TWI720051B - 經修飾之介白素－７融合蛋白的調配物 - Google Patents

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Abstract

在此提供的是一種包含經修飾之IL-7蛋白的藥學調配物。更具體地說，其包含(a)經修飾之IL-7融合蛋白；(b)濃度為10至50mM之基礎緩衝液；(c)濃度為2.5至5w/v%之糖；以及(d)濃度為0.05至6w/v%之界面活性劑。
此經修飾之IL-7融合蛋白的藥學調配物在諸如氧化或攪拌之應力條件下，不會顯示出凝集的形成，而是會在蛋白上顯示出保護作用，因此可有效地用於治療病人。

Description

經修飾之介白素-7融合蛋白的調配物
本發明有關一種包含經修飾之介白素-7融合蛋白的藥學組成物之調配物。
發明背景
介白素-7(IL-7)是一種可刺激由T細胞以及B細胞介導之免疫反應之細胞激素，以及明確而言，其在適應性免疫系統中扮演重要角色。雖然IL-7主要是由骨髓以及胸腺中之基質細胞分泌的，但其亦在角質細胞、樹突細胞、肝細胞、神經以及上皮細胞中產生(Heufler C et al.,1993,J.Exp.Med.178(3)：1109-14；Kroncke R et al.,1996,Eur.J.Immunol.26(10)：2541-4；Sawa Y et al.,2009,Immunity 30(3)：447-57；Watanabe M et al.,1995,J.Clin.Invest.95(6)：2945-53)。
IL-7藉由影響T細胞與B細胞的存活與分化以及刺激NK(自然殺手)細胞之活性等等，來活化免疫系統，更具體地說，其在B細胞的發展上起重要的作用。IL-7會經由刺激IL-2(一種細胞激素)以及干擾素-γ的分泌而增強人體的免疫反應。
換句話說，IL-7是一種細胞激素，其會促進T細胞、B細胞以及其它免疫細胞之存活以及增生，且為可應用於各種病症如病毒感染、癌症以及免疫系統損傷之免疫治療劑之極佳的候選物。最近，已經進行IL-7對各種惡性腫瘤以及人類免疫缺陷病毒感染的作用之臨床研究，報告結果顯示IL-7在人體內具免疫提升作用(Fry TJ et al.,2002,Blood 99(11)：3892-904；Muegge K et al.,1993,Science 261(5117)：93-5；Rosenberg SA et al.,J.Immunother.29(3)：313-9)。此外，已經報導IL-7有助於同種異體幹細胞移植後的免疫恢復(Snyder KM,2006,Leuk Lymphoma 47(7).1222-8)，以及亦可用於治療淋巴球減少症。據此，IL-7會重組免疫細胞、提高T細胞功能以及與誘發免疫抑制之物質競爭，因此可用於治療癌症或慢性感染。
然而，為了應用諸如IL-7之蛋白於藥學上之用途，需要製備一種考慮到該蛋白於周遭環境中之結構以及生化安定性之適合的調配物。此外，該蛋白之物化安定性會受到外在因素的影響，如藥學調配物之製造、蛋白之純化以及貯存。一般而言，蛋白在結構以及熱力學上是不安定的，因此易有凝集形成或易受物化降解。此外，當免疫球蛋白的Fc區用作融合配偶體時，整個融合蛋白的生化特性如熱力學性質、ζ電位和應力安定性等可能會有很大的變化，因為Fc區具有大的分子量和複雜結構。明確地，對於修飾之IL-7融合蛋白之安定的調配物的了解甚少。因 此，需要優化蛋白之調配物，以便增加該蛋白於藥學應用上之安定性。
本發明之揭示內容
因此，本發明人已經建立一種用以增加經修飾之IL-7融合蛋白的安定性之適當的調配物，供用於治療各種病症。
本發明之一目的是提供一種藥學調配物，其包含一增加安定性之經修飾之IL-7融合蛋白。
根據本明之標的，提供一種藥學調配物，其包含：(a)經修飾之IL-7融合蛋白；(b)濃度為10至50mM之基礎緩衝液；(c)濃度為2.5至5w/v%之糖；以及(d)濃度為0.05至6w/v%之界面活性劑。
如本發明之經修飾之IL-7融合蛋白的藥學調配物，在諸如氧化以及攪拌之應力條件下，不會顯示出凝集的形成，而是會維持該經修飾之IL-7融合蛋白之安定性，因此可用於治療病人。
圖1是顯示根據本發明之經修飾之IL-7融合蛋白的結構之示意圖。
圖2顯示經修飾之IL-7融合蛋白在各種基礎 緩衝液條件下之示差掃描量熱法(DSC)結果之圖表。
圖3顯示經修飾之IL-7融合蛋白在各種基礎緩衝液條件下之動態光散射(DLS)分析結果之圖表。
圖4顯示經修飾之IL-7融合蛋白在其中於組胺酸-醋酸鹽緩衝液中添加各種賦形劑之條件下之DLS分析結果之圖表。
圖5顯示經修飾之IL-7融合蛋白在其中於檸檬酸鈉緩衝液中添加各種賦形劑之條件下之DLS分析結果之圖表。
本發明之模式
以下，將詳細說明本發明。
本發明提供一種藥學調配物，其包含(a)經修飾之IL-7融合蛋白；(b)濃度為10至50mM之基礎緩衝液；(c)濃度為2.5至5w/v%之糖；以及(d)濃度為0.05至6w/v%之界面活性劑。
在此使用之術語"介白素-7(IL-7)"指的是一種造血生長因子，其在各種基質細胞、角質產生細胞、樹突細胞、神經元、上皮細胞等等中表達或分泌。IL-7可經由結合受體而促進免疫反應，以及活化各種涉及免疫系統之免疫細胞，如T細胞、B細胞、單核細胞。
此IL-7是介白素-7(IL-7)或具IL-7相似活性之多肽。
本發明之IL-7包括由序列辨識編號：1至6所 示之胺基酸序列所構成之多肽。此外，該IL-7融合蛋白之胺基酸序列可具有與序列辨識編號：1至6之序列約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同源性。IL-7可為IL-7融合蛋白或包含其片段之融合蛋白。此外，IL-7可源自人、大鼠、小鼠、猴子、母牛或綿羊。
具體而言，人衍生的IL-7可具有由序列辨識編號：1所示之胺基酸序列(Genbank登錄號：P13232)；大鼠衍生的IL-7可具有由序列辨識編號：2所示之胺基酸序列(Genbank登錄號：P56478)；小鼠衍生的IL-7可具有由序列辨識編號：3所示之胺基酸序列(Genbank登錄號：P10168)；猴子衍生的IL-7可具有由序列辨識編號4所示之胺基酸序列(Genbank登錄號：NP_001279008)；牛衍生的IL-7可具有由序列辨識編號：5所示之胺基酸序列(Genbank登錄號：P26895)；以及綿羊衍生的IL-7可具有由序列辨識編號：6所示之胺基酸序列(Genbank登錄號：Q28540)。
在此使用之術語"經修飾之IL-7"，指的是其中IL-7之末端存在一由1至10個胺基酸構成之寡肽，從而與野生型IL-7具有不同的序列之分子。
較佳地，如本發明之經修飾之IL-7具下列結構：A-IL-7；其中該A可結合至IL-7之N端。編碼該A之核酸可與 IL-7基因依序存在一DNA建構體上，其可表達成蛋白。此外，該A可獨立地表達或合成，之後再經化學鍵與IL-7結合。
該A可包含1至10個，具體地2至8個，更具體地1至5個胺基酸，其中所含的胺基酸可擇自於由下列構成之群組：甲硫胺酸(M)、甘胺酸(G)以及其等之組合。該A之例子包括M、G、MM、MG、GM、GG、MMM、GMM、MGM、MMG、GGM、GMG、MGG、GGG、MMMM(序列辨識編號：9)、GMMM(序列辨識編號：10)、MGMM(序列辨識編號：11)、MMGM(序列辨識編號：12)、MMMG(序列辨識編號：13)、GGMM(序列辨識編號：14)、MGGM(序列辨識編號：15)、MMGG(序列辨識編號：16)、GMGM(序列辨識編號：17)、MGMG(序列辨識編號：18)、GMMG(序列辨識編號：19)、GGGM(序列辨識編號：20)、MGGG(序列辨識編號：21)、GMGG(序列辨識編號：22)、GGMG(序列辨識編號：23)、GGGG(序列辨識編號：24)、MMMMM(序列辨識編號：25)、GMMMM(序列辨識編號：26)、GGMMM(序列辨識編號：27)、GGGMM(序列辨識編號：28)、GGGGM(序列辨識編號：29)、MGMMM(序列辨識編號：30)、MGGMM(序列辨識編號：31)、MGGGM(序列辨識編號：32)、MGGGG(序列辨識編號：33)、MMGMM(序列辨識編號：34)、MMGGM(序列辨識編號：35)、MMGGG(序列辨識編號：36)、MMMGM(序列辨識編號：37)、MMMGG(序列辨識編號：38)、 MMMMG(序列辨識編號：39)、MGGGM(序列辨識編號：40)、MGMGM(序列辨識編號：41)、GMGMG(序列辨識編號：42)、GMMMG(序列辨識編號：43)、GGMGM(序列辨識編號：44)、GGMMG(序列辨識編號：45)、MGGMG(序列辨識編號：46)、MGMGG(序列辨識編號：47)、GMMGM(序列辨識編號：48)、MGMMG(序列辨識編號：49)、GMGGM(序列辨識編號：50)、MMGMG(序列辨識編號：51)、GMMGG(序列辨識編號：52)、GMGGG(序列辨識編號：53)、GGMGG(序列辨識編號：54)、GGGMG(序列辨識編號：55)以及GGGGG(序列辨識編號：56)等等。根據本發明之範例，該A可為M、MM、GM、MGM或MMM。
根據本發明之經修飾之IL-7融合蛋白，可在其C端上另外包含一經修飾之免疫球蛋白之Fc區。
在此使用之術語"經修飾之IL-7融合蛋白"指的是其中經修飾的免疫球蛋白Fc區結合至經修飾的IL-7之C端之分子。
該經修飾之免疫球蛋白Fc區是一種Fc區，其對Fc受體或補體之結合活性被修飾而導致抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)被弱化。此修飾可經由Fc區中Fcγ受體(FcrR)、C1q以及Fc結合受體(FcRn)結合位點之基因突變(即，序列之取代、刪除)來實現。
此外，此修飾可經由混合不同類型的免疫球 蛋白序列來實現，即經由製備雜合Fc。
在此使用之術語"Fc區"、"Fc片段"或"Fc"，在從N端至C端之方向上可包括鉸鏈區、重鏈恆定區2(CH2)結構域以及重鏈恆定區3(CH3)結構域。此區可另外包含一種鉸鏈區，其中該鉸鏈區可作為連接子，且可經適當地修飾以改善分子特性。
稱作"hFc"或"hyFc"之Fc區或其片段，是一種雜合Fc類型，其是結合不同類型的Fc區所製得。此hyFc可包括一部分的人IgD鉸鏈區、人IgD CH2結構域之胺基酸殘基、人IgG4 CH2結構域之胺基酸殘基以及人IgG4 CH3結構域之胺基酸殘基。
可將Fc區變體修飾成防止在鉸鏈區處發生截斷。具體而言，可修飾序列辨識編號：7中位置144處之胺基酸和/或位置145處之胺基酸。較佳地，可用G或S取代序列辨識編號：7中位置144處之胺基酸K，以及可用G或S取代序列辨識編號：7中位置145之胺基酸E，形成一變體。
此外，二個融合蛋白可形成一個二聚體。例如，當第三結構域是Fc區時，該Fc域可結合彼此而形成二聚體。
根據本發明之範例，該經修飾之免疫球蛋白Fc區可為由序列辨識編號：7所示之胺基酸序列所構成之多肽。根據本發明之經修飾之免疫球蛋白之Fc區，可為該於美國專利案第7,867,491號中所述者，且可參考美國專利案第7,867,491號之說明產生。
根據本發明之一範例，該經修飾之IL-7可具有序列辨識編號：8之胺基酸序列。此外，該經修飾之IL-7可具有與序列辨識編號：8之胺基酸序列90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。
在此使用之術語"基礎緩衝液"意指一種利用其中所含之酸-鹼共軛組份的作用，容忍pH改變之溶液。
如本發明之基礎緩衝液可為組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉溶液。該基礎緩衝液可使用之濃度為10至50mM、15至40mM或20至30mM。根據本發明之範例，其可使用之濃度為20mM。
該組胺酸-醋酸鹽溶液是一種含有組胺酸離子之緩衝液。該組胺酸-醋酸鹽溶液是經由液態醋酸滴定L-組胺酸製得。而該檸檬酸鈉溶液是經由含水檸檬酸滴定檸檬酸鈉溶液，考慮最後濃度以及溶液之pH製得。
糖可穩定本發明之融合蛋白。此外，糖廣泛地用作為藥學調配物之賦形劑，因為其易溶於水中，且具有甜味。
根據本發明之調配物，所包含之糖的濃度可為2.5至5w/v%、3.5至5w/v%或4.5至5w/v%，在本發明之範例中，更具體例地為5w/v%。
在根據本發明之調配物中，該糖可為蔗糖、海藻糖、右旋糖或其等之混合物。在本發明之一範例中，該糖可為蔗糖。蔗糖是葡萄糖以及果糖通過1,2-鍵結形成 之雙糖，其在鹼性環境中相對安定，但在酸中容易水解。
在根據本發明之藥學調配物中，糖具有保護融合蛋白免受氧化應力之作用，而糖醇可用作為糖的替代物或輔助物質。糖醇可為山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甘露醇或其等之混合物。在本發明之一範例中，該糖醇可為山梨糖醇。
在此使用之術語"界面活性劑"是一種界定活化劑，更明確地，其意指非離子性界面活性劑。在根據本發明之藥學調配物中，該界面活性劑會抑制融合蛋白凝集的形成，從而增加該融合蛋白之安定性。
在根據本發明之調配物中，可添加之界面活性劑的濃度為0.05至6w/v%、0.1至5.5w/v%或0.1至5.0w/v%。
該界面活性劑可為聚山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、烷基硫酸酯、聚乙烯吡啶酮、泊洛沙姆(poloxamer)或其等之混合物。明確地，該界面活性劑可為聚山梨糖醇酯或泊洛沙姆。
如本發明之聚山梨糖醇酯是去水山梨醇脂肪酸酯與環氧乙烷結合所形成之聚氧乙烯高級脂族醇，根據聚氧乙烯基團之數目以及脂肪酸之總類，其可為聚山梨糖醇酯20(單月桂酸酯)、40(單棕櫚酸酯)、60(單硬脂酸酯)、65(三硬脂酸酯)或80(單油酸酯)。此外，泊洛沙姆是一種聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，其可隨著聚合物之長度變化。
在本發明之一範例中，該界面活性劑可為聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80或泊洛沙姆188。
如本發明之藥學調配物可另外包含胺基酸，諸如精胺酸、榖胺酸、甘胺酸、組胺酸或其等之混合物等等。該胺基酸是包含來作為使蛋白安定之賦形劑，且可根據蛋白之類型包含不同的胺基酸。該胺基酸可為精胺酸、榖胺酸、甘胺酸或組胺酸，根據本發明之範例，其可為榖胺酸。胺基酸添加之濃度可為40至60mM，根據本發明之範例為50mM。
當使用本發明之藥學調配物作為注射劑時，其可另外包含糖醇，用以調整滲透壓。該糖醇指的是其中糖之羰基基團還原成羥基基團(-OH)之長鏈醇。該糖醇可以濃度達到1至2w/v%之方式添加，且根據本發明之範例，其為1.5w/v%。
用於本發明之糖醇之例子包括山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甘露醇或其等之混合物。根據本發明之範例，該糖醇可為山梨糖醇。山梨糖醇是葡萄糖經由高壓添加以及還原所形成之具有6個羥基基團之糖醇，其亦稱作為D-山梨糖醇或D-葡萄糖醇。
本發明之藥學調配物可具有pH為5.0至6.0，具體地為5.0。假如基礎緩衝液之pH低於5.0，則融合蛋白之構形安定性會減低，而假如pH超過6.0，則取決於特定的組成，融合蛋白可能顯示出凝集的形成。
該調配物可為液態調配物。
本發明人已經製得一種經修飾之IL-7融合蛋白，其中寡肽結合至IL-7之N端，而免疫球蛋白之Fc區結合至IL-7之C端，以及選定一基礎緩衝液以及一賦形劑來製備該融合蛋白的藥學調配物。
首先，檢驗經修飾之IL-7融合蛋白在各種pH條件下依賴於基礎緩衝液之安定性。當使用檸檬酸鈉作為基礎緩衝液時，該融合蛋白之安定性隨著pH增加而增加(表2以及圖2)，但當pH增加時，ζ電位減低以及融合蛋白之凝集形成。當使用組胺酸-醋酸鹽作為基礎緩衝液時，獲得相似的結果，因此先在pH5.0之條件下進行實驗(表3以及圖3)。
此外，為檢驗在融合蛋白對抗如攪拌以及氧化之應力環境上之保護作用，添加糖或糖醇、界面活性劑以及胺基酸作為賦形劑。結果，蔗糖以及山梨糖醇在融合蛋白對抗氧化應力上顯示出保護作用，而界面活性劑如tween 20、Tween 80以及泊洛沙姆188，不管界面活性劑之類型，在融合蛋白對抗攪拌應力上均顯示出保護作用。在進一步使用胺基酸之情況下，觀察到添加精胺酸、榖胺酸、甘胺酸或組胺酸時對本發明之融合蛋白之保護作用，其中榖胺酸顯示出極佳的保護作用(表4以及表5)。
經由以上之方法，選擇在融合蛋白上顯示出保護作用之Tween 80以及蔗糖，然後檢驗所選擇賦型劑之結合的保護作用。結果，當Tween 80與蔗糖混合於組胺酸-醋酸鹽緩衝液中時，在融合蛋白對抗攪拌或氧化應力上顯 示出保護作用。且，當蔗糖、山梨糖醇以及Tween 80混合於組胺酸-醋酸鹽基礎緩衝液中時，在各種應力條件下均觀察到平均約1%之變化，證實此調配物非常的優良(表7、表8與表10)。
用於進行本發明之最佳模型
以下，將透過範例詳細說明本發明。下列範例是用於進一步說明本發明，而不是用於限制其範疇。
範例1：經修飾之介白素-7融合蛋白之製備
製備其中寡肽以及免疫球蛋白Fc區分別結合至N端以及C端之IL-7融合蛋白。使用人IL-7之序列(序列辨識編號：1)作為IL-7，以及使用甲硫胺酸(M)以及甘胺酸(G)之結合序列作為寡肽。Fc區是人IgD之Fc區與人IgG4之Fc區之雜合，其當結合生物活性融合蛋白時，相較於已知之經修飾之免疫球蛋白之Fc區，可大幅地增加於活體內之半衰期。
首先，將編碼具下列胺基酸序列之基因序列插入pAD15表達載體中：M-IL-7-hyFc、G-IL-7-hyFc、MM-IL-7-hyFc、MG-IL-7-hyFc、GM-IL-7-hyFc、GG-IL-7-hyFc、MMM-IL-7-hyFc、GMM-IL-7-hyFc、MGM-IL-7-hyFc、MMG-IL-7-hyFc、GGM-IL-7-hyFc、GMG-IL-7-hyFc、MGG-IL-7-hyFc、GGG-IL-7-hyFc、MMMM-IL-7-hyFc、GMMM-IL-7-hyFc、MGMM-IL-7-hyFc、MMGM-IL-7-hyFc、MMMG-IL-7-hyFc、GGMM-IL-7-hyFc、MGGM-IL-7-hyFc、MMGG-IL-7- hyFc、GMGM-IL-7-hyFc、MGMG-IL-7-hyFc、GMMG-IL-7-hyFc、GGGM-IL-7-hyFc、MGGG-IL-7-hyFc、GMGG-IL-7-hyFc、GGMG-IL-7-hyFc、GGGG-IL-7-hyFc、MMMMM-IL-7-hyFc、GMMMM-IL-7-hyFc、GGMMM-IL-7-hyFc、GGGMM-IL-7-hyFc、GGGGM-IL-7-hyFc、MGMMM-IL-7-hyFc、MGGMM-IL-7-hyFc、MGGGM-IL-7-hyFc、MGGGG-IL-7-hyFc、MMGMM-IL-7-hyFc、MMGGM-IL-7-hyFc、MMGGG-IL-7-hyFc、MMMGM-IL-7-hyFc、MMMGG-IL-7-hyFc、MMMMG-IL-7-hyFc、MGMGM-IL-7-hyFc、GMGMG-IL-7-hyFc、GMMMG-IL-7-hyFc、GGMGM-IL-7-hyFc、GGMMG-IL-7-hyFc、MGGMG-IL-7-hyFc、MGMGG-IL-7-hyFc、GMMGM-IL-7-hyFc、MGMMG-IL-7-hyFc、GMGGM-IL-7-hyFc、MMGMG-IL-7-hyFc、GMMGG-IL-7-hyFc、GMGGG-IL-7-hyFc、GGMGG-IL-7-hyFc、GGGMG-IL-7-hyFc或GGGGG-IL-7-hyFc。為了將融合蛋白基因插入表達載體pAD15中，在該融合蛋白基因序列之5'端形成EcoRI位點以及在hyFc基因序列之3'端形成XbaI位點。表達載體pAD15是從RcCMV骨幹獲得(購自Invitrogen,Carlsbad)。該pAD15含巨細胞病毒(CMV)衍生的啟動子、胎牛生長激素衍生的多(A)序列、兔β球蛋白衍生的gIVS(球蛋白介入序列)(Mol Cell Biol.1988,8：4395)以及其它因子。pAD15載體是透過修飾RcCMV載體(Invitrogen)之各個部分所製 得。首先，用XhoI酵素移除新黴素抗性位點，然後於CMV啟動子區之3'端加上gIVS。此外，於CMV啟動子區之5'端加上小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(GeneBank登錄號：NM 010049)。為了製備框架中IL-7之3'端以及hyFc之5'端間之連結位點，於IL-7編碼序列之3'端以及hyFc編碼序列之5'處生成NheI位點。通過使用各個限制酶位點之次選殖方法，製備最後的表達載體。更多有關製備經修飾之Fc區之資訊，可參考美國專利案第7,867,491號(表示為"雜合(Fc)蛋白")。本範例之hyFc蛋白含有9個在IgD CH1結構域中C端上之胺基酸(90-98)、30個在IgD鉸鏈區中之胺基酸(133-162)、8個在IgD CH2結構域中N端上之胺基酸(SHTQPLGV 163-170)、100個IgG4 CH2結構域上之胺基酸(121-220)以及107個IgG4 CH3結構域上之胺基酸(221-327)。
關於由經修飾之Fc區構成之hyFc蛋白，本發明參考韓國專利公開案第10-0897938號之範例中所述之每種用於製備hFc-2、hFc-3、hFc-4、hFc-5以及hFc-6之方法。本發明範例中所使用之hyFc蛋白，是與韓國專利公開案第10-0897938號中所述之hFc-5相同之雜合蛋白。
在表1中所示之條件下進行PCR。變性、貼合以及延伸，分別地在98℃下進行15秒、在55℃下進行30秒以及在72℃下進行60秒。
Figure 105136023-A0202-12-0016-1
使用電穿孔方法，將以下所製得之表達載體轉染進入CHO DG44細胞(來自Dr.Chasin，Columbia University,U.S.A.)中：M-IL-7-hyFc、G-IL-7-hyFc、MM-IL-7-hyFc、MG-IL-7-hyFc、GM-IL-7-hyFc、GG-IL-7-hyFc、MMM-IL-7-hyFc、GMM-IL-7-hyFc、MGM-IL-7-hyFc、MMG-IL-7-hyFc、GGM-IL-7-hyFc、GMG-IL-7-hyFc、MGG-IL-7-hyFc、GGG-IL-7-hyFc、MMMM-IL-7-hyFc、GMMM-IL-7-hyFc、MGMM-IL-7-hyFc、MMGM-IL-7-hyFc、MMMG-IL-7-hyFc、GGMM-IL-7-hyFc、MGGM-IL-7-hyFc、MMGG-IL-7-hyFc、GMGM-IL-7-hyFc、MGMG-IL-7-hyFc、GMMG-IL-7-hyFc、GGGM-IL-7-hyFc、MGGG-IL-7-hyFc、GMGG-IL-7-hyFc、GGMG-IL-7-hyFc、GGGG-IL-7-hyFc、MMMMM-IL-7-hyFc、GMMMM-IL-7-hyFc、GGMMM-IL-7-hyFc、GGGMM-IL-7-hyFc、GGGGM-IL-7-hyFc、MGMMM-IL-7-hyFc、MGGMM-IL-7-hyFc、MGGGM-IL-7-hyFc、MGGGG-IL-7-hyFc、MMGMM-IL-7-hyFc、MMGGM-IL-7-hyFc、MMGGG-IL-7-hyFc、MMMGM-IL-7-hyFc、MMMGG- IL-7-hyFc、MMMMG-IL-7-hyFc、MGMGM-IL-7-hyFc、GMGMG-IL-7-hyFc、GMMMG-IL-7-hyFc、GGMGM-IL-7-hyFc、GGMMG-IL-7-hyFc、MGGMG-IL-7-hyFc、MGMGG-IL-7-hyFc、GMMGM-IL-7-hyFc、MGMMG-IL-7-hyFc、GMGGM-IL-7-hyFc、MMGMG-IL-7-hyFc、GMMGG-IL-7-hyFc、GMGGG-IL-7-hyFc、GGMGG-IL-7-hyFc、GGGMG-IL-7-hyFc或GGGGG-IL-7-hyFc。48個小時後，使用不含HT之10% dFBS+MEM α培養基進行HT選擇，以及使用HT選定的選殖株進行MTX擴增，以擴大生產率。所獲得的單一細胞在測試其長期穩定性後，用於製備經修飾之IL-7融合蛋白。
範例2：經修飾之IL-7融合蛋白之純化
在獲得含有用範例1之方法製得之經修飾之IL-7融合蛋白之培養溶液之後，進行依照以下表2所示之條件之粒徑篩析(SE)HPLC測量產率。使用TSK-GEL G3000WxL管柱進行SE-HPLC 40分鐘。
首先，用緩衝液將各個經修飾之IL-7融合蛋白之樣本溶液稀釋至濃度1mg/ml。各稀釋液均經1ml針筒以及0.2μm濾器過濾，之後置於插件中。將插件插進小瓶中，保持蓋子關閉。之後，將各測試溶液注入SE-HPLC系統中，數量為20μl。根據波峰值測量純度以及相對產率。
結果，純化出具有高產率以及純度之具有圖1所示之結構之經修飾之IL-7融合蛋白(該經修飾之IL-7融合蛋白之製備以及純化，是根據韓國專利公開案第 10-2015-0082793號進行)。
實驗例1：基礎緩衝液之選擇
1.1.根據熱力學特性之選擇
為建立以上範例2中所純化之經修飾之IL-7融合蛋白之調配物，利用示差掃描量熱法(DSC)方法，檢驗該等融合蛋白於三種緩衝液中之熱力學特性。
首先，使用20mM pH 5.0、5.5或6.0之組胺酸-醋酸鹽緩衝液或檸檬酸鈉緩衝液或pH 8.0之三羥甲基胺基甲烷緩衝液，在4℃下對實施例2中純化的經修飾之IL-7融合蛋白進行透析。
同時，使用具有關於樣本以及對照溶液之體積為0.5147cm3之雙室之Microcal VP-DSC(Northampton,U.S.A.)進行DSC。掃描在1.25℃/min之速度、15℃至110℃之溫度下進行。在測量數值之前，令每個溶液均在真空狀態中攪拌，除去空氣。之後，先測量不含融合蛋白之溶液之標準值，然後以從測量值中減去標準值所判定之值顯示經修飾之IL-7融合蛋白之溫度記錄。
使用與裝置所提供之Origin 7.0軟體包連結在一起之Microcal LLC DSC(Northampton,U.S.A.)顯示結果圖。此外，使用Origin 7.0軟體，從此結果獲得融合蛋白之轉變溫度(Tm)以及焓(△H)。
如圖2所示，在MGM-IL-7-hyFc融合蛋白之情況下，於三種緩衝液之典型的DSC熱分析圖中識別出Tm1以及Tm2，分別為IL-7與hyFc之轉變溫度，以及二個代表經熱展開之融合蛋白結構之波峰。此等結果指出， IL-7與hyFc各因熱能吸收而呈展開之狀態，且其等在結構上是安定的。
一般來說，hyFc是一個用於製備長效蛋白之設計平台，其中雜合了IgD(鉸鏈-CH2)與IgG4(CH2-CH3)，且依各種環境因素具有從IgG4而來之單或雙轉變。然而，本實驗之結果顯示，顯然hyFc具有單轉變峰。
此外，如以下表2所示，當組胺酸-醋酸鹽緩衝液之pH從5.0至6.0時，Tm1與Tm2分別從58.89℃增加至62.92℃以及從66.93℃增加至69.91℃。再者，△H亦跟著Tm增加。此等結果指出，當pH增加時，要展開IL-7以及hyFc之結構，需要更高的溫度以及更高的熱能。即，IL-7與hyFc蛋白之構型安定性可能隨著pH的增加而增加。
即使使用pH5.0、5.5或6.0之檸檬酸鈉作為基礎緩衝液，Tm1以及Tm2亦隨著pH的增加而增加，此結果與使用組胺酸-醋酸鹽所獲得之結果一致。應注意，當pH從5.0增至6.0時，Tm1以及Tm2分別從57.23℃增至65.12℃以及從66.74℃增至71.34℃。
在使用檸檬酸鈉作為基礎緩衝液時之△H值方面，當pH為5.0時，Tm1以及Tm2之△H值是最低的。此結果指出，基礎緩衝液用於安定地保持融合蛋白之結構之合適的pH是5.5或6.0。
當使用pH8.0之三羥甲基胺基甲烷緩衝液時，Tm1、Tm2以及Tm1之△H值高於該等以其它緩衝液獲得之值。此結果與之前顯示經修飾之IL-7融合蛋白之構型 安定性隨著pH的增加而增加之結果一致。在高pH之三羥甲基胺基甲烷緩衝液之情況下，Tm2值相較於其它pH為6.0之緩衝液增加，但Tm2之△H值減少，指出其對IL-7之構型安定性的影響高於對hyFc之安定性。
Figure 105136023-A0202-12-0020-3
1.2.透過動態光散射(DLS)分析之選擇
進行DLS分析，以便評估蛋白間之靜電交互反應，以及Z平均尺寸、多分散指數(PDI)以及ζ電位，以及pH與緩衝液在凝集形成上之作用。使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments,UK)測量蛋白之粒徑以及ζ電位。
Z平均尺寸指的是諸如片段、單體以及凝集物之元素的平均值，其對很小的變化如小型凝集部分的出現很敏感。假如測量的PDI值低於0.05，則顯示為單分散標準，而假如該值大於0.7，則其指出樣本具有寬的尺寸分佈。ζ電位是繞著流體動力學表面的蛋白質之電排斥。假如ζ電位之絕對值高，則蛋白在溶液中較不會凝集以及不安定。
首先，在DLS分析方面，使經修飾之IL-7融合蛋白樣本在10℃之測量溫度下平衡。使用1ml之樣本， 在一次性定徑比色杯中測量粒徑5次，以及在角度設定到90°之一次性毛細管樣品池中測量ζ電位3次。使用裝置提供之Zetasizer軟體版本7.11(Malvern Instruments,UK)計算波峰之強度、平均粒徑、PDI以及ζ電位。
當使用pH5.0之組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉，或pH8.0之三羥甲基胺基甲烷作為基礎緩衝液時，以蛋白波峰之強度表示之蛋白大小分佈示於圖3中。三種緩衝液於不同pH條件下之Z平均尺寸、PDI以及ζ電位示於表3中。
如圖3所示，當使用pH5.0之組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉作為基礎緩衝液時，結果圖表在5個連續測量值中顯示單一窄波峰。同時，當使用pH8.0之三羥甲基胺基甲烷時，識別到一新波峰，表示在100至1,000nm處有凝集物。
如表3所示，使用組胺酸-醋酸鹽作為基礎緩衝液時，當pH從5.0增加至6.0時，出現新的凝集，且Z平均尺寸以及PDI分別從10.43nm增加至10.64nm以及從0.02增加至0.07。此外，當pH增加時，ζ電位之絕對值從4.42減少至1.28。
當使用檸檬酸鈉作為基礎緩衝液時，亦觀察到以上所述之根據pH改變之凝集現象：即，在檸檬酸鈉基礎緩衝液中，Z平均尺寸以及PDI增加，而ζ電位減少。
然而，在三羥甲基胺基甲烷基礎緩衝液中之Z平均尺寸以及PDI，相較於在其它緩衝液中之值，分別大 幅地增加至12.38nm以及0.34。此外，在三羥甲基胺基甲烷基礎緩衝液中發生蛋白凝集。而且，即使凝集發生，但在三羥甲基胺基甲烷緩衝液中之ζ電位的絕對值仍為20.27，其高於該等於其它緩衝液中之值。
因此，為了降低本發明之經修飾之IL-7融合蛋白之凝集，組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉可為適合的基礎緩衝液，較佳地在具低ζ電位之pH條件下。在高pH條件下，該緩衝液可結合使用蛋白凝集抑制劑。
Figure 105136023-A0202-12-0022-4
實驗例2：賦形劑之選擇
2.1.根據在應力條件下之保護作用之選擇
為了檢驗賦形劑對抗應力環境如攪拌以及氧化之保護作用，對包括濃度5w/v%之界面活性劑、濃度5w/v%之糖以及濃度50mM之胺基酸之各種不同的賦形劑進行粒徑排阻層析。在對照組中，於基礎緩衝液中僅添加經修飾之IL-7融合蛋白。在基礎緩衝液方面，使用pH5.0之組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉基礎緩衝液。
更具體地，使用於pH5.0之組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉基礎緩衝液中添加各種類型之賦形劑所製得之溶 液，在4℃下對該經修飾之IL-7融合蛋白進行透析。在攪拌應力環境方面，將0.5ml經過透析之經修飾之IL-7融合蛋白放進微管中，之後將其放進盒中以及使用Vortex-Genie 2(Scientific Industries,Inc.,U.S.A.)，在室溫、強度7下攪拌2個小時。
同時，在氧化應力環境方面，於0.5ml經透析之MGM-IL-7-hyFc融合蛋白中添加過氧化氫至最後濃度為1.0%(v/v)，然後貯存在室溫下20個小時。使用高效液相色層分析(HPLC)系統(Waters e2695,U.S.A.)，在吸收光譜之UV波長214nm下進行粒徑排阻層析。
<HPLC條件>
管柱：TSKgel G3000SWXL SEC管柱(300×7.8mm)(TOSOH Bioscience,U.S.A.)
移動相：含100mM NaCl以及10%乙腈，配製於50mM磷酸鈉中(pH 6.8)之溶液
流速：0.5ml/min
結果，觀察到許多元素，包括水溶性凝集物、單體以及片段，且利用數學方程式1計算各元素之含量。
[方程式1]特定元素之含量%=Ct/Cs×100
在此，Ct意指各元素之面積(水溶性凝集物、單體以及片段)，而Cs意指獲得樣本時元素之波峰的總合。
結果如表4以及5所示，檸檬酸鈉對照組中之 單體含量為96.34%，其因攪拌減少至78.18%，而因氧化減少至48.16%。
發現於組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉中添加諸如Tween或泊洛沙姆之廣為人知的非離子性界面活性劑，可保護MGM-IL-7-hyFc融合蛋白免受攪拌應力之影響。此非離子性界面活性劑具有保護蛋白免於在疏水性界面展開之極佳作用。當於緩衝液中添入Twin 20、Twin 80或泊洛沙姆188時，單體含量不會顯著地減少。然而，此等界面活性劑之保護作用實質上是相似的，表明該等界面活性劑在因攪拌而持續改變之疏水性環境下會保護本發明之融合蛋白。
同時，該等界面活性劑在MGM-IL-7-hyFc融合蛋白對抗氧化應力上，沒有顯示出任何保護作用，反而比對照組引起更多的單體含量減少。此外，Twin 20以及Twin 80已知會氧化蛋白。泊洛沙姆188與Twin 20以及Twin 80之作用一樣，亦會使得本發明之融合蛋白在氧化條件下不安定。
糖或糖醇如蔗糖與山梨糖醇常用作為用於使MGM-IL-7-hyFc融合蛋白安定之藥學賦形劑。然而，蔗糖以及山梨糖醇會引起比對照組低的單體含量，此表明其等在本發明之融合蛋白對抗攪拌應力方面，沒有保護作用。
在檸檬酸鈉緩衝液中攪拌後，以沒有曝露於應力下之參考值為基準，對照組中之單體含量減少 18.16%，而添加蔗糖以及山梨糖醇之單體含量分別減少39.29%以及53.51%。同時，在組胺酸-醋酸鹽緩衝液中攪拌後，以沒有曝露於應力下之參考值為基準，對照組中之單體含量減少2.23%，而添加蔗糖以及山梨糖醇之單體含量分別減少11.53%以及13.77%。
已知於調配物中添加糖與糖醇，會刺激攪拌期間IgG凝集的形成。當於調配物中添加蔗糖或山梨糖醇時，無論基礎緩衝液之類型為何，在攪拌期間凝集之形成均增加，其導致MGM-IL-7-hyFc融合蛋白之安定性降低。
同時，蔗糖以及山梨糖醇會增加融合蛋白在氧化應力下之安定性。在檸檬酸鈉緩衝液中，以沒有曝露於應力下之參考值為基準，對照組中之單體含量減少48.18%，而添加蔗糖以及山梨糖醇之單體含量分別減少2.55%以及2.79%。相似地，在組胺酸-醋酸鹽緩衝中，以沒有曝露於應力下之參考值為基準，對照組中之單體含量減少35.36%，而添加蔗糖以及山梨糖醇之單體含量分別減少1.68%以及1.47%。此結果表明，蔗糖以及山梨糖醇具有使蛋白免於氧化之保護作用。據報導，此二種物質能夠藉由優先從蛋白之表面排除而安定蛋白。
其次，關於胺基酸對MGM-IL-7-hyFc融合蛋白於應力條件下之安定性的作用，當於檸檬酸鈉緩衝液中分別加入50mM精胺酸、榖胺酸、甘胺酸以及組胺酸時，對抗攪拌之保護作用非常低。以沒有曝露於應力下之參考值為基準，對照組中之單體含量減少18.16%，而當分別添加精胺酸、榖胺酸、甘胺酸以及組胺酸時，單體含量減少 49.71%、64.75%、30.96%以及46.75%。同時，發現當使用組胺酸-醋酸鹽緩衝液時，精胺酸以及榖胺酸會使得本發明之融合蛋白不安定。
同時，當於組胺酸-醋酸鹽緩衝液中添加甘胺酸時，相較於沒有曝露於應力下之參考值，MGM-IL-7-hyFc融合蛋白之單體含量沒有減少。結果與從檸檬酸鈉緩衝液所得之結果相矛盾，表明MGM-IL-7-hyFc融合蛋白之安定性可以根據環境因子，包括緩衝液以及賦型劑，而變化。
此外，當於檸檬酸鈉緩衝液中分別添加精胺酸以及甘胺酸時，觀察到對抗氧化應力之保護作用，但在添加至組胺酸-醋酸鹽緩衝液中時沒有觀察到此作用。然而，在氧化應力方面，當於檸檬酸鈉緩衝液中分別添加精胺酸以及甘胺酸時，以沒有曝露於應力下之參考值為基準，該等樣本顯示單體含量分別減少30.66%以及3.21%，此小於對照組(減少48.18%)。同時，當於組胺酸-醋酸鹽緩衝液中添加精胺酸以及甘胺酸時，以沒有曝露於應力下之參考值為基準，相較於對照組(減少35.36%)，單體含量顯著地減少39.34%以及37.90%。特別是，在二種緩衝液中，添加甘胺酸在本發明之融合蛋白對抗攪拌以及氧化應力上，視緩衝液之類型顯示保護作用，而添加榖胺酸在融合蛋白對抗氧化應力上產生極佳的保護作用。
Figure 105136023-A0202-12-0027-7
Figure 105136023-A0202-12-0027-6
2.2.利用DLS分析之選擇
為檢驗各種賦形劑，包括界面活性劑、糖以及胺基酸，對經修飾之IL-7融合蛋白之安定性之作用，以實驗例1.2中所述之方法進行DLS分析。分別進行粒徑以及 ζ電位之測量三次。
MGM-IL-7-hyFc融合蛋白於pH5.0檸檬酸鈉緩衝液中，曝露於攪拌以及氧化應力下之Z平均尺寸示於圖4以及表6中。
Figure 105136023-A0202-12-0028-8
如圖4a所示，對照組進行三次粒徑測量之結果僅顯示出單一窄峰。然而，曝露於攪拌應力下之攪拌對照組在100nm大小處顯示出另一波峰。在此對照組中，Z平均尺寸從11.29nm增加至19.40nm，而PDI亦從0.07增加至0.19，表明發生凝集。同時，當添加Twin 20、Twin 80以及泊洛沙姆188時，Z平均尺寸分別增加0.16、0.09、0.31nm，而PDI分別增加0.04、0.04以及0.06。Z平均尺寸以及PDI之增加，暗示攪拌引起凝集。添加界面活性劑觀察到小量增加，表明界面活性劑具有防止凝集形成之蛋白保護作用。如圖4b所示，當添加界面活性劑時，沒有觀察到凝集波峰。
曝露於氧化應力下之氧化對照組在1,000nm大小處顯示出一額外波峰，同時Z平均尺寸以及PDI分別從11.29nm增加至177.10nm以及從0.07增加至0.85nm。此結果表明氧化形成凝集，且所形成之凝集大於攪拌所形成之凝集。如圖4c所示，分別添加蔗糖、山梨糖醇以及甘胺酸時，亦觀察到凝集波峰，但添加榖胺酸時，沒有凝集形成。在榖胺酸添加樣本之情況下，Z平均尺寸增加0.17nm以及PDI沒有變化。此結果表明，當於pH5.0檸檬酸鈉中添加榖胺酸時，其在MGM-IL-7-hyFc融合蛋白對抗氧化應力上顯示出極佳的保護作用。同時，當添加蔗糖、山梨糖醇以及甘胺酸時，Z平均尺寸分別增加1.27nm、2.22nm以及39.06nm，而PDI分別增加0.11、0.18以及0.45，當與其中加入其它賦形劑的樣本相比時，其被認為是小的。此結果表明，蔗糖、山梨糖醇以及甘胺酸在本發明之融合蛋白對抗氧化應力上具有保護作用，此與實驗例2.1之結果一致。
同時，MGM-IL-7-hyFc融合蛋白於pH5.0組胺酸-醋酸鹽緩衝液中，曝露於攪拌以及氧化應力下之Z平均尺寸示於圖5以及表7中。
Figure 105136023-A0202-12-0029-9
Figure 105136023-A0202-12-0030-10
如5a所示，對照組以及攪拌對照組顯示單一窄波峰，此與用檸檬酸鈉緩衝液之攪拌對照組之結果不同。然而，如圖5b所示，當添加甘胺酸時，觀察到凝集波峰，但當添加諸如Twin 20、Twin 80以及泊洛沙姆188之界面活性劑時，沒有觀察到凝集波峰，且Z平均尺寸以及PDI沒有變化。此結果表明，當於MGM-IL-7-hyFc融合蛋白調配物中添加甘胺酸時，攪拌會發生凝集的形成。
如圖5c所示，當添加蔗糖時，氧化引起Z平均尺寸以及PDI分別從11.21nm增加至12.47nm以及從0.17增加至0.22。二者之變化均小於對照組，表明蔗糖具有防止氧化應力之蛋白保護作用，但會引起凝集形成之問題。同時，當添加山梨糖醇時，Z平均尺寸以及PDI分別從12.02nm減少至11.61nm以及從0.13減少至0.09，且沒有發現凝集波峰。Z平均尺寸以及PDI之減少意味著片段增加，即使不顯著。當添加榖胺酸時，Z平均尺寸以及PDI稍微增加，而沒有發現凝集或片段。
因此，發現界面活性劑如Twin 20、Twin 80以及泊洛沙姆188在本發明之融合蛋白對抗氧化或攪拌應力上具有保護作用；糖或糖醇如蔗糖以及山梨糖醇展現出抗氧化應力之保護作用；以及胺基酸視基礎緩衝液而顯示 出不同的作用，但總體而言，榖胺酸顯示出高保護作用。
實驗例3：賦形劑之組合
根據實驗例2之結果，選擇Tween 80以及蔗糖，因為該等賦形劑在經修飾之IL-7融合蛋白對抗攪拌以及氧化應力上分別地顯示出保護作用。針對此等二種賦型劑之組合之實驗，使用Design of Experiment軟體(Design-Expert,Stat-Ease Inc.,U.S.A.)。以表8中所之方式組合二種賦型劑，然後檢測其等在經修飾之IL-7融合蛋白之安定性上之作用。本實驗例之應力條件與實驗例2.1的相同，且將經修飾之IL-7融合蛋白在調配物中之最後濃度從3調整至100g/ml。
Figure 105136023-A0202-12-0031-11
為檢驗抗應力條件之保護作用，在與實驗例2.1相同之HPLC條件下進行粒徑排阻層析[使用高效液相色層分析(HPLC)系統(Waters e2695,U.S.A.)，在吸收光譜之UV波長214nm下]。
首先，先進行包含濃度3mg/ml之經修飾之IL-7融合蛋白的調配物之實驗。結果如表9中所示，用檸檬酸鈉之對照組顯示單體含量為95.65%，其在攪拌下減少 至74.77%，而在氧化下減少至49.81%。添加Tween 80之樣本顯示出抗攪拌應力之保護作用，而添加蔗糖之樣本顯示出抗氧化應力之保護作用。添加Tween 80與蔗糖之組合之樣本，顯示出抗攪拌應力以及氧化應力之保護作用。
Figure 105136023-A0202-12-0032-12
同時，如表10中所示，用組胺酸-醋酸鹽緩衝液之對照組顯示出單體含量為95.46%，其在攪拌下減少至93.60%，而在氧化下減少至50.63%。與檸檬酸鈉緩衝液相比，組胺酸-醋酸鹽緩衝液顯示更佳的抗攪拌應力之保護作用，以及添加賦型劑之保護作用，與檸檬酸鈉之樣本中的相似。
Figure 105136023-A0202-12-0033-13
根據結果選擇賦型劑之條件。為取得適當的注射液之滲透強度，進一步添加山梨糖醇以及甘露醇，然後進行攪拌應力以及氧化應力實驗，亦進行在添加1.5w/v%山梨糖醇條件下之額外實驗。
於MGM-IL-7-hyFc融合蛋白之調配物中添加5w/v%蔗糖、1.5w/v%山梨糖醇以及0.05w/v% Tween 80，作為檸檬酸鈉緩衝液和組胺酸-醋酸鹽緩衝液各自的候選調配物。使用以上之調配物，進行冷凍/解凍、溫度應力以及氧化應力實驗。應力條件示於表11中，而分析結果示於表12中。
Figure 105136023-A0202-12-0033-14
Figure 105136023-A0202-12-0034-15
根據使用候選調配物之結果，如表12中所示，在使用檸檬酸鈉緩衝液之情況下，對照組顯示出單體含量為95.76%，而在應力下觀察到約3%的變化。
在使用組胺酸-醋酸鹽緩衝液之情況下，對照組顯示單體含量為95.59%，而在應力下觀察到約1%的變，顯示出比檸檬酸鈉緩衝液稍佳的保護作用。
檢驗該候選調配物在不同濃度的經修飾之IL-7融合蛋白上之作用。首先，製備包含3至100mg/ml之經修飾之IL-7融合蛋白、20mM之檸檬酸鈉以及5w/v%之蔗糖之調配物。然後，於其中添加1至2w/v%之山梨糖醇或甘露醇作為糖醇，以及0.05w/v%之Tween 80或泊洛沙姆作為界面活性，以及將最後的pH調整至5.0。結果顯示出，3至100mg/ml之經修飾之IL-7融合蛋白在各種組合條件下均得到良好的保護。
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<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL-7之胺基酸序列(登錄號：P13232)
<400> 1
Figure 105136023-A0202-12-0035-16
<210> 2
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠IL-7之胺基酸序列(登錄號：P56478)
<400> 2
Figure 105136023-A0202-12-0036-17
<210> 3
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL-7之胺基酸序列(登錄號：P10168)
<400> 3
Figure 105136023-A0202-12-0036-19
Figure 105136023-A0202-12-0037-20
<210> 4
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子IL-7之胺基酸序列(登錄號：NP_001279008)
<400> 4
Figure 105136023-A0202-12-0037-21
<210> 5
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 牛IL-7之胺基酸序列(登錄號：P26895)
<400> 5
Figure 105136023-A0202-12-0037-23
Figure 105136023-A0202-12-0038-24
<210> 6
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 綿羊IL-7之胺基酸序列(登錄號：Q28540)
<400> 6
Figure 105136023-A0202-12-0038-25
<210> 7
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hyFc之胺基酸序列
<400> 7
Figure 105136023-A0202-12-0039-26
<210> 8
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾之IL-7(MGM)融合hyFc之胺基酸序列
<400> 8
Figure 105136023-A0202-12-0040-27
Figure 105136023-A0202-12-0041-28
<210> 9
<211> 4
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 9
Figure 105136023-A0202-12-0041-29
<210> 10
<211> 4
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 10
Figure 105136023-A0202-12-0041-30
<210> 11
<211> 4
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 11
Figure 105136023-A0202-12-0041-31
<210> 12
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 12
Figure 105136023-A0202-12-0041-32
<210> 13
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 13
Figure 105136023-A0202-12-0042-33
<210> 14
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 14
Figure 105136023-A0202-12-0042-34
<210> 15
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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Figure 105136023-A0202-12-0042-35
<210> 16
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 16
Figure 105136023-A0202-12-0042-36
<210> 17
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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Figure 105136023-A0202-12-0042-37
<210> 18
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 18
Figure 105136023-A0202-12-0043-38
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 19
Figure 105136023-A0202-12-0043-39
<210> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 20
Figure 105136023-A0202-12-0043-40
<210> 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 21
Figure 105136023-A0202-12-0043-41
<210> 22
<211> 4
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 22
Figure 105136023-A0202-12-0043-42
<210> 23
<211> 4
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 23
Figure 105136023-A0202-12-0044-43
<210> 24
<211> 4
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 24
Figure 105136023-A0202-12-0044-44
<210> 25
<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 25
Figure 105136023-A0202-12-0044-45
<210> 26
<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 26
Figure 105136023-A0202-12-0044-46
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 27
Figure 105136023-A0202-12-0044-47
<210> 28
<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 28
Figure 105136023-A0202-12-0045-48
<210> 29
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 29
Figure 105136023-A0202-12-0045-49
<210> 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
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Figure 105136023-A0202-12-0045-50
<210> 31
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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Figure 105136023-A0202-12-0045-51
<210> 32
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
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Figure 105136023-A0202-12-0045-52
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 33
Figure 105136023-A0202-12-0046-53
<210> 34
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 34
Figure 105136023-A0202-12-0046-54
<210> 35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 35
Figure 105136023-A0202-12-0046-55
<210> 36
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 37
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 38
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<213> 人工序列
<220>
<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 39
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 41
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 42
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 44
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 45
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 46
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 48
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<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 48
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<210> 49
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 50
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 51
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 52
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
<400> 52
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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<210> 54
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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Figure 105136023-A0202-12-0050-74
<210> 55
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<213> 人工序列
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<223> 結合IL-7之寡肽
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Figure 105136023-A0202-12-0050-76

Claims (14)

  1. 一種藥學調配物，其包含：(a)經修飾之IL-7融合蛋白；(b)濃度為10至50mM之基礎緩衝液(basal buffer)；(c)濃度為2.5至5w/v%之糖；以及(d)濃度為0.05至6w/v%之界面活性劑，其中該經修飾之IL-7融合蛋白包含一含1至10個選自M以及G之胺基酸之寡肽；IL-7；以及一免疫球蛋白之Fc區，其中該寡肽結合至IL-7之N端，以及其中該免疫球蛋白之Fc區結合至IL-7之C端。
  2. 如請求項1之藥學調配物，其中該寡肽係擇自於由下列所構成之群組：M、G、MM、MG、GM、GG、MMM、GMM、MGM、MMG、GGM、GMG、MGG、GGG、MMMM(序列辨識編號：9)、GMMM(序列辨識編號：10)、MGMM(序列辨識編號：11)、MMGM(序列辨識編號：12)、MMMG(序列辨識編號：13)、GGMM(序列辨識編號：14)、MGGM(序列辨識編號：15)、MMGG(序列辨識編號：16)、GMGM(序列辨識編號：17)、MGMG(序列辨識編號：18)、GMMG(序列辨識編號：19)、GGGM(序列辨識編號：20)、MGGG(序列辨識編號：21)、GMGG(序列辨識編號：22)、GGMG(序列辨識編號：23)、GGGG(序列辨識編號：24)、MMMMM(序列辨識編號：25)、GMMMM(序列辨識編號：26)、GGMMM(序列辨識編 號：27)、GGGMM(序列辨識編號：28)、GGGGM(序列辨識編號：29)、MGMMM(序列辨識編號：30)、MGGMM(序列辨識編號：31)、MGGGM(序列辨識編號：32)、MGGGG(序列辨識編號：33)、MMGMM(序列辨識編號：34)、MMGGM(序列辨識編號：35)、MMGGG(序列辨識編號：36)、MMMGM(序列辨識編號：37)、MMMGG(序列辨識編號：38)、MMMMG(序列辨識編號：39)、MGGGM(序列辨識編號：40)、MGMGM(序列辨識編號：41)、GMGMG(序列辨識編號：42)、GMMMG(序列辨識編號：43)、GGMGM(序列辨識編號：44)、GGMMG(序列辨識編號：45)、MGGMG(序列辨識編號：46)、MGMGG(序列辨識編號：47)、GMMGM(序列辨識編號：48)、MGMMG(序列辨識編號：49)、GMGGM(序列辨識編號：50)、MMGMG(序列辨識編號：51)、GMMGG(序列辨識編號：52)、GMGGG(序列辨識編號：53)、GGMGG(序列辨識編號：54)、GGGMG(序列辨識編號：55)以及GGGGG(序列辨識編號：56)。
  3. 如請求項1之藥學調配物，其中該IL-7是具有序列辨識編號：1至6中任一個之胺基酸序列之多肽。
  4. 如請求項1之藥學調配物，其中該免疫球蛋白之Fc區具有序列辨識編號：7之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之藥學調配物，其中該基礎緩衝液是組胺酸-醋酸鹽或檸檬酸鈉。
  6. 如請求項1之藥學調配物，其中該糖係擇自於由下列所構成之群組：蔗糖、海藻糖、右旋糖以及其等之混合物。
  7. 如請求項1之藥學調配物，其中該界面活性劑係擇自於由下列所構成之群組：聚山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、烷基硫酸酯、聚乙烯吡啶酮、泊洛沙姆(poloxamer)以及其等之混合物。
  8. 如請求項1之藥學調配物，其另外包含任一個擇自於由下列所構成之群組之胺基酸：精胺酸、榖胺酸(glutamate)、甘胺酸、組胺酸以及其等之混合物。
  9. 如請求項8之藥學調配物，其中該胺基酸之濃度範圍從40至60mM。
  10. 如請求項9之藥學調配物，其中該胺基酸之濃度為50mM。
  11. 如請求項1之藥學調配物，其另外包含1至2w/v%之糖醇。
  12. 如請求項11之藥學調配物，其中該糖醇係擇自於由下列所構成之群組：山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甘露醇以及其等之混合物。
  13. 如請求項1之藥學調配物，其中該調配物之pH為5.0。
  14. 如請求項1之藥學調配物，其中該調配物是液態調配物。
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