KR20200024939A - 피치아 효모의 효율적인 생산 및 식물과 동물 건강을 향상시키기 위해 이들을 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 배양된 미생물 및/또는 그 성장 부산물을 포함하는 미생물 기반 조성물(microbe-based composition)뿐만 아니라, 이들 조성물을 생산 및 사용하기 위한 방법과 시스템을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 피치아 클레이드(Pichia clade)로부터 선택된 생물학적으로 순수한 효모, 및/또는 생물 계면활성제, 효소 및 용매와 같은 그 성장 부산물(growth by-product)을 포함하는 미생물 기반 조성물을 제공한다. 농업, 원예, 가축 사육 및 양식 산업에서 생산을 향상시키기 위해 이들 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

피치아 효모의 효율적인 생산 및 식물과 동물 건강을 향상시키기 위해 이들을 사용하는 방법

관련 특허 출원에 대한 상호 참조

이 출원은 2017년 7월 27일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/537,670호와 2017년 9월 27일에 출원된 제62/563,992호에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각은 본원에 완전히 참조로 포함되어 있다.

농업, 원예, 축산 및 양식 산업에서, 특정한 공통적인 문제는 비용은 낮게 유지하면서 생산 수확량을 최대화하는 농업인들의 능력을 방해한다. 이러한 것은, 세균(bacteria), 균류(fungi), 및 다른 유해생물(pest)과 병원체(pathogen)에 의해 발생하는 감염(infection)과 체내 침입(infestation); 이들의 환경 및 건강 영향을 포함하는, 사료 및 화학 비료의 높은 비용; 필수 영양소, 특히, 인산염을 사용 가능한 형태로 가용화시키는 어려움을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

농업 및 원예 산업에서, 농업인들은 농작물 수확량을 증대시키고 농작물을 병원체, 유해생물, 및 질병으로부터 보호하기 위해 합성 화학 물질과 화학 비료를 사용하는 것에 크게 의존하였지만; 과도하게 사용되거나 부적절하게 적용되면, 이들 물질은 지표수로 흘러 들어가서, 지하수에 용해되어, 공기 중으로 증발할 수 있다. 대기 및 수질 오염의 원인으로서, 이들 물질의 책임 있는 사용은 생태학적 및 상업적으로 불가피한 것이다. 적절히 사용된 경우라도, 특정 화학 비료와 농약의 과도한 의존과 장기간의 사용은 토양 생태계를 해롭게 바꾸고, 스트레스 내성을 감소시키며, 유해생물 저항성을 증가시키고, 식물과 동물의 성장과 활력을 방해한다.

가축과 양식의 경우, 사료를 공급하는 비용이 상당할 수 있다. 예를 들어, 특히 대규모 양식의 경우, 어류 집단에게 사료를 공급하는 것이 양식 운영 지출의 대부분을 차지한다. 어류의 식량은, 아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 콜레스테롤 및 필수 지방산을 포함하는, 적절한 영양 공급을 위해 필요한 폭 넓은 다른 성분과 함께 소화가 매우 잘 되는 단백질 공급원을 포함해야 한다. 전통적으로, 사료 공급원은, 예를 들어, 자연산 또는 양식 어류로부터 생산된 생선 가루(fish meal)(예를 들어, 생선 가루, 새우 믹스, 및 오징어 가루)를 포함하였지만; 전통적인 어류 및 어유(fish oil) 유래 사료를 만들기 위한 양식 및 어류 생산의 비용이 증가하는 것으로 인해, 많은 양식 작업이 어류에게 사료를 공급하기 위해 곡물 기반의 사료(grain-based feed)를 활용하기 시작했다. 옥수수, 콩, 통밀 및 수수와 같은 성분이 어류 사료를 제조하기 위해 현재 사용되고 있다. 곡물 기반 식단으로 인한 어류 자체의 건강에 미치는 영향은 결정적으로 알려져 있지는 않지만, 그럼에도 불구하고, 장기적으로 바람직하지 않은 결과를 초래할 가능성이 있다.

대규모의 축산 작업은 전형적으로 동물의 최적 성장을 위해 필요한 탄수화물, 섬유질, 및 단백질을 제공하도록 옥수수 및 콩과 같은 사료 곡물에 의존한다. 이들 식품은, 그 위(stomach)가 풀과 기타 고-셀룰로오스 함유 식물을 소화하는 데 가장 적합한 동물에게는 최적이 아니고, 이는 다수의 문제를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 곡물 기반 사료에 의존하는 축산 작업은 흔히 질병의 확산을 막기 위해 항생제에 의존해야만 하는데, 이는, 적절하지 못한 식단이, 매우 집중된 사료 공급 작업의 조밀한 생활 조건과 함께, 면역 체계가 손상된 동물을 생기게 하기 때문이다.

농작물 식물과 사육 동물 모두를 먹이고 보호하는 비용 외에, 영양 결핍, 특히, 인(phosphorous) 결핍은 이들 산업에 대해서 흔히 지속적인 문제이다. 인산염 형태의 인은 모든 유기체의 성장과 활력을 위한 많은 다른 기능뿐만 아니라, 유전 물질과 ATP의 생합성을 위해 필요하다. 식물에서 인 결핍을 예방 또는 치료하기 위해, 재배업자는 흔히 인 함유 비료를 전형적으로 토양에 적용한다. 그러나, 이들 화합물을 토양에 적용하는 것이 식물이 인을 흡수하여 사용할 수 있을 것이라는 것을 보장하지는 않는다. 피테이트(phytate)와 같은 인의 일부 형태는 불용성이거나 또는 그렇지 않으면 식물의 뿌리에 의해 흡수될 수 없다. 피테이트는 인, 에너지, 양이온 및 미오이노시톨(세포벽 전구체)을 위한 저장소로 작용하고, 이러한 형태로 남아서, 식물과 비반추 동물(non-ruminant animals)에 의해 활용될 수 없다.

토양에 식물-생체 이용 가능한 인이 적은 지역에서 방목하는 것과 같은 사육 동물에 대해서, 인 결핍은 불임, 우유 생산 감소(예를 들어, 소에서), 및 부적당한 골광화(bone mineralization)(예를 들어, 어류, 포유류, 및 가금류)를 포함하는 문제를 일으킬 수 있다. 식이성 보충(예를 들어, 무기 사료 인산염을 이용한)은 이러한 문제를 해결하는 가장 일반적인 방법이지만, 대규모로 사용할 경우 비용이 많이 들어갈 수 있다.

식량과 소비성 제품을 생산하는 지속 가능한 방법을 위한 세계적인 요구를 해결하기 위해, 세균, 효모 및 균류와 같은 미생물뿐만 아니라, 이들의 부산물이 농업과 원예, 축산, 임업, 및 토양, 물 및 기타 천연 자원의 복원을 포함하는 많은 환경에서 점점 더 유용해지고 있다. 예를 들어, 농업인들은 생물 농약(biopesticide) 및 생물 비료(biofertilizer)로서 생 미생물(live microbes), 이로부터 유래된 생물 제품(bio-products) 및 이들의 조합물과 같은 생물학적 작용제의 사용을 환영하고 있다. 이들 생물학적 작용제는 다음을 포함하여 다른 종래의 농약과 비료에 비해서 중요한 이점을 갖는다: 1) 이들은 종래의 화학 물질에 비해 덜 해롭고; 2) 이들은 더 효율적이고 특이적이며; 3) 이들은 흔히 빠르게 생분해되어, 환경 오염을 덜 일으킨다.

대규모로 식료품을 생산하는 경제 비용과, 현재 생산 방법의 건강과 환경에 미치는 불리한 영향은, 세계의 증가하는 인구에 식량을 공급하는 지속 가능성과 노력에 계속해서 부담을 준다.

따라서, 농작물, 가축 및 어류를 저렴한 비용으로 생산하는 개선된 무독성의 환경 친화적인 방법에 대한 계속된 필요성이 있다. 특히, 농업, 가축, 및 양식에서 질병 및 체내 침입의 확산을 치료 및 예방하기 위한 제품; 향상된 농작물 성장을 위한 토양 보충; 및 농작물, 동물 및 인간 소비자의 건강과 활력을 모두 손상시키지 않으면서, 가축과 양식 어류에게 사료를 공급하는 비용을 감소시키는 것에 대한 필요성이 있다.

본 발명은, 미생물뿐만 아니라, 생물 계면활성제(biosurfactant), 대사물질(metabolite) 및/또는 효소와 같은 이들의 성장의 부산물을 제공한다. 본 발명은 또한 이들 미생물과 이들의 부산물을 사용하는 방법뿐만 아니라, 이들을 생산하기 위한 방법과 시스템을 제공한다. 유리하게는, 본 발명의 미생물 기반 제품과 방법은 환경 친화적이고 조작 친화적(operational-friendly)이며 비용 효과적이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은, 배양된 미생물 및/또는 그 성장 부산물을 포함하는 미생물 기반 조성물뿐만 아니라, 이들 조성물을 생산하는 방법과 농업, 원예, 가축 사육 및 양식에서 이들을 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 미생물 기반 조성물은 식물과 동물에서 감염 또는 체내 침입을 예방 및/또는 치료하고; 토양을 개량하고 농작물 식물의 성장을 향상시키며; 및/또는 가축과 어류의 성장과 건강을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 미생물 기반 조성물은, 균류, 세균, 기생충, 및 선충류(nematode)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 해로운 단세포 또는 다세포 유기체에 의해 발생한 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 억제함으로써 식물, 인간 또는 동물을 보호하고; 수확량과 농산물(produce)의 품질을 향상시키며; 토양을 비옥하게하고; 가축 사료를 보충하고; 및/또는 어류와 수생 동물 사료를 보충하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 용도를 위한 방법이 또한 본원에 제공된다.

특정 실시예에서, 본 발명의 미생물 기반 조성물의 미생물은, 예를 들어, 피치아 아노말라(P. anomala){윅케르하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus)}, 피치아 쿠드리아제비(P. kudriavzevii){윅케르하모마이세스 쿠드리아제비(Wickerhamomyces kudriavzevii)}, 및/또는 피치아 구일리에르몬디(P. guilliermondii){메이에로지마 구일리에르몬디(Meyerozyma guilliermondii)}, 및/또는 이들의 조합물과 같은 피치아 클레이드(Pichia clade)로부터 선택된 생물학적으로 순수한 효모이다. 다른 피치아 클레이드 효모, 또는 이와 밀접하게 관련된 효모(예를 들어, 동일한 속 또는 과에 속하는) 및/또는 그 성장 부산물의 포함이 또한 예상된다.

본 발명의 미생물 기반 조성물은 소규모 내지 대규모 범위의 배양 공정을 통해 얻어질 수 있다. 이들 배양 공정은, 수중 배양(submerged cultivation), 고체 상태 발효(solid state fermentation, SSF), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

조성물 중의 효모는 활성 또는 비활성 형태일 수 있다. 또한, 조성물은 효모의 배양으로 생긴 발효 브로스(fermentation broth)를 또한 포함할 수 있고, 이는 특히 세포 성분 및 생물 계면활성제, 대사물질 및/또는 효소와 같은 미생물 성장 부산물을 포함할 수 있다. 유리하게는, 조성물의 직접적인 사용은, 즉, 추가적인 안정화, 보존, 및 저장 없이, 미생물의 높은 생존력(viability)을 유지하고, 이질적인 작용제(foreign agent)와 바람직하지 않은 미생물로부터 오염될 가능성을 감소시키며, 미생물 성장의 부산물의 활성을 유지한다.

특정 실시예에서, 미생물 기반 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 담체는, 제품이 생존할 수 있는 상태로 유지되거나, 또는 비활성 효모의 경우에, 효과적이기 위해 필요한 성분을 유지하는 방식으로, 효모 또는 효모 부산물이 표적 식물, 토양, 동물, 어류 등에 전달되도록 하는 이 기술분야에 공지된 임의의 적합한 담체일 수 있다.

특정 실시예에서, 조성물은 조성물의 효능을 향상시킬 수 있는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함한다. 예를 들어, 풀브산(fulvic acid), 휴민산(humic acid) 또는 휴민산염(humate)은 토양 개량 조성물을 기술하는 실시예에서 특히 유용한 보조제로서 작용할 수 있다.

미생물 기반 조성물은, 예를 들어, 액체 현탁액, 에멀션, 동결 또는 분무 건조 분말, 펠릿(pellet), 과립, 또는 겔로서 제제화될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 전체 미생물 배양물의 사용으로 인해, 예를 들어, 정제된 미생물 대사물질 단독에 비해서 이점을 갖는다. 이들 이점은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 효모 세포벽의 외부 표면의 일부로서 고농도의 만노단백질(mannoprotein); 효모 세포벽에 베타-글루칸의 존재; 배양물(culture)에서 생물 계면활성제의 존재; 및 배양물에서 용매(예를 들어, 락트산, 아세트산 에틸 등)와 다른 대사물질(예를 들어, 비타민, 미네랄, 탄수화물 및 단백질 공급원)의 존재. 이들 이점은 활성 또는 비활성 효모 사용시 나타난다.

특정 실시예에서, 미생물뿐만 아니라, 미생물의 대사물질과 기타 부산물은 서로 상승적으로 작용한다.

일 실시예에서, 본 발명은 성장 부산물의 성장 및 생산에 적합한 조건 하에서 본 발명의 미생물 균주(microbe strain)를 배양하고; 선택적으로, 부산물을 정제함으로써 피치아 효모의 성장 부산물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 성장 부산물은 정제되지 않지만, 그 대신에, 예를 들어, 그것이 생산된 발효 브로스를 포함하는 미정제 형태로 활용된다. 본 발명에 따른 성장 부산물의 예는 효소, 산, 용매, 에탄올, 단백질, 아미노산, 생물 계면활성제 등을 포함한다. 특정 실시예에서, 효소 피타아제(enzyme phytase)를 생산하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명은 농업, 원예, 가축 생산 및 양식으로부터 선택된 산업에서 생산을 향상시키는 방법을 추가로 제공하고, 여기에서 본 발명의 유효량의 미생물 기반 조성물은 선택된 산업과 관련된 특정 적용 또는 표적 장소(target site)에 적용된다. 적용 장소는 산업에 의존할 것이고, 예를 들어, 식물 및/또는 그 환경 또는 동물 및/또는 그 환경을 포함할 수 있다.

본 방법의 적용은 미생물 기반 조성물을 식물, 동물, 및/또는 그 주변 환경에 직접 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 미생물은 적용할 때에 살아있거나(또는 생존 가능) 또는 비활동성일 수 있다.

살아있는 미생물의 경우, 미생물은 적용 장소에서 원 위치에서 성장하여 현장에서 임의의 활성 화합물 또는 성장 부산물을 생산할 수 있다. 결과적으로, 치료 장소(treatment site)(예를 들어, CAFO 또는 양어장)에서 고농도의 미생물과 유익한 성장 부산물이 용이하고 연속적으로 이루어질 수 있다.

이를 위해, 이 방법은 적용 동안 미생물 성장을 향상시키기 위해 재료를 첨가하는(예를 들어, 미생물 성장을 촉진하기 위해 영양소를 첨가하는) 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 영양 공급원은, 예를 들어, 질소, 질산염, 인, 마그네슘 및/또는 탄소를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 이 방법은 적용 전에 미생물 기반 조성물을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 미생물 기반 조성물은 적용 장소 또는 적용 장소 가까이에서, 예를 들어, 장소에서 100 마일 이내에서 배양된다.

특정 실시예에서, 농업, 원예, 가축 사육 및/또는 양식 작업에서 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공되고, 여기에서 본 발명의 미생물 기반 조성물은 식물, 동물, 및/또는 그 주변 환경에 적용된다. 일부 실시예에서, 조성물은 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 일으키거나 또는 일으켰던 유기체 또는 유해생물에 직접 적용된다.

특정 실시예에서, 토양을 비옥하게 하기 위한 방법이 제공되고, 여기에서 본 발명의 미생물 기반 조성물이 토양에 적용된다. 유리하게는, 이 방법은 수확량을 증가시키고 토양에서 자란 농작물과 농산물의 품질을 향상시킬 수 있다. 또한, 이 방법은, 토양에 존재하는 사용할 수 없는 인산염을 회수하여 이를 식물에 의해 흡수될 수 있는 형태로 변환시키도록 작용함으로써 인산염 보존에 도움이 될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명은, 본 발명의 미생물 기반 조성물을 사용하여 가축과 양식 어류에 사료를 공급하기 위한 저비용 재료와 방법을 제공한다. 조성물은, 예를 들어, 조성물을 전통적인 가축 사료와 함께 사료통(feeding trough) 안에 넣고 가축이 이 조성물을 섭취하게 함으로써, 가축을 위한 영양가 높은 보충 식량 공급원으로서 사용될 수 있다. 미생물 기반 조성물은, 예를 들어, 조성물을 양어지(fish pond) 또는 수족관 안에 넣고 그 안의 어류가 이 조성물을 섭취하게 함으로써, 어류를 위한 영양가 높은 보충 식량 공급원으로 사용될 수 있다. 유리하게는, 본 발명은, 예를 들어, 이들의 성장과 이들의 면역 체계를 지탱함으로써, 동물의 성장과 건강은 향상시키면서 가축과 양식 어류에 사료를 공급하는 비용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명은 식물 및/또는 동물에서 영양 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위한 재료와 방법을 제공한다. 이 방법은, 식물에서 영양 결핍의 경우, 본 발명의 미생물 기반 조성물을 식물 주위의 토양에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 동물에서 영양 결핍의 경우, 이 방법은 본 발명의 미생물 기반 조성물을 동물의 사료 및/또는 식수에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 영양 결핍은 인 결핍이다.

유리하게는, 본 발명은 다량의 무기 화합물을 환경으로 방출하지 않으면서 사용될 수 있다. 추가로, 이 조성물과 방법은, 생분해성이고 독물학적으로 안전한 성분을 활용한다. 따라서, 본 발명은 "녹색의(green)" 치료로서 농업, 원예, 가축 사육 및/또는 양어(fish farming)에서 생산을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

도 1은, 피치아 아노말라의 피타아제 생산 활성을 측정하기 위해 사용된 인산염 농도를 나타내는 그래프를 도시한다.

본 발명은, 배양된 미생물 및/또는 그 성장 부산물을 포함하는 미생물 기반 조성물뿐만 아니라, 이들 조성물을 생산 및 사용하기 위한 방법을 제공한다. 미생물 기반 조성물은, 예를 들어, 식물과 동물에서 감염 또는 체내 침입을 예방 및/또는 치료하고; 토양을 개량하고 농작물 식물의 성장을 향상시키며; 및/또는 가축과 어류의 성장과 건강을 향상시키기 위해, 농업, 원예, 가축 사육 및 양식에서 사용될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 미생물 기반 조성물의 미생물은, 예를 들어, 피치아 아노말라(윅케르하모마이세스 아노말루스), 피치아 쿠드리아제비(윅케르하모마이세스 쿠드리아제비), 피치아 구일리에르몬디(메이에로지마 구일리에르몬디), 및/또는 이들의 조합물과 같은 피치아 클레이드로부터 선택된 생물학적으로 순수한 효모이다. 다른 피치아 클레이드 효모, 또는 이와 밀접하게 관련된 효모{예를 들어, 피치아 옥시덴탈리스(P. occidentalis)}, 및/또는 그 성장 부산물의 포함이 또한 예상된다.

본 발명은 또한 농업, 원예, 가축 사육 및 양식으로부터 선택된 산업에서 생산을 향상시키는 방법을 제공하고, 여기에서 이 방법은 본 발명의 미생물 기반 조성물을 산업과 관련된 특정 장소에 적용하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이 적용 장소는 식물, 동물, 및/또는 식물 또는 동물을 둘러싸는 환경일 수 있다.

선택된 정의

본원에 사용된 바와 같이, "미생물 기반 조성물"에 대한 참조는 미생물 또는 다른 세포 배양물의 성장의 결과로서 생산되었던 성분을 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서, 미생물 기반 조성물은 미생물 자체 및/또는 미생물 성장의 부산물을 포함할 수 있다. 미생물은, 식물 상태(vegetative state), 포자 형태(spore form), 균사체 형태(mycelial form), 임의의 다른 형태의 미생물 번식체(microbial propagule), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 미생물은 플랑크톤 또는 생물막(biofilm) 형태이거나, 또는 이 둘의 혼합물일 수 있다. 성장의 부산물은, 예를 들어, 대사물질(예를 들어, 생물 계면활성제), 세포막 성분, 발현 단백질, 및/또는 다른 세포 성분일 수 있다. 미생물은 손상되지 않았거나 또는 용해될 수 있다. 세포는 전혀 없거나, 또는 예를 들어, 조성물 1 밀리리터당 1 × 10⁴, 1 × 10⁵, 1 × 10⁶, 1 × 10⁷, 1 × 10⁸, 1 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 또는 1 × 10¹¹ 또는 그 이상의 세포 또는 번식체의 농도로 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 번식체는, 세포, 분생자(conidia), 낭포(cyst), 포자{예를 들어, 생식 포자, 내생 포자(endospore) 및 외생 포자(exospore)}, 균사체, 싹 및 종자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 새로운 및/또는 성숙한 유기체가 발달할 수 있는 미생물의 임의의 부분이다.

본 발명은 "미생물 기반 제품"을 추가로 제공하고, 이는 원하는 결과를 이루기 위해 실제로 적용되어야 하는 제품이다. 미생물 기반 제품은 단순히 미생물 배양 공정으로부터 수확된 미생물 기반 조성물일 수 있다. 대안적으로, 미생물 기반 제품은 첨가된 추가 성분을 포함할 수 있다. 이들 추가 성분은, 예를 들어, 안정제, 완충제, 담체(예를 들어, 물 또는 염 용액), 추가 미생물 성장을 지지하기 위해 첨가된 영양소, 비영양 성장 촉진제 및/또는 적용되는 환경에서 미생물 및/또는 조성물의 추적을 용이하게 하는 작용제를 포함할 수 있다. 미생물 기반 제품은 또한 미생물 기반 조성물의 혼합물을 포함할 수 있다. 미생물 기반 제품은, 여과, 원심 분리, 용해(lysing), 건조, 정제 등과 같지만, 이에 제한되지 않는 어떠한 방식으로 처리된 미생물 기반 조성물 중 하나 이상의 성분을 또한 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "수확된(harvested)"은 성장 용기(growth vessel)로부터 미생물 기반 조성물의 일부 또는 전부를 제거하는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "분리된" 또는 "정제된" 분자 또는 화합물은, 그것이 본래 결합되어 있는 세포 재료(cellular material)와 같은 다른 화합물이 실질적으로 없다. 정제되거나 분리된 폴리뉴클레오티드{리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)}는 그 자연 발생 상태에서 이에 접하는 유전자 또는 서열이 없다. 정제되거나 분리된 폴리펩티드는 그 자연 발생 상태에서 이에 접하는 아미노산 또는 서열이 없다.

본원에 사용된 바와 같이, "생물학적으로 순수한 배양물"은 이것이 본래 결합되어 있는 재료로부터 분리된 것이다. 바람직한 실시예에서, 배양물은 다른 모든 생세포로부터 분리되었다. 바람직한 추가 실시예에서, 생물학적으로 순수한 배양물은 이것이 본래 존재할 때와 동일한 미생물의 배양물과 비교해서 유리한 특징을 갖는다. 유리한 특징은, 예를 들어, 하나 이상의 바람직한 성장 부산물의 향상된 생산일 수 있다.

특정 실시예에서, 정제된 화합물은 해당 화합물의 중량(건조 중량)을 기준으로 적어도 60%이다. 바람직하게는, 조합제(preparation)는 해당 화합물의 중량을 기준으로 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 예를 들어, 정제된 화합물은 중량을 기준으로 원하는 화합물의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%(w/w)인 화합물이다. 순도는 임의의 적합한 표준 방법, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 의해 측정된다.

"대사물질(metabolite)"은 대사에 의해 생산된 임의의 물질(즉, 성장 부산물) 또는 특정한 대사 공정에 참여하기 위해 필요한 물질을 나타낸다. 대사물질은 물질 대사의 출발 재료(예를 들어, 글루코오스), 중간체(예를 들어, 아세틸-CoA), 또는 최종 생성물(예를 들어, n-부탄올)인 유기 화합물일 수 있다. 대사물질의 예는, 생체 고분자, 효소, 산, 용매, 알코올, 단백질, 비타민, 미네랄, 미량 원소(microelement), 아미노산, 및 생물 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "조절하다"는, 변경하다(예를 들어, 증가시키다 또는 감소시키다)와 상호 교환 가능하다. 이러한 변경은 본원에 기술된 것과 같은 표준 기술의 공지된 방법에 의해 검출된다.

본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭(shorthand)인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 20의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20으로 이루어지는 군으로부터의 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위 범위뿐만 아니라, 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 및 1.9와 같이 상기 언급된 정수 사이의 모든 중간 소수 값을 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위에 관해서는, 범위 중 어느 한 쪽의 단점(end point)으로부터 연장되는 "내포된 하위 범위(nested sub-ranges)"가 특정하게 고려된다. 예를 들어, 1 내지 50의 예시적인 범위의 내포된 하위 범위는, 한 방향으로는 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 및 1 내지 40을 포함하거나, 또는 다른 방향으로는 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20, 및 50 내지 10을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "감소시키다"는 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 음의 변화(negative alteration)를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "참조(reference)"는 표준 또는 통제 조건(control condition)을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "계면활성제"는 두 액체 사이 또는 액체와 고체 사이의 표면 장력(또는 계면 장력)을 낮추는 표면 활성제(surface-active agent)를 나타낸다. 계면활성제는 세제, 습윤제, 유화제, 기포제(foaming agent), 및 분산제로서 작용한다. "생물 계면활성제"는 살아있는 유기체(living organism)에 의해서 생산된 계면활성제이다.

본원에 사용된 바와 같이, "농업"은 식품, 섬유, 바이오 연료, 의약품, 화장품, 보충제, 장식용 목적, 및 다른 용도를 위한 식물 및/또는 균류의 배양(cultivation)과 번식(breeding)을 의미한다. 본 발명에 따라, 농업은 또한 원예, 조경, 조원(gardening), 식물 보존, 과수재배(orcharding) 및 수목재배(arboriculture)를 포함할 수 있다. 본원에서 농업에는, 토양 과학{예를 들어, 토양학(pedology)과 농림 토양학(edaphology)}뿐만 아니라, 농경학(agronomy), 또는 토양 및 농작물 생산의 케어, 모니터링 및 관리가 추가로 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, "가축"은, 식품, 섬유 및 노동력과 같은 상품을 생산하기 위해 농업 또는 산업 환경에서 기른 임의의 길들인 동물(domesticated animal)을 나타낸다. "가축 생산"은 이들 동물의 번식, 기르기, 사육, 축산(husbandry), 유지 및/또는 도축을 포함한다. 가축은 야지(open fields), 농장, 또는 동물 사료 공급 작업에서와 같이, 놓아 길러서(free-range) 생산될 수 있다. 가축이라는 용어에 포함된 동물의 종류는 알파카, 육우와 젖소, 들소, 돼지, 양, 염소, 말, 노새, 당나귀, 낙타, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 뿔닭, 및 비둘기 새끼(squab)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "동물 사료 공급 작업(animal feeding operation)" 또는 "AFO"는, 임의의 12개월 기간에서 총 45일 이상 동안, 동물이 우리 안에 있었거나 갇혀 있었고 사료가 공급되었거나 유지되었으며, 우리 안에 있거나 갇혀 있고 사료가 공급되거나 유지되며, 또는 우리 안에 있거나 갇히고 사료가 공급되거나 유지될 많은 시설(양어 시설은 포함하지 않음)을 나타내고, 농작물, 초목 식물(vegetation), 사료 생장물(forage growth), 또는 수확 후 찌거기(post-harvest residues)는 시설의 어느 부분에서도 정상적인 성장 시기에는 지속되지 않는다. AFO는 토지와 노동력 대신 인공 구조물과 장비(사료 공급, 온도 제어, 분뇨 관리 등을 위한)를 필수적으로 활용한다. "CAFO" 또는 "집중 AFO"는 비교적 작고 제한된 공간에 많은 수의 동물을 집중시키는 AFO이고, 그 크기는 환경 보호청(Environmental Protection Agency)에 의해 기술된 특정한 문턱값(threshold)을 충족한다.

본원에 사용된 바와 같이, "양식(aquaculture)", "양식업(aquafarming)", "수생 농업(aquatic farming)", "수생 재배(aquatic husbandry)" 또는 "양어(fish farming)"는, 양어장에서 수생 동물의 번식, 사육, 및 수확을 의미한다. 양식은 집약적(인공 울타리에서 고밀도로 어류를 기르는 기술에 의존하는)이거나 또는 확장적{해양, 또는 자연 및 인공 호수, 만(bay), 강(river), 피오르드(fiord), 또는 기타 수역에서 수행되는}일 수 있다. 양식은, 울타리, 연못, 탱크, 수족관, 우리, 또는 수로에서 시판 치수로 성장한 양식 어류(hatchery fish)와 조개류로부터 해산물을 생산하는 것을 포함한다. 또한, 양식은 개방된 해수 또는 밀폐된 구획의 해수에서 해양 생물의 배양물을 수반하는 해양 양식(mariculture)을 포함한다. 또한, 양식은 스톡 복원(stock restoration) 또는 "향상(enhancement)"을 포함하고, 여기에서 양식 어류와 조개류는 야생 개체군이나 연안 서식지를 재건하기 위한 노력으로 야생에 방류된다. 더 나아가, 양식은 수족관 거래를 위한 관상용 어류의 생산뿐만 아니라, 수족관 내에 사는 관상용 어류의 양어(husbandry)를 포함한다. 양식될 수 있는 종은 담수어 또는 해수어 및 조개류를 포함하고, 관상용 어류, 식용 어류, 스포츠 어류(sport fish), 미끼용 어류, 갑각류, 연체 동물, 조류(algae), 식용 해초, 또는 어란을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "양어장"은 양식이 일어나거나 일어날 수 있는 임의의 물 환경이다. 이 개시내용에 따른 양어장은, 연못, 관개 수로, 강, 호수, 해양, 피오르드, 탱크, 수족관, 우리, 또는 수로를 포함하는, 인공 또는 자연 발생 여부에 관계 없이, 모든 유형의 물 환경 또는 물 환경의 구획을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "유해생물(pest)"은, 인간 또는 인간의 관심사(human concerns)(예를 들어, 농업, 원예, 가축 케어, 양식)에 파괴적이고, 해롭고/해롭거나 유해한, 인간 이외의 임의의 유기체이다. 유해생물은 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 일으킬 수 있다. 유해생물은 바이러스, 균류, 세균, 기생충, 및/또는 선충류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 단세포 또는 다세포 유기체일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료(treating)"는, 상태(condition) 또는 장애의 정도, 징후(sign) 또는 증상(symptom)을 임의의 정도로 근절하거나, 감소시키거나, 개선하거나, 반전시키거나, 또는 예방하는 것을 나타내고, 상태 또는 장애의 완전한 치료를 포함하지만, 이를 필요로 하지는 않는다. 치료는 장애를 치료하거나, 호전시키거나, 또는 부분적으로 개선하는 것일 수 있다. 치료는 또한 상태 또는 장애를 예방하는 것을 포함할 수 있고, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 상태 또는 장애의 특정한 징후 또는 증상의 개시 또는 진행을 지연시키는 것을 의미한다.

미생물 기반 조성물

본 발명은 유익한 미생물뿐만 아니라, 생물 계면활성제, 대사물질, 산, 용매 및/또는 효소와 같은 이들 성장의 부산물을 포함하는 미생물 기반 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 농업, 원예, 가축 사육 및 양식에서 생산을 향상시키는 데 이들 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 미생물 기반 조성물을 생산하기 위한 재료와 방법을 제공한다.

유리하게는, 본 발명에 따라 생산된 미생물 기반 조성물은 무독성(예를 들어, 섭취 독성이 체중 1 kg당 5 g을 초과한다)이고, 예를 들어, 인간 또는 동물의 피부 또는 소화관에 자극을 일으키지 않으면서 고농도로 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 미생물 기반 조성물의 적용이 인간에 의해 생산되고 인간 소비를 위해 생산되는 가축 및 어류와 같은 살아있는 유기체의 존재시에 일어나는 경우에 특히 유용하다.

특정 실시예에서, 본 발명의 미생물은 생물학적으로 순수한 킬러 효모(killer yeast)이다. 특히, 본 발명은 피치아(Pichia) 속에 속하는 킬러 효모를 활용한다. 훨씬 더 구체적으로, 일 실시예에서, 미생물은 피치아 아노말라(윅케르하모마이세스 아노말루스), 피치아 구일리에르몬디(메이에로지마 구일리에르몬디), 피치아 쿠드리아제비(윅케르하모마이세스 쿠드리아제비), 및/또는 이들의 조합물을 포함한다.

본 발명의 미생물과 미생물 기반 조성물은 농업, 원예, 가축 사육 및 양식에서 생산을 향상시키는 데 유용한 다수의 유익한 특성을 갖는다. 예를 들어, 일 실시예에서, 조성물은 생물 계면활성제를 포함한다. 생물 계면활성제는 조성물에 존재하는 미생물의 성장의 결과로서 조성물에 존재할 수 있거나, 또는 생물 계면활성제는 다른 미생물에 의해 별도로 생산되고 미정제 형태 및/또는 정제된 형태로 조성물에 첨가될 수 있다. 예로서, 미정제 형태의 미생물 성장 부산물은 이들이 생산된 발효 브로스를 포함할 수 있다.

생물 계면활성제는 다양한 표면에 대한 미생물 점착을 억제하고, 생물막의 형성을 방지하며, 강력한 유화(emulsifying) 및 유화파괴(demulsifying) 특성을 가질 수 있다. 또한, 생물 계면활성제는, 예를 들어, 양어장과 수족관에서 물의 표면 및 계면 장력을 감소시킬 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 조성물의 생물 계면활성제는, 만노실에리스리톨 리피드(mannosylerythritol lipid), 소포로리피드(sophorolipid), 람노리피드(rhamnolipid) 또는 트레할로오스 리피드(trehalose lipid)와 같은 당지질(glycolipid) 생물 계면활성제이다. 생물 계면활성제는 또한 서팩틴(surfactin), 이투린(iturin), 펜기신(fengycin) 및 리케니신(lichenysin)과 같은 리포펩티드(lipopeptide)일 수 있다.

특정 실시예에서, 조성물은, 예를 들어, 슈도지마 효모(Pseudozyma yeast)에 의해 풍부하게 생산되는 만노실에리스리톨 리피드(MELs), 및 예를 들어, 스타르메렐라 효모(Starmerella yeast)와 피치아 효모에 의해 생산되는 소포로리피드(SLPs)와 같은 하나 이상의 당지질을 포함한다.

MELs와 SLPs는, 예를 들어, 항진균성, 항세균성, 항기생충성 및/또는 항바이러스성 특성을 통한 다양한 생화학적 및 생리학적 영향뿐만 아니라, 우수한 수면 및 계면 장력 감소 특성, 매우 효과적인 유화 및 유화파괴 특성을 나타낸다.

특정 실시예에서, 조성물 내에서 하나 이상의 생물 계면활성제의 농도는 0.001 내지 90 중량%(wt%), 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%, 및 더 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%이다. 생물 계면활성제는 약 0.01 g/L 내지 약 500 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 50.0 g/L, 약 1.0 내지 약 10.0 g/L 또는 약 2.0 내지 약 5.0 g/L로 추가 존재할 수 있다.

특정 실시예에서, 조성물은 미생물 효소를 추가로 포함한다. 효소는 그 안에 미생물의 성장의 결과로서 조성물에 존재할 수 있거나, 또는 별도로 생산되고 미정제 및/또는 정제된 형태로 조성물에 첨가될 수 있다. 예로서, 미정제 형태의 효소는 이들이 생산된 발효 브로스를 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, 조성물은 효소 피타아제를 포함한다. 유리하게는, 본원에 기술된 배양 방법은, 기술된 효모 종의 특정 조합 외에, 상승적으로 작용하여 예상치 못하게 높은 농도와 예기치 않은 효율로 피타아제를 생산한다.

특정 실시예에서, 조성물 내에서 피타아제(또는 다른 효소)의 농도는 0.001 내지 90 중량%(wt%), 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%, 더 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%이다. 피타아제(또는 다른 효소)는 약 0.01 g/L 내지 약 500 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 50.0 g/L, 약 1.0 내지 약 10.0 g/L 또는 약 2.0 내지 약 5.0 g/L로 추가 존재할 수 있다.

일부 실시예에서, 조성물은 효소, 생물 계면활성제, 용매, 산, 단백질, 미네랄 및/또는 비타민과 같은 추가 미정제 형태 또는 정제된 미생물 성장 생성물을 추가로 포함한다.

미정제 형태의 대사물질은, 예를 들어, 미생물의 배양으로 생긴 발효 브로스에 대사물질 침전물(metabolite sediment)을 포함하는 액체 혼합물의 형태를 취할 수 있다. 이 미정제 형태 용액은 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 또는 약 50%의 순수한 대사물질을 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 미생물 기반 조성물은 살아있는 및/또는 비활성 배양물 및/또는 미생물 대사물질(미생물 및/또는 임의의 잔류 영양소에 의해 생산된)을 함유하는 발효 브로스를 포함할 수 있다. 발효의 생성물은 추출 또는 정제 없이 바로 사용될 수 있다. 원하는 경우, 추출 및 정제는 문헌에 기술된 표준 추출 및/또는 정제 방법 또는 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따라, 미생물 기반 조성물은 미생물이 성장된 브로스를 포함할 수 있다. 이 조성물은, 예를 들어, 중량 기준으로, 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 브로스일 수 있다. 조성물 내 바이오매스의 양은, 중량 기준으로, 예를 들어, 이들 사이의 모든 백분율을 포함하여 0% 내지 100% 중 어느 것이라도 될 수 있다.

발효 브로스의 바이오매스 함량은, 예를 들어, 5 g/l 내지 180 g/l 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 브로스의 고체 함량은 10 g/l 내지 150 g/l이다.

미생물의 발효

본 발명은 미생물을 배양하고 미생물 대사물질 및/또는 성장 부산물을 생산하기 위한 방법을 활용한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바이오매스{예를 들어, 생존 세포 재료(viable cellular material)}, 세포외 대사물질(예를 들어, 저분자 및 분비된 단백질), 잔류 영양소 및/또는 세포내 성분(예를 들어, 효소 및 기타 단백질)을 생산하기 위한 재료와 방법을 제공한다.

본 발명은, 미생물을 배양하고 소규모(예를 들어, 실험실 환경)부터 대규모(예를 들어, 산업 환경)까지 임의의 원하는 규모로 미생물 대사물질을 생산하는 데 적합한 배양 공정을 활용한다. 이들 배양 공정은, 수중 배양/발효, 고체 상태 발효(SSF), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "발효"는 통제된 조건 하에서 세포의 성장을 나타낸다. 성장은 호기성(aerobic)이거나 또는 혐기성(anaerobic)일 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 미생물 성장 용기는 산업 용도를 위한 임의의 발효조(fermenter) 또는 배양 반응기일 수 있다. 일 실시예에서, 이 용기는 기능적인 제어/센서를 가질 수 있거나, 또는 기능적 제어/센서에 연결되어, pH, 산소, 압력, 온도, 교반기 축 동력(agitator shaft power), 습도 및/또는 미생물 밀도 및/또는 대사물질 농도와 같이, 배양 공정에서 중요한 인자를 측정할 수 있다.

이 용기는 또한 용기 내부에서 미생물의 성장(예를 들어, 세포 수와 성장 단계의 측정)을 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 용기로부터 일간 샘플(daily sample)이 채취되어, 평판 희석 기술(dilution plating technique)과 같이, 이 기술분야에 공지된 기술에 의해 계수(enumeration)될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 미생물 성장 시설은 원하는 규모로 해당 신선한 고밀도 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물을 생산한다. 이 미생물 성장 시설은 적용 장소 또는 적용 장소 가까이에 위치할 수 있다. 이 시설은 배치, 준연속, 또는 연속 배양으로 고밀도 미생물 기반 조성물을 생산한다.

분산된 미생물 성장 시설은 미생물 기반 제품이 사용될 위치{예를 들어, 필드(field) 또는 양어장}에 위치할 수 있다. 예를 들어, 미생물 성장 시설은 사용 위치에서 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10, 5, 3, 또는 1 마일 미만일 수 있거나, 또는 사용 장소 위에 직접 위치할 수 있다.

특정 실시예에서, 생산은 현지(local) 및/또는 분산된(distributed) 발효 방법을 사용하여 이루어질 수 있거나 또는 이루어지지 않을 수 있는데, 이는 종래의 방법이 본 발명에 따라서 또한 활용될 수 있음을 의미한다. 그러나, 본원에 기술된 바와 같은 현지 및/또는 분산된 미생물 성장 시설은, 유리하게는, 업스트림 처리 지연(upstream processing delay), 공급망 병목, 부적절한 저장, 및 다른 우발성(유용한 제품의 적시 운반과 적용을 억제하는)으로 인해 그 제품 품질이 좋지 않은 광범위한(far-flung) 산업 크기의 생산업자에 의존하고 있는 현재 문제에 대한 해결책을 제공한다.

미생물 성장 시설은, 미생물 이들 자체, 미생물 대사물질, 및/또는 미생물이 성장되는 브로스의 다른 성분을 포함하는 신선한 미생물 기반 조성물을 생산한다. 필요한 경우, 조성물은 고밀도의 영양 세포(vegetative cell), 비활성 세포, 번식체, 또는 영양 세포, 비활성 세포 및/또는 번식체의 혼합물을 가질 수 있다.

유리하게는, 조성물은 명시된 위치에서 사용하도록 맞춤화될 수 있다. 일 실시예에서, 미생물 성장 시설은 미생물 기반 제품이 사용될 장소에, 또는 장소 가까이에 위치한다. 미생물 성장 시설은, 예를 들어, 태양, 풍력, 및/또는 수력전기 발전을 활용함으로써, 공공시설을 사용하지 않고(off the grid) 작동할 수 있다.

미생물 성장 시설은 목적지 지리(destination geographies)와의 시너지 효과를 향상시키기 위해 미생물 기반 제품을 맞춤화하는 능력에 의해 제조 다양성을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 시스템은 자연적으로 발생하는 현지 미생물과 이들의 대사 부산물의 힘을 이용할 수 있다. 현지 미생물은, 예를 들어, 내염성(salt tolerance), 고온에서 성장하는 능력, 및/또는 특정한 대사물질을 생산하는 능력을 기초로 확인될 수 있다.

미생물 기반 제품은 현장에서 또는 적용 장소 가까이에서 생산되기 때문에, 안정화, 보존, 장기 저장 및 종래 생산의 광범위한 운송 공정 없이도, 훨씬 더 높은 밀도의 살아있는(또는 비활성) 미생물 및/또는 그 번식체가 생성될 수 있어서, 현장 적용시 사용하기 위한 훨씬 더 적은 부피의 미생물 기반 제품을 필요로 하거나, 또는 필요한 경우 훨씬 더 높은 밀도의 미생물 적용을 허용한다. 이는 이질적인 작용제(foreign agent)와 바람직하지 않은 미생물로부터 오염될 가능성을 감소시키고, 미생물 성장 부산물의 활성을 유지하며, 규모가 축소된(scaled-down) 효율적인 생물 반응기(bioreactor){예를 들어, 더 작은 발효 탱크와 더 적은 부피의 스타터 재료(starter material), 영양소, pH 조절제, 및 소포제 등}를 허용한다(세포를 안정화시킬 이유 없이). 현지 생산된 고밀도의 왕성한 미생물 배양물은 영양 세포 안정화를 거쳤거나 또는 일정 시간 동안 공급망에 그대로 있었던 미생물 배양물보다 필드에서 더 효과적이다.

미생물 기반 제품의 현지 생성은 또한 제품 내에 발효 브로스를 포함시키는 것을 용이하게 한다. 브로스는 현지 사용(local use)을 위해 특히 매우 적합한, 발효 중에 생산된 작용제를 함유할 수 있다.

감소된 운송 시간은 현지 수요에 의해 요구되는 시간과 부피로 신선한 배치의 미생물 및/또는 이들의 대사물질의 생산과 운반을 허용한다. 예를 들어, 발효 24시간 이내의 현지 생산과 운반은, 순수한 고밀도 세포 조성물과 실질적으로 더 낮은 운송 비용을 초래한다. 보다 효과적이고 강력한 미생물 접종물의 개발의 급속한 발전에 대한 전망을 감안하면, 소비자는 미생물 기반 제품을 신속하게 운반하는 이 능력으로부터 크게 이익을 얻을 것이다.

일 실시예에서, 배양 방법은, 종래의 방법을 사용하거나 또는 현지 또는 분산 시스템을 사용하여 수행되는지에 관계 없이, 당밀(molass), 요소 및 펩톤(peptone)을 포함하는 배지를 활용한다.

일 실시예에서, 당밀의 농도는 2 내지 6%, 바람직하게는 4%이다. 일 실시예에서, 요소의 농도는 0.01 내지 1.0%, 바람직하게는 0.2%이다. 일 실시예에서, 펩톤의 농도는 1.0 내지 5%, 바람직하게는 2.5%이다.

일 실시예에서, 이 방법은 질소 공급원으로 배양을 보충하는 단계를 포함한다. 질소 공급원은, 예를 들어, 질산칼륨, 질산암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄, 암모니아, 요소, 및/또는 염화암모늄일 수 있다. 이들 질소 공급원은 독립적으로 사용되거나 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다.

이 배양 방법은 성장하는 배양물에 산소첨가(oxygenation)를 제공할 수 있다. 일 실시예는 저산소 함유 공기를 제거하고 산소첨가된 공기를 도입하기 위해 공기의 느린 운동(slow motion)을 활용한다. 산소첨가된 공기는 액체의 기계 교반을 위한 임펠러(impeller)와, 액체 안에 산소를 용해시키기 위해 액체에 가스의 기포를 공급하기 위한 공기 살포기(air sparger)를 포함하는 메커니즘을 통해 매일 보충되는 주변 공기일 수 있다.

이 방법은 탄소 공급원으로 배양을 보충하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 탄소 공급원은 전형적으로 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 트레할로오스, 만노오스, 만니톨, 및/또는 말토오스와 같은 탄수화물; 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말산, 말론산, 및/또는 피루브산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 이소부탄올, 및/또는 글리세롤과 같은 알코올; 대두유, 쌀겨유, 올리브유, 옥수수유, 참기름, 및/또는 아마인유와 같은 지방 및 오일이다. 이들 탄소 공급원은 독립적으로 사용되거나 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 미생물을 위한 성장 인자와 미량 영양소가 배지에 포함되어 있다. 이는, 이들이 필요로 하는 모든 비타민을 생산할 수 없는 미생물을 성장시킬 때 특히 바람직하다. 철, 아연, 구리, 망간, 몰리브덴 및/또는 코발트와 같은 미량 원소를 포함하는 무기 영양소가 또한 배지에 포함될 수 있다. 또한, 비타민 공급원, 필수 아미노산, 및 미량 원소(microelement)는, 예를 들어, 옥수수 가루와 같은 곡분(flour) 또는 가루(meal)의 형태로, 또는 효모 추출물, 감자 추출물, 쇠고기 추출물, 콩 추출물, 바나나 껍질 추출물 등과 같은 추출물의 형태로, 또는 정제된 형태로 포함될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 생합성에 유용한 것과 같은 아미노산(예를 들어, L-알라닌)이 또한 포함될 수 있다.

일 실시예에서, 무기 염이 또한 포함될 수 있다. 사용할 수 있는 무기 염은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산수소이나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산철, 염화철, 황산망간, 염화망간, 황산아연, 염화납, 황산구리, 염화칼슘, 탄산칼슘, 및/또는 탄산나트륨일 수 있다. 이들 무기 염은 독립적으로 사용되거나 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다.

일부 실시예에서, 배양 방법은 배양 공정 전, 및/또는 배양 공정 동안 액체 배지(liquid medium)에 추가 산 및/또는 항균제를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 오염에 대해서 배양물을 보호하기 위해 항균제 또는 항생물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 에리스로마이신(Streptomyces erythromycin), 홉(hops) 또는 홉산(hop acid), 및/또는 소량의, 예를 들어, 50~100 ppm의 소포로리피드 또는 다른 생물 계면활성제가 항세균제로서 영양 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 배양 중에 기체가 생성될 때 거품의 형성 및/또는 축적을 방지하기 위해 소포제가 또한 첨가될 수 있다.

혼합물의 pH는 해당 미생물에 적합해야 한다. 완충제, 및 탄산염과 인산염과 같은 pH 조절제는 바람직한 값 가까이에 pH를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 배양물의 오염을 방지하기 위해 pH 조절이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양은 효모 성장에 적합한 낮은 pH(예를 들어, 3.0 ~ 3.5)에서 시작된 다음, 효모 축적 후 증가되고(예를 들어, 4.5 ~ 5.0으로), 발효의 나머지 동안 안정화될 수 있다. 금속 이온이 고농도로 존재하는 경우, 액체 배지에 킬레이트제의 사용이 필요할 수 있다.

미생물은 플랑크톤 형태(planktonic form) 또는 생물막(biofilm)으로 성장할 수 있다. 생물막의 경우, 용기는 미생물이 생물막 상태에서 성장할 수 있는 배양기(substrate)를 그 안에 가질 수 있다. 시스템은, 예를 들어, 생물막 성장 특징을 촉진 및/또는 향상시키는 자극(stimuli)(전단 응력과 같은)을 가하는 능력을 또한 가질 수 있다.

일 실시예에서, 미생물을 배양하기 위한 방법은 약 5℃ 내지 약 100℃, 바람직하게는 15 내지 60℃, 더 바람직하게는 25 내지 50℃에서 실행된다. 추가 실시예에서, 배양은 일정한 온도에서 연속적으로 실행될 수 있다. 다른 실시예에서, 배양은 온도 변화를 거칠 수 있다.

일 실시예에서, 이 방법과 배양 공정에서 사용된 장비는 멸균 상태이다. 반응기/용기와 같은 배양 장비는 멸균 유닛, 예를 들어, 오토클레이브(autoclave)와 분리될 수 있지만, 연결될 수 있다. 배양 장비는 접종을 시작하기 전에 원 위치에서 멸균하는 멸균 유닛을 또한 가질 수 있다. 공기는 이 기술분야에 공지된 방법에 의해 멸균될 수 있다. 예를 들어, 주변 공기는 용기 안으로 도입되기 전에 적어도 하나의 필터를 통과할 수 있다. 다른 실시예에서, 배지는 저온 살균될 수 있거나, 선택적으로는, 열이 전혀 가해지지 않을 수 있으며, 이러한 경우 세균 성장을 억제하기 위해 낮은 수분 활성(water activity)과 낮은 pH의 사용이 이용될 수 있다.

다른 실시예에서, 배양 시스템은 자가 멸균할 수 있고, 이는, 배양되고 있는 유기체가 항균성 성장 부산물 또는 대사물질의 생산으로 인해 다른 유기체로부터 오염되는 것을 방지할 수 있음을 의미한다.

일 실시예에서, 계면활성제, 효소, 대사물질, 및/또는 다른 단백질은 본 발명의 미생물 균주를 그 성장과 생산에 적합한 조건 하에서 배양하고; 선택적으로, 계면활성제, 효소, 대사물질 또는 다른 단백질을 정제함으로써 생산된다. 피치아 효모에 의해 생산되는 것으로 알려져 있는 임의의 유익한 성장 부산물은 본 발명에 따라 생산 및 정제될 수 있다. 이들은, 생물 계면활성제, 효소, 예를 들어, 엑소-β-1,3-글루카나아제, 키티나아제(chitinase) 및 피타아제, 용매, 단백질, 지질, 탄소 공급원뿐만 아니라, 미네랄과 비타민, 예를 들어, 비타민 B1, B2, B3 (PP), B5, B7(H), B6, 및 E를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

해당 미생물에 의해 생산된 미생물 성장 부산물은 미생물 내에 보유되거나 성장 배지로 분비될 수 있다. 다른 실시예에서, 미생물 성장 부산물을 생산하기 위한 방법은 해당 미생물 성장 부산물을 농축 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 성장 배지는 미생물 성장 부산물의 활성을 안정화시키는 화합물을 함유할 수 있다.

발효 브로스의 바이오매스 함량은, 예를 들어, 5 g/l 내지 180 g/l 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 브로스의 고체 함량은 10 g/l 내지 150 g/l이다.

성장 용기 또는 용기들로부터 미생물 기반 제품을 수확할 시기가 되면, 미생물 성장으로 생긴 미생물 및/또는 브로스는 성장 용기로부터 제거되고, 예를 들어, 즉시 사용을 위해 배관(piping)을 통해서 이동될 수 있다. 미생물은 활성 또는 비활성 형태일 수 있거나, 또는 활성 및 비활성 미생물의 조합을 함유할 수 있다.

조성물(미생물, 브로스, 또는 미생물과 브로스)은, 예를 들어, 의도된 용도, 고려된 적용 방법, 발효 탱크의 크기, 및 미생물 성장 시설부터 사용 위치까지 임의의 운송 방식을 고려하여, 적절한 크기의 용기에 넣을 수 있다. 따라서, 미생물 기반 조성물을 넣는 용기는, 예를 들어, 1 갤런(gallon) 내지 1,000 갤런 이상일 수 있다. 특정 실시예에서, 용기는 2 갤런, 5 갤런, 25 갤런, 또는 그 이상이다.

수확된 제품을 용기에 넣고/넣거나 배관을 통해 운반할 때(또는 사용을 위해 다른 방법으로 운반할 때) 추가 성분이 첨가될 수 있다. 첨가제는, 예를 들어, 완충제, 담체, 동일하거나 상이한 시설에서 생산된 다른 미생물 기반 조성물, 점도 조절제, 방부제, 미생물 성장을 위한 영양소, 추적제(tracking agent), 농약, 및 의도된 용도에 특정한 다른 성분일 수 있다.

일 실시예에서, 모든 미생물 배양 조성물은 배양이 완료되면(예를 들어, 원하는 세포 밀도, 또는 브로스 내에서 명시된 대사물질의 밀도를 이루면) 제거된다. 이러한 배치(batch) 절차에서, 첫 번째 배치를 수확하면, 완전히 새로운 배치가 시작된다.

다른 실시예에서, 발효 생성물 중 일부만이 언제든지 제거된다. 이 실시예에서, 생존 세포를 갖는 바이오매스는 신규한 배양 배치를 위한 접종물(inoculant)로서 용기 안에 남아 있다. 제거되는 조성물은 무세포 브로스(cell-free broth)일 수 있거나, 세포를 함유할 수 있다. 이러한 방식으로, 준연속 시스템이 생성된다.

미생물 기반 제품의 제조

본 발명의 하나의 미생물 기반 제품은 단순히 미생물 및/또는 미생물 대사물질(미생물 및/또는 임의의 잔류 영양소에 의해 생산된)을 함유하는 발효 브로스이다. 발효의 생성물은 추출 또는 정제 없이 바로 사용될 수 있다. 원하는 경우, 추출 및 정제는 문헌에 기술된 표준 추출 및/또는 정제 방법 또는 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다.

미생물 기반 제품 내의 미생물은 활성 또는 비활성 형태일 수 있다. 미생물 기반 제품은 활성 미생물과 비활성 미생물의 조합을 함유할 수 있다.

미생물 기반 제품은 추가적인 안정화, 보존, 및 저장 없이 사용될 수 있다. 유리하게는, 이들 미생물 기반 제품의 직접적인 사용은 미생물의 높은 생존력을 유지하고, 이질적인 작용제와 바람직하지 않은 미생물로부터 오염될 가능성을 감소시키며, 미생물 성장의 부산물의 활성을 유지한다.

미생물 성장으로 생긴 미생물 및/또는 브로스는 성장 용기로부터 제거되고, 예를 들어, 즉시 사용을 위해 배관을 통해서 이동될 수 있다. 다른 실시예에서, 이전에 기술된 바와 같이, 조성물(미생물, 브로스, 또는 미생물과 브로스)은 적절한 크기의 용기에 넣을 수 있다.

성장 용기로부터 미생물 기반 조성물을 수확하는 즉시, 수확된 제품을 용기에 넣고/넣거나 배관을 통해 운반할 때(또는 사용을 위해 다른 방법으로 운반할 때) 추가 성분이 첨가될 수 있다. 첨가제는, 예를 들어, 완충제, 담체, 보조제, 동일하거나 상이한 시설에서 생산된 다른 미생물 기반 조성물, 점도 조절제, 방부제, 미생물 성장을 위한 영양소, 추적제, 살생물제, 다른 미생물, 비생물학적 계면활성제, 유화제, 윤활제, 완충제, 용해도 조절제, pH 조절제, 안정제, 자외선 방지제 및 의도된 용도에 특정한 다른 성분일 수 있다.

일 실시예에서, 조성물은 바람직한 값 가까이에 pH를 안정화시키기 위해 유기 및 아미노산 또는 이들의 염을 포함하는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 미생물 기반 조성물의 pH는 해당 미생물에 적합해야 한다.

적합한 완충제는, 시트르산염, 글루콘산염, 타르타르산염, 말산염, 아세트산염, 락트산염, 옥살산염, 아스파르트산염, 말론산염, 글루코헵톤산염(glucoheptonate), 피부르산염(pyruvate), 갈락타르산염(galactarate), 글루카르산염(glucarate), 타르트론산염(tartronate), 글루타민산염(glutamate), 글리신, 리신, 글루타민, 메티오닌, 시스테인, 아르기닌 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 인산과 아인산 또는 이들의 염이 또한 사용될 수 있다. 합성 완충제가 사용되기에 적합하지만, 유기 및 아미노산 또는 이들의 염과 같은 천연 완충제를 사용하는 것이 바람직하다.

추가 실시예에서, pH 조절제는 수산화칼륨, 수산화암모늄, 탄산칼륨 또는 중탄산칼륨, 염산, 질산, 황산 및 이들의 혼합물을 포함한다.

일 실시예에서, 중탄산나트륨 또는 탄산나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 또는 중인산나트륨과 같은, 염의 수성 조합제(aqueous preparation)와 같은 추가 성분이 미생물 기반 조성물에 포함될 수 있다.

유리하게는, 미생물 기반 제품은 미생물이 성장된 브로스를 포함할 수 있다. 이 제품은, 예를 들어, 중량 기준으로, 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 브로스일 수 있다. 제품 내 바이오매스의 양은, 중량 기준으로, 예를 들어, 이들 사이의 모든 백분율을 포함하여 0% 내지 100% 중 어느 것이라도 될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 미생물 기반 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 담체는, 제품이 생존할 수 있는 상태로 유지되거나, 또는 비활성 효모의 경우에, 효과적이기 위해 필요한 성분을 유지하는 방식으로, 효모 또는 효모 성장 부산물이 표적 식물, 토양, 동물, 어류 등에 전달되도록 하는 이 기술분야에 공지된 임의의 적합한 담체일 수 있다.

특정 실시예에서, 특히 농업과 관련해서, 미생물 기반 조성물은 조성물의 효능을 증가시키기 위해 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 보조제는 풀브산, 휴민산 및 휴민산염 중 하나 이상으로부터 선택된다.

선택적으로, 조성물은 사용 전에 저장될 수 있다. 저장 시간은 짧은 것이 바람직하다. 따라서, 저장 시간은 60일, 45일, 30일, 20일, 15일, 10일, 7일, 5일, 3일, 2일, 1일, 또는 12시간 미만일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 생세포가 제품에 존재하는 경우, 제품은 예를 들어, 20℃, 15℃, 10℃, 또는 5℃ 미만과 같은 양온(cool temperature)에서 저장된다. 한편, 생물 계면활성제 조성물은 전형적으로 주위 온도에서 저장될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 미생물 기반 제품은, 예를 들어, 전체 미생물 배양물의 사용으로 인해, 예를 들어, 정제된 미생물 대사물질 단독에 비해서 이점을 갖는다. 이들 이점은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 효모 세포벽의 외부 표면의 일부로서 고농도의 만노단백질; 효모 세포벽에 베타-글루칸의 존재; 배양물에서 생물 계면활성제의 존재; 및 배양물에서 용매(예를 들어, 락트산, 에탄올, 아세트산 에틸 등)와 다른 대사물질의 존재. 이들 이점은 활성 또는 비활성 효모 사용시 나타난다.

미생물 기반 조성물은, 예를 들어, 액체 현탁액, 에멀션, 동결 또는 분무 건조 분말, 과립, 펠릿, 또는 겔 형태의 미생물 기반 제품으로서 제제화될 수 있다. 특정 적용에 적합한 다른 제제가 예상된다.

일 실시예에서, 특히, 가축 적용에 사용하기 위해, 미생물 기반 제품은 펠릿당 균일한 농도의 원하는 미생물 또는 미생물 성장 생성물, 예를 들어, 정제된 피타아제를 포함하는 공급 펠릿으로서 제제화될 수 있다. 공급 펠릿을 제조하기 위해 이 기술분야에 공지된 방법은, 가압 밀링(pressurized milling)을 포함하여, 이들을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 펠릿화 공정은 "냉간(cold)" 펠릿화, 또는 고열 또는 증기를 사용하지 않는 공정이다.

일 실시예에서, 특히, 수생 적용(aquatic application)에 사용하기 위해, 미생물 균주는 비활성 미생물 기반 조성물을 생산할 목적으로 배양된다. 조성물은, 원하는 미생물을 배양하고, 미세 유동화(micro-fluidizing)에 의해(또는 단백질 변성을 일으키지 않도록 이 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해) 미생물을 파괴함으로써 제조되어, 저온 살균되고 농축된 형태로 식료품에 첨가된다. 일 실시예에서, 비활성화는 저온 살균 온도(효모 세포 100%를 비활성화시키기에 충분한 시간 동안 최대 65℃ 내지 70℃) 및 pH 값을 최대 약 10.0까지 증가시켜 일어난다. 이는 세포의 부분적인 가수분해를 유도하고, 그 안에서 일부 영양 성분의 방출(freeing)을 허용한다. 그 다음, 조성물은 약 7.0 ~ 7.5의 pH로 중화되고 다양한 가수분해 성분이 혼합된다. 이어서, 생성된 미생물 기반 제품은, 예를 들어, 어류 사료 및 양어장 물의 처리를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 미생물 기반 제품은, 예를 들어, 다음을 효율적으로 전달하는 능력 때문에 다양한 고유의 환경에서 사용될 수 있다: 1) 활성 대사물질을 갖는 신선한 발효 브로스; 2) 세포 및/또는 번식체와 발효 브로스의 혼합물; 3) 영양 세포 및/또는 번식체를 포함하는 고밀도의 세포를 갖는 조성물; 4) 즉석(on short-order) 미생물 기반 제품; 및 5) 원격 위치에 있는 미생물 기반 제품.

본 발명의 미생물 기반 제품은 전통적인 제품에 비해 특히 유리하고, 여기에서 세포는 발효 성장 배지에 존재하는 대사물질과 영양소로부터 분리되었다.

본 발명에 따라 성장한 미생물 균주

본 발명의 시스템과 방법에 따라 성장한 미생물은, 예를 들어, 세균, 효모 및/또는 균류일 수 있다. 이들 미생물은 천연 또는 유전자 변형된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 미생물은 특정 유전자로 형질 변환되어 특정한 특징을 나타낼 수 있다. 미생물은 또한 원하는 균주의 돌연변이체(mutant)일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "돌연변이체"는 기준 미생물(reference microorganism)의 균주, 유전자 변이체 또는 아류형(subtype)을 의미하고, 여기에서, 돌연변이체는 기준 미생물과 비교해서 하나 이상의 유전자 변이체{예를 들어, 점 돌연변이(point mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 결실(deletion), 복제, 프레임 시프트 돌연변이(frameshift mutation) 또는 반복 확장(repeat expansion)}를 갖는다. 돌연변이체를 만드는 절차는 미생물학 기술에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, UV 돌연변이 유발(mutagenesis)과 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine)은 이 목적을 향해 광범위하게 사용된다.

바람직한 특정 실시예에서, 미생물은 "킬러 효모"로 알려진 임의의 효모이다. 본원에 사용된 바와 같이, "킬러 효모"는 균주 자체가 면역성인 독성 단백질 또는 당단백질의 그 분비를 특징으로 하는 효모의 균주를 의미한다. 킬러 효모에 의해 분비된 외독소(exotoxin)는 효모, 균류, 또는 세균의 다른 균주를 사멸시킬 수 있다. 예를 들어, 킬러 효모에 의해 억제될 수 있는 미생물은 푸사리움(Fusarium) 및 다른 사상균류(filamentous fungi)를 포함한다. 이러한 효모는, 윅케르하모마이세스, 피치아, 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 한세니아스포라(Hanseniaspora), 우스틸라고 데바리오마이세스(Ustilago Debaryomyces), 칸디다(Candida), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 토룰롭시스(Torulopsis), 윌리옵시스(Williopsis), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시예에서, 본 발명은 피치아 속에 속하는 킬러 효모를 활용한다. 훨씬 더 구체적으로, 본 발명의 미생물은 피치아 아노말라(윅케르하모마이세스 아노말루스), 피치아 구일리에르몬디(메이에로지마 구일리에르몬디), 피치아 쿠드리아제비(윅케르하모마이세스 쿠드리아제비), 및/또는 이들의 조합물을 포함한다. 이들 3개의 피치아 미생물과 이들의 대사물질 및 다른 성장 부산물(때로 본원에 "3P" 또는 "Triple-P"로 표시됨)은 서로 상승적으로 작용하여, 본 발명에 의해 기술된 바와 같이, 식물과 동물 건강을 향상시키기 위해 사용될 때 바람직한 결과를 낳는다.

이들 효모는, 유리한 대사물질을 생산하는 이들의 능력을 포함하여, 본 발명에 유용한 다수의 유익한 특징을 갖는다. 예를 들어, 피치아 아노말라는 엑소-β-1,3-글루카나아제 활성을 가질 수 있고, 이는 광범위한 병원성 균류의 성장을 사멸시키거나 저해할 수 있도록 한다. 또한, 5 ~ 7일 동안 배양되는 경우, 피치아 아노말라는 물의 표면/계면 장력을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 항균성 및 항진균성 특성을 나타낼 수 있는 생물 계면활성제를 생산한다.

피치아 쿠드리아제비는, 대장균(Escherichia coli), 엔테로콕쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 클렙시엘라(Klebsiella sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에어로지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 슈도모나스 알칼리게네스(Pseudomonas alcaligenes)와 같은, 여러 인간 및 동물 병원체에 대해 항세균성 활성을 갖는 대사물질을 생산한다. 또한, 피치아 쿠드리아제비에 의해 생산된 독소(toxin)는 식물 세균성 질병을 일으킬 수 있는 다른 많은 그램 양성(Gram-positive)과 그램 음성(Gram-negative) 세균을 억제할 수 있다.

피치아 구일리에르몬디의 균주는 β-1,3-글루카나아제와 키티나아제를 포함하는 가수분해 효소를 생산한다. 이들 효소는 살선충성(nematicidal){예를 들어, 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)에 대해} 및 항진균성{예를 들어, 보트리티스 시네레아(B. cinerea)에 대해} 특성을 갖는 것으로 알려져 있다.

다양한 부산물 외에, 이들 효모는 피틴산(phytic acid){피테이트, 또는 미오이노시톨 헥사키스포스페이트(myo-inositol hexakisphosphate)}의 가수분해를 촉매화하는 포스파타아제(phosphatase) 효소인, 피타아제를 생산할 수 있다. 피틴산은, 가수분해시 사용 가능한 형태의 무기 인을 방출하는, 소화되지 않는 유기 형태의 인이다.

또한, 피치아 효모는 다수의 단백질(최대 50%의 건조 세포 바이오매스를 함유하는), 지질 및 탄소 공급원뿐만 아니라, 광범위한 미네랄과 비타민(B1; B2; B3 (PP); B5; B7 (H); B6; E)의 생산자이다.

예를 들어, 농업, 원예, 가축 사육 및 양식에서 생산을 향상시키는 데 유용한 효소, 산, 단백질, 생물 계면활성제, 미네랄 또는 비타민의 상당량을 축적할 수 있는 다른 미생물 균주를 포함하는 다른 미생물 균주가 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다.

농업, 원예, 가축 생산 및 양식에서 생산을 향상시키는 방법

특정 실시예에서, 본 발명은, 농업, 원예, 가축 생산 및/또는 양식에서 생산을 향상시키기 위한 환경 친화적이고 비용 효율적인 재료와 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 본 발명의 미생물 기반 제품을 사용하여 배양된 식물, 균류 및/또는 동물의 건강과 품질을 향상시키기 위한 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 가축 및/또는 양식 어류에 사료를 공급하기 위한 방법이 제공된다.

구체적으로, 본 발명은 농업, 원예, 가축 생산 및 양식으로부터 선택된 산업에서 생산을 향상시키는 방법을 제공하고, 여기에서 본 발명의 유효량의 미생물 기반 조성물이 선택된 산업과 관련된 특정 적용 또는 표적 장소에 적용된다. 적용 장소는 산업에 의존할 것이고, 예를 들어, 식물 및/또는 그 환경 또는 동물 및/또는 그 환경을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 조성물 또는 제품을 표적 또는 장소에 "적용"하거나, 또는 표적 또는 장소를 "치료"하는 것은, 조성물 또는 제품이 그 표적 또는 장소에 영향을 가질 수 있도록 조성물 또는 제품을 표적 또는 장소와 접촉시키는 것을 나타낸다. 이 효과는, 예를 들어, 미생물 성장 및/또는 대사물질, 효소, 생물 계면활성제 또는 다른 성장 부산물의 작용에 기인할 수 있다. 적용 또는 치료는 미생물 기반 조성물을 식물, 균류, 동물, 및/또는 그 주변 환경에 직접 적용하는 단계를 포함할 수 있다.

적용은 조성물 또는 제품을 식물, 식물 부분, 및/또는 식물의 주변 환경(예를 들어, 토양)과 직접 접촉시키거나, 또는 동물, 동물의 몸체 부분, 및/또는 동물의 주변 환경(예를 들어, 동물의 식량 공급원)과 직접 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물 기반 제품은, 예를 들어, 액체 또는 건조 분말, 가루(dust), 과립, 미세 과립(microgranule), 펠릿, 습윤성 분말(wettable powder), 유동성 분말(flowable powder), 에멀션, 미세 캡슐(microcapsule), 오일, 겔, 페이스트 또는 에어로졸로서 분무될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 농업 및 원예 환경에서 미생물 기반 제품의 필드 적용(field application)을 허용한다. 본 발명의 미생물 기반 제품은, 예를 들어, 관개 시스템(irrigation system)을 통해, 분무, 종자 처리(seed treatment)로서, 토양 표면, 농작물, 식물 또는 균류 표면, 및/또는 유해생물 표면에 적용될 수 있다. 항공 또는 지면 기반의 "드론"을 통해서 종래 도구 또는 로봇 응용(robotic application)을 통한 기계적인 적용이 또한 용이하게 된다. 과일, 꽃, 구근(bulb), 잎, 낟알(grain), 뿌리, 종자, 및/또는 줄기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 식물의 임의의 부분이 본 발명에 의한 치료를 위해 선택될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 가축 생산 환경에서 미생물 기반 제품의 필드 적용을 허용한다. 미생물 기반 제품은, 예를 들어, 경구, 정맥내, 피하, 또는 국소 약물(medication) 또는 보충제(supplement)로서, 또는 동물의 식량 및/또는 급수에서, 동물에게 직접 적용될 수 있다. 미생물 기반 제품은 또한 동물의 생활 환경에, 예를 들어, 분무 또는 코팅으로서, 지면 또는 울타리(enclosure) 표면에, 또는 유해생물 표면에 직접 적용될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 수생 환경에서 미생물 기반 제품의 필드 적용을 허용한다. 미생물 기반 제품은, 예를 들어, 조성물을 양어장의 물에 펌핑, 분무, 붓기, 또는 주입함으로써, 또는 예를 들어, 조성물을 양어장의 다양한 표면, 벽, 또는 울타리 위에 코팅하거나 스프레딩함으로써, 양어장에 적용될 수 있다. 또한, 조성물은, 예를 들어, 식량 공급원의 형태로 동물 자체에 적용될 수 있다.

미생물은 적용할 때에 살아있거나(또는 생존 가능) 또는 비활동성일 수 있다. 살아있는 미생물의 경우, 미생물은 적용 장소에서 원 위치에서 성장하여 현장에서 임의의 활성 화합물 또는 성장 부산물을 생산할 수 있다. 결과적으로, 치료 장소(예를 들어, CAFO 또는 양어장)에서 고농도의 미생물과 유익한 성장 부산물이 용이하고 연속적으로 이루어질 수 있다.

이를 위해, 이 방법은 적용 동안 미생물 성장을 향상시키기 위해 재료를 첨가하는(예를 들어, 미생물 성장을 촉진하기 위해 영양소를 첨가하는) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 영양 공급원은, 예를 들어, 질소, 질산염, 인, 마그네슘 및/또는 탄소를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 이 방법은 적용 전에 미생물 기반 조성물을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 미생물 기반 조성물은 적용 장소 또는 적용 장소 가까이에서, 예를 들어, 장소에서 100 마일 이내에서 배양된다.

일부 실시예에서, 해로운 단세포 또는 다세포 유기체에 의한 감염 또는 체내 침입을 예방 및/또는 치료하고; 토양을 개량하고 농작물 식물의 성장을 향상시키며; 및/또는 가축과 어류의 성장과 건강을 향상시키기 위한 방법이 제공된다.

일 실시예에서, 감염, 체내 침입, 질병, 및/또는 그 확산을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 해로운 감염, 체내 침입 및/또는 질병은, 식물, 균류, 및/또는 농작물; 가축 및 기타 육상 동물; 및/또는 어류 및 기타 수생 유기체에 해로운, 균류, 세균, 기생충, 및/또는 선충류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 해로운 단세포 또는 다세포 유기체에 의해 일어난다.

일 실시예에서, 이 방법은 피치아 효모 및/또는 이들의 성장 부산물을 포함하는 미생물 기반 조성물을 장소에 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 조성물은 해로운 균류의 성장을 사멸 및/또는 경쟁적으로 저해하고; 해로운 그램 양성 및 그램 음성 세균의 성장을 사멸 및/또는 경쟁적으로 저해하며; 해로운 연충 기생충(helminthic parasites)을 사멸시키고; 및/또는 해로운 선충류를 사멸시킨다. 각각이 고유한 사멸 능력을 갖는 이들 효모의 조합은, 예를 들어, 유기 농업, 유기 가축 및 유기 양식 산업에서 효과적인 시너지 생물적 방제 작용제(synergistic biocontrol agent)를 생성한다.

유리하게는, 이 방법은 유독한 화학 물질 또는 항생제를 사용하지 않으면서 식물, 가축 및 양식 어류의 면역 및/또는 병원성 방어를 개선한다.

특정 실시예에서, 이 방법은 농업 환경에서 농작물, 식물 및/또는 균류의 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료함으로써 농업에서 생산을 향상시키기 위해 사용된다.

본 발명이 유용한, 식물을 침범하는 세균성 감염의 예는, 슈도모나스 시린가에 병원체변종(Pseudomonas syringae pathovars); 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum); 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens); 잔토모나스 오리재 병원체변종 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae); 잔토모나스 캄페스트리스 병원체변종(Xanthomonas campestris pathovars); 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종(Xanthomonas axonopodis pathovars); 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora); 자이렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa); 디케야(Dickeya){다단티이(dadantii) 및 솔라니(solani)}; 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum)(및 펙토박테리움 아트로셉티쿰); 클라비박터 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis){미치가넨시스(michiganensis) 및 세페도니쿠스(sepedonicus)}, 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi) 및 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(Candidatus Liberibacter asiaticus)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명이 유용한, 식물을 침범하는 바이러스성 감염의 예는, 칼라바이러스(Carlavirus), 아부틸론(Abutilon), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 포티바이러스(Potyvirus), 마스트레바이러스(Mastrevirus), 바드나바이러스(Badnavirus), 레오바이러스과(Reoviridae) 피지바이러스(Fijivirus), 오리자바이러스(Oryzavirus), 파이토레오바이러스(Phytoreovirus), 미코레오바이러스(Mycoreovirus), 라이모바이러스(Rymovirus), 트리티모바이러스(Tritimovirus), 이포모바이러스(Ipomovirus), 바이모바이러스(Bymovirus), 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus), 루테오바이러스(Luteovirus), 베고모바이러스(Begomovirus), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 토스포바이러스(Tospovirus), 코모바이러스(Comovirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 네포바이러스(Nepovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 베니바이러스(Benyvirus), 푸로바이러스(Furovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus) 및 포모바이러스(Pomovirus)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

선충류는 또한 본 발명을 사용하여 치료될 수 있다. 선충류의 예는, 헤테로데라 속(genus Heterodera){예를 들어, 헤테로데라 글리신(H. glycines), 헤테로데라 아베내(H. avenae) 및 헤테로데라 샤크티(H. schachtii)} 및 글로보데라(Globodera){예를 들어, 글로보데라 로스토키엔스(G. rostochiens) 및 글로보데라 팔리다(G. pallida)}의 낭종 형성 선충류; 트리코도루스 속(genus Trichodorus)의 궁침 선충류(stubby root nematodes); 디틸렌쿠스 속(genus Ditylenchus)의 구근 및 줄기 선충류(bulb and stem nematodes); 황금 선충(golden nematode), 헤테로데라 로스토키엔시스(Heterodera rostochiensis); 뿌리혹선충 속(genus Meloidogyne){예를 들어, 자바니카 뿌리혹선충(M. javanica), 당근 뿌리혹선충(M. hapla), 땅콩 뿌리혹선충(M. arenaria) 및 고구마 뿌리혹선충(M. incognita)}의 뿌리혹 선충류(root knot nematodes); 프라틸렌추스 속(genus Pratylenchus){예를 들어, 프라틸렌추스 구데이(P. goodeyi), 프라틸렌추스 페네트란스(P. penetrans), 프라틸렌추스 브락트부루스(P. bractrvurus), 프라틸렌추스 제아에(P. zeae), 프라틸렌추스 코페아에(P. coffeae), 프라틸렌추스 브락트부루스(P. bractrvurus), 및 프라틸렌추스 토르네이(P. thornei)}의 뿌리 병변 선충류; 타이렌출루스 속(genus Tylenchulus)의 감귤류 선충류, 및 벨로날라이무스 속(genus Belonalaimus)의 찌르는 선충류(sting nematodes)이다.

본 발명의 방법 및 조성물이 유용한 다른 식물 또는 농작물 질병은, 유해생물 및/또는 병원체가 일으키는 마름병(blight), 동고병(canker), 부패병(rot), 시들음병(wilt), 녹병(rust), 탄저병(anthracnose), 세균성 반점병(bacterial spot), 뿌리혹병(club root), 옥수수 깜부기(corn smut), 혹병(gall), 모잘록병(damping off), 노균병과 백분병(downy and powdery mildew), 검은별무늬병(scab), 점무늬병(leaf spot), 곰팡이, 모자이크 바이러스(mosaic virus), 엽종병(leaf blister) 및 잎오갈병(curl)을 포함한다.

다른 실시예에서, 이 방법은 가축 및 다른 육상 동물의 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료함으로써 가축 생산을 향상시키기 위해 사용된다.

본 발명의 방법 및 조성물이 유용한 질병의 예는, 칸디다증(Candidiasis), 백선, 소 호흡기 복합 증후군(Bovine Respiratory Disease Complex), 기종저(blackleg){클로스트리디아성(Clostridial)}, 소 호흡기 세포 융합 바이러스(Bovine Respiratory Syncytial Virus), 소 바이러스성 설사증, 헤모필루스 솜누스(Haemophilus Somnus), 소의 전염성 비기관염(Infectious Bovine Rhinotracheitis), 파스튜렐라 헤몰리티카(Pasteurella Haemolytica)와 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella Multocida), 광견병(rabies), 계두(fowl pox), 인플루엔자, 뉴캐슬병(Newcastle disease), 전염성 코리자(infectious coryza), 가금 콜레라(fowl cholera), 대장균증(Colibacillosis), 기관지 패혈증 균병(Bordetellosis), 아스페르길루스증(Aspergillosis), 마이코플라즈마(Mycoplasmas), 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitis), 보툴리누스중독증(botulism), 출혈성 장염(hemorrhagic enteritis), 살모넬라(Salmonella), 궤양성 또는 괴사성 장염, 병아리 이질(pullorum disease), 가금 티푸스(fowl typhoid), 톡시디아(Coccidia), 기생충(예를 들어, 회충, 편충, 신충), 흑두병(blackhead), 포도상구균(Staphylococcus), 연쇄상구균(Streptococcus), 파보바이러스(parvovirus), 렙토스피라증(Leptospirosis) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 실시예에서, 이 방법은 양어장에서 어류와 기타 수생 및/또는 해양 생물의 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료함으로써 양식에서 생산을 향상시키기 위해 사용된다. 바람직하게는, 이 실시예에 따른 미생물 기반 조성물의 효모는 비활성화 상태에서 양어장에 적용된다.

본 발명의 방법 및 조성물이 유용한 병원체의 예는, 바이러스{예를 들어, 아쿠아비르나바이러스(Aquabirnavirus), 베타노다바이러스(Betanodavirus), 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus), 알파바이러스(Alphavirus), 랍도바이러스(rhabdovirus) 및 라나바이러스(Ranavirus)}, 세균{예를 들어, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 에어로모나스(Aeromonas), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 프란시엘라(Francisella), 포토박테리움(Photobacterium), 피스시리케치아(Piscirickettsia), 슈도모나스(Pseudomonas), 테나시바쿨럼(Tenacibaculum), 비브리오(Vibrio), 예르시니아(Yersinia), 락토콕쿠스(Lactococcus), 레니박테리움(Renibacterium) 및 스트렙토콕쿠스(Streptococcus)}, 균류{예를 들어, 사프로레그니아(Saprolegnia), 아스페르길루스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 엑소피알라(Exophiala), 이크티오포누스(Ichthyophonus), 브랜키오마이세스(Branchiomyces), 데르모시스티디움(Dermocystidium), 프로토테카(Prototheca), 오실라토리아(Oscillatoria), 포마 헤르바룸(Phoma herbarum), 및 패실로마이세스(Paecilomyces)}, 물 곰팡이{예를 들어, 사프로레그니아(Saprolegnia sp.)}, 및 기생충{예를 들어, 선충류, 조충류, 회충, 거머리, 이(lice), 요각류(copepods)와 같은 후생동물 기생충(metazoan parasite), 담수백점충(Ichthyophthirius multifiliis)과 같은 단세포 기생충, 및 유스트롱길리드(Eustrongylides)와 같은 연충}을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명을 사용하여 완화 또는 예방될 수 있는 수생 바이러스성 질병은, 전염성 췌장 괴사(infectious pancreatic necrosis), 바이러스성 신경 괴사(viral nervous necrosis), 연어 빈혈증 바이러스(salmon anemia virus), 췌장 질병, 전염성 조혈 괴사 바이러스(infectious hematopoietic necrosis virus)와 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus), 및 유행성 조혈 괴사 바이러스(epizootic hematopoietic necrosis virus)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명을 사용하여 완화 또는 예방될 수 있는 수생 세균성 질병은, 지느러미 부식병(fin rot), 어류 수종증(fish dropsy), 운동성 에어로모나스 패혈증(motile aeromonas septicaemia), 절창병(furunculosis), 크리세오박테리오시스(chryseobacteriosis), 메기의 장 패혈증(enteric septicaemia), 에드워드균감염증(edwardsiellosis) 또는 부패성 질병(putrefactive disease), 콜룸나리스(columnaris), 거짓 콜룸나리스(false columnaris), 플라보박테리오시스(flavobacteriosis) 또는 무지개송어 자어 증후군(rainbow trout fry syndrome), 세균성 아가미병(bacterial gill disease), 프란시셀로시스(francisellosis), 겨울 궤양병(winter ulcer disease), 파스투렐라병(pasteurellosis), 피스시리케치오시스(piscirickettsiosis) 또는 리케차성 패혈증(rickettsial septicaemia), 슈도모나스 패혈증(pseudomonads septicaemia) 또는 적색 반점병(red spot disease), 테나시바쿨로시스(tenacibaculosis), 비브로시스(vibrosis), 예르시니아증(yersiniosis) 또는 장의 구적병(enteric redmouth disease), 락토코코시스(lactococcosis), 노카르디아증(nocardiosis), 세균성 신장병(bacterial kidney disease), 포도상구균 감염증(staphylococcosis), 연쇄상구균 감염증(streptococcosis), 및 출혈성 패혈증(haemorrhagic septicaemia)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명을 사용하여 완화 또는 예방될 수 있는 다른 수생 질병 또는 체내 침입은, 아가미 부식병(gill rot), 이크티오포누스 질병(ichthyophonus disease), 물곰팡이병(saprolegniasis), 벨벳 질병(velvet disease), 홀 인더 헤드(hole in the head), 및 선회병(whirling disease)을 포함한다.

본 발명의 추가 실시예에서, 토양을 비옥하게 함으로써 농업에서 생산을 향상시키기 위한 방법이 제공되고, 여기에서 본 발명의 미생물 기반 조성물이 토양에 적용된다. 하나 이상의 배양된 피치아 효모와, 선택적으로, 하나 이상의 보조제를 포함하는 조성물을 토양에 적용함으로써, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 피타아제, 아미노산, 단백질, 비타민 및 미량 원소와 같은 유익한 미생물 대사물질의 존재로 인해 농작물 수확량을 증가시키고, 성장한 농작물 및 식물 제품의 품질을 향상시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 보조제는 풀브산, 휴민산 및/또는 휴민산염이다.

유리하게는, 피타아제의 존재는 식물에서 영양 결핍의 치료 및/또는 예방을 허용한다. 특히, 본 발명은 식물을 둘러싸는 토양에 적용될 때 식물에서 인 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

추가 실시예에서, 본 발명은 인산염 보존에 사용될 수 있다. 인산염이 불용성 형태로 토양에 존재하는 경우, 인산염이 거기에 남아 있어서, 뿌리계(root system)를 심는 데 사용할 수 없다. 토양에 Triple-P 제품을 첨가함으로써, 인산염은 식물에 의해 회수될 수 있는 더 가용성인 형태로 변환될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 미생물 기반 조성물을 사용하여 가축에 사료를 공급하기 위한 저비용 재료와 방법을 추가로 제공한다. 일 실시예에서, 미생물 기반 조성물은 식이 보충제로서 동물의 사료 또는 식수와 제제화되거나, 또는 이들에 적용된다.

미생물 기반 조성물은, 예를 들어, 조성물을 전통적인 가축 사료와 함께 사료통 안에 넣고 가축이 이 조성물을 섭취하게 함으로써, 가축을 위한 영양가 높은 보충 식량 공급원으로서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 조성물은 사료 성분과 혼합되어 균일하고 균질화된 펠릿으로 제제화될 수 있다. 식품 보충제로서, 미생물 기반 제품은, 다른 이익 중에서도, 피타아제 및 아미노산, 단백질, 비타민 및 미량 원소의 추가 공급원을 제공할 수 있다.

일부 실시예에서, 미생물 기반 조성물은 가축에서 영양 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 이들의 사료 공급원에 피타아제를 보충함으로써 가축에서 인 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위한 식이 보충제로서 사용될 수 있다.

유리하게는, 본 발명은, 예를 들어, 이들의 면역 체계를 지탱하고, 인, 아미노산, 단백질, 비타민 및 기타 미량 원소의 추가 공급원을 제공함으로써, 가축 동물의 성장과 건강은 향상시키면서 가축에 사료를 공급하는 비용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 미생물 기반 조성물을 사용하여 어류에 사료를 공급하기 위한 저비용 재료와 방법을 제공한다. 미생물 기반 조성물은, 예를 들어, 조성물을 어류의 환경 안으로 도입하고 어류가 이 조성물 및/또는 사료를 섭취하게 함으로써, 어류를 위한 영양가 높은 식이 보충제로서 사용될 수 있다. 이 조성물은 또한 표준 어류 사료에 적용되거나 또는 이와 배합되어 양식 어류에 공급될 수 있다. 유리하게는, 본 발명은 양식 어류에 사료를 공급하는 비용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시예에서, 본 발명은 양식 어류에서 영양소 흡수를 개선함으로써 양식에서 생산을 향상시키는 방법을 제공한다. 구체적으로, 어류에 의한 섭취시, 본 발명의 미생물에 의해 생산된 생물 계면활성제는 어류의 소화관 내에서 지용성 비타민을 포함하는 영양소의 흡수를 개선함으로써 양식 어류의 전반적인 건강과 품질의 증가에 기여한다.

조성물은, 예를 들어, 액체 용액의 형태로, 또는 건조 분말, 가루, 플레이크 또는 펠릿으로서, 양어장 물과 같은 어류의 환경에 적용될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 조성물을 섭취하는 어류는 종래의 생선 가루가 공급된 어류와 비교했을 때 증가된 중량 증가(weight gain)를 경험하고, 중량 증가의 대부분은 더 낮은 체지방 비율이 수반되는 증가한 체단백질 비율의 결과이다.

다른 실시예에서, 본 발명은 어류에 사료를 보충하는 방법뿐만 아니라, 어류에 사료를 공급하는 비용을 낮추는 방법을 제공한다. 본 발명의 미생물 기반 조성물은, 농축된 양의 풍부한 단백질, 탄수화물, 지질, 지방산, 아미노산, 미네랄 및 비타민을 제공하는 비활성 효모 세포를 포함하는 단세포 단백질 공급원으로서 어류의 환경에 적용될 수 있다. 일부 실시예에서, 미생물 기반 조성물은 어류에서 영양 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 이들의 사료 공급원에 피타아제를 보충함으로써 양식 어류에서 인 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위한 식이 보충제로서 사용될 수 있다.

전통적인 어류 및 어유 유래 사료의 비용이 증가하는 것으로 인해, 많은 양식 작업이 어류에게 사료를 공급하기 위해 곡물 기반의 사료를 활용하기 시작했다. 옥수수, 콩, 및 수수와 같은 성분이 어류 사료를 제조하기 위해 현재 사용되고 있다. 곡물 기반 식단으로 인한 어류 자체의 건강에 미치는 영향은 결정적으로 알려져 있지는 않지만, 그럼에도 불구하고, 시간외로(overtime) 바람직하지 않을 가능성이 있다.

또한, 예를 들어, 해산물 산업의 성공은, 부분적으로는 높은 수준의 오메가-3 지방산과 같은 해산물을 인간이 소비하는 것의 매력적인 건강상의 이득에 의존한다. 육식성 또는 잡식성 식단으로부터 엄격하게 식물 기반 식단으로 양식 어류를 전이시킴으로써, 최종 어류 제품의 영양 함량이 변경될 수 있고, 예를 들어, 어류 제품의 지방산 함량이 감소될 수 있다. 인간의 영양뿐만 아니라, 해산물 산업에 미치는 이러한 변화의 영향은 광범위할 수 있다.

따라서, 기존의 어류 사료에 대한 보충제로 작용함으로써, 본 발명은 전통적인 어류 기반의 어류 사료(fish-based fish feeds)를 사용하는 비용 증가를 완화하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은, 양식 어류의 건강과 품질을 모두 손상시키지 않으면서, 전통적인 어류 기반 사료로의 복귀를 허용하면서도, 어류에 사료를 공급하는 비용을 낮출 수 있다.

예

본 발명 및 그것의 많은 이점에 대한 더 큰 이해는 예시로 제공된 다음의 예로부터 얻을 수 있다. 다음의 예는 본 발명의 방법, 적용, 실시예 및 변형의 일부를 예시한다. 이들은 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본 발명에 관해서 다수의 변화와 수정이 이루어질 수 있다.

예 1 - 피치아 효모 제품 "Triple-P"의 배양

본 발명에 사용하기 위한 피치아 효모를 배양하는 비용을 감소시키고, 이들 효모의 저비용 및 효율적인 산업 규모 생산을 확립하기 위해, 발효의 시스템과 방법이 제공된다.

Triple-P의 생산은, 통상적이지 않은 기술을 사용하고 성장과 대사물질 생산을 촉진하는 데 효과적인 호기성 조건 하에서 효모를 배양함으로써 이루어진다. 바람직하게는, 각각의 피치아 균주는 개별적으로 배양되고, 그후 생성된 배양물은 기계 혼합기를 사용하여 혼합되어 Triple-P 제품을 형성한다.

유리하게는, 본 발명의 시스템과 방법은 임의의 크기 작업을 위해 저렴하고, 실질적으로 무제한의 양의 효모 기반 제품을 생산할 수 있다. 또한, 시스템은, 예를 들어, 발효 시스템에 대한 이전의 경험이 거의 없거나 또는 전혀 없는 농업인 또는 재배업자에 의해 작동될 수 있다.

발효는, 바람직하게는 교반 없이, 배치(batch) 공정으로서 스케일러블 반응기(scalable reactor)에서 수행된다. 수직 평행 육면체 탱크를 포함하는 휴대용 분배 가능 반응기가 활용된다. 이 시스템은 2개의 배관 시스템(tubing system)을 포함하는 혼합 시스템이 장착되어 있고, 각각의 배관 시스템은 탱크의 하단(bottom)으로부터 배양물을 끌어당겨 탱크의 상단(top)에 침전시키는 펌핑(pumping) 메커니즘이 장착되어 있다. 움직이는 배양물의 통기(aeration)를 위해 여과된 공기를 시스템 안으로 첨가하기 위해 공기 압축기가 사용된다.

여과된 공기를 탱크 안에 첨가하는 것은 버블러(bubbler)를 통해 흐르는 스파징(sparging) 메커니즘에 의해 제어된다. 스파징을 위해 여과된 공기는 대용량 수중 펌핑 시스템을 통해 생성된다. 전체적으로, 탱크당 두 개의 72-인치 버블러가 있다.

반응기는 세포 및 대사물질 생산을 위한 효모를 성장시키기 위해 550 ~ 1,000 리터의 작업 부피(working volume)를 갖지만; 반응기의 크기, 재료(예를 들어, 금속) 및 구성은 (요건에 따라) 달라질 수 있다.

반응기는 전통적인 방법으로 멸균되지 않기 때문에, 배양물 생산 비용이 감소된다. 대신, 피치아 생산의 경우, 킬러 효모는 자가 멸균할 수 있고, 즉, 이들의 성장 부산물은 임의의 가능한 이질적인 미생물이 배양물을 오염시키는 것을 억제한다. 또한, 1% 과산화수소로 내부 표면을 처리하고 표백제와 고압 온수로 헹구는 것을 포함하는 빈 용기 위생(empty vessel sanitation) 방법이 사용될 수 있다.

반응기의 접종은, 20 ~ 30 리터의 활발히 성장하는 배양물에 의해 수행되어 시딩 재료(seeding material)에서 원하는 독소 및/또는 기타 성장 부산물의 존재를 보장하고 가능한 오염 물질의 증식을 방지하거나, 또는 농축된 피치아 상청액을 사용함으로써 수행될 수 있다. 또한, 접종은 pH 수준 2.5 ~ 3.5에서 시작하여, 발효 주기가 시작되는 동안 12시간 후에 4.5 ~ 5.0으로 증가할 수 있다.

발효의 온도와 pH는 결정적이지 않지만, 일반적으로 온도는 약 25 내지 37℃ 미만, 바람직하게는 약 25 내지 30℃이어야 하고, pH 수준은 약 3.0 내지 약 5.0, 바람직하게는 약 3.5 내지 약 4.5이어야 한다. 발효 중의 pH 안정화는 필요하지 않지만, 3.0 미만으로 떨어지는 경우에는 pH를 3.5 ~ 4.0으로 올리는 것이 권장된다.

필요한 경우, 발효 중에 pH의 조절 또는 유지는, 염기를 첨가하기 위해 자동 pH 조절기를 사용하는 것과 같이, 이 기술분야에서 통상적인 수동 또는 자동 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. pH 조절을 위해 사용된 바람직한 염기는 NaOH와 KOH를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

NYDB(물 1 리터당, 영양 브로스 10 g, 효모 추출물 8 g, 덱스트로오스 20 g), PDB(감자 덱스트로오스 브로스), ME(맥아 추출물)와 같은 복합 배지(complex media)와, 글루코오스, 수크로오스, 소르비톨, 당밀 등과 같은 다양한 탄소 공급원이 보충된 화학적으로 정의된 배지 양쪽 모두를 사용하여 발효에 의해 피치아를 생산할 수 있다.

그러나, 필요한 경우, 배지의 비용은, 아래 나열된 바와 같이, 세 가지 주요 성분만 갖는 것으로 추가 감소될 수 있다.

전형적인 성장 시간은 48시간 내지 72시간이고, CFU 농도는 6억 내지 10억 개의 세포/ml이다.

기성 배양물(readymade culture)은 많은 적용을 위한 최종 제품이다. 그러나, 필요할 경우, 효모 세포는 원심 분리, 여과 또는 침전에 의해 수확될 수 있다. 생성된 효모 페이스트(습식 바이오매스)는 저장 동안 저장 수명(shelf-life)을 늘리기 위해 염, 글리세롤, 락토오스, 트레할로오스, 수크로오스, 아미노산을 첨가함으로써 보존될 수 있다.

대부분의 상업적인 효모 제품은 액체 배지로부터 효모 세포를 분리하기 위해 고속 원심 분리에 의해 생산된다. 수집된 효모 세포는 동결 건조, 유동층 건조 또는 분무 건조에 의해 건조될 수 있다. 건조된 제품은 사용할 준비가 되면 물에 재수화될 것이다. 이들 단계는 세포 벽을 손상시키고 세포 사망(cell mortality)을 일으킬 것이다.

효모 세포를 사용 전에 연장된 시간 동안 보관해야 하는 경우, 이들을 적절한 용기 안에 넣고 4℃에서 보관해야 한다. 이 방법을 사용할 때, 효모 세포는 2일 내에 용기의 밑바닥에 가라앉았다. 배지 상청액은 액체를 사이펀으로 빨아올림으로써 제거될 수 있으며, 소량의 상청액이 효모 세포를 덮는다. 이러한 조건 하에서, 6개월의 저장 후, 피치아 세포의 생존력은 급격하게 감소하지 않을 것이다.

예 2 - 피치아 아노말라를 사용하는 피타아제 생산 계산

피치아 아노말라는 다음의 성장 배지: 당밀(4%), 요소(0.2%), 펩톤(2.5%)을 사용하여 72시간 동안 5.0으로 조절된 pH에서 발효 반응기에서 성장되었다.

피틴산은 참깨 씨(sesame seeds)로부터 이 씨를 파쇄(breaking)/분쇄(crushing)함으로써 채취되었다. 이어서, 씨 부분(5g)을 10 mL의 물에 첨가하고 혼합하였다. 피타아제의 존재를 위해 배지와 세포를 시험하였다. 0.2M 글리신 완충제를 사용하여 pH를 4로 조절하고, 피틴산의 pH를 또한 4로 조절하였다.

3일 후, 6개의 상이한 표준 물질(standard)을 제조함으로써 피타아제 활성을 측정하였다:

0) 550 마이크로리터의 물

1) 10 마이크로리터의 50 mM 인산칼륨과 540 마이크로리터의 물

2) 20 마이크로리터의 50 mM 인산칼륨과 530 마이크로리터의 물

3) 30 마이크로리터의 50 mM 인산칼륨과 520 마이크로리터의 물

4) 40 마이크로리터의 50 mM 인산칼륨과 510 마이크로리터의 물

5) 50 마이크로리터의 50 mM 인산칼륨과 500 마이크로리터의 물

500 ㎕의 피틴산, 25 ㎕의 0.2M 글리신 완충제 및 25 ㎕의 물을 사용하여 15개의 피틴산 블랭크(blank)를 제조하였다.

25 ㎕의 피타아제, 25 ㎕의 0.2M 글리신 완충제 및 500 ㎕의 물을 사용하여 15개의 피타아제 샘플 블랭크를 제조하였다.

500 ㎕의 피틴산, 25 ㎕의 0.2M 글리신 완충제 및 25 ㎕의 피타아제를 사용하여 15개의 피타아제 샘플을 제조하였다.

4 ml의 아세톤-몰리브덴산암모늄-H₂SO₄(50ml-25ml-25ml)의 용액을 6개의 표준 물질 각각에 첨가하였다.

각각의 샘플과 블랭크를 37℃에서 30분 동안 수조(water bath)로 옮겼다. 30분 후, 4 ml의 아세톤-몰리브덴산암모늄-H₂SO₄ 용액을 각각의 샘플과 블랭크에 빠르게 첨가하여 인산염을 침전시켰다. 그 다음에, 이들을 원심 분리하고, 300 ㎕의 상청액을 600 ㎕의 물에 용해시켰다.

다음으로, 500 ㎕의 모든 샘플, 블랭크 및 표준 물질을 Varioscan 장비 웰 플레이트(equipment well plate)에 업로드하고, 400 nm에서 흡광도를 측정하였다.

표준 값을 3회 측정하고, 이들의 평균을 취하였다. 표준 물질 1~5의 각각의 값에서 표준 물질 0 값을 빼서, 특정 농도의 인산염의 흡광도와 상관된 수를 얻었다. 각각의 표준 물질에 대한 평균 흡광도는 표 1에 보고되어 있다. 샘플과 블랭크의 평균 흡광도는 표 2에 보고되어 있다.

방출된 인산염의 밀리몰을 측정하기 위해, 피타아제 샘플 블랭크의 평균 흡광도를 피틴산 블랭크의 평균 흡광도에 더하고, 피타아제 샘플의 평균 흡광도에서 뺐다. 생긴 수는 0.012 OD였다. 도 1을 기초로, 방출된 인산염의 값은 0.198 mM이었다.

(1) 단위/ml의 효소활성 = (mM의 인산염)×(희석 인자) / (시간)×(첨가된 효소량)

마지막으로, 상기 식 1에 따라, 반응기에서 피타아제 농도는 792 단위(units)/ml인 것으로 계산되었다.

예 3 - 토마토 식물에 대한 TRIPLE-P의 적용

토마토 식물을 Triple-P 제품으로 처리하였다. 토마토 식물은 높이가 20~25% 증가하였다. 또한, 생산된 과일의 수와 생산된 과일의 크기 모두 50% 증가하였다.

Claims (23)

1. 농업, 원예, 가축 생산, 및/또는 양식에서 생산을 향상시키기 위한 조성물에 있어서,
   상기 조성물은 하나 이상의 생물학적으로 순수한 피치아 클레이드(Pichia clade) 효모 및/또는 그 성장 부산물과, 선택적으로, 담체를 포함하는, 생산을 향상시키기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 효모는, 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 쿠드리아제비(Pichia kudriavzevii), 피치아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii), 또는 이들의 조합물인, 생산을 향상시키기 위한 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 효모는 피치아 아노말라인, 생산을 향상시키기 위한 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   풀브산(fulvic acid), 휴민산(humic acid) 및 휴민산염(humate) 중에서 선택된 보조제를 더 포함하는, 생산을 향상시키기 위한 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   미생물 성장을 위한 첨가된 영양소를 더 포함하는, 생산을 향상시키기 위한 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 미생물 성장 부산물은 효소, 산, 용매, 알코올, 단백질, 비타민, 미네랄, 미량 원소(microelement), 아미노산, 및/또는 생물 계면활성제인, 생산을 향상시키기 위한 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 미생물 성장 부산물은 효소 피타아제(enzyme phytase)를 포함하는, 생산을 향상시키기 위한 조성물.
8. 농업, 원예, 가축 생산 및 양식으로부터 선택된 산업에서 생산을 향상시키는 방법에 있어서,
   상기 방법은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유효랑의 조성물을 상기 선택된 산업과 관련된 표적 장소에 적용하는 단계를 포함하는, 생산을 향상시키는 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 표적 장소는 식물, 균류, 동물, 및/또는 그 주변 환경인, 생산을 향상시키는 방법.
10. 제8항에 있어서,
    세균, 바이러스, 균류, 기생충, 및/또는 선충류를 포함하는, 해로운 단세포 또는 다세포 유기체에 의해 발생한 감염, 체내 침입 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용되는, 생산을 향상시키는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    선충류를 억제하기 위해 사용되는, 생산을 향상시키는 방법.
12. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 토양에 적용되는, 생산을 향상시키는 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 방법은 농작물 수확량을 증가시키는, 생산을 향상시키는 방법.
14. 제12항에 있어서,
    식물에서 영양 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는, 생산을 향상시키는 방법.
15. 제14항에 있어서,
    상기 영양 결핍은 인 결핍인, 생산을 향상시키는 방법.
16. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 식이 보충제로서 동물의 사료 및/또는 동물의 식수와 제제화되거나, 또는 이들에 적용되는, 생산을 향상시키는 방법.
17. 제16항에 있어서,
    동물에서 영양 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는, 생산을 향상시키는 방법.
18. 제17항에 있어서,
    상기 영양 결핍은 인 결핍인, 생산을 향상시키는 방법.
19. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 양식 어류를 위한 식이 보충제로서 어류의 환경, 또는 어류 사료에 적용되는, 생산을 향상시키는 방법.
20. 제19항에 있어서,
    상기 양식 어류에서 영양 결핍을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는, 생산을 향상시키는 방법.
21. 제20항에 있어서,
    상기 영양 결핍은 인 결핍인, 생산을 향상시키는 방법.
22. 제9항에 있어서,
    상기 미생물 및/또는 그 성장 부산물을 상기 표적 장소에 적용하기 전에 배양하는 단계를 더 포함하는, 생산을 향상시키는 방법.
23. 제22항에 있어서,
    상기 미생물은 분배 가능한 반응기 내에서 배지에 배양되고, 상기 배지는:
    당밀(molasses), 4%,
    요소(urea), 0.2%, 및
    펩톤(peptone), 2.5%를
    포함하는, 생산을 향상시키는 방법.

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