має послідовність, обрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 110, 111, 112, 1131 116.
В іншому втіленні нуклеїнова кислота може кодувати варіабельну область важкого ланцюга, що містить МН СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ одного з антитіл проти СО137, перерахованих в таблиці 1, тобто будь-якого з клонів 001-012, і кодує важкий ланцюг Їдс1 людини, який має послідовність, яка обрана з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 110, 111, 112, 113 і 116.
В окремих і конкретних втіленнях нуклеїнова кислота, нуклеотидна конструкція, комбінація першої і другої нуклеотидних конструкцій, експресуючий вектор або комбінація першого і другого експресуючого вектора, відповідно до даного винаходу можуть кодувати (а) НС, що включає (ї) МН, що містить МН СОК1, СОК2 ії СОКЗ антитіла проти СО40 з таблиці 1 ї, в першу чергу, каркасні області людини, які необов'язково включають одну або декілька амінокислотних зворотних мутацій на амінокислоту нелюдської послідовності і (її) важкий ланцюг Ідс1 людини, який має послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 110, 111, 112, 113 ї 116; (Б) НС, що включає (ї) УН, що містить МН СОК1, СОК2 ії СОКЗ одного з антитіл проти СО137, перерахованих в таблиці 1, тобто будь-якого одного з клонів 001-012, і в першу чергу каркасних областей людини, необов'язково включають одну або кілька зворотних амінокислотних мутацій на нелюдську амінокислотну послідовність, і (ії) важкий ланцюг ІдсС1 людини, який має бо послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО І1О МО: 110, 111, 112, 113 і 116;
(с) ІС, що включає (ї) МІ, що містить МІ СОК1, СОМК2 і СОКЗ антитіла проти СО40 з таблиці 1 ї, головним чином, каркасні області людини, необов'язково включають одну або декілька амінокислотних зворотних мутацій на нелюдську амінокислотну послідовність і (її) константну область легкого ланцюга, що має послідовність зЕО ІЮ МО: 114; (94) ІС, що включає (ї) МІ, що містить М СОКІ1, СОК2 ї СОКЗ одного з антитіл проти СО137, перерахованих в таблиці 1, тобто будь-якого з клонів 001-012, і, в першу чергу, каркасних областей людини, які необов'язково включають одну або кілька зворотних мутацій амінокислот на нелюдську амінокислотну послідовність, і (ії) константну область легкого ланцюга, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 114; (Е) обидва (а) і (Б); (РЕ) обидва (а) і (с); (С) обидва (Б) і (а); (Н) обидва (с) і (а); або (І) обидва (а), (Б), (с) та (4).
В інших окремих і конкретних втіленнях нуклеїнова кислота, нуклеотидна конструкція, комбінація першої і другої нуклеотидних конструкцій, експресуючий вектор або комбінація першого і другого експресуючого вектора відповідно до даного винаходу можуть кодувати (а) НС, що включає (ї) МН, що містить МН СОК1І, СОК2 і СОКЗ 5ЕО ІЮО МО: 1,21 31, В основному, каркасні області людини, які необов'язково включають одну або декілька амінокислотних зворотних мутацій на нелюдську амінокислотну послідовність і (її) важкий ланцюг Ідс1 людини, який має послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 110, 111, 112, 113 ї 116; (Б) НС, що включає (ї) МН, що містить МН СОКІ, СОК2 і СОКЗ 5ЕО ІЮ МО: 64, 651661, головним чином, каркасні області людини, які необов'язково включають одну або декілька амінокислотних зворотних мутацій на нелюдську амінокислотну послідовність і (її) важкий ланцюг Ідс1 людини, який має послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 110, 111, 112, 113 ї 116; (с) С, що включає (І) МІ, що містить МІ СОКІ1, СОК2 і СОКЗ 5ЕО ІЮО МО: 4, ХТ51і 5ЕО ІЮ
МО: 5 ії, в основному, каркасні області людини, необов'язково включають одну або декілька амінокислотних зворотних мутацій на нелюдську амінокислотну послідовність, і (ії) константну область легкого ланцюга, що має послідовність 5ЕО І МО: 114; (94) Г С, що включає (ї) МІ, що містить МІ СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ 5ЕО І МО: 67, АБ і 5ЕО І
МО: 68 і, в основному, каркасні області людини, які необов'язково включають одну або декілька амінокислотних зворотних мутацій на нелюдську амінокислотну послідовність, і (її) константну область легкого ланцюга, що має послідовність зЕО ІЮ МО: 114; (Е) обидва (а) і (Б); (РЕ) обидва (а) і (с); (С) обидва (Б) і (а); (Н) обидва (с) і (а); або (І) обидва (а), (Б), (с) та (9).
В інших окремих і конкретних втіленнях нуклеїнова кислота, нуклеотидна конструкція, комбінація першої і другої нуклеотидних конструкцій, експресуючий вектор або комбінація першого і другого експресуючого вектора відповідно до даного винаходу можуть кодувати (а) НС, що включає МН, що містить 5ЕО ІО МО: 117, і важкий ланцюг ІдС1 людини, який має послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО І1О МО: 110, 111, 112, 113 і 116; (Б) НС, що включає МН, що містить 5ЕО ІО МО: 123, і важкий ланцюг ІдДС1 людини, який має послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 110, 111, 112, 113 ї 116; (с) ІС, що включає МІ, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 121, і константну область легкого ланцюга, що має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 114; (4) ІС, що включає МІ, яка містить 5ЕО ІО МО: 127, і константну область легкого ланцюга, що має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 114; (Е) обидва (а) і (Б); (РЕ) обидва (а) і (с); (Ж) обидва (Б) і (а); (Н) обидва (с) і (4); або (І) обидва (а), (Б), (с) та (4).
В інших окремих і конкретних втіленнях нуклеїнова кислота, нуклеотидна конструкція, комбінація першої і другої нуклеотидних конструкцій, експресуючий вектор або комбінація першого і другого експресуючого вектора відповідно до даного винаходу можуть кодувати бо (А) НС, що включає 5ЕО І МО: 118 (2С040-001-НОб, Ідс1);
(В) НС, що включає 5ЕО І МО: 119 (С040-001-НСОб-ЕЕАЇ); (С) НС, що включає 5ЕО ІЮ МО: 120 (26040-001-НС6-ЕЕАВ); (С) НС, що включає 5ЕО ІО МО: 124 (С0137-009-НСТ); (Е) НС, що включає 5ЕО І МО: 125 (СО0137-009-НС7-ЕЕАВ); (Р) НС, що включає ЗЕО ІЮ МО: 126 (С0137-009-НС7-ЕЕАЇ); (С) І С, що включає ЗЕО ІЮ МО: 122 (2О040-001-І 1); (Н) С, що включає 5ЕО ІЮ МО: 128 (С0137-009-І 2); (І) обидва (а) і (9); (У) обидва (Б) і (9); (К) обидва (с) і (9); () обидва (а) і (п); (М) обидва (е) і (Р); (М) обидва (0) і (П); (0) обидва (Б) і (е); (Р) обидва (с) і (0); (0) обидва (9) та (М); (К) обидва (Б), (е), (9) та (п); (5) обидва (с), (0, (9) та (п).
В одному аспекті винахід відноситься до способу отримання біспецифічного антитіла відповідно до будь-якого з розкритих в даному документі втілень, що включає стадії а) культивування клітини-хазяїна, як описано в цьому документі, що включає експресуючий вектор, як описано в цьому документі, що експресує перше антитіло, як описано в цьому документі, і очищення зазначеного антитіла з культурального середовища; р) культивування клітини-хазяїна, як описано в даному документі, що включає експресуючий вектор, як описано в даному документі, експресуючого антитіла, як описано в даному документі, і очищення зазначеного антитіла з культурального середовища; с) інкубування зазначеного першого антитіла разом із зазначеним другим антитілом за відновлювальних умов, достатніх для того, щоб цистеїни в шарнірній області піддавалися ізомеризації дисульфідного зв'язку, і а) отримання зазначеного біспецифічного антитіла.
В одному аспекті винахід відноситься до клітини-хазяїна, що містить експресуючий вектор, як визначено вище. В одному втіленні клітина-хазяїн є рекомбінантною еукаріотичною, рекомбінантною прокаріотичною або рекомбінантною мікробною клітиною-хазяїном.
Композиції
Цей винахід також відноситься до композиції, яка містить мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом, нуклеїнову кислоту запропоновану даним винаходом, експресуючий вектор запропонований даним винаходом чи клітину-хазяїна запропоновану даним винаходом.
У додатковому втіленні композиція запропонована даним винаходом є фармацевтичною композицію.
У ще одному втіленні фармацевтична композиція запропонована даним винаходом додатково включає фармацевтично прийнятний носій.
У додатковому аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що включає: - мультиспецифічне антитіло до СО40хСО137, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень, і - фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтична композиція запропонована даним винаходом може містити одне мультиспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом або комбінацію різних мультиспецифічних антитіл запропонованих даним винаходом.
Фармацевтичні композиції можуть бути складені відповідно до загальноприйнятих методик, таких як розкриті в Кетіпдіоп: Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпагтасу, 19(й Едйіоп, Сеппаго, Еа.,
Маск Рибіїзпіпуд Со., Еазіоп, РА, 1995. Фармацевтична композиція запропонована даним винаходом може, наприклад, включати розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіонний детергент, наприклад, твін-20 або твін-80), стабілізатори (наприклад, цукри чи небілкові амінокислоти), консерванти, тканинні фіксатори, солюбілізатори і/або інші матеріали, придатні для включення до фармацевтичної композиції.
Фармацевтично прийнятні носії включають будь-які відповідні розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові агенти, агенти ізотонічності, антиоксиданти і агенти, що пригнічують абсорбцію, тощо, які є фізіологічно сумісними з 60 мультиспецифічними антитілами запропонованими даним винаходом. Приклади відповідних водних і неводних носіїв, які можуть бути використані в фармацевтичних композиціях даного винаходу, включають воду, фізіологічний розчин, фосфатний буферний розчин, етанол, декстрозу, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь тощо) і їх відповідні суміші, рослинні олії, колоїдні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь і органічні складні ефіри для ін'єкцій, такі як етилолеат, і/або різні буфери. Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для негайного приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Належна плинність може підтримуватися, наприклад, шляхом застосування матеріалів для покриття, таких як лецитин, шляхом підтримування необхідного розміру частинок у випадку дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин.
Фармацевтичні композиції відповідно до даного винаходу можуть також включати фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію тощо; (2) розчинні у олії антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксіанізол, бутильований гідрокситолуол, лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол тощо; і (3) металічні хелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота тощо.
Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом можуть також включати в композиції агенти ізотонічності, такі як цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, гліцерин або хлорид натрію.
Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом можуть також включати один або кілька ад'ювантів, придатних для вибраного способу введення, такі як консерванти, змочувальні агенти, емульгатори, диспергуючі агенти, консерванти або буфери, які можуть підвищити термін зберігання або ефективність фармацевтичної склад. Фармацевтична композиція запропонована даним винаходом може бути приготовлена з носіями, які будуть захищати мультиспецифічне антитіло від швидкого вивільнення, таких як композиції з контрольованим вивільненням, включаючи імплантат, трансдермальні пластирі та мікроїнкапсульовані системи доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерілдістеарат, здатні до біологічного розкладання, біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідріди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри і тільки полімолочну кислоту або віск, або інші матеріали, добре відомі в даній галузі. Способи приготування таких композицій зазвичай відомі фахівцям в даній галузі.
Стерильні розчини для ін'єкцій можуть бути отримані шляхом включення активної сполуки в необхідній кількості у відповідному розчиннику з одним або комбінацією інгредієнтів, наприклад, як зазначено вище, за необхідності, з подальшою стерилізацією мікрофільтрації. Зазвичай дисперсії готують шляхом включення активної сполуки в стерильний носій, який включає основне дисперсійне середовище і необхідні інші інгредієнти, наприклад, з перерахованих вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій прикладами способів приготування є вакуумне висушування та висушування сублімацією (ліофілізація), які дають порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий потрібний інгредієнт з його попередньо стерильно відфільтрованого розчину.
Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях можуть варіюватися так, щоб отримати кількість активного інгредієнта, яка є ефективною для досягнення потрібної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції та режиму введення, без токсичності для пацієнта. Обраний рівень дозування буде залежати від багатьох фармакокінетичних факторів, включаючи активність конкретних використовуваних композицій даного винаходу, шлях введення, час введення, швидкість виведення конкретної сполуки, що використовується, тривалість лікування, інші лікарські засоби, сполуки і/або матеріали, які використовуються в поєднанні з конкретними композиціями, які застосовуються, віком, статтю, масою, станом, загальним станом здоров'я і попередньою історією хвороби пацієнта, якого лікують, і аналогічними факторами, добре відомими в медицині.
Фармацевтична композиція може бути введена будь-яким придатним шляхом і способом. В одному втіленні фармацевтичну композицію даного винаходу вводять парентерально. Термін "вводиться парентерально", як він використовується в даному документі, означає способи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і включає епідермальну, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньокапсулярну, інтраорбітальну, внутрішньосерцеву, трансдермальну, внутрішньоочеревинну, внутрішньосухожильну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуглобову, субкапсулярну, субарахноїдальну, внутрішньоспінальну, 60 внутрішньочерепну, внутрішньогрудну, епідуральну та інтрастернальну ін'єкцію і інфузію.
В одному втіленні фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенною або підшкірноою ін'єкцією або інфузією.
Застосування
Цей винахід також відноситься до мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом, нуклеїнової кислоти запропонованої даним винаходом, вектору експресії даного винаходу, клітини-хазяїна запропонованої даним винаходом, композиції запропонованої даним винаходом, або фармацевтичної композиції запропонованої даним винаходом для застосування як лікарського засобу.
Цей винахід також відноситься до мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом, нуклеїнової кислоти запропонованої даним винаходом, вектору експресії запропонованого даним винаходом, клітини-хазяїна запропонованої даним винаходом, композиції запропонованої даним винаходом, або фармацевтичної композиції запропонованої даним винаходом для застосування для лікування захворювання, такого як онкологічне або інфекційне захворювання.
Згідно винаходу термін "захворювання" відноситься до будь-якого патологічного стану, зокрема до онкологічних захворювань, інфекційних захворювань, запальних захворювань, метаболічних захворювань, аутоїмунних порушень, дегенеративних захворювань, захворювань, пов'язаних з апоптозом і відторгнення трансплантата.
Термін "злоякісне захворювання", який використовується в даному документі, охоплює захворювання, що характеризується аберантним регульованим клітинним ростом, проліферацією, диференціюванням, адгезією і/або міграцією. Під "злоякісною пухлинною клітиною" слід розуміти аномальну клітину, яка росте в результаті швидкої неконтрольованої клітинної проліферації і продовжує рости після припинення стимулів, які ініціювали нове зростання.
Термін "онкологічне захворювання" відповідно до винаходу включає лейкемії, семіноми, меланоми, тератоми, лімфоми, нейробластоми, гліоми, рак прямої кишки, рак ендометрію, рак нирки, рак надниркової залози, рак щитовидної залози, гемобластози, рак шкіри, рак головного мозку, рак шийки матки, рак кишечника, рак печінки, рак товстої кишки, рак шлунка, рак кишківника, рак голови та шиї, рак шлунково-кишкового тракту, лімфоми, рак стравоходу, колоректальний рак, рак підшлункової залози, рак вуха, носа і горла (ЕМТ), рак молочної залози, рак передміхурової залози, рак матки, рак яєчників і рак легень, і їх метастази. Їх прикладами є рак легень, рак молочної залози, рак передміхурової залози, рак товстої кишки, нирково-клітинні карциноми, рак шийки матки або метастази типів злоякісних новоутворень або пухлин, описаних вище.
Термін "онкологічне захворювання" відповідно до винаходу також включає метастази злоякісних новоутворень. Під "утворення метастаз" мають на увазі поширення злоякісних пухлинних клітин з вихідної ділянки до інших частин тіла. Формування метастаз є дуже складним процесом і залежить від відділення злоякісних клітин з первинної пухлини, інвазії позаклітинного матриксу, пенетрації через ендотеліальні базальні мембрани для проникнення в порожнину організму і судини, а потім, після перенесення кров'ю, інфільтрації в органи-мішені.
Нарешті, зростання нової пухлини, тобто вторинної пухлини або метастатичної пухлини, на ділянці-мішені залежить від ангіогенезу. Утворення метастаз пухлин часто відбувається навіть після видалення первинної пухлини, оскільки пухлинні клітини або компоненти можуть залишатися і розвивати метастатичний потенціал. В одному втіленні термін "утворення метастаз" відповідно до винаходу відноситься до "віддаленого утворення метастаз", яке відноситься до утворення метастаз, віддаленого від первинної пухлини і системи регіонарних лімфатичних вузлів.
Термін "інфекційне захворювання" відноситься до будь-якого захворювання, яке може передаватися від людини до людини або від організму до організму і викликатися мікробним агентом (наприклад, застудою).
Приклади інфекційних захворювань включають вірусні інфекційні захворювання, такі як
СНІД (НІМ), гепатит А, В або С, герпес, оперізуючий лишай (вітряна віспа), німецький кір (вірус краснухи), жовта лихоманка, лихоманка Денге тощо, флавівіруси, віруси грипу, геморагічні інфекційні захворювання (віруси Марбург або Ебола) і важкий гострий респіраторний синдром (ЗАКЗ5Б), бактеріальні інфекційні захворювання, такі як хвороба легіонерів (І едіопеЇІа), венеричні захворювання (наприклад, хламідіоз або гонорея), виразка шлунка (Неїїсобрасіег), холера (міргіо), туберкульоз, дифтерія, інфекції, викликані кишковою паличкою, стафілококами, сальмонелою або стрептококами (правець); інфекції, які викликаються найпростішими патогенами, такими як малярія, сонна хвороба, лейшманіоз; токсоплазмоз, тобто інфекції, які бо викликаються плазмодіями, трипаносомами, лейшманією і токсоплазмами; або грибковими інфекціями, які викликаються, наприклад, Стуріососси5 пеоїогтап5, Нівіоріазта сарзшашт,
Соссідіоіїдез іттійі5, Віазїотусез адегтайнаїй5 або Сапаїйда аїіБбісапв.
Термін "запальне захворювання" відноситься до будь-якого захворювання, яке характеризується або пов'язане з високим рівнем запалення в тканинах, зокрема в сполучній тканині, або дегенерацією цих тканин. Хронічне запальне захворювання є захворюванням, яке характеризується постійним запаленням. Приклади (хронічних) запальних захворювань включають целіакію, васкуліт, вовчак, хронічну обструктивну хворобу легенів (СОРО), хвороба подразненого кишківника, атеросклероз, артрит, анкілозуючий спондиліт, хвороба Крона, коліт, хронічний активний гепатит, дерматит і псоріаз.
Термін "порушення обміну речовин" відноситься до будь-якого захворювання або порушення, яке порушує нормальний обмін речовин. Приклади включають цистиноз, діабет, дисліпідемію, гіпертиреоз, гіпотиреоз, гіперліпідемію, гіполіпідемію, галактоземії, хвороба Гоше, ожиріння і фенілкетонурію.
Термін "аутоїмунний розлад" відноситься до будь-якого захворювання/розладу, при якому організм проявляє імуннну реакцію (тобто реакцію імунної системи) на певну складову своєї власної тканини. Іншими словами, імунна система втрачає здатність розпізнавати певну тканину або систему в організмі як власну і націлюється і атакує її, як якщо б вона була чужорідною.
Аутоїмунні захворювання можуть бути класифіковані на ті, в яких вражений переважно один орган (наприклад, гемолітична анемія і антіммунний тиреоїдит), і ті, в яких процес аутоїмунного захворювання поширений на багато тканини (наприклад, системний червоний вовчак).
Наприклад, вважається, що розсіяний склероз спричинений тим, що Т-клітини атакують оболонки, які оточують нервові волокна головного і спинного мозку. Це призводить до втрати координації, слабкості і помутніння зору. Аутоїмунні захворювання відомі в даній галузі і включають, наприклад, тиреоїдит Хашимото, хворобу Грейвса, вовчак, розсіяний склероз, ревматичний артрит, гемолітичну анемію, антімммунний тиреоїдит, системний червоний вовчак, целіакію, хворобу Крона, коліт, діабет, склеродермію, псоріаз тощо.
Термін "дегенеративне захворювання" відноситься до будь-якого захворювання, при якому функція або структура уражених тканин або органів буде з часом все більше погіршуватися.
Приклади включають хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, бічний аміотрофічний склероз (АГ 5), хворобу Хантінгтона, макулярну дегенерацію, розсіяний склероз, м'язову дистрофію, хворобу Німана-Піка, остеопороз і ревматоїдний артрит.
Термін "захворювання, пов'язані з апоптозом" відноситься до будь-якого захворювання, в якому залучені зміни апоптозу. Приклади включають онкологічні захворювання, неврологічні розлади, такі як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, хвороба Хантінгтона, аміотрофічний бічний склероз (АЇ 5) і інсульт, серцеві захворювання, такі як реперфузія ішемії і хронічна серцева недостатність, інфекційні захворювання і аутоїмунні захворювання.
Термін "відторгнення трансплантата" відноситься до відторгнення трансплантованої тканини або органу імунною системою реципієнта, що може, в кінцевому підсумку, зруйнувати трансплантовану тканину або орган.
В одному втіленні застосування мультиспецифічного антитіла, нуклеїнової кислоти, експресуючого вектора, клітини-хазяїна або композиції для застосування відповідно до даного винаходу може бути використано для лікування раку.
В одному втіленні використання мультиспецифічного антитіла, нуклеїнової кислоти, експресуючого вектора, клітини-хазяїна або композиції для застосування відповідно до даного винаходу може бути використано для лікування інфекційного захворювання.
Цей винахід також відноситься до способу лікування захворювання, такого як рак або інфекційне захворювання, що включає введення мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом, нуклеїнової кислоти запропонованої даним винаходом, експресуючого вектора запропонованого даним винаходом, клітини-хазяїна запропонованої даним винаходом, композиції запропонованої даним винаходом або фармацевтичної композиції запропонованої даним винаходом об'єкту, який цього потребує.
Цей винахід також відноситься до застосування мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом, нуклеїнової кислоти запропонованої даним винаходом, експресуючого вектора запропонованого даним винаходом, клітини-хазяїна запропонованої даним винаходом, композиції запропонованої даним винаходом або фармацевтичної композиції запропонованої даним винаходом для виготовлення лікарського засобу.
В одному втіленні спосіб або застосування відповідно до даного винаходу призначене для застосування в поєднанні з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, такими як хіміотерапевтичні агенти. 60 В одному аспекті винахід відноситься до мультиспецифічного антитіла, такого як біспецифічне антитіло, відповідно до будь-яких з розкритих в даному документі втілень, композиції, розкритої в даному документі, або фармацевтичної композиції, розкритої в даному документі, для застосування як лікарського засобу.
В іншому аспекті даний винахід відноситься до застосування мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування захворювань, такого як онкологічне або інфекційне захворювання.
В одному аспекті винахід відноситься до мультиспецифічного антитіла відповідно до будь- яких з розкритих в даному документі втілень, композиції, розкритої в даному документі, або фармацевтичної композиції, розкритої в цьому документі, для застосування для лікуванні захворювання, такого як онкологічне або інфекційне захворювання.
В одному аспекті винахід відноситься до способу лікування захворювання, який передбачає введення мультиспецифічного антитіла відповідно до будь-яких з розкритих в даному документі втілень, композиції, розкритої в даному документі, або фармацевтичної композиції, описаної в даному документі, суб'єкту, який цього потребує.
Мультиспецифічні антитіла запропоновані даним винаходом можуть бути використані для ряду цілей. Зокрема, мультиспецифічні антитіла запропоновані даним винаходом можна використовувати для лікування різних форм раку, включаючи метастатичні онкологічні захворювання і рефрактерні онкологічні захворювання.
В одному втіленні застосування відповідно до даного винаходу поєднується з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, такими як хіміотерапевтичні агенти.
Зокрема, мультиспецифічні антитіла запропоновані даним винаходом можуть бути корисними в терапевтичних схемах, при яких важливим є збільшення проліферації Т-клітин.
Приклад такої терапевтичної схеми включає, не обмежуючись названим, рак або пухлини, такі як гематологічні і солідні пухлини, наприклад, меланома, рак легень, рак молочної залози, недрібноклітинний рак легень (МЗСІ С), рак товстої кишки, рак нирки, рак шийки матки і рак передміхурової залози, такі як меланома або МЗС С.
Їх прикладами є рак легень, рак молочної залози, рак передміхурової залози, рак товстої кишки, нирково-клітинні карциноми, рак шийки матки або метастази таких типів злоякісних новоутворень або пухлин.
Цей винахід також відноситься до способу лікування онкологічних захворювань, який передбачає а) вибір суб'єкта, який страждає на рак, і б) введення суб'єкту мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом або фармацевтичної композиції запропонованої даним винаходом.
Також винахід стосується застосування мультиспецифічного антитіла, яке зв'язується з людським СО40 і СО137 людини, для приготування лікарського засобу для лікування онкологічного захворювання, такого як одне з конкретних онкологічних станів, згаданих в даному документі.
Винахід також відноситься до мультиспецифічного антитіла для застосування для лікування онкологічного захворювання, такого як одне з онкологічних станів, згаданих вище.
В одному втіленні спосіб або застосування відповідно до даного винаходу призначений для застосування в поєднанні з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, такими як хіміотерапевтичні агенти.
Для вищезазначених застосувань може бути використане будь- мультиспецифічне антитіло, таке як біспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом.
В одному аспекті винахід відноситься до діагностичної композиції, яка містить мультиспецифічне антитіло, згідно будь-якого з втілень, розкритих в цьому документі.
В одному втіленні діагностична композиція є супутньою діагностикою, яка використовується для скринінгу і відбору тих пацієнтів, які отримають користь від лікування мультиспецифічним антитілом.
У додатковому втіленні способів лікування запропонованих даним винаходом ефективність лікування контролюється під час терапії, наприклад, в заздалегідь визначені моменти часу, шляхом визначення пухлинного навантаження.
Режими дозування в вищевказаних способах лікування і застосуваннях коригуються для забезпечення оптимальної потрібної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, може бути введений один болюс, можуть вводитися кілька розділених доз протягом періоду часу, або доза може бути пропорційно зменшена або збільшена, як зазначено залежно від терапевтичної ситуації. Парентеральні композиції можуть бути складені в одиничній дозованій формі для простоти введення та однаковості дозування. 60 Ефективні дозування і схеми дозування для мультиспецифічних антитіл залежать від захворювання або стану, що підлягає лікуванню, і можуть бути визначені фахівцями в даній галузі. Межі приблизного діапазону для терапевтично ефективної кількості мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом становлять приблизно 0,001-30 мг/кг.
Лікар або ветеринар, який має звичайні навички в даній галузі, може легко визначити і призначити ефективну кількість необхідної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар можуть починати призначати прийом доз мультиспецифічного антитіла, що використовується у фармацевтичній композиції, з рівнів нижчих, ніж потрібно для досягнення потрібного терапевтичного ефекту, і поступово збільшувати дозування до тих пір, поки не буде досягнутий потрібний ефект. Зазвичай придатною добовою дозою мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом буде така кількість сполуки, яка є найнижчою дозою, ефективною для отримання терапевтичного ефекту. Введення може, наприклад, бути парентеральним, таким як внутрішньовенне, внутрішньом'язове або підшкірне. В одному втіленні мультиспецифічні антитіла можна вводити інфузією в щотижневому дозуванні, розрахованому за мг/м. Такі дозування можуть, наприклад, грунтуватися на дозуваннях мг/кг, представлених вище, відповідно до наступних: доза (мг/кг) х 70:1,85. Таке введення може повторюватися, наприклад, від 1 до 8 разів, наприклад від З до 5 разів. Введення може бути виконане шляхом безперервної інфузії протягом періоду від 2 до 24 годин, наприклад, від 2 до 12 годин. В одному втіленні мультиспецифічні антитіла можна вводити повільною безперервною інфузією протягом тривалого часу, нариклад, більше 24 годин, для зменшення токсичних побічних ефектів.
В одному втіленні мультиспецифічні антитіла можна вводити в щотижневому дозуванні, розрахованому у вигляді фіксованої дози, до 8 разів, наприклад, від 4 до 6 разів, коли вводять один раз на тиждень. Такий режим може бути повторений один або кілька разів за необхідності, наприклад, через б місяців або 12 місяців. Такі фіксовані дози можуть, наприклад, бути засновані на дозуваннях мг/кг, представлених вище, виходячи з маси тіла 70 кг. Дозування може бути визначине або скориговане шляхом визначення кількості мультиспецифічних антитіл запропонованих даним винаходом в крові при введенні, наприклад, шляхом відбору біологічного зразка і використання антиідіотипових антитіл, які націлені на антигензв'язувальну область мультиспецифічних антитіл проти антигену СЮО137 запропонованого даним винаходом.
В одному втіленні мультиспецифічні антитіла можна вводити як підтримуючу терапію, таку як, наприклад, один раз на тиждень протягом періоду 6 місяців або більше.
Мультиспецифічне антитіло також можна вводити профілактично, щоб знизити ризик розвитку онкологічного захворювання, відтермінувати початок виникнення події в прогресуванні онкологічного захворювання і/або зменшення ризику рецидиву, коли злоякісне захворювання знаходиться в стадії ремісії.
Мультиспецифічні антитіла запропоновані винаходом також можна вводити в комбінованій терапії, тобто в поєднанні з іншими терапевтичними агентами, які відповідають захворюванню або стану, який підлягає лікуванню. Відповідно, в одному втіленні лікарський засіб, що містить мультиспецифічні антитіла, призначений для комбінування з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, такими як цитотоксичний, хіміотерапевтичний або антиангіогенний агент.
Таке комбіноване введення може бути одночасним, роздільним або послідовним. Для одночасного введення агенти можна вводити у вигляді однієї композиції або у вигляді окремих композицій, в залежності від ситуації. Таким чином, даний винахід також відноситься до способів лікування захворювання, які включають введення мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом в поєднанні з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, як описано нижче.
В одному втіленні даний винахід відноситься до способу лікування розладу, який включає введення терапевтично ефективної кількості мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом і, необов'язково, щонайменше, одного додаткового терапевтичного агента об'єкту, який цього потребує.
В одному втіленні даний винахід відноситься до способу лікування або профілактики онкологічного захворювання, який включає введення терапевтично ефективної кількості мультиспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом і, щонайменше, одного додаткового терапевтичного агента об'єкту, який цього потребує.
Фармацевтичні композиції запропоновані винаходом також можна вводити в комбінованій терапії, тобто в поєднанні з іншими агентами або в поєднанні з іншим режимом лікування.
Наприклад, мультиспецифічні антитіла можна комбінувати з променевою терапією і/або хірургією і/або аутологічною або алогенною трансплантацією периферійних стовбурових клітин бо або трансплантацією кісткового мозку.
Біомаркери
Таким чином, в одному аспекті даний винахід також відноситься до застосування мультиспецифічного антитіла як біомаркера.
В іншому аспекті винахід відноситься до набору для виявлення поперечної зшивки між
СОра40- і Ср137-експресуючими клітинами в зразку, отриманому від пацієнта, такому як зразок крові, зразок лімфатичного вузла або зразок кісткового мозку, який включає ї) мультиспецифічне антитіло відповідно до будь-якого з втілень, розкритих в цьому документі; і її) спосіб застосування зазначеного набору.
У додатковому аспекті винахід відноситься до способу виявлення того, чи відбувається перехресне зв'язування між СО40- і СО0О137-експресуючими клітинами в зразку, отриманому від пацієнта, такому як зразок крові, зразок лімфатичного вузла або зразок кісткового мозку, після введення біспецифічного антитіла відповідно до будь-якого з розкритих в даному документі втілень, який включає стадії: () контакт зразка з мультиспецифічним антитілом відповідно до будь-якого з втілень, описаних в цьому документі, за умов, які забезпечують утворення комплексу між зазначеним мультиспецифічним антитілом і СО40- і СО137-експресуючими клітинами; і (ІЇ) аналіз того, чи був сформований комплекс.
Виявлення комплексу може бути виконане способами, відомими в даній галузі, такими як виконані в Прикладі 4, 5, 6, 10, 11 або 12.
Антиїідіотипові антитіла
В іншому аспекті винахід відноситься до антиідіотипового антитіла, яке зв'язується з першою іабо другою антигензв'язувальною областю, як визначено в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень.
У конкретному втіленні антиіїдіотипове антитіло зв'язується з першою і/або другою антигензв'язувальною областю мультиспецифічного антитіла, де - перша антигензв'язувальна область включає послідовність МН, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 117, і послідовність МІ, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 121, та - друга антигензв'язувальна область включає послідовність МН, що включає 5ЕО ІЮО МО:
Зо 123, і послідовність МІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 127.
В одному втіленні антиїдіотипове антитіло зв'язується з першою антигензв'язувальною областю, визначеною в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень. У конкретному втіленні перша антигензв'язувальна область включає послідовність МН, яка включає ЗЕО ІЮ
МО: 117, і послідовність МІ, що включає 5ЕО ІЮО МО: 121.
В іншому втіленні антиїдіотипове антитіло зв'язується з другою антигензв'язувальною областю, визначеною в будь-якому з розкритих в цьому документі втілень. У конкретному втіленні друга антигензв'язувальна область включає послідовність МН, що містить ЗЕО ІЮ МО: 123, і послідовність МІ, яка містить зЗЕО ІЮО МО: 127.
Даний винахід додатково ілюструється такими прикладами, які не слід тлумачити як такі, що обмежують обсяг винаходу.
Приклади
Приклад 1. Отримання антитіл
С040 і кожне з антитіл проти СО137 (тобто клонів 1-12), згаданих у наведеній вище таблиці 1, продукували за допомогою послідовностей МН і МІ, описаних в таблиці 1, з легкого к-ланцюга людини і важкого ланцюга їД01 людини. СО40-антитіло отримували з двома різними важкими ланцюгами Ідс1 людини; 1) важким ланцюгом Ідс1 людини, що містить наступні амінокислотні мутації: 1 234Е, І235Е, 0265А і Г405І (ГЕАМ), де номер положення амінокислоти відповідає нумерації БО (відповідає БЕО ІО МО: 113); ії 2) важкого ланцюга (901 людини, що містить наступні амінокислотні мутації: /234Е, 1235Е, 0265А і К409К (ЕГЕАК), де номер положення амінокислоти відповідає нумерації ЄЮ (відповідає ФЕО ІЮ МО: 112).
Всі антитіла проти СО137 були отримані з важким ланцюгом ЇдДСб1 людини, що містить наступні амінокислотні мутації: /234Е, 1235Е, 0265А і К409К (ЕГЕАК), де номер положення амінокислоти відповідає нумерації ЄЮ (відповідає ФЕО ІЮ МО: 112).
Аналогічно, було отримано антитіло 012, що містить послідовності УН і МІ,, згадані в таблиці 1, з легеим ланцюгом 951 людини і важким ланцюгом дб людини, що включає наступні амінокислотні мутації: 1234Е, І235Е, 0265А і Е405І (БГЕАЇ), де номер амінокислотного положення відповідає нумерації ЄЮ (відповідає ФЕО ІЮ МО: 113).
Антитіла продукували за безсивороткових умов шляхом спільної трансфекції відповідних векторів, що експресують важкі та легкі ланцюги в клітинах Ехрі 293 "м (кат. Мо Тпегтовізпег 60 А14527) з використанням Ехрібесіатіпе "м 293 (кат. Мо ТпептовРізпег А14525) відповідно до інструкцій виробника. Антитіла очищали афінною хроматографією з протеїном А та буфер замінювали на 12,6 мМ МаНгРО», 140 мМ Масі, буфер рН 74 (В.Вгашп або ТнепторізНег). Після заміни буфера зразки стерильно фільтрували через тупикові фільтри 0,2 мкм. Очищені білки аналізували за допомогою СЕ-505 і НР-5ЕС. Концентрацію вимірювали за поглинанням при 280 нм. Очищені антитіла зберігали при 2-8 26.
Приклад 2. ДНК-тасування між СО137 дикого кабана або слона і людини для визначення доменів, важливих для зв'язування анти-СО137 антитіл
Для визначення доменів, важливих для зв'язування анти-СО137 антитіл з СО137 людини, проводили ДНК-тасування між СО137 людини і дикого кабана (зи5 5сгоїа; ХР 005665023) або між СО137 людини і африканського слона (Іоходопіа айісапа; ХР 003413533). Випадкові конструкції отримували з ДНК, що кодує СЮО137 людини, шляхом заміни людських доменів доменами дикого кабана (випадкова конструкція 1-4, 6) або слона (випадкова конструкція 5).
Якщо домен в СО137 людини важливий для зв'язування анти-СО137 антитіла, зв'язування буде втрачене при заміні цього домену доменом дикого кабана або африканського слона.
Вимагалося, щоб антитіло не зв'язувалось з усією послідовністю СО137 слона або дикого кабана. Гомологія між СО137 людини і дикого кабана і між СО137 людини і африканського слона складає 70,2 і 74,5 95, відповідно. на Фігурі 1 показано вирівнювання послідовностей
СО0137 людини, дикого кабана та африканського слона. На Фігурі 2 показані конструкції для
СО0Б137 людини, містять домени СО137 дикого кабана або домени африканського слона, як зазначено. 3х105 клітин НЕК293Т-17 висівали в колби для культивування 175 (Сгеіпег Віо-Опе, кат. Мо 658175) в 20 мл середовища КРМІ 1640 сСІшамАХ, яке містить 10 956 ЕС5 (Віоспгот, кат. Мо 5 0115). Після інкубації протягом ночі клітини тимчасово трансдукували експресуючими векторами, які кодують змішані конструкції або СО137 дикого кабана, африканського слона або людини нижче конститутивно активного промотора чинника елонгації-ї альфа (ЕБР-1 альфа) з використанням реактиву ТгапоІТФ9-І 1 ТгапеТесіоп Кеадепі, Мігиз Віо (МУУК Іпіеппайіопаї, кат. Мо 731-0029), відповідно до інструкцій виробника. На наступний день клітини збирали з використанням 1,5 мл Ассціазе (бідта Аїагісн, кат. Мо. Аб6964) (інкубація при 37 "С протягом 5 хвилин) і проточну цитометрію проводили, власне, як описано в Прикладі 4, для вимірювання поверхневої експресії змішанних конструкцій і СО137 людини, африканського слона і дикого кабана і для вимірювання зв'язування клонів антитіла до різних змішаних конструкцій. Щоб виміряти експресію конструкцій на клітинній поверхні, трансдуковані клітини інкубували з 1 мкг/мл козячого поліклонального антитіла проти СО137 людини (К 50 бузіетв5, кат. АЕ8З8) в буфері РГАС5 (0О-РВ5 з додаванням 5 мМ ЕОТА |бЗідта Аїагісп, кат. Мо 036901) і 5 95 (об./об.) фетальної бичачої сироватки (ЕВ5, Віоспгот, кат. Ме. 5 01151) (4 "С, 20 хв.) з подальшою інкубацією з міченим АРС антитілом проти ЇдО кози (Н - 1) (К 850 бузієтв, кат. Мо. РО108) (4 "С, 20 хв.). Зв'язування різних клонів антитіл СО137 з клітинами, які експресують конструкції у випадковому порядку, вимірювали шляхом інкубації трансдукованих клітин з 1 мкг/мл клонів антитіл з подальшою інкубацією з Е (аб ) 2-фрагментом АйЙіпіРиге, міченим АРС (кінцеве розведення 1:50; Чдаск5оп, кат. Мо 109-136-127).
Все змішані конструкції СО137, а також СО137 людини, африканського слона і дикого кабана, були експресовані на клітинній поверхні з однаковими рівнями експресії (Фігура 3).
В таблиці 2 і на Фігурі 4 показано, що всі клони, за винятком клону 1, показали втрату зв'язування, щонайменше, з СЮО137 африканського слона або дикого кабана. Клони 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ї 11 показали втрату зв'язування, щонайменше, з однією з змішанних конструкцій.
Клон 1 продемонстрував знижене зв'язування з СО137 африканського слона і змішанною конструкцією 5, і в порівнянні зі зв'язуванням з СО137 людини. Клон 12 не показав втрати зв'язування з будь-якою з змішанних конструкцій, але показав знижене зв'язування з змішанною конструкцією 5. Жоден з клонів не показав втрати зв'язування або зменшеного зв'язування з змішаними конструкціями 1 і 2.
Таблиця 2
Зведена інформація про зв'язування антитіл проти СО137 з змішаними конструкціями
Зв'язування,
Зв'язування, подібне до знижене в зв'язування з СО137 порівнянні зі відсутність зв'язування людини зв'язуванням з
СО0137 людини кабана 12 слона ннжжяжяпяинннннннІнждшШшШнннннннннннннннннннннннннншшшш
Приклад 3. Отримання біспецифічних антитіл за допомогою 2-МЕА-індукованого обміну Бар- плечей
Спосіб отримання стабільних біспецифічних антитіл на основі ІдС1ї описаний в
ММО2011131746 (Септар). Продукт біспецифічного антітіла, отриманий цим способом, описаним нижче, більше не братиме участі в обміні Габ-плечей. Основою для цього способу було використання додаткових доменів СІЗ, які сприяють утворенню гетеродимерів в визначених умовах аналізу. Щоб забезпечити виробництво біспецифічних антитіл цим способом, були отримані молекули ЇДС1, що несуть певні мутації в домені СНЗ: в одному батьківському антитілі мутації Т350І, КЗ370Т їі Е405І (або мінімально Е405І), в іншому батьківському антитілі ЇдО1 - мутація КА09НК.
Концентрації батьківських антитіл ЇдС1, які мінімально містили точкову мутацію Е405І. або
К409К, вимірювали за їх поглинанням при 280 нм. Конкретні коефіцієнти екстинкції, засновані на амінокислотній послідовності, були використані для визначення концентрації білка.
Система Сире є гнучкою роботизованою робочою камерою Септар. Система була розроблена і побудована у співпраці з компанією Реак Апаїувзіз апа Ашо/!таїйіоп (РАА), Фарнборо,
Великобританія.
Біспецифічні антитіла були отримані шляхом об'єднання наступних антитіл з Прикладу 1: - Антитіло СО40-ЕЕАЇ в поєднанні з кожним з антитіл СО137-ЕЕАВ, - Антитіло СО40-ЕЕАК в поєднанні з антитілом 012-ЕЕАЇ, і - Кожне з антитіл СО137-ЕЕАК в поєднанні з антитілом Б12-ЕЕАЇ.
Процес виявлення біспецифічних антитіл виконується автоматизованим способом в системі
Сибе, як показано на Фігурі 5 і описано нижче.
Для генерації біспецифічних антитіл виконуються наступні (автоматизовані) стадії: - Залежно від необхідного об'єму, вихідні планшети з глибокими комірками (96-комірковий прозорий поліпропіленовий планшет з глибокими комірками 2 мл з М-подібним дном, Согпіпод, кат. Мо 3960; 48-комірковий Кіріаїет? 5УМ 5 мл, Кійег, кат. Мо 43001-1062; 24-комірковий Кіріаїе
БУМ 10 мл, КіШег, кат. Мо 43001-1066) заповнювали батьківськими антитілами (антитілами, які містять Е405І - ії К409К- в різних планшетах) в концентрації 1,0 мг/мл (в їх РВ5, В.Вгацп) (Фігура 5, ліві планшети). - З цих вихідних планшетів готуються за допомогою Сибе відповідно до Фігури 5 планшети попереднього відсіву (96-комірковий, з М-подібним дном, Согпіпу), середні планшети. Для кожної комбінації з батьківським антитілом в сітці обміну 67,5 мкл батьківського антитіла додавали до відповідного планшету попереднього відсіву. - Після попереднього відсіву проводився обмін. В даному випадку два батьківських антитіла (67,5 мкл, 1,0 мг/мл кожне), кожне з різних планшетів попереднього відсіву, додавали в обмінний планшет (96-комірковий поліпропіленовий круглодонний планшет, ОСгеїпег, кат. Мо 650293), кожне антитіло в кінцевій концентрації 0,5 мг/мл (еквімолярна концентрація) (Фігура 5, праві планшети).
- Реакцію обміну починали, додаючи 15 мкл 75 мМ 2-меркаптоетіламін-НСЇІ (2-МЕА) (в їх
РВ5, В.Вгашп) в обмінний планшет. Загальний об'єм в обмінному планшеті тепер становить 150 мкл (кінцева концентрація 2-МЕА 7,5 мМ) - Обмінні планшети інкубували при 31 "С протягом 5 годин в автоматичному інкубаторі
Суютаї 6000 (Тнегто 5сіепійіс). - Відновник 2-МЕА видаляли за допомогою знесолювальних колонок (знесолювальних колонки РпутТір, смола 600 мкл, РнуМехив, кат. РОК 91-60-06), протікання через які відбувається під дією гравітації. - Колонки кондиціонували шляхом розміщення адаптера з 96 колонками в положенні для зливу відходів, додавши два рази по 450 мкл їх РВ5З (В.Вгашп), і дозволивши розчинам текти через колонки в відходи. - Після кондиціонування додавали 100 мкл зразка з обмінного планшета, виштовхуючи тим самим рештки РВ5 з колонок. - Після того як розчини пропускаються через колонки в відходи, адаптер з колонками поміщається на знесолювальний (або цільовий) планшет (96-комірковий круглодонний, Огеїпег). - Решту зразка з обмінного планшета додавали в колонки. - Після того як зразки пропускали через колонки в планшет для знесолення, в колонки додавали 225 мкл їх РВ5 (В.Вгапп), і зразок елюювали в планшет для знесолення. - 2-МЕА залишається всередині колонок. Там, де це доречно, колонки можна регенерувати, промиваючи їх РВ5З (В.Вганпп). - Планшети для знесолення зберігали в автоматичному інкубаторі Суїотаї 6001 (ТНегто
Зсієпійс) при 8 "С. Ці планшети тепер містять біспецифічні антитіла.
Кінцеві зразки біспецифічних антитіл фільтрували через тупикові фільтри 0,2 мкм і вимірювали при 280 нм (А280) оптичну щільність біспецифічних продуктів для визначення кінцевої концентрації. Зразки зберігали при 2-8"С протягом не менше 24 годин перед повторним застосуванням.
Ефективність обміну біспецифічних антитіл визначали кількісно, використовуючи високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) - хроматографію з гідрофобною взаємодією (НІС), використовуючи колонку з бутил-МРЕ, 2,5 мкм, 4,6х35 мм, НІС-НРІ С (Тозой Віозсіепсе) зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Батьківські антитіла і зразки для аналізу були нормалізовані за концентрацією і розбавлені в два рази НІС-елюентом А (15,4 мМ К»НРО», 9,6 мМ КнНеРо»х, 1,5 М (МНа) 2505; рН 7,0). 50 мкл зразка упорскували і проводили елюцію з 12-хвилинним градієнтом елюента НІС А до елюент НІС В (15,4 мМ КеНРО», 9,6 мМ КНегРО»х; рН 7,0) з детекцією при 280 нм. Як варіант, ВЕРХ, аналітична катіонообмінна хроматографія (СІЕХ), була використана для кількісної оцінки ефективності обміну біспецифічних антитіл. Батьківські антитіла і зразки для аналізу у концентрації 1 мг/мл в рухомій фазі А (10 мМ МаРо»х, рН 7,0) ін'єктували в ВЕРХ. По- різному заряджені молекули дО поділяли, використовуючи аналітичну колонку РгоРас МУСХ- 10,4 ммх250 мм, зі швидкістю потоку 1 мл/хв. 50 мкл зразка упорскували і проводили елюцію з градієнтом рухомої фази А (10 мМ МаРО»4, рН 7,0; приготували з 0,1 М запасу натрій- фосфатного буфера, який був отриманий шляхом додавання 10,3 г МагНРО»х 2НгО їі 5,07 г
МанНегРох на літр МіШі-О) до рухомої фази В (10 мМ МарРох, рН 7,0, 0,25 М Масі) з детекцією при 280 нм. Програмне забезпечення Етроуег З (УмМаїег5) використовувалося для призначення піків як батьківських антитіл або біспецифічних продуктів реакції і для інтеграції площ піків для кількісної оцінки перебігу реакції обміну біспецифічних антитіл. Продукти реакції біспецифічних антитіл додатково аналізували з використанням аналітичної ексклюзійної хроматографії, використовуючи колонку Т2К НР-5ЕС (300055УХІ; Тозоп Віозсіепсе5, через Отпіїаро, Бреда,
Нідерланди) і капілярного електрофорезу - з додецилсульфатом натрію (СЕ-505) з використанням І абсСпір СХІЇ (Саїїрег І Ме бсіепсе5, Массачусетс) на НТ Ргоївїп Ехргез5 І арспір (Саїїрег Це Зсіепсе5, Массачусетс) за відновлювальних і невідновлювалних умов відповідно до інструкцій виробника.
Приклад 4. Репортерний аналіз, що вимірює транс-активацію біспецифічними антитілами, які зв'язуються з СО40 і СО137.
С0р40 переважно експресується на антигенпрезентуючих клітинах (АРС), таких як дендритні клітини, тоді як СО137 переважно експресується на активованих Т-клітинах. Таким чином, біспецифічні антитіла, які зв'язуються з СО40 і СО137, можуть зв'язуватися одночасно з АРС і Т- клітинами, які експресують ці рецептори. Таким чином, ці біспецифічні антитіла можуть опосередковувати контакт клітина-клітина між АРС і Т-клітинами шляхом зв'язування і активації обох рецепторів. Ця активація рецепторів може бути індукована шляхом перехресного зшивання і кластеризації рецептора при взаємодії клітина-клітина і не обов'язково залежить від 60 агоністичної активності батьківських моноспецифічних двовалентних антитіл. Таким чином, ці транс-активуючі біспецифічні антитіла можуть проявляти костимулюючу активність в контексті взаємодій між АРС і Т-клітинами.
Для вимірювання активації кожного рецептора біспецифічними антитілами була створена система репортерного аналізу. Транскрипційна репортерна клітинна лінія МЕ-кВ/293/5ЕР-Ї ис тм (бБузіет Віозсіепсев5; кат. Мо ТК8бОА-1) є репортерною клітинною лінією, призначеною для моніторингу шляху передачі сигналу МЕ-кВ іп мйго. Активація шляху МЕ-кВ може контролюватися шляхом виявлення флуоресценції зеленого флуоресцентного білка (СЕР), а також активності люциферази для кількісних репортерних аналізів активації транскрипції.
Клітини МЕ-кВ/293/5ЕР-І цс стабільно трансдукували експресувальними векторами, які кодують повнорозмірний людський СО40 або СО137 нижче від конститутивно активного промотора людського фактора елонгації-1 альфа (ЕЕ-1 альфа), з використанням реагенту для трансфекції
Тгап5ІТФ-ІТ1, Мігиз Віо (МУУК Іпіегпайопа!Ї, кат. Мо 7731-0029), відповідно до інструкцій виробника. Стабільні клони відбирали з використанням 10 мг/мл бластидіну (Іпулімодеп, кат. Мо апі-БІ-1). Крім того, клітини К562 стабільно трансдукували, як описано вище, людськими СО40 і
С0137 для генерації клітинних ліній, які можуть забезпечити відповідний цільовий антиген для іншого плеча біспецифічного антитіла. Експресію рецепторів на клітинній поверхні вимірювали способом проточної цитометрії. 0,3х109 клітин центрифугували (460 мкг, 5 хв.) і промивали в буфері РГАС5 (0О-РВ5 з додаванням 5 мМ ЕОТА |Зідта Аїагісп, кат. Мо 03690) і 5 95 (об./об.) ембріональної бичачої сироватки (ЕВ5, Віоспгот, кат. Мо. 5 01151) (460 мкг, 5 хв.). 50 мкл розбавленого 1:50 розведеного алофікоцианін-міченого (АРС) антитіла проти СО40 людини (ВО
Віозсіепсе5, клон 5С3, кат. Мо 555591) або фікоеритрин-міченого (РЕ) антитіла проти СО137 людини (ВО Віозсіепсез, клон 484-1, кат. Мо 555956) додавали до осаду клітин та інкубували при 4"С в темряві протягом 20 хвилин. Після триразового промивання буфером ЕБАС5 клітини ресуспендували в 100 мкл буфера ЕБАС5 і зв'язування антитіл визначали за допомогою проточної цитометрії на ЕАС5Сапіо ІІ (ВО Віозсіепсевз). Була добре показана експресія клітинної поверхні СО40 ії СО137 на трансдукованих клітинах МЕ -кВ/293/СЕР-І ис (Фігура 6А) та клітинах
К562 (Фігура 6В).
Репортерний аналіз, який вимірює транс-активацію, був налаштований таким чином: клітини
МЕ-кВ/293/5ЕР-Г ис, які експресують один з двох зазначених рецепторів ТМЕ, висівали у кількості 10000 клітин/комірку в 30 мкл середовища КРМІ 1640 з добавкою сСішамАХ (іге
ТесПппоіодієз, кат. Мо 61870) в білих непрозорих 384-комірковий планшетах для культивування клітин (РегкіпЕІтег, кат. Мо. 6007680). Біспецифічні антитіла, які зв'язуються одним плечем з
С040, а іншим плечем з СО137 і відповідні моноспецифічні, моновалентні (такі, що містять одне нерелевантне контрольне плече |Б12|) контрольні антитіла додавали в 10 мкл/комірку до репортерних клітин в серійних розведеннях (в середовищі), в діапазоні від 0,078 мкг/мл до кінцевої концентрації 10 мкг/мл, включаючи контроль буфера. 17000 клітин К5б62, які експресують другий рецептор ТМЕ або клітини К562 (К562 м/) дикого типу, додавали в 10 мкл середовища в кожну комірку та інкубували при 37 "С ії 5 95 СО» протягом 18 годин. Таким чином, біспецифічні антитіла здатні зв'язуватися з першим рецептором ТМЕ на клітинній лінії МЕ- кВ/293/5ЕР-Гис і, в той же час, з другим рецептором ТМЕ на клітинній лінії К5б62. Тільки активація рецептора першого рецептора ТМЕ на клітинах МЕ-кВ/293/5ЕР-І ис вимірюється за активністю люциферази, індукованої при передачі сигналів МЕ-кВ. Таким чином, біспецифічні антитіла, націлені на СО40 ії СО137, аналізували двома репортерними аналізами: перший аналіз, що вимірює активацію СО137, індуковану одночасним скріпленням СО137 на репортерній клітинній лінії і СО40 на клітинах К5б2 (НЕК293 МЕК СО137 дір Іс ж
К5О62 С040), і другий аналіз, який вимірює активацію СО40, індуковану одночасним скріпленням
СО040 на репортерні клітинній лінії і СО137 на клітинах К5б2 (НЕК293 МЕК СО40 дір Іс їз
К562 СО137). Активність люциферази вимірювали в одиницях відносної люмінесценції на планшеті Епмізіоп (РегкіпЕІтег) після додавання 50 мкл/комірку реагенту З(еаду-сСІоФ (Рготеда; кат. Мо. Е2520), відновленому в буфері Сіо І узіз Вимег (Рготеда; кат. Мо. Е26бА) та інкубації за кімнатної температури протягом 30 хв.
Тільки біспецифічні антитіла проти СО40хСО137 (Фігура 7 АГ, нижні панелі, перший і третій графік) індукували активність люциферази (в концентраціях близько 100 нг/мл і вище) в клітинах
МЕ-кВ/293/БЕР-І ис, трансдукованих або СО137, або СО40, за умов транс-активації (інкубація з
К562-0040 або К562-С0137, відповідно). Жодне з моноспецифічних моновалентних (містять одне нерелевантне контрольне плече ІБ12|) контрольних антитіл не індукувало активність люциферази в трансдукованих клітинах МЕ-кВ/293/5ЕР-І ис (верхні панелі). Крім того, за відсутності умов трансактивації (з використанням клітин К562 дикого типу) біспецифічні антитіла проти С040хСО0137 НЕ індукували люциферазну активність (нижні панелі, друга і четверта 60 панелі).
Приклад 5. Неантигенспецифічний аналіз проліферації Т-клітин для вимірювання трансактивації біспецифічними антитілами, які зв'язуються з СО40 і СО137
Для вимірювання неантигенспецифічної проліферації Т-клітини в популяції мононуклеарних клітин периферійної крові (РВМС) інкубували з субоптимальною концентрацією антитіла проти
СОЗ (клон ОСНТІ) в поєднанні з біспецифічними або контрольними антитілами СО40хСО137. У цій популяції РВМС антиген-презентуючі клітини, які експресують СО40, можуть бути пов'язані з
СОр40-специфічним плечем біспецифічного антитіла, тоді як Т-клітини в популяції можуть бути пов'язані з СО137-специфічним плечем. Транс-активація Т-клітин, індукована перехресним зв'язуванням з антиген-презентуючими клітинами через біспецифічне антитіло, вимірюється як проліферація Т-клітин.
РВМС були отримані з лейкоцитарних плівок здорових донорів (Тгапвіи5іоп5о2епіга!є,
Університетська клініка, Майнц, Німеччина) з використанням градієнта фіколу (ММУК, кат. 17- 5446-02). РВМС були помічені з використанням 1,6 мкМ сукцинімідилового ефіру карбоксірлуоресцеіну (СЕЗЕ) (Тегто Різпег, кат. С34564) в РВ5, відповідно до інструкції виробника. 75000 мічених СЕБЕ РВМС висіювали на комірку в 96-комірковий круглодонний планшет (Зідта Аїагісп, СІ 53799-50ЕА) і інкубували з субоптимальною концентрацією антитіла проти СОЗ (КО Зузіетв, клон ОСНТІ, кат. Мо. МАВТ1О0; 0,01-0, 1 мкг/мл (кінцева концентрація), яка була попередньо визначена для кожного донора і біспецифічних або контрольних антитіл, в 150 мкл ІМОМ СІшамАХ з додаванням 5 95 сироватки АВ людини, при 37 "С, 5 95 СО», на чотири дні. Проліферацію СО4 ї і СО8 ї- Т-клітин аналізували проточною цитометрією, власне, як описано вище. 30 мкл, які містять РЕ-міченого СО4-антитіла (ВО Віозсіепсе5, кат. Мо 555347; кінцеве розведення 1:80), РЕ-Су7-міченого СОва-антитіла (клон КРА-Т8, еВіозсіепсе, кат. Мо 25- 0088-41 ; кінцеве розведення 1:80) АРС-міченого СО56-антитіла (еВіозсіепсев5, кат. Мо 17-0567; кінцеве розведення 1:80) і 7-ААО (ВесКтап СошКег, кат. Мо. АО7704; кінцеве розведення 1:80) в буфері РГАС5 використовували для фарбування клітин і виключення з аналізу клітин-природних кілерів (СО56) і мертвих клітин (7-ААВ). Зразки вимірювали на ГАС5Сапіо ІІ (ВО Віозсіепсев).
Детальний аналіз проліферації Т-клітин на основі піків СЕЗЕ, що вказують на поділ клітин, був виконаний за допомогою програмного забезпечення Біомл)о 7.6.5. Розраховували середній процентний вміст Т-клітин, які пройшли поділ ( 95 клітин, що поділилися), і середня кількість поділів клітин, які пройшли поділ (індекс проліферації).
На Фігурі 8А показано, що тільки біспецифічні антитіла СО40хСО137 ефективно посилювали проліферацію СО8 я Т-клітин. Контрольні моноспецифічні моновалентні антитіла (612хС2040; р12хСО0137) і комбінація моноспецифічних моновалентних СО40 антитіл з моноспецифічними моновалентними СО137 антитілами (612хС0040 - р12хС0137) НЕ індукували більшої проліферації, ніж спостерігається в контролі (тільки слабо активовані РВМС, сі, м/о).
Гістограми проточної цитометрії для різних антитіл в різних концентраціях були кількісно визначені для демонстрації відсотка клітин, що поділилися (Фігура 8В) та індексу проліферації (Фігура 8С), як описано вище. Ці фігури показують, що тільки біспецифічні антитіла були здатні індукувати проліферацію клітин СО8 я з оптимумом від 0,04 до 0,2 мкг/мл.
Приклад 6. Антиген-специфічний аналіз проліферації СО8 ї- Т-клітин для вимірювання транс-активації біспецифічними антитілами, які зв'язуються з СО40 і СО137.
Щоб виміряти індукцію проліферації біспецифічними антитілами в антигенспецифічну аналізі, дендритні клітини (ОС) були трансфіковані іп мйго-транскрибованою РНК (ІМТ-РНК)
Клаудин 6 для експресії антигену Клаудин 6. Т-клітини трансфіковані Клаудин-6-специфічним
НІГА-Аг2-рестриктованим Т- клітинним рецептором (ТОК). Цей ТОК може розпізнавати епітоп
Клаудин-б, представлений в НІГА-А?2 на ОС. Біспецифічне антитілл СО40хС0137 може поперечно зшивати СО40 на дендритній клітині і 60137 на Т-клітині, приводячи до активації ОС і костимулюючого сигналу для Т-клітини, що призводить до проліферації Т-клітин.
НГ А-А2 ї РВМС були отримані від здорових донорів (Тгапеизіоп52епігаІє, Університетська клініка, Майнц, Німеччина). Моноцити виділяли з РВМС методом магнітно-активованого сортування клітин (МАС5) з використанням анти-СО14 мікрогранул (Мінепуї; кат. Мо 130-050- 201) відповідно до інструкцій виробника. Лімфоцити периферійної крові (РВІ, СО14-негативна фракція) були заморожені для майбутнього виділення Т-клітин. Для диференціації в незрілі ОС (ОС) культивували 1х1095 моноцитів/мл в ЕРМІ СішамАХ (Гіїє Тесппоіодіеє СтрЬН, Мо 61870- 044), що містить 5 95 сироватки АВ людини (5ідта-Аїагіспй Спетіе СтьН, кат. Мо Н4522-100МІ), піруват натрію (Ііїе (есппоіодіеє СтрН, кат. Мо 11360- 039), незамінні амінокислоти (ШіТе
ІесппоІодіез СтбрН, кат. Мо 11140-035), 100 МО/мл пеніциліну-стрептоміцину (Сіте Тесппоіодіе5
СІтрбН, кат. Мо 15140-122), 1000 МО/мл гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора (СМ- С5Е; Мікепуї, кат. Мо 130- 093-868) і 1000 МО/мл інтерлейкіну 4 (ІІ -4; МікКепуї, кат. 60 Мо 130-093-924), протягом п'яти днів. Один раз протягом цих п'яти днів половину середовища замінювали свіжим середовищем. ОС отримували збором неадгерентних клітин; адгерентні клітини відокремлювали інкубацією з РВ5, що містить 2 мМ ЕОТА, протягом 10 хвилин при 37 "С. Після відмивання ОС заморожували в КЕРМІ СішамАХ, що містить 10 95 об./о0б6. ОМБО (АрріїСпет СтрН, кат. Ме АЗ672,0050) і 50 95 об./0б. людської сироватки АВ для майбутніх антигенспецифічних аналізів Т-клітин.
За один день до початку аналізу Т-клітин розморожували заморожені РВІ іс від того ж донора. РВІ використовували для виділення СО8 - Т-клітин за технологією МАС5 з використанням анти-СО8 мікрогранул (МіМКепуі, кат. Мо 130-045-201), відповідно до інструкцій виробника. Близько 10-15х10 6 208 -- Т-клітин електропорували з 10 мкг ІМТ-РНК, яка кодує альфа-ланцюг, плюс 10 мкг ІМТ-РНК, яка кодує бета-ланцюг Клаудин-б-специфічного мишачого
ТОВ (НІ А-Аг-рестриктований, описаний в УМО 2015150327 А1) в 250 мкл Х-Мімо15 (Віогут
Зсіепійс ЗтрнН, кат. Мо 8,81026) в кюветі для електропорації діаметром 4 мм (МУК Іпіегпайіопаї!
СІтбН, кат. Мо 732- 0023) з використанням пристрою системи електропорації ВТХ ЕСМФ 830 (ВТХ; 500 В, 1 х З мс імпульс). Відразу після електропорації клітини переносили в свіже середовище ІМОМ (Шіте ТесппоЇодіез ОтбН, кат. Мо 12440-061) з додаванням 5 95 сироватки АВ людини і залишали при 37 "С, 5 956 СбО2 протягом, щонайменше, 1 години. Т-клітини мітили з використанням 1,6 мкМ сукциніміділового ефіру карбоксіфлуоресцеїну (СЕЗЕ; Іпийгодеп, кат. Мо
С34564) в РВ5, відповідно до інструкцій виробника, і інкубували в середовищі ІМОМ з додаванням 5 95 сироватки АВ людини, протягом ночі.
До 5х109 розморожених іс електропорували з 0,4-5 мкг ІМТ-РНК, що кодує повнорозмірний
Клаудин-б (Опіргої Р5Об7У47), в 250 мкл середовища Х-Мімо15, використовуючи систему електропорації, як описано вище (300 В, 1х12 мс імпульс) і інкубували в середовищі ІМОМ з додаванням 5 95 сироватки АВ людини, протягом ночі.
На наступний день клітини збирали. Експресію Клаудин-6 на клітинній поверхні ОС і ТОК на
Т-клітинах перевіряли за допомогою проточної цитометрії Для цього ОС фарбували кон'югованим з АІехаб47 антитілом, специфічним до СІ ОМб (комерційно недоступне; власне виробництво), а Т-клітини фарбували антитілом проти б-ланцюга ТОК миші (Весіоп ОісКкіпзоп
СтрН, кат. Мо 553174). 5000 електропорованих ОС інкубували з 50000 електропорованимі міченими СЕБЕ Т-клітинами в присутності біспецифічних або контрольних антитіл в ІМОМ сішамАХ (Ше ТесПппоїодієв, кат. Мо 12440-061) з додаванням 5 95 людської сироватки АВ в 96- комірковому круглодонному планшеті. Проліферацію Т-клітин вимірювали через 5 днів з допомогою проточної цитометрії. Детальний аналіз проліферації Т-клітин на основі піків СЕЗЕ, які вказують на поділ клітин, був виконаний за допомогою програмного забезпечення ЕІомл)о 7.8.5. Розраховували середній процентний вміст Т-клітин, які пройшли поділ ( 96 виділених клітин), і середню кількість поділів клітин, які пройшли поділ (індекс проліферації).
На Фігурі 9А показано, що тільки біспецифічні антитіла до СО40хСО0137 ефективно посилювали проліферацію Т-клітин СО8 ж. Контрольні моноспецифічної моновалентні антитіла (б12х0040; рІ2х00137) і комбінація моноспецифічних моновалентних СО40 з моноспецифічними моновалентною антитілами СО137 (512х2040 ї- Б12хС0137) НЕ індукували більшою проліферації, ніж це спостерігалося в контролі (тільки слабо активовані РВМС, контрольні, без активації). Те ж саме відбивається і на відсотку клітин, що поділилися (Фігура 98) і дуже чітко видно з індексу проліферації (Фігура 9С). На Фігурі 90 показано, що індукція антиген-специфічної проліферації біспецифічними антитілами СО40хСО0137 залежала від концентрації, при цьому оптимум становив близько 0,1 мкг/мл в цьому аналізі.
Приклад 7. Гуманізація мишачих і кролячих антитіл
Послідовності гуманізованих антитіл з антитіл мишачих анти-СО40-001 і кролячих анти-
СО0137-009 були отримані в Апійоре (Кембридж, Великобританія). Послідовності гуманізованих антитіл були отримані з використанням технології гуманізації зародкової лінії (СОК-щеплення).
Гени гуманізованної М-області були сконструйовані на основі послідовностей зародкової лінії людини, найбільш близьких до амінокислотних послідовностей МУН і Мк антитіл миші і кролика.
Для кожного з батьківських антитіл, відмінних від людини, конструювали серію генів зародкових гуманізованих М-областей від чотирьох до шести МН і чотирьох або п'яти Мк (М). Структурні моделі М-областей нелюдського батьківського антитіла були отримані з використанням Зм/55
РОВ і проаналізовані для виявлення амінокислот в каркасах М-області, які можуть бути важливі для властивостей зв'язування антитіла. Ці амінокислоти були відзначені для включення в одне або кілька варіантів СОК-прищеплених антитіл. Найбільш близькі збігаються послідовності зародкової лінії, що використовуються як основи для гуманізованих дизайнів, показані в таблиці
З.
Таблиця З
Найбільш близькі послідовності М-сегмента і .)-сегмента зародкової лінії людини. он Гео фени У ей антитіло . . сегмент У- сегмент .)-області сегмент У- сегмент .)-області області людини людини області людини людини
Мишаче анти- я я
Кроляче анти- ж ж
Варіантні послідовності з найменшою частотою виникнення потенційних Т-клітинних епітопів потім відбирали з використанням власних технологій Апійоре іп віїсо, ІГоре "м ії ТСЕО "м (база даних Т-клітинних епітопів) (Ре!ту, І СА, Хдопез, ТО апа ВаКег, МР Мем Арргоаснез (о Ргедісійоп ої
Іттипе Незропзев їо ГПнегарешіс Ргоївїп5 дигіпуд Ргесіїпіса! ОемеІортепі (2008). Огидзв іп НО 9 (6): 385-396; 20; Вгузоп, С), допе5, ТО апа ВакКег, МР Ргеєаїсійоп ої Іттиподепісіїу ої Тнегарешіс
Ргоївіїпе (2010). Віодтд5 24 (1): 1-8). Нарешті, нуклеотидні послідовності сконструйованих варіантів були оптимізовані за кодонами для експресії в клітинах людини.
Послідовності варіабельної області гуманізованих антитіл проти СО40 ії СО137 показані в списку послідовностей і в таблиці 1 вище.
Приклад 8. Експресовані конструкції для антитіл, транзиторна експресія та очистка
Для експресії антитіл послідовності УН і МІ. клонували в експресуючих векторах (рсомМАЗ.3), що містять у випадку МН, релевантну константну область важкого ланцюга (НС), в деяких випадках містить мутацію Е405І або К409К і/або І234Р. 1І235Е і 0265А і, в разі МІ, області легкого ланцюга (І С). Антитіла були експресовані у вигляді Їдс1, к. Суміші плазмідної ДНК, які кодують як важкі, так і легкі ланцюги антитіл, були транзиторно трансфіковані в клітини
Ехрі293Е (Ше ІесппоЇодіех, США) з використанням 293Гесіїп (Ге (есппоіодіе5), власне, як описано МіпК еї аїЇ. (МіпкК еї аЇ., Мейо», 65 (1), 5-10 2014 року). Потім антитіла очищали хроматографією з іммобілізованим протеїном б.
Приклад 9. Неспецифічний аналіз проліферації Т-клітин для перевірки функціональності зв'язування гуманізовані біспецифічного антитіла з СО40 ії СО137.
Щоб виміряти функціональність зв'язування гуманізовані біспецифічного антитіла з СО40 і
СО0137, був проведений антиген-неспецифічний аналіз проліферації Т-клітин, як описано вище.
Якщо коротко, РВМС одного донора мітили СЕЗЕ і інкубували з субоптимальною концентрацією антитіла проти СОЗ (клон ОСНТІ; 0,01 мкг/мл, як визначено для цього донора) і 0,008, 0,04,0,2 або 1 мкг/мл гуманізованого біспецифічного антитіла СО40хС0О137, батьківського біспецифічного антитіла або контрольного антитіла Ідс1.
Проліферацію СО8 я Т-клітин аналізували проточною цитометрією, власне, як описано вище. Детальний аналіз проліферації Т-клітин на основі піків СЕБЕ, що вказують на поділ клітин, був виконаний за допомогою програмного забезпечення Біом.о 7.6.5. Розраховували середній процентний вміст Т-клітин, які пройшли поділ ( 95 виділених клітин), і середню кількість поділів клітин, які пройшли поділ (індекс проліферації).
На Фігурі 10 показано, що гуманізоване біспецифічне антитілло СО40хСО137 (Віз01-2040- 001-НОбІ С1-РЕАЇ хСО137-009-НС7І С2-РЕЕАК) ефективно посилювало проліферацію СО8 кт Т- клітин. Гуманізоване біспецифічне антитіло збільшувало як процентне співвідношення виділених клітин, так і середню кількість поділів СО8 жї клітин. Ефективність гуманізованого біспецифічного антитіла була порівнянна з ефективністю батьківського біспецифічного антитіла (б040-001х00137-009).
Приклад 10. Антигенспецифічний аналіз проліферації Т-клітин СО8 ж- для перевірки функціональності зв'язування гуманізованого біспецифічного антитіла з СО40 і СО137.
Щоб виміряти функціональність зв'язування гуманізованого біспецифічного антитіла з СО40 і СО0137, проводили антигенспецифічний аналіз проліферації СО8 я Т-клітин, як описано вище.
Коротко кажучи, мічені СЕБЕ СООМ «з Т-клітини, трансфіковані СІ ОМ6-ТСК, інкубували з РНК - електропорацією ОС СІОМб в присутності гуманізованого СО40хСО137 біспецифічного антитіла, батьківського антитіла або контрольного антитіла Ідс1. Проліферацію Т-клітин вимірювали способом проточної цитометрії через 4 дні. Детальний аналіз проліферації Т-клітин на основі піків СЕ5Е, що вказують на поділ клітин, був виконаний за допомогою програмного забезпечення Еіомліо 7.6.5. Розраховували середнє процентний вміст Т-клітин, які пройшли поділ ( 96 поділилися клітин), і середню кількість поділів клітин, які пройшли поділ (індекс проліферації).
На Фігурі 11 показано, що гуманізоване біспецифічне антитілло СО40хСО137 (Віз01-2040- 001-НбІ С1-РЕАЇГ хСО137-009-НС7І С2-РЕЕАК) ефективно посилювало проліферацію СО8 т Т- клітин. Ефективність гуманізованого біспецифічного антитіла була порівнянна з ефективністю батьківського біспецифічного антитіла (С040-001х20137-009). У цьому аналізі як гуманізоване, так і батьківське біспецифічне антитіло збільшували відсоток виділених клітин, а також індекс проліферації СО8 « клітин.
Приклад 11. Аналіз експансії ТІЇ ех мімо для оцінки впливу біспецифічних антитіл срабхоОр137 на лімфоцити, інфільтруючі пухлину.
Щоб оцінити вплив біспецифічного антитіла СО40хСО137 (Віз51-С040-001-ЕРЕА/С0137- 009-РЕАК) на лімфоцити, інфільтруючі пухлину (ТІЇ), ех мімо культуру пухлинної тканини людини проводили наступним чином. Резекції свіжої пухлинної тканини людини тричі промивали шляхом перенесення ізольованих шматків пухлини з однієї комірки, що містить середовище для промивання, з шестикоміркового планшета (Різпег Зсіепійс, кат. Мо 10110151) в наступну, використовуючи шпатель або серологічну піпетку. До складу середовища для промивання входили Х-МІМО 15 (Віогут, кат. Мо 881024) з додаванням 1 95 Реп/5ігер (Пепто
ЕізПег, кат. Мо 15140-122) і 1 95 фунгізону (Тегто Різпег, кат. Мо. 15290-026) . Потім пухлину розрізали хірургічним ножем (Вгайп/Коїйй, кат. Мо. 5518091 (ВА223) і нарізали на шматки пухлини діаметром близько 1-2 мм. Два шматки кожної вносили в одну комірку 24-коміркового планшета (МК іпіегпайопаї, кат. Мо 70160), яка містить 1 мл середовища ТІЇ (Х-МІМО 15, 10 95 альбумін сироватки людини (НЗА, С5І Вепйгіпд, кат. Мо РАМ-6446518), 1 95 Реп/сігер, 1 95 Еипді2опе і 1-2 (РгоїеиКкіп?б5, Момапіз РНагпта, кат. Мо 02238131) у зазначеній концентрації. Зв'язування біспецифічного антитіла з СО40 і СО137 додавали в зазначених кінцевих концентраціях.
Культуральні планшети інкубували при 37 "С і 5 95 СО» протягом 72 годин, і в кожну комірку додавали 1 мл свіжого середовища ТІЇ, яке містить зазначену концентрацію ІІ -2 і зазначену концентрацію біспецифічного антитіла. Комірки контролювали на наявність кластерів ТІЇ за допомогою мікроскопа І еіса ОМі1, оснащеного 5,0-мегапіксельною камерою, раз на два дні.
Комірки були індивідуально розділені і було виявлено понад 25 мікрокластерів ТІЇ. Для поділу культур ТІЇ. клітини ресуспендували і переносили в комірку б6-коміркового планшета і додавали ще 2 мл середовища ТІЇ.
Після загального періоду культивування 10-14 днів ТІЇ. збирали і аналізували проточною цитометрією. Для здійснення кількісного порівняння різних груп обробки, клітинний осад ресуспендували після останньої стадії промивання ЕБАС5З-буфером, доповненим ВО тм
СотрВеайдз (ВО бріозсіепсеб5, кат. Мо. 51-90-9001291). Проточний цитометричний аналіз проводили на проточному цитометрі ВО РАСб5Сапіо "м || (Весіоп ОісКіпзоп), а отримані дані аналізували з використанням програмного забезпечення РіІом.до 7.6.5. Відносну кількість життєздатних ТІЇ. (7-ААЮО-негативних клітин) на 1000 гранул розраховували для кожної комірки.
На Фігурі 12 показаний аналіз експансії ТІЇ. з тканини меланоми людини. в даному документі 100 од/мл ІІ -2 використовували як добавки для середовища ТІЇ. Крім того, були додані наступні концентрації біспецифічного антитіла, яке зв'язується з СО40 ії СО137 (Віз61-С040-001-
ЕЕАГ/СО137-009-РЕАК): 0,016, 0,08, 0,4, 2,0 і 10,0 мкг/мл; комірки без додавання антитіл відігравали роль негативного контролю. Після 14 днів культивування ТІЇ. збирали і аналізували проточною цитометрією Було виміряно п'ять зразків для кожної концентрації антитіл, отриманих з різних комірок 24-коміркового планшета. У всіх зразках, культивованих з біспецифічним антитілом, що зв'язуються з СО40 і СО137, кількість життєздатних ТІЇ було значно збільшена порівняно з контрольними зразками без антитіл. В цілому, спостерігалося приблизно 100-разове збільшення середньої відносної кількості життєздатних ТІЇ. (Фігура 12).
Фігура 13 показує аналіз експансії ТІЇ. з тканини недрібноклітинного раку легенів (МЗСІ С). В даному документі 10 од./мл ІЇ-2 використовували як добавку для середовища ТІЇ. Крім того, вводили такі кінцеві концентрації біспецифічного антитіла, яке зв'язується з СО40 і С0137 (Віха1-С2040-001-ЕЕАГ/С01.37-009-ЕЕАК): 0,01, 0,1 ї 1,0 мкг/мл; комірки без додавання антитіл відігравали роль негативного контролю. Після 10 днів культивування ТІЇ. збирали і аналізували проточною цитометрією. Було виміряно п'ять зразків для кожної концентрації антитіл, отриманих з різних комірок 24-коміркового планшета. У всіх зразках, культивованих з біспецифічним антитілом, яке зв'язуються з СО40 і СО137, кількість життєздатних ТІЇ. була значно збільшена порівняно з контрольними зразками без антитіл. В цілому, збільшення середньої відносної кількості життєздатних ТІЇ. до 10 разів спостерігалося при 0,1 або 1 мкг/мл 60 (Фігура 13).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Септаб дА/5 «120» МУЛЬТИСПЕЦИФІЧНІ АНТИТІЛА ПРОТИ С0О40 І С0137 «1305 Р/0101-МО «1605» 136 «1705 Патентна версія 3.5 «2105» 1 «211». 8 «212» РЕТ «2135 Ми5 МизсиЇи5 (Миша хатня) «4005 1 сі1у Туг ТИг Ре ТНг сЇи Туг Пе 1 5 «2105» 2 «211». 8 «212» РЕТ «2135 Ми5 МизсиЇи5 (Миша хатня) «4005» 12
ІІе ІЇе Рго А5п А5зп сіу СсСІу ТНг 1 5 «210» 3 «211» 15 «212» РЕТ «2135 Ми5 МизсиЇи5 (Миша хатня) «400» 3
ТиИг Агу9 Агод сіи ма! Туг с1у Агуд Азп Туг Туг АЇа Гей Азр Туг 1 5 10 15 «210». 4 «2115» 56 «212» РЕТ «2135 Ми5 МизсиЇи5 (Миша хатня) «400» 4 сіп сІ1у Іїе Ап А5п Туг 1 5 «210». 5 «211». 9 «212» РЕТ «2135 Ми5 МизсиЇи5 (Миша хатня) «400» 5 бо сіп сіп Туг бег А5п Гей Рго Туг Тиг 1 5
«2105 Ь6 «2115 122 «212» РЕТ «2135 Ми5 МизсиЇи5 (Миша хатня) «400» 6 сіи ма! сіп Гей сіп сіп бек с1іу Рго А5р Гей ма! Гуз Рго су АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ІІе 5ег Суб Гуз ТИг бек сіу Туг ТНг РНе ТНг сіи Ттуг 20 25 30 че Мес ні5 Тер ма! Гуз сіп 5ег Ні с1у Гу5 5ег ей сі Тгр Пе 35 40 45 сСіу сСІЇу ІчІЇе Іїе Рго Абзп Ап сіу сіу Тиг б5ег Туг Азп сіп Гуз РБНе 50 55 бо їу5 Азр Гуз АЇа Тис Мет Тиг ма! Азр Гу5 бег бег 5ег Тиг с1у туг 65 70 75 80 мес сіи Ге Агуд бег о їеи ТНг об5ег сій Азр 5ег АіЇа ма! Туг Туг сСузв 85 90 95
ТИг Агу9 Ага сі ма! Туг С1у Агу Азп Туг Туг АЇа Гей Азр Туг Тгр 100 105 110 сіу сіп с1іу ТйгогГеи ма! Тис ма! 5ег 5ег 115 120 «2105 7 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Ми5 МизсиЇи5 (Миша хатня) «4005 7
Азр че сіп Меє ТПг о сіп Тиг о Ттг о б5ег б5ег геу б5ег АЇа б5ег Ге с1у 44 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тиг ІІе Тиг Су5 5ег Аїа 5ег сіп сіу ІЇе Азп Азп Туг 20 25 30
Те Азп Тгр Туг сп сіп Гуз Рго Азр сІіу Тиг маїЇ Гуз Гец Геи Пе 35 40 45 туг Туг ТНг б5ег б5ег Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агдуд Ре 5ег СОс1У бо 50 5зег сіу б5ег сіу ТиИг Азр Туг бег Ге ТНг ІїІе 5ег Азп Гей си Рго 65 70 75 80 сій Азр ІчІІе Аїа ТиИг Туг Туг Суз сіп сіп Туг 5ег Азп Гец Рго Туг 55 85 90 95
ТиИг РнНе СсСІіу сіу СІіУу ТНг Гуз Гей си ІїЇе Гуз 100 105 60 «210» 8 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий)
«400» 8
Сс1У Рпе 5ег Гей 5ег 5ег Туг АїЇа 1 5 «210» 19 «2115 7 «212» РЕТ «2135 ОгустоЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 9 че Тер Азп доп сІу АЇїа ТЕГ 1 5 «210» 10 «2115 14 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4А00» 10 діа Агд 5ег АЇа А5зп А5р Аіа Тгр 5ег Тиг Туг 5ег А5Зргеи 1 5 10 «210» 11 «2115 б «212» РЕТ «2135» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 11 сіп Тс Іе ТНг дп туг 1 5 «2105» 12 «2115 14 «212» РЕТ «2135» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 12 сіп Азп Туг Туг Туг с1у бег 5ег 5ег сіу Туг с1у РНе ма! 1 5 10 «210» 13 «2115 117 «212» РЕТ 00 «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 13 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу сЇу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг о Суз ТИг Ома! бек сіу РПе 5ег їец 5ег 5ег Туг АїЇа 20 25 30 60 ма!ї 5ег Тгр ма!Ї Аг9 сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сіЇу Ге сЇи Тер Пе Сс1У 35 40 45 ма! Ше Тер д5п доп сіу Аїа Тиг Ні5 Ттуг Аїа Тиг Тер АЇа Гуз с1у
50 55 60
Агу Рпе ТиПг ІІе 5ег їу5 Аїа бег Тиг о Ттиг ма! Азр Ге Гуз ма! тНг 65 70 75 80 5зег Рго ТиИг ТИг осі Азр Тиг Аїа Тиг оТуг Ре Су АїЇа Агд 5ег АїЇа 85 90 95
Ап А5р Аіа Тгр 5ег Тиг Туг 5ег Азр Ге Тгр сіу сіп сіу ТНиг Геи 100 105 110 ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 «2105» 14 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 14
Азр чІІе ма! Меє Тиск сіп Тиг Рго АїЇа 5ег ма! си АїЇа АїЇа маїЇ с1у 1 5 10 15 сІу Тиг ма! ТиИг ІІе Гуз Су5 сп Аїа б5ег сіп Тиг ІІе Тиг Азп тТуг 20 25 30 їеи бег Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Рго Рго Гуз еп їеи ІЇе 35 40 45 тТуг Гуз АЇїа бег ТНг Ге ТиИг о бег сіу ма!Ї 5ег 5ег Агд РНе Гуз Сс1У 50 55 60 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг ІїЇе 5ег Азр Гей си 5ег 565 70 75 80
Азр Азр діа Аіа ТиИг Туг Туг Суз сіп Азп Туг Туг Туг сіу 5ег 5ег 85 90 95 бег сіу Туг сіу Ре ма! Рбе сіу сіу сіу Тиг сіи ма! ма! маї Гуз 100 105 110 «210» 15 «2115 8 «2125» РЕТ 2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 15 сіу Рпе бег Геу Тиг Ттуг Туг АїЇа 1 5 «210» 16 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 16 60 ІЇе Туг Азр Азп сІу АЇа ТНг 1 5 «2105» 17
«2115 14 «212» РЕТ 2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 17 діа Агд 5ег АіЇа А5зп А5п діа Тгр б5ег ТиИг Туг 5ег А5ЗПп 'Геи 1 5 10 «210» 18 «2115 б «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 18 сі Азр ІЇе 5ег 5ег Туг 1 5 «210» 19 «2115 14 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 19 сіп бег Туг Туг 5ег с1у бек ІІе 5ег сіу Туг с1у РНе ма! 1 5 10 «210» (20 «2115 117 «212» РЕТ 2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» (20 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу сЇіу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу ТиИг Рго 1 5 10 15
Ге Тийг Ге ТиИг о Суз Тиг Ома! бег с1у Рпе 5ег Ге ТНиг Туг Туг Аїа 20 25 30 ма! Тиг Тер маїЇ Агу сіп Рго Рго сІу Гуз СІу Ге сім Тер Іе с1у 35 40 45 ма! те Туг дА5р Азп сіу Аїа Тйг АЇа Рібе АЇа ТНг Тер Аїа Гуз с1у 60
Агу Рпе ТиПг о Меї б5ег уз Азп 5ег ТИг о Тиг ма! Аїа ге Гуз ма! тЕг 50 65 70 75 80 5зег Рго ТиИг ТИг осі Азр Тиг Аїа Тиг оТуг Ре Су АїЇа Агд 5ег АїЇа 85 90 95 55 А5п А5п АЇа Тер бег ТиИг Туг 5ег Азп Геу Тгр с1Їу сіп с1у ТНг Ге 100 105 110 ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 бо «210» 21 «2115 112 «212» РЕТ
«2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 21
Азр ІчІІе ма! меє Тйг о сіп ТНг Рго 5ег 5ег ма! 5ег АїЇа АїЇа ма! с1у 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Азп Су5 сіп АЇїа б5ег сій А5зр ІчІІе 5ег 5ег Туг 20 25 30
Іїеи бег Тгр Туг сп сіп Гуз Гей су сіп Рго Рго Гуз Гей їеи Пе 35 40 45 тТуг Гуз АЇїа бег ТИг Ге сі бег сіу ма! Рго 5ег Аг4д РНе Гуз С1У 50 55 60 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Туг ТНг Ге ТНг Іїе 5ег Азр Гей си 5ег 65 70 75 80
Ар Азр АЇа Аіа Тиг о туг Туг Суз сп 5ег Туг Туг 5ег о1у бек Пе 85 90 95 5зег сіу Туг сіу Ре ма! Ре сіу сіу сіу Тиг сІіу ма! ма! маї Гуз 100 105 110 «2105» 22 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 22 сС1у Ре Тиг ІІе 5ег 5ег Туг НІ5 1 5 «210» 23 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А0О0» 23 чІІе туг сіу сіу ТНг Аїа Тиг тНг 1 5 «210» 24 «2115 17 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 24 діа Агд Аіа Агуд Туг б5ег сіу сіу б5ег Туг АЇїа Азп Туг ма! РНе Азп 1 5 10 15
Гей «210». 25 «2115 б 60 «2125 РТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 25 сіп б5ег ІЇе 5ег 5ег Туг 1 5 «210» 26 «2115 14 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 26 сіп сіу Туг Азр Тгр бег 5ег 5ег Азп Агу Туг Азр Азп ОТГ 1 5 10 «2105» 27 «2115 121 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 27 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу сЇу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Ге ТК Гей Тиг оСуз ТИг Аїа 5ег сіу Ре ТиПг Іїе 5ег 5ег Туг НІі5 20 25 30 мес те Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сІЇу сім сІу Гей сіЇи Ттр Пе сі1у 35 40 45
А5р че Туг сіу сіу Тийг Аїа Тиг Тиг Азр Туг АїЇа 5ег Тгр Аїа Гуз 50 55 60 сСІ1Уу Аг Рпе ТиПг ІЇе 5ег Гуз ТИг об5ег Тиг Тиг ма! Азр гей Гуз Меє 565 70 75 80
Тиг о бек огГеу Тиг о Тиг сій Азр Тс Аїа Тис о Туг Рпе Суз АїЇа Агд АїЇа 85 90 95
Агд Туг бег сіу сіу бег Туг АЇїа Азп Туг ма! Рпе Азп Геу Тгр су 100 105 110 сіп су ТНгогГеи ма! Тис ма! 5егк 5ег 115 120 «210». 28 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А0О0» 28
Азр чІІе ма! Меє Тиск сіп Тиг Рго АїЇа 5ег ма! си АїЇа АїЇа маїЇ с1у 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Гуз Суз сіп АЇа б5ег сіп 5ег ІІе 5ег 5ег Туг 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Рго Рго Гуз еп їеи ІЇе 60 35 40 45 тТуг Агуд ТиИг о бег ТиИг о Ге сі бег сіу ма! Рго 5ег Аг4д РНе Гуз С1У 50 55 60
5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг ІїЇе 5ег Азр Гей си 5ег 65 70 75 80
АїЇа Азр АЇа Аїа Тйг Ттуг Туг Су5 сіп сіу Туг Азр Тгр 5ег 5ег 5ег 85 90 95
Азп Ага Туг Азр Азп о ТИг Ре сіу сіу сіу ТиИг сіи ма! ма! маї Гуз 100 105 110 «210» 29 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А0О0» 29
Сс1Уу Ре 5ег Гей 5ег Агд Туг др 1 5 «210» 30 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 30
ІІе 5ег 5ег 5ег сіу су ТЕГ 1 5 «210» 31 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4А00» 31
Аа Агд сій сІу Азр Туг Тер Азр РНе Азвп Ге 1 5 10 «2105» 32 «2115 б «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 32 сп б5ег ІЇе 5ег Ап Ге 1 5 «210» 33 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 33
АЇа сіу сіу Рібе Рго сіу Ге Азр Тиг маї АїЇа Аїа 1 5 10 бо «210» 34 «2115 114 «212» РЕТ
2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 34 сп б5ег гей сій січ бек сіу сіу Агд Гей ма! Тиг о Рго сіу ТНг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг о Суз ТНг Аїа бек сіу РПе 5ег їец б5ег Агуд Туг дзхр 20 25 30
Мет 5ег Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Туг Пе с1у 35 40 45 ма! те 5ег 5ег 5ег сіу сіу ТНг Азп Туг АїЇа Азп Тгр АїЇа Гуз с1у 50 55 60
Агу Рпе ТиПг о ІІе 5ег Гуз ТИПг обег Тиг о тТиг о маї Азр Ге Гуз ІЇе тТНг 65 70 75 80 бег Рго ТиИг ТиИг сій Азр Тг Аїа Тис о Ттуг Рбе Суз АїЇа Агд сіи с1у 85 90 95
Азр Туг Тер Азр Ре Азп Ге Тгр сіу Рго сіу Тиг Геу ма! тТНг маї 100 105 110 5ег 5ег «210» 35 «2115 110 «2125 РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4005» 35
АЇа сіп ма! Ге Тис о сіп ТПг о Рго б5ег 5ег ма! 5ег АїЇа АЇа ма! сІу 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Азп Су5 сп АЇа 5ег сіп 5ег І|е 5ег Азп'геи 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Рго Рго Гуз еп їеи ІЇе 35 40 45
Туг с1у АЇїа бег ТНг Ге АЇїа бег сіу ма! Рго 5ег Агуд Рпе 5ег Сс1Уу 60 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг ІїЇе 5ег Азр Гей си 5ег 65 70 75 80 50 Ар Ар АЇа Аіа Тиг о Ттуг Туг Су5 Аїа сіу сІу Ре Рго с1Уу Гей дер 85 90 95
Тиг ма!Ї Аїа Аїа РНе сіу сіу сіу Тиг сі Аїа ма! ма! тТНг 100 105 110 55 «210» 36 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) бо «400» 36 сС1Уу Ре Тиг ІІе б5ег д5р РНе НІ15
1 5 «2105» 37 «2115 8 «2125» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 37
ІІе Те ТНг 5ег АЇа 5ег Тиг тТиг 1 5 «210» 38 «2115» 15 «2125 РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 38
АїЇа Ага бег ТиИг оТуг ТиИг Ар Тигобекг сіу Туг Туг Рпе Ар РНе 1 5 10 15 «210» 39 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 39 сіп б5ег ІїІе Туг Азп су Ап Ага 1 5 «210» 40 «2115 13 «2125» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 40
Те сіу бег Туг Азр Суб Ар 5ег АЇїа Азр Су РПпе АїЇа 1 5 10 «210» 41 «2115 119 «2125» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 41 сіп б5ег ма! сі сій бег сіу сіу Агуд Ге ма! Тис Рго с1Їу ТНИк Рго 1 5 10 15
Ге ТигоГеи Тк Су ТИг о АїТа бек сіу Рпе ТиИг ІІе 5ег А5зр Ре Ні 20 25 30 ма! Тиг Тер маїЇ Агу сіп Аїа Рго сІу Гуз СІу Ге сім Тер Іе с1у 35 40 45
Тиг ІЇе ІчІІе ТНг 5ег АїЇа 5ег ТНг ТНг АїЇа Туг АЇа Тиг Тгр Аїа Ага 60 50 55 60 сСІ1Уу Аг Рпе ТиПг ІЇе 5ег Гуз 5ег 5ег ТИг Тиг маїЇ Азп їеци Гуз Іе 65 70 75 80 ма! бек Рго ТиИг Типг сій Азр Тг о Аіа Тг оТуг Рбе Су5 АЇа Ага 5ег 85 90 95
Тис оТуг Тис Азр Тйгобег с1іу Туг Туг Рпе Азр Рпе Тгр су сіп с1У 100 105 110
Тиг Ге ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 «210» 42 «2115 113 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 42
АЇїа сіп ма! ге Тис о сіп ТиПг АЇїа 5ег Рго ма! 5ег АЇа АїЇа маїЇ с1у 1 5 10 15 сіу тТиг ма! ІІе Іїе Азп Су5 сіп 5ег 5ег сп 5ег Пе Туг Азп с1у 20 25 30
Ап Агд Гей 5ег Тгр Туг сіп сіп Гу5 Рго с1у сіп Рго Рго Гуз Геи 35 40 45 їеи ІІе Туг б5ег АЇа бек ТНг Гей АЇа б5ег сіу ма! 5ег 5ег Ага РНе 50 55 бо їу5 сіу бег сіу б5ег сіу ТПг сіп Рпе ТПг їГеу АЇа ІЇе 5ег А5зр маї 65 70 75 80 сіп б5ег Ад5р Азр АЇа АЇа Тиг о Туг Туг Суз Ге сіу 5ег Туг Азр сСуз 85 90 95
А5р 5ег АіЇа Азр Суз Рпе Аіа Ре сіу сіу сіу Тиг сі ма! маї маї 100 105 110 си «210» 43 «2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 43
Сс1У Ре 5ег Гей 5ег 5ег Туг АїЇа 1 5 «2105» 44 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 44
ІІе б5ег Тиг 5ег сіу Те ТЕГ 1 5 бо «210» 45 «2115» 15 «212» РЕТ
«2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 45
АЇїа Агуд Гей Азп сіу Ріпе Азр Азр Туг ма! Агуд Туг Ре Азр РПе 1 5 10 15 «210» 46 «2115 б «2125 РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 46 с бег ІїЇе Аіа 5ег А5зп 1 5 «210» 47 «2115 12 «2125» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 47 сіп 5ег АїЇа Рне Туг ма! 5ег 5ег 5ег Азр Азп АїЇа 1 5 10 «210» 48 «2115 118 «2125 РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 48 сіп б5ег ма! сі сій бег сіу сіу Агуд Ге ма! Тис Рго с1Їу ТНИк Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг о Суз ТИг Ома! бек сіу РПе 5ег їец 5ег 5ег Туг АїЇа 20 25 30
Мет 5ег Тгр ма! Агу сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Ттр Пе сі1у 35 40 45
ІІе ІІе 5ег ТНг 5ег сіу ІІе ТНг Туг Туг АЇа 5ег Тгр АїЇа Гуз С1У 60
Агу Рпе ТиПг о ІІе 5ег Гуз ТИПг обег ТиПг Меє маїЇ Азр ге Гуз ІІе ТЕГ 65 70 75 80 50 бег Рго ТИг ТиИг сій Азр Тг АЇїа Тис о Туг Ре Су АЇа Агд Геи деп 85 90 95 сС1У Ре А5зр Азр Туг ма! Агуд Туг Рпе Азр Ріе Тгр сЇу Гей су ТНг 100 105 110 55
Гей ма! Тиг ма! 5ег 5ег 115 «210» 49 60 «211» 110 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий)
«400» 49
АЇїа ІчІІе сій Ге Тис осіп Тиг о Рго 5ег 5ег ма! 5ег АЇа АЇа маїЇ сіу 1 5 10 15 сіу Тиг ма! ТНг ІЇе Азп Су5 сп АЇїа 5ег сій 5ег ІІе діа 5ег деп 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Рго Рго Гуз Ге їеи Пе 35 40 45
Туг Аїа АЇїа бег Туг Ге Аїа бег сіу ма! Рго 5ег Аг49д РНе Гуз С1У 50 55 60 бБег сЇу бег сіу Тк сіи Туг ТНг Ге Тиг ІІе 5ег сіу ма! сіп 5ег 65 70 75 80
АІ1а Азр діа Аіа ТиПг Туг Туг Суз сіп б5ег АЇїа Ре Туг ма!Ї 5ег 5ег 85 90 95 зег А5зр Азп АЇа Ре сіу сіу сіу Тиг сіи ма! ма! ма! Гуз 100 105 110 «2105. «50 «2115»о.. 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 50
СсІ1Уу Рпе 5ег Гей б5ег б5ег Туг др 1 5 «210» 51 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 51
ІчІІе сіу б5ег А5зр сіу 5ег АїЇа 1 5 «2105 52 «211» 12 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 52
Аїа Ага А5р Тер Ап А5р Туг Тер Аїа Ні д5р гец 1 5 10 «2105» 53 «2115о. 8 «212» РЕТ 2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4005» 53 бо сіп ч1ІІе ма! ТНг 5ег Гуз 5ег АїЇа 1 5
«2105» 54 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4005» 54
АЇїа сіу сіу Туг Туг Азп 5ег СсІу А5зр Ге А5Зп РГгО 1 5 10 «2105». чі55 «2115 115 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4005» 55 сіп 5ег гей сій сі бег сіу сіу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг о Суз ТНг АЇа бек сіу Ре 5ег їеи бег бег Туг дор 20 25 30 ма! 5ег Тгр маїЇ Агу сіп Аїа Рго сІу Гуз СІу Ге січ Туг ІІе с1у 35 40 45
Ре Іїе сІу 5ег Азр с1Їу 5ег Аїа Ні Туг Аїа Тиг Тгр ма! Гуз с1уУ 50 55 60
Ага Рпе ТиИг ІЇе бек Гуз ТиПгобег Тиг Тиг ма! Азр ге Гуз ІїЇе тиг 65 70 75 80 5зег Рго ТиИг ТИг осі Азр Тиг АїЇа Тиг оТуг Ре Суз АїЇа Агд Азр Тгр 85 90 95
А5п о А5р Туг Тер АТа Ні5 Ар Ге Тгр сіу Рго с1у ТиИг Ге ма! тиг 100 105 110 ма! 5ег 5ег 115 «2105 56 «2115 112 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 56
Аа сіп ма! Ге Тк о сіп ТиПготТг об5ег Рго ма! 5ег АЇа АїЇа маїЇ с1у 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Азп Су сіп АЇїа б5ег сіп ІчІІе ма! ТНг 5ег уз 20 25 30 5ег АЇа Гец бег Тгр Туг сіп сіп Гу5 Рго сіу сіп Рго Рго Аг4д Ге 35 40 45
Іїеи ІІе Туг Гуз АЇа бек ТНг Гей АЇїа б5ег сіу ма! Рго 5ег Ага РНе 50 55 60 бо 5зег сіу б5ег сіу б5ег сіу ТиИг сіп Ре ТНг їеи ТНг ІЇе 5ег др геи 65 70 75 80 сі б5ег А5р Азр АЇа АїЇа ТИг Туг Туг Суз АЇа сіу сіу Туг Туг деп 85 90 95 5зег с1у Азр Ге Азп Рго Рпе сіу сіу сіу Тйг сіи ма! маї!ї маї Гуз 100 105 110 «2105 57 «2115 8 «212» РЕТ «2135 ОгустоЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 57
Сс1Уу Рпе 5ег Гей 5ег б5ег Туг др 1 5 «210». 58 «2115 7 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 58
ІІе б5ег 5ег б5ег сІу Азп ТЕГ 1 5 «2105» 59 «2115 11 «212» РЕТ «2135» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 59
Аа Агд сій сІу Азр Туг Тер Азр РНе Азвп Ге 1 5 10 «210» 6560 «2115 б «212» РЕТ «2135» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 60 сп б5ег ІЇе 5ег Ап Ге 1 5 «210» 01 «2115 12 «212» РЕТ 00 «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4А00» 61
АЇа сіу сіу Рпе Рго сіу Ге Азр Тиг сІіу АЇїа ТНг 1 5 10 «210» 562 «2115 114 «212» РЕТ 60 00 «2135» Огустоі1ади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 62 сіп 5ег гей сій сі бег сіу сіу Агуд Ге ма! Тиг Рго сіу ТиИг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг о Суз ТНг Аїа бек сіу РПе 5ег їеци б5ег б5ег Туг дзхр 20 25 30
Мет 5ег Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сіи Туг Пе с1у 35 40 45
Туг ІчІІе бег 5ег бек с1іу Азп ТИг Туг Туг АЇа 5ег Тгр АЇа Гуз 5ег 50 55 60
Агу Рпе ТиПг о ІІе 5ег уз ТИПгобег Тиг о Ттиг о маї Азр Ге Гуз ІЇе тТНг 65 70 75 80 5зег Рго ТиИг ТИг сі Азр Тиг Аїа Тиг о Туг Рне Суз АїЇа Аго сіЇи с1у 85 90 95
Азр Туг Тер Азр Ре Азп Ге Тгр сіу Рго сіу ТиИг Геу ма! ТНг маї 100 105 110 5ег 5ег «210» 6563 «211» 110 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 63
Аа сіп ма! Гей Тис о сіп Тиг о Рго 5ег 5ег ма! 5ег АЇа АїЇа маїЇ с1у 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Азп Су5 сп АЇа 5ег сіп 5ег ІІе 5ег дзвпіеий 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Агу Рго Агуд Гей їеи ІїЇе 35 40 45
Ттуг Ага АїЇа бег ТИг Гей АЇїа б5ег сіу ма! Рго 5ег Агд РпПе Гуз су 50 55 60 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг ІїЇе 5ег Азр Гей си 5ег 65 70 75 80 сій Азр АЇїа АїЇа ТиИг Туг Туг Суз АЇа сіу сіу Рібе Рго сіу Ге др 85 90 95
Тиг с1у Аїа ТНг РНе сіу сіу сіу Тиг сі Аїа ма! ма! тТНг 100 105 110 «210» 64 «2115 8 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 64 сС1Уу Ре 5ег Гей Азп Азр Туг Тгр во 1 5 «210» 65 «2115 7
«212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 65
ІчІІе Азр ма! сіу сіу б5ег геи 1 5 «210» 66 «2115 11 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 66
Аа Агд сіу сіу Ге Тиг Туг сіу РНе А5р Ге 1 5 10 «2105» 67 «2115 656 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 67 сі Азр ІЇе 5ег 5ег Туг 1 5 «210» 6568 «211» 12 «212» РЕТ 2135 Огустоіїадиб5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 68
Ні Туг туг Аїа Тк Іїе 5ег су Ге сіу ма! Аїа 1 5 10 «210» 659 «211» 114 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 69 сіп 5ег гей сій сі бег сіу с1у Агу Гей ма! Тис Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи Тиг о Суз ТИг Ома! бек сіу РПе 5ег еп Азп д5р Туг Тгр 20 25 30
Мет 5ег Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сЇу Гей сЇи Тгр Пе су 35 40 45
Туг ІІе Азр ма! сіу сіу 5ег їеу Туг Туг АЇа 5ег Тгр АЇа Гуз с1у 50 55 60
Агу Рпе ТиПг о ІІе 5ег Агуд ТиПгобег Тиг оТтигома!ї Азр Ге Гуз Мес тТНг 65 70 75 80 бо 5зег Ге Тиг о Тиг сі Азр Тиг Аїа Тиг оТуг Рне Суз АїЇа Аго сіу СсС1У 85 90 95
Геи Тиг Туг С1у Ре А5р Гей Тгр сЇу Рго сіу Тиг Гей ма! ТНг ма! 100 105 110 5ег 5ег «2105 70 «2115 110 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 70
Азр ІчІІе ма! Меє Тис о сіп ТиПг о Рго Аіа 5ег ма! б5ег січ Рго маїЇ с1у 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Азп Су5 сіп АЇїа б5ег сій А5зр ІчІІе 5ег 5ег Туг ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Агду Рго Гуз Агд Геу Іе 20 35 40 45
Туг с1у АЇїа бег А5зр Ге АЇїа бег сіу ма! Рго 5ег Агуд РПе 5ег АїЇа 50 55 60 25 бег сіу бег сіу Тк сіЇи Туг АЇа Ге ТиПг ІІе б5ег Азр Гец сіи 5ег 65 70 75 80
Аїа А5р Аїа діа Тис о тТукг Туг Суз Ні Туг Туг Аїа ТиИг Те 5ег сІу 85 90 95 30 їеи сіу ма! Аїа РнНе сіу сіу сіу Тк сіи ма! маї маї (уз 100 105 110 «2105» 7/1 «2115о. 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 7/1
Сс1У Рпе 5ег Гей 5ег Тиг Туг АїЇа 1 5 «2105 72 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 72 ма! Туг Азр Ап сіу Туг Іе 1 5 «2105 73 «211» 14 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 7З бо діа Агд 5ег АЇа Азр сіу 5ег Тгр 5ег ТиИг Туг РНе А5ЗП Геи 1 5 10
«2105 174 «2115 б «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «4005 74 сі бег ІїІе 5ег Азп Туг 1 5 «2105 75 «2115 14 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 75 сіп Тс Ап о Туг Суз Суз 5ег б5ег 5ег А5р Азп сіу Ре діа 1 5 10 «2105» 76 «2115 117 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 76 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу сЇу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи Тиг о Суз ТИг Ома! бек сіу Ре 5ег їеци б5ег Тиг Туг АїЇа 20 25 30 мес те Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Ттр Пе сі1у 35 40 45 ма! ма! Туг д5р Ад5п сіу Туг ІІе 5ек Ні5 Аїа Тис Тер ма! Гуз с1у 50 55 бо
Ага Рпе ТиИг ІЇе бек Гуз ТиПгобег Тиг Тиг ма! сіу ге сої че тиг 65 70 75 80 5зег Рго ТиИг ТИг осі Азр Тиг Аїа Тиг оТуг Ре Су АїЇа Агд 5ег АїЇа 85 90 95
Азр сЇ1у 5ег Тгр 5ег Тиг Туг Ре Азп Ге Тгр Ссіу сіп сіу ТНиг Геи 100 105 110 ма! Тиг ма! 5ег 5ег 115 «2105 77 «2115 112 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 77
Азр чІІе ма! Меє ТиПг сіп Тиг Рго АїЇа 5ег ма! си АїЇа АїЇа маїЇ с1у во 1 5 10 15 сіу Тиг ма! Тис ІЇе Гуз Суз сіп АЇїа б5ег сій 5ег ІІе 5ег АдА5п Туг 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сіу сіп Рго Рго Гуз Гей їеи Пе 35 40 45
Туг Гуз АЇа бек ТИг Ге АїЇа 5ег сіу ма! бег 5ег Агд РНе Гуз Ос1У 50 55 60 5зег сіу б5ег сіу Тиг сі Ре ТНг Ге ТНг ІїЇе 5ег Азр Ге сіЇи 5ег 65 70 75 80
АІ1а Азр діа Аіа ТиПг о Туг Туг Суз сіп ТНг о Азп Туг Су5з Су 5ег 5ег 85 90 95 зег А5зр Азп сіу Ре АїЇа Ре сіу сіу сіу Тйг сіи ма! маї!ї маї Гуз 100 105 110 «2105» 78 «2115 8 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 78 сС1у ІТе д5р' Ге 5ег 5ег Туг НІ5 1 5 «2105 79 «2115 7 «212» РЕТ «2135» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 СКролик дикий) «А00» 79 чІІе Аїа Туг сіу сІу Азп ТЕГ 1 5 «210» 80 «2115 12 «212» РЕТ «2135» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 80
Аіа Агд сіу Туг 5ег сі Азр 5ег Туг Тгр ОС1У Ге 1 5 10 «210» 81 «2115 б «212» РЕТ 00 «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 81 сіп Азп ІЇе си А5зп Туг 1 5 «210» 82 «2115 12 «212» РЕТ 60 00 «2135» Огустоі1ади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «А00» 82 сіп сіп Ар Туг сЇу чІІе Іїе Ріпе маї д5р доп Іе 1 5 10 «210» 83 «211» 115 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 83 сіп 5ег гей сій сі бег сіу сіу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тиг Рго 1 5 10 15
Ге ТигоГеи Тк Су Тигома! бек сіу ІТе Азр Ге 5ег 5ег Туг НІі5 мес Суз Тгр ма! Аг9д сіп АїЇа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Туг Пе с1у 20 Туг Ше АїЇа Туг сІу с1у Азп Тиг Туг Туг АЇа Азп Тгр АїЇа Гуз су 60
Агу Рпе ТиПг о ІІе бек їу5 ТИПгобег Тиг о Ттиг ома!ї Азр Ге Агдуд ІЇе тТНг 65 70 75 80 25 5зег Рго ТиИг ТИг осі Азр Тиг АїЇа ТигоТуг Ре Су АїЇа Агд сіу тТуг 85 90 95 5зег сі Азр бег Туг Тгр СІу Гей Тгр сіу Рго сіу ТНг Гей ма! тТНг 30 100 105 110 ма! 5ег 5ег 115 35 «210» 84 «2115 110 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) 40 «400» 84
АІїа Туг Азр Меє ТиПг сіп Тиг Рго АЇа 5ег ма! си АїЇа АїЇа маїЇ с1у 1 5 10 15 45 сіу Тиг ма! ТиИг те Гуз Су5 сп Аїа 5ег сп Азп ІЇе си Азп Туг 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу сіп Рго Рго Гуз еп їеи ІЇе 35 40 45 50
Туг Азр ТНиИг бег губ Ге ТНг обег сіу ма! Рго 5ег Агуд РПе 5ег с1уУ 50 55 бо 5зег сіу бег сіу ТИг А5зр Ре ТНг Ге ТНг ІїЇе 5ег сіу ма! сіп 5ег 55 65 70 75 80
А5р Ар діа Аіа Тиг Туг Туг Суз сіп сіп Азр Туг СІУу ІЇІе Іе РНе 85 90 95 60 ма! Азр Азп ІчІЇе Рібе сІЇу сіу сіу Тиг сіи ма! ма! маї Гуз 100 105 110 «210» 85
«2115 8 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 85 сСІ1Уу Ре 5ег Гей 5ег Азр Туг Туг 1 5 «210» 86 «2115 7 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 86
Мет бег с1у бек су 5ег ТНг 1 5 «210» 87 «2115» 18 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 87
Аа Агд Азр сІу Азр Туг АЇа сІу Тгр сіу Туг АЇа Тиг сіу Аїа РНе 1 5 10 15
А5р Рго «210» 88 «2115 8 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 88 сіп 5ег ма! ма! су Азп 5ег І еи 44 1 5 «210» 89 «2115 12 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 89
Тиг с1у Ага Туг Азп бег Азр ТИг о Азр Тиг РНе маї 1 5 10 «210» 90 «2115 122 «212» РЕТ «213» ОгустоіЇади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 90 сіп 5ег ма! сіи сі б5ег сіу сЇу Агу Ге ма! Тиг Рго сіу Тиг Рго во 1 5 10 15
Геи ТНгоГеи ТНг оСуз ТИг Ома! бек сіу РПе 5ег їец б5ег д5р Туг Туг 20 25 30 мес тТиг Тгр ма! Аг9д сіп Аїа Рго сЇу Гуз сІу Гей сЇи Туг Пе с1у 35 40 45
ІІе Меєс б5ег сіу 5ег с1у бек Тиг Туг Туг Аїа 5ег Тгр Аїа Гуз Ос1У 50 55 60
Агу Рпе ТиПг ІІе 5ег Гуз ТИг 5ег 5ег ТиИг ТИг Ге сі Гей Гуз ІЇе 65 70 75 80
Тигобег о Рго ТиИг о Тиг сі Азр Тс Аїа ІЇе Туг Ре Су АїЇа Агд А5зр 85 90 95
СІу Азр Туг АЇа сіу Тгр сЇу Туг АЇа ТНг сІіу АЇїа Ріпе д5р Рго Тгр 100 105 110 сСІ1Уу Рго сіу ТПг Гей ма! ТНг ма! 5ег 5ег 115 120 «210» 91 «2115 112 «212» РЕТ «2135 Огустоіїади5 сипісиіи5 (Кролик дикий) «400» 91
АІїа Аїа ма! ге ТиПг о сіп Тиг о Рго 5ег Рго ма! 5ег АЇа АїЇа маїЇ сіІу 1 5 10 15 сіу Тйг ма! Тиг о ІІе 5ег Су5 сіп Аїа 5ег сіп 5ег ма! ма! с1у деп 20 25 30 5ег їеу Ге бег Тер РНе сіп Гуз Гуз Рго СсІу сіп Рго Рго Гуз Геи 35 їеи ІІе Туг 5ег АЇа б5ег 5ег їец АЇа б5ег сіу ма! Рго 5ег Ага РНе 60
Гуз сС1у бЗег сіу б5ег сіу Тк сіп Рпе ТНг Ге ТНг ІІе 5ег дзр еи 4065 70 75 80 сі бег А5зр Азр АЇа АїЇа Тиг о Туг Туг Суз ТиИг с1у Агуд Туг Азп 5ег 85 90 95 45 А5р Тг о Азр ТИг Ре ма! Рібе сіу сіу сіу Тиг сіи ма! ма! маї Гуз 100 105 110 «2105» 92 «2115 255 50 «2125» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «А00» 92 55 Мес сіу Азп бег Суз Туг Азп ІІе ма! АїЇа ТИг їеи Ге Гей маї Ге 1 5 10 15
Азп Рпе сій Агуд ТИг о Агуд бег ге сіп Азр Рго Суб 5ег Азп Су Рго 20 25 30 бо
АІїа сіу Тк Ре Суб Ар АЗп Азп Аго Азп сіп чІЇе Су5 бег Рго Суз 35 40 45
Рго Рго Азп бег РПпе 5ег 5ег АїЇа сіу сІу сіп Агуд Тиг Суз Азр Пе 50 55 бо
Суз Агуд сп Суз Гуз сІіу ма! Ре Агу ТНг Агуд Гуз сій Суз 5ег 5ег 65 70 75 80
Тиг об5ег Ад5п Аа сі Суз Азр Суб ТИгоРго с1іу Рпе Ні5 Су Ге с1у 85 90 95
АїЇа сіу Су 5ег Меє Су сім сп Азр Суз Гуз сіп сІЇу сіп сЇи Ге 100 105 110
ТиИг о Гуз Гуз сіу Су5 Гуз Азр Суз Суз РНе с1у ТиИг РНПе Азп А5р сІп 115 120 125
Гуз Агд с1у ІІе Суз Агуд Рго Тгр ТИг Азп Суз 5ег їеи дА5р ау Гуз 130 135 140 5зег ма! Ге ма!Ї Азп сіу ТИг оГуз сі Агуд Азр ма! Ма! Су с1у Рго 145 150 155 160 5ег Рго АЇа Азр Ге бег Рго сіу АїЇа бег бек ма! ТНг Рго Рго АїЇа 165 170 175
Рго Аїа Агу сі Рго сіу Ні5 5ег Рго сіп І1е І1е 5ег Ріе РНе Гей 180 185 190
Аїа Ге Тиг обег ТНПг Аїа ге їеу Рпе їеи Гей Ріпе РПе Геи ТНг Ге 195 200 205
Агу Ре 5ег ма! ма! Гуз Агд сІіу Ага Гуз Гуз Ге Ге Туг ІІе РНе 210 215 220
Гуз сІп Рго Рпе Мет Агд Рго ма! сіп ТНг Тк сіп сіи сій Ар с1у 35. 225 230 235 240
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго си сім сіи сій сІу сіу Суз си І ей 245 250 255 40 «2105» 93 «2115» 205 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність 45 «220» «223» М/А «400» 93 50 Мес сіу Азп бег Суз Туг Азп ІІе ма! АїЇа ТИг їеи Ге Гей маї Ге 1 5 10 15
Азп Рпе сій Агуд ТИйг о Агуд бег ма! Рго А5р Рго Суб 5ег Азп Су 5ег 20 25 30 55
Аа сіу ТиПг Рібе Су5з сЇу Гуз Азп ІІе сіп сі Ге Су5 Меїс Рго Суз
Рго Рго Азп бег РПпе 5ег 5ег АЇа сіу сіу сіп Агуд Тиг Суз Азр Пе бо 50 55 бо
Суз Агуд сп Суз Гуз сІіу ма! Ре Агу ТНг Агуд Гуз сій Суз 5ег 5ег 65 70 75 80
Тиг об5ег Ад5п Аа сі Суз Азр Суб ТИг о Рго с1іу Рпе Ні5 Су Ге с1У 85 90 95
АїЇа сіу Су5 5ег Мекє Су5 си сіп Азр Суз Гуз сіп сЇу сіп сЇи Геиц 100 105 110
ТиИг о Гуз Гуз сіу Су5 Гуз Азр Суз Суз РНе с1у ТИг РНПе Азп дА5р сіп 115 120 125
Гуз Агд с1у ІІе Суз Агуд Рго Тгр ТИг Азп Суз 5ег їеи дА5р ау Гуз 130 135 140 5зег ма! Ге ма!Ї Азп сіу ТИг оГуз сі Агуд Азр ма! Ма! Су с1у Рго 145 150 155 160 5ег Рго АЇа Азр Ге бег Рго сіу АїЇа бег бек ма! ТНг Рго Рго АїЇа 165 170 175
Рго Аїа Агу сі Рго сіу Ні5 5ег Рго сіп І1е І1е 5ег Ріе РНе Гей 180 185 190
АЇїа Ге Тиг 5ег ТНг АЇа Ге їеи сіу сіу Суз СсСЇи Ге 195 200 205 «210» 94 «2115 255 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 94 мес сіу А5зп бег Суз Туг Азп ІІе ма! АЇа ТНг Ієи їеи їеи маї І ец 1 5 10 15
Азп Рпе сій Агуд ТИг о Агуд бег ге сіп Азр Рго Суб 5ег Азп Су Рго 20 25 30
АІїа сіу ТиПг Ре Суб Ар АЗп Азп Аго Азп сіп ІчІЇе Су5 бег Рго Су 35 40 45
Рко Ге Азп бег Ре б5ег бег ТИг сіу сіу сіп Меє Ап Суз Азр Меї бо
Суз Агд Гуз Суз сі сіу ма! Рпе Гуз ТНг Гуз Агуд Аїа Суз 5ег Рго 65 70 75 80 50
ТИг Агдуд Ар АТа сі Суз сої Суб Тг о Рго с1у Рбе Ні5 Су Ге с1У 85 90 95
АІїа сіу Суз 5ег Меє Су5з сім сіп А5р Су Гуз сіп сС1у сіп си Геи 55 100 105 110
ТиИг о Гуз Гуз сіу Су5 Гуз Азр Суз Суз РНе с1у ТИг РНПе Азп дА5р сіп 115 120 125 60 Гуз Агуд с1у ІчІЇе Су5 Агд Рго Тгр Тиг Азп Су 5ег Геци А5р Оу Гуз 130 135 140 5зег ма! Ге ма!Ї Азп сіу ТИг оГуз сі Агуд Азр ма! Ма! Су с1у Рго
145 150 155 160 5ег Рго АЇа Азр Ге бег Рго сіу АїЇа бег бек ма! ТНг Рго Рго АїЇа 165 170 175
Рго Аїа Ага сій Рго сіу Ні б5ег Рго сіп ІІе чІ1е 5ег Ре РНе Ге 180 185 190
Аїа Ге Тиг обег ТНПг Аїа ге їеу Рпе їеи Гей Ріпе РПе Геи ТНг Ге 195 200 205
Агу Ре 5ег ма! ма! Гуз Агод СсІіУ Ага Гуз Гуз Ге Ге Туг ІІе РНе 210 215 220
Гуз сбЇп Рго Ре Меє Агд Рго ма! сіп Тиг Тег сіп сім си Азр с1у 225 230 235 240
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго сіи сіи сіи сіи сІу сіу Суз сЇи Гей 245 250 255 «210» 95 «2115 255 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 95 мес сіу А5зп бег Суз Туг Азп ІІе ма! АїЇа ТНИг іеи їеи їеи маї гей 1 5 10 15
Азп Рпе сій Агуд ТИг о Агуд бег ге сіп Азр Рго Суб 5ег Азп Су Рго 20 25 30
АІїа сіу Тк Ре Суб Ар АЗп Азп Аго Азп сіп чІЇе Су5 бег Рго Суз 35 40 45
Рко Рго Азп бег Ре 5ег 5ег АЇа сіу сіу сіп Агуд ТПг сСуз Азр ІЇе 50 55 бо
Суз Агуд сп Суз Гуз сіу ма! Ре Агу ТНг Агуд Гуз сій Суз 5ег 5ег 65 70 75 80
ТиИг о бег А5Ззп АїЇа сі Су Азр Су Ма! Рго сіу РПе Аг4д Суз Гей СсС1У 85 90 95
Аа сіу Суз Аіа Меє Су5з сі сі Туг Су5з сіп сіп сіу сіп сЇи Геи 100 105 110
Тиг о сіп Гуз сіу Су5 Гуз Азр Суз Суз РНе с1у ТИг РНе Азп дА5р сіп 115 120 125 їу5 Ага с1у ІчІІе Суз Агуд Рго Тгр ТИг Азп Су 5ег Геу Авзр су Гуз 130 135 140 5зег ма! Ге ма!ї Азп сіу ТиИг оГу5 сі Агуд Азр ма! ма! Су С1У Рго 145 150 155 160 бо 5ег Рго АЇа Азр Ге бег Рго сіу АїЇа бег бек ма! ТНг Рго Рго АїЇа 165 170 175
Рго Аїа Ага сій Рго сіу Ні б5ег Рго сіп ІЇе І1е б5ег Ре РНе Ге 180 185 190
Аїа Ге Тиг обег ТНПг Аїа ге їеу Рпе їеи Гей Ріпе РПе Геи ТНг Ге 195 200 205
Агу Ре 5ег ма! ма! Гуз Агд сІіу Ага Гуз Гуз Ге Ге Туг Те РНе 210 215 220
Гуз сбіп Рго Ре Меє Агд Рго ма! сіп Тиг Тег сіп сім си Азр с1у 225 230 235 240
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго сіи сім сіи сій сІіу сіу Суз сЇи Гей 245 250 255 «210» 96 «2115 255 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 96 мес сіу А5зп бег Суз Туг Азп ІІе ма! АЇа ТНИг іеи їеи їеи маї гей 1 5 10 15
Азп Рпе сій Агуд ТИг о Агуд бег ге сіп Азр Рго Суб 5ег Азп Су Рго 20 25 30
АІїа сіу ТиПг Ре Суб Ар АЗп Азп Аго Азп сіп чІЇе Су5 бег Рго Суз 35 Рго Рго Азп бег Ре 5ег 5ег АЇа сіу сіу сіп Агуд ТПг сСуз Азр ІЇе бо
Суз Агуд сп Суз Гуз сІіу ма! Ре Агу ТНг Агуд Гуз сій Суз 5ег 5ег 65 70 75 80 40
Тиг об5ег Ад5п Аа сі Суз Азр Суб ТИг о Рго с1іу Рпе Ні5 Су Ге с1У 85 90 95
АІїа сіу Суз 5ег Меє Су5з сім сіп А5р Су Гуз сіп сС1у сіп си Геи 45 100 105 110
ТиИг Гуз січ сіу Су5 Гуз Азр Суз бег РНпе с1у ТНг РНе Азп А5р Си 115 120 125 50 сі Ні с1у ма! Су5з Агуд Рго Тгр ТИг Азр Су5 5ег Гей Азр С1У Гуз 130 135 140 5зег ма! Ге ма!Ї Азп сіу ТИг оГуз сі Агуд Азр ма! ма! Су С1У Рго 145 150 155 160 55 5ег Рго АЇа Азр Ге бег Рго сіу АїЇа бег бек ма! ТНг Рго Рго АїЇа 165 170 175
Рго Аїа Ага сій Рго сіу Ні б5ег Рго сіп ІІе чІ1е 5ег Ре РНе Ге бо 180 185 190
Аїа Ге Тиг обег ТНПг Аїа ге їеу Рпе їеи Гей Ріпе РПе Геи ТНг Ге 195 200 205
Агу Ре 5ег ма! ма! Гуз Агод сІіу Ага Гуз Гуз Ге Ге Туг ІІе РНе 210 215 220
Гуз сп Рго Рпе Мес Агд Рго ма! сіп Тис ТтНг сіп сЇи сій Ар СУ 225 230 235 240
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго си сім сіи сій сІу сіу Суз си І ей 245 250 255 «210» 97 «2115 255 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «А00» 97 мес сіу А5зп бег Суз Туг Азп ІІе ма! АЇа ТНИг іеи їеи їеи маї гей 1 5 10 15
Азп Рпе сій Агуд ТИг о Агуд бег ге сіп Азр Рго Суб 5ег Азп Су Рго 20 25 30
АІїа сіу ТиПг Ре Суб Ар АЗп Азп Аго Азп сіп чІЇе Су5 бег Рго Суз 35 40 45
Рго Рго Азп бег Ре 5ег 5ег АЇа сіу сіу сп Агуд Тиг Су Азр Пе 50 55 бо
Суз Агуд сп Суз Гуз сІіу ма! Ре Агу ТНг Агуд Гуз сій Суз 5ег 5ег 65 70 75 80
Тиг об5ег Ад5п Аа сі Суз Азр Суб ТИг о Рго сіу Рпе Ні5 Су Ге с1у 85 90 95
АІїа сіу Суз 5ег Меє Су5з сім сіп А5р Су Гуз сіп сС1у сіп си Геи 100 105 110
ТиИг о Гуз Гуз сіу Су5 Гуз Азр Суз Суз РНе с1у ТиИг РНе Азп А5р сІп 115 120 125 їу5 Ага с1у ІчІІе Суз Агуд Рго Тгр ТИг Азп Суз 5ег їеу АїЇа су Гуз 130 135 140
Рго ма! Геи Мет Азп сіу ТНИг Гуз АЇа Агуд Азр ма! ма! Суз сІу Рго 145 150 155 160
Агу Рго АіЇа Азр Гей 5ег Рго сіу Аіа б5ег б5ег ма! Тиг Рго Рго АїЇа 165 170 175
Рго Аїа Ага сій Рго сіу Ні б5ег Рго сіп ІІе чІ1е 5ег Ре РНе Ге 180 185 190
Аїа Ге Тиг обег ТНПг Аїа ге їеу Рпе їеи Гей Ріпе РПе Геи ТНг Ге 195 200 205 60 Агуд Ре бег ма! ма! Гуз Агуд сІу Агд Гуз Гу5 Ге Ге Туг ІІе РНе 210 215 220
Гуз сІп Рго Рпе Мет Агд Рго ма! сіп ТНг Тк сіп сіи сій Ар с1у
225 230 235 240
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго си сім сіи сій сІу сіу Суз си І ей 245 250 255 «210» 98 «2115 255 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 98 мес сіу А5зп бег Суз Туг Азп ІІе ма! АЇа ТНИг іеи їеи їеи маї гей 1 5 10 15
Азп Рпе сі Агуд ТИг о Агуд бег ге сіп д5р Рго Суб 5ег Азп Су Рго 20 25 30
АІїа сіу ТиПг Ре Суб Ар АЗп Азп Аго Азп сіп чІЇе Су5 бег Рго Суз 35 40 45
Рко Рго Азп бег Ре 5ег 5ег АЇа сіу сіу сіп Агуд ТПг Су Азр Пе 50 55 бо
Суз Агуд сп Суз Гуз сІіу ма! Ре Агу ТНг Агуд Гуз сій Суз 5ег 5ег 65 70 75 80
Тиг об5ег Ад5п Аа сі Суз Азр Суб ТИг о Рго с1іу Рпе Ні5 Суз Ге с1У 85 90 95
АІїа сіу Суз 5ег Меє Су5з сім сіп А5р Су Гуз сіп сС1у сіп си Геи 100 105 110
ТиИг о Гуз Гуз сіу Су5 Гуз Азр Суз Суз РНе с1у ТИг РНе Азп дА5р сіп 115 120 125 їу5 Ага с1у ІчІІе Суз Агуд Рго Тгр ТИг Азп Су 5ег Геу Авзр су Гуз 130 135 140 5зег ма! Ге ма!Ї Азп сіу ТИг оГуз сі Агуд Азр ма! Ма! Су с1у Рго 145 150 155 160 5зег Рго ТИг Азр Ре бег Рго с1у ТНг Рго бег ТиИг ТНиг Меє Рго маї 165 170 175
Рго сіу сіу сЇи Ргкго сіу Ні Тис 5ег Ні5 ІЇІе ІчІІе 5ег Ре РНе Ге 180 185 190
Аїа Ге Тиг обег ТНПг Аїа ге їеу Рпе їеи Гей Ріпе РПе Геи ТНг Ге 195 200 205
Аг Ре бег ма! ма! Гуз Агуд сЇу Агду Гуз Гуз Гей Ге Туг І1е РПНе 210 215 220
Гуз сІп Рго Рпе Мет Агд Рго ма! сіп ТНг Тк сіп си сій Ар с1у 225 230 235 240 бо
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго си сім сіи сій сІу сіу Суз си І ей 245 250 255
«210» 99 «2115». 8 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 99 сіу Ттуг Агуд Ре 5ег Азп РНе ма! 1 5 «210» 100 «2115». 8 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 100
ІчІІе А5зп Рго Туг А5зп СсІУ А5ЗПп Гуз 1 5 «2105» 101 «2115». ДЦ 20 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «4005» 101
АІ1а Агд ма! сіу Рго Туг 5ег Тгр А5зр Азр 5ег Рго сіп Азр Азп Туг 1 5 10 15
Туг Мет Азр ма! 20 «2105» 102 «211» 7 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «4005» 102
Ні 5ег ІїІе Агд 5ег Аг Ага 1 5 «210» 103 «2115». 9 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 103 сіп ма! Тукг су АЇїа 5ег 5ег Туг ТНг 1 5 «210» 104 5Б «2115» 127 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 104 бо сіІп ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сІу АїЇа сім ма! Гуз Гуз Рго су АїЇа 1 5 10 15 б5ег ма! Гуз ма! б5ег Сузх сіп АЇїа бег сіу Туг Агд Рпе 5ег Азп РНе 20 25 30 ма! Пе н1і5 Тер ма! Агд сіп Аїа Рго сіу сіп Агуд Ре сіи Тгр Меєс 35 40 45 сІіу Тгр Іїе Азп Рго Туг А5зп с1Їу Азп Гуз сій Рібе б5ег АЇа Гуз РНе 50 55 60 сіп Азр Агуд ма! Тис Ре Тиг Аїа Азр Тиг о б5ег АЇїа доп Тиг Аїа туг 65 70 75 80 мес сіи Ге Агуд б5ег їеи Агуд б5ег Аіа Азр ТИг АЇа ма! Туг Туг сСузв 85 90 95
АІ1а Агд ма! сіу Рго Туг 5ег Тгр Азр дА5р 5ег Рго сіп Азр дзп тТуг 100 105 110
Туг Мет Азр ма! Тер сіу Гуз сіу Тиг Тиг о ма!ї Те ма!ї 5ег 5ег 115 120 125 «210» 105 «2115» 108 «212» РЕТ «2135 Ното 5аріеєп5 (Людина) «4А00» 105 сі чІІе ма! Гей ТНг о сіп бек Рго сЇу ТНг їеи 5ег їеи 5ег Рго с1у зо 1 5 10 15 сії Аг Аїа Тис о РНе 5ег Су5 Агуд 5ег б5ег Ні 5ег ІІе Агд 5ег Ага 20 25 30
Агд ма! Аїа Тгр Туг сіп НІі5 Гуз Рго су сіп Аїа Рго Ага Гей ма! 35 40 45
ІІе ні5 сіу ма! 5ег А5зп Агуд діа бек сіу ІчІІе 5ег А5зр Агуд РНе 5ег 50 55 60 сІ1у б5ег с1у бек с1у ТИг А5зр Рпе ТНг Гей Тиг ІЇе Тиг Аг маї си 65 70 75 80
Рго сій Азр Рпе АЇа Гей Туг Туг Суз сіп ма! Туг сІу АЇа 5ег 5ег 85 90 95
Туг ТНг Ре СсІіу сіп сіу ТиИг Гуз Гей сЇи Аг Гуз 100 105 «210» 106 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 106 сСІіу сп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Тукг ТНгогГеи Рго Рго 5ег Ага др 1 5 10 15 60 сій бе ТПг огГуз Ап сп ма! 5ег Ге Тк Суб Ге ма! Гуз с1Їу РНе 20 25 30
Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! сЇи Тгр сЇи 5ег Азп с1Їу сп Рго си
35 40 45
Азп о АЗп о Туг Гуз Тис о Тйг о Рго Рго ма! Ге Азр бег Азр сіу 5ег РНе 50 55 бо
Рпе Гей Туг бег Гуз Гей ТНг ма! Азр Гуз 5ег Аг9д Тгр сіп сіп сіу 65 70 75 80
А5п ма! Рпе 5ег Суб б5ег ма! Меє Ні сім АЇа Гей Ні дп НІі5 Туг 85 90 95
ТиИг сп губ бег їеу бег Ге бег Рго С1у Гуз 100 105 «210» 107 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 107 сСІіу сп Рго Агдуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг о Геи Рго Рго 5ег Ага сій 1 5 10 15 сі Меє ТиИг оГу5 Азп сіп Ма! бег ге Тиг Суз Ге ма! Гуз с1у РПе 20 25 30
Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! сіи Тер сЇи 5ег Азп СсІу сп Рго си 35 40 45
Азп о АЗп о Туг Гуз Тис о Тйг о Рго Рго ма! Ге Азр бег Азр сіу 5ег РНе 50 55 бо
Рпе Гей Туг бег Гуз Гей ТНг ма! Азр Гуз 5ег Аг4д Тгр сіп сп сІу 565 70 75 80
А5п ма! Рпе 5ег Суб б5ег ма! Мес Ні5 сіи Аїа Гец Ні д5п Ні5 Туг 85 90 95
Тиг о сіп губ бег Гей бег їеу б5ег Рго су Гуз 100 105 «210» 108 «2115 107 «2125» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «4А00» 108 с1іу сбіп Рго Агд сій Рго сіп ма! Туг Тиг огГеи Рго Рго 5ег Аг дер 1 5 10 15 сі Гей ТНг огГуз Азп сп Ма! бег гей Тиг Суз Гей ма! Гуз с1у РНе 20 25 30
Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! сЇи Тгр сЇи 5ег Азп с1Їу сп Рго си 35 40 45
Азп о АЗп о Туг Гуз Тис о Тйг о Рго Рго ма! Ге Азр 5ег А5зр сіу 5ег РНе бо 50 55 бо
Рпе Гей Туг бег Гуз Гей ТНг ма! Азр Гуз 5ег Аг9д Тгр сіп сіп сіу 65 70 75 80
А5п ма! Рпе 5ег Суб б5ег ма! Мес Ні5 сіи сСІіу Ге Ні д5п Ні5 Туг 85 90 95
ТПТг сп Гуз бег їеу бег Гей 5ег Рго су Гуз 100 105 «210» 109 «2115» 330 «2125 РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «4А00» 109
АЇа бег ТНИг губ с1у Рго бег ма! Ре Рго Гей АЇїа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20
Рпе Рго сі Рго ма! ТНг Ма! бек Тгр Азп 5ег с1іу АЇа Гей Тиг 5ег с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 25 50 55 60 їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 30 Тукг те Суз5з Ап ма! А5зп НІіб5 їу5 Рго 5ег Азп ТИг Гуз ма! Азвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг о Ні Тс Суб Рго Рго сСуз 100 105 110 35
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сій ма! Тиг сСуз 40 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гуз Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160 45 Туг ма! Азр сї1у ма! сіи ма!Ї ніх А5п Аїа Гу5 ТИг Гуз Рго Агд си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АЇа Рго ІІе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 225 230 235 240 60 Мет ТиИг оГуз Азп сіп ма! бек ге ТиИг Суз Геу ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго бег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго си деп
260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИг о Тис о Рго Рго ма! Ге Ар 5ег Азр сіу 5ег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег ей 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105» 110 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 110
АЇа бег ТИг губ с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго ма! ТНг Ма! бег Тгр Азп 5ег су АЇа Гей Тиг 5ег с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 35 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец с1іу Тс сіп ТНг 65 70 75 80 40 Тукг те Суз5з А5зп Ма! А5п НІіб5 Гу5 Рго 5ег Азп ТИг Гуз ма! Азвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні Тс Суб Рго Рго Су 100 105 110 45
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Мес ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сій ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гуз Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160
Туг ма! Азр сї1у ма! сіи ма!ї ніх А5п АїЇа Гу5 ТИг Гуз Рго Агд сі 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190 бо
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій (225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйг о Тис о Рго Рго ма! Ге Азр 5ег Азр СсІ1у б5ег РНе Геи 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні си АїТа Ге Ні5 А5п Ні Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег ей 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «210» 111 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 111
АЇа бег ТИг оГу5 с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго ма! ТНг Ма! 5егкг Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 60 їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5ег ей с1у ТНг сп ТНг 65 70 75 80 50 Тукг те Суз5з Ап ма! А5зп НІіб5 їу5 Рго 5ег Азп ТИг Гуз ма! Азвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг Ні ТИг оСу5 Рго Рго Су 100 105 110 55
Рго АЇа Рго сій Гей ей сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд ТиИг о Рго сі ма! Тиг сСуз бо 130 135 140 ма! ма! ма! др ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гуз Ріпе А5Зп Тгр 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гуз Рго Агд сі 165 170 175 си сіп Туг Азп о 5ег Тиг о Туг Агуд ма! ма! 5ег ма! Ге Тиг маї ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 15. 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Ргко 5ег Азр ІЇІе АЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйг о Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Агд Ге Тиг маї Аз5р Гуз 5ег Агд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг зо 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег ей 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105» 112 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 112
АЇа бег ТИг губ с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго ма! ТНг Ма! 5егкг Тгр Азп 5ег с1Їу АїЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 60 Тукг че Суб Азп ма! Азп Ні Гуз Рго бег Азп ТИг Гуз ма! дзвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг о Ні Тс Суб Рго Рго сСуз
100 105 110
Рго АЇа Рго сій Рпе сій сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд ТиИг о Рго сі ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! діа ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5п Тгр 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сЇи маїЇ Ні5 А5п Аїа Гу5 ТНг Гуз Рго Агд сі 165 170 175 січ сіп Туг А5зп бек ТиИг о Туг Ага ма! Ма!Ї бек маЇ Геу Тиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Агд сі) сій 25. 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйг о Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Агд Ге Тиг маї Аз5р Гуз 5ег Агд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТНг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег ей 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105» 113 «2115» 330 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 113
АЇа бег ТИг губ с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30 бо
Рпе Рго сі Рго ма! ТНг Ма! 5егкг Тгр Азп 5ег с1Їу АЇа Гец Тиг 5ег 35 40 45 с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп ТНг 65 70 75 80 туг те Су5 А5зп ма! Азп Ні Гу5 Рго бег А5п ТИг о Гу маї Ар Гуз 85 90 95
Агд ма! сЇи Рго Гу5 б5ег Су5 Азр губ ТИг Ні ТИг о Су Рго Рго сСуз 100 105 110
Рго АїЇа Рго сій Рпе сій сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меє ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сій ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! діа ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5п Тгр 145 150 155 160 туг ма! Азр сіу ма! сіи ма! Ні А5п Аїа Гу5 ТНг Гуз Рго Ага си 165 170 175 січ сбіп Туг А5зп бек ТиИг о Туг Агд ма! Ма! бек маЇ Ге Тиг маї Ге 180 185 190
Ні сп Ар Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег дзгп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Аг4д сім сій 35. 225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп с1у сіп Рго сЇи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИйг о Тис о Рго Рго ма! Ге Азр 5ег Азр СсІ1у б5ег РНе Геи 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агд Тгр сіп сіп сІУ деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег ей 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «210» 114 «2115 107 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) 60 «400» 114
Агу Тпг Ома! Аіїа діа Рго 5ег ма! РНе ІІе РНе Рго Рго 5ег А5зр СсЇи 1 5 10 15 сіп Гей Гуз бег сіу ТПг Аїа б5ег ма! ма! Суз5з Ге Гей А5п дзп РНе 20 25 30 5: Туг Рго Агуд сій АЇїа Гуз маЇ сіп Тгр Гуз ма! Азр Азп АЇа Ге сІп 35 40 45 5зег с1у Азп бег сіп сі б5ег ма! Тиг сім сіп Ар бег Гуз Азр 5ег 50 55 бо
ТиИг Туг 5ег Геу б5ег бег ТНг Гей ТНг Гей 5ег Гуз АїЇа Азр Туг Си 65 70 75 80
Гуз Ні Гуз ма! Ттуг АЇїа Су5 сіи ма! ТтНг Ні сіп сЇу Гей 5ег 5ег 85 90 95
Рго ма! ТНг Гуз бег Рпе Азп Агу сІу сіи Су 100 105 «2105» 115 «2115 277 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 115 мет ма! Агд Гей Рго Гей сіп Суз ма! Ге Тгр сіу Суз їГец Ге ТНг 1 5 10 15
Аїа ма! Ні5 Рго сі Рго Рго ТИг Аїа Су5 Агд9 сіи Гуз сіп Туг Гей 20 25 30
ІІе Азп 5ег сіп Су5 Су5 5ег Гей Су5з Ссіп Рго су сіп Гуз Геи маї 35 зег Азр Суз ТИг сі Ре Тиг сі Тиг си Суз Гей Рго Суз су СсЇи бо сбег сі Ре Гей дА5р ТиИг Тер АЗп Агу си ТВг Ні Су Ні сп Ні 4065 70 75 80
Гуз Туг Суз Азр Рго Ап Геи су Геи Агдуд ма! сіп сіп Гуз сІу ТНг 85 90 95 45 бБег с1іи Тис о А5р Тиг о І1е Су5 Тиг Суз си сі с1у Тер Ні Суз Тс 100 105 110 бег сі Аїа Су5 сі бек Су5з ма! Ге Ні Агуд 5ег Су5 5ег Рго с1у 115 120 125 50
Рпе сІу ма! Гуз сп ІІе Аїа Тк сіу ма! 5ег д5р Тиг ІЇе Су си 130 135 140
Рго Суз Рго ма! с1іу Ре Ре 5ег Азп ма! 5ег 5ег АЇа Рібе сім уз 55 145 150 155 160
Суз Ні Рго Тгр ТИг 5ег Су си ТИг губ Азр Ге ма! ма! сіп сп 165 170 175 60 Аїа сіу ТИПг о А5зп Гуз Тйг о Азр ма! ма! Су5 сіу Рго сп д5р Ага Геи 180 185 190
Агу АЇїа Геци ма! ма! ІЇІе Рго ІЇе че Ріє СІу ІЇеєе Ге РНе АїЇа ІїЇє
195 200 205 їеи Гей ма! Гей ма! Рпе ІїЇе Гуз Гуз ма! АЇїЇа Гуз Гуз Рго ТИг деп 210 215 220
Гуз Аїа Рго Ні5 Рго Гуз сп сіи Рго сіп сій ч1іе Ап Рпе Рго А5р 225 230 235 240
А5р Ге Рго сіу 5ег А5зп ТИг АТа Аїа Рго ма! сіп сім ТНг гГеи ні 245 250 255 сіу Суз сп Рго ма! ТНг сіп сім Азр сІЇу Гуз сі 5ег Агуд Те 5ег 260 265 270 ма! сіп сЇи Аг9д сп 275 «2105» 116 «2115» 330 «2125» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 116
АЇа бег ТИг губ с1у Рго бег ма! Рпе Рго Гец АїЇа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 10 15 5ег ТиИг 5ег сіу сСіу ТНг Аїа АїЇа ге сіу Суз Гей Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго сі Рго ма! ТНг Ма! 5егкг Тгр Азп 5ег с1Їу АЇа Гец Тиг 5ег с1у ма! Ні Тис РНе Рго Аїа ма!Ї Ге сіп 5ег 5ег су Гей Туг 5ег 35 50 55 бо їеи бег бек ма! Ма! ТНг омМаї Рго 5ег 5ег 5егїец су ТНг сіп Тиг 65 70 75 80 40 Тукг те Суз5з А5зп Ма! А5п НІіб5 Гу5 Рго 5ег Азп ТИг Гуз ма! Азвр Гуз 85 90 95
Агуд ма! си Рко Гуз б5ег Су5з Азр Гуз ТИг о Ні Тс Суб Рго Рго сСуз 100 105 110 45
Рго АЇа Рго сій Рпе сій сіу сіу Рго бег ма! Ре Гей Рібе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Гуз Азр ТИг оїеи Меї ІІе 5ег Агуд Тиг о Рго сій ма! Тиг сСуз 130 135 140 ма! ма! ма! діа ма! бек Ні5 сі Ар Рго сіи ма! Гу5 Ріпе А5п Тгр 145 150 155 160
Туг ма! Азр с1їу ма! сіи ма! Ні А5п АЇа Гу5 ТИг Гуз Рго Ага си 165 170 175 сіи сіп Туг Азп о бег Тиг о Туг Агуд ма! ма 5ег ма! Геци ТНг маї гей 180 185 190 бо
Ні сп Азр Тер Гей А5п сіу Гуз сі Туг Гуз Су5з Гуз ма! 5ег дп 195 200 205
Гуз АЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТНг Пе 5ег уз АїЇа Гуз с1у 210 215 220 сіп Рго Агуд сій Рго сіп ма! Туг Тиг оГец Рго Рго 5ег Аг4д сі) сій (225 230 235 240
Мест Тиг оГуз Азп сіп ма! бек їеи Тиг Суз Ге ма! Гуз сіу Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа ма! сім Тгр сіи 5ег Азп сіу сіп Рго с1Їи деп 260 265 270
АзпоТуг Гуз ТИг Тис о Рго Рго маЇ Ге Азр б5ег Азр сіу бег РНе РНе 275 280 285 їеи Туг бЗег Гуз Ге ТНг маї А5р Гуз 5ег Агд Тгр сіп сіп сІ1У деп 290 295 300 ма! Ре 5ег Суб 5ег ма! Мес Ні сій Аїа Ге Ні Азп Ні Туг ТИг 305 310 315 320 сіІп Гуз 5ег ей 5ег ей 5ег Рго СОУ Гуз 325 330 «2105» 117 «2115 122 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 117 сім ма! сп Ге ма! сіп 5ег сІу АїЇа сіи ма! Гуз Гуз Рго су Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! бег Суз Гуз ТИг бек сіу Туг ТНг РНе ТНг сіи туг 20 25 30 че Мес ні5 Тер ма! Аг9уд сіп діа Рго сіу сіп с1у Гей сіи Тер Меє 35 40 45 сСіу сСІЇу ІчІЇе Іїе Рго Абзп Ап сіу сіу Тиг б5ег Туг Азп сіп Гуз РБНе бо сіп с1у Агуд ма! ТигоМеє Тис ма! Азр Гуз б5ег ТИг о б5ег Тиг са1у Ттуг 65 70 75 80 50 Мес сі Ге бег бек Геу Агуд бег сі Азр Тиг Аїа ма! Туг Туг Су 85 90 95
ТИг Агу9 Ага сі ма! Туг С1у Агу Азп Туг Туг АЇа Гей Азр Туг Тгр 100 105 110 55 сіу сіп с1іу ТйгогГеи ма! Тис ма! 5ег 5ег 115 120 «2105» 118 60 «211» 452 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність
«223» М/А «400» 118 сіи ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сІу АїЇа сім ма! Гуз Гуз Рго су АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! бег Су5з Гуз ТИг бек сіу Туг ТНг РНе ТНг сіи тТуг 20 25 30 че Мес ні5 Тер ма! Аг9уд сіп діа Рго сіу сіп с1у Гей сіи Тер Меє 35 40 45 сІу оїу ІІе ІЇе Рго А5зп А5зп сіу сіу Тиг бег Туг Азп сп Гуз Ре 50 55 бо сіп с1у Агуд ма! ТигоМеє Тис ма! Азр Гуз б5ег ТИг о б5ег Тиг са1у Ттуг 65 70 75 80 мес сіи Ге бег б5ег їеи Агуд б5ег сій Азр ТИг АЇа ма! Туг Туг сСузв 85 90 95
ТИг Агу9 Ага сі ма! Туг С1у Агу Азп Туг Туг АЇа Гей Азр Туг Тгр 100 105 110 сіу сіп с1іу Тйгогеи ма! Тис ма! 5ег б5ег АЇа 5ег ТиИг Гуз сІу Рго 115 120 125 бег ма! РНе Рго Гей Аїа Рго бег бег Гуз бег ТиИг 5ег со1Їу с1у тиг 130 135 140
АЇїа АЇїа Гей сіу Суз Ге ма!їЇ Гуз Азр Туг Рпе Рго сі Рго ма! тТНг 145 150 155 160 ма! 5ек Тер А5зп 5ег сіу Аїа Ге Тийг об5ег сіу ма! Ні Тис РНе Рго 165 170 175
АІїа ма Гей сіп 5ег б5ег сіу Ге Туг бег Геу бег 5ег ма! ма! тНг 180 185 190 ма! Рго 5ег 5ег б5егїеу сіу Тийг сіп Тийг Туг ІчІІе Су5 Азп маї Азп 195 200 205
Ні Гуз Рго б5ег А5п ТИгоГуз ма! А5р Гуз Агд ма! си Рго Гуз 5ег 210 215 220
Суз Азр губ ТИг Ні ТИгоСу5 Рго Рго Су5 Рго АїЇа Рго сіи Геи Гец 225 230 235 240 сіу с1у Рго бек ма! Ре Гей Рпе Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Гей 245 250 255 мес ІїІе б5ег Агуд ТИг оРго сіи ма! Тиг Суз ма! ма! ма! Азр ма! 5ег 260 265 270
Ні сій Ар Рго сій ма! Гуз Ре А5зп Тгр Туг ма! Азр о1у маї сіи 275 280 285 60 маїЇ Ніб5 Абп Аїа Гуз ТИгоГу5 Рго Агд сій сій сій Туг А5Зп о 5ег Тиг 290 295 300 туг Агуд ма! ма! 5екг ма! Ге Ттиг ма! Ге Ні5 сп Ар Тер Геи д5п
305 310 315 320 сСІУу Гуз сЇи Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег Ап Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго 325 330 335 че сі Гуз ТНг ІЇе 5ег Гуз АЇа Гуз СсІ1у сп Рго Аг си Рго сіІп 340 345 350 ма! Тукг Тиг Ге Рго Рго 5ег Агуд сі сіи Мес ТНг Гуз Азп сп маї 355 360 365 5зег Ге Тиг Суз Ге ма!Ї Гуз с1у Рне Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа маї 370 375 380 си Тер соЇи 5ег Азп сіу сіп Рго сі Абзп Ази Туг губ Тиг Те Рго 385 390 395 400
Рго ма! Ге Ар бег Азр сіу бег Рпе РПе гГеи Туг 5ег уз Ге ТНг 405 410 415 ма! Азр Гуз 5ег Агуд Тер сіп сіп сіу Азп ма! Ре 5ег Су 5ег маї 420 425 430 мес Ні5 сі АїТа Гей Ні5 Ап Ні Туг ТНг сп Гуз 5ег їГеи 5ег гей 435 440 445 5ег Рго С1У Гуз 450 «210» 119 «2115» 452 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 119 сім ма! сп Ге ма! сіп 5ег с1у АїЇа сіи ма! Гуз Гуз Рго сІ1у Аїа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! бег Суз Гуз ТИг бек сіу Туг ТНг РНе ТНг сіи тТуг 20 25 30 че Мес ні5 Тер маї Аг9у сіп діа Рго сСіу сіп сЇу Гей сі Тер Меєс 35 40 45 сСіу сСІ1у ІчІЇе Іїе Рго А5зп Ап сіу сіу Тиг б5ег Туг Азп сіп Гуз РБНе 50 55 бо сіп с1у Агуд ма! ТигоМеє Тис ма! Азр Гуз б5ег ТИг о б5ег Тиг са1у Туг 65 70 75 80
Мес сі Ге бег бег Геу Агуд бег сі Азр Тиг Аїа ма! Туг Туг Су 85 90 95
ТИг Агу9 Ага сі ма! Туг С1у Агу Азп Туг Туг АЇа Гей Азр Туг Тгр 100 105 110 бо сіу сіп с1у Тйгогеи ма! Тис ма! 5ег б5ег АЇа 5ег ТиИг Гуз сІу Рго 115 120 125
5зег ма! Ре Рго Ге АїЇа Рго бег б5ег Гуз бег Тиг б5ег су сЇу ТНг 130 135 140
АЇїа АЇїа Гей сіу Суз Ге ма!їЇ Гуз Азр Туг Рпе Рго сі Рго ма! тТНг 145 150 155 160 ма! 5ек Тер А5зп 5ег сіу Аїа Ге Тийг об5ег сіу ма! Ні Тис РНе Рго 165 170 175
АЇїЇа ма! Ге сіп бек б5ег сіу Ге Туг бег Гей бег 5ег ма! ма!ї тиг 180 185 190 ма! Рго 5егкг 5ег б5егїеу сіу Тийг о сіп Тийг оТуг ІчІЇе Су5 Азп маї Азп 195 200 205
Ні Гуз Рго 5ег Ап ТИгоГуз ма! А5зр Гуз Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег 210 215 220
Суз Азр губ ТИг Ні ТйгоСуз Рго Рго Суб Рго Аїа Рго сіи Рібе си 20225 230 235 240 сіу с1у Рго бек ма! Ре Гей Рпе Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Гей 245 250 255
Мес ІчІІе бег Агуд Тис о Рго сі ма! Тиг Суз ма! ма! ма! Аїа маї 5ег 260 265 270
Ні сій Ар Рго сій ма! Гуз Ре А5п Тгр Туг ма! Азр о1у маї сіи 275 280 285 ма! Ні Ап Аа Гу ТНИг Гуз Рго Агуд сій сі сій Туг А5Зп о б5ег ТИг 290 295 300 туг Агуд ма! ма! 5екг ма! Ге Ттиг ма! гГеи ніх сп д5р Тер Геи двп 305 310 315 320 сСІУу Гуз сЇи Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег Ап Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго 325 330 335
ІЇе сі Гуз ТиИг Іе 5ег їу5 АЇа Гу сІу сп Рго Агд си Рго сіп 340 345 350 ма! Тукг Тк Ге Рго Рго 5ег Агуд сі сіи Мес ТНг Гуз Азп сп маї 355 360 365 5зег Ге Тиг Суз Ге ма!Ї Гуз с1у Рне Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа маї 370 375 380 сіи Тер сої бег А5зп сЇу сіп Рго сій А5зп Ази Туг Гуз Тг Тег о Рго 385 390 395 400
Рго ма! Геи Ар бег Азр сіу б5ег Рпе Гей їеи Туг б5ег уз Геу ТНг 405 410 415
Ма! Азр Гуз б5ег Агуд Тгр сп сіп сЇу Азп ма! Ре 5ег Су 5ег маї 420 425 430 мес Ні5 сі АїТа Гей Ні5 Ап Ні Туг ТНг сп Гуз 5ег їГеи 5ег гей 435 440 445 бо 5ег Рго С1У Гуз 450
«2105» 120 «2115» 452 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 120 сіи ма! сіп Гей ма! сіп 5ег сІу АїЇа сім ма! Гуз Гуз Рго су АїЇа 1 5 10 15 5зег ма! Гуз ма! бег Су5з Гуз ТИг бек сіу Туг ТНг РНе ТНг сіи тТуг че Мес ні5 Тер ма! Аг9уд сіп діа Рго сіу сіп с1у Гей сіи Тер Меє 20 сіу сіу ІІе ІчІЇе Рго А5зп Ап сіу сіу ТПг о бег Туг Азп сіп Гуз Ре бо сіп с1у Агуд ма! ТигоМеє Тис ма! Азр Гуз б5ег ТИг о б5ег Тиг са1у Ттуг 65 70 75 80 25 мес сіи Ге бег б5ег гей Агуд бег сій Азр ТИг АЇїа ма! Туг Туг Су 85 90 95
ТИг Агу9 Ага сі ма! Туг С1у Агу Азп Туг Туг АЇа Гей Азр Туг Тгр 30 100 105 110 сіу сіп с1іу Тйгогеи ма! ТНг ма! 5ег б5ег діа б5ег ТИг Гуз с1у Рго 115 120 125 35 бег ма! РНе Рго Гей Аїа Рго бег бег Гуз бег ТиИг 5ег со1Їу с1у тиг 130 135 140
АЇїа АЇїа Гей сіу Суз Ге ма!їЇ Гуз Азр Туг Рпе Рго сі Рго ма! тТЕг 145 150 155 160 40 ма! 5ек Тер А5зп 5ег сіу Аїа Ге Тийг об5ег сіу ма! Ні Тис РНе Рго 165 170 175
АІїа ма Гей сіп 5ег б5ег сіу Ге Туг бег Геу бег 5ег ма! ма! тиг 45 180 185 190 ма! Рго 5ег 5ег б5егїеу сіу Тийг о сіп Тийг оТуг ІчІЇе Су5 Азп маї Азп 195 200 205 50 Ні Гуз Рго бег Азп ТИгоГуз ма! А5зр Гуз Агд ма! си Рго Гуз 5ег 210 215 220
Суз Азр губ ТИг Ні ТигоСуз Рго Рго Суб Рго Аїа Рго сіи Рібе си 225 230 235 240 55 сіу с1у Рго бек ма! Ре Гей Рпе Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг Гей 245 250 255 мес ІїІе б5ег Агуд ТИг оРго сіи ма! Тис Суз ма! ма! ма! АїЇа маї 5ег бо 260 265 270
Ні сій Ар Рго сій ма! Гуз Ре А5зп Тгр Туг ма! Азр о1у маї сіи 275 280 285 ма! Ні Ап Аа Гу ТНИг Гуз Рго Агуд сій сі сій Туг А5Зп о б5ег ТИг 290 295 300
Туг Агд ма! ма! 5ег ма! Геу Тиск ма! гГеу Ні сіп А5р Тер Гей доп 305 310 315 320 сСІУу Гуз сЇи Туг Гуз Суз Гуз ма! 5ег Ап Гуз АЇа Гей Рго АЇа Рго 325 330 335 че сі Гуз ТНг ІЇе 5ег Гуз АЇа Гуз СсІ1у сп Рго Аг си Рго сіІп 340 345 350 ма! Тукг Тиг Ге Рго Рго б5ег Агуд сі сіи Мес ТНг Гуз Азп сп маї 355 360 365 5зег Ге Тиг Суз Ге ма!Ї Гуз с1у Рне Туг Рго 5ег Азр ІЇе АїЇа маї 370 375 380 сі Тер сої бег Азп сіу сіп Рго сі Абп Азп Туг Гуз ТВг о Тиг о РгОо 385 390 395 400
Рго ма! Ге Ар бег Азр сіу бек Рпе РПе Геи Туг 5ег Агуд Ге Тиг 405 410 415 ма! Азр Гуз 5ег Агуд Тер сіп сіп сіу Азп ма! Ре 5ег Су 5ег маї 420 425 430 мес Ні5 сі АїТа Гей Ні5 Ап Ні Туг ТНг сп Гуз 5ег їГеи 5ег гей 435 440 445 5ег Рго С1У Гуз 450 «2105» 121 «2115 107 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 121
А5р ІІе сіп Мес ТиПг о сіп 5ег Рго бег 5ег їеу 5ег АЇа 5ег ма! с1у 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тиг ІІе Тиг Су5 5ег Аїа 5ег сіп сіу ІЇе Азп Азп Туг 20 25 30
Гей Азп Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу Гуз АїЇа ма! Гуз Гей їеи Іе 35 40 45 туг Туг ТНг б5ег б5ег Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агдуд Ре 5ег СОс1У 50 55 бо 5зег сіу б5ег сіу ТиИг Азр Туг ТИг РНе ТНг Іїе 5ег 5ег ей сп Рго 65 70 75 80 60 сій Азр чІІе Аїа Тийг тТуг туг Суз соЇп сіп Туг бег Азп Геу Рго Туг 85 90 95
ТиИг РНе сіу сіу сіу ТНг Гуз ма! си ІїЇе Гуз
100 105 «2105 122 «2115 214 «2125» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «4005» 122
Азр че сіп Меє ТиПг осіп 5ег Рго 5ег 5ег Геу б5ег АЇа 5ег маїЇ сІу 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тиг ІІе Тиг Су5 5ег Аїа 5ег сіп сіу ІЇе Азп Азп Туг
Гей Азп Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу Гуз АїЇа ма! Гуз Гей їеи Іе 20 35 40 45 туг Туг ТНг б5ег б5ег Ге Ні 5ег сіу ма! Рго 5ег Агдуд Ре 5ег СОс1У 50 55 бо 25 бег сіу бег сіу ТНПг Азр Туг Тиг Рпе ТПг ІІе б5ег 5ег Гец сіп Рго 65 70 75 80 сій Азр ІчІІе Аїа ТиИг Туг Туг Суз сіп сіп Туг 5ег Азп Гец Рго Туг 85 90 95 30
ТиИг РНе сіу сіу сіу ТНг Гуз ма! сіи ІїЇе Гуз Агд ТНиг ма! Аїа Аїа 100 105 110
Рго бег ма! Рпе ІЇе РПе Рго Рго 5ег А5р си сіп Гей Гуз 5ег с1у 115 120 125
ТиИг Аїа б5ег ма! ма! Су5х Ге Гей А5зп Азп Рпе Туг Рго Аг сім АїЇа 130 135 140
Туз ма! сп Тер Гуз ма! д5р доп Аїа ге сіп б5ег сІу Азп 5ег сіп 145 150 155 160 сі бек ма! Тиг сім сіп Ад5р б5ег Гуз Азр 5ег ТИг Туг 5ег ге 5ег 165 170 175 бег ТИг Ге ТИг оїеу б5ег Гуз АЇа Азр Туг сіи Гуз Ні Гуз ма! туг 180 185 190
АТа Су5х сіи ма! Типк Ні5 сіп сіу Гей 5ег о бег Рго ма! ТиИг Гуз 5ег 195 200 205
Рпе Азп Агд сіу сіЇи сСуз 210 «210» 123 «2115 117 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність 60 0«220» «223» М/А «4005» 123 сіи ма! сіп Гей ма! сіи 5ег сІіу сіу сіу Ге ма! сіп Рго сІУ Ага 1 5 10 15 бБег Ге Агд Гей бег Суз ТНг АЇїа бег сіу Рпе 5ег Гей Азп Ар Туг 20 25 30
Тер Мес 5ег Тгр маї Агд сіп АїЇа Рго сіу Гуз СсЇу гГеи сЇи Тер маї 35 40 45 сіу туг ІІе Азр ма! сІЇу сіу 5ег їеи Туг Туг АЇа АїЇа 5ег маї Гуз 50 55 бо сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Агу Ар А5зр 5ег Гуз 5ег І|е АЇа Туг Гей 15. 65 70 75 80 сіп Меє А5зп бег ей Гуз ТИг сій Азр ТИПг АЇїа ма! Туг Туг Суз АїЇа 85 90 95
Агд сіу сіЇу Ге Тиг туг сІу Ріе Азр гГеи Тгр сЇу сіп сЇу ТНг Ге 100 105 110 ма! Тиг маї 5ег 5ег 115 «2105» 124 «2115» 447 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 124 сіи ма! сіп Гей ма! сіи 5ег сІіу сіу сіу Ге ма! сіп Рго сІУ Ага 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге бег Су5 ТИг АЇа бек сіу Рпе 5ег Ге Азп А5р тТуг 20 25 30
Тер Мес 5ег Тгр маї Агд сіп АїЇа Рго сіу Гуз СсЇу гГеи сЇи Тер маї 35 40 45 сіу Туг ІІе Азр ма! сіу сІу 5ег Ге Туг Туг Аїа АЇа 5ег маї Гуз бо сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Агу Ар А5зр 5ег Гуз 5ег І|е АЇа Туг Гей 65 70 75 80 50 сіп Меє А5зп бег ей Гуз ТИг сій Азр ТИПг АЇїа ма! Туг Туг Суз АїЇа 85 90 95
Агу сЇу сіу Ге Тийг Туг сіу Ре Азр Ге Тгр сіу сіп сіу ТНиг Геи 55 100 105 110 ма! Тиг ма! 5ег 5ег діа б5ег ТигоГу5 сіу Рго бег ма! РНе Рго Геи 115 120 125 60 Аїа Рго бег бег їу5 5ег ТиИг 5ег с1Їу с1у Тг Аїа Аїа ге су Сув 130 135 140 їГеи ма! Гуз Азр Туг Рпе Рго сій Рго ма! Тиг ма! бек Тер Азп 5ег
145 150 155 160
СТУ АТа ге ТиПг о б5ег о сіу ма! Ні Тиг РНе Рго Аїа маї! Геи сіп 5ег 165 170 175 5зег сіу Ге Туг б5ег Ге бег бег ма! ма! Тиг ма! Рго 5ег 5ег 5ег 180 185 190 ей сіу Тк сій тигоТукг ІТе Суб А5п ма! Абзп Ні губ Рго 5ег двп 195 200 205
Тис огГуз ма! Азр губ Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег Суб Азр Гуз ТНг НІ15 210 215 220
Тг Суз Рго Рго Суб5 Рго АЇа Рго сій Ге їеи сіу сіу Рго 5ег ма! 225 230 235 240
Рпе Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг о їеи Меє ІІе 5ег Ага тиг 245 250 255
Рго сіи ма! тик Су ма! ма! маї д5р маї 5ег Ні сЇи А5р Рго си 260 265 270 ма! Гуз Рпе А5п Тгр туг ма! Азр сіу ма! сіи маїЇ Ні Ап Аїа Гуз 275 280 285
ТиИг огГуз Рго Агуд січ сі сбіп Туг Азп о бег ТИг оТуг Агуд ма! Ма! 5ег 290 295 300
Мма!ї Гей тик маї Ге Ні сіп дор Тер Геи Ап сІ1у Гуз сЇи Туг Гуз 305 310 315 320
Суз Гуз ма! 5ег Ап Гуз АїЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТиИг Іе 325 330 335 5ег Гу5 АЇа Гуз сіу сіп Рго Агуд сі Рго сіп ма! Туг ТНг Геи Рго 340 345 350
Рго бег Агуд сіи сіи Меє ТНИг Гуз Азп сіп ма! 5ег їеи Тиг Суз Гей 355 360 365 ма! Гуз сіу Рпе Туг Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тер си 5ег Азп 370 375 380 сІу сбіп Рго сі Абзп А5п о Туг Гуз Тс о ТВг оРго Рго ма! Гец Азр 5ег 385 390 395 400
Азр сіу бек Ре Ре Ге Туг бег губ Ге ТиИг ма!Ї Азр Гуз 5ег Ага 405 410 415
Тер сп сій сіу доп ма! РНе 5ег Суб б5ег ма! Меє Ні сім Аїа Ге 420 425 430
Ні Ап Ні Туг Те о сіп губ б5ег ге б5ег Геу б5ег Рго Оу Гуз 435 440 445 «2105» 125 «2115» 447 «212» РЕТ 60 «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А
«4005» 125 сіи ма! сіп Гей ма! сіи 5ег сІіу сіу сіу Ге ма! сіп Рго сІУ Ага 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге бег Су5 ТИг АЇа бек сіу Рпе 5ег Гей Азп А5р тТуг 20 25 30
Тер Меє 5ег Тгр ма! Агд сіп АїЇа Рго сІу Гуз сіу Ге си Тер ма! 35 40 45 сіу Ттуг ІІе Азр ма! сІЇу сіу 5ег їеи Туг Туг АЇа АїЇа 5ег маї Гуз 50 55 бо сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Агу Ар А5зр 5ег Гуз 5ег І|е АЇа Туг Гей 65 70 75 80 сіп Меє А5зп бегїеи Гуз ТИг сій Азр ТИПг АЇїа ма! Туг Туг Суз АїЇа 85 90 95
Агу сЇу сіу Ге Тийг Туг сіу Ре Азр Ге Тгр сіу сіп сіу ТНиг Геи 100 105 110 ма! Тиг ма! бег бек Аїа 5ег Тиг огГуз с1іу Рго бек ма! Ре Рго Ге 115 120 125
Аіа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сІу сіу ТНг Аїа АЇїа Ге с1у Су 130 135 140 їГеи ма! Гуз Азр Туг Ре Рго сі Рго ма! Тк ма! бек Тгр Азп 5ег 145 150 155 160
СТУ АТа ге ТиПг о б5ег сіу ма! Ні Тиг РНе Рго Аїа маї Гей сіп 5ег 165 170 175 5зег сіу Ге Туг б5ег Ге бег бег ма! ма! ТиИг омаї Рго 5ег 5ег 5ег 180 185 190
Ге сіу Тк сіп ТйготТує ІЇе Суб А5п ма! А5Зп Ні5 Гу5 Рго 5ег дзп 195 200 205
Тис огГуз ма! Азр губ Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег Суб А5зр Гу5 Тег НІ15 210 215 220
ТиИг Суб Рго Рго Суб Рго АЇа Рго сіи РНе сіи сіу сіу Рго 5ег маї 225 230 235 240
Рпе Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг о їеи Меї ІІе 5ег Аг тТиг 245 250 255
Рго сіи ма! тик Су ма! ма! маї Аїа ма! 5ег Ні сЇи А5р Рго си 260 265 270 ма! Гуз Ре Азп Тгр Туг ма! Ар су ма! сіи ма! Ні Ап АїЇа (Гуз 275 280 285
ТиИг огГуз Рго Агуд січ сі сбіп Туг Азп о бег ТИг оТуг Агуд ма! Ма! 5ег 290 295 300 бо
Ууаії! Ге тиг маї Геци Ні5 сіп дор Тгр Гей Ап с1у Гуз сі Туг Гуз 305 310 315 320
Суз Гуз ма! 5ег Ап Гуз АїЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТиИг Іе 325 330 335 5ег Гу5 АЇа Гуз сіу сіп Рго Агуд сі Рго сіп ма! Туг ТНг Геи Рго 340 345 350
Рго бег Агуд сіи сіи Меє ТНг Гуз Азп сіп ма! 5ег їеи Тиг Суз Гей 355 360 365 ма! Гуз с1у Рпе Туг Рго 5ег Аз5р ІЇе АїЇа ма! сіи Тер сЇи 5ег деп 370 375 380 сСіу сіп Рго сій А5зп АЗп о Туг Гуз Тис Тс о Рго Рго ма! Гец Азр 5ег 385 390 395 400
Азр сіу бек Ре Ре Ге Туг бег Агд Ге ТиИг ма!Ї Азр Гуз 5ег Ага 405 410 415
Тер сп сій сіу доп ма! РНе 5ег Су б5ег ма! Меє Ні сім Аїа Ге 420 425 430
Ні Ап Ні Туг Те о сіп Гуз 5ег їеи б5ег їеу б5ег Рго О1У Гуз 435 440 445 «210» 126 «2115» 447 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 126 сі ма! сп Геу ма! сі б5ег сІЇу сіу сіу Ге ма! сіп Рго с1у Ага 1 5 10 15 5зег Ге Ага Ге бег Су5 ТИг АЇа бек сіу Рпе 5ег Ге Азп А5р тТуг 20 25 30
Тер Мес 5ег Тгр маї Агд сіп АїЇа Рго сіу Гуз СсЇу гГеи сЇи Тер маї 35 40 45 сіу туг ІІе Азр ма! сІЇу сіу 5ег їеи Туг Туг АЇа АїЇа 5ег маї Гуз бо сСІ1Уу Аг Рпе Тиг ІЇе 5ег Агу Ар А5зр 5ег Гуз 5ег І|е АЇа Туг Гей 65 70 75 80 50 сіп Меє Азп бегоїеи Гуз ТПг осі Азр Тийг АЇїа ма! Туг Туг Суз Аїа 85 90 95
Агу сЇу сіу Ге Тийг Туг сіу Ре Азр Ге Тгр сіу сіп сіу ТНиг Геи 100 105 110 55 ма! Тиг ма! 5ег 5ег діа б5ег ТигоГу5 сіу Рго бег ма! РНе Рго Геи 115 120 125
Аіа Рго 5ег 5ег Гуз 5ег ТИг 5ег сІу сіу ТНг Аїа АЇїа Ге с1у Су бо 130 135 140 їГеи ма! Гуз Азр Туг Рпе Рго сій Рго ма! Тиг ма! бек Тер Азп 5ег 145 150 155 160
СТУ АТа ге ТиПг о б5ег сіу ма! Ні Тиг РНе Рго Аїа маї Гей сіп 5ег 165 170 175 бег с1у Гей Туг 5ег Ге бег 5ег ма! ма! Тиг ма! Рго 5ег 5ег 5ег 180 185 190 ей сіу Тк сій тигоТукг ІТе Су5 А5зп ма! А5п Ні губ Рго 5ег двп 195 200 205
Тис огГуз ма! Азр губ Агуд ма! сі Рго Гуз 5ег Суб Азр Гуз ТНг НІ15 210 215 220
ТиИг Суб Рго Рго Суб Рго АЇа Рго сіи РНе сіи сіу сіу Рго 5ег маї 15. 225 230 235 240
Рпе Гей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр ТИг о їеи Меє ІІе 5ег Ага тиг 245 250 255
Ргкго сій ма! Тиг Суз ма! ма! ма! АїТа ма! 5ег ніх си Ар Рго си 260 265 270 ма! Гуз Рпе А5п Тгр туг ма! Азр сіу ма! сіи маїЇ Ні Ап Аїа Гуз 275 280 285
ТиИг огГуз Рго Агуд січ сі сбіп Туг Азп о бег ТИг оТуг Агуд ма! Ма! 5ег 290 295 300
Уаії! Ге тиг маї Геци Ні сіп дор Тгр Гей Ап с1у Гуз сі Туг Гуз зо 305 310 315 320
Суз Гуз ма! 5ег Ап Гуз АїЇа Геи Рго АїЇа Рго ІЇе сій Гуз ТиИг Іе 325 330 335 бег Гуз АЇа губ сіу сіп Рго Агд сіи Рго сіп ма! Туг Тиг Геи Рго 340 345 350
Рго бег Агуд сіи сіи Меє ТНИг Гуз Азп сіп ма! 5ег їеи Тиг Суз Гей 355 360 365 ма! Гуз сіу Рпе Туг Рго 5ег Азр ІЇе АЇа ма! сіи Тер си 5ег Азп 370 375 380 сСІіу сіп Рго сій А5зп АЗп о Туг Гуз Тис Тс о Рго Рго ма! Гец Азр 5ег 385 390 395 400
А5зр сЇ1у бек Ре Гей їеи Туг бег Гу5 Ге ТиИг ма!Ї Азр Гуз 5ег Ага 405 410 415
Тер сіп сп с1у Ап ма! Ре 5ег Су5 5ег ма! мес Ніх си Аїа гей 420 425 430
Ні Ап Ні Туг Те о сіп Гуз 5ег їеи б5ег їеу б5ег Рго О1У Гуз 435 440 445 «2105» 127 «2115 110 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність бо «220» «223» М/А
«400» 127
Азр ІчІІе ма! Меє Тис сіп 5ег Рго 5ег 5ег їеу 5ег АіЇа 5ег маїЇ сІу 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тийг ІІе Тиг Су5 сіп Аїа б5ег сі Азр ІІе б5ег 5ег Туг 20 25 30 ем АїЇа Тгр Туг сп сіп Гуз Рго сЇу Гуз АЇа Рго Гуз Агуд Гей Пе 35 40 45
Туг с1у АЇїа бег А5зр Ге АЇїа бег сіу ма! Рго 5ег Агуд РПе 5ег АїЇа 50 55 бо бБег сіу бег сіу ТНПг Азр Туг ТИг Рпе Тиг ІЇе 5ег 5ег Гец сіп Рго 65 70 75 80 сі А5р ч1іе Аїа ТИг оТуг Туг Су5 Ні Туг Туг Аїа Тиг Пе 5ег с1Уу 85 90 95 ей сІу ма! Аїа Рпе СсІу сіу сіу Тиг Гуз ма! сі Пе Гуз 100 105 110 «2105» 128 «211» 217 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» М/А «400» 128
Азр ІчІІе ма! Меє Тис о сіп 5ег Рго 5ег 5ег Геу б5ег АЇа 5ег маїЇ с1у 1 5 10 15
Азр Агд ма! Тиг ІІе Тиг Су5 сіп Аіїа 5ег сі Азр ІІе 5ег 5ег Туг 20 25 30
Тем АЇа Тгр Туг сіп сіп Гуз Рго сіу Гуз АЇа Рго Гуз Агд Гей Іе 35 40 45
Туг с1у АЇїа бег А5зр Ге АЇїа бег сіу ма! Рго 5ег Агуд РНе 5ег АїЇа 50 55 бо 5зег сіу б5ег сіу ТиИг Азр Туг ТИг РНе ТНг Іїе 5ег 5ег ей сп Рго 65 70 75 80 сі А5р т1іе Аїа ТИг оТуг Туг Су5 Ні Туг Туг Аїа Тиг Іїе 5ег с1Уу 85 90 95 еи сІіу ма! Аїа Рпе СсІу сіу сіу Тиск Гуз ма! сій те Гуз Ага тТиг 100 105 110
Ма! Аїа АїЇа Рго бек ма! Рібе ІІе Рпе Рго Рго 5ег Азр сЇи сіп Ге 115 120 125
Гуз бек с1у ТПг АЇїЇа бек ма! ма! Суз Ге Гей А5п Азп Ре Туг Рго 130 135 140 бо
Агу сЇо Аїа Гуз ма! сіп Тер Гуз маїЇ Азр Азп АїЇа Ге сіп 5ег с1у 145 150 155 160
Ап о б5ег сіп сі бек ма! ТиПг сі сіп Азр б5ег Гуз Азр бег Тиг туг 165 170 175 бег ге б5ег бег ТИг оїеци ТИг о їеи 5ег Гуз АЇа Азр Туг сіи Гу НІі5 180 185 190
Гуз ма! Тукг АТа Су5з сі ма! тик ніх сіп сіу Ге 5ег б5ег Рго ма! 195 200 205
Тг Гуз бег Рпе Азп Агд сІу си сСузв 210 215 «2105» 129 «2115» 24 «2125 РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 129
Ге сіп Азр Рго Суб5 бег Ап Су5 Рго Аіа сіу ТИг РПе сСуз Азр деп 1 5 10 15
Ап Агд Ап сіп тІІе Су5з 5ег Рго 20 «2105» 130 «2115 41 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «4А00» 130
Суз Рго Рго Ап бег Ре 5ег 5ег АЇа сіу сіу сіп Агуд Тиг Суз дер 1 5 10 15
ІІе Су5 Ага сіп Су5з Гуз сіу ма! Ре Агуд ТНг Агд Гуз сіи Суз 5ег 20 25 30 5ег ТНИг б5ег А5Зп АЇа сі Суз Азр Су 35 40 «2105» 131 «2115» 26 «212» РЕТ «2135 Ното 5аріеєп5 (Людина) «400» 131
Тис оРго с1у Рпе Ні Суз Ге сіу Аїа с1іу Су5 5ег Мес Су сЇи сп 1 5 10 15
А5р Суз Гуз сп сіу сіп сі Ге ТНиг Гуз 20 25 «2105» 132 «2115» 24 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) 60 «400» 132
Гуз су Суз Гуз Азр Суз Суз РПпе сіу ТНг РПе Ап А5р сіп Гуз Ага 1 5 10 15 сіу тІІе Су5з Агд Рго Тгр ТНг дп «210» 133 «2115 23 «212» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 133
Суз б5ег Гей Ар с1у Гуз 5ег ма! Геи ма! Ап сіу Тиг Гуз си Ага 1 5 10 15
Азр ма! ма! Су5 су Рго 5ег «210» 134 «2115 25 20 «2125» РЕТ «2135 Ното з5аріеп5 (Людина) «400» 134
Ркго АЇа Азр Ге бег Рго сіу АЇа бег 5ег ма! Тис Рго Рго АїЇа Рго 1 5 10 15
Аїа Агд си Рго сіу Ні5 5ег Рго сп 20 25 «2105» 135 «2115 255 «212» РЕТ «2135 5и5 5сгоТа (Дикий кабан) «4А00» 135 мес сіу Азп сіу Туг Туг Азп ІІе ма! АїЇа Тиг ма! гей їеи ма! Меє 1 5 10 15
Азп Рпе сій Агуд ТИйг о Агуд бег ма! Рго Азр Рго Суб 5ег Азп Сувз 5ег 20 25 30
Аа сіу ТиПг Рібе Су5з сЇу Гуз Азп ІІе сіп сі Ге Су5 Меїс Рго Суз 35 40 45
Рго бег Азп бег Ре 5ег 5ег ТИг 5ег с1Їу сіп Гуз АЇа Суз Азп ма! 60 50 сСу5 Ага Гуз Суз сі сіу ма! Ре Агуд Тиг о Гуз Гуз січ Су5з бег 5ег 65 70 75 80
ТиИг о бег АЗзп АїЇа ма! Су5з сіи Суз ма! Рго сіу Рпе Аг4д Суз Гей СсС1У 85 90 95 55
Аа сіу Суз Аіа Меє Су5з сі сі Туг Су5з сіп сіп сіу сіп сЇи Геи 100 105 110
Тиг о сіп січ сіу Су5 Гуз Азр Суз бег РНпе с1у ТНг РНе Азп А5р Си бо 115 120 125 си Ні сіу ма! Су5 Агд Рго Тгр ТИг Азр Су 5ег їеци Аїа су Гуз 130 135 140
Рго ма! Геи Мет Азп сіу ТНИг Гуз АЇа Агуд Азр ма! ма! Су с1у Рго 145 150 155 160
Агд Рго ТИг Ар Ре бег Рго сіу ТИг Рго бег Тиг ТиИг Меє Рго ма! 165 170 175
Рго сіу сіу сЇи Ргкго сіу Ні Тк 5ег Ні ма! те ІІе РНе РНе Ге 180 185 190
Аіа їеи Меє б5ег ТПг АіЇа ма! Ре ма! Ге ма! б5ег Туг Ге Аїа Геи 195 200 205
Агу Ре 5ег ма! ма! сіп сіп сіу Агд уз Гуз Ге їеу Туг ІїЇе маї 210 215 220
Гуз сп Рго Ре Гей Гуз Рго АЇа сіп ТНг ма! сіп сіи сій Азр діа 225 230 235 240
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго си сім сіи сій сІу сій Су си І ей 245 250 255 «210» 136 «2115 255 «212» РЕТ «213» оходопса агїгісапа (дфриканський слон) «4А00» 136 мес сіу Азп сіу Туг Туг Азп Меї ма! АЇїа Тиг ма! гей їеи ма! Меє зо 1 5 10 15
Ап Рпе сій Агд Тпг сіу Аїа ма! сіп Азр 5ег Суз Ага Азр Суз Геи 20 25 30
АЇа сіу ТиИг Туг Суз ма! губ Азп сі 5ег сіп ІчІІе Су5 5ег Рго Су 35 40 45
Рго Геи Азп бег РПе бег бег ТИг сіу сіу сіп Меє Азп Суз Азр Меї 50 55 бо
Суз Агд Гуз Суз сі сіу ма! Рпе Гуз ТНг Гуз Агуд Аїа Суз 5ег Рго 65 70 75 80
ТИг Агуд Ар АТа сі Су5 сої Суз ма! б5ег с1іу Рпе Ні5 Су Ге с1у 85 90 95
АІїа сіу Суз ТиИг Меє Суз сіп сіп д5р Су Гуз сіп с1у сіп си Геи 100 105 110
Тйг Гуз сої сіу Суз Гуз Ар Суз Суб Ге сіу ТиИг Рпе Азп А5р сп 115 120 125
Гуз Азп с1у ІІе Суз Агуд Рго Тгр ТИг Азп Суз 5ег ей сій су Гуз 130 135 140 5зег ма! Ге АїЇа Азп сіу ТИг оГуз Гуз Агуд Азр ма! Ма! Су су Рго 145 150 155 160
Рго Аїа АЇа Ар бег Ре Рго А5зр ТИг бег б5ег ма! Тиг ма! Рго діа бо 165 170 175
Рго си Ага Гуз Рго А5р Ні Ні Рго сп Іїе т11е ТНг РНПе РНе Ге 180 185 190
АЇа ге ІІе 5ег АЇа діа Ге їеи Ре Ге ма! РНпе РНе Геи маї маї 195 200 205
Агуд Рпе 5ег ма!Ї АїЇа Гу Тгр су Агд Гуз Гу5 Ге Ге Туг ІІе РНе 210 215 220
Гуз сп Рго Ре ІЇе Гуз Рго ма! сіп ТНг Аїа сіп сіи сій Ар сі1у 225 230 235 240
Суз бег Суз Агуд Рпе Рго си сім сіи сій сІу дА5р Су си ї ей

Claims (6)

245 250 255 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Мультиспецифічне антитіло, яке містить: (І) перше зв'язувальне плече, що містить першу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО40, де зазначена перша антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого ланцюга СОКІ, СОК2 та СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 1, 2 та 3, відповідно, і варіабельні області легкого ланцюга СОКІ, СОК2 та СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮ МО: 4, УТ5 та 5, відповідно; та першу константну послідовність важкого ланцюга (СН); (ІЇ) друге зв'язувальне плече, що містить другу антигензв'язувальну область, пов'язану з людським СО137, де зазначена друга антигензв'язувальна область включає варіабельні області важкого ланцюга СОКІ, СОКО2 та СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 5ЕО ІЮО МО: 64, 65 та 66, відповідно, і варіабельні області легкого ланцюга СОКІ, СОК2 та СОКЗ, що мають послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮ МО: 67, СА5 та 68, відповідно; і Зо другу константну послідовність важкого ланцюга (СН).
2. Мультиспецифічне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що вказана перша антигензв'язувальна область включає першу варіабельну послідовність важкого ланцюга (УН) і першу варіабельну послідовність легкого ланцюга (МІ), причому зазначена друга антигензв'язувальна область включає другу послідовність УН і другу послідовність МІ., ї кожна з зазначених першої і другої послідовностей МН і МІ. містить три послідовності СОК, СОКІ, СОК2 і СОКЗ, відповідно, і чотири каркасні послідовності ЕК1, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4, відповідно.
3. Мультиспецифічне антитіло за п. 2, яке відрізняється тим, що зазначена послідовність МН першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 70 9У»,, щонайменше 75 9), щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 99 або 100 95 ідентична з щонайменше однією з 5ЕО ІЮО МО: 117 і 6.
4. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 2-3, яке відрізняється тим, що зазначена послідовність МІ. першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 96, щонайменше 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 99 або 100 95 ідентична з щонайменше однією з 5ЕО ІО МО: 121 ї 7.
5. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 2-4, яке відрізняється тим, що зазначена послідовність МН першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 70 96, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 90, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 99 або 100 95 ідентична з 5ЕО ІЮ МО: 117; і де зазначена послідовність МІ першої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 уо, щонайменше 99 або 100 95 ідентична з 5ЕО ІЮ МО: 121.
6. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 2-5, яке відрізняється тим, що зазначена послідовність УН другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 96, щонайменше 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 99 або 100 95 ідентична з щонайменше однією з 5ЕО ІЮО МО: 1231 69. 60 7. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 2-6, яке відрізняється тим, що зазначена послідовність МІ. другої антигензв'язувальної області включає амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 96, щонайменше 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 99 або 100 95 ідентична з щонайменше однією з 5ЕО ІЮО МО: 127 і 70.
8. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 2-7, яке відрізняється тим, що зазначена послідовність МН і зазначена послідовність МІ другої антигензв'язувальної області містять амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 70 95, щонайменше 75 96, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 97 95, щонайменше 99 або 100 95 ідентична з 5ЕО ІЮ МО: 123 і ЗЕО ІО МО: 127, відповідно.
9. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що (Ї) вказане перше зв'язувальне плече включає перший важкий ланцюг, який містить послідовність варіабельної області першого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність першого важкого ланцюга (СН), і перший легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність першого легкого ланцюга (МІ), ії (І) вказане друге зв'язувальне плече включає другий важкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого важкого ланцюга (МН) і константну послідовність другого важкого ланцюга (СН), і другий легкий ланцюг, який містить варіабельну послідовність другого легкого ланцюга (МІ).
10. Мультиспецифічне антитіло за п. 9, яке відрізняється тим, що зазначений перший легкий ланцюг додатково включає константну послідовність першого легкого ланцюга (СІ), а зазначений другий легкий ланцюг додатково включає константну послідовність другого легкого ланцюга (СІ).
11. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що перша антигензв'язувальна область отримана з мишачого антитіла.
12. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що перша антигензв'язувальна область отримана з гуманізованого антитіла.
13. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що перше зв'язувальне плече отримане з повнорозмірного антитіла.
14. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що перше зв'язувальне плече отримане з повнорозмірного антитіла Їдс1, А (лямбда) або Ідс1, Кк (каппа).
15. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що друга антигензв'язувальна область отримана з кролячого антитіла.
16. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що друга антигензв'язувальна область отримана з гуманізованого антитіла.
17. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що друге зв'язувальне плече отримане з повнорозмірного антитіла.
18. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що друге зв'язувальне плече отримане з повнорозмірного антитіла ІдС1, А (лямбда) або ІдС1, Кк (каппа).
19. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що кожна з першої і другої антигензв'язувальних областей отримана з гуманізованого антитіла.
20. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що кожне з першого і другого зв'язувального плеча отримане з повнорозмірного антитіла.
21. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що кожне з першого і другого зв'язувальних плечей отримане з повнорозмірного антитіла Ідс1, А (лямбда) або ІдсС1, к (каппа).
22. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначений перший і зазначений другий важкі ланцюги належать до ізотипу до, що має підклас, вибраний з групи, яка складається з Ідс1, Ідо2, ІдОЗ і ІДС.
23. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 9-22, яке відрізняється тим, що кожний з вказаних першого і другого важких ланцюгів містить щонайменше шарнірну область, область СН2г і СНЗ.
24. Мультиспецифічне антитіло за п. 23, яке відрізняється тим, що області СНЗ3 першого і другого важких ланцюгів містять асиметричні мутації.
25. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 9-24, яке відрізняється тим, що в зазначеному першому важкому ланцюзі щонайменше одна з амінокислот в положеннях, які відповідають положенням, відповідно згаданим в групі, яка складається з 7366, І 368, К370, 0399, 405, 7407 і К409 в важкому ланцюзі їдс51 людини, відповідно до нумерації ЕЄО, була замінена, і в зазначеному другому важкому ланцюзі щонайменше одна з амінокислот в положеннях, які відповідають положенням, відповідно згаданим групі, яка складається з 7366, І 368, К370, 0399, 60 Е405, у407 і К409 у важкому ланцюзі Їдс1 людини, відповідно до нумерації Є була замінена, і де зазначений перший і другий важкі ланцюги не замінені в однакових положеннях.
26. Мультиспецифічне антитіло за п. 25, яке відрізняється тим, що (ії) амінокислота в положенні, яке відповідає Е405 важкого ланцюга ІдОс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Ї у зазначеному першому важкому ланцюзі, а амінокислота в положенні, яке відповідає К409 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БЮ є К у зазначеному другому важкому ланцюзі, або (ії) амінокислота в положенні, яке відповідає К.409 важкого ланцюга ЇдС1 людини, відповідно до нумерації ЕМО, є К у зазначеному першому важкому ланцюзі, і амінокислота в положенні, яке відповідає Е405 важкого ланцюга ІдОс1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Ї у зазначеному другому важкому ланцюзі.
27. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що вказане антитіло включає перший і другий важкі ланцюги, і де вказане антитіло індукує Ес- опосередковану ефекторну функцію меншою мірою в порівнянні з мультиспецифічним антитілом, яке містить такі ж першу і другу антигензв'язувальні області і два важкі ланцюги, що містять шарнірну область ЇдДС1 людини, області СН2 і СНЗ.
28. Мультиспецифічне антитіло за п. 27, яке відрізняється тим, що зазначені перший і другий важкі ланцюги модифіковані таким чином, що мультиспецифічне антитіло індукує Ес- опосередковану ефекторну функцію меншою мірою в порівнянні з мультиспецифічним антитілом, яке є ідентичним, за винятком того, що воно включає немодифікований перший і другий важкі ланцюги.
29. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 27-28, яке відрізняється тим, що зазначену Ес- опосередковану ефекторну функцію визначають відносно зв'язування з Есу-рецепторами, зв'язування з С14 або індукції Ес-опосередкованого перехресного зв'язування Еск.
30. Мультиспецифічне антитіло за п. 29, яке відрізняється тим, що зазначену Ес- опосередковану ефекторну функцію визначають відносно зв'язування з С14.
31. Мультиспецифічне антитіло за п. 30, яке відрізняється тим, що константні послідовності зазначених першого і другого важкого і легкого ланцюгів були модифіковані таким чином, що зв'язування Сід із зазначеним мультиспецифічним антитілом знижене в порівнянні з біспецифічним антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 9б5, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 97 або на 100 95, де зв'язування С14 визначають за допомогою ІФА.
32. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що вказане антитіло включає перший і другий важкі ланцюги, де щонайменше в одному із зазначених першого і другого важких ланцюгів одна або більше амінокислот в положеннях, що відповідають положенням 1234, 1235. 0265, М297 і РЗЗІ важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації БО, неє ГГ, , 0, М і Р, відповідно.
33. Мультиспецифічне антитіло за п. 32, яке відрізняється тим, що положення, які відповідають положенням 1234 і 1235 важкого ланцюга ЇдД01 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є ЕР і Е, відповідно, в зазначених першому і другому важких ланцюгах.
34. Мультиспецифічне антитіло за п. 33, яке відрізняється тим, що положення, які відповідають положенням 1 234, І 235 і 0265 важкого ланцюга Ід1 людини, відповідно до нумерації ЕМ, є Е, Е і А, відповідно, в зазначених першому і другому важких ланцюгах.
35. Мультиспецифічне антитіло за п. 34, яке відрізняється тим, що положення, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 важкого ланцюга ІЇдс1 людини, відповідно до нумерації БО як першого важкого ланцюга, так і другого важкого ланцюга, є Е, Е і А, відповідно, і де (Її) положення, яке відповідає Е405 важкого ланцюга 951 людини, відповідно до нумерації ЄЮ першого важкого ланцюга, є ГЇ, і положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга ІдС1 людини, відповідно до нумерації БЮ другого важкого ланцюга є К, або (ії) положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга ІдС1 людини, відповідно до нумерації ЕО першого важкого ланцюга, є К, і положення, яке відповідає Е405 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ другого важкого ланцюга, є Г.
36. Мультиспецифічне антитіло за п. 33, яке відрізняється тим, що положення, які відповідають положенням 1 234 і 235 важкого ланцюга Ідс1 людини, відповідно до нумерації БО як першого важкого ланцюга, так і другого важкого ланцюга, є Е і Е, відповідно, і де (ї) положення, яке відповідає Е405 важкого ланцюга Їдс01 людини, відповідно до нумерації ЕЮ першого важкого ланцюга, є ГІ, і положення, яке відповідає К.409 важкого ланцюга ІдДО1 людини, відповідно до нумерації ЄЮ другого важкого ланцюга, є ЕК, або (ії) положення, яке відповідає К409 важкого ланцюга Їдс1 людини, відповідно до нумерації БО першого важкого ланцюга, є К, і положення, яке відповідає Е405 важкого ланцюга ІдсС1 людини, відповідно до нумерації ЕО другого важкого ланцюга, є І. 60 37. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що вказане антитіло здатне до перехресного зшивання першої клітини, яка експресує людський С040, і другої клітини, яка експресує СО137 людини.
38. Мультиспецифічне антитіло за п. 37, яке відрізняється тим, що зазначене зшивання визначають за допомогою аналізу з використанням першої клітинної лінії, яка експресує людський СО40, і другої клітинної лінії, яка експресує СО137 людини, і де або перша, або друга клітинна лінія включає репортерну структуру, яка утворюється в результаті продукування вимірюваного репортера при активації МЕ-кКВ.
39. Мультиспецифічне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що вказане антитіло індукує і/або посилює проліферацію Т-клітин.
40. Мультиспецифічне антитіло за п. 39, яке відрізняється тим, що зазначені Т-клітини є ср4-Т-клітинами і/або СО8-Т-клітинами.
41. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 39-40, яке відрізняється тим, що зазначену індукцію або посилення проліферації Т-клітин визначають шляхом субоптимальної активації Т- клітин в пулі РВМО.
42. Мультиспецифічне антитіло за п. 41, яке відрізняється тим, що субоптимальну активацію визначають шляхом титрування концентрації антитіла проти СОЗ, який додається в пул РВМС, вимірювання Т-клітинної проліферації і вибору концентрації антитіла проти СОЗ, яка призводить до низької проліферації Т-клітин, але дозволяє подальше посилення проліферації Т-клітин.
43. Мультиспецифічне антитіло за п. 39-40, яке відрізняється тим, що проліферацію Т-клітин вимірюють шляхом спільного культивування Т-клітин, які експресують специфічний Т-клітинний рецептор (ТСК), з дендритними клітинами (ОС), презентуючими відповідний антиген на головному комплексі гістосумісності, який розпізнається ТОК.
44. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 39-40, яке відрізняється тим, що зазначені Т- клітини є лімфоцитами, інфільтруючими пухлину (ТІЇ), ії зазначену індукцію або посилення проліферації ТІЇ. визначають шляхом інкубації зразка пухлини людини з інтерлейкіном-2 (ІІ -2) і зазначеним антитілом, а також шляхом виділення і підрахунку ТІЇ. після інкубації протягом періоду від близько 10 днів до близько 14 днів.
45. Мультиспецифічне антитіло за п. 44, яке відрізняється тим, що зазначена пухлина людини є меланомою або пухлиною недрібноклітинного раку легенів (М5СІ С).
46. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що вказане антитіло є біспецифічним антитілом.
47. Нуклеїнова кислота, яка кодує одну або більше амінокислотних послідовностей за пп. 1-46.
48. Нуклеїнова кислота, що кодує мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 1-46.
49. Експресуючий вектор, який містить нуклеїнову кислоту за одним з пп. 47-48.
50. Клітина-хазяїн, яка містить нуклеїнову кислоту за одним з пп. 47 або 48 або експресуючий вектор за п. 49.
51. Клітина-хазяїн за п. 50, яка відрізняється тим, що зазначена клітина-хазяїн є рекомбінантною еукаріотичною, рекомбінантною прокаріотичною або рекомбінантною мікробною клітиною-хазяїном.
52. Композиція анти-СО40хСО137, що містить мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 1-46, нуклеїнові кислоти за одним з пп. 47 і 48, експресуючий вектор за п. 49 або клітину-хазяїн за одним з пп. 50 і 51.
53. Композиція за п. 52, яка є фармацевтичною композицією.
54. Фармацевтична композиція за п. 53, яка додатково включає фармацевтично прийнятний носій.
55. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 1-46, нуклеїнова кислота за п. 47 або 48, експресуючий вектор за п. 49, клітина-хазяїн за п. 50 або 51, композиція за п. 52 або фармацевтична композиція за п. 53 або 54 для застосування у вигляді лікарського засобу для лікування раку.
56. Мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 1-46, нуклеїнова кислота за п. 47 або 48, експресуючий вектор за п. 49, клітина-хазяїн за п. 50 або 51, композиція за п. 52 або фармацевтична композиція за п. 53 або 54 для застосування при лікуванні раку.
57. Мультиспецифічне антитіло, нуклеїнова кислота, експресуючий вектор, клітина-хазяїн або композиція для застосування за п. 55 або 56, де рак вибраний з групи, яка складається з меланоми, раку легень, раку молочної залози, раку товстої кишки, раку нирки, раку шийки матки і раку передміхурової залози, як наприклад недрібноклітинного раку легень (МЗСІ С) або меланоми.
58. Спосіб лікування захворювання, який передбачає введення мультиспецифічного антитіла за одним з пп. 1-46, нуклеїнової кислоти за п. 47 або 48, експресуючого вектора за п. 49, клітини- 60 хазяїна за п. 50 або 51, композиції за п. 52 або фармацевтичної композиції за п. 53 або 54 пацієнтові, який цього потребує.
59. Застосування мультиспецифічного антитіла за одним з пп. 1-46, нуклеїнової кислоти за п. 47 або 48, експресуючого вектора за п. 49, клітини-хазяїна за п. 50 або 51, композиції за п. 52 або фармацевтичної композиції за п. 53 або 54 для виготовлення лікарського засобу для лікування раку.
60. Спосіб або застосування за одним з пп. 55-59, який відрізняється тим, що спосіб або застосування призначені для застосування в комбінації з одним або більше додатковими терапевтичними агентами, такими як хіміотерапевтичний агент.
61. Спосіб отримання біспецифічного антитіла за п. 46, який включає стадії: а) забезпечення першого антитіла, яке містить область Ес, причому зазначена область Ес включає першу область СНЗ; р) забезпечення другого антитіла, яке містить другу область Ес, причому зазначена область Ес включає другу область СНЗ, де перше антитіло є антитілом проти СО40, яке містить дві перші антигензв'язувальних області за одним з пп. 1-46, і друге антитіло є антитілом проти СО137, яке містить дві другі антигензв'язувальних області за одним з пп. 1-46 або навпаки; і де послідовності зазначених першої і другої областей СНЗ є різними і є такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою областями СНЗ сильніша, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої і другої областей СНЗ; с) інкубування зазначеного першого антитіла разом із зазначеним другим антитілом за відновлювальних умов; і а) отримання зазначеного біспецифічного антитіла СО40хСО137.
62. Спосіб детектування того, чи відбувається перехресне зв'язування між СО40- і СО137- експресуючими клітинами в зразку, отриманому від пацієнта, такому як зразок крові, зразок лімфатичного вузла або зразок кісткового мозку, після введення мультиспецифічного антитіла за одним з пп. 1-46, який передбачає стадії: ї) контакт зразка з мультиспецифічним антитілом за одним з пп. 1-46 за умов, які забезпечують утворення комплексу між зазначеним мультиспецифічним антитілом і клітинами, які експресують СО40 і СО137; і її) аналіз того, чи був утворений комплекс.
63. Набір для детектування перехресного зв'язування між СО40- і СО137-експресуючими клітинами в зразку, отриманому від пацієнта, такому як зразок крові, зразок лімфатичного вузла або зразок кісткового мозку, який включає: ії) мультиспецифічне антитіло за одним з пп. 1-46; і її) спосіб застосування зазначеного набору.
ї я Людима СЕМБО МИМАКІ (2 я--- МОМЕСУМЕУАТ СОУ КЕНТАВР СВМСРАСТКОТММЕНОТИ Шари (хр розлїз53і (3) моптІМоцЕТНЕ АТ сни кн о спас Дикий хабано (хр ОО5Б65025у (5 Моро руде в ув ще весно оте В В 51 100 Людима СТВО НОМАМУ (46) еРОСРУНЯКОЕАОСОВТОПТОВОСКОИРКТАКЕСВВТОМАКОВОТРОКНОТ, Шари (Ж 03313533) (51 БЕСРІНакЗЕВОвоМЕСОВеВ У В АСВ МАО ВВС шряшии Жибав схе обхБеногяк Сі месофнек еВ ви с ет кове тА В Весь 103 о Людина 48МБО МИМАКІ Єв) БАЕСВМСВОрСКОВОКТТККОСКОССКОТкМВОКех еко ьОшка Жари (ХР пОзат3533У 1013 пвВОДМОВОрСкОоСовКт оси роовтЕмоо кет овртмся ЦДкВ дикий хабак схе бохевобойнсвак пдосфчеве ково вІтИоскоесте мов овен зба 155 дов люлмиа ІТМНЯ НИМАМІ (Раб) УТУМСТКЕВОУУСОРЕРАОП РОВУ ТРЕАРАВЕРОНЕВОТІ КЕНІЇ Шари хг боз4у35а3К (їв ЗИМИ Вос Ко УРЕ НДНННВОТ УДК дижий кабан (хо поБебноз стати УЦфоткакрУчссвко цу вод ее фон те кра ОК -О Мюмузна ІЖМВО НУМАМ) (196 яТАББЕОБЕЕКТОВЕЯМУККОКККРОТІЕКОРЕКВеуУЄтТуОвиООсясВЕ Шари (ХР бОЗ4ІЗ533) (281) ЩА ЕИЕКІ ЙДЕ ДКВС ЕКОРЕВК Ота кООсясВЕ дикий хабан СХР ОбІБОБОгОКІВОІУ ТАТИ М ВУ ВК КеІ т УКОр ЕВ Ох сесвх я з Лющима сКМКО НОМеНу аби вЕБЕКОшН, Шари ХР бО34195335 (251) БЕБЕКЕОДСЕЬ Дорн кабаш їм ОпуСраЮИЗ ги БЕБЕКІЕВИВх ї ТКУ НЕЖААК жести зицексіях катка ПЕЗ КА ПОКІСКИО АТК ВК КОСТИК БМ ВС КІ НВК сихжівіовннт о ПеремішуВаННЯ хоттхн КВ ВОВНУ С ОВВНВКВВВ ВЕК ВЕК ВВ ЗВ еВ КВУ СИЛЕКМ подат ЗМБКІСМТУЮТЬКІ МІ КВТ ОКО ОККО КАТ АХ ЗАКО УК УТ ОВК КОДИ, ТИКИ тка Ваз САМ ЗТИКа ВОМВАН сво Є МОКЛгХо КІ КТЕНЕВуИ КОКОСА ВІКА КОМ В КТК ВСІ УА КК КЕКВ КК УСТ У КИ ьтЯ в. ДЯК НОМ хво ка. 3 АКБ СЖИИЖАТУ С ЖІЧЕСМТауу роси Е А ЕрюЮюі СТРОКУ КАКО ТО СКОТТ БАКА Ко ВУС
В.В ЦД овове Я ВОКЯСУКТУЮ ТІ МО КЕТИ ОК СІМСЬ АЯКС КК ОКР КВК КОСУ ЕТя Ки А І ПВ ОВК ІК к а яка ТНК НиумАМ ЯК КККИСОУ ЧА. КУГЖЕВТА У КОРМ К АТ ЮК ВСУ ЕМВ ВВ ТВ УК В МВА СВК ТИ СТУК КОТЮК ВТК ККУ КЕКВ КИМ т. ЯКкя МНИОМАК Ка В ВИК СУМКА ТУ КК НК Ко о В В М В СОКУ е КАКЯВТОВСИЮКУсУКО ух КСВ СУМА ТО БОКИ СОрск ин емо скаси Кс оКОвІ СНеКТк ди и мокавтвок кв ткана асани птввнаки сх пе вл са ЕСЕ ек века ек вакани МоКР.ФИЮВКОХ віях с увевкт я рет ВИ ЕНН ть ака кнаскнть вки кн ПВ вс ЕХ че їю ще в я ще -о тв зв зх зв ще жк
З. ТЯ ОМА КЕН ТКЕВ УВА УМРТАРАВЕООНІ УВІ І РЕАК УТА КВК ТАНЕ КА У ТНЕУ КСВ ТОВ НЕВААН зіабіа ї ЕБКИОК УМ МВ КАСУ РІВ "ОІВ кеВ ЕК А ТЕТА КК ВЕСТ Й КУ УЧКИИККІ КК ОР КМНАТУТО ВВС СВе ов кЕаС Пен сннноосттн ВК онтуютюутттттттнннння З ТНКО АЛИАНаИЙеЙ 0 СеКООК УЮ ВО Вр АБИ НКР ЯРУ ТАКЕКЕК ТВ ЯУ ФК ЮВАКЦі я КАФРЕМКУУЧ ТЕКС АВК «Перемішування д.ТМНО НЕВІДОМО КОКО УКУ ККУ ЖАВ ХР ЦАСУИТРРАНАНКУСНІРО Е РКК, УВК ІІ ЕК: ТІК КОНИК КУ РИМА УВО ОАЕ РЕЖЕНОВСЯК МНН ул дуття ння БІМНЯІКНАКНЯНИНЯ Сто У УНК УС АФК ЗРНАЕУУТРРАКАНЕР НУ ГУКА ІЗ КЕРУ ТАКА ЗАСН У КК РІС ЯСНЕ. ПУ схстуя няння о ТМНЯ МАМАМИ С СБКОК БУ КЕН РАЗ ОАБУІ НИ АРАЙЕРННЕРЦІ УКРА УСТА КІКЕСА АЕН КІ КИМ ТОВ КСВ РАЕС МВВ ол ут ус тету зетення У ТННВ НЮМАММНМеЄ СЗКООКТ НО РАВ ЯКА ААНВ КИМ КРАЛИ УТА КК МЕКІТУ ВКА КНЕУ КЕР ОВУ АРІ Перемішування п ния ХР ов ОО Во в ов С ден тьотя СВК о; сі ВК ов Ко Усву в екеКОСть КІСТ НЄ ВИК де КВ АН ся .
Фіг. 2 Людина, Контроль: дикий тип «Дикий кабан блон Перемішування ї Перемішування 2 ПеремішуванняЗ Перемішування4: Перемішування Перемішування Є інн з Інтенсивність флуоресценції (АРС)
Фіг. З
ВІЗУ шия Перемішування Перемішування Перемівування Перемінуазнияю. Перемнкування акіб2-396 зк1395361 ак3і15-138 «кб9-МІй кі Я ага? ще Дехийкабин Дихийхабин Дикий кабан Дикий кабан Слоно Дивийхабані Слоно 0 Дихвій кабан срізачві Ді А И т й ї А Ж і ой |. у хе ТЕ Я т. й їі і їжі їі ді ри й я г Я. «М 1 І Ша і і кі ї З рі 1 їі кі срізлоюх ЯЙ и, А А Я і гі я | ! | у т Мулннй ння, З Мннсов сення нн Знай. ; а м Те 1 няно небесних срізуоюз | Її КД /| | | | ! сну і ДІ Й : | ї І СЕ ак Бод і і ЩЕ НІ їй ! М як и ! сматюм Ї А АК БА ж й й й Кк ЩІ Гн ннннннниМ ДрннбтнснннннМ ей лннннннин 0 Меденннненняяй Мо еюннннянй Конні 0 Ж лннннножні | Мнений Конт мав От ї т ту вт шк УМ вд А А Й І А . ЩІ. її і ї В : ї: З НН НЕ Од : і ей. Я ; ЛШ: З ий ІД 1 ІД і і і З : З рі іі: їі : І д! и й Д А п її Кх І г А. і і і я і Я е ОРЕ рі Б і Іі Ві37-006 ! м ЕЕ | дк | ж Н | Я |: І ; й г | : і ; і г : і п : і ! ; КЕ й КО МО и г а в вббсшиниЯ Мнннбшнн Мннб слини МненбвннниМ М бо ненні | Звання па Зв'язування антитіла (АР)
Фіг. 4 пС0157 , , , , й ; Дикий тип. з Перемівування? Перемівування 2 ПеремішуванняЗ Перемішуваннях Перемішування Перемішуванняє у Слон о Дикий кабан Поліклональне / . /у | і ! і СВІЗІАВ | и и ' Сея ! ! | | | ї СО137-007 | ку я ІК Ї щі ! вин ДАЛА ТАК п и ух ! | 1. А Ал / Л, З, с0137-009 л | м і А Ні, со137-010. | й | ; ва і І ! а | 1: ШК і-й С0137-031 л | ДІ І | й Я І С0137-012 Лі | | М ; поточне ооо оточене у Зв'язування антитіла (АРС)
Фіг. 4 (продовження) Вихідні Гомодимери КЯПОХ планшети д и ; дні гомодимери каозК попереднього відсіву Тестовий планшет з гомодимерами КОЗА 24-, Я8-, 9б-лункові попіпропіленові од-лункові 2 Мп поліпропіленові 0000 96-пункові полівровленов; планшети з глибокими лунками -.Дланшети з глибокими лунками : кругодонні ппаншети З00 ми Под етстот 15 1111115) окісі5іє кієі8 11715 0 ЩЕ ТТ 1и 17181171 дикі і в сівіє кт нік ов с ате | тів ві 1 кі рев тет 07 ія тв 1-12... Приют.| вісі гів нігті кю в і фе с ате єв ТТ 7 11717117 вання | КШеісівї є є сік і а 1 МИР 5 сеатре | гів візок 1 р плахшеі В сів є ів візок! Р 5 є ет етя но ) плову НВ ВІ ов ін аю В сіні тя в МИНА ШАНИ МИНЕ НО НК НИ НЕ НА А реднь ою ВВ ТД дні нище п відсіву Гомодимери ЕЯО5І. планшети Тестовий планшет Вихідні гомодимери РЕК І попередчьсго відсіву : х з сумнишю гомодимерів 409. та РАОБІ. г4-, 48-, З8-пункові поліпропіленові еб-лункові 2 ми поліпоопіненові : с Зб-лункові поліпропіленові Планшети З глибокими лунками планшети з глибокими лунками : г кругюдовні планиюти 300 ми -Т 1515 | . ТЕН вет те а еТИ СТ кет : Я Вся «зів в В КВ МИ МИ МЕ НИК МК НО НИ Ж Пригату- ес Се ноятм вам Тек Ол 1 вання, | а 55 ків ві5 5 я8|51700М БЕ ов сві явне яв в Бк) С 1 одна 1 6 вів вів в вв ві з ееісвінвіяв! жів вв ві ві ва) АК дялоде- ! В егістіи гівно роз МИНИНА НИВИ НИ ПНО ЗИ НОНИ ЧК НА ЯНВ, педньо ДЛ ВДВ : інв квілаіяні вві ве) ві тв) кв) відсіву
Фіг. 5 о ях В де Є КК р ее ! г я в о ! що з сраб С0р137 й 5 о я ! Є що ва ОХ ! де Си іс УНК і - «« -6Ю :;3/ 6 я ь - «- 6565Б- їі -ойх Ср Сб5137 А НЕКЗЯЗ МЕК 137, рр ше НЕКгОЗ МРК СОМО «бо. Ве его вавававововаваговововавававововавававгвввгвававововававававовававававововаваи зго вавававововавававововавававововавававагомозмагввввававововававававововавававогой к5Ба. СрАО КБ дикий тив К5Б2 КОЗУ К5Б2. дини тип оессосоооооооговооооооооооооооооовввоооооооо: зоооооооооооооговоооооооооввоововвовововосовот зеоеооооооововооооогоооововооовоооооовововосох звооовоооовоооооооооооовозооооововововововооо Кк ВОХВ і ож нини - с ж же; І Я ее І че 8 ой шо чок І жк і Її о хош зда 5 зва: і ко і З же ва Б . ва іа, В зах яка Я віза за ше ! іху ов узі бее ак є що і - в я ще А я Її сц вкосвових се о. ; і ще і Е - г мк маса зу - шк 5; є Ме
Фо. 15 ке є ї Е ВІДДДД ри МКДДДКІ ух ху В КДД ун Дод роти йо о дою Роже і Я юв же Ф Е мож ! зак і ЇХ вок ! хо шок рожа ро кож - йо Во Ше аг ве 25, се ДО аж ях а ве ЯМ сжою р і якк | щі о | яке вах, В же дк" се; ово» ве ї сі зо Шо їожшк кожовію ! Фо ше ї как ; Колот ий чани см сіло со КК до КоКк видове зіккк ас Е 8 Вр х; чї хі і В чу г хе що що. У Е хо хе хо В кону. Мел Фіг 7
В НЕК2О3 МЕК СЄБІ37, вгр. Іше НЕКХУЗ МК СОЧО яр Ше "мііівівівівівівівівівівівівівівівівівівівівівівівівівініівівівівівінів кінні ніінівівінів нів війні нів івівівінівініінівівінівініініівінівініінінівінівініві "тівінівівівівівівівівівівівівівівінівівівівінівініівівівівів ній інівівівівініівівівівівінівінівівівійнінівінііві вів нівініінінівінівініінінівінівінівініінінінінівініінінівінівіні. к5Ба СО КБ5Б2. дикий тип К5Ба 137 Ж552 дикий тм ВД уникання ФІ ухлклялняня інн А АНА Ан ДЕ жк рентні ДЖ рулон яння А АНА АНАА АН нАнАнКя її с жк - що же як і їж жк 2 З В вк, ко ї 8 зе лову З те ков юко 1 ї Є кое дк і: ру я ох Ї 5 ? ! її хе зд г 1 Бесея ко і З жожУ до 1 яко: ог Ї Е ї » КУ б «ей я ої ою. ї що; зі как зок! мив До з ї хи в т пк " ї ше З чої жевжевяа ке : щ рах тої : "С - ни є 5 ї 3 6 дров ла Ам нік Док нка дй кн кю леж, ш ву - хх юх х 9 я Мох є и - ех " М хе зеохож
Ф х. Ж -
в 5. 5 Я юн нн п Її ї М ОВ вок Пооякев Об я роя ! -- їз хо ! хо ! я З ! корі і те В ше. Аж ок що : і х ро: ї ! : БО Я яко 0 на вл же Зо фо і сяту ! З ко рожі оооюь : ДОЖ А о мох жі зах ! т. дин І м "г ї ї 5 ох шк ! ові. і 5 зе І неї Кт з 1 хи ох і тесог З. і і і : В а нчччччнннн І , і і Ї і ж якої і яко: у ; чок ! ру і й й Ї. занувн-аліликн плюмнк сх лам ек яке ие З Ї слова ; ї двслишю Е 5 а х швом ч гі ви : кож юю радон Кони. інглмлі Ж
Фіг. 7 (продовження) С НЕКОЗ МК СО137, яр ис МНЕКЛУЗ МКК СОВА яр. ше паза аа. ваазааааааваааааааававааааваааававааааааваааааававаааааавааааааваааааааааааааааа аа ках срад КБ дикий тил К5БІ СТІ 37 КБ. дикий тип Ї; нн нн нн мий ча о 4 ОХ, рун ДОД риття Ж вояк якх ! 5 м зе В ах жабу. : ї Б я зав об те бу я ох : г Тр жом зо : 8 я хід . : 8 лк залі і й же за жа Зак таж, Еш - Ж я : т в яке зи до 1 ов - . ява . й 5 гекієжу сі зе Ка х. я оду ь 8 вв с з ш- 1 ю ж й шо ки Мо х з 1 У Ки ох 5 й сі сх Ж ХЕ фа бр сх 00 МКОВ ре ее тт ткеттту 0 ВВ ке й в «ке Її Аж і БЕ Де ще в роз ОЗ х зер охо Тосщоз АН як Ос мар зох і - сю г 8 б Що ков: я рож Ж жахи ж х зх ТО ов дет і ой ох кет ! ох їж В олег де зх 18 зов ПИ
ПОС. то ех пекан : З : Жах 157 ж шк ж й й ; високої З якими с й мкс хххож з
Б У. г хо ме хожх Декан й ЖОВ, ї хх що Ж що є че ся зо Зх коми. Геглми
ФІГ. 7 (продовження)
о НЕК?9У5 МЕК КЗЗ. троє НЕК?93 МК СОЛО втр ше пекар роді рі оо ііі і павлвававвввавввававваававаааавввавлвииаввалваввааааввалавввааавввававалаавваааавваааалаааааааааваний КІ сод4о КБ дикий ТИЙ КБ СО137 КидО дикий ний йд вв реетттттттттттттттттяя Ко ренту ВЕ ЖК у дід рент Б Е в ох Е хе Ко здаву і є яке ! о Те ко Кок і ко і зо ТР жор і ово : Х як ож шк й , - і о ж 1 « ж ке но ов віта яа че 4 щроае меважиув ня ТА Гооое Як р ояе . ТЯ жи вокоє В і Я уродж ке воомнксекеькикй є с сдка. Е ре Фе т с с у м ся ос в й ХУ хо НХ о КЕ х С же оз: Я опе ої - Ж Ж М й шо кох важо і з ШОВ й я «хо іо жу яке : ВЕ Т -о ков же яко і ЕВ божа аю Її Вже якос. : х Зк Б і й ях мк і т ЖЖ ож ох. КОЖ о сх я : ДЖ А В зов й см ! ей Ден жк яр, ж ово МИЖТ жде ро кеетеннют к хі У З уд -Е ! і ок торі : Е В ФК КА ді КУ КддинкАЮВ, як днзлюжк ТК КВК. дод 5 утиски, денні з х її т її іст і у жо ЩО « хо м мож т - ЖК Ковнц. Інг/мя
Фіг. 7 (продовження) Е НЕКОЯЗ МК СО137 рр ве НЕКЛОЇ МЕК СО4О дір. ше мапплнинннннннанининнннпавининипипапанинипа пива пинини вилити и и иа чипипипапанинининапанининипапапининиппппппинипи попи ли и и и ин кг сао К5БІ дикий тий КУЄ: СО137 К5Ба дикий тип папи вапном: винними. пава апавававвававпамвватааттнн й йо БУ рт тт юю 0 ВЩІЙ реко т окт ; ання Ян зе я Її Же Од р За І м ! м які Гоа рощя ро а о роках і де | о: ОО вка і Як І с | ; дз рені | З ше «тілі яв тат ж ро І дк ВЕ ваті з т жи . то юе іо завх | ко ! У жу З зве зу роб Тож В в КІ че яю х ХЕ о Ж ч ж ж що юю ї х що сюйо с оон ЕЕ ШЕ с З ЩЕ Е Б зів се: Я нини ЩО др ум ланАААААААААААААААА АННА Уфдунннтнттнннннннжннженженжтнжттктнкнння Ге во У. ї х ' ії Б В і -кг ож Роже мя рова Б як ож о їх яю як сок ка Р і ШЕ он б че яти о о З якої б жо ит в В ще б'я Ж же Й 1 же Хор С вт ОБ; ж во й Її ве зо і ї пОЖ вич я 1 з 5 ' кр хх фр ве КУ ї ою їм уд і з тата Б | до У роар дик Ша " З рі кох -- Тоояаще ог ровек 5 що Ї що ; чої Р чав її й сок Кік но зай імкі нн ві іКК апетит тан 5 сю собакою ! . х з ч Мао кв ї У ве ВО ши прнкамік нні дин нн кійкснмнной Кониу. НМА!
Фіг. 7 (продовження)
Е НЕК2О3 НЕК СБІЗ7 бр НЕКООЗ МК СОЛО яв лис мегогеовогоововоововеововеововеввовеововеововеввовеововеввоввововеввовеввовеввовеввоввввоввовогвого «оовввавававававввааававававачавававававаававввавааааавввввввавававававачававававававававовававами К5БІ СВай КБНІ. ДИКИЙ тип Как Ср137 КБ: ДИКИЙ Тип песеотеетентетеотететеетттететестетення пееотентететентететт нетто потоне тоететететевтентн зпотететеетеоттеотетет тестове ДЯ руту тет тент, ЯК у 5 УК ру вн Ж що ї ще їм же і хок : Б як роякЕ То вх І зохі і фожв; се В от -рожек гояаеь ро Ок : ла зи їжак і т я роя і - зх ож іо ! кет : ТЗ зе ОВК оо і зкох « ; і До ла; роя ово «ера ер, що РОЖеЕ ТО Чкодожхь т і зжох ма : яння Я й ї й фанів нінкн, х врннінілеівносонв Вк Жов ой, з пре нновуск вектвр нн Кран вав кіз ввнани св - ТЕ ш Ж ; щ В щ Я ро дід рт ння нчннннннннят е дуття пф ртттннннннннннннннннннннннннннннннннння Еш З жу і зар З ЩЕ і як : вод 5 ек Її жк Я і і БЕ ово Соояек рощоех рок : З я як ОА не. ш й ТУ ся Н зе 1 У ок «де ча : 0 --д - Н 1 1 ом : бою : ; а док Тож і ож шля «8 зер ! де щоб зай жк 1 ще ШЕ їх Ї : о що хо І 3 То- ї шу : «ок м 2 І "Й ви лк ОР ШК я : І зей кхй В'я я ер 5 Тож 8 оон Роояе Бр й о пирня Тож ТОВяЖг їоВиЕк ! Ж о яЖ Ток й 3 ї хе : зі. і е й те аамев КН во сіломют кінні, емо мам В Ки В яні МАххи іт ММ вк ність, , ліжок яких піокй Ж В У Ох т - ях ? « жов Венері хідні нка, конц. (нгімиї . ,
Фіг. 7 (продовження) б НЕК?293 МЕК. СОП1З7 дв Є НЕК2ОЗ НЕК СБЯО рр. Ше кава соб КАБ ДИКИЙ ТИЙ ква щи Кона ДИКИЙ ТИ ий. знов зн. пок Щ вер ре фр рент Жввреннннннння ; Божі і Що жожї хо і г яке ро ак ек яке РОК і яке В т Ще - : ; І ще, ! ; Я Я зав ро є Оу квт й М ході яв рожа вікі яке как - Ж ее зу жжкжир и ово ! як. Ки я яка х здо «3 ТУ яв і о: є У й. ч силі її ж. ух. Іф 1 ЩІ сх ш з о х в Кг І І 7 7 7 тт " якому дурне ккд кору -ко Кс її р З її ст НН С о ст С т п гЯ 8 і ом зош ТОВ жох і як : В бою з око око ! Бе рожа с Б І : а : ж Ж Во ох : В яке , рояер і ш А змо дос око йо: 00 ЖК ; З пе 5 ка . вхо ГО о г дотннвн нія Й шк ; Ї ; змо Вжа ноя ою Ор . І їх ії їі 55 Мо ду де аку ОБ в і як ко Ж Ж Ж г: хо. пай зво ож Гоявеь і в ХК ове зе жожоюой В вк і яву і а в а нію г СКК а у К х 7 ; ї 5 с ккіхауий дії 5 ї У У щу де у Я хх Зх ох гі х їх БЕ: ЕЕ хо Древо ккв ен Ж " в коні. ІВМмлі «
Фіг. 7 (продовження)
н НЕК2ОЗ МЕК СОЇТ37 вт ше НЕКТЯЗ МК СОЧО віро се знанні іні іні нні іні ін іно піні ніна 0 збеівеввінінініів о нінінініііі но нініініін а ніна інно ніссан сіні ко В КБ5БО ДИКИЙ Тип ке? ср137 К562 дикий тий папгопопапоповвовопапапава кооаапововватаниня оооооопоповвовоатано каноооапаповавванина епоооввовоатано каоооапапоаввоватанано поопоовоопапапаввовоктоповововатанаавно дО СВД рення ФО ренту КД учня ФДфріннннтнтнтнттнтнтнтнтнтнтн «4 хо їі я роя : і ї оо їв ТОЖ здав : щеку ї Жожер Гор ЕЕ з і як : Во як оди ші . вом ОО БЕ-най Ной БЕ 1 хе їі ож ж : ке ї х і і і 1 Н їх Може 1 ох Ії дя : я ї У зав Кок : х як : зе ; ро яр їх ( мк х : сх кох базі . Ка МЕ їмо і ща ві лати "ех «тк І по Ме дек Її «хх 1 щкожеЖх : же ї Е Тк хі ку де і Об яхь і тек : В а еннти ім лес нік как канів деенінкиннк нюх Ж кни ви вної деки кю уко ж й Вінник нас нАаідннлнкаию. Н ср : що «е ї г З хо Ух я х ке хх хе : те х З що: що ОВ х . а є окр і ву рен Е он ВКА А У В 5 дк як іо жкр ож і - Е Ток о щи : і ї ВК Є кі Її ежвр ро ! ект ! Ой ве кі Я я Ше 5 К : 1 ї І ї З З жк Тож Ве Гор : ХЕ Со Н 1 : мк З Я де с оде ій ояке і Б? Ж Я жк Тов іо Жоюже Тк і: ї ХА мок ; : ; 1 ? ек же о РО же «УТ же ак 0 В 5 хе КЕ щи ож : в : зе "т т Таб" ж і що щук їв : ох ї до 3 ЩЕ т 7 пеня и ут І "ї І ї х . 5 о в Тож : дух Тожек Н Е гі рек іконок, «пп о у т в . : ві. опер ох еднкн : Е ; їх «Е її Др ана п КД дод КаКщ про юку сек то, Ек ге ї « хх хх з х « дже юх 5 ху Ж г Ж 7 Е М хижа Кони. (г/м (нг шк Фіг, 7 (продовження) І НЕК?ЯЗ МАК СО137 тр Ве НЕКЯЗ МЕК СОЯ бі ис звгогововнвнввввввововвввввввввввн кнопок квввввввво в коннвнванооввввввввввввнвввввввнвии: 0 звдвввеввввввввввввввввввввввввввввкнововккевввовооккпвввькввввввввввоовввввввоводвввввввв Кб; СОдВ к5Б2. дикий тв кщаг 50137 К5БІ дикий тив мимо см мм. мм ву ях Ї вом; : я Тож : с і шкі Пов рожі : т Хо рожа ис і хі і тоже Роже рою і як ! ре хожку Її зо : З як : ях х : Ка Н с ї - : : що Козеее ї вк : как : х ож І ей Жак і і : Н х ї я : е «є : що ровжер Аз 5 у кі "зу що рожеве : М зах хв : які я : п уч хОЖЕ Ї хожь оо : я : Ж до ожек зба. що ОВ ої : ки я с. м шкл ж. ще г Хуст тя . і ж й Тир новою нс інно пен КК пре дракон у кю з ож що щ -Е й
Ж Х. ш МОУ ут нути ет Ме ДУ у тт чок т воОВ Фо ікру : оз зу : хі : Мо боже -ю М ЗК : НМ днини і хх ! Ощш геї . кт ї ї ОО ши У" Ще : : дог ом хо «а ї « Шех ДИ хх : ЩЕ КЕ хо й я Же ї Фриег 5 ші З : ЕЕ є, 1 ї виші : Во ех З, їж : де е ях : й 5 з й : деку І Ж з : хх ові з х Ії ї їх і Я : ЩО Ж ож у» шк ож Ге рт
"о. я Ко ї М де ї З, М ї 3 ЩЕ ке хх зх Н чої : « : : що що ди То : 8 ек І я : х Ї пнях : ї ї Й. : Щ : їх -х : жк х хар : мае : ї Н анти Дюк оф те ї : : З ФВ .сгетоводу спот дт Кк «Мет ІМ, дек М ОА КК М. ловакмк локКхж м Кк. К Ку евідуте То иовк КВК Ло, Ес ки АК ОК ть. х х хх 5 Ж У Ко у к Ж ОО Є Ох т х зм Ж 5 Ю я Гн Конц. знгмлі
Фіг. 7 - РІС 7 (продовження)
і НЕК293 МЕК СОІ37. Вір. с НЕКОВІ МЕК СОЛО рр. ве "пророк ррвр рр рр рр рр р рр рр рр рврнвр р рр рр рр рврнвр рр р рр рр рнвр р рин рририррр ори рр р рр ерирор рр ор оререрирть «апавапаванавававаааааавававааааавававававававававаааававаааааавававававававававаа вва вав». кава срав КОХ дикий тий к5в2 СОІ3У Каб дикий тип пипинии и вові реве рорроркоркрввкйн "мини нив «Оті кі кінні кіна кікініні кіна інінінікікінінатін кана натаніна канатик. ЛІ нікікі іні кін кінікі іні іні на кікі іні інінінінінінітінітіні ж дв яооко ТО вибрння ЯК рен Ве ява г як і В: о зав і в око і г : і В чаог яв. і дра ик і ой 5 і 6 Ко зи І а ог зах : ОО як ко і у в; зано ї А як ко і зді жах ї - . я ета М кої коді рообяаа ут зах зко І б вне ; їй як т ко " і - Я5 00 фреон сі а дл : є Я м г с : В, ро т «с ех хо ХЕ Ж м ее -- чок я с кг Ох хо З ю. з хо. тк Ж ; : уашн ВМО ну 5 ЖК век; іо ; шо : Жов У яв. Ж ов я Код я-е ! ях і мрожер : хх ж В яекг рою ; ТЗ і , Ї ОК ба Ток Я ак, «і ОВ хе мк ; | я хв во є 8 Ж ша; ді зх і я яко тва й з - свв Ел хх ре ОВО ЖЕ сит ЕОозажк і Боже; : я вк Б х роко і ї ї і А Ж ха і ах соя ак ї ОБ бета фун В рн ГУ : 8 7 Кк я лк хох х ще щ У хо БО Є Ковиу. |неїмлі - Фік. 7 (продовження) Кк НЕК2ЯЗ ВЕК ЄВІЗУ дер є НЕК2ЯЗ МЕК Сб яр Ше пиннннннннннннннн нн ннннньни нн нь нни нн ниж нь пінньниньнийннькиннькиннькиннькиьни апакннанннаннннан нан ааннна канаьнннйкнньнаинннанииааьнаиьнааьньаьньаьньиььних кана СОЯ КБ дикий тн К5Б2. 137 Кана ДИКИЙ ТИЙ мкл кИПИМИИИИИИИ ин. киш МІНИ. ДИ ЯКОЮ етична ння Ва рт де ттттттнннннннннннннннннннну 0 й ше Е ще ов т ке І Ж БО І ія к 1 й: х с.
ЗК. і ще ШО | яка: щожав І жа; жав за заз як ка В шу ро шк дж їй і з к . вро в хакі З і Аж і де Но т : : і Ж т, завів сяк мова я шов ме я вх Е з шву шо х дами Же ва 00щяк і ГО ояоь ї як і ов шоже роя ! Ж ще : жа і НН рон ок ! ш В роко ' ря і - ака ї око; і 85 ді 1 ще РОжояат шк ' яю: Тео та же й жо ож і ж втіха Ше В ща шк за Евер роко КУ 5 жк ! чок і 8 уд ! -е і Ж Х нені за сі яжо й «ев З с хі. ; : схо Е о я ярок : 5 ож ОО я а 5 й що хх Кеонц. (неймлі . фіг, 7 (продовження)
Е НЕК29З МЕК КФ137 ер. с НЕК293 МЕК КОАО вбр ше пов І авввололввввлавлввввввввлвввввввввввввавоввававававававлввввававввввавввававввовавававлававі кова СОдО К5Б2 дикий тип к5Б2 СБ137 К5Б52 дикий тип зогогогототвовгвгогютювововгвввтттню. зггггогогототовововготютввовгвтвттт. зеогоговововговововововгвгововввововтю чгогогоготововгогогоговововгвгввютввя фену ВД ун Федр 00 Хр -щ ющее ожжее го і : : : «і рок оожех роя : що жк ОБЖ : я : тої : Ф ж і кажу ОВ : кг : т хо ока го ожЕе : Зк : гоже од : В ку : З : х ході іовк оон, : св ек : дог як Ж хек з катар ово хек, зе їх : і я т : Є : кВ з в ро " Я «хз М : 5 ох, : З ї ще ор роОВЖг ге М. : «й ї схох п -- Дек у кн предок Дует есьнн дру орднмо, що, ,
5. ; їх З - : ж шо В р ДЕ ди оду Миття, шко Може 1 ді : Е І : : : ЕЕ У зі : і Боже : хоїЕ : а 5 єр ь і со рої : і : шо Бк : оті їодяжк : хі ! я с ї : т ї т ї х 1 : Ех 5 о : хуке н її ке : вні : Фк Фк : хих Рожа 1 хо : шва хх : ї Аа мину т : З су 1 же ТОМ ож у кі : Зо у ЖЕ я мк БОМ мот кб ЩО : дБ ж хі кої мові БО Откт ! «ее . і Б ж аж що : В ож ожЕк : зі: зх ях у : їх : жк роя З ме! - їй чі Ж «а юух ДТ : ту : т ве : : х : Кк в ЩУ ХХ фонннююннннниттиий : сад : е ї ї хи : ХЕ «охо 1 ї 009 яку : : : ч Шен мокя НЕ них теку ; : : г : т пу ух філол 5 Ду дноднн то анннв НЕД е В 7 8 охо МЕ В х Я меж преманае мен м тні конц. Інг/миї .
Фіг. 7 (продовження)
в12-БЕДІХСОЛО-001-РЕАК Б12-РЕДІхСОЮ137-005-РЕАК В12-РЕАЇхСВІ137-009-ТЕАК « З ! Б В12-РЕЛІХСО137-005-РЕАВ я / Б12-ЕЕДА/СВ137-009-ТЕАВ Кк Е В12-РЕДІ хСІ4О-О01-ЕЕДЕ БІ2- ЕД ИСБАО-О01-РЕАК СО40-001-ГЕДІХСЮІ37-005-ЕЕАВ СрАОО01- РЕА ХСО137-009-ЕЕАВ
Фіг. 8
В 2.6. збу Фк Ещо, В о: | В Ген ФК Е | в т. - хе ЕЕ : ї їж є Ж ії зва-всв-ана ННННЕ т- ; р - 5: : Еш в БЕК Мате вБЕ 55 55555 ЗЕ 555 55 55355 Ж Ж 85 555 585 55 ЕЕ я ББ5 ВЕ В ВЕ : В ЗБЕ НВБЕ в 85 ШИ 55: 55 555555 ї вив екв мож в "тн як в ж ев ва пеппоцтитовтицтоттвтицнтютное 00 Копппіцтточтвтонвтицнтюнноко 0 птппоцтоктвтотнточнонтья « ш , Зоо - с ще я с я Б 55 ОБОВ в й їв 5 8 Б В 8 г. я еВ т 5 в ке ре ре й т хі з ех я «а як Мо жк ке : з В в вх ! я Ой : х я Я З 5 а З : е що ї вт ше ко п о - ще щ. В що ЖЕ д Бк х йротз -4 їхч - я р 15 В 8 а Е я в З ; В з
Фіг. 9 (продовження) с 5бч м т. т й ся Ко е ; т. аа де ЗО в ЩІ 5 в Б. ек рондо викон тдннонтон В. ЕЕ Е 5 й - що БЕ 19 5 Б БЕ ВЕ "В Б ЗБ 585 БОБ г ш 555855 ЕЕ А 555 28455 - є Фі ож од ж ж а: - е вк Ж є як й 5 в вв с Гу І Го в. У я во шо ї «3 ос В я ВЕ В З В ВВ На ї з 5 з щ В ях Б 5 В в в с з ча : 5 ї - З - рай я З І а и тя в ж їй їх що г ВЕ Є 5 я ЕК й З ав . З в яв : В А
Фіг. 8 (продовження)
ОП « 25 Фк но с З в 28 5 з с с в 2 а
5 я. їх. рака уктиАВА КУ двккя КАН юку «У ШЕ З ай Га ще - ! 5 14 Ж до ж - Й 7 15 кл о ЕЕ 5 ня ВЕ вк БЕ Б ве 58 852 88555 5 3535: 335 558 58555 й БЕ БЕ 555 Б ш БЕБ Б БВ БВ ш НЕ ЕЕ ЕЕ 3 855 325 3545 з їз ПО Я - 4 5 "та "га" та" М 5 5 з З я я ек пої ш 5 ей - - 5 З 5 В й й 5 й є їн Мк мо В. - що ж - 5 з - 5 5 : т З ; мк т те. В 5 т З р «а З в ро я В З іх В ВВ а є 5 8 5 5 я Б 5 У К ня на С Є « ва й са Є У. т «4 й ЖК ті т " Ж - В В - Кі що ! " 7 ре З й З а
Фіг. 9 (продовження) Е 25 ЕЕ
З. сх -Ж 80 2. - Ф 29 Е Кс, ЛЕ ПЕ в З б 20 звід кж жі ажууют хвата жаф ков уки яки -- о се - Б Е" Ж М шо 585 55535 "8555 555 555 55555 9553 555 5825 523552 5 228 ЗВ 83 ВЕ ЗБ БЕ БЕ ЕЕ ю Б ББ ББЕ ВВ Ш БЕ ВЕБ 555 2355 З ж ЕЕ Ж Б 5 ха І іх ВЛ: З 5 Ше цу с йон - 5 є ке "а 85 я ч З 85 о ї де ЩЕ 4 чеиннннннннниннн пінні -6Й-- « « « м - я щі є в пе є ме ке це М Я щі ові пі В В 8 В Е БЕ в - 5 БВ т - - т ха
Ф. о ї- ж в -оя т т Я Я в КЕ 5 ся 8 2 . т «а В я 85 я 8 88 о : х : ' о Во я « щ З ш щі х 8 хх х ш щ щі ом не ї 15 що - - «а - зх «ч У у З 7 в ; 3 в аз З в 7 З а
Фіг. 8 (продовження)
А чи БІ2-РЕАТХСОАОО01-РЕАК Б13-БЕДІХС137005-ЕБАВ Б12-РЕАТХСІ137-009-РЕД В !
о г ЗУ Е Бі2-РЕДІХСЯО-001-ЕЕАН- 0 БІ2-РЕАХСОЛОО01-БЕДН я т БІ2-ЕЕВІХСІі87-005-РЕАВ 0/ 6Б12-РЕАЇхСО137-009-БЕАВ СО409-091-РЕДіХСОВ137-005-ЕЕАН СО40-001-КЕАГЯСІЗ137-009-РЕАВ. нт ооо вінок СЕЗЕ
В 25 25 о
Е г. 2.0. во ті. т я ; Е о ге «я. хо «Е.А. ; о як -« В. ЩЕ .. Я Я Я... : що шо 45 Ж 8 З Р 4) ЧЕ є шо ше ЕЕ ши ЗЕ5 555 555 555 " Ваз 383 333 88. Й ЗЕ ЕЕ БЕ БЕ вве БЕ ВЕ ВЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ БЕ: заз зняв вах оч ем оч вет же во" в шо є же тов т є -еї су З В В РУ 8 - ; В а а я я ше ше ше 33 «- - « : 58 8 8 858 8 8 А 8 8 5 8 8 5
Фіг. 9 (продовження) с Ж 20. Ж ге) Е пе 5 ха ккии ки я кий еВ пах. «щих В. с зо В зві. о 5 - о ан Я Й . а:
я 2. В о 5 Ф щ-- Ф ев Б 555 555 55555 те 5555 Я ЕЕ Б ЕЕ БЕ: З 88 888 ЗЕ 8555 ТЕБЕ ЕВ вт і а г хв юю ат ""ва5 кв ан асо шк у авооа Ж я в є в кв Є жа З й В 5 Бе сі 505 55 ОК 8 5 85 В В З ї 5 В 1 Бої В в В ев ; с я кВ й к я 5 х а за та в т и в 8 2 2 В В
Фіг. 9 (продовження)
о ях 28 20 шо ях не. це т 5 -о їв Я Еш й | й в оре бронх в ноз Й Ж Я Е ий Е в І З В 555 555 55: 53335 в 855 399 533 25535 "ЕБЕ ЕВ ЕЕ 5555 " ЖБЯ БЕ ЗЕ 8555 ве шж в вок ""я85 ав вок т "пада же ч ж -
ово. ОВО В Я ; В я Я 5 б В В вх В В д В 5858 й 38 З ка 5 5 ЕЕ а ка х Я і 8 8 В 8 Фіг, 9 (продовження)
Е
3.2- 28 У Ще -
8 2.
6 В ; В 24 / кт Емми 2.2. кю ак рей Тед юк кає кююю ж
2.0 ення 105 404 103 4027 05 409 40 конц. антитіла (мкг/мл) -ф- С040-001-ЕЕДІхСО137-005-ЕЕЛЕ -к- СрІ0-001 ЕД ХОВІ37-009-ЕЕАЕ
Фіг. 9 (продовження)
о 80 ав о КК - Є З Гаї Е Фо В 40: во - В « 5 о о Я шк . . . шккжіютим | жжежні плжажткитв, зжжея ід я 2 го, ВШ... М... - 4. т о х Ф 7 Б о. па. ах, тв. пд. ш 15 пі: тя. п.й. пд,
т. є з ї- в ї- - - Ма З ї - Га - зав 85 58 7888888 58 ж КЕ й у я: й З щ- - с г" ко т ев - в 5 те ? в 7 е опонент нення. жона Ж ще Є о о ід У КУ х б і. 8 б 5 5 а я г т . ж з А 5 Х Ж г Ф 5 5 й о У Е КУ о о дж мч ді 5 ? КУ 88 5 я о б, Є схе ї а я Ж гоже Ф й ХЕ 9 Со сг ще АК го о х - Я пу Ж жк 5 8 Ка КО 8 к о Кей бо хо
Фіг. 10 5 шо ЗВ Е г Е З г. шо 7 Ки 2: о ж ЩО
Фк . рові я - я ж жеккажкяи сжеккх Киж киев пжекьє ж Мао хе ш їз 1.5 кі В. вк в ще ще й - 1. или ШЕ х ЗЕ БЕЗ 555 50 085 31 5 5558555 5 5 г з Б-Я щ- а да ще Ф ВНЗЕ ВІВ КІ ВЕ ЗАВ В -аваа -- шо дж оф ч- є «б г -« її є - З ж СбіІ3 ов слІх СОВИ ОюЮх Контрольне ОЇ СОІЗРОННОТЬСЯХ СОТОК ОО картрольне з СМООіНОВСІ 0 СОМ! срМодОєНоВМ 0 со тральне до
Фіг. 11 щ-й й Ж з? понкофунаннккнох
5. 105 спинна ст : е пий ва ве кт ж
, . . в во о чеовввогіфоввсссввоє те 10 а. е щ- ш 101 Гек іо сх - с як - 2 З 2 - я 5 5 в є ге Ж ія ж -к ж Я Рез -- як 2 - 2 - іє, оо Е се не ре о -
Фіг. 12 - ки - 104. . ж є Ж « к "ііі іні нічні и 2 є 10 - в з - а х : в а 5 пня В г - ЕЕ Фе 102. е є е с - Е Е Е Б Ф Я ще ще КЗ - 2 о о 2
Фіг. 13
UAA201901470A 2016-07-14 2017-07-14 Мультиспецифічне антитіло до cd40 і cd137 UA128304C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP2016066840 2016-07-14
PCT/EP2017/067924 WO2018011421A1 (en) 2016-07-14 2017-07-14 Multispecific antibodies against cd40 and cd137

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA128304C2 true UA128304C2 (uk) 2024-06-05

Family

ID=59501399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201901470A UA128304C2 (uk) 2016-07-14 2017-07-14 Мультиспецифічне антитіло до cd40 і cd137

Country Status (15)

Country Link
US (6) US11091557B2 (uk)
EP (1) EP3484922A1 (uk)
JP (2) JP7138630B2 (uk)
KR (2) KR102632202B1 (uk)
CN (2) CN109641959B (uk)
AU (2) AU2017296095B2 (uk)
BR (1) BR112019000512A2 (uk)
CA (1) CA3030636A1 (uk)
EA (1) EA201990293A1 (uk)
IL (1) IL264142A (uk)
MA (1) MA45672A (uk)
MX (1) MX2018015853A (uk)
SG (1) SG11201811431VA (uk)
UA (1) UA128304C2 (uk)
WO (1) WO2018011421A1 (uk)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3623386T3 (da) 2015-01-08 2022-07-04 BioNTech SE Agonistiske tnf-receptor-bindingsmidler
BR112019000512A2 (pt) 2016-07-14 2019-04-24 Genmab A/S anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, métodos de tratamento de uma doença, para produzir um anticorpo biespecífico e para detectar se a reticulação entre as células que expressam cd40 e cd137 ocorre em uma amostra, uso de um anticorpo multiespecífico, e, kit
CA3030640A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric cd40 binding molecules and uses thereof
WO2019025545A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
CN111511762A (zh) * 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
AU2018335828A1 (en) * 2017-09-19 2020-03-05 Mab Discovery Gmbh Agonistic CD40 antibodies
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
CN112867733B (zh) * 2018-10-19 2023-01-06 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗cd137抗体及其应用
WO2020094744A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 Genmab A/S Antibody formulation
CN113226357A (zh) * 2018-11-23 2021-08-06 斯特赖克药物公司 双特异性缀合物
CN110229232B (zh) * 2019-06-19 2020-05-19 北京智仁美博生物科技有限公司 双特异性抗体及其用途
US20230285555A1 (en) * 2020-04-17 2023-09-14 Dingfu Biotarget, Co., Ltd. Preparation specifically bound with cd137 and use thereof
GB202008003D0 (en) * 2020-05-28 2020-07-15 Quine Medical Ab Anti-CD40 antibody
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
CN112321700A (zh) * 2020-09-21 2021-02-05 四川省人民医院 一种新型冠状病毒感染的外周血tcr标志物及其检测试剂盒和应用
CN114560940B (zh) * 2020-11-27 2023-07-14 缔码生物科技(武汉)有限公司 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用
US20240174759A1 (en) 2021-03-09 2024-05-30 Genmab A/S Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in therapy
KR20240046323A (ko) 2021-07-13 2024-04-08 비온테크 에스이 암에 대한 병용 요법에 있어서 cd40 및 cd137에 대한 다중특이 결합제
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
WO2023218051A1 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024059901A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Currus Biologics Pty Ltd A method of rescuing exhausted immune cells
WO2024115725A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
IL132560A0 (en) 1997-05-02 2001-03-19 Genentech Inc A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
US20030118588A1 (en) 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
AU3662101A (en) * 2000-02-01 2001-08-14 Tanox Inc Cd40-binding apc-activating molecules
AU2001296507A1 (en) 2000-10-02 2002-04-15 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US20030223989A1 (en) * 2002-04-18 2003-12-04 Pluenneke John D. CD137 agonists to treat patients with IgE-mediated conditions
CA2965865C (en) 2002-07-18 2021-10-19 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
AU2004255216B2 (en) 2003-07-01 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
WO2005044854A2 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
WO2005044855A2 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Use of antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies for treatment of multiple myeloma
US20070098718A1 (en) 2003-11-04 2007-05-03 Chiron Methods of therapy for b cell-related cancers
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
AU2005227322A1 (en) 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007053767A1 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Novartis Ag Uses of anti-cd40 antibodies
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
JP5374359B2 (ja) 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
US20090074711A1 (en) 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
GB0620894D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
CN101821288A (zh) 2007-06-21 2010-09-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
EP2195341B1 (en) 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
WO2010047830A2 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Scripps Research Institute Agents for hcv treatment
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트
KR20110104032A (ko) 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
CN102448984A (zh) 2009-03-27 2012-05-09 酶遗传学股份有限公司 使用包含抗体-受体组合的多特异性结合蛋白的组合物和方法
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CN102711810B (zh) 2009-11-30 2015-04-22 詹森生物科技公司 效应子功能已消除的抗体Fc区突变体
RU2580038C2 (ru) 2009-12-04 2016-04-10 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
GB201003293D0 (en) * 2010-02-26 2010-04-14 Adjuvantix Ltd Cancer vaccine
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
PT2560993T (pt) * 2010-04-20 2024-09-16 Genmab As Proteínas contendo anticorpo heterodimérico fc e métodos para a produção das mesmas
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
MX338953B (es) 2010-08-16 2016-05-06 Novimmune Sa Metodos para la generacion de anticuerpos multiespecificos y multivalentes.
MX340558B (es) 2010-08-24 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Anticuerpos biespecificos que comprenden fragmento fv estabilizado con disulfuro.
BR112013002167A2 (pt) 2010-08-24 2016-05-31 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso, método de tratamento de um paciente que sofre de câncer e de um paciente que sofre de inflamação
DK2614082T3 (en) 2010-09-09 2018-11-26 Pfizer 4-1BB BINDING MOLECULES
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
US20140170148A1 (en) * 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2
EP3508500A1 (en) 2011-04-29 2019-07-10 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
EP3674320A3 (en) 2011-10-27 2020-08-12 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
AU2013249985B2 (en) 2012-04-20 2017-11-23 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
SG11201408646VA (en) * 2012-07-06 2015-01-29 Genmab Bv Dimeric protein with triple mutations
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
KR102270618B1 (ko) 2012-10-30 2021-06-30 아펙시젠, 인코포레이티드 항-cd40 항체 및 사용 방법
CN104870476B (zh) 2012-11-21 2018-04-13 药物抗体公司 靶向vegfr‑2和dll4的双靶向抗体及包含它的药物组合物
CN113248615A (zh) * 2013-07-05 2021-08-13 根马布股份公司 人源化或嵌合cd3抗体
RS58627B2 (sr) 2014-04-01 2022-06-30 Biontech Cell&Gene Therapies Gmbh Klaudin-6-specifični imuno receptori i t-ćelijski epitopi
CA2943943C (en) 2014-04-07 2023-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating antigen-binding molecule
CA2957146A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Alligator Bioscience Ab Combination therapies with anti cd40 antibodies
DK3623386T3 (da) * 2015-01-08 2022-07-04 BioNTech SE Agonistiske tnf-receptor-bindingsmidler
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
CN107921104A (zh) 2015-02-22 2018-04-17 索伦托治疗有限公司 结合cd137的抗体疗法
JP2018520650A (ja) 2015-05-21 2018-08-02 アリゲーター・バイオサイエンス・アーベー 新規のポリペプチド
US10875926B2 (en) 2015-09-22 2020-12-29 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Fully human antibody against human CD 137
MA43017A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf
GB201519481D0 (en) 2015-11-04 2015-12-16 Cancer Rec Tech Ltd Immunomodulatory antibodies
MX2018012897A (es) 2016-04-22 2019-01-17 Alligator Bioscience Ab Nuevos polipeptidos biespecificos contra cd137.
WO2017205738A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
BR112019000512A2 (pt) 2016-07-14 2019-04-24 Genmab A/S anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, métodos de tratamento de uma doença, para produzir um anticorpo biespecífico e para detectar se a reticulação entre as células que expressam cd40 e cd137 ocorre em uma amostra, uso de um anticorpo multiespecífico, e, kit
CN109983033B (zh) 2016-09-23 2023-10-31 美勒斯公司 调节细胞表达的生物活性的结合分子
CN108367075B (zh) 2016-11-23 2022-08-09 免疫方舟医药技术股份有限公司 4-1bb结合蛋白及其用途
WO2018187215A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific 4-1bb agonist molecules
WO2018213747A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. 4-1bb agonist and cd40 agonist bispecific molecules

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240017129A (ko) 2024-02-06
US20200247899A1 (en) 2020-08-06
US20220064317A1 (en) 2022-03-03
US12077596B2 (en) 2024-09-03
IL264142A (en) 2019-02-28
US11939388B2 (en) 2024-03-26
US11440966B2 (en) 2022-09-13
CN117247458A (zh) 2023-12-19
JP2019533466A (ja) 2019-11-21
CN109641959A (zh) 2019-04-16
AU2017296095B2 (en) 2024-05-02
BR112019000512A2 (pt) 2019-04-24
JP7138630B2 (ja) 2022-09-16
EA201990293A1 (ru) 2019-07-31
US20200062853A1 (en) 2020-02-27
MX2018015853A (es) 2019-08-21
WO2018011421A1 (en) 2018-01-18
US20220033510A1 (en) 2022-02-03
CA3030636A1 (en) 2018-01-18
US11084882B2 (en) 2021-08-10
US20210317225A1 (en) 2021-10-14
KR102632202B1 (ko) 2024-02-02
US20230089969A1 (en) 2023-03-23
KR20190028508A (ko) 2019-03-18
CN109641959B (zh) 2023-08-22
AU2024205418A1 (en) 2024-08-22
US11091557B2 (en) 2021-08-17
MA45672A (fr) 2019-05-22
JP2022184871A (ja) 2022-12-13
SG11201811431VA (en) 2019-01-30
EP3484922A1 (en) 2019-05-22
AU2017296095A1 (en) 2019-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA128304C2 (uk) Мультиспецифічне антитіло до cd40 і cd137
US20240228635A9 (en) Ccr8 antibody and application thereof
US20230034161A1 (en) Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CN109906232B (zh) 包含λ轻链和κ轻链的多特异性抗体分子
US20230042324A1 (en) Anti-gitr antibodies and uses thereof
SA517380971B1 (ar) Cd19 أجسام مضادة ومستقبلات مولد ضد خميرية نوعية لـ
CN110249046A (zh) 用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生
EA038603B1 (ru) Антитела против псма, биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, которые связывают псма и cd3, и их применение
AU2018256392B2 (en) Anti-PD-L1 antibody and use thereof
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
JP2019514355A (ja) 抗人ｐｄ−１人源化単クローン抗体及び応用
BR112014009069A2 (pt) polipeptídeos de anticorpo que antagonizam cd40l
CN106536556A (zh) 结合lgr5的人源化抗体
UA115533C2 (uk) ГУМАНІЗОВАНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, СПЕЦИФІЧНЕ ДО КОМПЛЕКСУ αβTCR/СD3 ЛЮДИНИ
CN103153331A (zh) 靶向于钙粘着蛋白-11的ec1结构域的人源化抗体及相关组合物和方法
JP2022523197A (ja) Ｔ細胞関連のがん細胞に結合する多機能性分子およびその使用
KR20230028242A (ko) T 세포 관련 암 세포에 결합하는 다중기능성 분자 및 그것의 용도
CN116234829A (zh) 抗tcr抗体分子及其用途
CN116249718A (zh) 结合至钙网蛋白的多功能性分子及其用途
JP2021518168A (ja) 拮抗的抗原結合タンパク質
KR20230166096A (ko) Cldn18.2 항원 결합 단백질 및 이의 적용
KR20240004462A (ko) Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
CN107849134A (zh) 用抗ccr4抗体介导细胞因子表达的方法
EP4406970A1 (en) Monoclonal antibody targeting tigit
CN112041432A (zh) Foxp3靶向剂组合物以及用于过继细胞疗法的使用方法