TWI796345B - 畢赤酵母屬(pichia)酵母菌之高效生產及其用於增進植物及動物健康之用途 - Google Patents

畢赤酵母屬(pichia)酵母菌之高效生產及其用於增進植物及動物健康之用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供包含所培養微生物及/或其生長副產物之基於微生物之組合物，以及生產及使用此等組合物之方法及系統。更特定地，本發明提供基於微生物之組合物，其包含選自畢赤酵母屬(Pichia )分支(clade)之生物純酵母菌及/或其生長副產物，諸如生物界面活性劑、酶及溶劑。亦提供使用此等組合物以提高農業、園藝業、家畜飼養業及水產養殖業之生產的方法。

Description

畢赤酵母屬(PICHIA)酵母菌之高效生產及其用於增進植物及動物健康之用途
在農業、園藝業、畜牧業及水產養殖業中，某些共同的問題使得農戶無法在保持較低成本的同時使產量最大化。此等問題包括(但不限於)：由細菌、真菌以及其他害蟲及致病菌所引起之感染及傳染；飼料及化學肥料之高成本，包括其環境及保健影響；以及使必需營養素(特定言之磷酸鹽)溶解成可用形式的難度。
在農業及園藝業中，農戶在很大程度上依賴於使用合成的化學物質及化學肥料來增加農作物產量且使農作物不受致病菌、害蟲及疾病之害；然而，在超限使用或施用不當時，此等物質可流入地表水中、滲入地下水中以及蒸發至空氣中。作為空氣及水污染之來源，負責任地使用此等物質在生態及商業方面勢在必行。即使正確地加以使用，但某些化學肥料及農藥之過度依賴及長期使用會不利地改變土壤生態系統，降低抗逆性，增加抗蟲性，且阻礙植物及動物生長及生命力。
對於畜牧及水產養殖，飼養成本可為相當高的。舉例而言，尤其在大規模養殖的情況下，為魚群提供食物構成水產養殖經營開支的主要部分。魚飼料必須含有高度可消化的蛋白質源以及恰當營養所需要的全範圍的其他組分，包括胺基酸、碳水化合物、維生素、礦物質、膽固醇及必需脂肪酸。傳統上，飼料源包括由例如野生魚或養殖魚製成之魚粉，例如魚粉、蝦混合物及魷魚粉；然而，由於製造傳統魚源性飼料及魚油源性飼料之魚類養殖及生產成本增加，許多水產養殖公司已開始使用基於穀物之飼料來飼養魚類。目前正使用諸如玉米、大豆、全麥及高粱之原料來製造魚類飼料。儘管尚未確鑿知曉基於穀物之食物對魚類自身健康之影響，但仍具有造成長期不良後果的可能。
大規模畜牧公司通常依賴於提供諸如玉米及大豆之穀物來為動物之最佳生長提供必要的碳水化合物、纖維及蛋白質。對於胃最適合於消化草及其他含高纖維素的植物的動物而言，此等食物並非最佳的，且可導致一系列問題。舉例而言，由於不合適的食物以及充滿高度密集餵養操作之生活條件，依賴於基於穀物之飼料的畜牧公司通常必須依賴於抗生素以避免疾病擴散，從而使動物免疫系統受損。
除了提供食物以及保護農作物及所養殖動物兩者之成本外，營養缺乏(特定言之磷缺乏)通常一直為此等產業之問題。遺傳物質及ATP之生物合成以及所有生物體之生長及生命力的許多其他功能需要呈磷酸鹽形式之磷。為預防或處理植物之磷缺乏，栽培者通常施加含磷肥料，通常施加至土壤中。然而，向土壤中施加此等化合物並不保證植物將能夠吸收及使用磷。一些形式的磷(諸如植酸鹽)不可溶或無法被植物根部吸收。植酸鹽充當磷、能量、陽離子及肌醇(一種細胞壁前驅物)之儲存物，其維持不能由植物及非反芻動物利用之形式。
對於所養殖動物，諸如在土壤缺乏植物生物可用磷之區域中放牧的所養殖動物，磷缺乏可導致若干問題，包括不育、產奶量(例如牛產奶量)減少及骨礦化(例如魚類、哺乳動物及家禽之骨礦化)不足。食物補充(例如，用無機磷酸鹽飼料進行食物補充)為對抗此等問題之最常見方法，但在大規模使用時該方法可花費較高成本。
為了解決生產食物及可消費產品之可持續方法的全球性需要，諸如細菌、酵母菌及真菌之微生物以及其副產物正逐漸用於多種環境中，包括農業及園藝業、畜牧業、林業以及土壤、水及其他天然資源之修復。舉例而言，農戶接受使用生物製劑作為生物農藥及生物肥料，該等生物製劑諸如活的微生物、由其衍生之生物產品及其組合。此等生物製劑相比於其他習知農藥及肥料具有重要優勢，包括：1)其相比於習知化學物質具有更少危害；2)其更高效且更具特異性；3)且其通常快速生物降解，產生較少環境污染。
大規模生產食物商品之經濟成本以及當前生產方法之健康及環境不利影響不斷對可持續性及供應全球增長人口之努力造成負擔。
因此，仍然需要以低成本生產農作物、家畜及魚類之經改良、無毒且環境友好的方法。特定言之，需要用以處理及預防農業、畜牧業及水產養殖中疾病及傳染之擴散的產物；補充土壤以促進農作物生長之產物；以及降低飼養家畜及養殖魚類之成本的產物，其皆不損害農作物、動物及人類消費者之健康及生命力。
本發明提供微生物以及其生長副產物，諸如生物界面活性劑、代謝物及/或酶。本發明亦提供使用此等微生物及其副產物之方法，以及生產該等微生物及其副產物之方法及系統。有利地，本發明之基於微生物之產物及方法為環境友好、操作友好且具有成本效益的。
在較佳實施例中，本發明提供包含所培養微生物及/或其生長副產物的基於微生物之組合物，以及生產此等組合物之方法，及該等組合物在農業、園藝業、家畜飼養及水產養殖中之使用方法。一般而言，基於微生物之組合物可用於預防及/或處理植物及動物之感染或傳染；改良土壤及促進農作物生長；及/或促進家畜及魚類之生長且增進其健康。
更特定言之，基於微生物之組合物可用於：通過控制由有害的單細胞或多細胞生物體所引起之感染、傳染及/或疾病來保護植物、人類或動物，該等有害生物體包括(但不限於)真菌、細菌、寄生蟲及線蟲；提高生產之產量及品質；使土壤肥沃；補充家畜飼料；及/或補充魚類及水產動物飼料。本文亦提供用於該等用途之方法。
在特定實施例中，本發明之基於微生物之組合物的微生物為生物純酵母菌，其選自畢赤酵母屬(Pichia )分支，諸如異常畢赤酵母(P . anomala ) (異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus ))、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(P . kudriavzevii ) (庫德里阿茲威氏威克漢姆酵母(Wickerhamomyces kudriavzevii ))及/或季也蒙畢赤酵母(P . guilliermondii ) (季也蒙酵母(Meyerozyma guilliermondii ))及/或其組合。亦設想包含其他畢赤酵母屬分支酵母菌，或與其緊密相關之酵母菌(例如屬於相同屬或科)，及/或其生長副產物。
可經由介於小規模至大規模範圍內的培養方法獲得本發明之基於微生物之組合物。此等培養製程包括(但不限於)深層培養、固態醱酵(solid state fermentation；SSF)及其組合。
組合物中之酵母菌可呈活性或非活性形式。此外，組合物亦可包含由酵母菌培養所產生之醱酵液，其尤其可包括細胞組分及微生物生長副產物，諸如生物界面活性劑、代謝物及/或酶。有利地，直接使用組合物，亦即在無進一步穩定、防腐及儲存的情況下使用組合物，保持微生物之高生存力，降低外部製劑及非所需微生物之污染可能性，且維持微生物生長副產物之活性。
在某些實施例中，基於微生物之組合物進一步包含載劑。載劑可為此項技術中已知之任何適合載劑，其准許以使得產物保持活力的方式或在非活性酵母菌的情況下以使得產物維持生效所必需的組分的方式，將酵母菌或酵母菌副產物遞送至目標植物、土壤、動物、魚類等。
在某些實施例中，組合物進一步包含能夠增強組合物效力之佐劑。舉例而言，富里酸(fulvic acid)、腐植酸或腐植酸鹽可充當特別適用於描述土壤改良組合物之實施例的佐劑。
基於微生物之組合物可調配成(例如)液體懸浮液、乳液、冷凍乾燥或噴霧乾燥粉末、顆粒、細粒或凝膠。
在某些實施例中，本發明之組合物由於(例如)使用全部微生物培養物而優於例如單獨的經純化微生物代謝物。此等優勢包括以下中之一或多者：作為酵母細胞壁外表面之一部分之甘露糖蛋白的濃度較高；酵母細胞壁中存在β-葡聚糖；培養物中存在生物界面活性劑；以及培養物中存在溶劑(例如乳酸、乙酸乙酯等)及其他代謝物(例如維生素、礦物質、碳水化合物及蛋白質來源)。在使用活性或非活性酵母菌時存在此等優勢。
在某些實施例中，微生物以及微生物之代謝物及其他副產物彼此協同作用。
在一個實施例中，本發明提供生產畢赤酵母屬酵母菌之生長副產物之方法，其藉由：在適合於培育及生產生長副產物之條件下培養本發明之微生物菌株；及視情況純化該等副產物。在一些實施例中，生長副產物並非純化的，而是替代地以粗產物形式使用，例如包含生產該生長副產物之醱酵液。根據本發明之生長副產物之實例包含酶、酸、溶劑、乙醇、蛋白質、胺基酸、生物界面活性劑及其他生長副產物。在特定實施例中，提供生產植酸酶之方法
本發明進一步提供提高選自農業、園藝業、家畜生產及水產養殖之產業之生產的方法，其中將有效量的本發明之基於微生物之組合物施用於與所選產業有關之特定施用點或目標點。施用點將取決於產業，且可包括例如植物及/或其環境或動物及/或其環境。
本發明方法之施用可包括將基於微生物之組合物直接施用於植物、動物及/或其周圍環境。微生物在施用時可具有活性(或具有活力)或不具有活性。
在活性微生物的情況下，微生物可在施用點處原地生長，且就地產生任何活性化合物或生長副產物。因此，在處理場所(例如CAFO或養魚場)可容易且不間斷地獲得高濃度的微生物及有益的生長副產物。
為此目的，該等方法可包含在施用期間添加用以促進微生物生長之物質(例如，添加用以促進微生物生長之營養素)。在一個實施例中，營養素來源可包括例如氮、硝酸鹽、磷、鎂及/或碳。
在一個實施例中，該等方法進一步包含在施用之前培養基於微生物之組合物之步驟。較佳地，在施用點處或附近培養基於微生物之組合物，例如在距該施用點100哩以內進行培養。
在某些實施例中，提供農業、園藝業、家畜飼養業及/或水產養殖業中處理及/或預防感染、傳染及/或疾病之方法，其中將本發明之基於微生物之組合物施用於植物、動物及/或其周圍環境。在一些實施例中，將組合物直接施用於造成或已經造成感染、傳染及/或疾病之生物體或害蟲。
在某些實施例中，提供用於使土壤肥沃之方法，其中將本發明之基於微生物之組合物施用於土壤。有利地，該等方法可增加土壤中生長的農作物及農產品之產量且提高其品質。此外，該等方法可藉由起作用以回收土壤中存在的不可用磷酸鹽且將其轉化成植物可吸收形式來幫助節省磷酸鹽。
在某些實施例中，本發明提供使用本發明之基於微生物之組合物來餵養家畜及養殖魚類之低成本物質及方法。藉由例如將組合物與傳統家畜飼料一起放入飼槽中且使家畜攝入該組合物，該組合物可用作家畜之高營養補充食物來源。藉由例如將基於微生物之組合物放入魚塘或水族箱中且使其中的魚類攝入該組合物，該組合物可用作魚類之高營養補充食物來源。有利地，本發明可用於降低餵養家畜及養殖魚類之成本，同時藉由例如支持動物生長及其免疫系統而促進動物之生長且增進其健康。
在某些實施例中，本發明提供用於處理及/或預防植物及/或動物之營養素缺乏的物質及方法。在植物缺乏營養素的情況下，該等方法可包含將本發明之基於微生物之組合物施用於植物周圍的土壤中。在動物缺乏營養素的情況下，該等方法可包含將本發明之基於微生物之組合物施用於動物之飼料及/或飲用水中。在一個實施例中，營養素缺乏為磷缺乏。
有利地，本發明可在不向環境中釋放大量無機化合物的情況下使用。此外，該等組合物及方法使用生物可降解且在毒理學上安全的組分。因此，本發明可以「綠色」處理方式用於提高農業、園藝業、家畜飼養及/或魚類養殖之生產。
相關專利申請案之交叉引用 本申請案主張2017年7月27日申請之美國臨時專利申請案第62/537,670號及2017年9月27日申請之美國臨時專利申請案第62/563,992號之優先權，該等申請案中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供包含所培養微生物及/或其生長副產物之基於微生物之組合物，以及生產及使用此等組合物之方法。該等基於微生物之組合物可用於農業、園藝業、家畜飼養及水產養殖中，例如用於預防及/或處理植物及動物之感染或傳染；改良土壤及促進農作物生長；及/或促進家畜及魚類之生長且增進其健康。
在特定實施例中，本發明之基於微生物之組合物的微生物為生物純酵母菌，其選自畢赤酵母屬分支，諸如異常畢赤酵母(異常威克漢姆酵母)、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(庫德里阿茲威氏威克漢姆酵母)、季也蒙畢赤酵母(季也蒙酵母)及/或其組合。亦設想包含其他畢赤酵母屬分支酵母菌，或與其緊密相關之酵母菌(例如西文畢赤酵母(P . occidentalis ))，及/或其生長副產物。
本發明亦提供提高選自農業、園藝業、家畜飼養及水產養殖之產業之生產的方法，其中該方法包含將本發明之基於微生物之組合物施用於與產業有關之特定點。舉例而言，施用點可為植物、動物及/或該植物或動物周圍之環境。
所選定義 如本文中所使用，對「基於微生物之組合物」之提及意謂包含由於微生物或其他細胞培養物之生長而產生的組分的組合物。因此，基於微生物之組合物可包含微生物本身及/或微生物生長副產物。微生物可呈營養態、呈孢子形式、呈菌絲形式、呈任何其他微生物繁殖體形式或此等形式之混合物。微生物可為浮游的或呈生物膜形式，或為兩者之混合物。生長副產物可例如為代謝物(例如生物界面活性劑)、細胞膜組分、經表現蛋白及/或其他細胞組分。微生物可為完整或裂解的。細胞可完全不存在，或以例如每毫升組合物1 × 104 、1 × 105 、1 × 106 、1 × 107 、1 × 108 、1 × 109 、1 × 1010 或1 × 1011 或更多細胞或繁殖體之濃度存在。如本文所使用，繁殖體為微生物中可發育出新生物體及/或成熟生物體之任何部分，包括(但不限於)細胞、分生孢子、包囊、孢子(例如，繁殖孢子、內生孢子及外生孢子)、菌絲、芽及種子。
本發明進一步提供「基於微生物之產物」，其為待應用於實務中以達成所需結果之產物。基於微生物之產物可簡單地為自微生物培養製程收集之基於微生物之組合物。可替代地，基於微生物之產物可包含已添加之另外成分。此等額外成分可包括例如穩定劑、緩衝液、載劑(例如水或鹽溶液)、用以支持進一步微生物生長之補充營養素、非營養素生長增強劑及/或有助於追蹤施用基於微生物之產物之環境中的微生物及/或組合物的製劑。基於微生物之產物亦可包含基於微生物之組合物的混合物。基於微生物之產物亦可包含已經以某種方式處理之基於微生物之組合物的一或多種組分，該方式諸如(但不限於)過濾、離心、裂解、乾燥、純化及類似者。
如本文中所使用，「收集」係指自生長容器移除一些或所有基於微生物之組合物。
如本文中所使用，「經分離」或「經純化」分子或化合物實質上不含其在自然界中相關聯的其他化合物，諸如細胞物質。經純化或經分離之聚核苷酸(核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA))不含在其天然存在狀態下位於其側面的基因或序列。經純化或分離之多肽不含在其天然存在狀態下位於其側面的胺基酸或序列。
如本文中所使用，「生物純培養物」為已經與其在自然界中相關聯之物質分離的培養物。在一較佳實施例中，培養物已經與所有其他活細胞分離。在其他較佳實施例中，生物純培養物相比於與自然界中存在形式相同的微生物的培養物具有有利特性。該等有利特性可為例如促進一或多種所需生長副產物之生產。
在某些實施例中，經純化之化合物為相關化合物之至少60重量% (乾重)。較佳地，製劑為相關化合物之至少75重量%、更佳至少90重量%且最佳至少99重量%。舉例而言，經純化之化合物為至少90重量%、91重量%、92重量%、93重量%、94重量%、95重量%、98重量%、99重量%或100重量% (w/w)之所需化合物的化合物。純度藉由任何適當標準方法量測，例如藉由管柱層析法、薄層層析法或高效液相層析(HPLC)分析。
「代謝物」係指由代謝產生之任何物質(亦即，生長副產物)或參與特定代謝過程所需之物質。代謝物可為有機化合物，其為代謝之起始物質(例如，葡萄糖)、中間產物(例如，乙醯基-CoA)或最終產物(例如，正丁醇)。代謝物之實例包括(但不限於)生物聚合物、酶、酸、溶劑、醇、蛋白質、維生素、礦物質、微量元素、胺基酸及生物界面活性劑。
如本文中所使用，「調節」可與更改(例如增加或降低)互換。此類更改藉由標準技術已知之方法偵測，諸如本文所述之彼等方法。
本文所提供之範圍應理解為範圍內所有值之簡寫。舉例而言，1至20之範圍應理解為包括由以下組成之群中之任何數字、數字之組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以及所有介於前述整數間的十進制值，諸如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8及1.9。就子範圍而言，特別涵蓋自範圍之任一端點擴展的「嵌套子範圍」。舉例而言，例示性範圍1至50之嵌套子範圍可包含一個方向上的1至10、1至20、1至30及1至40，或另一方向上的50至40、50至30、50至20及50至10。
如本文中所使用，「減少」意謂負向更改至少1%、5%、10%、25%、50%、75%或100%。
如本文中所使用，「參考」係指標準或對照條件。
如本文中所使用，「界面活性劑」係指降低兩種液體間或液體與固體間表面張力(或界面張力)之表面活性製劑。界面活性劑充當清潔劑、濕潤劑、乳化劑、起泡劑及分散劑。「生物界面活性劑」為由活生物體產生之界面活性劑。
如本文中所使用，「農業」意謂培養及飼養植物及/或真菌以用於食物、纖維、生物燃料、藥品、化妝品、補充物、觀賞目的及其他用途。根據本發明，農業亦可包括園藝、景觀美化、園林業、植物保護、果樹栽培及樹木培植。在本文中，農業進一步包括土壤科學(例如，發生土壤學及耕作土壤學)以及農學，或對土壤及農作物生產之養護、監測及管理。
如本文中所使用，「家畜」係指飼養在農業或工業環境中以生產諸如食物、纖維及勞動力之商品的任何家養動物。「家畜生產」包括此等動物之繁殖、養殖、飼養、管理、維護及/或屠宰。家畜可為自由放養(諸如在戶外)、在農場上或在動物飼養作業中生產。術語家畜所包括之動物類型可包括(但不限於)羊駝、肉牛及奶牛、野牛、豬、綿羊、山羊、馬、騾、驢、駱駝、雞、火雞、鴨、鵝、珍珠雞及乳鴿。
如本文中所使用，「動物飼養作業」或「AFO」係指其中動物在任何12個月時間段內已經、目前正或將被關住或限制且飼養或維持總共45天或更多天的批次或設施(不包括魚養殖設施)，且在設施之任何部分內，農作物、植被、牧草生長或收集後殘留物在正常生長季節中並非持續的。AFO基本上使用人造結構及設備(用於餵養、溫度控制、糞便管理等)來代替土地及勞動力。「CAFO」或「集中型AFO」為將較大數目的動物集中在相對較小且受限空間中之AFO，其大小符合環境保護署(Environmental Protection Agency)所規定之特定臨限值。
如本文中所使用，「水產養殖(aquaculture/aquafarming/aquatic farming)」、「水產管理」或「魚類養殖」意謂在養魚場中繁殖、飼養及捕獲水產動物。水產養殖可為小面積的(依賴於在人工封閉區中以高密度養殖魚類之技術)或為大面積的(在海洋中進行，或在天然及人造湖、海灣、河流、峽灣或其他水體中進行)。水產養殖包括自孵化的魚類及貝類生產海鮮，該等魚類及貝類在封閉區、池塘、水槽、水族箱、籠子或水溝中生長至市售尺寸。此外，水產養殖包括海洋生物養殖，其需要在開放海水或封閉的海水區段中培養海洋生物。此外，水產養殖包括物種修復或「增強」，其中將孵化的魚類及貝類釋放至野外以致力於重建野生種群或海岸棲息地。更進一步，水產養殖包括生產觀賞魚以用於水族箱貿易，以及管理水族箱內容納的觀賞魚。可養殖的物種包括淡水或鹽水魚類及貝類，且可包括觀賞魚、食用魚、娛樂用魚(sport fish)、釣餌魚、甲殼動物、軟體動物、藻類、海菜或魚卵。
如本文中所使用，「養魚場」為其中存在或可存在水產養殖之任何水環境。根據本發明之養魚場可包括所有類型之水環境或水環境區段，無論是人造還是天然存在的，包括池塘、灌溉水渠、河、湖、海洋、峽灣、水槽、水族箱、籠子或水溝。
如本文中所使用，「害蟲」為對人類或人類相關事物(例如農業、園藝、家畜照料、水產養殖)具有破壞性、有害及/或不利的任何生物體，人類除外。害蟲可導致感染、傳染及/或疾病。害蟲可為單細胞或多細胞生物體，包括(但不限於)病毒、真菌、細菌、寄生蟲及/或線蟲。
如本文中所使用，「處理」係指在任何程度上根除、減輕、改善、逆轉或預防病狀或病症之程度、病徵或症狀，且包括(但不需要)完全治癒病狀或病症。處理可為治癒、改善或部分改善病症。處理亦可包括預防病狀或病症，如本文中所使用其意謂延遲病狀或病症之特定病徵或症狀之發作或進展。
基於微生物之組合物 本發明提供基於微生物之組合物，其包含有益微生物以及該等微生物之生長副產物，諸如生物界面活性劑、代謝物、酸、溶劑及/或酶。本發明亦提供將此等組合物用於提高農業、園藝業、家畜飼養及水產養殖之生產的方法。此外，本發明提供用於生產基於微生物之組合物的物質及方法。
有利地，根據本發明生產之基於微生物之組合物為無毒(例如，攝入毒性大於每公斤體重5克)，且可以高濃度應用而不對(例如)人類或動物之皮膚或消化道造成刺激。因此，本發明在基於微生物之組合物施用於活生物體的情況下特別適用，該等活生物體諸如人類生產且用於人類食用之家畜及魚類。
在某些實施例中，本發明之微生物為生物純殺手酵母菌。特別地，本發明使用屬於畢赤酵母屬之殺手酵母菌。甚至更特定地，在一個實施例中，該等微生物包括異常畢赤酵母(異常威克漢姆酵母)、季也蒙畢赤酵母(季也蒙酵母)、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(庫德里阿茲威氏威克漢姆酵母)及/或其組合。
本發明之微生物及基於微生物之組合物具有許多適用於提高農業、園藝業、家畜飼養及水產養殖生產的有益性質。舉例而言，在一個實施例中，該組合物包含生物界面活性劑。生物界面活性劑可由於組合物中所存在之微生物生長而存在於該組成物中，或生物界面活性劑可由其他微生物分開產生且以粗產物形式及/或純化形式添加至組合物中。作為實例，粗產物形式的微生物生長副產物可包含產生該等副產物之醱酵液。
生物界面活性劑抑制微生物附著於各種表面，防止形成生物膜，且可具有強大的乳化及去乳化(demulsifying)性質。此外，生物界面活性劑能夠降低例如養魚場及水族箱中水的表面及界面張力。
在某些實施例中，本發明組合物之生物界面活性劑為糖脂生物界面活性劑，諸如甘露糖赤蘚糖醇脂、槐糖脂、鼠李糖脂或海藻糖脂。生物界面活性劑亦可為脂肽，諸如界面活性素、伊枯草菌素(iturin)、豐原素(fengycin)及地衣素(lichenysin)。
在一個特定實施例中，該組合物包含一或多種糖脂，諸如甘露糖赤蘚糖醇脂(MEL)，其由例如擬酵母屬(Pseudozyma )酵母菌大量產生；及槐糖脂(SLP)，其由例如擬球酵母屬(Starmerella )酵母菌及畢赤酵母屬酵母菌產生。
MEL及SLP展現極佳的水表面及界面張力降低性質、高效的乳化及去乳化性質，及經由例如其抗真菌、抗細菌、抗寄生蟲及/或抗病毒性質之多方面的生物化學及生理影響。
在某些實施例中，組合物中一或多種生物界面活性劑之濃度為0.001重量% (wt%)至90 wt%、較佳0.01 wt%至50 wt%且更佳0.1 wt%至20 wt%。生物界面活性劑可進一步以約0.01 g/L至約500 g/L、約0.5 g/L至約50.0 g/L、由約1.0 g/L至約10.0 g/L或由約2.0 g/L至約5.0 g/L存在。
在某些實施例中，組合物進一步包含微生物酶。該等酶可由於其中的微生物生長而存在於該組成物中，或可單獨產生且以粗產物及/或經純化形式添加至組合物中。作為實例，粗產物形式的酶可包含在其中產生該等酶之醱酵液。
在特定實施例中，該組合物包含植酸酶。有利地，除所描述的酵母菌種之特定組合外，本文中所描述之培養方法協同作用，以出乎意料的較高濃度及非預期效率產生植酸酶。
在某些實施例中，組合物中植酸酶(或其他酶)之濃度為0.001重量% (wt%)至90 wt%、較佳0.01 wt%至50 wt%且更佳0.1 wt%至20 wt%。植酸酶(或其他酶)可進一步以約0.01 g/L至約500 g/L、約0.5 g/L至約50.0 g/L、約1.0 g/L至約10.0 g/L或約2.0 g/L至約5.0 g/L存在。
在一些實施例中，組合物進一步包含額外粗產物形式或經純化的微生物生長產物，諸如酶、生物界面活性劑、溶劑、酸、蛋白質、礦物質及/或維生素。
粗產物形式的代謝物可呈例如液體混合物之形式，該液體混合物包含由微生物培養產生的醱酵液中之代謝物沈積物。此粗產物形式溶液可包含約25%至約75%、約30%至約70%、約35%至約65%、約40%至約60%、約45%至約55%或約50%之純代謝物。
在某些實施例中，本發明之基於微生物之組合物可包含含有活性及/或非活性培養物、及/或由微生物產生之微生物代謝物、及/或任何殘留營養素之醱酵液。醱酵產物可不經萃取或純化而直接使用。視需要，可容易地使用文獻中所描述之標準萃取及/或純化方法或技術來實現萃取及純化。
有利地，根據本發明，基於微生物之組合物可包含在其中生長微生物之培養液。該組合物可為例如至少1重量%、5重量%、10重量%、25重量%、50重量%、75重量%或100重量%培養液。組合物中生物質的量可為例如0重量%至100重量%，包括其間之所有百分比。
醱酵液之生物質含量可為例如5 g/l至180 g/l或更多。在一個實施例中，培養液之固體含量為10 g/l至150 g/l。
微生物之醱酵 本發明使用培養微生物且生產微生物代謝物及/或生長副產物之方法。更特定言之，本發明提供用於生產生物質(例如活的細胞物質)、細胞外代謝物(例如小分子及分泌蛋白質)、殘留營養素及/或細胞內組分(例如酶及其他蛋白質)之物質及方法。
本發明使用適合於以較小規模(例如實驗室環境)至較大規模(例如工業環境)之任何所要規模培養微生物且生產微生物代謝物之培養製程。此等培養製程包括(但不限於)深層培養/醱酵、固態醱酵(SSF)及其組合。
如本文中所使用，「醱酵」係指細胞在受控條件下之生長。生長可為好氧或厭氧的。
根據本發明使用之微生物生長容器可為用於工業用途之任何醱酵器或培養反應器。在一個實施例中，容器可具有功能控制件/感測器或可連接至功能控制件/感測器，以量測培養製程中之重要因素，諸如pH、氧氣、壓力、溫度、攪拌軸功率、濕度、黏度及/或微生物密度及/或代謝物濃度。
容器亦可能夠監測容器內部微生物之生長(例如，量測細胞數目及生長階段)。可替代地，可每天自容器獲取樣品，且藉由此項技術中已知之技術(諸如稀釋平板技術)對該樣品進行計數。
在較佳實施例中，包含多個微生物生長容器之微生物生長設施以所需規模生產新製、高密度的微生物及/或相關微生物生長副產物。微生物生長設施可位於施用點處或附近。設施以分批、擬連續或連續培養方式生產高密度的基於微生物之組合物。
分散式微生物生長設施可位於將使用基於微生物之產物的位置處(例如野外或養魚場)。舉例而言，微生物生長設施可距使用位置小於300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1哩，或可正位於使用點。
在某些實施例中，可以或可以不使用本地及/或分散式醱酵方法來實現生產，其意謂亦可根據本發明使用習知方法。然而，有利地，如本文中所描述之本地及/或分散式微生物生長設施為依賴於遠方工業級製造商之當前問題提供解決方案，該等製造商之產物品質由於上游加工延遲、供應鏈瓶頸、不恰當儲存及其他妨礙有效產物之及時輸送及施用的意外事件而受損。
微生物生長設施生產新製的基於微生物之組合物，該等基於微生物之組合物包含微生物自身、微生物代謝物及/或在其中生長微生物之培養液的其他組分。視需要，該等組合物可具有高密度的營養細胞、非活性細胞、繁殖體，或營養細胞、非活性細胞及/或繁殖體之混合物。
有利地，該等組合物可經調整以供在指定位置使用。在一個實施例中，微生物生長設施位於將使用基於微生物之產物的位置處或附近。微生物生長設施可藉由利用(例如)太陽能、風能及/或水力發電而遠離隔篩起作用。
微生物生長設施藉由調整基於微生物之產物以改良與目的地地形之協同作用的能力而提供生產變通性。舉例而言，本發明之系統能夠利用天然存在之當地微生物及其代謝副產物之能量。可基於例如耐鹽性、在高溫下生長之能力及/或產生特定代謝物之能力來鑑別當地微生物。
由於基於微生物之產物係在施用點現場或附近產生，而無需習知生產之穩定、防腐、長期儲存及大範圍運輸過程，因此可產生密度高得多的活性(或非活性)微生物及/或其繁殖體，由此需要體積小得多的基於微生物之產物用於現場施用或在必要時允許密度高得多的微生物施用。此情形降低外部製劑及非所需微生物之污染可能性，維持微生物生長副產物之活性，且在無需使細胞穩定的情況下允許有效按比例縮小的生物反應器(例如，較小醱酵槽及較小體積的起始物質、營養素、pH控制劑及去泡劑等)。微生物之當地產生的高密度、穩固培養物與已經歷營養細胞穩定或已在供應鏈中擱置一段時間的培養物相比在野外更有效。
基於微生物之產物的當地產生亦有助於將醱酵液包括在產物中。培養液可含有在醱酵期間產生的尤其適合於當地使用之製劑。此進一步促進產物之可攜帶性。
減少的運輸時間允許以當地需求所要求之時間及體積生產且遞送微生物及/或其代謝物之新製批料。在當地生產且例如在醱酵24小時內進行輸送產生純的高細胞密度的組合物，且在實質上降低裝運成本。鑒於研發更高效且有力的微生物接種劑之快速改進的預期，消費者將極大地受益於此快速輸送基於微生物之產物的能力。
在一個實施例中，無論是使用習知方法還是使用當地或分散式系統進行之培養方法皆使用包含糖蜜、脲及蛋白腖之培養基。
在一個實施例中，糖蜜之濃度為2%至6%，較佳為4%。在一個實施例中，脲濃度為0.01%至1.0%，較佳為0.2%。在一個實施例中，蛋白腖之濃度為1.0%至5%，較佳為2.5%。
在一個實施例中，該方法包括為培養補充氮源。氮源可為例如硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、磷酸銨、氨、脲及/或氯化銨。此等氮源可獨立使用或以兩者或更多者之組合形式使用。
該培養方法可為生長的培養物提供氧合作用。一個實施例使用慢速空氣流動來移除含氧低的空氣且引入含氧空氣。含氧空氣可為每天經由機械裝置補充之環境空氣，該等機械裝置包括用於機械攪拌液體之葉輪及用於向液體中供應氣泡以將氧氣溶解至液體中之空氣鼓泡器。
該方法可進一步包含為培養補充碳源。碳源通常為：碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇及/或麥芽糖；有機酸，諸如乙酸、反丁烯二酸、檸檬酸、丙酸、蘋果酸、丙二酸及/或丙酮酸；醇類，諸如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、異丁醇及/或丙三醇；脂肪及油，諸如大豆油、玄米油、橄欖油、玉米油、芝麻油及/或亞麻子油。此等碳源可獨立使用或以兩者或更多者之組合形式使用。
在一個實施例中，培養基中包括微生物之生長因子及痕量營養素。此情形在培育不能產生其所需所有維生素的微生物時尤其較佳。培養基中亦可包括無機營養素，包括諸如鐵、鋅、銅、錳、鉬及/或鈷之痕量元素。此外，可包括例如呈麵粉或粗粉(諸如玉米粉)形式、或呈提取物(諸如酵母提取物、馬鈴薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等)形式、或呈經純化形式之維生素、必需胺基酸及微量元素源。亦可包括胺基酸，諸如適用於蛋白質生物合成之胺基酸，例如L-丙胺酸。
在一個實施例中，亦可包括無機鹽。可用無機鹽可為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化鎂、硫酸鐵、氯化鐵、硫酸錳、氯化錳、硫酸鋅、氯化鉛、硫酸銅、氯化鈣、碳酸鈣及/或碳酸鈉。此等無機鹽可獨立使用或以兩者或更多者之組合形式使用。
在一些實施例中，該培養方法可進一步包含在培養過程之前及/或期間在液體培養基中添加額外酸及/或抗微生物劑。抗菌劑或抗生素可用於保護培養物免受污染。舉例而言，鏈黴菌屬紅黴素(Streptomyces erythromycin )、酒花或酒花酸及/或少量(例如50-100 ppm)的槐糖脂或其他生物界面活性劑可作為抗細菌劑而添加至營養物培養基中。此外，亦可添加消泡劑以避免在培養期間產生氣體時形成及/或積聚發泡體。
混合物之pH應適合於相關微生物。可使用緩衝液及pH調節劑(諸如碳酸鹽及磷酸鹽)來使pH穩定接近較佳值。亦可使用pH控制來避免培養物污染。舉例而言，可以適合於酵母菌生長之較低pH (例如3.0-3.5)開始培養，且隨後在酵母菌積聚之後增加pH (例如4.5-5.0)且在剩餘醱酵時間內穩定。當存在高濃度的金屬離子時，可能有必要在液體培養基中使用螯合劑。
微生物可以浮游形式或以生物膜形式生長。在生物膜的情況下，容器內部可具有基板，微生物可在該基板上以生物膜狀態生長。系統亦可具有例如施加促進及/或改良生物膜生長特性之刺激(諸如剪應力)的能力。
在一個實施例中，該微生物培養方法在約5℃至約100℃、較佳15℃至60℃、更佳地25℃至50℃下進行。在另一實施例中，培養可在恆定溫度下持續進行。在另一實施例中，培養可經受溫度改變。
在一個實施例中，該方法及培養製程中使用之設備為無菌的。諸如反應器/容器之培養設備可與滅菌單元(例如高壓滅菌器)分隔但與其連接。培養設備亦可具有在接種開始之前原位進行滅菌的滅菌單元。可藉由此項技術中已知之方法對空氣進行滅菌。舉例而言，可在將環境空氣引入至容器中之前使該環境空氣通過至少一個過濾器。在其他實施例中，可對培養基進行殺菌，或視情況不加入任何熱量，其中可使用低水活性及低pH來控制細菌生長。
在其他實施例中，培養系統可為自身滅菌的，其意謂所培養的生物體由於產生抗微生物生長副產物或代謝物而能夠避免被其他生物體污染。
在一個實施例中，藉由在適合於本發明之微生物菌株生長及生產的條件下培養該微生物菌株而產生界面活性劑、酶、代謝物及/或其他蛋白質；且視情況，純化該界面活性劑、酶、代謝物或其他蛋白質。已知由畢赤酵母屬酵母菌產生之有益生長副產物中之任一者可根據本發明產生及純化。此等生長副產物包括(但不限於)：生物界面活性劑；酶，諸如外-β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶及植酸酶；溶劑；蛋白質；脂質；碳源；以及礦物質及維生素，諸如維生素B1、B2、B3 (PP)、B5、B7 (H)、B6及E。
由相關微生物產生之微生物生長副產物可保留於微生物中或分泌於其生長培養基中。在另一實施例中，用於產生微生物生長副產物之方法可進一步包含濃縮及純化相關微生物生長副產物之步驟。視情況，生長培養基可含有使微生物生長副產物之活性穩定的化合物。
醱酵液之生物質含量可為例如5 g/l至180 g/l或更多。在一個實施例中，培養液之固體含量為10 g/l至150 g/l。
當是時候自一或多個生長容器收集基於微生物之產物時，微生物及/或由微生物生長產生之培養液可自生長容器移除且經由例如管道輸送以供立即使用。微生物可呈活性或非活性形式，或可含有活性微生物與非活性微生物之組合。
考慮例如預期用途、預期施用方法、醱酵槽大小及自微生物生長設施運輸至使用位置之任何模式，亦可將組合物(微生物、培養液或微生物及培養液)置放於適當大小的容器中。因此，其中置放基於微生物之組合物的容器可為例如1加侖至1,000加侖或更大。在某些實施例中，容器為2加侖、5加侖、25加侖或更大。
在將所收集產物置放於容器中及/或用管道輸送(或以其他方式輸送以供使用)所收集產物時，可添加其他組分。該等添加劑可為例如緩衝液、載劑、在相同或不同設施處產生之其他基於微生物之組合物、黏度改質劑、防腐劑、用於微生物生長之營養素、追蹤劑、農藥及特定用於預期用途之其他成分。
在一個實施例中，在培養完成後(例如，在達成所需細胞密度或培養液中指定代謝物之密度後)，移除所有微生物培養組合物。在此分批步驟中，在收集第一批之後開始全新的一批。
在另一實施例中，在任何一次僅移除一部分醱酵產物。在此實施例中，具有活細胞之生物質保留在容器中，作為新培養批次之接種劑。移除之組合物可為不含細胞之培養液或可含有細胞。以此方式，建立擬連續系統。
基於微生物之產物的製備 一種本發明之基於微生物之產物僅為含有微生物及/或由微生物產生之微生物代謝物及/或任何殘留營養素之醱酵液。醱酵產物可不經萃取或純化而直接使用。視需要，可容易地使用文獻中所描述之標準萃取及/或純化方法或技術來實現萃取及純化。
基於微生物之產物中之微生物可呈活性或非活性形式。基於微生物之產物可含有活性微生物與非活性微生物之組合。
基於微生物之產物可在無進一步穩定、防腐及儲存的情況下使用。有利地，直接使用此等基於微生物之產物保持微生物之高生存力，降低外部製劑及非所需微生物之污染可能性，且維持微生物生長副產物之活性。
微生物及/或由微生物生長產生之培養液可自生長容器移除且經由例如管道輸送以供立即使用。在其他實施例中，如先前所描述，可將組合物(微生物、培養液或微生物及培養液)置放於適當大小的容器中。
在自生長容器收集基於微生物之組合物之後，在將所收集產物置放於容器中及/或用管道輸送(或以其他方式輸送以供使用)所收集產物時，可添加其他組分。該等添加劑可為例如緩衝液、載劑、佐劑、在相同或不同設施處產生之其他基於微生物之組合物、黏度改質劑、防腐劑、用於微生物生長之營養素、追蹤劑、殺生物劑、其他微生物、非生物界面活性劑、乳化劑、潤滑劑、緩衝劑、溶解度控制劑、pH調節劑、穩定劑、抗紫外線劑及特定用於預期用途之其他成分。
在一個實施例中，組合物可進一步包含包括有機酸及胺基酸或其鹽之緩衝劑，以使pH穩定接近較佳值。基於微生物之組合物的pH應適合於相關微生物。
合適的緩衝液包括(但不限於)檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、草酸鹽、天冬胺酸鹽、丙二酸鹽、葡庚糖酸鹽、丙酮酸鹽、半乳糖二酸鹽、葡糖二酸鹽、丙醇二醇鹽、麩胺酸鹽、甘胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、精胺酸及其混合物。亦可使用磷酸及亞磷酸或其鹽。合成緩衝液適合於使用，但較佳使用天然緩衝液，諸如有機酸及胺基酸或其鹽。
在另一實施例中，pH調節劑包括氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀或碳酸氫鉀、鹽酸、硝酸、硫酸及其混合物。
在一個實施例中，基於微生物之組合物中可包括額外組分，諸如鹽之水性製劑，諸如碳酸氫鈉或碳酸鈉、硫酸鈉、磷酸鈉或磷酸氫鈉。
有利地，基於微生物之產物可包含在其中生長微生物之培養液。產物可為例如至少1重量%、5重量%、10重量%、25重量%、50重量%、75重量%或100重量%培養液。產物中生物質的量可為例如0重量%至100重量%，包括其間之所有百分比。
在某些實施例中，本發明之基於微生物之組合物進一步包含載劑。載劑可為此項技術中已知之任何適合載劑，其准許以使得產物保持活力的方式或在非活性酵母菌的情況下以使得產物維持生效所必需的組分的方式，將酵母菌或酵母菌生長副產物遞送至目標植物、土壤、動物、魚類等。
在某些實施例中，特定言之在農業背景中，基於微生物之組合物可進一步包含用以提高組合物之效力的佐劑。在一個實施例中，該佐劑係選自富里酸、腐植酸及腐植酸鹽中之一或多者。
視情況，組合物在使用之前可經儲存。較佳地，儲存時間較短。由此，儲存時間可少於60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小時。在一較佳實施例中，若產物中存在活細胞，則以諸如小於20℃、15℃、10℃或5℃之低溫儲存產物。另一方面，通常可以環境溫度儲存生物界面活性劑組合物。
在某些實施例中，本發明之基於微生物之產物由於(例如)使用全部微生物培養物而優於例如單獨的經純化微生物代謝物。此等優勢包括以下中之一或多者：作為酵母細胞壁外表面之一部分之甘露糖蛋白的濃度較高；酵母細胞壁中存在β-葡聚糖；培養物中存在生物界面活性劑；以及培養物中存在溶劑及其他代謝物(例如乳酸、乙醇、乙酸乙酯等)。在使用活性或非活性酵母菌時存在此等優勢。
基於微生物之組合物可調配成呈例如液體懸浮液、乳液、冷凍乾燥或噴霧乾燥粉末、細粒、顆粒或凝膠形式的基於微生物之產物。設想其他調配物適合於特定應用。
在一個實施例中，尤其用於家畜餵養，基於微生物之產物可調配成每顆粒包含均一濃度之所需微生物或微生物生長產物(例如經純化植酸酶)的飼料顆粒。可使用此項技術中已知用於生產飼料顆粒之方法來生產飼料顆粒，該等方法包括加壓碾磨。較佳地，粒化製程為「冷」粒化或不使用高熱量或蒸汽之製程。
在一個實施例中，尤其用於水產養殖，出於生產非活性的基於微生物之組合物的目的而培養微生物菌株。該組合物藉由培養所需微生物、經由微流化(或經由此項技術中已知之不造成蛋白質變性的任何其他方法)破壞微生物而製備，經殺菌，且以濃縮形式添加至食料中。在一個實施例中，在巴氏滅菌溫度(在足以使100%酵母細胞失活之時間段內達至65℃至70℃)及增加pH值直至約10.0的情況下出現失活。此誘導細胞部分水解，且允許釋放其中的一些營養組分。隨後，將組合物中和至pH約7.0-7.5，且混合各種水解組分。所產生之基於微生物之產物隨後可用於例如魚飼料及養魚場水之處理。
本發明之基於微生物之產物可用於各種獨特環境中，此係由於例如高效輸送以下之能力：1)具有活性代謝物之新製醱酵液；2)細胞及/或繁殖體與醱酵液之混合物；3)具有高密度細胞(包括營養細胞及/或繁殖體)之組合物；4)短期內的基於微生物之產物；以及5)遠距離處之基於微生物之產物。
相比於細胞已與醱酵生長培養基中所存在之代謝物及營養素分離的傳統產物，本發明之基於微生物之產物尤其有利。
根據本發明培育之微生物菌株 根據本發明之系統及方法培育之微生物可為例如細菌、酵母菌及/或真菌。此等微生物可為天然微生物或經遺傳修飾之微生物。舉例而言，微生物可經轉型具有特定基因以展現特定特性。微生物亦可為所需菌株之突變體。如本文中所使用，「突變體」意謂參考微生物之遺傳變異型或亞型菌株，其中突變體相比於參考微生物具有一或多種遺傳變化(例如，點突變、錯義突變、無意義突變、缺失、重複、讀框轉移突變或重複擴增)。製造突變體之步驟已為微生物技術所熟知的。舉例而言，出於此目的廣泛使用UV突變誘發及亞硝胍。
在某些較佳實施例中，微生物為被稱為「殺手酵母菌」之任何酵母菌。如本文中所使用，「殺手酵母菌」意謂特徵為分泌毒性蛋白質或糖蛋白之酵母菌株，菌株自身對該等毒性蛋白質或糖蛋白免疫。殺手酵母菌分泌之外毒素能夠殺滅其他酵母菌株、真菌或細菌。舉例而言，殺手酵母菌可控制的微生物包括鐮刀菌屬(Fusarium )及其他絲狀真菌。此類酵母菌可包括(但不限於)威克漢姆酵母屬、畢赤酵母屬、漢森酵母屬(Hansenula )、酵母屬(Saccharomyces )、漢遜酵母屬(Hanseniaspora )、黑粉菌屬(Ustilago )、德巴利酵母屬(Debaryomyces )、假絲酵母屬(Candida )、隱球酵母屬(Cryptococcus )、克魯維酵母屬(Kluyveromyces )、球擬酵母屬(Torulopsis )、擬威爾酵母屬(Williopsis )、接合酵母屬(Zygosaccharomyces )及其他酵母菌。
在特定實施例中，本發明使用屬於畢赤酵母屬之殺手酵母菌。更特定言之，本發明之微生物包括異常畢赤酵母(異常威克漢姆酵母)、季也蒙畢赤酵母(季也蒙酵母)、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(庫德里阿茲威氏威克漢姆酵母)及/或其組合。此三種畢赤酵母屬微生物以及其代謝物及其他生長副產物(有時本文中稱為「3P」或「三-P 」)在用於增進植物及動物健康時彼此協同作用以產生所要結果，如本發明所描述。
此等酵母菌具有適用於本發明之多個有益特性，包括其產生有利代謝物的能力。舉例而言，異常畢赤酵母具有外-β-1,3-葡聚糖酶活性，從而使得其能夠殺滅一系列病原性真菌或抑制其生長。此外，在培養5-7天時，異常畢赤酵母產生生物界面活性劑，其能夠降低水之表面/界面張力且展現抗微生物及抗真菌特性。
庫德里阿茲威氏畢赤酵母產生針對若干人類及動物致病菌具有抗細菌活性之代謝物，該等致病菌諸如大腸桿菌(Escherichia coli )、糞腸球菌(Enterococcus faecalis )、克雷伯氏菌(Klebsiella )屬、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )及產鹼假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes )。此外，庫德里阿茲威氏畢赤酵母產生之毒素能夠控制可導致植物細菌性疾病之多種其他革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌。
季也蒙畢赤酵母菌株產生水解酶，包括β-1,3-葡聚糖酶及幾丁質酶。已知此等酶具有殺線蟲(例如抗南方根瘤線蟲(Meloidogyne incognita ))及抗真菌(例如抗灰黴菌(B . cinereal ))性質。
除各種副產物外，此等酵母菌亦能夠產生植酸酶，植酸酶為一種催化植酸(植酸鹽或肌醇六磷酸鹽)水解的磷酸酶。植酸為難消化的有機形式的磷，其在水解時釋放可用形式的無機磷。
此外，畢赤酵母屬酵母菌為多種蛋白質(含有高達50%的乾細胞生物質)、脂質及碳源以及全範圍的礦物質及維生素(B1；B2；B3 (PP)；B5；B7 (H)；B6；E)之生產者。
根據本發明亦可使用其他微生物菌株，包括例如能夠積聚大量例如可用於提高農業、園藝業、家畜飼養及水產養殖之生產的酶、酸、蛋白質、生物界面活性劑、礦物質或維生素的其他微生物菌株。
提高農業、園藝業、家畜生產及水產養殖之生產的方法 在某些實施例中，本發明提供用於提高農業、園藝業、家畜生產及/或水產養殖之生產的環境友好、具有成本效率的物質及方法。更特定地，本發明提供使用本發明之基於微生物之產物來改良所培養植物、真菌及/或動物之健康及品質的方法。在一個實施例中，提供用於飼養家畜及/或養殖魚類之方法。
特定地，本發明提供提高選自農業、園藝業、家畜生產及水產養殖之產業生產的方法，其中將有效量的本發明之基於微生物之組合物施用於所選產業有關之特定施用點或目標點。施用點將取決於產業，且可包括例如植物及/或其環境或動物及/或其環境。
如本文中所使用，將組合物或產物「施用」於目標或位點或者「處理」目標或位點係指使組合物或產物與目標或位點接觸，以使得組合物或產物可影響該目標或位點。該影響可由於例如微生物生長及/或代謝物、酶、生物界面活性劑或其他生長副產物之作用。施用或處理可包括將基於微生物之組合物直接施用於植物、真菌、動物及/或其周圍環境。
施用可進一步包括使組合物或產物與植物、植物部分及/或植物之周圍環境(例如土壤)直接接觸，或與動物、動物身體部分及/或動物之周圍環境(例如動物之食物源)直接接觸。舉例而言，本發明之基於微生物之產物可以液體或乾粉、粉塵、細粒、微粒、顆粒、可潤濕粉末、可流動粉末、乳液、微膠囊、油、凝膠、糊狀物或噴霧劑之形式噴灑。
在一個實施例中，本發明允許基於微生物之產物在農業及園藝環境中之現場施用。舉例而言，本發明之基於微生物之產物可經由沖洗系統、以噴霧形式、以種子處理形式施用於土壤表面，施用於農作物、植物或真菌之表面，及/或施用於害蟲表面。亦有利於經由習知工具進行機械施用或經由空中或地面「無人機」進行機器人施用。可選擇植物之任何部位來藉由本發明處理，該等部位包括(但不限於)果實、花、鱗莖、葉子、穀粒、根、種子及/或莖幹。
在一個實施例中，本發明允許基於微生物之產物在家畜生產環境中之現場施用。基於微生物之產物可例如以口服、靜脈內、皮下之方式或作為局部藥物或補充品直接施用於動物，或施用於動物之食物及/或水源中。基於微生物之產物亦可例如以噴霧或塗層之方式施用於動物之生活環境，施用於地面或圍籬表面，或直接施用於害蟲表面。
在一個實施例中，本發明允許基於微生物之產物在水產環境中之現場施用。可例如藉由將組合物抽汲、噴塗、傾倒或噴射至養魚場之水中，或藉由例如將組合物塗佈或鋪展至養魚場之各種表面、牆壁或圍籬上，而將基於微生物之產物施用於養魚場。此外，該等組合物可例如以食物源之形式施用於動物本身。
微生物在施用時可具有活性(或具有活力)或不具有活性。在活性微生物的情況下，微生物可在施用點處原地生長，且就地產生任何活性化合物或生長副產物。因此，在處理場所(例如CAFO或養魚場)可容易且不間斷地獲得高濃度的微生物及有益的生長副產物。
為此目的，該等方法可進一步包含在施用期間添加用以促進微生物生長之物質(例如，添加用以促進微生物生長之營養素)。在一個實施例中，營養素來源可包括例如氮、硝酸鹽、磷、鎂及/或碳。
在一個實施例中，該等方法進一步包含在施用之前培養基於微生物之組合物。較佳地，在施用點處或附近培養基於微生物之組合物，例如在距該施用點100哩以內進行培養。
在一些實施例中，提供用於以下之方法：預防及/或處理有害的單細胞或多細胞生物體造成之感染或傳染；改良土壤及促進農作物生長；及/或促進家畜及魚類之生長及增進其健康。
在一個實施例中，提供一種用於處理及/或預防感染、傳染、疾病及/或其擴散之方法。在特定實施例中，有害的感染、傳染及/或疾病係由有害的單細胞或多細胞生物體造成，該等有害的生物體包括(但不限於)對以下有害的真菌、細菌、寄生蟲及/或線蟲：植物、真菌及/或農作物；家畜及其他陸地動物；及/或魚類及其他水生生物體。
在一個實施例中，該方法包含將包含畢赤酵母屬酵母菌及/或其生長副產物之基於微生物之組合物施用於一位點，在該位點中，該組合物殺滅有害真菌及/或競爭性地抑制其生長；殺滅有害的革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌及/或競爭性地抑制其生長；殺滅有害的腸蟲寄生蟲；及/或殺滅有害的線蟲。此等酵母菌(其中之每一者具有獨特的殺滅能力)之組合產生例如有機農業、有機畜牧及有機水產養殖產業中之有效的協同性生物控制劑。
有利地，該等方法在不使用刺激的化學物質或抗生素的情況下改良植物、家畜及養殖魚類之免疫及/或病原防禦。
在特定實施例中，該方法用於藉由預防及/或處理農業環境中農作物、植物及/或真菌之感染、傳染及/或疾病而提高農業生產。
本發明對其有效的影響植物之細菌感染之實例包括(但不限於)丁香假單胞菌致病變型(Pseudomonas syringae pathovars )；青枯菌(Ralstonia solanacearum )；根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )；水稻黃單胞菌水稻致病變型(Xanthomonas oryzae pv . oryzae )；野油菜黃單胞菌致病變型(Xanthomonas campestris pathovars )；地毯草黃單胞菌致病變型(Xanthomonas axonopodis pathovars )；解澱粉歐文菌(Erwinia amylovora )；葉緣焦枯病菌(Xylella fastidiosa )；基氏菌(Dickeya ) (菊歐文氏桿菌(dadantii )及早疫病菌(solani ))；胡蘿蔔軟腐病果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum ) (及黑脛病菌(Pectobacterium atrosepticum ))；密執安棍狀桿菌(Clavibacter michiganensis ) (密執安棍狀桿菌(michiganensis )及密執安棍狀桿菌壞腐亞種(sepedonicus ))、油橄欖癌腫假單胞菌(Pseudomonas savastanoi )及柑橘黃龍病菌亞洲種(Candidatus Liberibacter asiaticus )。
本發明對其有效的影響植物之病毒感染之實例包括(但不限於)香石竹潛隱病毒(Carlavirus )、檾麻(Abutilon )、大麥病毒(Hordeivirus )、馬鈴薯Y病毒(Potyvirus )、玉米線條病毒(Mastrevirus )、桿狀DNA病毒(Badnavirus )、呼腸孤病毒科(Reoviridae )、斐濟病毒(Fijivirus )、水稻病毒(Oryzavirus )、植物呼腸孤病毒(Phytoreovirus )、真菌呼腸孤病毒(Mycoreovirus )、黑麥草花葉病毒(Rymovirus )、小麥花葉病毒(Tritimovirus )、番薯屬病毒(Ipomovirus )、大麥黃花葉病毒(Bymovirus )、南瓜花葉病毒(Cucumovirus )、黃矮病毒(Luteovirus )、菜豆金黃花葉病毒(Begomovirus )、彈狀病毒科(Rhabdoviridae )、西紅柿斑萎病毒(Tospovirus )、豇豆花葉病毒(Comovirus )、南方菜豆花葉病毒(Sobemovirus )、線蟲傳多面體病毒(Nepovirus )、菸草脆裂病毒(Tobravirus )、甜菜壞死黃脈病毒(Benyvirus )、真菌傳棒狀病毒(Furovirus )、花生叢簇病毒(Pecluvirus )及馬鈴薯帚頂病毒(Pomovirus )。
亦可使用本發明處理線蟲。線蟲之實例為：異皮線蟲屬(Heterodera ) (例如大豆孢囊線蟲(H . glycines )、燕麥孢囊線蟲(H . avenae )及甜菜孢囊線蟲(H . shachtii ))及球異皮線蟲屬(Globodera ) (例如馬鈴薯金線蟲(G . rostochiens )及馬鈴薯白線蟲(G . pallida ))之孢囊線蟲；毛刺線蟲屬(Trichodorus )之粗短根線蟲；莖線蟲屬(Ditylenchus )之鱗莖及莖幹線蟲；馬鈴薯異皮線蟲屬(Heterodera rostochiensis )金線蟲；根瘤線蟲屬(Meloidogyne ) (例如，爪哇根瘤線蟲(M . javanica )、北方根瘤線蟲(M . hapla )、花生根瘤線蟲(M . arenaria )及南方根瘤線蟲(M . incognita ))之根癭線蟲；短體線蟲屬(Pratylenchus ) (例如古氏短體線蟲(P . goodeyi )、穿刺短體線蟲(P . penetrans )、最短尾短體線蟲(P . bractrvurus )、玉米短體線蟲(P . zeae )、咖啡短體線蟲(P . coffeae )、最短尾短體線蟲及索雷短體線蟲(P . thornei ))之根腐線蟲；半穿刺線蟲屬(Tylenchulus )之柑橘半穿刺線蟲；及刺線蟲屬(Belonalaimus )之刺線蟲。
本發明方法及組合物對其有效的其他植物或農作物疾病包括造成以下情形之害蟲及/或致病菌：枯萎病、潰瘍病、腐爛、枯萎、銹病、炭疽病、細菌性斑點病、根腫病、玉米黑粉病、蟲癭、猝倒病、霜黴病及白粉病、瘡痂病、葉斑病、發黴、嵌紋病毒、葉皰病及卷葉病。
在另一實施例中，該方法用於藉由預防及/或處理家畜及其他陸地動物之感染、傳染及/或疾病而提高家畜生產。
本發明方法及組合物對其有效的疾病之實例包括(但不限於)念珠菌病(Candidiasis )、癬菌病、牛呼吸道疾病綜合征、黑腿病(梭菌性(Clostridial )黑腿病)、牛呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹瀉、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus Somnus )、牛感染性鼻氣管炎、溶血巴斯德菌(Pasteurella Haemolytica )及多殺巴斯德菌(Pasteurella Multocida )、狂犬病、禽痘、流行性感冒、新城雞瘟(Newcastle disease)、感染性鼻黏膜炎、家禽霍亂、大腸桿菌病(Colibacillosis )、波氏桿菌病(Bordetellosis )、麯黴病(Aspergillosis )、黴漿菌(Mycoplasmas )、東方馬腦炎、肉毒中毒、出血性腸炎、沙門氏菌(Salmonella )、潰瘍性或壞死性腸炎、雞白痢、禽傷寒、球蟲目(Coccidia )、蠕蟲(例如，蛔蟲、鞭蟲、腎蟲)、黑頭粉刺、葡萄球菌(Staphylococcus )、鏈球菌(Streptococcus )、細小病毒(parvovirus)、鉤端螺旋體病(Leptospirosis )及其他疾病。
在另一實施例中，該方法用於藉由預防及/或處理養魚場中之魚類及其他水生及/或海洋生物體之感染、傳染及/或疾病來提高水產養殖之生產。較佳地，根據此實施例之基於微生物之組合物的酵母菌以不活化狀態施用於養魚場。
本發明方法及組合物對其有效的致病菌之實例包括(但不限於)：病毒(例如水生雙RNA病毒(Aquabirnavirus )、β野田病毒(Betanodavirus )、正黏病毒(Orthomyxovirus )、α病毒(Alphavirus )、棒狀病毒(rhabdoviruses)及蛙病毒(Ranavirus ))；細菌(例如螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens )、氣單胞菌(Aeromonas )、愛德華氏菌(Edwardsiella )、產黃菌(Flavobacterium )、弗朗西斯氏菌(Francisella )、發光桿菌(Photobacterium )、魚立克次體(Piscirickettsia )、假單胞菌(Pseudomonas )、黃桿菌(Tenacibaculum )、弧菌(Vibrio )、耶爾森菌(Yersinia )、乳球菌(Lactococcus )、腎桿菌(Renibacterium )及鏈球菌(Streptococcus ))；真菌(例如水黴菌(Saprolegnia )、麴菌(Aspergillus )、青黴菌(Penicillium )、外瓶黴菌(Exophiala )、魚孢黴菌(Ichthyophonus )、鰓黴菌(Branchiomyces )、膚孢蟲(Dermocystidium )、原壁菌(Prototheca )、顫藍細菌(Oscillatoria )、草莖點黴菌(Phoma herbarum )及擬青黴菌(Paecilomyces ))；水黴菌(例如水黴屬(Saprolegnia ))；及寄生蟲(例如線蟲、絛蟲、蛔蟲、水蛭、蝨子、多細胞動物寄生蟲(諸如橈足動物)、單細胞寄生蟲(諸如多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis ))及蠕蟲(諸如胃瘤線蟲(Eustrongylides )))。
可使用本發明緩解或預防之水生病毒性疾病包括(但不限於)感染性胰臟壞死、病毒性神經壞死、鮭魚貧血病毒、胰臟疾病、感染性造血壞死病毒及病毒性出血性敗血症病毒及流行性造血壞死病毒)。
可使用本發明緩解或預防之水生細菌性疾病包括(但不限於)腐鰭病、魚水腫、運動型氣單胞菌敗血症、癤瘡、金黃細菌病(chryseobacteriosis)、鯰魚腸敗血症、愛德華氏菌病(edwardsiellosis disease)或腐敗性疾病、柱狀病、假柱狀病、弗拉維細菌病(flavobacteriosis)或虹鱒魚弗雷症候群(rainbow trout fry syndrome)、細菌性鰓病、弗朗西斯氏菌病(francisellosis)、冬季潰瘍病、巴斯德菌病(pasteurellosis)、魚立克次氏體病或立克次體敗血症、假單胞菌敗血症或赤斑病、黏著桿菌病(tenacibaculosis)、弧菌病(vibrosis)、耶爾森菌病(yersiniosis)或紅口病、乳酸菌病(lactococcosis)、奴卡菌病(nocardiosis)、細菌性腎病、葡萄球菌病、鏈球菌病及出血性敗血症。可使用本發明緩解或預防之其他水生疾病或傳染病包括腐鰓病、魚孢黴菌疾病、水黴病、絲絨病、頭洞症及眩暈病。
在本發明之其他實施例中，提供藉由使土壤肥沃而提高農業生產之方法，其中將本發明之基於微生物之組合物施用於土壤。藉由將包含一或多種所培養畢赤酵母屬酵母菌以及視情況存在之一或多種佐劑的組合物施用於土壤，本發明方法可提高農作物產量且提高所長出的農產品及植物產物之品質，此係由於例如存在有益的微生物代謝物，諸如植酸酶、胺基酸、蛋白質、維生素及微量元素。在特定實施例中，佐劑為富里酸、腐植酸及/或腐植酸鹽。
有利地，植酸酶之存在允許處理及/或預防植物之營養素缺乏。特定言之，本發明在施用於植物周圍的土壤時可用於處理及/或預防植物之磷缺乏。
在另一實施例中，本發明可用於節省磷酸鹽。當磷酸鹽以不可溶形式存在於土壤中時，磷酸鹽留存在土壤中，無法被植物根系統吸收。藉由向土壤中添加三-P 產物，磷酸鹽可轉化成植物可回收之更可溶形式。
本發明進一步提供使用本發明之基於微生物之組合物餵養家畜之低成本物質及方法。在一個實施例中，基於微生物之組合物作為膳食補充品與動物飼料或飲用水一起調配，或施用於動物飼料或飲用水。
例如藉由將組合物與傳統家畜飼料一起放入飼槽中且使家畜攝入組合物，組合物可用作家畜之高營養補充食物來源。在一個實施例中，組合物可與飼料組分混合且調配成均一、均質化的顆粒。作為食物補充品，基於微生物之產物可提供植酸酶及額外胺基酸、蛋白質、維生素及微量元素源以及其他益處。
在一些實施例中，基於微生物之組合物可進一步用於處理及/或預防家畜之營養素缺乏。特定言之，本發明可用作膳食補充品，藉由為家畜之飼料源補充植酸酶而處理及/或預防家畜之磷缺乏。
有利地，本發明可用於降低餵養家畜之成本，同時促進家畜動物生長且增進其健康，例如藉由支持其免疫系統及提供額外的磷、胺基酸、蛋白質、維生素及其他微量元素源。
在另一實施例中，本發明提供使用本發明之基於微生物之組合物餵養魚類之低成本物質及方法。例如藉由將基於微生物之組合物引入魚類環境中且使魚類攝入該組合物及/或飼料，該組合物可用作魚類之高營養膳食補充品。該組合物亦可施用於標準魚飼料或與標準魚飼料組合，且餵食給養殖魚類。有利地，本發明可用於降低餵養養殖魚類之成本。
在一些實施例中，本發明提供藉由改良養殖魚類之營養素吸收而提高水產養殖生產之方法。特定言之，本發明微生物所產生之生物界面活性劑在被魚類攝入時，藉由改良魚類消化道內對營養素(包括脂溶性維生素)之吸收而促使養殖魚類之整體健康及品質提高。
該組合物可例如以液體溶液之形式或以乾粉、粗粉、薄片或顆粒之形式施用於魚類環境，諸如養魚場的水。有利地，在與用習知魚粉餵養之魚類相比時，攝入本發明組合物之魚類重量增加，其中大部分體重增加係由於伴隨體脂百分比下降之體蛋白質百分比增加。
在另一實施例中，本發明提供為魚類餵養進行補充之方法，以及降低餵養魚類成本之方法。本發明之基於微生物之組合物可作為包含非活性酵母細胞之單細胞蛋白質源施用於魚類環境中，密集量的該等非活性酵母細胞提供大量蛋白質、碳水化合物、脂質、脂肪酸、胺基酸、礦物質及維生素。在一些實施例中，基於微生物之組合物可用於處理及/或預防家畜之營養素缺乏。特定言之，本發明可用作膳食補充品，藉由為養殖魚類之飼料源補充植酸酶而處理及/或預防養殖魚類之磷缺乏。
由於傳統魚源性及魚油源性飼料之成本增加，許多水產養殖企業已開始使用基於穀物之飼料來餵養魚類。當前使用諸如玉米、大豆及高粱之成分來製造魚飼料。儘管尚未確鑿知曉基於穀物之食物對魚類自身健康之影響，但仍具有隨時間推移變得不合期望的可能。
此外，例如海鮮產業的成功部分依賴於人類食用海鮮之誘人健康益處，諸如高含量的Ω-3脂肪酸。藉由將養殖魚類自肉食或雜食轉變為絕對草食，最終魚類產品之營養含量可改變，例如魚類產品之脂肪酸含量可能降低。此類改變對海鮮產業以及人類營養之影響可為廣泛的。
由此，藉由充當現有魚類飼料之補充品，本發明可用於緩解使用傳統基於魚類之魚飼料的成本增加。本發明可降低餵養魚類之成本，同時考慮到繼續使用傳統的基於魚類之飼料，其皆不損害養殖魚類之健康及品質。
實例 根據藉助於說明給出之以下實例可更加理解本發明及其多種優勢。以下實例說明本發明之方法、應用、實施例及變體中之一些。該等實例不應被視為限制本發明。關於本發明可進行眾多改變及修改。
實例1——畢赤酵母屬酵母菌產物「三-P 」之培養 為了降低培養適用於本發明之畢赤酵母屬酵母菌之成本，且為了建立此等酵母菌之低成本及高效工業規模生產，提供醱酵系統及方法。
藉由使用非習知技術且在可有效促進生長及代謝物產生之好氧條件下培養酵母菌來實現三-P 之生產。較佳地，單獨地培養畢赤酵母屬菌株中之每一者，其後使用機械混合器合併所得培養物以形成三-P 產物。
有利地，本發明之系統及方法對於任何規模之作業而言為便宜的，且可實際上生產無限量的基於酵母之產物。此外，該等系統可由例如先前幾乎沒有接觸過醱酵系統之農戶或栽培者操作。
醱酵以分批製程方式在可擴展反應器中進行，較佳地不進行攪拌。使用包含豎直的平行六面體貯槽之便攜式、分散式反應器。該系統裝備有包含兩個管道系統之混合系統，每一管道系統裝備有抽汲機構以將培養物自貯槽及沈積物底部抽吸至貯槽頂部中。使用空氣壓縮機向系統中添加經過濾空氣，以用於為移動的培養物通氣。
藉由鼓泡機構控制經過濾空氣至貯槽中之添加，該經過濾空氣穿過鼓泡器。經由大容量水抽汲系統產生用於鼓泡之經過濾空氣。每個貯槽總共存在兩個72吋起泡器。
反應器具有用於培育酵母菌以用於細胞及代謝物生產之550-1,000公升的工作體積；然而，反應器之尺寸、材料(例如金屬)及組態可變化(視需求而定)。
由於並未使用傳統方法來對反應器進行滅菌，因此培養物生產之成本降低。替代地，對於畢赤酵母屬生產而言，殺手酵母菌能夠自滅菌，亦即，其生長副產物防止任何可能的外部微生物污染培養物。此外，可使用一種空容器衛生清潔方法，該方法包括用1%過氧化氫處理內表面且用漂白劑及高壓熱水沖洗。
可藉由20-30公升活躍生長的培養物來進行反應器之接種，以確保接種物質中存在所需毒素及/或其他生長副產物且避免可能的污染物增加，或藉由使用濃縮的畢赤酵母屬上清液來進行反應器之接種。此外，可在pH水準2.5-3.5下開始接種，且在醱酵循環早期階段期間在12小時之後增加至4.5-5.0。
儘管醱酵之溫度及pH並非關鍵的，但通常溫度應在約25℃至小於37℃之間，較佳在約25℃至30℃之間。pH水準應介於約3.0至約5.0之間，較佳介於約3.5至約4.5之間。儘管在醱酵期間不需要pH穩定，但建議在pH下降至低於3.0時將其升高至3.5-4.0。
視需要，可使用此項技術中已知之手動或自動技術來實現醱酵期間pH之控制或維持，諸如使用自動pH控制器來添加鹼。用於pH控制之較佳鹼包括(但不限於) NaOH及KOH。
可使用諸如NYDB (每公升水10 g營養素培養液、8 g酵母提取物、20 g右旋糖)、PDB (馬鈴薯右旋糖培養液)、ME (麥芽提取物)之複合培養基及補充有各種碳源(諸如葡萄糖、蔗糖、山梨醇、糖蜜等)之化學成分確定之培養基，藉由醱酵產生畢赤酵母。
然而，視需要，可藉由僅具有如下所列之三種主要組分而進一步降低培養基成本。
Figure 107126028-A0304-0001
典型的生長時間為48小時至72小時，且CFU濃度為6億至10億個細胞/毫升。
現成的培養物為用於多種應用之最終產物。然而，視需要，可藉由離心、過濾或沈澱收集酵母細胞。可藉由添加鹽、丙三醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、胺基酸來保存所產生之酵母菌糊狀物(濕生物質)，以在儲存期間延長貯存期限。
大部分市售酵母菌產物係藉由高速離心以使酵母細胞與液體培養基分離而產生。可藉由冷凍乾燥、流化床乾燥或噴霧乾燥來乾燥所收集酵母細胞。在準備使用時乾燥產物將在水中再次水合。此等步驟將損害細胞壁且導致細胞死亡。
若酵母細胞在使用之前必須儲存較長時間，則應將其置放於合適的容器中且儲存在4℃下。在使用此方法時，酵母細胞在兩天內沈降在容器底部。可藉由吸出液體來移除培養基上清液，留下少量上清液以覆蓋酵母細胞。在此等條件下，且在儲存六個月之後，畢赤酵母細胞之生存力不會顯著降低。
實例2——計算使用異常畢赤酵母之植酸酶生產 在醱酵反應器中，在調整為5.0之pH下，用以下生長培養基培育異常畢赤酵母72小時：糖蜜(4%)、脲(0.2%)、蛋白腖(2.5%)。
藉由使芝麻種子破裂/破碎而自該等芝麻種子獲得植酸。隨後將種子部分(5 g)添加至10 mL水中且混合。測試培養基及細胞是否存在植酸酶。使用0.2 M甘胺酸緩衝液將pH調整為4，且亦將植酸之pH調整為4。
3天後，藉由製備6個不同標準物來量測植酸酶活性： 0) 550微升水 1) 10微升的50 mM磷酸鉀及540微升水 2) 20微升的50 mM磷酸鉀及530微升水 3) 30微升的50 mM磷酸鉀及520微升水 4) 40微升的50 mM磷酸鉀及510微升水 5) 50微升的50 mM磷酸鉀及500微升水
使用500 µL植酸、25 µl的0.2 M甘胺酸緩衝液及25 µl水來製備十五個植酸空白。
使用25 µl植酸酶、25 µl的0.2 M甘胺酸緩衝液及500 µl水來製備十五個植酸酶樣品空白。
使用500 µL植酸、25 µl的0.2 M甘胺酸緩衝液及25 µl植酸酶來製備十五個植酸酶樣品。
將4 ml丙酮-鉬酸銨-H2 SO4 (50 ml-25 ml-25 ml)之溶液添加至6種標準物中之每一者中。
將樣品及空白中之每一者轉移至水浴中，在37℃下保持30分鐘。30分鐘後，快速將4 ml丙酮-鉬酸銨-H2 SO4 溶液添加至樣品及空白中之每一者中，以使磷酸鹽沈澱。隨後對其進行離心，且將300 µl上清液溶解於600 µl水中。
接下來，將500 µl所有樣品、空白及標準物上裝至Varioscan設備孔培養盤中，且在400 nm下量測吸光度。
量測3次標準物值且取其平均值。自標準物1至5的值中之每一者減去標準物0值，以得到與特定濃度之磷酸鹽之吸光度相關的數值。表1中報導標準物中之每一者之平均吸光度。表2中報導樣品及空白之平均吸光度。
Figure 107126028-A0304-0002
Figure 107126028-A0304-0003
為了確定所釋放磷酸鹽之毫莫耳，將植酸空白之平均吸光度加上植酸酶樣品空白之平均吸光度，且自植酸酶樣品之平均吸光度減去植酸酶樣品空白之平均吸光度。所得數值為0.012 OD。基於圖 1 ，所釋放磷酸鹽之值為0.198 mM。 (1) 酶活性(單位/毫升) =( 磷酸鹽 (mM)) × ( 稀釋係數 ) (次數) × (所添加酶的量)
最後，根據上面方程式1，計算出反應器中之植酸酶濃度為792單位/毫升。
實例3——三-P 於番茄植物之應用 用三-P 產物處理番茄植物。番茄植物高度增加20%至25%。此外，所生產的果實數目及所生產的果實大小均增加50%。
圖 1 示出描繪如用於判定異常畢赤酵母之植酸酶生產活性的磷酸鹽濃度之曲線圖。

Claims (14)

  1. 一種提高農業及園藝業之生產的組合物，該組合物包含異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)及季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)及其生長副產物，及含有或不含載劑。
  2. 如請求項1之組合物，其進一步包含選自富里酸(fulvic acid)、腐植酸及腐植酸鹽之佐劑。
  3. 如請求項1之組合物，其進一步包含用於微生物生長之補充營養素。
  4. 如請求項1之組合物，其中該等微生物生長副產物為酶、酸、溶劑、醇、蛋白質、維生素、礦物質、微量元素、胺基酸及/或生物界面活性劑。
  5. 如請求項1之組合物，其中該等微生物生長副產物包含植酸酶。
  6. 一種提高農業及園藝業生產的方法，其中該方法包含將有效量的如請求項1至5之組合物施用於植物及/或植物周圍環境。
  7. 如請求項6之方法，其用於預防及/或治療有害的單細胞或多細胞生物體，包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲及/或線蟲所引起之感染、侵害及/或 疾病。
  8. 如請求項7之方法，其用於控制線蟲。
  9. 如請求項6之方法，其中該組合物施用於土壤。
  10. 如請求項9之方法，其中該方法使農作物產量增加。
  11. 如請求項9之方法，其用於治療及/或預防植物之營養素缺乏。
  12. 如請求項11之方法，其中該營養素缺乏為磷缺乏。
  13. 如請求項6之方法，其進一步包含在施用於該植物及/或植物周圍環境之前培養該微生物及/或其生長副產物。
  14. 如請求項13之方法，其中在分散式反應器內之培養基中培養該微生物，該培養基包含：4%糖蜜，0.2%脲，及2.5%蛋白腖。
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