TWI376417B - Cells or plants having a producing ability of polylactate or its copolymers and method for preparing polylactate or its copolymers using the same - Google Patents

Cells or plants having a producing ability of polylactate or its copolymers and method for preparing polylactate or its copolymers using the same Download PDF

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TWI376417B
TWI376417B TW095118221A TW95118221A TWI376417B TW I376417 B TWI376417 B TW I376417B TW 095118221 A TW095118221 A TW 095118221A TW 95118221 A TW95118221 A TW 95118221A TW I376417 B TWI376417 B TW I376417B
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Description

1376417 九、發明說明： 毒· 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種具有產生聚乳酸(polylactate ; PLA)或其 共聚物(copolymer)之能力的細胞或植物，以及一種利用上述細胞 或植物而製備聚乳酸或其共聚物之方法，且特別有關於一種能表 現一可編碼(encode)成一將乳酸轉化(convert)成乳酸基輔酶 A(lactyl-CoA)的酵素(enzyme)之基因(gene)、和一種能編石馬成一涉 及聚經基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate ; PHA)合成的酵素之基 鲁 因’以及一種可用以製備聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物 (hydroxyalkanoate-lactate copolymer)之方法，而此方法包括在一包 含乳酸、一提供經基烧酿基辅酶A (hydroxyalkanoyl-CoA)或乳酸之 : 碳源、以及各種羥基脂肪酸的培養基中培養上述細胞或植物。 • 【先前技術】 聚乳酸為一種來自於乳酸且常見的生物可分解 (biodegradable)之聚合物’其具有多種的應用，例如可作 φ 為一般或藥用聚合物。在目前而言，聚乳酸乃通常利用 乳酸進行聚合而製備’而乳酸則經由微生物的發酵 (ferment)而產生，然而只有低分子量的聚乳酸（1()〇〇_2〇〇〇 道爾頓（dalton))可經由乳酸直接聚合而產生。爲了合成 高分子量（大於1〇〇,〇〇〇道爾頓）的聚乳酸，可使用一種利 用鏈偶合劑（chain coupling agent)而將乳酸直接聚合而 得的低分子量之聚乳酸進行聚合，以得到具有高分子量 之聚乳酸的方法，然而此方法乃具有缺點如下，例如由 於其需添加溶劑或鏈偶合劑而使得製備高分子量聚乳酸 1376417 、的程序變得較為複雜’且難以將上述溶劑或鏈偶合劑移 除。在目前製備市售高分子聚乳酸的製程中，乃使用一 種將乳酸轉化成乳酸交酯（lactide)，再藉由將乳酸交酯經 脫水環化（cyclodehydration)以合成聚乳酸的方法。 另’聚輕基脂肪酸醋為一種聚醋（polyester)，當存在 有過多的碳源而缺乏其他的營養元素（例如構、，氣、鎮、 或氧等元素）時，微生物會在其胞内累積聚羥基脂肪酸酯 作為碳或能量儲存的化合物。由於聚羥基脂肪酸酯具有 _ 類似於從石油中所合成之聚合物的性質，因此可將其視 為一種現存合成塑膠之可替換的材料，且同時可顯現極 佳的生物分解率。 現存的聚羥基脂肪酸酯可分為具有短碳鏈的短鏈聚 * 羥基脂肪酸酯（short-chain-length PHA; SCL-PHA)與具有 長碳鏈的中鏈聚經基脂肪酸醋（medium-chain-length PHA ; MCL-PHA)。一種可合成翠羥基脂肪酸酯的基因 I 乃於假單胞菌屬的真養雷爾氏菌ewirop/ίβ， Psewi/om⑽仍）進行複製（clone) ’而藉由基因重組微生物 (recombinant microorganism)所合成的聚經基脂肪酸酯 貝1J可包含多種不同的單體（monomer)(Qi ei flA, FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624” 爲了在為生物體内產生聚羥基脂肪酸酯，必需具有 8 1376417 一種酵素將微生物的代謝物（metabolite)轉化成聚經基脂 肪酸酯的單體，以及一種聚羥基脂肪酸酯合成酶 (synthase)利用聚輕基脂肪酸醋的單體合成聚經基脂肪 酸酯聚合物。於真養雷爾氏菌等菌株内進行複製的聚羥 基脂肪酸酯合成酶乃利用羥醯基輔酶 A (hydroxyacyl-CoA)為基質（substrate)，而複製於真養雷爾 氏菌等菌株的 ketothiolase(P/ii^)、acetoacetyl-CoA TQductsise(PhaB)、 複製於假單胞菌屬的 3-hydroxydecanoyl-ACP:CoA transferasei/^izG1)、源於豚 鼠氣單胞菌caWae)和銅綠假單胞菌 {Pseudomona aeruginosa)之(R)-specific enoyl-CoA hydrataseCP/ia^iFukui et al., J. BacterioL, 180:667, 1998; Tsage d a/., Le"., 184:193, 2000)、源於 大腸桿菌（五.co//)和綠膿桿菌 3-ketoacyl-ACP reductase(Fa^G)(Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol., 182:2978, 2000; Park et al.，FEMS Microbiol. Lett·， 214:217，2002)乃習知可用以提供作為聚羥基脂肪酸酯 基質的羥醯基輔酶A之酵素，且不同種類的聚羥基脂肪 酸酯可利用上述酵素將羥基脂肪酸酯在其碳鏈的不同位 置（主要在第3碳、第4碳、第5碳、或第6碳的位置） 上經基化而合成。 然而根據報導，在第2碳的位置進行羥基化的羥基 脂肪酸乃具有較差的聚羥基脂肪酸酯合成酶活性 (activity)(Zhang et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol.,
9 1376417 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. BiotechnoL, 40:699, 1994; Yuan et al., Arch. Biochem. 少/d, 394:87，2001)，而至目前為止，利用聚經基 脂肪酸酯聚合酶（polymerase)在乳酸基輔酶A的試管内 (in vitro)活性試驗所得知之聚經基脂肪酸醋合成酶對乳 酸基輔酶A的活性已有報導，然而聚羥基脂肪酸酯合成 酶對乳酸基辅綠A而言則具有非常弱的活性（Zhang ei al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699,1994)，也就是說沒有例子顯示聚羥基脂肪酸酯和 其共聚物乃經由自然的方式或使用重組細胞或植物而產 生，因為羥基脂肪酸，例如在第2個碳的位置羥基化之 乳酸，乃非適於聚羥基脂肪酸酯合成酶的基質特異性 (substrate specificity) ° 因此，本案申請人乃致力於利用細胞或植物以生產 高分子量的聚乳酸及其共聚物，而結果證實了在一含有 • 乳酸的生產培養基中，聚[羥基脂肪酸-共-乳酸]共聚物 (poly[hydroxyalkanoate-co-lactate] copolymer)可藉由培 養一將源於丙酸梭菌（C/oWni/zMm 之丙酿輔 酶 A 的轉化酶基因（propionyl-CoA transferase gene(pc〇) 轉殖（transform)至基因重組的真養雷爾氏菌中而產生， 而上述丙醯輔酶A的轉化酶基因為一能在含有乳酸的生 產培養基中可編碼成一種將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的 酵素之基因，而聚乳酸則可藉由培養一將源於仙人掌桿 菌cere奶）之聚經基脂肪酸自旨合成酶基因以及 1376417 =明基因轉殖至重組的大腸桿菌中而產生，簡此實現本 【發明内容】 盆丘tt:的目的之一就是提供一種具有產生聚乳酸或 物了聚物如聚（羥基脂肪酸·共·乳酸）之能力的細胞或植 植物另一目的為提供一種藉由培養上述細胞或 植物而製備聚乳酸或其共聚物之方法。 ^達上述與其他目的，在—實施例中，本發明主要 从供―料有產生聚㈣缝基脂肪酸·乳酸共聚物 ::消基脂肪酸-共-乳酸)之能力的細胞或植物，其同時 ς有:種能編碼成-可將乳酸轉化成乳酸基輔酶Α的酵 哲因、和一種能編碼成一可利用乳酸基辅酶A為基 質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因。 在另一實施例中，本發明則提供了一種可用以 酸或經基脂肪酸·乳酸共聚物如聚(經基脂肪酸-共_ i 此方法包括在—包含乳酸或乳酸和經基脂 ”，，土質的培養基中培養上述細胞，以及自上述培 =細匕胞中回收聚乳酸或經基脂肪酸-乳酸共聚物如聚 ^基月曰肪酸-共-乳酸)，或培養上述植物，以及由上述培 養的植物中时聚乳酸或祕脂㈣_乳酸共聚物。 在又 實軛例中，本發明係提供一種用以製備聚乳 11 1376417 k 酸或羥基脂肪酸·乳酸共聚物如聚（羥基脂肪酸·共-乳酸) 的重組載體（recombinant vector) ’其包含了一種能編瑪 成一可將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因、和一 種能編碼成一可利用乳酸基輔酶A作為基質的聚羥基脂 肪酸酯合成酶之基因，以及具有上述重組載體轉殖的細 胞或植物。 在又另一實施例中，本發明提供一種可用以製備聚 乳酸或羥基脂肪酸·乳酸共聚物如聚（經基脂肪酸-共-乳 鲁 酸）之方法，此方法包括在一包含乳酸或乳酸和經基脂肪 酸作為碳源的培養基中培養上述轉殖細胞，以及自上述 培養的細胞中回收聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物’或 - 培養上述轉殖植物，以及由上述培養的植物中回收聚乳 . 酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物。 在又另一實施例中’本發明提供一種羥基脂肪酸-乳 酸共聚物，亦即聚（羥基脂肪酸-共_乳酸），其包含了作為 單體之乳酸’以及一或一以上之經基脂肪酸擇自於一包 鲁 含 3-經丁酸（3-hydroxybutyrate ; 3HB)、3-經戍酸 (3-hydroxyvalerate)、經丁酸（4-hydroxybutyrate ; 4HB)、中鏈長度（6-14個 碳）的 (D)- 3-羥基羧 酸 ((D)-3-hydroxycarboxylic acids)、 3- 經基 丙 酸 (3-hydroxypropionic acid) ' 3- 羥 基 己 酸 (3-hydroxyhexanoic acid) 、3- 羥 基 庚 酸 (3-hydroxyheptanoic acid) ' 3> 羥 基. 辛 酸 (3-hydroxyoctanoic acid)' 3-經基壬酸（3-hydroxynonanoic 12 1376417 acid)、3-經基癸酸（3-hydroxydecanoic acid)、3-經基十一 酸（3-hydroxyundecanoic acid)、3-經基十二酸 (3-hydroxydodecanoic acid) 、 3-經基十四酸 (3-hydroxytetradecanoic acid) 、3-經基十六酸 (3-hydroxyhexadecanoic acid) 、 4-經戊酸 (4-hydroxyvaleric acid)、4-經基己酸（4-hydroxyhexan〇jc acid)、4-經基庚酸（4-hydroxyheptanoic acid)、4-經基辛 酸（4-hydroxyoctanoic acid) 、 4-經基癸酸
(4-hydroxydecanoic acid)、5-經戊酸（5-hydroxyvaleric acid)、5-經基己酸（5-hydroxyhexanoic acid)、6-經基十二 酸（6-hydroxydodecanoic acid)、3-經基-4-戊烯酸 (3-hydroxy-4-pentenoic acid)、3-經基-4-反-己稀酸 (3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid)、3-經基-4-正-己稀酸 (3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid)、3-經基-5-己烯酸 (3-hydroxy-5-hexenoic acid)、3-經基-6-反-辛稀酸 (3-hydroxy-6-trans-octenoic acid)、3-經基-6-正-辛烯酸 (3-hydroxy-6-cis-octenoic acid)、3-經基-7-辛烯酸 (3-hydroxy-7-octenoic acid)、3-經基-8-壬稀酸 (3-hydroxy-8-nonenoic acid) 、3-經基-9-癸烯酸 (3-hydroxy-9-decenoic acid)、3-經基-5-正-十二稀酸 (3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid)、3-經基-6-正-十二烯 酸（3-hydroxy-6-cis-dodecenoic acid)、3-經基-5-正-十四 稀酸（3-hydroxy-5-cis-tetradecenoic acid)、3-經基-7-正-十四烯酸（3-hydroxy-7-cis-tetradecenoic acid)、3-經基 -5,8-正-正_十四烯酸（3-117(11：〇\丫-5,8-<^5-(^5-161^(16〇611〇卜 13 1376417
acid)、3-經基-4-曱基戊酸（3-hydroxy-4-methylvaleric acid)、3-經基-4-曱基己酸（3-hydroxy-4-metliyliexanoic acid)、3-經基-5-曱基己酸（3-hydroxy-5-methylhexanoic acid)、3-經基-6-甲基庚酸（3-hydroxy-6-methylheptanoic acid)、3-經基-4-曱基辛酸（3-hydroxy-4-methyloctanoic acid)、3-經基-5-曱基辛酸（3-hydroxy_5-methyloctanoic acid)、3-經基-6-曱基辛酸（3-11丫(11*〇\丫-6-11161:11>4〇(^&11〇4 acid)、3-經基-7-曱基辛酸（3-hydroxy-7-methyloctanoic acid)、3-經基-4-曱基壬酸（3-hydroxy-6-methylnonanoic acid)、3-經基-7-曱基壬酸（3-hydroxy-7-methylnonanoic acid)、3-經基-8-甲基壬酸（3-hydroxy-8-methylnonanoic acid)、3-經基-7-甲基癸酸（3-hydroxy-7-methyl.decanoic acid)、3-經基-9-曱基癸酸（3-hydroxy-9-methyldecanoic acid) 、 3· 羥基 -7- 曱基 -6- 辛烯酸 (3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid)、經 丁二酸（malic acid) 、3-經基丁 二酸甲 S旨（3-hydroxysuccinic acid-methylester)、3-經基己二酸曱醋（3-hydroxyadipinic acid-methylester)、3-羧基辛二酸甲酯（3-hydroxysuberic acid-methylester)、3-經基癸二酸甲酉旨（3-hydroxysebacic acid-methylester)、3-經基壬二酸曱酉旨（3-hydroxyazelaic acid-methylester)、3-經基辛二酸乙醋（3-hydroxysuberic acid-ethylester)、3-羥基癸二酸乙酯（3-hydroxysebacic acid-ethylester)、3-經基庚二酸丙醋（3-hydroxypimelic acid-prophylester) 、 3-經基癸二酸苯曱酉旨 (3-hydroxysebacic acid-benzylester)、3-經基-8-乙酿氧基 1376417
辛酸（3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid)、3-經基-9-乙酿 氧基壬酸（3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid)、苯氧基-3-經基丁酸(phenoxy-3-hydroxybutyric acid)、苯氧基-3-經 基戊酸(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、苯氧基-3-經基 庚酸（phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid)、苯氧基-3-經基 辛酸（phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid)、對-氰基苯氧基 -3-經基丁酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid)、 對-乱基苯氧基-3-經基戊酸 (para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、對-氰基苯氧 基-3-經基己酸（para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、 對-靖基苯氧基-3-經基己酸 (para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、3-經基-5-苯基戊酸（3-hydroxy-5-phenylvaleric acid)、3-經基-5-環 己基丁酸（3_117(11>〇\7-5-〇>^1〇116\丫11)1^丫14。&(^(1)、3,12-二 經基十二酸（3，12-(1丨11丫<11*〇\丫(1〇(16〇&11〇丨〇&(^(!)、3,8-二經基 -5-正-十四酸（3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid)、3-經基-4,5-環氧癸酸（3-11}^1*〇叉)^-4,5-6卩〇\)^6〇311〇丨〇&(^(1)、 3-經基-6,7-環氧十二酸（3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid) 、經基-8,9- ί哀氧基.-5,6-正-十四酸 (3-hydr〇xy-8,9-epoxy_5,6-cis-tetradecanoic acid)、7-氰基 -3-經基庚酸(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid)、9-氰基 -3-經基壬酸（9-cyano-3-hydroxynonanoic acid)、3-經基-7-氟基庚酸（3-hydroxy-7-fluor〇heptanoic acid)、3-經基-9-氟基壬酸（3-hydroxy-9-fluorononanoic acid)、3-經基-6-氯基己酸（3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid)、3-經基-8-
15 1376417 氯基辛酸（3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid)、3-經基-6-溴基己酸（3-hydroxy-6-bromohexanoic acid)、3-經基-8-溴基辛酸（3-hydroxy-8-bromooctanoic acid)、3-經基-11-漠基十一酸（3-hydroxy-l 1-bromoundecanoic acid)、3-輕 基-2-丁浠酸(3-hydroxy-2-butenoic acid)、6-羥基-3-十二 浠酸（6-hydroxy-3-dodecenoic acid)、3-經基，2-甲基丁酸 (3-hydroxy-2-methylbutyric acid)、3-經基-2-曱基戊酸 (3-hydroxy-2-methylvaleric acid)、以及 3_經基-2,6-二曱 基-5-庚烯酸(3-hydroxy-2,6-dimethyl-5-heptenoic acid)所 組成之族群中。 在又另一實施例中，本發明係提供一種具有3至12 個碳數之3-羥基脂肪酸（3HA)和乳酸的共聚物如聚（3-羥 基脂肪酸-共-乳酸)(poly(3HA-co-lactate))。 為讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更 明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，並配合所附圖式， 作詳細說明如下： 【實施方式】 本發明之一實施例係有關於一種具有產生聚乳酸或 羥基脂肪酸-乳酸共聚物如聚（羥基脂肪酸-共-乳酸）之能 力的細胞或植物，其同時具有一種能編碼成一可將乳酸 轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因、和一種能編碼成一 可利用乳酸基輔酶A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之 基因。 16 1376417 聚生聚乳酸或經基脂肪酸_乳酸共聚物如 二=曰不:=_乳酸)之能力的細胞或植物乃得自 於· W將不具有可柄成聚絲脂肪 =胞或植物轉殖入一種可編碼成一能將乳== I基輔酶A的酵素之基因，以及一種能一 乳酸基_A為基質的聚經基脂肪義旨合成酶之基=; 或（u)將具有一種能編碼成一可利用乳酸 質=2:肪_合成酶之基因的細胞或植物轉= 了種可編碼成—能將乳酸轉化成乳酸基辅酶A的酵素之 土因，或（ln)將具有一種可編碼成一能將乳酸轉化成 酸f輔酶A的酵素的基因之細胞或植物轉殖入一種能編 碼成-可則乳酸基_ A為基f的聚經基脂肪酸醋合 成酶之基因；然本發明並非以此為限。舉例來說，在一 個具有任-上述兩種基因（一種能編碼成一可利 基輔酶A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因、以及 一種可編碼成一能將乳酸轉化成乳酸基辅酶八酵 基因）的細胞中，與其他基因進行上述基因的放大 (amplify)或轉殖應包含在本發明的範圍之中。 在本發明中，可編碼成-能將乳酸轉化成乳酸基輔 酶A的酵素之基因乃較佳包含丙醯辅酶A的轉化酶基因 0^^)，而本發明的細胞或植物乃較佳轉殖入一包含丙醯 輔酶A轉化酶的基因（^以)之重組載體， 含WC基因的載體或咖髮基因:f 染色體（chromosome)令。在此例中，如利用乳酸或羥基 脂肪酸和乳酸作為碳源，則可用以製備聚乳酸或羥基脂 肪酸-乳酸共聚物如聚（羥基脂肪酸_共_乳酸卜另，^編 碼成一可利用乳酸基辅酶A為基質的聚經基脂肪酸=合 17 1376417 成酶之基因乃較佳包含phC基因，而本發明的細胞或 植物乃較佳轉殖入一包含基因之重組載體，同時 轉殖入一包含基因的載體或phC基因則較佳插入 至其染色體中。在此例中，如利用脂肪酸或乳酸作為碳 源’則可用以製備具有3至12個碳數之3-羥基脂肪酸 (3HA)的3-羧基脂肪酸和乳酸之共聚物，如聚(3-經基脂 肪酸·共-乳酸）。
已知多種不同的微生物乃具有編碼聚羥基脂肪酸酯 合成酶的基因之細胞（KR 10-250830 B1)，例如包含 Achromobacter sp.、Achromobacter xylosoxidans 專無色 桿菌屬的槪毛物，包含 Acidovorax delafieldii、Acidovorax facilis ' Acinetobacter sp. x Acinetobacter calcoaceticus ' Acinetobacter Iwoffii 等不動桿菌屬（Acinetobacter·、的微 生物 J 包含 Actinomyces sp. 、 Aeromonas caviae 、 Aeromonas hydrophila、Aeromonas salmonicida 等產_ l 單· 胞菌屬（Jero/nowas)的微生物，包含 d/ca/igewes aeWws、 Alcaligenes denitrificans、Alcaligenes eutrophus[在重新 命名為真養雷爾氏菌之後，乃重新命名為 eutropha) 、 Alcaligenes faecalis 、 Alcaligenes latus 、 Alcaligenes pacificus、Alcaligenes paradoxus、Alcaligenes 等產驗菌屬的微生物，包含 Alteromonas macleodii 、 Amoebobacter roseu 、 Amoebobacter pendens 等可變桿菌屬（Amoebobacter·)的 i 生物，包含 Aphanocapa sp. 、 Aphanothece sp.、 Aquaspirillum autotrophicum 、 Azorhizobium caulinodans ' Azospirillum sp. ' Azospirillum brasilense ' //po/erwm 等固氣螺菌屬 的微
18 1376417 生物，包含 Azotobacter sp. 、Azotobacter agilis、 Azoiobacter chroococcum、Azotobacter macrocytogenes、 Jzoiokcier 等固氮菌屬的微生 物，tl 含 Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus subtillus、Bacillus thuringiensis 專 芽孢桿菌屬CSaczZ/M·?)的微生物，包含sp.、 ίζ/Ζ?α等貝氏硫菌屬（Beggk/oa)的微生物，包含 Beijerinckia indicus、Beijerinckia mobilis 專拜葉林免氏 菌屬α)的微生物，包含 «iziWgews、
Beneckea pelagia等呉內免氏菌屬（Beneckea)的微支物， 包含 Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、 Caryophamon laturrf 、 Caulobacter bacteroides 、 Cflw/okcier crescewiMS 等柄桿菌屬的微生 物，包含 Chloroflexus aurantiacus、Chlorogloea fritschii 等 Chlorogloea菌屬的微±物，包含Chromatium minutissimum ' Chromatium okenii ' Chromatium tepidum 等著色菌屬（CT^romai/wm)的微生物，包含 Chromobacterium violaceum 等 色 桿菌屬 (Chromobacterium)的微 ± 物，包含 Clostridium botulinum、Clostridium sphenoides 等後菌慝（Clostridium) 的微支物 » 包含 Comamonas acidovorans ' Comamonas ZeWoWerowi等叢毛單胞菌屬（Comamow似）的微生物，包 含 Corynebacterium autotrophicum 、 Corynebacterium 等棒桿菌屬的微生 物，包含 等德克斯氏菌 屬（Derxia)的敗支物，包含 Desulfococcus τηιιΙίίν〇γαη3、
Desulfonema limicola ' Desulfonema magnum ^ g
19 1376417
屬的微生物’包含 Desulfosacina variabilis ' Desulfovibrio sapovorans ' Ectothiorhodospira halochloris 、 Ectothiorhodospira mobilis 、 Ectothiorhodospira vacMo/aia 等外硫紅螺旋菌屬 (Ectothiorhodospira)的微支物，包含 Ferrobacillus ferroxidans 、 Flavobacterium sp. 、 Haemophilus influenzae 、 Halobacterium gibbonsii ' Halobacterium volcanii等盤桿菌屬（Halobacterium)的微支物，包含 Haloferax mediterranei 、 Hydroclathratus clathratus 、 Hydrogenomonas facilis 、 Hydrogenophaga flava 、 Hydrogenophaga pseudoflava 、 Hydrogenophaga 等嗔氫菌屬的微生物， 包含 Hyphomicrobium vulgare 等生絲微菌屬 (Hyphomicrobium)的敬 物，匕含 Ilyobater delafieldii、 Labrys monachus 、 Lamprocystis reseopersicina 、 Lampropedia hyaline ' Legionella sp. 、 Leptothrix discophorus ' Methylobacterium AMI ' Methylobacterium 等曱基桿菌屬菌屬的微生 ' tL ^ Methylococcus thermophilus 、 Methlocystis parvus 、 Methylomonas methanica 、 Methylosinus sporium、Methylosinus irichosporium 專罗备灣由菌屬 的微生物，包含 Methylovibrio soehngenii 、 Micrococcus denitrificans 、 Micrococcus 則等微球菌屬（Micrococcrw·?)的微生·物，包 ^ Mycobacterium alburn^ Mycobacterium vacae 菌屬（Mycobacterium)的微支物，包含 Nitrobacter agilis、 Nitrobacter winogradskyi 等罐後菌屬（Nitrobacter)的微
20 1376417 t 物，tl 含 Nocardia alba、Nocardia asteroides、Nocardia lucida、Nocafdia rubra 等謹号氏菌屬（Nocardia)的微支 物，包^含 Paracoccus dentrificans、Oscillatoria limosa、 Penicillium cyclopium ' Photobacterium mandapamensis ' Photobacterium phosphoreum 等發光桿菌屬 (Photobacterium)的敬么物，包含 Physarum ploycephalum 和 Pseudomonas glathei 、 Pseudomonas indigoferu 、 Pseudomonas lemonieri 、 Pseudomonas mallei --Pseudomonas marina ' Pseudomonas mixta ' Pseudomonas
oleovorans 、 Pseudomonas oxalaticus 、 Pseudomonas pseudoalcaligenes 、 Pseudomonas aeruginosa 、 Pseudomonas alcaligenes 、 Pseudomonas asplenii 、 Pseudomonas butanovora 、 Pseudomonas cepacia 、 Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas dacunhae、 Pseudomonas denitrificans 、 Pseudomonas diminuta 、 Pseudomonas echinoides 、 Pseudomonas fluorescens 、 Pseudomonas putida 、 Pseudomonas rubrilineas 、
Pseudomonas saccharophila 、 Pseudomonas stutzeri 、 Pseudomonas syringae 、 Pseudomonas thermophilus 、 v/rfi/(/7ava 等假單胞菌屬的 微生物，青枯菌屬（Ralstonia)的微支物，包含Rhizobium hedysarum 、Rhizobium lupini 、 Rhizobium meliloti ' Rhizobium phaseoli、Rhizobium trifoli 等根瘤菌屬 (Rhizobium)的微支物，紅疏菌屬（RhodobacUlus)的微支 物，包含 Rhodobacter capsulatus 、 Rhodobacter sphaeroides等1工細溘屬（Rhodobacter)的微t物，包含 Rhodococcus rhodochrous 等紅球菌屣（Rhodococcus)的微 1376417 t 物，包含 Rhodocyclus gelatinosus、Rh'odocyclus tenuis 等紅環菌屬的微生物，包含 Rhodomicrobium vannielii 和 Rhodopseudomonas acidophila、Rhodopseudomonas capsulata 專紅假翠脱镜 屨（Rhodopseudomonas)的微支物，tl 含 Rhodospirillum molischianum、Rhodospirillum 等紅螺菌屬
(Rhodospirillum)的微 t 物，包含 Sphingomonas paucimobilis ^ Spirillum itersomii ^ Spirillum serpens 菌屬（5^>///1/历）的微生物，包含 Spirulina jenneri、 Spindina maxima、Spirulina subsaksa 專螺、旋暮屬 (Spirulina)的微支物，包含 Staphylococcus aureus、 Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus xylosus 筹葡 萄球菌屬的微生物，包含 Stella vaewo/izia 等星狀菌屬（*Se//a)的微生物， t 含 Streptomyces antibioticus、Streptomyces coelicolor 等鏈黴菌屬（Are/Momyces)的微生物，包含 Syntrophomonas wolfei ' Thermophilic cyanobacteria、 Thermus thermophilus、Thiobacillus A2、Thiobacillus acidophilus、Thiobacillus versutus 等硫桿菌屬 (Thiobacillus)的德l 毛物，tl 含 Thiocapsa pfennigii 等炎疏 菌屬（Thiocapsa)的微支物，包含 Thiocystis violacea、 Vibrio parahaemolyticus ' Xanthobacter autotrophicus、 Xanthomonas maltophilia、Zoogloea ramigera 專動膝議 屬（Zoogloea)的微±物等。 在另一實施例中，本發明則提供了一種可用以製備 聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物如聚（羥基脂肪酸-共-乳酸）之方法，此方法包括在一包含乳酸或乳酸和經基脂 22 1376417 ^ 肪酸作為石反源的培養基中培養上述細胞，以及自上述培 養的細胞中回收聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物，或^ 養上述植物，以及由上述培養的植物中回收聚乳酸或經 基脂肪酸-乳酸共聚物。 在本發明中，羥基脂肪酸-乳酸共聚物如聚（羥基脂肪 酸-共-乳酸）乃較佳擇自於一包含聚（3_經基丁酸_共_乳酸) (poly(3HB-co-lactate))、聚（4-經基丁酸·共·乳酸） (poly(4HB-co-laetate))、聚（3_ 經基丙酸共-乳酸） φ (p〇ly(3HP-co-lactate))、聚（3_經基丁 酸-共 _4_經基 丁酸_ 共-乳酸）(poly(3HB-co-4HB-co-lactate))、以及聚（3-經基 丙酸-共-4_經基丁酸·共-乳 酸）(poly(3HP-co-4HB-co-lactate))所組成之族群中，然並 * 非以此為限。例如’在本發明所提供之羥基脂肪酸-乳酸 共聚物如聚（羥基脂肪酸-共-乳酸）中，上述羥基脂肪酸可 包含一或一以上擇自於一包含3_羥丁酸、3·羥戊酸、4_ 羥丁酸、中鏈長度（6-14個碳）的（D)_3-羥基羧酸、3-羥基 丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬 φ 酸、3_羥基癸酸、3-羥基十一酸、3-羥基十二酸、3-羥基 十四酸、3-羥基十六酸、4-羥戊酸、4-羥基己酸、4-羥基 庚®^說基辛酸、4-經基癸酸、5-經戊酸、5-經基己酸、 6-羥基十二酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反-己烯酸、 3-羥基-4-正·己烯酸、3_羥基_5_己烯酸、3_羥基_6_反_辛 烯酸、3-羥基-6-正-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基_5·正-十二烯酸、3-沒基-6-正-十二烯酸、3-經基-5-正-十四稀酸、3-經基-7-正-十四烯酸、3-羥基-5,8-正-正-十四烯酸、3-羥基-4-甲 基戍酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-曱基己酸、3-羥 23 1376417 基-6-曱基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基_5_曱基辛 酸、3-羥基-6-曱基辛酸、3_羥基·7_甲基辛酸、3_羥基·4_ 曱基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3· 羥基-7-曱基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基_7_曱基_6二 辛烯酸、羥丁二酸、3-羥基丁二酸甲酯、3_羥基己二酸 曱酯、3-羥基辛二酸甲酯、3_羥基癸二酸甲酯、弘羥基壬 二酸甲酯、3-羥基辛二酸乙酯、3_羥基癸二酸乙酯、弘 羥基庚二酸丙酯、3-羥基癸二酸苯曱酯、3_羥基_8乙醯 氧基，酸、3-羥基-9-乙醯氧基壬酸、苯氧基_3_羥基丁 酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基_3_羥基庚酸、苯氧基-3_ 羥基辛酸、對-氰基苯氧基_3_羥基丁酸、對-氰基苯氧基 -3-羥基戊酸、對-氰基苯氧基_3_羥基己酸、對-硝基苯氧 基-3-羥基己酸、3_經基_5_苯基戊酸、3•經基_5•環己基丁 酸、3，12-二羥基十二酸、3,8_二羥基_5_正-十四酸、3_羥 ^:4,5·環氧癸酸、3老基_6,7_環氧十二酸、3經基-π 環氧基-5,6-正-十四酸、7·氰基_3_羥基庚酸、9氰基-3_ ㈣壬酸、3-經基_7_氟基庚酸、3_經基冬氣基壬酸、> J基-6-氣基己酸、3，基·8_氯基辛酸、3經基·卜溴基己 Γ丁;基辛酸、3々基-11·漠基十一酸、3_經基 烯，、6_經基十二烯酸、3省基_2_甲基丁酸、 所Ϊ: \曱基戊酸、以及3_羥基_2,6·二甲基·5·庚烯酸 所組成之族群中。 酸實施例^ ’本發明係提供一種用以製備聚乳 之^ ί J肪f_礼酸共聚物如聚(羥基脂肪酸-共-乳酸） 乳萨美2 :含了一種能編碼成-可將乳酸轉化成 乳δ的酵素之基因，和一種能編碼成一可利用 土辅扭Α為基質的聚經基脂肪酸醋合成酶之基因，
24 1376417 以及具有上述重組載體轉殖的細胞或植物。 所謂“載體”係指一包含經操作而連接至一適當控制 序列（control sequence)的脫氧核糖核酸（DNA)序列之構 築基因，其可於一合適的宿主（host)中表現上述脫氧核糖 核酸序列的功用。在本發明中，質體載體（plasmid vector)、嗤菌體載體（bacteriophage vector)、黏粒載體 (cosmid vector)、酵母菌人工合成染色體之載體 (YAC(Yeast Artificial Chromosome) vector)均可作為本 發明上述之載體使用，且較佳使用質體載體。一般可使 用於本發明的質體載體乃具有（a)—複製起點（replication origin)，以便有效進行複製，而於每一宿主細胞中包含 有數百個質體載體；（b)—抗藥性基因（antibiotic-resistam gene)，以便於挑選轉殖有質體载體的宿主細胞；以及（c) 一含有酶切位點（restriction enzyme cutting site)的結 構，使一外來基因片段可以插入。而儘管沒有適當的酶 切位點，一載體與一外來基因亦可根據習知方法，而輕 易利用合成的寡核酸轉接子（adaptor)或連接子（linker)而 結合（ligate)。 而當結合後，則可將載體轉殖至一合適的宿主細胞 中。原核細胞（prokaryotic cell)和真核細胞（eukaryotic cell)均可作為本發明中合適的宿主細胞，而更佳為原核 細胞。不具有上述聚羥基脂肪酸酯合成酶的微生物，例 如大腸桿菌，以及具有上述聚羥基脂肪酸酯合成酶的微 生物，其均可用作為合適的原核細胞。另，轉殖入一可 編碼為聚羥基脂肪酸酯合成酶的基因之大腸桿菌可視為 具有上述可編碼聚羥基脂肪酸酯合成酶的基因之微生 25 Kb 1376417 ，物。較佳的大腸桿菌可包含大腸桿菌DH5a、大腸桿菌 JM101、大腸桿菌K12、大腸桿菌W3110、大腸桿菌 X1776、大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene)、以及大腸桿菌 B等，然而大腸桿菌，例如FMB101、NM522、NM538、 或NM539 ’以及其他原核細胞種（Species)屬（genera)等亦 可被使用。.除了上述具有可編碼聚羥基脂肪酸酯合成酶 的基因之火腸桿菌和微生物外，土壤’桿菌屬 (乂例如土壌桿菌A4、芽孢桿菌綱 例如枯草芽抱桿菌swW/以）、腸菌科 鲁 （enterobacteria)例如鼠傷寒沙門氏菌 ί少或黏質沙雷氏菌（《SerraHiz warcescews)等微 生物亦可作為宿主細胞。而一般的真核宿主細胞，例如 酵母菌（yeast)、真菌（fungi)、昆蟲細胞（insect cells)如草 地夜蛾 SF9 細胞（叹/rwg/perc/a (SF9))、動物細 胞如中國倉鼠卵巢細胞（CHO)或鼠細胞、組織培養（tissue cultured)的人類細胞、和植物細胞等亦可被使用。假使 轉殖入了合適的宿主細胞中，在某些情況下，一載體可 不顧宿主基因組（host genome)而進行複製和功能，或者 • 可併入其本身的基因組。 而如此技藝中所熟知之常識，在一宿主細胞中的轉 殖基因欲具有高度表現的程度，需將此基因操作連接至 一所選擇的表達宿主（expression host)中可作用之轉錄 (transcription)、轉譯（translation)、和表現（expression)等 調控序列（regulating sequence)中。上述表現控制序列和 對應的基因乃較佳包含於一表現載體中，而此表現載體 係同時具有細菌選擇性標記基因（bacterial selection marker)及複製起點。在此實施例中，一表達宿主為真核
26 1376417 • 細胞，而上述表現載體則需額外具有一有益於真核宿主 細胞之表現標記（expressi〇n marker)。 上述之轉殖細胞乃藉由前述之表現載體而構成本發 明之另一實施例。在本發明中，所謂“轉殖，，係指脫氧核 糖核酸可作為染色體外之可進行複製的遺傳因子 (factor)，或者藉由引入脫氧核糖核酸而構成整個染色 體’使其如同宿主一般。 並非所有的載體及表現調控序列在表現本發明的脫 • 氧核糖核酸序列上均作用相同，另，並非所有的宿主對 一相同的表現系統均作用相同。然而，熟習此技藝之人 士係可在本發明所揭露的範圍内且不需經由過度試驗的 情況下，而適當選择所需部分的載體、表現控制序列和 宿主等。舉例來說，在選擇載體的過程中必需考量到宿 主因為此载體必需可於上述宿主内進行複製，而載體 的複製數量、調控複製數量的能力、以及由相關載體（例 如抗生素標記基因（antibiotic marker)的表現）所編喝之 其他蛋白質的表現等因素均應被考量，而熟習此技藝之
鲁人士係可於上述變異因數的範圍内，選擇適用於本&明 之多種不同的載體/表現調控序列/宿主之組合。 X 、植物的轉殖亦可藉由習知方法例如使用土壤桿菌屬 或病毒載體（virus vector)而達成，舉例來說，轉殖植物 可^由將一包含有本發明所述之基因的重組載體轉殖入 土壤桿菌屬的微生物中，以及利用上述土壤桿菌屬之轉 殖微生物而感染目標植物的組織等方式而得到。例如， 適用於本發明之轉殖植物係可藉由一種相同或類似於先 前有關於利用轉殖植物而製備聚羥基脂肪酸醋的專利 27 1.376417 (WO 94/11519; us 6, 103, 956)所述之方法而得到。 可用於本發明之轉殖植物係包含菸草（tobacco)、番 茄（tomato)、紅辣椒（red peppers)、豆（beans)、稻㈣十 J^—等’然並非以此為限。$，儘管轉㈣植物為 人士而言，其亦可藉由組織培養等方式而進行
，本發明之又另一實施例中係有關於一種製備聚乳酸 或羥基脂肪酸-乳酸共聚物如聚（羥基脂肪酸共乳酸）之 方法，此方法包括在一包含乳酸或乳酸和羥基脂肪酸作 為碳源的培養基中培養上述轉殖細胞，以及自上述培養 的細胞中回收聚乳酸或羥基脂肪酸_乳酸共聚物，或^養 上述轉殖植物，以及由上述培養的植物中回收聚乳酸或 羥基脂肪酸-乳酸共聚物。 本發明之又另一實施例中係有關於一種羥基脂肪酸 -乳酸共聚物如聚（羥基脂肪酸_共_乳酸），其包含了作為 單體之乳酸，以及一或一以上之經基脂肪酸擇自於一包 籲含3-羥丁酸、3-羥戊酸、4-羥丁酸、中鏈長度（6_14個碳） 的（D)-3-經基缓酸、3-羥基丙酸、3_羥基己酸、3-經基庚 酸、3-經基辛酸、3-經基壬酸、3-經基癸酸、3-經基Ί-- 酸、3·羥基十二酸、3-羥基十四酸、3-羥基十六酸、4-幾戊酸、4-羥基己酸、4-經基庚酸、4-經基辛酸、4-經基 癸酸、5-經戊酸、5-經基己酸、6-經基十二酸、3-經基-4-戊烯酸、3-經基-4-反-己烯酸、3-羥基-4-正-己稀酸、3-經基-5-己烯酸、3-經基-6-反-辛稀酸、3-羥基-6-正-辛烯 酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯 酸、3-經基-5-正-十二烯酸、3-經基-6-正-十二稀酸、3- \<9) 28 1376417 羥基-5-正-十四烯酸、3·羥基_7·正·十四烯酸、3-羥基5 & 正-正-十四烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己 酸、3-經基-5-曱基己酸、3_羥基_6_甲基庚酸、3·經^_4_ 甲基辛酸、3-羥基_5-曱基辛酸、3_羥基_6_f基辛酸"、3_ 羥基-7-甲基辛酸、3·羥基_4_甲基壬酸、3_羥基甲基壬 酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3_羥基_7·曱基癸酸、3_羥 甲基奏酸、3-輕基-7-曱基-6-辛稀酸、經丁二酸、美 丁一酸甲酯、3-經基己二酸甲醋、3-羥基辛二酸甲酯、 3-羥基癸二酸甲酯、3_羥基壬二酸甲酯、3-羥基辛二^乙 酯、3-羥基癸二酸乙酯、3-羥基庚二酸丙酯、3羥基癸二 酸苯甲酯、3·羥基-8-乙醯氧基辛酸、3-羥基-9-乙醯氧基 壬酸、笨氧基-3-羥基丁酸、苯氧基_3_羥基戊酸、苯氧基 -3-羥基庚酸l苯氧基_3_羥基辛酸、對_氰基苯氧基_34 基丁酸、對-氰基苯氧基_3_羥基戊酸、對_氰基苯氧基_3_ 毯基己SiL、對-確基苯氧基_3_經基己酸、經基_5_苯基 戊酸、3-羥基-5-環己基丁酸、3，12_二羥基十二酸、3,$_ ^羥基-5-正-十四酸、3_羥基_4,5_環氧癸酸、3羥基七7_ 環氧十二酸、3-羥基-8,9-環氧基-5,6-正-十四酸、7-氰基 -3-羥基庚酸、9-氰基-3·羥基壬酸、3-羥基_7_氟某庵酴、 辛酸、3-羥基-6-溴基己酸、3-羥基-8-溴基辛酸、3_羥基 -11-溴基十一酸、3-羥基-2-丁烯酸、6_羥基_3_十二烯酸"; 3-羥基-2-甲基丁酸、3_羥基_2_甲基戊酸、以及3_羥基 -2,6-二甲基-5-庚烯酸所組成之族群中。 在本發明中，上述羥基脂肪酸可較佳包含3-羥基丁 酸（3-hydroxybutyrate ; 3HB)和 4-羥基丁酸 (4_hydr〇XybUtyrate ; 3HB)、或者 3-經 ^ 丙酉^
29 1376417 (3-hydroxypropionate ; 3HP)和 4-經基丁酸。 在本發明又一實施例中則提供一種具有3至12個碳 數之3-羥基脂肪酸和乳酸的共聚物如聚（3-羥基脂肪酸_ 共-乳酸）。 在本發明中，上述具有3至12個碳數之3-羥基脂肪 酸和乳酸的共聚物乃較佳包含聚（3-羥基己酸共-3-羥基 辛 酸-共 -3- 輕基蔡酸-共-乳 酸）(poly(3HHx-co-3HO-co_3HD_co-lactate))或聚（3-經基 己酸-共-3-羥基辛酸-共-3-羥基十二酸-共-乳酸） (poly(3HHx-co-3HO-co-3HD-co-3HDD-lactate))。 在本發明中，當將一能編碼成一可將乳酸轉化成乳 酸基輔酶A的酵素之基因（pci)插入至pTac99A中以構築 一表現載體pTac99APct，如第一圖所示，而來自於載體 pTac99APct 之包含了 tac 啟動子（promoter)、前述之 基因、轉錄終止子（transcription terminator)的上述基因片 段則插入至pBBRIMCS中以構築一重組表現載體 pMCSTacPct，如第二圖所示。另，一源自於仙人掌桿菌 (ATCC 14579)之可編碼成聚羥基脂肪酸酯合成酶的基因 則插入至載體pl0499A中，以構築一重組表現 載體pl0499BcRBC，如第三圖所示。此外，將一源自假 單胞菌屬61-3之可編碼成聚羥基脂肪酸酯合成酶的基 因（pkC)放大並且插入至pl0499A中，以構築一重組表 現載體P10499613C2，如第四圖所示。 同時，此技藝人士應當明瞭多種不同的聚羥基脂肪 酸酯及其共聚物係可根據所使用的碳源之種類而製備 30 1376417 (KR 10-250830 Bl; Lee, Biotechnol. Bioeng., 49:1, 1996; Steirlbchel and Valentin, FEMS Microbiol. Lett.^ 128:219, 1995)。而包含3-經基丙酸（3-11丫(!1*〇\>^卩1'〇卩1〇11&16;311卩）、 4-經基丁酸（4-hydroxybutyrate ; 4HB) '3 -羥基丁酸 (3-hydroxybutyrate ;3HB)、 3- 經 基 己 酸 (3-hydroxyhexanoate ；3HHx) 、3- 羥 基 辛 酸 (3-hydroxyoctanoate ；3HO)、 3- 羥 基 葵 酸 (3-hydroxydecanoate ;3HD)、以 及 3-經 基 十二 酸 (3-hydroxydodecanoate; 3HDD)等羥基脂肪酸均可作為一 φ 聚羥基脂肪酸酯之單體。製備一包含不同單體和分子組 成比例的聚經基脂肪酸I旨是可行的，亦即根據使用於培 養基中的碳源，羥基脂肪酸-乳酸共聚物乃包含羥基脂肪 酸，例如3-羥丁酸、3-羥戊酸、4-羥丁酸、中鏈長度（6_ 14 個碳）的（D)-3-羥基羧酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-' 經基庚酸、3_羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3_ 經基十一酸、3-經基十二酸、3 -經基十四酸、3 -經基十六 酸、4-經戊酸、4-羥基己酸、4-經基庚酸、4_經基辛酸、 4-羥基癸酸、5-羥戊酸、5-經基己酸、6-羥基十二酸、3_ • 羥基戊烯酸、3-羥基-4-反-己烯酸、3-羥基-4-正-己烯 酸、3-羥基_5_己烯酸、3-羥基-6-反-辛烯酸、3-羥基_6_ 正-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基 -9-癸烯酸、3_羥基_5_正_十二烯酸、3_羥基_6正-十二$ 西夂3起基-5-正-十四稀酸、3-經基-7-正-十四稀酸、3_ 羥基-5,8-正-正·十四烯酸、3_羥基·4·曱基戊酸、3羥基_4_ 曱基己酸、3-羥基-5-曱基己酸、3-羥基-6-曱基庚酸、3_ &基甲基辛酸、3-經基-5-曱基辛酸、3-經基-6-曱基辛 酸、3-羥基·7_曱基辛酸、3_肆基_4_曱基壬酸、％羥基 31 1376417 .甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-曱基癸酸、3- 备基-9-曱基癸酸、3_羥基_7·曱基-6-辛烯酸、羥丁二酸、 3_經基丁二酸甲酯、3_羥基己二酸曱酯、3-羥基辛二酸曱 酿、3-羥基癸二酸曱酯、3_羥基壬二酸曱酯、3_羥基辛二 酸乙醋、3-羥基癸二酸乙酯、3_羥基庚二酸丙酯、3_羥基 ，二酸笨曱醋' 3-羥基-8-乙醯氧基辛酸、3-羥基_9_乙醯 ^基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯 氧基-3-羥基庚酸、苯氧基_3_羥基辛酸、對-氰基苯氧基 _3,羥基丁酸、對-氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對-氰基苯氧 φ 羥基己酸、對-硝基笨氧基_3_羥基己酸、3_羥基-5_ 笨基戊酸、3-羥基-5-環己基丁酸、3,12-二羥基十二酸、 3,8_二羥基-5-正-十四酸、3_羥基_4,5_環氧癸酸、3-羥基 .:6,7-環氧十二酸、3-羥基-8,9-環氧基-5,6-正-十四酸、7- 氰基-3-羥基庚酸、9_氰基_3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟基庚 文3 &基-9-乱基壬酸、3-經基-6-氯基己酸、3-經基-8_ 氯基辛酸、3·羥基-6-溴基己酸、3-羥基-8-溴基辛酸、3- 羥基-11-溴基十一酸、3_羥基_2_丁烯酸、6羥基_3_十二 烯酸、3-羥基·2_甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸、以及 攀3-經基_2,卜二甲基_5_庚烯酸等。另，除了上述單鍵化合 物外亦可製備包含具有雙鍵或三鍵之經基脂肪酸化合 物作為單體的共聚物。因此，除了上述單鍵化合物外， 本發明所述之“羥基脂肪酸”亦可包含具有雙鍵^三鍵的 羥基脂肪酸化合物。 因此，在此實施例中，使用轉殖入本發明之重组載 體的細胞或植物，可用以製備乳酸和多種不同的羥基脂 肪酸的共聚物如聚（3-羥基脂肪酸_共_乳酸），以及聚乳 酸’例如第五圖至第八圖所示。
32 1376417 * 在此實施例中，使用具有一能編碼成一可利用乳酸 基輔酶A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因的真養. 雷爾氏菌NCIMB11599，並轉殖入一包含丙醯輔酶A的 轉化酶基因（pd)之質體，以得到一重組的真養雷爾氏 菌，且上述之重組的真養雷爾氏菌乃培養於一含有乳 酸、或乳酸和不同的碳源之培養基中，並可製備多種不 同的共聚物之組合。舉例來說，當上述重組的真養雷爾 氏菌乃培養於一包含乳酸的生產培養基中，則可制備— 聚（3-羥基丁酸-共-乳酸），如第五圖所示。另，當:述重 φ 組的真養雷爾氏函乃培養於一包含3-經基丁酸、4·經基 丁酸、以及乳酸的生產培養基中’則可用以製備聚（广二 基丁 S文-共-4-經基丁酸-共·乳酸），如第六圖所示。 . 在此實施例中，一種轉殖有一包含源自於仙人掌桿 菌（ATCC 14579)的；基因之重組載體、與一包含 基因的重組載體之重組大腸桿菌（或者為一轉殖入有 同日^，含；基因和；基因的重組載體之重組的大 腸桿菌）可於一供應乳酸之培養基中進行培養，因而可製 φ 備聚乳酸，如第七圖所示。另，在此實施例中，上述重 組=大腸桿菌可於一供應有乳酸和不同碳源的培養基中 進打培養，因而可用以製備多種不同組合的共聚物。 同時，在KR 10-0447531B1 —案中，在分別含有癸 烯酸（deCenoic acid)和十二烯酸（d〇decen〇 養 基中培養一轉殖有Pl0侧3C2之重組大腸』 WB101，乃製備出一含有3_羥基己酸、3_羥基辛酸、和 3 1基葵&之共聚物以及一含有經基己酸、3-經基 辛Ssl 3經基葵酸和3 -經基十二酸之共聚物。因此，在 33 成ί ’ 一轉殖有源自於假單胞菌屬61_3之可編碑 因的重組载趙之重組大腸桿菌(ί:二 重組的大腸桿菌）乃於—Α女1 土口扪垔，，且載體之 m 、 3有乳酸和脂肪酸的生產培養 丁：養’因而可用以製備一包含3至 , 脂肪酸s旨的單體和乳酸的共聚物如聚㈣ ί歹曰二文)，如第八圖所示。舉例來說，在此實 大腸桿菌乃於一包含乳酸和癸晞酸的培 〜ili二4，因此可用以製備聚（3-經基己酸·共-3- M基蔡酸-共-乳酸），而上述重組的大腸 ^乃》躲供應有乳酸和十二烯酸的料基中進行诗 養’因而可製備聚（3·經基己酸·共_3_經基辛酸_共_3_經^ 十二酸_共_乳酸）。 上述用以製備生物製品聚乳酸和其共聚物的培養基 乃並未特別限制，只要其並未對本發明所欲達成之目的 造成阻礙即可。在本發明中，當培養重組的大腸桿菌時 乃使用一種LB培養基（Luria-Bertani ; LB)之複合培養基 (complex medium)，而當進行重組的真養雷爾氏菌之培 養時，則使用一種缺氮的MR培養基（N_limited medium)之基礎培養基（basic medium)。 實施例 以下，本發明將藉由數個實施例以作詳細說明，然 而所列舉之實施例僅為說明之目的，而並非用以限定本 發明之範圍，任何熟習此技藝者均可在未脫離本發明所 揭不之精神和範圍内完成多種等效改變或修部。
34 1376417 .儘管在以下實施例中係以/7Ci基因作為編碼成一種 將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因，以用於提供 聚羥基脂肪酸酯聚合酶基質和乳酸基輔酶A，然熟習此 技藝之人士顯然可利用源自於其他微生物中的轉化酶而 得到同樣的結果。 另，儘管在以下的實施例中係以源自於假單胞菌屬 61-3的；基因，以及源自於仙人掌桿菌（ATCC 14579) 的基因作為能編碼成一可利用乳酸基輔酶A為 基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因為例，然而熟習此 ® 技藝之人士應明白當聚羥基脂肪酸酯合成酶具有相似的 基質特異性（substrate specificity)源生自不同種類的微生 物，m -kp Wautersia eutropha 、 Alcaligenes latus 、 Sinorhizobium meliloti 、 Bacillus megaterium 、以及 Chromatium vinosum等微支物亦可使用0 另，儘管下列實施例中係以大腸桿菌和真養雷爾氏 菌作為不具有編碼成聚羥基脂肪酸酯合成酶的基因之微 生物的範例，並且以具有編碼成聚羥基脂肪酸酯合成酶 • 的基因之微生物作為範例，然而對於此技藝之人士而 言，當可達到同樣的結果時，亦可使用其他種類的細胞 (細菌、酵母菌、真菌、動物細胞、或植物細胞）或植物 等。 實施例一：構築包含Pd基因的重組載體 具有基序列（basic sequence)為序列識別號1和2的引 子（primer)乃根據；?ci基因序列而合成（Selmer ei a/., ·/. 269:372,2002)，以作為 基因聚合酶連鎖 35 1376417 ，反應（pcr)複製之用： 序列識別號1:
5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAG
ATGA 序列識別號2: 5-gctctagattaggacttcatUccttcagacccattaagccttctg 爲放大基因，利用丙酸梭菌的染色體脫氧核糖核 酸作為模板（template)，以及上述序列識別號為1和2的 • 引子，進行聚合酶連鎖反應。聚合酶連鎖反應的操作乃 於下列條件下進行30次循環:於94°C下進行50秒的變性 反應（denaturation)、在 52°C 下進行 50 秒的退火（annealing) 反應、以及在72°C下進行2分鐘的延伸（extension)反應。 接著利用瓊脂糖凝耀電泳(agarose gelelectrophoresis)測 試聚合酶連鎖反應的反應產物，並且觀察到對應於pci 基因之1.5Kb的基因片段。當利用五限制酵素 對 pTac99A 載體（Park and Lee, «/. 185:5391, 2003)進行切割，將基因插入至pTac99A載體中的 鲁 識別部位（recognition site)以製備 pTac99Pct 重組表現載體，如第一圖所示。另，將得自一利用 限制酵素對pTac99Pct進行切割後所得到的 基因片段插入至利用限制酵素所進行切 割的 pBRRlMCS(Kovach ei a/., 166:175, 1995) 中，以製備成pMCSTacPct，如第二圖所示。 實施例二：構築一包含可編碼成聚羥基脂肪酸酯合成 酶的基因之重組裁體
36 1376417 爲增強兄5C基因的操縱子（〇per〇n)，利用仙人掌 桿菌的染色體脫氧核糖核酸作為模板（template)，以及序 列識別號為3和4的引子，進行聚合酶連鎖反應。聚合 酶連鎖反應的操作乃於下列條件下進行30次循環：；^ 94°C下進行50秒的變性反應、在52°C下進行50秒的退 火反應、以及在72°C下進行2分鐘的延伸反應。 序列識別號3: 5-ggaattcatgaattgtttcaaaaacga
序列識別號4: 5-cgggatccttaattagaacgctcttcaa 接著利用瓊脂糖凝膠電泳測試聚合酶連鎖反應的反 應產物，並且觀察到對應於基因之2.5Kb的基 因片段。當利用限制酵素對pi〇499A載體 (KR 10-0447531B1)進行切割後，將基因插入至 pl0499A載體利用EcoRI/^mHI限制酵素的識別部位 處，以製備pl〇499BcRBC重組表現載體，如第三圖所示。 另，將源自假單胞菌屬61-3之可編碼為聚羥基脂肪 酸酯聚合酶的；?kC基因進行放大，並且插入至pi 0499A 中，以製備一重組表現載體pl0499613C2(KR 10-0447531B1)，如第四圖所示。 實施例三：構築重組真養雷爾氏菌以及利用其製備鞀 基脂肪酸-乳酸共聚物 當藉由實施例一中所製備的pMCSTacPct引入至真 養雷爾氏菌NCIMB11599中而構築重組真養雷爾氏菌 (pMCSTacPct)後，接著進行雙步驟的培養。在一 NB培 1376417 β 養基中（營養液:每公升5公克的蛋白脒(Pept〇ne)，每公 升3公克的牛肉抽出物（Beef extract))培養重組的真養雷 爾氏菌一整夜，將藉由離心所得到的菌株培養於一含有 每公升2公克之缺氮的MR培養基中三天。上述缺氮的 MR培養基之組成如下：6.67公克磷酸二氫卸（κη2Ρ〇4)、4 公克的構酸鼠·一錢（(ΝΗ4)2ΗΡ〇4)、〇.8公克的七水合硫酸 鎂（MgS04 · 7Η20)、0.8 公克的擰檬酸（citric acid)、以 及5毫升的微量金屬溶液。而每公升之上述微量金屬溶 液係包含5毫升之5體積莫耳濃度的鹽酸(HC1)、10公克 φ 的七水合硫酸亞鐵（FeS〇4 · 7Ηζ〇)、2公克的氣化鈣 (CaCl2)、2.2公克的七水合硫酸鋅（ZnS04 . 7H20)、0.5 公克的四水合硫酸猛（M11SO4 · 4H2〇)、1公克的五水合 硫酸銅（CuS’〇4 . 5H2〇)、0.1公克的四水合翻酸敍 ((ΝΗ4)6Μο7〇24 · 4H20)、以及0·02公克的十水合四硼酸 鈉（Na2B402 . 10Η2Ο)。 當藉由離心而得到上述菌株，並且進行冷凍乾燥 (freeze-dried)後’利用三氣甲烷（chl〇roform)對累積於上 述菌株内的聚合物物質進行回收。而經由對上述回收的 聚合物所進行之磁核共振（NMR)分析結果，證實了上述 所回收的聚合物物質為聚（3-羥基丁酸-共_乳酸）之共聚 物，如第九圖和第十圖所示。 實施例四：構築重組大腸椁菌以及利用耸製備聚乳酸 和經基脂肪酸-乳酸共聚物 將實施例一中所製備的pMCSTacPct、以及實施例二 中所製備的pl〇499BcRBC引入至大腸桿菌XLl-Blue中 以構築重組的大腸桿菌，並且在一含有每公升2公克的 1376417 乳酸之LB培養基中進行培養4天，接著再進行離心以 ^收上述g株。上述所回收的菌株乃接著進行冷;東乾 並且利用三氯甲垸對累積於上述菌株中的聚合物物 質進行回H經由對上述回㈣聚合物所進行之磁核 ^振分析結果’證實了上述所回收的聚合物物質為聚乳 k ’如第-]—圖所示。 另，將實施例一中所製備的pMCSTacPct、以及實施 例二中所製備的Pi(M99613C2引入至大腸桿菌WB1〇1 『311〇(fadB::Km)]中以構築重組的大腸桿菌，而大腸桿 j WB1G1為-認為可如同⑽突變株的大腸桿菌般而 有效生產中鏈聚羥基脂肪酸酯（KR 1〇_〇44753bi)的菌 株。將上述重組的大腸桿菌WB1〇1分別於一含有每公升 2公克的乳酸、以及每公升2公克的癸烯酸之lb培養基 、進行培養4 X ’接著再進行離心以回收上述菌株。上 述所回收的g株乃接著進行冷綠燥，並且湘三氣甲 ^對累積於上述g株中的聚合物物質進行回收。而經由 、上述回收的聚合物所進行之磁核共振分析結果，證實 I上述所回收的聚合物物質為聚（3_經基己酸共_3_經基 辛馱-共-3-羥基葵酸_共_乳酸）之共聚物。 雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並 I ，疋本發明’任何熟習此技藝者，在未脫離本發 ^所揭不之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含 在下述之申請專利範圍内。 工業應用.½ 一種能表現一可編碼成 如上所詳述，本發明係提供 、么) 39 1376417 一將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因、和一種& 編碼成一可利用乳酸基輔酶A為基質之聚羥基脂肪酸= 合成酶的基因之細胞或植物，以及一種可利用上述細胞 或植物而製備聚乳酸或羥基脂肪酸_乳酸共聚物之方 法:而根據本發明，可利用細胞或植物而製備聚乳酸， 並可用以製備包含乳酸和多種羥基脂肪酸作為單體之多 種不同的聚酯。

Claims (1)

  1. .X 1-376417
    申請專利範圍： 公# I _________ 、、 一種製備聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物之方 法丄包括：將具有產生聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物 月b力的、.、田胞於包含乳酸、或乳酸和多種經基脂肪酸 作為碳源的培養基中進行培養，其中，該細胞包含一種 可編碼成一將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因、 以及-種能編碼成—可利用乳酸基辅酶A為基質的聚經 酶之基因’而該可編碼成該將乳酸轉化 ^ ^ ^酶的酵素之基因包含丙醯輔酶Α的轉化酶 二而可利用乳酸基辅酶A為基質的聚羥基 月曰肪酸酉曰合絲之基因包含咖匸基因或咖就基因； if所培養的細胞中回收聚乳酸或羥基脂肪酸-礼酸共聚物。 2.如申請專利範圍帛1項所述之製備聚乳酸或羥基 1 旨，乳酸共聚物之方法，其中該具有產生聚乳It: 基月曰肪酸-乳酸共聚物之能力的細胞係藉由將-不且有 成將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因的細 fit —種可編碼成—將乳酸轉化成乳酸基辅酶A的 為A質二一種能編碼成一可利用乳酸基輔酶A 為基質的聚焱基脂肪酸酯合成酶之基因。 3·如申請專利範圍第2項所述之 月旨，-乳酸共聚物之方法，其中上述細胞係轉殖= 包二：，基因之重組載體’並且同時轉殖入有一包含 ^或基因之載體、或將咖 如基因插入至該載體之染色體中。 囚及 1 1376417 2項所述之製備聚乳酸或經基 上述不具有可編碼成將 的酵素之基因的細胞包含大腸 4.如申請專利範圍第 脂肪酸-乳酸共聚物之方法 乳酸轉化成乳酸基辅酶A 桿菌。 5.如 脂肪酸-二專聚 ;聚:之?基脂肪酸乃方包
    酸、3._ 酸、3.n(m 3-羥基辛酸、3_羥基壬酸、3·羥基癸酸、％羥基十一酸、 3- 羥基十二酸、3_羥基十四酸、3_羥基十六酸、4·羥戊酸、 4- 羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4_羥基癸酸、5_ 經戍酸、5-經基己酸' 6_經基十二酸、3_經基冰戍烯酸、 3-羥基-4-反-己烯酸、3·羥基-4-正-己烯酸、3_羥基_5己 烯酸、3-羥基-6-反·辛烯酸、3-羥基-6-正-辛烯酸、3_羥 基-7-辛烯酸、3-經基-8-壬烯酸、3-經基-9-癸烯酸、3-羥 基-5-正-十一缔酸、3-經基-6-正-十二婦酸、3-經基_5-正_ 十四烯酸、3-羥基-7-正-十四烯酸、3·羥基-5,8-正-正-十 四稀酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-經基-4-曱基己酸、3-經 基-5-曱基己酸、3-經基-6-曱基庚酸、3-經基-4-曱基辛 酸、3-經基-5-甲基辛酸、3-經基-6-甲基辛酸、3-經基-7-甲基辛酸、3-羥基-4-甲基壬酸、3·羥基-7-曱基壬酸、3-經基-8-曱基壬酸、3-經基-7-曱基癸酸、3-經基-9-曱基癸 酸、3-經基-7·甲基-6-辛稀酸、經丁二酸、3-經基丁二酸 甲酯、3-羥基己二酸甲酯、3-羥基辛二酸甲酯、3-羥基癸 二酸曱酯、3-羥基壬二酸曱酯、3·羥基辛二酸乙酯、3-羥基癸二酸乙酯、3_羥基庚二酸丙酯、3-羥基癸二酸苯 2 1376417 曱酯、3·羥基-8·乙醯氧基辛酸、3_羥基_9_乙醯氧基壬 酸、苯氧基_3_羥基丁酸、笨氧基_3_羥基戊酸、苯氧基_3_ 羥基庚酸、本氧基-3-羥基辛酸、對_氰基苯氧基羥基 丁酸、對-氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對_氰基苯氧基_3_羥 基己酸、對-確基笨氧基-3-經基己酸、經基_5_苯基戊 酸、3-羥基-5-環己基丁酸、3，12•二羥基十二酸、3,8-二 羥基-5-正-十四酸、3-羥基-4,5-環氧癸酸、3_羥基_6,7_環 氧十二酸、3-羥基-8,9-環氧基_5,6_正_十四酸、7•氰基_3· 羥基庚酸、9·氰基_3_羥基壬酸、3-羥基·7_氟基庚酸、3_ ^羥基氟基壬酸、3_羥基_6-氯基己酸、3-羥基_8_氣基辛 酸、3-羥基-6-溴基己酸、3-羥基溴基辛酸、3_羥基d卜 溴基十一酸、3-羥基-2-丁烯酸、6•羥基_3_十二烯酸、夂 羥基-2-甲基丁酸、3-羥基_2_甲基戊酸、以及夂羥基 -2,6-二曱基-5-庚稀酸所組成之族群中。 6. 如申請專利範圍第5項所述之製備聚乳酸或羥基 脂肪酸-乳酸共聚物之方法，其中上述羥基脂肪酸-乳酸 共聚物係擇自於一包含聚（3_羥基丁酸_共乳酸）、聚ΜΙ 經基丁 共-乳酸）、聚（3-經基丙酸-共-乳酸）、聚（3_經基 丁酸-共-4-羥基丁酸-共-乳酸）、以及聚（3_羥基丙酸-共·4_ 經基丁酸-共-乳酸）所組成之族群中。 7. 種製備一共聚物之方法，該共聚物為具有3至 12個碳數的3-羥基脂肪酸和乳酸之聚（3_羥基脂肪酸-共_ 乳酸）共聚物，而此方法包括：將具有產生聚乳酸或羥基 月曰肪酸-乳酸共聚物之能力的細胞於一包含乳酸和脂肪 酸作為碳源的培養基中進行培養，其中，該細胞包含一 種可編碼成一將乳酸轉化成乳酸基辅酶A的酵素之基 13.76417 = 成一可利用乳酸基辅酶A為基質的 轉化二基輔 =編碼成該將乳酸 ==成酶之基因包含_基酶因或為上= Α ΐ 養的細胞中回收具有3至12個碳數 =-。錄脂肪酸和乳酸之聚（3·經基脂肪酸·共·乳酸）共 %
    法利範圍第7項所述之製備—共聚物之方 处Α4 有產生聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物之 成將乳酸轉化成乳 =轉化成乳酸基種 酸基辅酶A為基質的聚經基脂肪酸醋 法，9甘ί中請專利範圍第8項所述之製備—共聚物之方 上述細胞係轉殖入有一包含夕以基因之重組載 夕并Μ且同時轉殖入有一包含基因或基因 染色體中或將p/iac基因或基因插入至該載體之 10.如中請專利範圍第7項所述之製備—共聚物之方 、二中該共聚物為聚（3_經基己酸-共-3-經基辛酸-共-3-葵酸-共·乳酸）共聚物，而該脂肪酸包含癸稀酸，該 ^基知肪酸包含3_羥基己酸、3_羥基辛酸、和3羥基 蔡酸。 4 1376417 如申請專利第7項所述之製備一共聚物之方 羥A + 一^共聚，聚(3_經基己酸-共_3_經基辛酸-共-3- ^^ 7 -共-乳酸）共聚物，而該脂肪酸包含十二烯 脂肪酸包含3·經基己酸、玲基辛酸、ί 迕基4¾、和3•羥基十二酸。 法，1聚ί酸或經基脂肪酸-乳酸共聚物之方 物之能力^物有/中生，m基脂肪酸-乳酸共聚 s轉化成乳醆基輔酶“酵素二== A的酵素之美成該將乳酸轉化成乳酸基辅酶 成酶之基因包含崎因或=聚基 基脂2 2 _乳酸或羥 _旨肪酸-乳酸 有可編碼成將乳酸轉化成乳酸im:由將-不具 的酵素之基因轉化成乳酸基輔酶A …質的聚經基脂肪酸二 用乳酸基輔酶 14.如申請專利範圍第 基:旨r_乳酸共聚物之方法，其中丄述 匕δ /?ci基因之重組載體， ’、轉殖入有 —基因或一基因之載體:或:二有二 所培養的植物中回收聚乳酸或經基脂二^ 5 1376417 基因插入至該載體之染色體中。 15. —種製備聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物之方 法」包括：將具有產生聚乳酸或羥基脂肪酸乳酸共聚物 之能力的之細胞於一包含乳酸、或乳酸和多種羥基脂肪 酸作為碳源的培養基中進行培養，其中，該細胞係藉由 將一具有一種能編碼成一可利用乳酸基辅酶A為基質的 聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因的細胞或植物轉殖入一種 I編碼成一將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因而 得，而該可編碼成該將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素 之基因包含丙醯輔酶A的轉化酶基因仏以基因），而可利 用乳酸基辅酶A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因 包含基因或基因；以及自上述所培養的細 胞中回收聚乳酸或羥基脂肪酸_乳酸共聚物。 16. 如申請專利範圍第15項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸-乳酸共聚物之方法，其中上述具有一種能編碼 f一可利用乳酸基輔酶A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成 酶之基因的細胞乃一同隨著該可編碼成聚羥基脂肪酸酯 合成酶的基因進行放大。 17. 如申請專利範圍第15項所述之製備聚乳酸或羥 基月a肪酸-乳酸共聚物之方法，其中該具有能編碼成可利 用乳酸基辅酶A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因 的細胞乃擇自於一由包含產氣單胞菌屬⑽似）的 ,微生物、無色桿菌屬（心/^則⑽）的微生物、含 Jczi/ovorax 和 Jc/c/ovorio: 之不動桿菌 屬（Acinetobacter)的微支物、放緣菌屬的微 生物、產驗菌屬的微生物、交替單胞菌屬 6 1376417 (乂/化"〇»2〇«似）的微生物、可變桿菌屬（^4所〇6办〇6〇0化，）的微 生物、含 Aphanocapa sp. 、 Aphanothece sp. 、 Aquaspirillum autotrophicum、Azorhizobium caulinodans 和sp之固氮螺菌屬（乂zc^/?zW//wm)的微生 物、固氮菌屬的微生物、芽抱桿菌屬 (5ac///w*s)的微生物、貝氏硫菌屬的微生物、 拜葉林克氏菌屬的微生物、貝内克氏菌.屬 (Beneckea)的薇么物、含 Bordetella pertussis、 Bradyrhizobium japonicum 和 Caryophamon latum 之柄得 菌屬（Caw/Macier)的微生物、菌屬的微生 物、著色菌屬（C/irowfli/wm)的微生物、色桿菌屬 (Chromobacierium)的槪支物、後菌屬（Clostridium)的微 生物、叢毛單胞菌屬的微生物、棒桿菌屬 (Cor少weftacier/wm)的微生物、藻青菌屬 的微生物、德克斯氏菌屬（Z)er:u‘fl)的微生物、脫硫線菌屬 的微生物、含 vanflftz·//·?和 Desulfovibrio •sapovora/i·?之外硫紅螺旋菌屬 (Ectothiorhodospira)的微生物、含 Ferrobacillus ^ ferroxidans 、 Flavobacterium sp.和 Haemophilus influenzae之盤桿菌屬（Halobacterium)的微支物、含 Haloferax mediterranei ' Hydroclathratus clathratus 和 Hydrogenomonas facilis Μ, Μ M (Hydrogenophaga)^] 微支物、支線微菌屬（Hyphomicrobium)的微支物、含 Ilyobacter delafieldii、Labrys monachus、Lamprocystis reseopersicina、Lampropedia hyalina、Legionella sp.和 Leptothrix discophorus 之罗 l得菌饜（Methylobacterium) 的微生物、曱基彎曲菌屬的微生物、微球 7 1376417 菌屬（Mz'crococcws)的微生物、分枝桿菌屬 的微生物、硝酸菌屬（A^rMcfcier)的微生物、諾卡氏菌屬 的微生物、含ParacoccM·? 、 Oscillatoria limosa 和 Penicillium cyclopium 之發先择镜 屬（Phoiobacterium)的微支物、含 Physamm ploycephalum 之假單胞菌屬（尸的微生物、青枯菌屬 (/^/以〇⑴·α)的微生物、根瘤菌屬（及/zizM/wm)的微生物、 紅硫菌屬（/^oi/okc/Z/ws)的微生物、紅細菌屬 (Rhodobacier)的微支物、紅球菌屬（Rhodococcus)的微支 物、江環菌屬（Rhodocyclus)的微支物、含 Rhodomicrobium vannielii之t工假單胞菌屬（Rhodopseudomonas)的微主 物、红螺、菌凰（Rhodospirillum)的敬;L 物、含 Sphingomonas paucimobilis之螺、菌屬（Spirillum)的数支物、螺旋蘇屬 的微生物、葡萄球菌屬少/ococcms)的微生 物、星狀菌屬（57e//a)的微生物、鏈黴菌屬（•Sirepiow少ces) 的微生物、含 Syntrophomonas wolfei、Thermophilic cyanobacteria、Thermus thermophilus 和 Thiobacillus A2 之硫桿菌屬的微生物、笑硫菌屬（77n’OCflJ!75iZ) 的敬支物、以反含 Thiocystis violacea、Vibrio parahaemolyticus 、 Xanthobacter autotrophicus Xanthomonas maltophilia 之動膠遠凰（Zoogloea)的微支 物所組成之族群中。 18.如申請專利範圍第15項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸-乳酸共聚物之方法，其中上述羥基脂肪酸-乳 酸共聚物之羥基脂肪酸乃包含一或一以上擇自於一包含 3-羥丁酸、3-羥戊酸、4-羥丁酸、中鏈長度（6-14個碳） 的（D)-3-羥基羧酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚 8 1376417 酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一 酸、3-羥基十二酸、3-羥基十四酸、3·羥基十六酸、4-羥戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基 癸酸、5-羥戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二酸、3-羥基-4-戊稀酸、3-經基-4-反-己稀酸、3-經基-4-正-己稀酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反-辛烯酸、3-羥基-6-正-辛烯 酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯 酸、3-羥基-5-正-十二烯酸、3-羥基-6-正-十二烯酸、3-羥基-5-正-十四烯酸、3-羥基-7-正-十四烯酸、3-羥基·5,8-% 正-正-十四烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-曱基己 酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-曱基辛酸、3-羥基-5-曱基辛酸、3-羥基-6-曱基辛酸、3_ 羥基-7-曱基辛酸、3-羥基-4·甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬 酸、3-羥基-8-曱基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-曱基癸酸、3-羥基-7-曱基-6-辛烯酸、羥丁二酸、3-羥基 丁二酸曱酯、3-羥基己二酸曱酯、3-羥基辛二酸甲酯、 3-羥基癸二酸曱酯、3_羥基壬二酸甲酯、3-羥基辛二酸乙 ^ 酯、3-羥基癸二酸乙酯、3-羥基庚二酸丙酯、3-羥基癸二 酸苯曱酯、3-羥基-8-乙醯氧基辛酸、3-羥基_9_乙醯氧基 壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基 -3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對-氰基苯氧基_3_羥 基丁酸、對-乱基苯氧基-3-經基戊酸、對-氰基笨氧基_3_ 羥基己酸、對-硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基_5-苯基 戊酸、3-羥基-5-環己基丁酸、3,12-二羥基十二酸、3,8· 二羥基-5-正-十四酸、3-羥基-4,5-環氧癸酸、3_羥基_6 7_ 環氧十二酸、3·羥基-8,9-環氧基_5,6_正_十四酸、7氰基 •3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3_羥基_7_氟基庚酸 1376417 3-羥基-9-氟基壬酸、3_羥基_6_氯基己酸、3羥基_8_氯基 辛酸、3-羥基-6-溴基己酸、3_羥基·8_溴基辛酸、3_羥基 -11-溴基十一酸、3-羥基-2-丁浠酸、6-羥基-3-十二烯酸、 3-羥基-2-曱基丁酸、3_羥基·2_曱基戊酸、以及弘羥基 -2,6-二甲基-5-庚烯酸所組成之族群中。 19. 如申請專利範圍第18項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸-乳酸共聚物之方法，其中上述羥基脂肪酸_乳 酸共聚物係擇自於一包含聚（3_羥基丁酸_共_乳酸）、聚（4_ % 羥基丁酸-共-乳酸）、聚（3-羥基丙酸-共-乳酸）、聚（3-羥基 丁酸-共·4-羥基丁酸-共-乳酸）、以及聚（3_羥基丙酸-共_4_ 羥基丁酸-共·乳酸）所組成之族群中。 20. —種製備聚乳酸或羥基脂肪酸_乳酸共聚物之方 法，包括：培養具有產生聚乳酸或羥基脂肪酸乳酸共聚 物之能力的之植物，其中，該植物係藉由將一具有一種 能編碼成一可利用乳酸基辅酶Α為基質的聚羥基脂肪酸 酯合成酶之基因的植物轉殖入一種可編碼成一將乳酸轉 化成乳酸基輔酶A的酵素之基因而得，而該可編碼成該 將乳I轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因包含丙醯輔酶 A的轉化酶基因㈣基因），而可利用乳酸基輔酶a為基 質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因包含尸基因或 凡5C基因，以及自上述所培養的植物中回收聚乳酸 羥基脂肪酸-乳酸共聚物。 2如申凊專利範圍第20項所述之製備聚乳酸或羥 ^脂肪酸·乳酸共聚物之方法，其中上述具有—種能編碼 成一可利用乳酸基輔酶A為基質的聚經基脂肪酸醋合成 轉之基因的植物乃-同隨著該可編碼成聚經基脂肪酸醋 u/b417 合成酶的基因進行放大。 、22.種製備聚乳酸或經基脂肪酸-乳酸共聚物之方 :二，括:將具有產生聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物 :士之細胞於一包含乳酸、或乳酸和多種羥基脂肪酸 源的培養基中進行培養，其中，該細胞係藉由將 :八有-種可編碼成-將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵 ^之基因的細胞轉殖人—種能編碼成—可利用乳酸基辅 A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因而得到，而 該可編碼成該將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因 J含丙醯輔酶A的轉化酶基因如基因），而可利, 土輔酶A為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因包含 MaC基因或咖灿(：基因；以及自上述所培養的細胞中 回收聚乳酸或經基脂肪酸_乳酸共聚物。 23. 如申請專利範圍第22項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸·乳酸共聚物之方法’其中上述具有一種可編碼 成一將^酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基因的細胞乃 一同隨著該可編碼成一將乳酸轉化成乳酸基辅酶A的 素之基因進行放大。 24. 如申請專利範圍第22項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸-乳酸共聚物之方法，其中上述可編碼成一將乳 酸，化成乳酸基輔A的酵素之基因的細胞乃包含丙酸 後菌（Clostridium propionicum)。 25·如申請專利範圍第22項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸-乳酸共聚物之方法’其中上述經基脂肪酸乳 酸共聚物之羥基脂肪酸乃包含一或一以上擇自於一 11 1376417 3-羥丁酸、3-羥戊酸、4_羥丁酸、中鏈長度（614個碳 的（D) 3-說基叛酸、3-經基丙酸、3-經基己酸、3·經基庚 酸、3-羥基辛酸、3_羥基壬酸、3羥基癸酸、3_羥基十一 酸、、3-羥基十二酸、3_羥基十四酸、3•羥基十六酸、4· 羥戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4_羥基 癸酸、5-羥戊酸、5-羥基己酸、6_羥基十二酸、3羥基 Α烯酸、 3-羥基 反-己烯酸、 3-羥基-4-正-己烯酸、 3_ 羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反·辛烯酸、3-羥基-6-正-辛烯 酸3-故基-7-辛烯酸、3-經基_8_壬烯酸、3-經基-9-癸稀 零酸、3-經基-5-正-十二稀酸、3_經基_6•正_十二稀酸、3_ 羥基-5-正-十四烯酸、3_羥基_7_正_十四烯酸、3羥基_5,8_ 正-正-十四烯酸、3-羥基_4_曱基戊酸、3_羥基_4·甲基己 酸、3-羥基-5-曱基己酸、3_羥基_6_曱基庚酸、3•羥基_4_ 甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3_羥基_4_甲基壬酸、3羥基_7•曱基壬 酸、3-羥基_8_曱基壬酸、3_羥基_7_甲基癸酸、3羥基_9· 曱基癸酸、3-經基-7-曱基-6-辛烯酸、經丁二酸、3-經基 φ 丁二酸曱酯、3-羥基己二酸曱酯、3_羥基辛二酸曱酯、 3經基癸一酸曱自旨、3 -經基壬二酸曱醋、3 -經基辛二酸乙 酯、3-羥基癸二酸乙酯、3_羥基庚二酸丙酯、3羥基癸二 酸笨曱酯、3-羥基-8-乙醯氧基辛酸、3·羥基-9-乙醯氧基 壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基_3_羥基戊酸、苯氧基 _3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對-氰基苯氧基_3_羥 基丁酸、對-氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對-氰基苯氧基_3-經基己酸、對-硝基苯氧基_3_羥基己酸、3-羥基-5-苯基 戊酸、3-羥基-5-環己基丁酸、3,12-二羥基十二酸、3,8-二經基-5-正-十四酸、3-羥基-4,5-環氧癸酸、3-經基-6,7- 12 1376417 琢乳十一酸、3-經基-8,9-環氧基-5,6-正-十四酸、7-氛基 -3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟基庚酸、 3-羥基-9-氟基壬酸、3·羥基_6•氣基己酸、3•羥基_8氣基 辛酸、3-沒基_6_溴基己酸、3-經基-8-溴基辛酸、3-經基 -11-溴基十一酸、3_羥基_2_丁烯酸、6_羥基·3十二烯酸二 3-羥基-2-甲基丁酸、3_羥基_2_甲基戊酸、以及3_羥基 -2,6-二甲基-5-庚烯酸所組成之族群中。 26.如申請專利範圍第25項所述之製備聚乳酸或羥 _基脂肪酸·乳酸共聚物之方法，其中上述㈣脂肪酸·乳 酸共聚物係擇自於一包含聚（3_羥基丁酸_共_乳酸）、聚 羥基丁酸-共·乳酸）、聚（3_羥基丙酸_共_乳酸）、聚羥基 工酸-共經基丁酸-共·乳酸）、以及聚（3·㈣丙酸 經基丁酸-共-乳酸）所組成之族群中。 27. -種製備聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物之方 法，包括：培養具有產生聚乳酸或經基脂肪酸-乳酸政聚 物之能力之植物，其中’該植物係藉由將一具有一種；
    化成乳酸基輔酶八的酵素之基因的細 J轉二入-種此、編碼成一可利用乳酸基輔酶A為基質的 聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因而得到，而該可編碼成該 二礼酸轉化成乳酸基辅酶A的酵素之基因包含丙醯輔心 A的轉化酶基因㈣基因），而可利用乳酸基輔酶a 質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因包含 因= 經基脂肪酸·乳酸共聚物。°養的植物中时聚乳酸或 項所述之製備聚乳酸或羥 其中上述具有一種可編碼 28.如申請專利範圍第27 基脂肪酸-乳酸共聚物之方法， 13 1376417 成y將，酸轉化成乳酸基辅酶A的酵素之基因的植物乃 一同隨著該可編碼成一將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵 素之基因進行放大。 29. —種基因重組載體，其可用以製備聚乳酸或羥 f脂肪酸-乳酸共聚物’且其中上述基因重組載體係包含 一種可編碼成一將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之基 因、以及一種能編碼成一可利用乳酸基輔酶A為基質的 聚經基脂肪酸醋合成酶之基因’而該可編碼成該將乳酸 %轉^成乳酸基輔酶A的酵素之基因包含丙醯輔酶A的轉 =酶基因（pci基因）’而可利用乳酸基輔酶a為基質的聚 •經基脂肪酸酯合成酶之基因包含如^^基因或如基 因。 30. 如申請專利範圍第29項所述之基因重組載體， ^中該能編碼成該可利用乳酸基輔酶A為基質的聚羥基 脂肪酸i旨合成酶之基因為一種能編碼成—用以合成^ 3至12個奴數之聚經基脂肪酸g旨的酵素之基因。 31. 如申°月專利範圍第30項所述之基因重組載體， ^中該能編碼成一用以合成具有3至12個碳數之聚羥基 脂肪酸酯的酵素之基因包含源自於假單胞菌屬 sp )的 基因。 、32. 一種製備聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物之方 法，包括：將一轉殖之細胞於一包含乳酸、或乳酸和多種 羥基脂肪酸作為碳源的培養基中進行培養，其中，該轉 殖之細胞由一可用以製備聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共 聚物的基因重組載體轉殖而成，且該基因重組載體係& 13/6417 含一種可編碼成一將乳酸轉化成乳酸基輔酶A的酵素之 基因、以及一種能編碼成一可利用乳酸基辅酶A為基質 的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基因，而該可編碼成該將乳 酸轉化成乳酸基’辅酶A的酵素之基因包含丙醯辅酶A的 轉化酶基因（pci基因），而可利用乳酸基輔酶A為基，質的 聚經基脂肪酸S旨合成酶之基因包含p/iflC基因或 基因；以及自上述所培養的細胞中回收聚乳酸或羥基脂 肪酸·乳酸共聚物。 33. 如申請專利範圍第32嗔#方誇洪中該能編碼成該可 _ 利用乳酸基輔酶Α為基質的聚羥基脂肪酸酯合成酶之基 因為一種能編碼成一用以合成具有3至12個碳數之聚羥 基脂肪酸酯的酵素之基因。 34. 如申請專利範圍第33項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸-乳酸共聚物之方法，其中該能編碼成一用以合 成具有3至12個碳數之聚羥基脂肪酸酯的酵素之基因包 含源自於假單胞菌屬sp.)的p/zizC1基因。 (. 35. —種製備聚乳酸或羥基脂肪酸-乳酸共聚物之方 法，包括：培養一轉殖之植物，其中，該轉殖之植物由一 可用以製備聚乳酸或羥基腊肪酸-乳酸共聚物的基因重 組載體轉殖而成，且該基因重組載體係包含一種可編碼 成一將乳酸轉化成乳酸基辅酶A的酵素之基因、以及一 種能編碼成一可利用乳酸基輔酶A為基質的聚羥基脂肪 酸酯合成酶之基因，而該可編碼成該將乳酸轉化成乳酸 基輔酶A的酵素之基因包含丙醯辅酶A的轉化酶基因 基因），而可利用乳酸基輔酶A為基質的聚羥基脂肪 酸酯合成酶之基因包含基因或凡5C基因；以及 15 自上述所培養的植物中回收聚乳 共聚物。 酸或經基脂肪酸-乳酸 36.如申請專利範圍第 基脂肪酸·乳酸共聚物之方法，1二之製備聚乳酸或羥 乳酸基辅酶A為基質的心能編碼成該可利用 -種能編碼成一用：合成酶之基因為 肪酸醋的酵素之：因:成具有3至12個碳數之聚經基脂 37.如申請專利範圍第36項所述之製備聚乳酸或羥 基脂肪酸·乳酸共聚物之方法，其中該能編碼成一用以合 成具有3至12個碳數之聚羥基脂肪酸酯的酵素之基因包 含源自於假單胞菌屬Sp.)的如aC基因。 1376417.
    1376417
    第四圖 1376417
    葡萄糖 乳酸
    4-¾基 丁酸一 3-羥基 丙酸— 葡萄塘 乳狻
    丙明酸 乙醯輔病：A 乳酸基辅裔A 4-羥丁 聚羥基脂肪 酸鮮IA奠 ο-β S,聚羥基脂肪 ㈣合成e |聚羥基脂肪 丄酸酯合成麻
    聚(4-羥基丁酸-共-乳酸-共-3- / 羥基丙酸)顆％-^ 第六圖 1376417
    葡萄糖 乳黢
    FadD, 醯基】 «ξ商A 6磷酸i 5萄糖取 丨故 (Acyl-CoA) Pet 3-酮醯基 神A (3-Ketoacyl -CoA) ^fadA FadE\ 脂肪酸/9氡化途徑 (Fatty acid沒-烤Si基稱濟A oxidation pathway) (Enoyl-CoA) VFadB Fai Lbh.i
    FabGx v( ( S) -3 -Hydroxy acy 1 -CoA (R)-3-»醯基 ((R)-3-Hydroxyacy1-CoA) 丙酮致乳酸基辅麻A
    聚羥基脂肪 酸酯合成鱗 聚>(3-羥基脂肪 酸-共-乳酸)《粒 第八圖 4 I 1376417
    1376417
    6 1376417
    第十一圖
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