KR20230128033A - 가용성 gp130 이량체를 포함하는 제제 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 2개의 단일 사슬 gp130-Fc융합 단백질의 이량체, 히스티틴염, 트레할로스 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수성 제제를 제공한다. 상기 수성 제제는 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

가용성 gp130 이량체를 포함하는 제제 및 사용 방법

본 발명은 바이오 의약품 연구 분야에 속하고, 구체적으로 gp130 이량체를 포함하는 제제 및 염증성 질병 및 암을 포함하는 다양한 IL-6에 의해 매개되는 병증을 치료하기 위한 용도에 관한 것이다.

당단백질 130(gp130, IL6ST, IL6-beta 또는 CD130으로도 칭함)은 막관통 단백질이다. 이는 IL-6 수용체 계열에서 I형 사이토카인 수용체의 하나의 서브 유닛을 형성한다. 이는 사이토카인 참여 후의 신호 전달에 매우 중요하다. 구조적으로, gp130은 그 세포 외 부분에서 5개의 피브로넥틴 III형 도메인 및 하나의 면역글로불린 유사 C2형 도메인으로 이루어진다.

IL-6 수용체 패밀리의 구성원은 모두 gp130과 복합체를 형성하여 신호 전달을 한다. 예를 들어, IL-6은 IL-6 수용체에 결합한다. 그 후, 이 두 가지 단백질의 복합체는 gp130에 결합된다. 그 후, 세 가지 단백질로 이루어된 복합체는 모두 이량체화되어, 다운스트림 신호를 생성할 수 있는 육량체 복합체를 형성한다.

IL-6은 예를 들어 감염 및 조직 손상에 응답하는 조혈 세포 및 비조혈 세포에서 생성되는 다면발현성 사이토카인이다. IL-6은 주로 간세포 및 일부 백혈구에 존재하는 막결합 IL-6R을 통한 소위 전형적인 리간드-수용체 경로, 및 막결합 IL-6R에서 유래된 단백질 가수 분해 절단 또는 선택성 스플라이싱으로부터 유래된 순환 sIL-6R(soluble IL-6R 또는 가용성 IL-6R로 칭함)의 트랜스 신호 전달 경로(트랜스 신호 경로)와 같은 두가지 주요 신호 전달 경로를 통해 다중 생물학적 활성을 발휘한다.

전형적인 경로에서, IL-6은 제한된 범위의 세포 유형 표면 상의 막결합 IL-6R에 직접 결합된다. IL-6/IL-6R 복합체는 신도 전달성 gp130 수용체 단백질의 미리 형성된 이량체와 결합하여, gp130 동형 이량체의 공간적 변화를 일으키고, 이로써 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 유발한다. 전형적인 신호 전달은 장 상피 세포의 성장 및 재생 신호와 같은 급성 염증 방어 매커니즘과 관건적인 생리학적 IL-6 기능을 담당한다. IL-6R 및 gp130의 세포 외 도메인은 선택적으로 스플라이싱된 mRNA를 번역하여 생성될 수 있고, 막 고정 도메이 없어 sIL-6R 및 gp130 변이체를 생성한다.

IL-6/sIL-6R 복합체의 활성은 일반적으로 순환 중에 존재하는 높은 수준의 가용성 sgpl30(soluble gp130)에 의해 제어되고, 이는 막결합된 gp130와 효과적으로 경쟁한다. 본 발명 중의 gp130 이량체는 천연 sgpl30에 비해 더욱 높은 결합 친화력을 가지기에 IL-6 신호 전달 억제 능력이 더욱 강하다. 본 발명의 제제는 상기 gp130 이량체가 생산, 운송 및 응용에서 더욱 안정적이도록 할 수 있다.

종래 기술에 존재하는 문제점을 극복하기 위해, 본 발명은 gp130 이량체(또는“gp130을 포함하는 융합 단백질” 또는 “융합 단백질”로 약칭)를 포함하는 제제, 및 염증성 질병 및 암을 포함한 다양한 IL-6에 의해 매개되는 병증을 치료하기 위한 용도를 설명하였다. 상기 제제는 하나의 히스티틴염 완충계를 포함하고, pH 7.6 정도이며, 매우 높은 안정성을 가지고, 안전하게 다양한 조제량으로 인간에 투여될 수 있다.

하나의 실시 형태에 있어서, 본 명세서에서 수성 제제(액체 제제로도 칭함) 및 동결 건조 제제를 설명하였고, 융합 단백질, 20-30 mM의 히스티틴염, 220-280 mM의 트레할로스 및 0.01(w/v)%-0.03(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하며, pH는 7.0-8.2이고, 상기 융합 단백질은 2개의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1인 단량체를 포함하며, 복수의 이황화결합으로 서로 연결된다. 일부 실시 형태에 있어서, 수성 제제는 적어도 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL 또는 적어도 30 mg/mL의 상기 융합 단백질을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제의 pH는 7.4-7.8이다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제의 pH는 7.6이다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 24-26 mM의 히스티틴염을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 25 mM의 히스티틴염을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 240-260 mM의 트레할로스를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 250 mM의 트레할로스를 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 0.015(w/v)%-0.025(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 등장화제(tonicity agent)(또는 삼투압 조절제 또는 안정제로 칭함), 계면활성제, 항산화제, 방부제 또는 이의 혼합물을 더 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 각각의 융합 단백질 분자는 6개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 각각의 융합 단백질 분자는 3개, 2개 또는 1개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스를 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 52%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 54%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 52-65%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다.

하나의 바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 25 mg/mL의 상기 융합 단백질, 24-26 mM의 히스티틴염, 240-260 mM의 트레할로스 및 0.015(w/v)%-0.025(w/v)%의 폴리소르베이트 80를 포함하고, pH는 7.6-7.8이다.

하나의 바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 30 mg/mL의 상기 융합 단백질, 25 mM의 히스티틴염, 250 mM의 트레할로스 및 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH는 7.6이다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 10 mM보다 높은(또는 5 mM, 2 mM, 1 mM, 0.1 mM 또는0.01 mM보다 높은) 히스티틴염을 제외한 다른 아미노산염을 포함하지 않거나, 바람직하게는, 다른 임의의 아미노산염을 전혀 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 10 mM보다 높은(또는 5 mM, 2 mM, 1 mM, 0.1 mM 또는0.01 mM보다 높은) 트레할로스를 제외한 다른 당을 포함하지 않거나 또는, 바람직하게는, 다른 임의의 당을 전혀 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 인간의 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증을 치료하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에 있어서, 여기서 상기 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 염증성 장질환이고, 바람직하게는 여기서 상기 치료는 염증성 장질환의 완화를 유도한다. 일부 실시 형태에 있어서, 여기서 상기 염증성 장질환은 크론병 또는 궤양성 대장염이고, 바람직하게는 여기서 상기 치료는 염증성 장질환의 완화를 유지한다. 일부 실시 형태에 있어서, 여기서 상기 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 류마티스 관절염, 건선, 포도막염 또는 죽상동맥경화증이다. 일부 실시 형태에 있어서, 여기서 상기 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 염증성 장질환에 무관한 결장염이고, 바람직하게는 여기서 상기 결장염은 방사성 결장염, 게실 결장염, 허혈성 결장염, 감염성 결장염, 셀리악병, 자가면역성 결장염 또는 결장에 영향을 미치는 알레르기로 인한 결장염이다.

본 명세서에서 건조 제제를 더 설명하였고, 이는 본 명세서에 기재된 임의의 수성 제제를 동결 건조하여 얻을 수 있거나, 물을 첨가한 후 본 명세서에 기재된 임의의 수성 제제를 생성할 수 있다.

도 1은 pH/완충계 스크리닝 DSC 결과이다.
도 2는 pH/완충계 스크리닝 HT-DLS 결과이다.
도 3은 보조재 및 계면활성제 스크리닝 DSC 결과이다.
도 4는 다양한 배합의 동결 건조품의 외관이다.

정의

모든 숫자 번호(예를 들어 범위를 포함하는 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량)는 모두 0.1 또는 10%의 증가량 ⑴ 또는 (-) 변화의 근사치이다. 항상 명확하게 설명되지는 않지만 모든 숫자 번호의 앞에 모두 용어 “약”이 기재되는 것을 이해해야 한다. 항상 명확하게 설명되지는 않지만 본 명세서에 기재된 시약은 예시적인 것에 불과하고 그 등가물은 본 분야에 공지된 것임을 이해해야 한다.

용어 “단백질” 및 “폴리펩티드”는 서로 교환하여 사용할 수 있고, 가장 광번위한 의미로 2개 이상의 서브 유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드 모사체의 화합물을 지칭한다. 상기 서브 유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시 방안에 있어서, 상기 서브 유닛은 에스테르, 에테르 등과 같은 다른 결합에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 반드시 포함해야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 최대 아미노산 수에 대해서는 한정하지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “아미노산”은 글리신, D 및 L광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티드 모사체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다. 자연적으로 존재하는 아미노산의 단일 자모와 세 자모의 약어는 이하에 열거된다.

“조성물”은 활성제 및 다른 불활성(예를 들어, 검출 가능한 시약 또는 표지) 또는 활성 화합물 또는 조성물(예컨대 보조제)의 조합을 의미한다. “약물 조성물”은 활성제와 불활성 또는 활성 담체의 조합을 포함하여, 체외, 체내 또는 시험관 내 진단 또는 치료 용도에 적용되는 조성물을 생성하는 것을 의미한다.

“수성 제제”는 물을 용매로 하는 액체 제제를 의미한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 수성 제제는 동결 건조, 분무 건조 및/또는 동결이 필요없이 안정성(예를 들어 화학적 및/또는 물리적 안정성 및/또는 생물학적 활성)이 유지되는 제제이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “완충액”은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 나타내고, 이는 약물 제제의 pH를 안정시킨다. 적합한 완충액은 본 분야에 잘 알려져 있고 문헌에서 찾아볼 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 완충액은 트리스 완충액, 아르기닌 완충액, 히스티딘 완충액, 구연산염 완충액, 숙신산염 완충액 및 인산염 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. pH는 사용되는 완충액과 무관하게, 숙신산, 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 구연산, 숙신산염, 구연산염, 트리스 염기, 히스티딘, 히스티딘 HCl, 수산화나트륨 및 수산화칼륨과 같은 본 분야에서 이미 알려진 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 적합한 완충액으로서 히스티딘 완충액, 2-모르폴리노 에탄술폰산(MES), 카코딜레이트(cacodylate), 인산염, 아세테이트, 숙신산염 및 구연산염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 완충액의 농도는 약 4 mM에서 약 60 mM, 또는 대안적으로 약 4 mM에서 약 40 mM, 또는 대안적으로 약 5 mM에서 약 25 mM 사이일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “치료”, “요법” 및 “처리”는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 또는 병증 또는 그 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 질병 또는 병증 또는 그 하나 이상의 증상을 경감시키거나, 질병 또는 병증 또는 그 하나 이상의 증상의 발작을 지연시키거나, 또는 질병 또는 병증 또는 그 하나 이상의 증상의 발전을 억제시키는 것을 의미한다. 일부 실시 형태에 있어서, 치료는 하나 이상의 증상이 발전된 후에 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 치료는 증상이 없는 상황에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상 발작 전에 감염이 쉬운 대상체(예를 들어 증상 이력 및/또는 유전 또는 기타 감염이 쉬운 요소를 고려)에게 사용될 수 있다. 증상 해소 후에도 재발의 예방 또는 지연과 같은 치료를 계속 진행할 수 있다.

본 발명의 각 주제의 고유 명사 또는 용어의 해석 및 실시예는 통용될 수 있어, 더 이상 중복하여 설명하지 않는다.

제제

IM001는 2개의 단일 사슬 gp130-Fc융합 단백질을 포함한 이량체이다. 이는 염증성 질병 및 암을 포함한 다양한 IL-6에 의해 매개되는 병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 다른 단백질 약물과 유사하게, IM001의 가용성, 안정성 및 활성은 환경의 영향을 받는다. 따라서, 적합한 완충계를 포함한 적합한 제제를 개발하는 것이 쉽지 않다.

본 발명자는 12가지의 pH/완충계 배합(표 2), 9가지의 보조재 및 계면활성제 수성 제제 스크리닝 배합(표 7)을 제조하여, 30℃에서 2주간 안정성을 조사하고, DSC, DLS, 외관, 단백질 농도, pH, SEC-HPLC, SDS(환원/비환원)방법으로 이들을 비교하였다. pH ≤ 6.5인 경우, 현저한 가시적 이물질 생성이 관찰되었고, 단백질도 매우 불안정한 반면, pH 8.0(약알칼리성)의 완충계에서 더욱 안정적인 것으로 밝혀졌다. 그 외, 동일한 pH 8.0 완충계에서, 히스티딘 완충계의 안정성이 글리신 및 트리스 완충계보다 강하였다. 흥미롭게도, IM001 단백질을 완충계에 첨가한 후 pH가 이동될 수 있고, pH 8.0 히스티딘 완충계는 단백질을 첨가한 후 pH가 7.6으로 이동된다.

다양한 수성 제제 배합을 조사한 후, 본 출원의 발명자는 자당 및 폴리소르베이트 80 보호 효과 하에, 15 mg/mL의 단백질 농도에서의 안정성이 가장 우수한 것을 발견하였다. 그러나 아쉽게도 단백질 농도가 30 mg/mL에 도달할 경우, 그 안정성이 미흡하였다.

항체와 같은 Fc 단편을 포함하는 많은 단백질로부터 농도가 더욱 높은 안정적인 수성 제제를 용이하게 개발할 수 있기에 이 결과는 비교적 의외였다. 본 출원의 발명자는 어떠한 특정 이론에 얽매이지 않고, 이는 본 융합 단백질 분자의 특성이 고온 또는 고농도에서 불안정적이고, 또한 등전점 원인으로 인해 선택할 수 있는 pH완충계도 한정적이여서, 일반적인 단일클론항체와 같은 생물학적 약물 문자 제제의 개발보다 더욱 도전적이라고 생각하였다.

고농도 제제 배합의 안정성을 향상시키기 위해, 본 출원의 발명자는 5개의 동결 건조 제제 스크리닝 배합(표 14)을 제조하여, 25℃ 및 40℃ 조건 하에서 안정성을 조사하였고, 실험 결과에 따르면, 30 mg/mL의 동일 고농도에서, 동결 건조품의 안정성이 용액 배합보다 모두 현저히 개선되었다. 흥미롭게도 동결 건조 배합(30 mg/mL의 25 mM의 His, 250 mM의 Trehalose, 0.02%의 PS80, pH 7.6)은 상이한 온도 및 다양한 테스트에서 모두 매우 우수한 결과를 보여주고, 특히 고온 40℃ 조건 하에서 2개월 동안 거의 변화가 없으며, 동일 제제가 다양한 테스트에서 모두 우세를 보여주기가 쉽지 않기에, 이러한 결과는 매우 의외였다. 따라서 이를 모두 IM001단백질의 동결 건조 제제 배합으로 한다. 또한, 이 동결 건조 제제 배합에 사용된 당(트레할로스)도 수성 제제 배합 중의 바람직한 방안(자당)과 다르다.

이러한 테스트 결과에 기반하여, 본 출원은 융합 단백질, 히스티틴염, 트레할로스 및 폴리소르베이트를 포함하는 IM001에 적용되는 수성 제제 및 동결 건조 제제를 제공하였다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 동결 건조 후 동결 건조 제제를 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 동결 건조 제제는 적정량의 물을 첨가한 후 상기 수성 제제를 생성할 수 있다. 이러한 수성 제제는 환자에게 주사하여 적합한 질병을 치료할 수도 있다.

상술한 바와 같이, 여기서 융합 단백질(IM001)은 2개의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1인 단량체를 포함하고, 복수의 이황화결합으로 서로 연결된다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 각각의 융합 단백질 분자는 6개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 각각의 융합 단백질 분자는 3개, 2개 또는 1개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 52%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 54%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 52-65%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL 또는 적어도 30 mg/mL의 상기 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 10-60 mg/mL, 15-45 mg/mL, 20-40 mg/mL, 25-35 mg/mL 또는30 mg/mL의 상기 융합 단백질을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 10 mM의 히스티틴염을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM 또는35 mM의 히스티틴염을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 10-50 mM 히스티틴염 또는10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM, 22-28 mM 또는24-26 mM의 히스티틴염을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 25 mM의 히스티틴염을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 100 mM의 트레할로스를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM 또는 300 mM의 트레할로스를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 100-400 mM 트레할로스 또는150-350 mM, 200-300 mM, 220-280 mM, 240-260 mM 또는245-255 mM의 트레할로스를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 250 mM의 트레할로스를 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 폴리소르베이트20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 0.005(w/v)%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 0.01(w/v)%의 폴리소르베이트, 또는 적어도 0.015(w/v)%의 폴리소르베이트, 적어도 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트, 또는 적어도 0.025(w/v)%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 0.01(w/v)%-0.03(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 0.015(w/v)%-0.025(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 0.018(w/v)%-0.022(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 0.019(w/v)%-0.021(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제의 pH는 7.0 이상이다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제의 pH는 7.1 이상, 7.2 이상, 7.3 이상, 7.4 이상, 7.5 이상 또는7.6 이상이다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제의 pH는 7.0-8.2 또는7.1-8.1, 7.2-8.0, 7.3-7.9, 7.4-7.8, 7.5-7.7 또는7.55-7.65이다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제의 pH는 7.6이다.

하나의 예시적인 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 25 mg/mL의 상기 융합 단백질, 24-26 mM의 히스티틴염, 240-260 mM의 트레할로스 및 0.015(w/v)%-0.025(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하고, 또한 pH는 7.4-7.8이다. 하나의 예시적인 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 25 mg/mL의 상기 융합 단백질, 24-26 mM의 히스티틴염, 240-260 mM의 트레할로스 및 0.015(w/v)%-0.025(w/v)%의 폴리소르베이트 80으로 이루어지고, 또한 pH는 7.4-7.8이다.

하나의 예시적인 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 적어도 25 mg/mL의 상기 융합 단백질, 25 mM의 히스티틴염, 250 mM의 트레할로스 및 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하고, 또한 pH는 7.6이다. 하나의 예시적인 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 30 mg/mL의 상기 융합 단백질, 25 mM의 히스티틴염, 250 mM의 트레할로스 및 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80으로 이루어지고, 또한 pH는 7.6이다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 등장화제(또는 삼투압 조절제, 안정제로 칭함), 계면활성제, 항산화제, 방부제 또는이의 혼합물을 더 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 등장화제(또는 삼투압 조절제, 안정제로 칭함)를 더 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “등장화제”는 제제의 장력을 조절하기 위한 약학적으로 허용 가능한 시약을 의미한다. 등장성은 일반적으로 용액에 대한 것이고, 일반적으로 인간 혈청의 용액에 대한 삼투압에 관한 것이다. 제제는 장력이 감퇴하거나, 등장되거나 장력 항진일 수 있다. 한편, 상기 제제는 등장된 것이다. 등장 제제는 액체 또는 고체 형태(예를 들어 동결 건조 형태)로부터 복원된 액체이고, 일부 기타 이와 비교되는 용액(예컨대 생리식염수 및 혈청)과 동일한 장력을 가지는 용액을 의미한다. 적합한 등장제는 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세롤, 만니톨 및 본 명세서에서 정의한 아미노산, 당의 임의의 조성 및 그 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 계면활성제를 더 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “계면활성제”는 양친화성 구조를 가지는 약학적으로 허용 가능한 유기 물질을 의미하고; 즉, 서로 반대되는 용해 경향을 가지는 그룹으로 이루어지며, 일반적으로 유성 탄화수소 사슬 및 수용성 이온 그룹으로 이루어진다. 계면활성제의 가시적 계면활성 부분의 전하는 음이온성 계면활성제, 양이온 성계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 일반적으로 다양한 약물 조성물 및 생물학적 물질 제제의 습윤제, 유화제, 가용화제 및 분산제로 사용된다. 본 명세서에 기재된 약학적 제제의 일부 실시 방안에 있어서, 계면활성제의 양은 중량/부피 백분율로 표시되는 백분율(w/v%)로 설명된다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(Tween), 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 알킬페닐폴리옥시에틸렌에테르(Triton-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(poloxamer, Pluronic) 또는 소듐 도데실 설페이트(SDS)의 군을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르는 폴리소르베이트 20 (Tween 20 ™ 상표로 판매) 및 폴리소르베이트 80(Tween 80 ™ 상표로 판매)을 포함한다. 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체는 Pliironic®F68 또는 Poloxamer 188™ 명칭으로 판매되는 공중합체를 포함한다. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 Bri j™ 상표으로 판매되는 알킬 에테르를 포함한다. 알킬페닐 폴리옥시에틸렌 에테르는 Triton-X 상품명으로 판매되는 것들을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 항산화제를 더 포함한다. “항산화제”는 다른 분자의 산화를 지연시키거나 방지할 수 있는 분자를 의미한다. 산화는 물질에서 전자를 산화제로 전달하는 화학 반응이다. 산화 반응은 유리기를 생성할 수 있고, 상기 유리기는 단백질 치료제를 불안정적이게 하며, 최종적으로 산물 활성의 연쇄 반응에 영향을 미친다. 항산화제는 유리기 중간 산물을 제거하여 이러한 연쇄 반응을 종료시키고, 자체 산화로 다른 산화 반응을 억제한다. 따라서, 항산화제는 일반적으로 구연산염, EDTA, DPTA, 티올, 아스코르브산 또는 폴리 페놀과 같은 환원제, 킬레이트제 및 산소 제거제이다. 항산화제의 비제한적인 구현예로서 아스코르브산(AA, E300), 티오황산염, 메티오닌, 토코페롤(E306), 프로필갈레이트(PG, E310), tert-부틸 하이드로퀴논(TBHQ), 부틸화 히드록시아니솔(BHA, E320) 및 부틸화 히드록시톨루엔(BHT, E321)을 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 방부제를 더 포함한다. “방부제”는 천연 또는 합성 화학품이고, 이를 식품, 의약품, 코팅재, 생물학적 샘플, 목재 등과 같은 제품에 첨가하여, 미생물 성장 또는 희망하지 않는 화학적 변화에 의해 분해되는 것을 방지한다. 방부제 첨가제는 단독으로 또는 다른 방부 방법과 함께 사용할 수 있다. 방부제는 박테리아 및 곰팡이의 성장을 억제하는 항미생물 방부제, 또는 성분의 산화를 억제하는 산소 제거제와 같은 항산화제일 수 있다. 흔히 보는 항미생물 방부제는 염화벤잘코늄, 안식향산, 클로로헥시딘(cholorohexidine), 글리세롤, 벤조산, 칼륨소르베이트, 티메로살, 아황산염(이산화황, 아황산수소나트륨, 아황산수소칼륨 등) 및 EDTA 이나트륨을 포함한다. 다른 방부제는 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 또는 메틸 파라벤과 같은 비경구 단백질에 자주 사용되는 방부제를 포함한다.

실시예로부터 알 수 있다시피, 글리신, 트리스(Tris), 만니톨 등과 같은 일부 상용 생물학적 약물 제제 보조재는 우수한 수성 제제 또는 동결 건조 제제를 형성하는 데 도움이 되지 않는다. 따라서, 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 이러한 보조재를 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 10 mM보다 높은(또는 5 mM, 2 mM, 1 mM, 0.1 mM 또는 0.01 mM보다 높은) 히스티틴염을 제외한 아르기닌, 라이신, 아스파라긴, 글루타민, 글리신 또는 이들의 염과 같은 다른 아미노산염을 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 히스티틴염을 제외한 아르기닌, 라이신, 아스파라긴, 글루타민, 글리신 또는 이들의 염과 같은 다른 아미노산염을 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 10 mM보다 높은(또는 5 mM, 2 mM, 1 mM, 0.1 mM 또는0.01 mM보다 높은) 트레할로스를 제외한 자당과 같은 다른 당을 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 수성 제제는 트레할로스를 제외한 자당과 같은 다른 당을 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 명세서에서 동결 건조 제제와 같은 상응한 건조 제제도 설명하였다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 건조 제제는 동결 건조를 통해 본 명세서에 기재된 수성 제제를 획득할 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 건조 제제는 적정량의 물을 첨가한 후 본 명세서에 기재된 수성 제제를 생성할 수 있다.

용도

본 출원에 기재된 제제는 다양한 해당 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명 중의 gp130 이량체는 천연 가용성 gp130에 비해 더욱 높은 결합 친화력을 가지고, 따라서 더욱 강한 IL-6 신호 전달을 억제하는 능력을 가진다. IL-6신호 전달 및 수많은 질병에 관련하여, 이하에 간단히 설명하고 본 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 기타 질병을 포함한다.

크론병(CD), 궤양성 결장염(UC), 류마티스 관절염(RA) 또는 건선과 같은 만성 염증은 조직학적으로 대식세포 및 림프구와 같은 단핵 세포의 존재와 관련이 있고, 급성 염증기 해결에 사용될 수 있는 것을 얻은 후 조직에 지속적으로 존재한다. 만성 염증성 질병 모델에서, IL-6은 T 세포에서 지속적인 MCP-I 분비, 혈관 증식 및 항사멸 기능을 유도함으로써 손상된 부위의 단핵 세포 축적에 유리한 유해 작용이 있는 것으로 보인다.

염증성 장질환(IBD), 즉 CD 또는 UC는 감염이 쉬운 대상체의 장에서 발생하는 만성 염증이고, 특정 병원체와 관련이 없는 것으로 사료된다. 상피 점막 장벽의 변화는 장 투과성의 증가가 수반되어 점막 면역계가 장 내 항원에 노출되는 것을 강화시켜, 환자의 장 면역계가 부적절하게 활성화된다. 점막 CD4+ T-림프구의 제어되지 않는 활성화는 염증 촉진사이토카인의 연속적인 과도한 방출이 수반되어, 병원성 위장 염증 및 조직 손상을 유발한다. IBD의 발병 매커니즘에 관여하는 주요 활성화 면역세포는 장 T세포와 대식세포라는 데 공통적인 인식을 가지고 있다.

IL-6은 인체에서 IBD 중의 중추 사이토카인으로 나타난다. 대조군과 비교하여, ⑶ 및 UC 환자는 임상 활동과 관련된 높은 수준의 IL-6을 생성하는 것을 발견하였다. ⑶환자의 SIL-6R 수준이 증가되고, 따러서 혈청 내 IL-6/sIL-6R 복합체의 수준이 증가된 것도 발견하였다. CD 및 UC 환자의 수술 결장 표본으로부터 얻은 고유층 고유 단핵 세포에 따르면, CD4+T세포 및 대식세포는 모두 대조에 비해 증가된 IL-6의 양을 생성한 것으로 나타났다. SIL-6R은 대식세포 및 단핵 세포의 표면에서 이탈되어 방출되는 것을 통해, IL-6 수준 상승과 관련된 생산 증가가 수반되는 것으로 밝혀졌다. CD환자에게서, 점막 T세포는 IL-6 트랜스 신호 전달에 대해 강력한 증거를 보여주고, STAT3, bcl-2 및 bcl-xl의 활성화가 수반된다. IL-6 트랜스 신호 전달의 차단은 T세포 사멸을 일으키며, IL-6/sIL-6R시스템이 CD에서 세포 사멸에 대한 T세포의 내성을 매개하는 것을 나타낸다.

따라서, IBD환자에서, 염증 지속을 유발하는 고유층 중의 염증 촉진 CD4+ T세포의 획득성 축적은 항사멸 IL-6/sIL-6R 트랜스 신호 전달에 크게 의존한다. 관련 정보에 따르면, IL-6/sIL-6R 복합체에 작용함으로써, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드는 CD 및 기타 염증성 질병의 치료에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 제제는 IL-6에 의해 매개되는 병증을 치료할 수 있다. IL-6에 의해 매개되는 병증은 염증성 질병 또는 암을 포함한다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 및 조성물은 청소년 특발성 관절염, 크론병, 결장염(예를 들어 방사성 결장염, 게실 결장염, 허혈성 결장염, 감염성 결장염, 셀리악병, 자가면역성 결장염 또는 결장에 영향을 미치는 알레르기로 인한 결장염을 포함하는 IBD와 무관한 결장염), 피부염, 건선, 포도막염, 게실염, 간염, 과민성 대장증후군(IBS), 홍반성 루푸스, 신장염, 파킨슨병, 궤양성 결장염, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병, 관절염, 류머티즘성 관절염, 천식 및 죽상동맥경화증 및 혈관염과 같은 다양한 심혈관 질병과 같은 염증성 질병에 걸린 피험자에게 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 염증성 질병은 당뇨병, 통풍, 냉동 단백질 관련 주기성 증후군 및 만성 폐쇄성 폐 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 염증성 장질환이고, 바람직하게는 치료가 염증성 장질환의 완화를 유도한다. 바람직하게는, 염증성 장질환은 크론병 또는 궤양성 결장염이고, 바람직하게는 치료가 염증성 장질환의 완화를 유지한다. 바람직하게는, 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 류마티스 관절염, 건선, 포도막염 또는 죽상동맥경화증이다. 바람직하게는, 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 염증성 장질환에 무관한 결장염이고, 바람직하게 결장염은 방사성 결장염, 게실 결장염, 허혈성 결장염, 감염성 결장염, 셀리악병, 자가면역성 결장염 또는 결장에 영향을 미치는 알레르기로 인한 결장염이다. 바람직하게는, 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 크론병, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 및 건선으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 크론병 및 궤양성 대장염으로부터 선택된다.

염증성 장질환 등과 같은 염증성 질병에 대해, 치료는 병증의 완화, 병증 완화의 유지 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

기타 실시 형태는 암을 치료하고, 암의 심각성을 낮추거나 암을 예방하는 방법을 제공하고, 암은 다발성골수종, 형질세포 백혈병, 신장세포암, 카포시육종, 결장직장암, 위암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 신경교종, 다형성교세포종, 폐암(비소세포폐암(NSCLC; 선암 및 편평세포암)을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 비호지킨림프종, 호지킨병, 형질세포종, 육종, 흉선종, 유방암, 전립선암, 간세포암, 방광암, 자궁암, 췌장암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 난소암, 자궁경부암, 고환암, 위암, 식도암, 간암, 급성림프구성 백혈병(ALL), T-ALL, 급성골수성 백혈병(AML), 만성골수성 백혈병(CML), 만성림프구성백혈병(CLL), 타액암 또는 기타 암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 실시 형태는 질병을 치료하고, 질병의 심각성을 낮추거나 질병을 예방할 수 있는 방법을 제공하고, 상기 질병은 패혈증, 골흡수(골다공증), 악질, 암 관련 피로, 건선, 전신성 청소년 특발성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 사구체막 증식성 사구체신염, 고감마글로불린혈증, 케슬맨병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종 및 자가면역성 인슐린 의존성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된다.

생산 방법

본 출원의 추가적인 양태는 상기 제제의 생산 방식을 제공한다. SEQ ID NO:1을 코딩하는 cDNA는 신호 펩티드가 항체 사슬의 아미노산 서열의 아미노 말단 프레임 내에 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉 비면역글로불린에서 유래된 신호 펩티드)일 수 있다.

조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질 전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등 요소에 의해 결정될수 있다. 포유 동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 레트로바이러스 LTR, 거대세포바이러스(CMV)(예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 유인원 바이러스 40(SV40)(예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP), 폴리오마 및 강한 포유동물 프로모터(예컨대 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터)의 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 바이러스 요소를 포함한다. 숙주 세포는 포유 동물, 곤충, 식물, 박테리아 또는 효모 세포일 수 있고, 바람직한 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유 동물 세포이다. 예시적 CHO세포는 유럽 세포 배양 보존 센터(ECACC, 번호 9406067)에서 획득한 (CHO) /dhfr^-세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CHO세포이고, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 CHO세포에 사용되도록 코돈에 의해 최적화된다.

본 출원의 다른 양태는 본 명세서에 개시된 방법으로 생성된 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 이량체는 본 명세서에 기재된 특징(예를 들어, 몰당 폴리펩티드의 ％갈락토오스-α-l, 3-갈락토오스, 시알화)을 가진다. 상기 방법으로 생산된 이량체는 적합한 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이와 같이 생산된 융합 단백질 분자는 6개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스, 또는 3개, 2개 또는1개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스를 포함한다.

이와 같이 생산된 융합 단백질 분자는 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 52%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 54%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서, 상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 여기서 평균적으로 적어도 52-65%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함한다.

실시예 1

IM001단백질은 gp130-Fc융합 단백질 유전자를 발현하는 CHO-K1 조작된 세포로부터 세포 배양, 단리 및 정제하여 얻는다.

표 1. IM001단일 사슬의 아미노산 서열

IM001의 cDNA서열은 CHO세포 발현계에서 발현된다. Fc영역 중 IgGl Cys-Pro-Pro-Cys 서열의 존재는 2개의 동일한 gp130-Fc 서브 유닛이 Fc영역의 설프히드릴기 잔기를 통해 이량체화되도록 하여, 함께 IM001을 형성한다.

IM001약물 물질의 시범성 제조 및 정제 과정은 이하와 같다. 생산 생물 반응기에 접종하기 전에 단백질이 없는 배지를 사용하여 WCB 바이알에서 세포를 소생시키고 점진적으로 확장시킨다. 세포 배양이 완료된 후, 배양물 여과를 통해 세포 및 세포 파편을 제거하였다. 정제는 3개의 칼럼 크로마토그래피 단계, 하나의 농축 및 삼투 단계 및 2개의 특정 바이러스 제거 단계(바이러스 불활성화 처리 및 나노 여과, 외피 및 비외피 바이러스 제거)로 구성된다. 농축 및 삼투 후, 부형제를 첨가하여 약물 물질을 배합한다. 배합된 IM001은 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 용기에 여과된다.

본 실시예는 IM001 단백질이 가장 안정적인 pH/완충계를 스크리닝하는 것도 시도하였다.

투석 방법으로 IM001 원액을 각각 20 mM의 아세테이트(pH4.5, pH5.0, pH5.5), 구연산염(pH5.0), 히스티딘-아스파르트산염(pH5.0, pH5.5), 히스티딘(pH5.5, pH6.0, pH6.5, pH7.0, pH8.0) 및 인산염(pH7.0)으로 교환하엿다. 단백질 농도를 30 mg/mL 정도로 조절한 후, 0.22 μm의 PVDF 멤브레인 필터로 여과하였다. 여과 후 샘플은 병에 담아 밀봉하였다. 모든 작업은 모두 생물 안전 실드(safety shield)에서 수행된다. 그 중 한병을 T0으로 하고, T0 DSC 및 HT-DLS 결과에 따라 적합한 안정성 조사 조건을 선택하며, 나머지 샘플을 상기 조건에 따라 보관하고, 각 병은 표 2에 규정된 시점에 샘플링하여 분석한다.

표 2. IM001 pH/완충계 스크리닝 연구 방안

1.1. DSC 및 HT-DLS 결과

결과는 표3, 도1-도2를 참조한다. 모든 배합의 Tm-onset는 40.9-43.0℃이고, Tagg Onset에서 배합 1의 60.6℃ 및 배합 11의 65.7℃를 제외하고, 다른 배합의 Tagg Onset는 모두 45℃ 정도이다.

표 3. IM001 pH/완충계 스크리닝 DSC 및 HT-DLS 결과

1.2. 외관, pH 및 단백질 농도 결과

결과는 표4를 참조한다. 외관 결과에 따르면 T0 시 배합 1 및 배합 11에서 가시적 이물질이 관찰되지 않는 것을 제외하고, 모든 배합에서 모두 가시적 이물질이 관찰되었으며, 30℃에서 1주간 및 2주간 보관 후 모든 배합에서 모두 가시적 이물질이 관찰되었다. pH 및 단백질 농도 결과에 따르면 30℃에서 2주간 보관한 모든 배합은 모두 현저한 변화가 없었다.

표 4. IM001 pH/완충계 스크리닝 외관, pH 및 단백질 농도 결과

비고: SY(담황색)/SO (미세 유광)/OL(유광), FP(가시적 이물질이 없음)/PO(가시적 이물질이 있음)/+(소량의 가시적 이물질)/++(대량의 가시적 이물질)

1.3. SEC 순도 결과

결과는 표 5를 참조하고, 결과에 따르면, 30℃에서 1-2주간 보관한 후, 모든 배합의 SEC 순도는 상이한 정도로 감소되었고, 배합 11의 감소 정도가 가장 낮고(약 13%), 다른 완충계의 감소 폭 범위는 19.3%-72%이다.

표 5. IM001 pH/완충계 스크리닝 SEC순도 결과

1.4. SDS-PAGE(환원/비환원) 결과

결과는 표 6을 참조하고, 환원SDS-PAGE 결과에 따르면 30℃에서 2주간 보관한 후, p10(pH 7.0의 His), p11(pH 8.0의 His) 및 p12(pH 7.0의 Phosphate)의 순도는 감소되지 않았고, 나머지 샘플은 모두 상이한 정도로 감소되었며, 감소 폭은 10.8%~50.0% 사이에 있고; 비환원 SDS-PAGE 순도는 모두 상이한 정도로 감소되었고, p10(pH 7.0의 His), p11(pH 8.0의 His) 및 p12(pH 7.0의 Phosphate)의 감소 폭이 다른 샘플보다 작으며, 나머지 샘플의 감소 폭은 14.6%~65.7%이다.

표 6. IM001 pH/완충계 스크리닝 SDS-PAGE(환원/비환원) 결과

본 연구는 DSC, DLS, 외관, 단백질 농도, pH, SEC-HPLC, SDS-PAGE(환원/비환원)방법으로 IM001단백질이 가장 안정적인 pH/완충계를 스크리닝하였다. DSC 및 DLS 결과에 따르면, IM001 분자의 Tm Onset 및 Tagg Onset는 pH값의 상승에 따라 상승 추세를 보이고, p11(pH 8.0의 His)의 Tm Onset 및 Tagg Onset은 나머지 샘플보다 높다. 30℃ 조건 하에서 2주간 조사한 후, 외관, SEC-HPLC, SDS-PAGE(환원/비환원) 결과에 따르면, IM001은 저pH 환경에서 상대적으로 불안정하고, 배합 11(히스티틴염 완충계, pH 8.0, 단백질 포함 시 pH 7.6)은 각 테스트에서 다른 배합에 비해 상대적으로 우수하였다.

실시예 2

본 실시예의 연구 목적은 pH/완충계의 스크리닝 기초 상에 적합한 보조재 안정제를 스크리닝하는 것이다.

pH/완충계 스크리닝 실험 결과에 기반하여, pH 8.0의 25 mM의 히스티딘 완충계를 보조재로 하여 주요 평가 완충계를 스크리닝하였다. 그 외 pH 7.5의 글리신 완충계 및 pH 7.5의 트리스 완충계를 추가 조사하였다. 초여과 원심분리의 방식을 통해 IM001 원액을 25 mM의 히스티딘 완충계(pH 8.0), 25mM의 글리신완충계(pH7.5) 및 25mM의 트리스 완충계(pH7.5)로 교환하고, 실험 방안에 따라 각각 서로 다른 보조재 모액 및 계면활성제 모액을 첨가하며, 단백질 함량을 각각 30mg/mL와 15mg/mL 정도로 조절하여, 최종적으로 서로 다른 보조재 및 계면활성제를 함유하는 9개의 배합으로 제조하였다. 생물안전 캐비닛에서 각각 0.22 μm의 PVDF 멤브레인을 사용하여 여과한 후, 페니실린병에 나누어 넣은 후 마개로 밀봉하였다. 다양한 조건의 실험 조사을 시작하고, 구체적인 방안은 표 7을 참조하며, 표에서 배합의 pH는 단백질을 첨가하기 전의 완충액 pH이고, IM001단백질을 완충계에 첨가하여 pH 이동 현상이 발생하며, 실제 배합 pH는 측정 결과를 참조한다.

표 7. 보조재 및 계면활성제 스크리닝 방안

Y= 외관, pH, 단백질 농도, SEC-HPLC; Z= MFI; X= DSC, 삼투압

비고: 1. 보조재 스크리닝 샘플을 2~8℃에서 1개월간 조사한 후, F5 배합을 제외한 다른 배합은 모두 현저한 입자가 나타났고, 본 회차 보조재 스크리닝에 사용된 원자재 T0점 순도가 비교적 낮으며, 대표성이 제한적이여서, 1개월 조사 후의 샘플링 포인트에서 더이상 샘플링 검출하지 않는다.

2.1 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 DSC 결과

모든 배합의 샘플을 제조한 후, 샘플에 대해 DSC검출을 수행하고, 검출 결과는 표 8을 참조하며, DSC 그래프는 도 3을 참조한다. 데이터에 따르면 9개 샘플의 Tm Onset는 45℃ 정도에 있고, 상이한 배합 샘플의 Tm Onset는 현저한 차이가 없다.

표 8. 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 DSC 결과

2.2 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 외관 검출 결과

보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험의 외관 결과 합계는 표 9를 참조하고, 데이터에 따르면 9개 배합 샘플은 동결 융해를 거쳐 5개 사이클 조사 후, 모두 가시적 입자가 관찰되지 않은 반면; 25℃에서 300 rpm으로 7일간 진탕하는 조건 하에서, 9개 배합 샘플에서 모두 많은 가시적 입자가 나타났고; 고온(30±2℃)조건 하에서 2주간 조사 후, F1 및 F4배합에 가시적 입자가 나타나고, 가속(25±2℃) 조건 하에서 1개월간 조사 후, F1, F4 및 F5 배합에서 가시적 입자가 나타나며, 장기간(2~8℃) 조사 조건에서 1개월간 조사한 후, F5 배합을 제외하고, 다른 배합에서 모두 가시적 입자가 나타났다.

표 9 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 외관 결과

비고: C 무색(colorless)/SY 담황색(slightly yellow)/Y 황색(yellow);

CL 맑고 투명(Clear liquid)/미세 유광SO(slightly opalescent liquid)/유광O(opalescent liquid);

FP 가시적 입자 없음(free of visible particles)/PO가시적 입자(particles observed)/+소량(a few visible particles)/ ++비교적 많음(many visible particles)

2.3 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 삼투압, pH 및 단백질 농도 결과

보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험의 삼투압, pH 및 단백질 농도 결과 합계는 표 10을 참조하고, 데이터에 따르면 9개 배합 샘플은 반복적인 동결 융해, 진탕, 고온(30±2℃) 조사, 가속(25±2℃) 및 2~8℃ 조사 후, pH 및 단백질 농도는 모두 현저한 변화가 없었다.

표 10 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 pH 및 단백질 농도

2.4 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험의 불용성 미립자 검출(MFI) 결과

보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험의 불용성 미립자 검출(MFI) 결과 합계는 표 11을 참조하고, 동결 융해 샘플 데이터에 따르면, F1 배합 샘플은 동결 융해를 거친 후, 불용성 미립자 수량이 나머지 샘플보다 많고; 30℃에서 2주간 조사 후 샘플 데이터에 따르면 F1 배합 샘플의 불용성 미립자 수량이 나머지 샘플보다 많고, F4 배합 샘플은 가시적 입자가 비교적 많아, MFI 검출을 수행하지 않았으며; 25℃에서 1개월간 조사한 샘플의 데이터에 따르면, F1 및 F4 배합 샘플의 불용성 미립자 수량이 나머지 샘플보다 많앗다.

표 11 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험의 불용성 미립자 검출(MFI) 결과

2.5 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험의 순도(SEC-HPLC) 결과

SEC-HPLC검출 결과 합계는 표 12를 참조하고, 25℃에서 1개월간 조사한 샘플 및 30℃에서 2주간 조사한 샘플의 데이터에 따르면 F4 및 F5 배합 샘플의 감소 폭이 모두 다른 샘플보다 크고, F9 감소 폭은 모두 나머지 샘플보다 작으며, 나머지 샘플의 감소 폭은 비슷하다. 2~8℃에서 1개월간 조사한 샘플 데이터에 따르면 F5 샘플 메인 피크 순도는 2.1% 감소하고, 나머지 배합 샘플 메인 피크 순도는 현저한 변화가 없었다. 5개 사이클 샘플을 동결 융해한 데이터에 따르면 F8 샘플 메인 피크 순도는 10.3% 감소하고, 나머지 샘플 메인 피크 순도는 현저한 변화가 없었다.

표 12 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 순도(SEC-HPLC) 결과

2.6 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 순도(SDS-PAGE) 결과

SDS-PAGE데이터 합계는 표 13을 참조하고, 환원 SDS-PAGE 데이터에 따르면, 상이한 샘플 사이의 순도 데이터는 현저한 차이가 없고, 비환원 SDS-PAGE 데이터에 따르면, F9 샘플의 순도가 나머지 샘플보다 우수하고, 나머지 샘플의 순도 데이터는 비슷하다.

표 13 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험의 SDS-PAGE 결과

2.7 보조재 및 계면활성제 스크리닝 실험 요약

외관 및 불용성 미립자 측정 결과에 따르면 폴리소르베이트 80은 폴리소르베이트20에 비해 미립자 발생을 피하는 데 더 유리하고; 단백질에 대한 글리신 완충계의 안정 작용은 히스티딘 완충계보다 약하다.

SEC 데이터에 따르면 IM001 단백질에 대한 만노스의 보호 작용은 자당 및 트레할로스보다 약하고; DSC 및 DLS 결과에 따르면, IM001 분자는 비교적 낮은 온도 조건 하에서(40-50℃) 사슬이 끊기고및 중합되기 쉽다. F2 및 F3 배합 샘플의 각 조사 조건 데이터가 비슷하고, 단백질에 대한 자당 및 트레할로스의 안정 작용이 비슷한 것을 나타내며; F4 및 F5배합 샘플의 각 조사 조건의 메인 피크 순도가 나머지 샘플보다 다소 낮고, pH 8.0의 히스티딘 완충계가 글리신 및 트리스 완충계보다 우수한 것을 나타내며; F2 및 F6 배합 샘플의 각 조사 조건 하에서의 데이터가 비슷하고, F6 배합에 1 mM의 메티오닌을 첨가한 것은 F2 배합 에 메티오닌을 첨가하지 않은 것과 현저한 차이가 없는 것을 나타내고; F2 및 F7 배합 샘플의 각 조사 조건 하에서의 데이터가 비슷하고, F7배합에 4%의 만니톨 및 2%의 자당 조합을 함유한 안정성은 F2배합에 250 mM의 자당을 함유한 안정성과 비슷한 것을 나타낸다. F9 배합 샘플의 각 조사 조건 하에서 메인 피크 순도는 모두 F2보다 높고, 수성 제제의 15 mg/mL의 단백질 농도가 30 mg/mL에 비해 IM001 단백질 안정에 더 유리한 것을 나타낸다.

환원 SDS-PAGE 데이터에 따르면, 상이한 샘플 사이의 순도 데이터는 현저한 차이가 없고, 비환원SDS-PAGE 데이터에 따르면 F9 샘플의 순도가 나머지 샘플보다 우수하며, 나머지 샘플의 순도 데이터가 비슷하다. F2 및 F9 배합은 농도가 다른 점을 제외하고, 기타 조성이 일치하며, 이로써 수성 제제의 15 mg/mL의 단백질 농도가 30 mg/mL에 비해 IM001 단백질 안정에 더욱 유리한 것을 나타낸다.

실시예 3

본 실시예의 연구 목적은 고농도 동결 건조 제제 배합을 스크리닝하는 것이다.

수성 제제 배합 스크리닝 결과에 따르면, IM001 단백질 농도가 30 mg/mL로 향상하였고, 25℃ 이상 온도에서 방치 시간이 길어짐에 따라 순도는 현저히 감소되는 추세를 보였다. 따라서 동결 건조 제제의 배합 설계를 진행하였고, 방안은 표 14를 참조한다. IM001 원액을 25 mM의 히스티딘 완충계(pH 8.0)로 교환하고, 실험 방안에 따라 각각 서로 다른 보조재 모액 및 계면활성제 모액을 첨가하며, 단백질 함량을 조절하고, 각각 서로 다른 종류의 당의 모액 및 계면활성제 모액을 첨가하며, 단백질 함량을 30 mg/mL로 조절하였다. 제조된 5개 배합을 생물안전 캐비닛에서 각각 0.22 μm의 PVDF 멤브레인을 사용하여 여과한 후, 피펫으로 5 mL의 약액을 취해 세척 멸균한 20R 페니실린병에 취하고, 즉시 마개로 막고 압연하며, 라벨링하였다. 그 후 동결 건조하고, 상이한 조건의 안정성 조사을 시작하며, 구체적인 방안은 표 15를 참조한다.

표 14동결 건조 제제의 스크리닝 배합 리스트

표 15 동결 건조품 안정성 실험 방안

여기서 X=외관, 삼투압, pH, 단백질 농도, SEC-HPLC;

Y= MFI;

Z= 수분 함량, Tc, Tg’

3.1 동결 건조품 외관 관찰

동결 건조품 외관은 도 4에 도시된 것을 참조하고, 모든 배합은 동결 건조 후 외관이 모두 백색의 푸석한 덩어리 형태이고, 여기서 F7(4%의 만니톨 및 2%의 자당을 함유) 형태는 다른 동결 건조품에 비해 더욱 푸석하다.

3.2 동결 건조품 수분 함량 측정

동결 건조품 수분 측정의 결과는 표 16을 참조하고, 상이한 배합의 수분 함량은 모두 3% 미만이며, 동결 건조품 수분 함량 기준에 도달하고, 구체적인 수분 함량은 1.1~1.6% 사이에 있다. 여기서 F7의 수분 함량이 다소 높은 1.63%이다.

표 16 동결 건조품 수분 함량 측정

3.3 동결 건조 배합의 냉동 용액 유리 전이 온도(Tg’) 및 동결 건조 함몰 온도(Tc) 측정

동결 건조 배합의 냉동 용액 유리 전이 온도(Tg’) 및 동결 건조 함몰 온도(Tc) 측정 결과는 표 17을 참조하고, 자당을 함유한 배합 F2, F16, F17의 Tg’는 모두 -27℃ 정도이고, 트레할로스를 함유한 배합 F7의 Tg’는 다소 높은 -25.9℃이며, 4%의 만니톨 및 2%의 자당을 함유한 배합 F7의 Tg’가 가장 낮은 -33.2℃이다. 또한, 우리는 F2 및 F15 이 2개의 배합의 Tc를 측정하였고, 각각 -23.8℃ 및 -26.7℃이였다.

표 17 동결 건조 용액의 유리 전이 온도(Tg’) 및 동결 건조 함몰 온도(Tc) 측정 결과

3.4 동결 건조품 재용해 용액의 외관 검출

동결 건조품의 동결 건조 전후의 질량 변화 차이에 기반하여, 재용해 물 첨가 부피를 산출하여 얻고, 물을 첨가하여 동결 건조품을 재용해하며, 재용해 완료 후 재용해 용액의 외관을 관찰하고, 결과는 표 18에 나타낸 바와 같다. T0, 가속 조건(25℃) 및 고온 조건(40℃)에 방치한 샘플을 포함한 모든 샘플에서, 재용해 후의 용액은 모두 담황색, 미세 유광이며, 모두 가시적 입자가 관찰되지 않았다.

표 18 동결 건조품 재용해 용액의 외관 측정 결과

비고: C 무색(colorless)/SY 담황색(slightly yellow)/Y 황색( yellow);

CL 맑고 투명(Clear liquid)/미세 유광SO(slightly opalescent liquid)/유광O(opalescent liquid);

FP 가시적 입자 없음(free of visible particles)/PO 소량 입자(a few visible particles)

3.5 동결 건조품 재용해 용액의 pH, 단백질 농도 및 삼투압 검출

상이한 배합의 동결 건조품의 재용해 용액의 pH, 단백질 농도 및 삼투압의 측정 결과 합계는 표 19를 참조하고, 데이터에 따르면 5개 배합 샘플을 가속 조건(25℃) 및 고온 조건(40℃)에 방치한 후, pH, 단백질 농도 및 삼투압이 모두 현저하게 변화하지 않았다.

표 19 동결 건조품 재용해 용액의 pH, 단백질 농도 및 삼투압 측정 결과

3.6 동결 건조품 재용해 용액의 불용성 미립자 검출(MFI)

동결 건조품 재용해 용액의 불용성 미립자 검출(MFI) 결과 합계는 표 20을 참조하고, 상이한 배합의 불용성 미립자 수량은 현저한 차이를 보이지 않고, 25℃에서 1개월간 방치 또는 40℃에서 2개월간 방치한 후의 샘플은, 재용해 후 불용성 미립자 수가 T0 샘플에 비해 현저히 증가하지 않았다.

표 20동결 건조품 재용해 용액의 불용성 미립자 검출 (MFI) 결과

*^1,2 이 2개의 샘플은 오염되었을 가능성이 있고, 표 중 데이터로부터 알 수 있다시피 F2의 25C-3M, 40C-1M 및 40C-2M샘플의 불용성 미립자는 T0샘플보다 현저히 낮고, F15의 경우 또한 40C-1M, 40C-2M샘플의 불용성 미립자 수가 25C-3M샘플에 비해 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다.

3.7 동결 건조품 재용해 용액의 순도(SEC-HPLC) 검출

SEC-HPLC검출 결과 합계는 표 21을 참조하고, 모든 배합은 가속 조건(25℃) 및 고온 조건(40℃)하에서 2주간에서 3개월간 방치하였으며, F7 SEC순도가 약간 감소된 것을 제외하고, 다른 SEC순도는 거의 변화가 없으며, 동결 건조품의 안정성이 액체 제제에 비해 현저히 향상된 것을 설명한다. 여기서 F7배합(4%의 만니톨 및 2%의 자당을 함유)의 안정성은 기타 배합에 비해 다소 떨어지고, 어닐링 후의 만니톨 결정, 단백질이 당의 보호 작용을 잃는 것과 관계될 수 있으며, 나머지 배합의 SEC 메인 피크 함량은 거이 변화하지 않았고, 모두 양호한 안정성을 갖는다.

표 21 동결 건조품 재용해 용액의 순도(SEC-HPLC) 검출 결과

3.8 동결 건조 제제의 스크리닝 실험 요약

조사한 5개의 동결 건조품은 모두 우수한 외관을 가지고, 백색의 푸석한 덩어리 형상이였다. 수분 함량 측정 결과는 1.1~1.6% 사이에 있고, 모두 3% 미만이며, 수분 함량이 합격이다. 가속 조건(25℃) 및 고온 조건(40℃)에 2주에서 3개월간 방치한 후, 재용해 용액은 모두 담황색이고, 미세 유광을 띄며, 가시적 입자가 존재하지 않았다. F7(4% 만니톨 및 2% 자당을 함유)의 Tg’는 -33.2℃이고, 나머지 배합의 Tg’는 -26~-27℃ 정도이다. MFI 결과에 따르면 상이한 배합 사이는 현저한 차이가 없다. SEC 결과에 따르면 F7을 제외한 모든 조사 배합은 동결 건조 후 안정성이 우수하고, 가속 조건(25℃)에 3개월간 방치하고 고온 조건(40℃)에 2개월간 방치하여도, 그 메인 피크는 모두 현저한 감소가 없으며, F7 배합(4%의 만니톨 및 2%의 자당 함유)의 SEC 메인 피크는 다른 배합에 비해 더욱 많이 감소되었고, 그 안정성이 더욱 떨어진다.

요약

완충계 스크리닝 결과에 따르면, pH 8.0 His완충염(배합 pH 7.6)계의 안정성이 가장 우수하다.

보조재 및 계면활성제 스크리닝 결과에 따르면, pH 8.0히스티딘 완충계의 안정성이 글리신 및 트리스 완충계보다 강하고, 자당 및 트레할로스의 보호 효과가 비슷하며, 만니톨의 보호 효과보다 우수하고, 15 mg/mL의 단백질 농도 안정성이 30 mg/mL의 체계보다 우수하며, 그 중 F9 배합(15 mg/mL의 단백질, 25 mM의 His, 250 mM의 수크로스, 0.02%의 PS80, pH 7.6)의 수성 제제 안정성이 가장 우수하다.

동결 건조 제제 스크리닝 실험 결과에 따르면, 동결 건조품의 안정성은 용액 배합에 비해 모두 현저하게 개선되었다. 그 중 F7 배합(30 mg/mL의 단백질, 25 mM의 His pH 8.0, 4%의 만니톨, 2%의 수크로스, 0.02%의 PS80)의 안정성 다소 떨어지고, 나머지 배합은 모두 우수한 안정성을 보여준다.

이상 실험 결과에 기반하여, 우리는 F15 배합 30 mg/mL의 단백질, 25 mM의 His, 250 mM의 트레할로스, 0.02%의 PS80, pH 7.6)을 IM001 단백질의 동결 건조 제제 배합으로 선택하였다.

상술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과하고, 본 발명에 대해 어떠한 형식적 또는 실질적으로 한정하고자 하는 것이 아니며, 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 있어서, 본 발명의 방법을 이탈하지 않는 전제 하에서 여러 개선 및 보충을 할 수도 있으며, 이러한 개선 및 보충은 본 발명의 청구 범위 내에 속하는 것으로 간주해야 한다. 본 전공을 숙지한 기술자라면, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 상황에서 이상 개시한 기술 내용을 이용한 여러 변경, 변형 및 동등한 변화는 모두 본 발명의 등가적인 실시예에 속하고; 동시에, 본 발명의 실질적인 기술에 의거하여 상기 실시예에 대해 진행한 어떠한 동등한 변화의 변경, 변형 및 변화는 모두 여전히 본 발명의 기술 방안의 범위 내에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> I-MAB BIOPHARMA (HANGZHOU) CO., LTD. <120> FORMULATION CONTAINING SOLUBLE GP130 DIMER AND METHOD FOR USING SAME <130> 54LW-309949-WO <150> CN2020116241588 <151> 2020-12-31 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 822 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser Pro Glu Ser Pro Val Val 1 5 10 15 Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys Val Leu Lys Glu Lys Cys 20 25 30 Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr Ile Val Trp Lys Thr Asn 35 40 45 His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr Ile Ile Asn Arg Thr Ala 50 55 60 Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser Leu Asn Ile Gln Leu Thr 65 70 75 80 Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu Gln Asn Val Tyr Gly Ile 85 90 95 Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys Pro Lys Asn Leu Ser Cys 100 105 110 Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys Glu Trp Asp Gly Gly Arg 115 120 125 Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr 130 135 140 His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg Asp Thr Pro Thr Ser Cys 145 150 155 160 Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val Asn Ile Glu Val Trp Val 165 170 175 Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr Ser Asp His Ile Asn Phe 180 185 190 Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro Pro His Asn Leu Ser Val 195 200 205 Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu Lys Leu Thr Trp Thr Asn 210 215 220 Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg 225 230 235 240 Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile Pro Pro Glu Asp Thr Ala 245 250 255 Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu 260 265 270 Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu Asp Gly Lys Gly Tyr Trp 275 280 285 Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Glu Asp Arg Pro 290 295 300 Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile Asp Pro Ser His Thr Gln 305 310 315 320 Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys Thr Leu Pro Pro Phe Glu 325 330 335 Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val Thr Leu Thr Arg Trp Lys 340 345 350 Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala Thr Lys Leu Thr Val Asn 355 360 365 Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Thr Val Arg Asn Leu Val 370 375 380 Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile Pro Ala Cys Asp Phe Gln 385 390 395 400 Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala Phe Pro Lys Asp Asn Met 405 410 415 Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu Ser Val Lys Lys Tyr Ile 420 425 430 Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala Pro Cys Ile Thr Asp Trp 435 440 445 Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr Tyr Leu Arg Gly Asn Leu 450 455 460 Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val Thr Pro Val Tyr Ala Asp 465 470 475 480 Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Pro 485 490 495 Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu 500 505 510 Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val Asp Val Gln Asn Gly Phe 515 520 525 Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr Ile Ile Gly Asn Glu Thr 530 535 540 Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu 545 550 555 560 Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met Ala Ala Tyr Thr Asp Glu 565 570 575 Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe Thr Thr Pro Lys Phe Ala 580 585 590 Gln Gly Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 595 600 605 Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 610 615 620 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 625 630 635 640 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 645 650 655 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 660 665 670 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 675 680 685 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 690 695 700 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 705 710 715 720 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 725 730 735 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 740 745 750 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 755 760 765 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 770 775 780 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 785 790 795 800 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 805 810 815 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 820

Claims (27)

1. 융합 단백질, 20-30의 mM 히스티틴염, 220-280 mM의 트레할로스 및 0.01(w/v)%-0.03(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH가 7.0-8.2이며, 상기 융합 단백질은 2개의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1인 단량체를 포함하고, 복수의 이황화결합으로 서로 연결되는 수성 제제.
2. 제1항에 있어서,
   상기 수성 제제의 pH가 7.4-7.8인 수성 제제.
3. 제2항에 있어서,
   상기 수성 제제의 pH가 7.6인 수성 제제.
4. 제1항에 있어서,
   상기 수성 제제는 24-26 mM의 히스티틴염을 포함하는 수성 제제.
5. 제4항에 있어서,
   상기 수성 제제는 25 mM의 히스티틴염을 포함하는 수성 제제.
6. 제1항에 있어서,
   상기 수성 제제는 240-260 mM의 트레할로스를 포함하는 수성 제제.
7. 제6항에 있어서,
   상기 수성 제제는 250 mM의 트레할로스를 포함하는 수성 제제.
8. 제1항에 있어서,
   상기 수성 제제는 0.015(w/v)%-0.025(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하는 수성 제제.
9. 제8항에 있어서,
   상기 수성 제제는 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하는 수성 제제.
10. 제1항에 있어서,
    등장화제(tonicity agent), 계면활성제, 항산화제, 방부제 또는 이의 혼합물을 더 포함하는 수성 제제.
11. 제1항에 있어서,
    상기 각각의 융합 단백질 분자는 6개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스를 포함하는 수성 제제.
12. 제11항에 있어서,
    상기 각각의 융합 단백질 분자는 3개 이하의 갈락토오스- α -1,3-갈락토오스를 포함하는 수성 제제.
13. 제11항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 글리칸을 포함하고, 평균적으로 적어도 52%의 상기 글리칸은 하나 이상의 시알산 잔기를 포함하는 수성 제제.
14. 제1항에 있어서,
    적어도 10 mg/mL의 상기 융합 단백질을 포함하는 수성 제제.
15. 제14항에 있어서,
    적어도 25 mg/mL의 상기 융합 단백질을 포함하는 수성 제제.
16. 제1항에 있어서,
    적어도 25 mg/mL의 상기 융합 단백질, 24-26 mM의 히스티틴염, 240-260 mM의 트레할로스 및 0.015(w/v)%-0.025(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH가 7.4-7.8인 수성 제제.
17. 제16항에 있어서,
    30 mg/mL의 상기 융합 단백질, 25 mM의 히스티틴염, 250 mM의 트레할로스 및 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH가 7.6인 수성 제제.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    10 mM보다 높은 히스티틴염을 제외한 다른 아미노산염을 포함하지 않거나, 바람직하게는, 다른 아미노산염을 포함하지 않는 수성 제제.
19. 제18항에 있어서,
    10 mM보다 높은 트레할로스를 제외한 다른 당을 포함하지 않거나, 바람직하게는, 트레할로스를 제외한 다른 당을 포함하지 않는 수성 제제.
20. 제19항에 있어서,
    30 mg/mL의 상기 융합 단백질, 25 mM의 히스티틴염, 250 mM의 트레할로스 및 0.02(w/v)%의 폴리소르베이트 80으로 이루어지고, pH가 7.6인 수성 제제.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간의 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증을 치료하는 데 사용되는 수성 제제.
22. 제21항에 있어서,
    상기 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 염증성 장질환이고, 바람직하게는 상기 치료가 염증성 장질환의 완화를 유도하는 수성 제제.
23. 제21항에 있어서,
    상기 염증성 장질환은 크론병 또는 궤양성 대장염이고, 바람직하게는 상기 치료가 염증성 장질환의 완화를 유지하는 수성 제제.
24. 제21항에 있어서,
    상기 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 류마티스 관절염, 건선, 포도막염 또는 죽상동맥경화증인 수성 제제.
25. 제21항에 있어서,
    상기 염증성 질병 또는 IL-6에 의해 매개되는 병증은 염증성 장질환과 무관한 결장염이고, 바람직하게는 상기 결장염은 방사성 결장염, 게실 결장염, 허혈성 결장염, 감염성 결장염, 셀리악병, 자가면역성 결장염 또는 결장에 영향을 미치는 알레르기로 인한 결장염인 수성 제제.
26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 수성 제제를 동결 건조하여 얻을 수 있는 건조 제제.
27. 물을 첨가한 후 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 수성 제제를 생성할 수 있는 건조 제제.