JP2013165734A - ３−ヒドロキシアルカノエート単位及びラクテート単位含有共重合体及びその製造方法 - Google Patents

３−ヒドロキシアルカノエート単位及びラクテート単位含有共重合体及びその製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】３−ヒドロキシアルカノエート単位及びラクテート単位含有共重合体及びその製造方法を提供する。
【解決手段】本発明は、３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体及びその製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を、同時に有する細胞又は植物を利用して製造されたラクテート及び３−ヒドロキシアルカノエートの単量体からなる共重合体を製造する方法及びその方法で製造された共重合体に関する。本発明の共重合体は 従来の合成プラスチックの代わりに有効に用いることができる生分解性高分子であり、また、医療用途のために使用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体及びその共重合体の製造方法に関する。
ポリラクテート（ＰＬＡ）は、ラクテート由来の代表的な生分解性高分子であり、汎用高分子又は医療用高分子としての応用性の高い高分子である。現在、ＰＬＡは微生物発酵により生産されたラクテートを重合して製造されているが、ラクテートの直接重合によっては、低い分子量（１０００〜５０００ダルトン）のＰＬＡだけが生成される。高分子量（１００，０００ダルトン以上）のＰＬＡを合成するためには、鎖カップリング剤（chain coupling agent）でラクテートを直接重合することにより得られた低分子量のＰＬＡを重合する方法を使用できる。しかし、溶剤やカップリング剤の添加によって高分子量のＰＬＡを製造する工程が複雑になり、またそれを除去することが容易ではないとういう短所がある。現在、商用化されている高分子量のＰＬＡの生産工程は、ラクテートをラクチドに転換してラクチド環の開環縮合反応によってＰＬＡを合成する方法が使用されている。
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、過度な炭素源が存在しながら、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の営養分が不足する時、微生物がエネルギー及び炭素源貯蔵物質として、その内部に蓄積されたポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油から由来された合成高分子に似た物性を有しながら、完全な生分解性を示すので、既存の合成プラスチックの代替物質として認識されている。
従来のＰＨＡは短い炭素数を有するＳＣＬ−ＰＨＡ（短鎖長ＰＨＡ）と長い炭素数を有するＭＣＬ−ＰＨＡ（中鎖長ＰＨＡ）とに分けられる。ＰＨＡを合成する酵素の遺伝子は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha ）、シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）の微生物からクローニングされ、上記ＰＨＡを合成する酵素遺伝子が形質転換された組換え微生物を通して様々な種類の単量体からなるＰＨＡが合成された（非特許文献１、２、３；特許文献１、２、３，４）
微生物でＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素と、ＰＨＡモノマーを用いてＰＨＡ高分子を合成するＰＨＡ合成酵素とが必要とされる。ＰＨＡ合成酵素は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡを基質として用いてＰＨＡを合成し、ＰＨＡの基質であるヒドロキシアシル−ＣｏＡを提供しうる酵素としては、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）などから由来されたα−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）、シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）から由来された３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰ：ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰｈａＧ）、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）とシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）から由来された（Ｒ）特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）（非特許文献４、５）、大腸菌とシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）などから由来された３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）（非特許文献６、７、８）など、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）から由来されたホスホトランスブチラーゼ（Ｐｔｂ）とブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ）（特許文献９）など、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）から由来されたＣａｔ２（非特許文献１０）などが知られている。
このような酵素を利用して様々な炭素位置（主に３、４、５、６位）にヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエートを用いて様々な種類のＰＨＡを合成してきた。
しかし、２位がヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエートに対するＰＨＡ合成酵素の反応性はほとんど有していないことが報告された（非特許文献１１、１２）。今までは、ラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡポリメラーゼのin vitro活性測定を通してＰＨＡ合成酵素のラクチル−ＣｏＡに対する反応性を分析した報告があったが、ラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡ合成酵素の反応性は非常に弱い（非特許文献１１、１２）。即ち、２位−炭素位置がヒドロキシル化されたラクテートのようなヒドロキシアルカノエートはＰＨＡ合成酵素の基質特異性に適していないため、自然的に又は組換え細胞を用いてＰＨＡ及びその共重合体を製造した例はない。
国際公開第２００１／５５４３６号パンフレット 米国特許第６，１４３，９５２号明細書 国際公開第１９９８／５４３２９号パンフレット 国際公開第１９９９／６１６２４号パンフレット
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従って、本発明の目的は、３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、上記３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体を効率的に製造する方法を提供することにある。
上記本発明の目的を達成するために、本発明は、ラクテート単量体単位及び３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位を含むことを特徴とする共重合体を提供し、好ましくは、上記３−ヒドロキシアルカノエートは３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバリレート、３−ヒドロキシプロピオネート及び中間鎖長（ＭＣＬ）の３−ヒドロキシアルカノエートからなる群から選択された１つ以上であることを特徴とする。
ＰＨＡ合成酵素とＣＰ−ＰＣＴが共に発現されるオペロン形態の構造的発現されるシステムを示した模式図である。 本発明に係るＰＨＡ合成酵素遺伝子とＣＰ−ＰＣＴ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴの遺伝子地図である。 本発明に係るＰＨＡ合成酵素遺伝子とＣＰ−ＰＣＴ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣの遺伝子地図である。 ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）のｐｈａＡとｐｈａＢ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢの遺伝子地図である。 ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢプラスミドで形質転換された組換え大腸菌により生合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＭＣＬＰＨＡ−ｃｏ−ＬＡ）三重合体の成分を分析したガスクロマトグラム結果である。 ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢプラスミドで形質転換された組換え大腸菌により生合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−ＬＡ）三重合体の成分を分析したガスクロマトグラム結果である。
本発明において、用語“共重合体”とは、単量体単位の種類が２個の二重合体、単量体単位の種類が３個の三重合体及び単量体単位の種類が４個の四重合体を含む意味である。
また、上記中間鎖長（ＭＣＬ）の３−ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシヘキサノエート（ＨＨｘ）、３−ヒドロキシヘプタノエート（３ＨＨｐ）、３−ヒドロキシオクタノエート（３ＨＯ）、３−ヒドロキシノナノエート（３ＨＮ）、３−ヒドロキシデカノエート（３ＨＤ）、３−ヒドロキシウンデカノエート（３ＨＵＤ）及び３−ヒドロキシドデカノエート（３ＨＤＤ）からなる群から選択された１つ以上であってもよいが、本発明はこれに制限されない。
より好ましくは、本発明は、上記共重合体として、ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体（poly(MCL3-hydroxyalkanoate-co-lactate)）、３−ヒドロキシブチレート−中間鎖長（ＭＣＬ）３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート三重合体（poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL3-hydroxyalkanoate-co-lactate)）、３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバリレート−ラクテート三重合体（poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-lactate)）、３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート共重合体（poly(3-hydroxypropionate−co−lactate)）及び３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体（poly(3-hydroxybutyrate-co-hydroxypropionate-co-lactate)）を提供する。
また、本発明は、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換し、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を、同時に有する細胞又は植物を培養することを特徴とするラクテート単量体単位及び３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位包含共重合体の製造方法を提供する。
本発明において、上記細胞又は植物は、上記２つの遺伝子の一つ又は両方を有しない細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、及び／又は基質としてラクチル−ＣｏＡをＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得ることができる。
より好ましくは、本発明において、上記ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）である。
本発明において、上記細胞又は植物は、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子をさらに含有することができ、上記３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素はα−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）及び／又はアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）である。
本発明の製造方法において、好ましくは、上記細胞は微生物であり、より好ましくは、上記微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である
本発明において、上記培養は、３−ヒドロキシアルカノエート（３−ＨＡ）を含有する培地で行われ、上記３−ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバリレート、３−ヒドロキシプロピオネート及び中間鎖長（ＭＣＬ）の３−ヒドロキシアルカノエートからなる群から選択された１つ以上である。さらに、３−ヒドロキシバリレート、３−ヒドロキシプロピオネートなどの供給源として、バレリアン酸、プロピオン酸などを利用することができる。
上記３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体合成能を有する細胞又は植物は、（ｉ）上記２つの遺伝子を有しない細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子とラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子とで形質転換し、（ｉｉ）ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子で形質転換し、又は（ｉｉｉ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換し、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子を有する細胞又は植物をラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して、得ることを特徴とする。しかし、本発明の範囲は上記で説明された具体例に制限されない。
本発明において、上記ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子、及び３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子を、同時に有する細胞又は植物は、（ｉ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子を有する細胞又は植物をラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子及び３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子で形質転換し、（ｉｉ）ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及び３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子で形質転換し、（ｉｉｉ）３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換し、（ｉｖ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞又は植物を３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子で形質転換し、（ｖ）３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子及びラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子で形質転換し、又は（ｖｉ）３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子及びラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得ることができる。しかし、本発明の範囲は上記で説明された具体例に制限されない。
本発明において、上記３−ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバリレート、３−ヒドロキシプロピオネート及び中間鎖長（ＭＣＬ）の３−ヒドロキシアルカノエートからなる群から選択された１つ以上を使用することが好ましく、ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエートは炭素の個数が６〜１２個のヒドロキシアルカノエートを使用することが好ましい。さらに具体的に、ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨｘ）、３−ヒドロキシヘプタノエート（３ＨＨｐ）、３−ヒドロキシオクタノエート（３ＨＯ）、３−ヒドロノナノエート（３ＨＮ）、３−ヒドロキシデカノエート（３ＨＤ）、３−ヒドロキシウンデカノエート（３ＨＵＤ）、３−ヒドロキシドデカノエート（３ＨＤＤ）又はこれらの混合物を使用することが好ましい。
さらに、細胞又は植物はｐｃｔ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換されていてもよい。同時に、細胞又は植物はｐｈａＣを含むベクターで形質転換されていてもよく、ｐｈａＣが染色体内に挿入される。さらに、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子はｐｈａＣである場合には、 細胞又は植物はｐｃｔ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換されていてもよい。同時に、細胞又は植物はｐｈａＣを含むベクターで形質転換されていてもよく、ｐｈａＣが染色体内に挿入されている。
当技術分野に知られたように、上記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞としては様々な微生物が知られている（韓国特許第１０−２５０８３０号）。例えば、 Achromobacter sp.、 Achromobacter xylosoxidansなどを含むAchromobacter属微生物、Acidovorax delafieldii、Acidovax facilis、Acinetobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffiiなどを含むAcinetobacter属微生物、 Actinomyces sp.、Aeromonas caviae、Aeromonas hydrophila、Aeromonas salmonicidaなどを含むAeromonas属微生物、Alcaligenes aestus、Alcaligenes denitrificans、Alcaligenes eutrophus（Ralstonia eutrophaとして再命名された後、再びWautersia eutrophaとして再命名される）、Alcaligenes faecalis、Alcaligenes latus、Alcaligenes pacificus Alcaligenes paradoxus、Alcaligenes venestusなどを含むAlcaligenes属微生物、Alteromonas macleodii、Amoebobacter roseu、Amoebobacter pendensなどを含むAmoebobacter属微生物、Aphanocapa sp.、Aphanothece sp. Aquaspirillum autotrophicum、Azorhizobium caulinodans、Azospirillum sp.、Azospirillum brasilense、Azospirillum lipoferumなどを含むAzospirillum属微生物、Azotobacter sp.、Azotobacter agilis、Azotobacter chroococcum、Azotobacter macrocytogenes、Azotobacter vinelandiiなどを含むAzotobacter属微生物、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus subtillus、Bacillus thuringiensisなどを含むBacillus属微生物、Beggiatoa sp.、Beggiatoa albaなどを含むBeggiatoa属微生物、Beijerinckia indicus、Beijerinckia mobilisなどを含むBeijerinckia属微生物、Beneckia natrigens、Beneckea pelagiaなどを含むBeneckea属微生物, Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、Caryophamon latum、Caulobacter bacteroides、Caulobacter crescentusなどを含むCaulobacter属微生物、Chloroflexus aurantiacus、Chlorogloea fritschiiなどを含むChlorogloea属微生物、Chromatium minutissimum、Chromatium okenii, Chromatium tepidum などを含むChromatium 属微生物, Chromobacterium violaceumなどを含むChromobacterium属微生物、Clostridium botulinum、Clostridium sphenoidesなどを含むClostridium属微生物、Comamonas acidovorans、Comamonas testosteroniなどを含むComamonas属微生物、Corynebacterium autotrophicum、Corynebacterium hydrocarboxydansなどを含むCorynebacterium属微生物、Cyanobacteria、Derxia gummosaを含むDerxia属微生物、Desulfococcus multivorans、Desulfonema limicola、Desulfonema magnumなどを含むDesulfonema属微生物、Desulfosacina variabilis、Desulfovibrio sapovorans、 Ectothiorhodospira halochloris、Ectothiorhodospira mobilis、Ectothiorhodospira vacuolataなどを含むEctothiorhodospira属微生物、Ferrobacillus ferroxidans、Flavobacterium sp.、Haemophilus influenzae、Halobacterium gibbonsii、Halobacterium volcaniiなどを含むHalobacterium属微生物、Haloferax mediterranei、Hydroclathratus clathratus、Hydrogenomonas facilis、Hydrogenophaga flava、Hydrogenophaga pseudoflava、Hydrogenophaga taeniospiralisなどを含むHydrogenophaga属微生物、Hyphomicrobium vulgareを含むHyphomicrobium属微生物、Ilyobacter delafieldii、Labrys monachus、Lamprocystis reseopersicina、Lampropedia hyalina、Legionella sp.、Leptothrix discophorus、Methylobacterium AM1、Methylobacterium extorquensなどを含むMethylobacterium属微生物、Methylococcus thermophilus、Methlocystis parvus、Methylomonas methanica、Methylosinus sporium、Methylosinus trichosporiumなどを含むMethylosinus属微生物、Methylovibrio soehngenii、Micrococcus denitrificans、Micrococcus halodenitrificansなどを含むMicrococcus属微生物、Mycobacterium album、 Mycobacterium vacaeなどを含むMycobacterium 属微生物、Nitrobacter agilis, Nitrobacter winogradskyiなどを含むNitrobacter属微生物、Nocardia alba、 Nocardia asteroides、Nocardia lucida、Nocardia rubraなどを含むNocardia属微生物、Paracoccus dentrificans、scillatoria limosa、Penicillium cyclopium、Photobacterium mandapamensis、Photobacterium phosphoreumなどを含むPhotobacterium属微生物、Physarum ploycephalumとPseudomonas glathei、Pseudomonas indigofera、Pseudomonas lemonieri、Pseudomonas mallei、Pseudomonas marina、Pseudomonas mixta、Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas oxalaticus、Pseudomonas pseudoalcaligenes、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas butanovora、Pseudomonas cepacia、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas denitrificans、Pseudomonas diminuta、Pseudomonas echinoides、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas rubrilineas、Pseudomonas saccharophila、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas syringae、Pseudomonas thermophilus、Pseudomonas viridiflavaなどを含むPseudomonas属微生物、Ralstonia 属微生物、Rhizobium hedysarum、Rhizobium lupini、Rhizobium meliloti、Rhizobium phaseoli、 Rhizobium trifoliなどを含むRhizobium属微生物、Rhodobacillus属微生物、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroidesなどを含むRhodobacter属微生物、Rhodococcus rhodochrousを含むRhodococcus属微生物、Rhodocyclus gelatinosus、 Rhodocyclus tenuis などを含むRhodocyclus 属微生物, Rhodomicrobium vannieliiとRhodopseudomonas acidophila、Rhodopseudomonas capsulataなどを含むRhodopseudomonas属微生物、Rhodospirillum molischianum、Rhodospirillum rubrum などを含むRhodospirillum属微生物、Sphingomonas paucimobilis、Spirillum itersomii、Spirillum serpensなどを含むSpirillum属微生物、Spirulina jenneri、Spirulina maxima、Spirulina subsaksaなどを含むSpirulina属微生物、Staphylococcus aureus、 Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus xylosusなどを含むStaphylococcus属微生物、Stella humosa、Stella vacuolataなどを含むStella属微生物、Streptomyces antibioticus、Streptomyces coelicolorなどを含むStreptomyces属微生物、Syntrophomonas wolfei、Thermophilic cyanobacteria、Thermus thermophilus、Thiobacillus A2、Thiobacillus acidophilus、Thiobacillus versutusなどを含むThiobacillus属微生物、Thiocapsa pfennigiiなどを含むThiocapsa属微生物、Thiocystis violacea、Vibrio parahaemolyticus、Xanthobacter autotrophicus、Xanthomonas maltophilia、Zoogloea ramigeraなどを含むZoogloea属微生物などがある。
好ましくは、本発明の上記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子は、シュードモナスエスピー６−１９由来のｐｈａＣ1ｐｓ６−１９である。より好ましくは、上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子は、配列番号８のアミノ酸配列で、ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；v）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又はｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列をコードする遺伝子である。このようなＰＨＡ合成酵素変異体を用いることがラクチル−ＣｏＡの基質利用性の側面からより好ましい。
本発明において、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を、同時に有する細胞又は植物は３−ヒドロキシアルカノエートを含む培地で培養して本発明の共重合体を製造できる。もしグルコースやクエン酸などの他の炭素源からラクテートと３−ヒドロキシアルカノエートを生合成しうる細胞又は植物であれば、培地に３−ヒドロキシアルカノエート、ラクテートなどを加えなくてもよい。
本発明の転換酵素の遺伝子及び合成酵素の遺伝子を含有する植物体を製造するための植物体の形質転換は、アグロバクテリウム又はウイルスベクターなどを用いる常法により達成できる。例えば、本発明に係る遺伝子を含有する組換えベクターでアグロバクテリウム中の微生物を形質転換させた後、上記形質転換されたアグロバクテリウム中の微生物を対象植物の組織などに感染させ、形質感染された植物を得ることができる。より具体的に、対象植物の外植体（explant）を前培養（pre-culture）した後、これを上記形質転換されたアグロバクテリウムと共同培養して形質転換させる工程；形質転換された外植体をカルス誘導培地で培養し、カルスを収得する工程；及び得られたカルスを切断し、これをシュート誘導培地で培養して芽を形成させる工程；を経て形質転換された植物を製造できる。
本発明で、用語“外植体（explant）”とは、植物体から切断した組織の断片を意味し、子葉（cotyledon）又は胚軸（hypocotyl）を含む。子葉又は胚軸は本発明の外植体として使用できる。植物の種子を消毒・洗浄した後、ＭＳ培地で発芽させることによって得られた子葉を使用することがより好ましい。
本発明で利用可能な形質転換された植物は、タバコ、トマト、唐辛子、豆、稲、トウモロコシなどが挙げられるが、これらに制限されない。また、たとえ形質転換された植物が有性繁殖する植物でも、組織培養などにより無性的に繰返生殖させることができることは当業者にとって自明である。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。下記実施例は当業者が本発明に対する理解を助けるために実例として提供されており、本発明の範囲が制限することを意図としない。
実施例１：ｐｃｔ遺伝子及びＰＨＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えプラスミドの構築 ３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体を製造するために、ｐｃｔ遺伝子とＰＨＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ、ｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣなどを構築した。
（１）ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴプラスミドの構築
ｐｃｔ遺伝子としてはクロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）遺伝子が使用され、ＰＨＡ合成酵素遺伝子としてはシュードモナスエスピー６−１９（Pseudomonas sp. 6-19）のＰＨＡ合成酵素遺伝子が使用された。
図１のように合成酵素（synthase）とＣＰ−ＰＣＴが共に発現されるオペロン形態の構造的発現されるシステムを構築した。ＣＰ−ＰＣＴの場合、発現時に宿主微生物に対して強い毒性を有していることがよく知られている。即ち、ＩＰＴＧによって誘導されたｔａｃプロモーター又はＴ７プロモーター発現誘導システム（このシステムは組換えタンパク質の発現に広く使用されている）において、発現誘導物質添加直後に微生物は全て死滅する。この理由のために、弱く発現されるが、微生物成長によって持続的に発現される発現されるシステムを使用することは、適当と考えられる。ＣＰ−ＰＣＴ遺伝子はクロストリジウム・プロピオニカム（ＤＳＭＺ１６８２）の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｐｃｔ遺伝子配列（Selmer et al., Eur J Biochem., 269:372, 2002）に基づいて構築された配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いるＰＣＲによって得られた。
配列番号１：５−ｇｇａａｔｔｃＡＴＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＡＴＧＡ
配列番号２：５−ｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｇｇａｃｔｔｃａｔｔｔｃｃｔｔｃａｇａｃｃｃａｔｔａａｇｃｃｔｔｃｔｇ
このとき、野生型のＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩ制限酵素部位をクローニングの容易性のためにＳＤＭ方法で除去した。さらに、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、配列番号３と４の塩基配列を有するプライマーでオーバーラップＰＣＲを遂行した。
配列番号３：５−ａｇｇ ｃｃｔ ｇｃａ ｇｇｃ ｇｇａ ｔａａ ｃａａ ｔｔｔ ｃａｃ ａｃａ ｇｇ− ３
配列番号４：５−ｇｃｃ ｃａｔ ａｔｇ ｔｃｔ ａｇａ ｔｔａ ｇｇａ ｃｔｔ ｃａｔ ｔｔｃ ｃ− ３
シュードモナスエスピー６−１９（ＫＣＴＣ １１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、シュードモナスエスピー６−１９の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004）に基づいた配列番号５と６の塩基配列を有するプライマーを構築し、ＰＣＲを遂行してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を得た。ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子の塩基配列を配列番号７に示し、これから計算されたアミノ酸配列を配列番号８に示した。
配列番号５：５− ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＧ −３
配列番号６：５− ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ −３
上記得られたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Stratagene Co., USA）のＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１組換えベクターを製造した。ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位がそれぞれ両端に一つずつだけが含まれたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子断片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法で、アミノ酸を変換することなく、除去し、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を添加するために、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラップＰＣＲを遂行した。
配列番号９：５− ａｔｇ ｃｃｃ ｇｇａ ｇｃｃ ｇｇｔ ｔｃｇ ａａ −３
配列番号１０：５− ＣＧＴ ＴＡＣ ＴＣＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＣ −３
配列番号１１：５− ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＧ −３
配列番号１２：５− ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ −３
配列番号１３：５− ＧＴＡ ＣＧＴ ＧＣＡ ＣＧＡ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＴＧＡ ＧＴＧ −３
配列番号１４：５− ａａｃ ｇｇｇ ａｇｇ ｇａａ ｃｃｔ ｇｃａ ｇｇ −３
アミノ酸配列分析を通してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素のＳＣＬ（short-chain-length ＰＨＡ）合成活性に影響を及ぼすアミノ酸位置３箇所（１３０、３２５、４８１）を見つけたあと、配列番号１５／１６、配列番号１７／１８及び配列番号１９／２０のプライマーを用いて、ＳＤＭ方法でｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素のアミノ酸配列中のＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍが変異された変異体をコードする遺伝子を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３００を構築した（図１）。構築されたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体を下記表１に示した。
配列番号１５：５− ａｔｃ ａａｃ ｃｔｃ ａｔｇ ａｃｃ ｇａｔ ｇｃｇ ａｔｇ ｇｃｇ ｃｃｇ ａｃｃ− ３
配列番号１６：５− ｇｇｔ ｃｇｇ ｃｇｃ ｃａｔ ｃｇｃ ａｔｃ ｇｇｔ ｃａｔ ｇａｇ ｇｔｔ ｇａｔ− ３
配列番号１７：５− ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＡＣＣ− ３
配列番号１８：５− ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＣＡＧ− ３
配列番号１９：５− ＣＧＡ ＧＣＡ ＧＣＧ ＧＧＣ ＡＴＡ ＴＣＡ ＴＧＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＣＧＣ− ３
配列番号２０：５− ＧＣＧ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＴＣＧ− ３
上記構築されたｐＰｓ６１９Ｃ１３００ベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、上記クローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを構築した（図２）。
（２）ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢの構築
Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のα−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）及びアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）を提供するプラスミドｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢを構築した（Si-Jae Park, PhD thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2003）。ｐＳＹＬ１０５（Lee et al. Biotechnol. Bioeng. 44: 1337, 1994）をＰｓｔＩで切断して得たｐｈａＡＢ遺伝子をＰｓｔＩで切断したｐ１０４９９Ａ（Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 2002）に挿入し、ｐ１０４９９ＰｈａＡＢを構築した。上記ｐ１０４９９ＰｈａＡＢプラスミドをＳｓｐＩで切断して１０４プロモーターとｐｈａＡＢ遺伝子を含有する遺伝子断片を得て、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢＢＲ１ＭＣＳプラスミドに挿入してｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢプラスミドを構築した（図４）。
（３）ｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣプラスミドの構築
ｐＴａｃ９９Ａ（Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003）ベクターをＳｓｐＩで切断して得たＴａｃプロモーターと転写ターミネータを含む遺伝子断片をＳｓｐＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech, Sweden）に挿入してｐＴａｃｌａｃベクターを構築した。Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＤＳＭＺ１８０）を主鎖として、配列番号２１、２２のプライマーを用いてＣ．ｖｉｎｏｓｕｍのｐｈａＥＣ遺伝子を増幅した。
配列番号２１：ｇｇａａａｔｃ ｃａｔ ＡＴＧＡＣＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＴＧＧＣＧ
配列番号２２：ｇｇａａａｔｃ ｃａｔａｔｇ ａｔｃ ｃａｇ ｇｇｃ ｃａｃ ｔａｔ ｃｔｃ ｃａａ ｃｔｇ
増幅されたｐｈａＥＣ遺伝子はｐＴａｃｌａｃベクターをＮｄｅＩで切断した後、挿入した（ｐＴａｃｌａｃＮＣｖＥＣ）。さらに、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで切断して得たｐｃｔ遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで切断したｐＴａｃｌａｃＮＣｖＥＣに挿入することによって、ｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣを完成した（図３）。
実施例２：ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造
実施例１で構築されたｐｃｔ遺伝子とＰＨＡ遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをＥ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１（Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003）に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを得た。ＷＢ１０１はｆａｄＢ Ｅ．ｃｏｌｉ変異体であり、ＭＣＬ−ＰＨＡの生産において効果的であることが明らかになった菌株である（韓国特許登録番号１０−０４４７５３１）。
上記形質転換体を下記のように２段階培養して、ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を得た。まず、上記形質転換された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが含有されている１００ｍＬのＬＢ培地［バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／L］で２４時間培養した後、４℃、１０００gで１５分間遠心分離して菌体を回収した。
回収した菌体を１０ｇ／Ｌのブドウ糖、２ｇ／Ｌのナトリウムデカノエート及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンがさらに含有されたＬＢ培地（バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／L；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で３日間嫌気的に培養した。
上記培養液を４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収し、十分な量の蒸留水で４洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥した。湿気が完全に除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として用いて硫酸触媒下で、メタノールと反応させた。これを室温で、クロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を添加して混合した後、二つの層に分離されるまで静置した。二つの層において、メチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取し、ガスクロマトグラフィーで高分子の成分を分析した。内部標準物質としてはベンゾエートを用いた。
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ菌体でメチル−３−ヒドロキシデカノエート及びメチル−ラクテートが検出され、組換え大腸菌によりＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体［poly(MCL3-hydroxyalkanoate-ｃｏ-lactate)］が生成されたことを確認できた。
実施例３：３−ヒドロキシブチレート−ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート三重合体の製造
実施例１で構築したｐｃｔ遺伝子とＰＨＡ遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをＥ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１［W3110(fadB::Km), Park and Lee, J. Bacteriol. 185:5391, 2003］に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを得た。ＷＢ１０１はｆａｄＢ Ｅ．ｃｏｌｉ変異体であり、ＭＣＬ−ＰＨＡの生産において効果的であることが明らかに菌株である（韓国特許登録番号第１０−０４４７５３１号）。
上記形質転換体を下記のように２段階培養して、３−ヒドロキシブチレート−ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート三重合体を得た。まず、上記形質転換された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが含有されている１００ｍＬのＬＢ培地［バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ］で２４時間培養した後、４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収した。
回収した菌体を２ｇ／Ｌのナトリウムデカノエート、１ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレート及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンがさらに含有されたＬＢ培地（バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で３日間嫌気的に培養した。
さらに、上記ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ及びｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢをＥ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１に形質転換させ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢを得た。
上記Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢを下記のように２段階培養して、３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバリレート−ラクテート三重合体を得た。まず、上記形質転換された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールが含有されている１００ｍＬのＬＢ培地（バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で２４時間培養した後、４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を２ｇ／Ｌのナトリウムデカノエート、１ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレート及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＬＢ培地で3日間嫌気的に培養した。
上記Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ及びＥ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢの培養液をそれぞれ４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収し、十分な量の蒸留水で４回洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥した。湿気が完全に除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として使用して硫酸触媒下で、メタノールと反応させた。これを室温でクロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を添加して混合した後、二つの層に分離されるまで静置した。二つの層において、メチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取し、ガスクロマトグラフィーで高分子の成分を分析した。内部標準物質としてはベンゾエートを用いた。
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ菌体及びＥ．ｃｏｌｉ ＷＢ１０１／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢ菌体でメチル−３−ヒドロキシブチレート、メチル-３−ヒドロキシデカノエート及びメチル-ラクテートが検出され、組換え大腸菌によって３−ヒドロキシブチレート−ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ラクテート三重合体［poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL3-hydroxyalkanoate-co-lactate)］が生成されたことを確認できた（図５）。
実施例４：３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバリレート−ラクテート共重合体の製造
実施例１で構築したｐｃｔ遺伝子とＰＨＡ遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０（Invitrogen）に形質転換させ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを得た。
上記形質転換体を下記のように２段階培養して、３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバリレート−ラクテート三重合体を得た。まず、上記形質転換された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが含有されている１００ｍＬのＬＢ培地（バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で２４時間培養した後、４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収した。
回収した菌体を１ｇ／Ｌの３−ヒドロキシバリレート（３−ＨＶ）、１ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンがさらに含有されたＭＲ培地［１Ｌ当たり、グルコース１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、クエン酸０．８ｇ及び微量金属溶液５ｍＬ；微量金属溶液の組成：１Ｌ当たり、５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、及びＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ］で3日間嫌気的に培養した。
さらに、上記ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢと共にそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０（Invitrogen）に形質転換させ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢを得た。
上記形質転換体を下記のように２段階培養して、３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバリレート−ラクテート三重合体を得た。まず、上記形質転換された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールが含有されている１００ｍＬのＬＢ培地（バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で２４時間培養した後、４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収した。
回収した菌体を２ｇ／Ｌのプロピオン酸又は２ｇ／Ｌのバレリアン酸、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＭＲ培地（１Ｌ当たり、グルコース１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、クエン酸０．８ｇ及び微量金属溶液５ｍＬ；微量金属溶液の組成：１Ｌ当たり、５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、及びＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ）で３日間嫌気的に培養した。
上記培養液を４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収し、十分な量の蒸留水で４回洗浄したあと、８０℃で１２時間乾燥させた。湿気が完全に除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として用いて硫酸触媒下で、メタノールと反応させた。これを室温でクロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を添加して混合した後、二つの層に分離されるまで静置した。二つの層において、メチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取し、ガスクロマトグラフィーで高分子の成分を分析した。内部標準物質としては、ベンゾエートを用いた。
分析の結果、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ及びＴｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳ１０４ＲｅＡＢの両方で、メチル−３−ヒドロキシブチレート、メチル−３−ヒドロキシバリレート及びメチル−ラクテートが検出され、組換え大腸菌によって３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバリレート−ラクテート三重合体［poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-lactate)］が生成されたことを確認できた（図６）。
実施例５：３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート共重合体の製造
実施例１で構築したｐｃｔ遺伝子とＰＨＡ遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０（Invitrogen）に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを得た。
上記形質転換体を下記のように２段階培養して、３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート共重合体を得た。まず、上記形質転換された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが含有されている１００ｍＬのＬＢ培地（バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で２４時間培養した後、４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収した。
回収した菌体を２ｇ／Ｌの３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンがさらに含有されたＭＲ培地（１Ｌ当たり、グルコース１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、クエン酸０．８ｇ及び微量金属溶液５ｍＬ；微量金属溶液の組成：１Ｌ当たり、５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、及びＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ）で３日間嫌気的に培養した。
上記培養液を４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収し、十分な量の蒸留水で４回洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥した。湿気が完全に除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として用いて硫酸触媒下で、メタノールと反応させた。これを室温でクロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を添加して混合した後、二つの層に分離されるまで静置した。二つの層において、メチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取し、ガスクロマトグラフィーで高分子の成分を分析した。内部標準物質としてはベンゾエートを用いた。
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ菌体でメチル−３−ヒドロキシプロピオネート及びメチル−ラクテートが検出され、組換え大腸菌によって新規な３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバリレート−ラクテート三重合体が生成されたことを確認できた。
実施例６：３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体の製造
実施例１で構築したｐｃｔ遺伝子とＰＨＡ遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０（Invitrogen）に形質転換させ、Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを得た。
上記形質転換体を下記のように２段階培養して、３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体を得た。まず、上記形質転換された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが含有されている１００ｍＬのＬＢ培地（バクト(登録商標)トリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクト(登録商標)イースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で２４時間培養した後、４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収した。
回収した菌体を２ｇ／Ｌの３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）、１ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンがさらに含有されたＭＲ培地（１Ｌ当たり、グルコース１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、クエン酸０．８ｇ及び微量金属溶液５ｍＬ；微量金属溶液の組成：１Ｌ当たり、５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、及びＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ）で３日間嫌気的に培養した。
上記培養液を４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収し、十分な量の蒸留水で４回洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥した。湿気が完全に除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として用いて硫酸触媒下で、メタノールと反応させた。これを室温でクロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を添加して混合した後、二つの層に分離されるまで静置した。二つの層において、メチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取し、ガスクロマトグラフィーで高分子の成分を分析した。内部標準物質としてはベンゾエートを用いた。
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ菌体でメチル−３−ヒドロキシプロピオネート、メチル-３−ヒドロキシブチレート及びメチル-ラクテートが検出され、組換え大腸菌によって３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体［poly(３-hydroxybutyrate-co-hydroxypropionate-co-lactate)］が生成されたことを確認できた。
実施例７：様々な変異体の構築
上記ｐＰｓ６１９Ｃ１３００変異体と同様にして、下記プライマーを用いて様々なＰＨＡ合成酵素変異体を構築した。構築された変異体を下記表２、３、４及び５にまとめて示した。
Ｅ１３０Ｄ
配列番号１５：５’−ａｔｃ ａａｃ ｃｔｃ ａｔｇ ａｃｃ ｇａｔ ｇｃｇ ａｔｇ ｇｃｇ ｃｃｇ ａｃｃ− ３'
配列番号１６：５’ −ｇｇｔ ｃｇｇ ｃｇｃ ｃａｔ ｃｇｃ ａｔｃ ｇｇｔ ｃａｔ ｇａｇ ｇｔｔ ｇａｔ− ３'
Ｓ３２５Ｔ
配列番号１７：５’−ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＡＣＣ− ３'
配列番号１８：５’− ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＣＡＧ− ３'
Ｓ４７７Ｒ
配列番号２３：５’−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｃｇｃ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号２４：５’−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ｇｃｇ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
Ｓ４７７Ｈ
配列番号２５：５’−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｃａｔ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号２６：５’−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ａｔｇ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
Ｓ４７７Ｆ
配列番号２７：５’− ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｔｔｔ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号２８：５’− ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ａａａ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
Ｓ４７７Ｙ
配列番号２９：５’−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｔａｔ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号３０: ５’−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ａｔａ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
Ｓ４７７Ｇ
配列番号３１：５’−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｇｇｃ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号３２：５’−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ｇｃｃ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
Ｑ４８１Ｋ
配列番号３３：５’−ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ ａａａ ａｇｃ ａｔｃ ｃｔｇ ａａｃ ｃｃｇ ｃ− ３'
配列番号３４：５’−ｇｃｇ ｇｇｔ ｔｃａ ｇｇａ ｔｇｃ ｔｔｔ ｔｇａ ｔａｔ ｇｃｃ ｃ− ３'
Ｑ４８１Ｍ
配列番号３５：５’−ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ ａｔｇ ａｇｃ ａｔｃ ｃｔｇ ａａｃ ｃｃｇ ｃ− ３'
配列番号３６：５’−ｇｃｇ ｇｇｔ ｔｃａ ｇｇａ ｔｇｃ ｔｃａ ｔｇａ ｔａｔ ｇｃｃ ｃ− ３'
Ｑ４８１Ｒ
配列番号３７：５’−ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ ｃｇｃ ａｇｃ ａｔｃ ｃｔｇ ａａｃ ｃｃｇ ｃ− ３'
配列番号３８：５’−ｇｃｇ ｇｇｔ ｔｃａ ｇｇａ ｔｇｃ ｔｇｃ ｇｇａ ｔａｔ ｇｃｃ ｃ− ３'
実施例８：様々な変異体を用いたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の合成
上記実施例３に記載された方法と同様にして、シュードモナスエスピー６-１９由来ＰＨＡ合成酵素変異体とプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現が可能な組換え大腸菌の構築し、これを利用してＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を構築した。その結果を下記表６、７及び８に示した。
上記表６、７及び８に示されたように、本発明のＰＨＡ合成酵素変異体はラクチル−ＣｏＡを基質として用いてラクテート共重合体を高効率で製造することができた。
以上で詳細に説明して立証されたように、本発明は３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含有する共重合体を提供する効果がある。ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を、同時に有する細胞又は植物を培養することを特徴とする上記共重合体の製造方法を提供する効果がある。本発明の共重合体は生分解性高分子であり、従来合成プラスチックの用途を代替することができ、医療用にも使用可能である。

Claims (11)

  1. ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を、同時に有する細胞又は植物を培養する工程を含む、ラクテート単量体単位及び３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位包含共重合体の調製方法。
  2. 前記細胞又は植物が、前記２つの遺伝子の一つ又は両方を有しない細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、及び／又は基質としてラクチル−ＣｏＡを使用するポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子で、形質転換して得られるものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の前記遺伝子が、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子が、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）６−１９由来のｐｈａＣ１ｐｓ６−１９であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＰＨＡ合成酵素遺伝子が、
    ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
    ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；
    ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
    ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；
    ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；
    ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
    ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
    ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
    ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
    ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；
    ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；
    ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；
    ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；
    ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
    ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
    ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；
    ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；
    ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；
    ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；
    ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
    ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
    ｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
    ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又は
    ｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ
    の変異を有する配列番号８のアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 前記細胞又は植物が、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 前記３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素が、α−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）及び／又はアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞が微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 前記培養が、３−ヒドロキシアルカノエート（３−ＨＡ）を含有する培地で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記３−ヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバリレート、３−ヒドロキシプロピオネート及び中間鎖長（ＭＣＬ）の３−ヒドロキシアルカノエートからなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
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