BRPI0718979A2

BRPI0718979A2 - Copolímero, e, método para preparar o mesmo

Info

Publication number: BRPI0718979A2
Application number: BRPI0718979-6A
Authority: BR
Inventors: Si-Jae Park; Sang-Hyun Lee; Eun-Jeong Lee; Hye-Ok Kang; Tae-Wan Kim; Taek-Ho Yang; Sang-Yup Lee
Original assignee: Lg Chemical Ltd
Priority date: 2006-11-21
Filing date: 2007-11-21
Publication date: 2014-02-11
Also published as: JP2010510372A; US8765402B2; EP2087025B1; AU2007322529A1; JP2013165734A; EP2087025A4; AU2007322529B2; EP2087025A1; BRPI0718979B1; US20110046339A1; WO2008062996A1

Description

I “COPOLÍMERO, E, MÉTODO PARA PREPARAR O MESMO” [CAMPO TÉCNICO]

A presente invenção refere-se a um copolímero compreendendo unidade de monômero de 3-hidroxialcanoato e unidade de 5 monômero de lactato e um método para fabricar este polímero.

[TÉCNICA ANTECEDENTE]

Polilactato (PLA) é um polímero biodegradável típico originado do lactato, o qual tem uma variedade de aplicações como um polímero comum ou medicinal. No momento, PLA está sendo preparado por polimerização de lactato o qual é produzido através da fermentação de microorganismos, mas somente PLA de peso molecular baixo (1000-5000 daltons) é produzido através de polimerização direta de lactato. Para sintetizar peso molecular alto (>100,000 daltons) de PLA, um método de polimerização de PLA de peso molecular baixo obtido por polimerização direta de lactato com um agente de copulação de cadeia pode ser usado. No entanto, ele tem desvantagens como que o processo para a preparação de PLA de peso molecular alto é complicado devido à adição de um solvente ou um agente de copulação de cadeia, e também não é fácil removê-lo. No momento, o processo para a preparação de PLA comercialmente disponível de peso molecular alto, um método, no qual lactato é convertido em lactídeo para sintetizar PLA por ciclo desidratação do anel láctico, está sendo usado.

Entretanto, poliidroxialcanoato (PHA) é um poliéster cujos microorganismos se acumulam no mesmo como um carbono e um composto de armazenamento de energia quando outros elementos nutritivos, por 25 exemplo, fósforo, nitrogênio, magnésio, oxigênio, são deficientes enquanto a fonte de carbono está em excesso. PHA é reconhecido como um material alternativo para plásticos sintetizados porque ele tem propriedades similares aos polímeros sintéticos originados do petróleo, e, no mesmo tempo, mostra uma excelente propriedade biodegradável. O existente PHA é dividido entre SCL-PHA (PHA com comprimento de cadeia curto) tendo cadeias de carbono curtas e MCL-PHA (PHA com comprimento de cadeia médio) tendo cadeias de carbono longas. Um gene sintetizando PHA foi clonado a partir de Ralstonia eutropha, 5 Pseudomonas sp. Microorganismo, e PHA consistindo em vários monômeros foram sintetizados por recombinação de microorganismos (Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al, FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6.143.952; WO 98/54329; e WO 99/61624).

Para produzir PHA em microorganismos, uma enzima que

converte metabólitos de microorganismos em um monômero de PHA e PHA sintase que sintetiza um polímero de PHA usando os monômeros de PHA são requeridos. PHA sintase sintetiza PHA usando hidroxiacil-CoA como um substrato e alfa-cetotiolase (PhaA), acetoacetil-CoA redutase (PhaB), clonada 15 a partir de Ralstonia eutropha etc., 3-hidroxidecanoil-ACP:CoA transferase (PhaG) clonada a partir de Pseudomonas sp., (R)-específica enoil-CoA hidratase (PhaJ) derivada de Aeromonas caviae e Pseudomonas aeruginosa (Fukui et al., J. Bacteriol., 180:667, 1998; Tsage et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000), 3-cetoacil-ACP redutase (FabG) derivada de E. coli, 20 Pseudomonas aeruginosa, etc. (Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol., 182:2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 2002), fosfotransbutilase (Ptb) e butirato quinase (Buk) derivada de Clostridium acetobutyricum (Liu e Steinbuchel, Appl Environ Microbiol, 66:739, 2000), Cat2 derivada de Clostridium kluyveri 25 (Hein et al. FEMS Microbiol. Lett., 15:411, 1997), etc. são conhecidas como enzimas capazes de gerar hidroxiacil-CoA que é um substrato de PHA.

Vários tipos de PHAs foram sintetizados com essas enzimas usando hidroxialcanoatos hidroxilados em várias posições na cadeia de carbono (principalmente as posições 3, 4, 5, e 6). No entanto, relatou-se que se tem uma pequena atividade de PHA sintase em hidroxialcanoato que é hidroxilado na posição 2 (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin e Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994). Até agora, foram elaborados relatos de 5 atividade de PHA sintase em Iactil-CoA medida in vitro, mas atividade de PHA sintase em Iactil-CoA é muito fraca (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin e Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994). Isto é, não existem exemplos de produção natural ou produção por células recombinantes de PHA e seus copolímeros devido 10 um hidroalcanoato, como lactato hidroxilado na posição 2 de carbono, não é um substrato adequado para PHA sintase.

[DESCRIÇÃO]

[PROBLEMA TÉCNICO]

Consequentemente, o objeto da presente invenção é prover um copolímero compreendendo unidade de monômero de 3-hidroxialcanoato e unidade de monômero de lactato.

Outro objeto da presente invenção é prover um método para preparar eficientemente um copolímero compreendendo unidade de monômero de 3-hidroxialcanoato e unidade de monômero de lactato.

[SOLUÇÃO TÉCNICA]

Para realizar o objeto, a presente invenção provê um copolímero compreendendo unidade de monômero de lactato e unidade de monômero 3-hidroxialcanoato, e preferivelmente, o 3-hidroxialcanoato é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxibutirato, 3- 25 hidroxivalerato, 3-hidroxipropionato e 3-hidroxialcanoato com comprimento de cadeia médio (MCL).

O termo "copolímero," como usado aqui, é entendido incluir bipolímero consistindo de dois monômeros distintos, terpolímero consistindo de três monômeros distintos ou tetrapolímero consistindo de quatro monômeros distintos. Além disso, o 3-hidroxialcanoato com comprimento de cadeia médio (MCL) pode ser pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxi-hexanoato (3HHx), 3-hidroxi-heptanoato (3HHp), 3- hidroxioctanoato (3HO), 3-hidroxinonanoato (3HN), 3-hidroxidecanoato (3HD), 3-hidroxiundecanoato (3HUD) e 3-hidroxidodecanoato (3HDD), mas a presente invenção não é limitada aos mesmos.

Mais preferivelmente, a presente invenção provê copolímero de 3-hidroxialcanoato com MCL -lactato (poli (3-hidroxialcanoato com MCL- co-lactato)), terpolímero de 3-hidroxibutirato-3-hidroxialcanoato com comprimento de cadeia médio (MCL) -lactato (poli (3-hidroxibutirato-co- 3- hidroxialcanoato com MCL-co-lactato)), terpolímero de 3-hidroxibutirato-3 - hidroxivalerato-lactato (poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co- lactato)), copolímero de 3-hidroxipropionato-lactato (poli (3- hidroxipropionato-co-lactato)) e terpolímero de 3-hidroxibutirato-3- hidroxipropionato-lactato (poli (3-hidroxibutirato-co-hidroxipropionato-co- lactato)) como o copolímero.

A presente invenção também provê um método para preparar um copolímero compreendendo unidade de monômero de lactato e unidade de monômero de 3-hidroxialcanoato, em que o método compreende cultivar uma célula ou planta compreendendo um gene de enzima convertendo lactato em Iactil-CoA e convertendo 3-hidroxialcanoato em 3-hidroxialcanoil-CoA e gene de poliidroxialcanoato (PHA) sintase juntos.

Na presente invenção, a célula ou planta pode ser obtida transformando uma célula ou planta não tendo qualquer uma ou ambas das duas enzimas com um gene de enzima convertendo lactato e 3- hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, e/ou um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato.

Mais preferivelmente, na presente invenção, o gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil- CoA, respectivamente, é gene de propionil-CoA transferase (pct).

Na presente invenção, a célula ou planta podem ainda compreendem um gene de enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3- 5 hidroxialcanoil-CoA, e a enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3- hidroxialcanoil-CoA é alfa-cetotiolase (PhaA) e/ou acetoacetil-CoA redutase (PhaB).

Preferivelmente, no método de preparação de acordo com a presente invenção, a célula é preferivelmente um microorganismo. Mais preferivelmente, e mais preferivelmente, o microorganismo é E. Coli.

Na presente invenção, o cultivo é realizado em um meio de cultura compreendendo 3-hidroxialcanoato, e o 3-hidroxialcanoato pode ser pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxipropionato e 3-hidroxialcanoato com 15 comprimento de cadeia médio (MCL). Além disso, ácido valérico, ácido propiônico, etc. podem ser usados como fontes de 3-hidroxivalerato, 3- hidroxipropionato, etc.

A célula ou planta estando apta a sintetizar o copolímero compreendendo unidade de monômero de 3-hidroxialcanoato e unidade de 20 monômero de lactato pode ser obtida (i) transformando uma célula ou planta não tendo as duas enzimas com um gene de enzima convertendo lactato e 3- hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, e um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato, (ii) transformando uma célula ou planta tendo um gene de PHA sintase usando 25 Iactil-CoA como um substrato com um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, ou (iii) transformando uma célula ou planta tendo um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil- CoA, respectivamente, com um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato. Entretanto, o escopo da presente invenção não é limitado aos exemplos concretos descritos acima.

A célula ou planta tendo um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, 5 respectivamente, um gene de PHA sintase, e um gene de enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3-hidroxialcanoil-CoA juntos podem ser obtidos (i) transformando uma célula ou planta tendo um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, com um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um 10 substrato e um gene de enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3- hidroxialcanoil-CoA, (ii) transformando uma célula ou planta tendo um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato com um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3- hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, e um gene convertendo em 3- 15 hidroxialcanoil-CoA, (iii) transformando uma célula ou planta tendo um gene de enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3-hidroxialcanoil-CoA com um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, e um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato, (iv) transformando uma célula ou planta tendo 20 um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, e um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato com um gene de enzima convertendo 3- hidroxialcanoato em 3-hidroxialcanoil-CoA, (v) transformando uma célula ou planta tendo um gene de enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3- 25 hidroxialcanoil-CoA e um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato com um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, ou (vi) transformando uma célula ou planta tendo um gene de enzima convertendo 3- hidroxialcanoato em 3-hidroxialcanoil-CoA e um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil- CoA, respectivamente, com um gene de PHA sintase usando Iactil-CoA como um substrato. Entretanto, o escopo da presente invenção não é limitado aos exemplos concretos descritos acima.

5 Na presente invenção, o 3-hidroxialcanoato é preferivelmente

pelo menos um selecionado do grupo consistindo de 3-hidroxibutirato, 3- hidroxivalerato, 3 -hidroxi-propionato e 3-hidroxialcanoato com MCL, e o 3- hidroxialcanoato com MCL é preferivelmente hidroxialcanoato tendo 6~12 números de carbono. Mais especificamente, o 3-hidroxialcanoato com MCL é 10 preferivelmente 3-hidroxi-hexanoato (3HHx), 3-hidroxi-heptanoato (3HHp), 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-hidrononanoato (3HN), 3-hidroxidecanoato (3HD), 3-hidroxiundecanoato (3HUD), 3-hidroxidodecanoato (3HDD) ou sua mistura.

Além disso, as células ou plantas podem ser transformadas 15 com um vetor recombinante compreendendo gene pct. Ao mesmo tempo, as células ou plantas podem ser transformadas com um vetor compreendendo phaC, ou phaC é inserido em um cromossomo. Além disso, no caso que um gene codificando PHA sintase para o qual Iactil-CoA é um substrato é phaC, as células ou plantas podem ser transformadas com um vetor recombinante 20 compreendendo gene pct. Ao mesmo tempo, as células ou plantas podem ser transformadas com um vetor compreendendo phaC, ou phaC é inserido em um cromossomo.

Como é conhecido na técnica, vários microorganismos têm um gene codificando PHA sintase (Patente Coreana publicada No. 10-250830). 25 Os seguintes são exemplos de tais microorganismos: microorganismos do gênero Achromobacter que incluem Aehromobaeter sp., Aehromobaeter xylosoxidans, etc., microorganismos do gênero Aeinetobaeter que incluem Aeidovorax delafieldii, Aeidovax faeilis, Aeinetobaeter sp., Aeinetobaeter ealeoaceticus, Aeinetobaeter Iwoffii, etc., microorganismos do gênero Aeromonas que incluem Actinomyces sp., Aeromonas eaviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonieida, etc., microorganismos do gênero Alealigenes que incluem Alcaligenes aestus, Alealigenes denitrificans, Alealigenes eutrophus (depois renomeado como Ralstonia eutropha, é 5 renomeado como Wautersia eutropha), Alealigenes faecalis, Alealigenes latus, Alealigenes pacifieus, Alcaligenes paradoxus, Alealigenes venestus, etc., microorganismos do gênero Amoebobaeter que incluem Alteromonas maeleodii, Amoebobaeter roseu, Amoebobaeter pendens, etc., microorganismos do gênero Azospirillum que incluem Aphanoeapa sp., 10 Aphanotheee sp., Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium eaulinodans, Azospirillum sp., Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum, etc., microorganismos do gênero Azotobaeter que incluem Azotobacter sp., Azotobaeter agilis, Azotobacter chroocoeeum, Azotobaeter maeroeytogenes, Azotobaeter vinelandii, etc., microorganismos do gênero Bacillus que incluem 15 Bacillus anthracis, Bacillus eereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtillus, Bacillus thuringiensis, etc., microorganismos do gênero Beggiatoa que incluem Beggiatoa sp., Beggiatoa alba, etc., microorganismos do gênero Beijerinekia que incluem Beijerinekia indieus, Beijerinekia mobilis, etc., microorganismos do gênero Beneekea que incluem Beneekea natrigens, 20 Beneckea pelagia, etc., microorganismos do gênero Caulobaeter que incluem Bordetella pertussis, Bradyrhizobium Japonicumy Caryophamon latum, Caulobaeter baeteroides, Caulobaeter ereseentus, etc., microorganismos do gênero Chlorogloea que incluem Chloroflexus aurantiaeus, Chlorogloea fritsehii, etc., microorganismos do gênero Chromatium que incluem 25 Chromatium minutissimum, Chromatium okenii, Chromatium tepidum, etc., microorganismos do gênero Chromobaeterium que incluem Chromobaeterium violaeeum, etc., microorganismos do gênero Clostridium que incluem Clostridium botulinum, Clostridium sphenoides, etc., microorganismos do gênero Comamonas que incluem Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni, etc., microorganismos do gênero Corynebacterium que incluem Corynebaeterium autotrophieum, Corynebaeterium hydroearboxydans, etc., microorganismos do gênero Derxia que incluem Cyanobaeteria, Derxia gummosa, etc., microorganismos do gênero Desulfonema que incluem Desulfococcus multivorans, Desulfonema limieola, Desulfonema magnum, etc., microorganismos do gênero Ectothiorhodospira que incluem Desulfosacina variabilis, Desulfovibrio sapovorans, Ectothiorhodospira haloehloris, Ectothiorhodospira mobilis, Ectothiorhodospira vaeuolata, etc., microorganismos do gênero Halobaeterium que incluem Ferrobacillus ferroxidans, Flavobaeterium sp., Haemophilus influenzae, Halobaeterium gibbonsii, Halobaeterium voleanii, etc., microorganismos do gênero Hydrogenophaga que incluem Haloferax mediterranei, Hydroelathratus elathratus, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenophaga fiava, Hydrogenophaga pseudoflava, Hydrogenophaga taeniospiralis, etc., microorganismos do gênero Hyphomierobium que incluem Hyphomierobium vulgare, etc., microorganismos do gênero Methylbaeterium que incluem Ilyobater delafieldii, Labrys monaehus, Lamproeystis reseopersicina, Lampropedia hyaline, Legionella sp., Leptothrix diseophorus, Methylbaeterium AMl, Methylbaeterium extorquens, etc., microorganismos do gênero Methylosinus que incluem Methylococcus thermophilus, Methlocystis parvus, Methylomonas methaniea, Methylosinus sporium, Methylosinus trichosporium, etc., microorganismos do gênero Mierococeus que incluem Methylovibrio soehngenii, Mierococeus denitrificans, Mierococeus halodenitrificans, etc., microorganismos do gênero Mycobacterium que incluem Mycobacterium album, Mycobaeterium vaeae, etc., microorganismos do gênero Nitrobaeter que incluem Nitrobaeter agilis, Nitrobaeter winogradskyi, etc., microorganismos do gênero Noeardia que incluem Noeardia alba, Noeardia asteroides, Noeardia lueida, Noeardia rubra, etc., microorganismos do gênero Photobaeterium que incluem Paracoccus dentrificans, Oscillatoria limosa, Penicillium eyelopium, Photobaeterium mandapamensis, Photobaeterium phosphoreum, etc., microorganismos do gênero Pseudomonas que incluem Physarum ployeephalum and Pseudomonas glathei, Pseudomonas indigofera, 5 Pseudomonas lemonieri, Pseudomonas mallei, Pseudomonas marina, Pseudomonas mixta, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas oxalatieus, Pseudomonas pseudoalealigenes, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alealigenes, Pseudomonas asplenii, Pseudomonas butanovora, Pseudomonas eepaeia, Pseudomonas eoronafaciens, Pseudomonas dacunhae, Pseudomonas 10 denitrifieans, Pseudomonas diminuta, Pseudomonas eehinoides, Pseudomonas fluoreseens, Pseudomonas putida, Pseudomonas rubrilineas, Pseudomonas saeeharophila, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas syringae, Pseudomonas thermophilus, Pseudomonas viridiflava, etc., microorganismos do gênero Ralstonia, microorganismos do gênero Rhizobium que incluem 15 Rhizobium hedysarum, Rhizobium lupini, Rhizobium meliloti, Rhizobium phaseoli, Rhizobium trifoli, etc., microorganismos do gênero Rhodobacillus, microorganismos do gênero Rhodobaeter que incluem Rhodobaeter eapsulatus, Rhodobaeter sphaeroides, etc., microorganismos do gênero Rhodococcus que incluem Rhodoeoeeus rhodoehrous, etc., microorganismos 20 do gênero Rhodoeyelus que incluem Rhodoeyelus gelatinosus, Rhodoeyelus tenuis, etc., microorganismos do gênero Rhodopseudomonas que incluem Rhodomierobium vannielii and Rhodopseudomonas aeidophila, Rhodopseudomonas eapsulata, etc., microorganismos do gênero Rhodospirillum que incluem Rhodospirillum molisehianum, Rhodospirillum 25 rubrum, etc., microorganismos do gênero Spirillum que incluem Sphingomonas paueimobilis, Spirillum itersomii, Spirillum serpens, etc., microorganismos do gênero Spirulina que incluem Spirulina jenneri, Spirulina maxima, Spirulina subsaksa, etc., microorganismos do gênero Staphylococcus que incluem Staphyloeoceus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus xylosus, etc., microorganismos do gênero Stella que incluem Stella humosa, Stella vaeuolata, etc., microorganismos do gênero Streptomyees que incluem Streptomyees antibiotieus, Streptomyees eoelieolor, etc., microorganismos do gênero Thiobacillus que incluem 5 Syntrophomonas wolfei, Thermophilie eyanobaeteria, Thermus thermophilus, Thiobacillus A2, Thiobacillus aeidophilus, Thiobacillus versutus, etc., microorganismos do gênero Thioeapsa que incluem Thioeapsa pfennigii, etc., microorganismos do gênero Zoogloea que incluem Thioeystis violaeea, Vibrio parahaemolytieus, Xanthobaeter autotrophieus, Xanthomonas maltophilia, 10 Zoogloea ramigera, etc.

Preferivelmente, o gene de poliidroxialcanoato (PHA) sintase da presente invenção é phaClps6-i9 originado de Pseudomonas sp. 6-19. Mais preferivelmente, o gene de PHA sintase codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 tendo mutações de:

a) S325T e Q481M; b) E130D e Q481K; c) S325T e Q481K;

d) E130D e Q481M; e) E130D e Q481R; f) E130D, S325T e Q481M; g) E130D, S325T e Q481K; h) E130D, S477R e Q481K; i) E130D, S477R e Q481M; j) E130D, S477R e Q481R; k) E130D, S477H e Q481K; 1) E130D, S477H e Q481M; m) E130D, S477H e Q481R; n) E130D, S477F e Q481K; 20 o) E130D, S477F e Q481M; p) E130D, S477F e Q481R; q) E130D, S477Y e Q481K; r) E130D, S477Y e Q481M; s) E130D, S477Y e Q481R; t) E130D, S325T, S477R e Q481M; u) E130D, S325T, S477R e Q481K; v) E130D, S325T, S477F e Q481M; w) E130D, S325T, S477G e Q481M; ou x) E130D, S325T, S477F e Q481K.Estes mutantes de PHA sintase são mais preferíveis 25 no aspecto de usar Iactil-CoA como um substrato.

Na presente invenção, a célula ou planta tendo o gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3- hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, e gene de poliidroxialcanoato (PHA) sintase juntos pode ser cultivada em um meio de cultura compreendendo 3- hidroxialcanoato para produzir o copolímero da presente invenção. Se a célula ou planta podem biossintetizar lactato e 3-hidroxialcanoato a partir de outras fontes de carbono tais como glicose, ácido cítrico, etc., pode não existir necessidade de ainda adicionar 3-hidroxialcanoato, lactato e assim por diante ao meio de cultura.

Transformação de plantas para preparar planta compreendendo genes de transferase e sintase pode ser realizada por métodos convencionais usando Agrobactérias ou vetores de vírus. Por exemplo, plantas transformadas são obtidas transformando uma Agrobactéria com um vetor recombinante 10 contendo o gene inventivo e infectando um tecido, etc. da planta alvo com uma Agrobactéria transformada. Mais especificamente, a planta transformada pode ser preparada pré-cultivando um explante de planta de interesse, e então transformando o explante co-cultivando o explante e uma Agrobactéria transformada; cultivando referidos explantes infectados para induzir calos; e 15 excisando o calo obtido, e cultivando o mesmo em meio indutor de brotos.

O termo “explante," como usado aqui, significa um fragmento de tecido cortado de uma planta, e inclui cotilédone ou hipocótilo. Cotilédone ou hipocótilos podem ser usados como o explante da presente invenção. E mais preferível usar cotilédone obtido desinfectando e lavando as sementes da planta, e germinado o mesmo em meio de cultura MS.

Plantas transformadas úteis para a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, tabaco, tomate, pimentas vermelhas, feijões, arroz, e milho. Também, mesmo que uma planta transformada seja uma que propaga sexualmente, será óbvio para o versado na técnica que tal planta pode ser reproduzida assexuadamente usando cultura de tecido de planta, etc.

[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]

Figura 1 é um diagrama simples de sistema de operon de expressão constitutiva expressando PHA sintase e CP-PCT juntos.

Figura 2 é um mapa de genes de plasmídeo recombinante pPs619C1300-CPPCT compreendendo gene de PHA sintase e gene de CP- PCT de acordo com a presente invenção.

Figura 3 é um mapa de genes de plasmídeo recombinante pTacCpPctNCvEC compreendendo gene de PHA sintase e gene de CP-PCT de acordo com a presente invenção.

Figura 4 é um mapa de genes de plasmídeo recombinante pMCS104ReAB compreendendo genes de phaA e phaB de Ralstonia eutropha.

Figura 5 é resultado de cromatografia de gás de terpolímero P (3HB-co-MCL PHA-co-LA) preparado pelo de E. coli recombinante transformado com plasmídeo pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB.

Figura 6 é um resultado de cromatografia de gás de terpolímero P (3HB-co-3HV- co-LA) preparado pelo E. coli recombinante transformado com plasmídeo pPs619C1300-CPPCT/pMCS104ReAB. [MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO]

Em seguida, a presente invenção é descrita em detalhe considerável. Os exemplos a seguir são oferecidos como forma de ilustração para ajudar os versados na arte a compreender a presente invenção, e não são destinados a limitar o escopo da invenção.

Exemplo 1: Construção de um plasmídeo recombinante compreendendo gene de pct e gene de PHA sintase

Plasmídeos recombinantes, pPs619C1300-CPPCT e pTacCpPctNCvEC, compreendendo gene de pct e gene de PHA sintase são construídos para preparar um copolímero compreendendo unidade de 3- hidroxialcanoato e unidade de lactato.

(1) Construção de plasmídeo pPs619C 13 OO-CPPCT

Gene de propionil-CoA transferase (CP-PCT) derivado de Clostridium propionicum foi usado como um gene de pct, e gene de PHA sintase derivado de Pseudomonas sp. 6-19 foi usado como o gene de PHA sintase.

O operon de sistema de expressão constitutivo expressando PHA sintase e CP-PCT juntos foi construído como na figura I. CP-PCT é bem conhecido por ter toxicidade para o microorganismo hospedeiro. Isto é, 5 em sistema de expressão de promotor de tac ou promotor de T7 induzido por IPTG (este sistema é amplamente usado na expressão de uma proteína recombinante), todos os microorganismos morrem logo após a adição de indutor. Por causa disso, pensa-se como sendo adequado usar sistema de expressão, que é fracamente expressado, mas continuamente expressado, de 10 acordo com o crescimento do microorganismo. Gene de CP-PCT foi obtido por PCR usando o DNA cromossômico de Chostridium propionicum (DSM1682) como gabarito e os iniciadores de SEQ ID NO: I e SEQ ID NO: 2 feitos baseados na seqüência de gene de pct (Selmer et al., Eur J Biochem., 269:372, 2002).

SEQ ID NO: 1: 5 -ggaattc AT G AG AAAGGTTCCC ATT ATT ACCGC AG ATGA

SEQ ID NO: 2: 5-gctctagattaggacttcatttccttcagacccattaagccttctg O sítio de enzima de restrição Ndel de CP-PCT selvagem foi

removido por método SDM para a facilidade de clonagem. Além disso, PCR de sobreposição foi realizado com os iniciadores de SEQ ID NO: 3 e 4 para adicionar sítio de reconhecimento de SbfiJNde\.

SEQ ID NO: 3: 5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3

SEQ ID NO: 4: 5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3

Para separar o gene de PHA sintase (phaClPs6-i9) originado de Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP), DNA total de Pseudomonas sp. 6-

19 foi extraído, e os iniciadores de SEQ ID NO: 5 e 6 foram preparados baseados na seqüência de gene phaClPs6-i9 (Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical e Biomolecular Engineering, KAIST, 2004) e PCR foi realizado para obter o gene de phaClPs6-i9. A seqüência nucleotídica de gene de phaClPs6-i9 é mostrada na SEQ ID NO: 7, da qual a seqüência de aminoácido avaliada é mostrada em SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 5: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3

SEQ ID NO: 6: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3

O gene phaClPs6-i9 obtido acima foi inserido no sítio BstBI/Sbfl de pBluescript II (Stratagene Co., USA) para fazer vetor 5 recombinante pPs619Cl. Sítios BstBI contidos no interior foram removidos por método SDM (mutagênese sítio-dirigida) sem mutação de aminoácido para fazer fragmento de gene de sintase phaClPs6-i9 tendo dois sítios BstBI/Sbfl apenas em ambas as extremidades, e PCR de sobreposição foi realizado com os iniciadores de SEQ ID NO: 9 e 10, SEQ ID NO: 11 e 12, e 10 SEQ ID NO: 13 e 14 para adicionar sítio de reconhecimento BstBI/Sbfl.

SEQ ID NO: 9: 5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3

SEQ ID NO: 10: 5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3

SEQ ID NO: 11: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3

SEQ ID NO: 12: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3

SEQ ID NO: 13:5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3

SEQ ID NO: 14: 5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3

Três posições (130, 325, e 481) de aminoácido que afetam a atividade de síntese de SCL (PHA com comprimento de cadeia curto) de phaC 1 ps6_ 19 sintase foram encontradas por meio de análise de alinhamento de seqüência de aminoácido, e pPs619C1300 compreendendo o gene codificando o mutante tendo mutações de E130D, S325T e Q481M na seqüência de aminoácido phaClPs6.19 sintase foi construído por método SDM, usando o iniciador de SEQ ID NO: 15/16, 17/18, e 19/20 (figura I). O mutante de phaClPs6-i9 sintase foi mostrado na tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Vetor Substituição de ácido Substituição de Iniciador recombinante nucleico aminoácido pPs619C1300 GAA -^GAT E130D SEQ ID NO: 15/16 AGC --->ACC S325T SEQ ID NO: 17/18 CAG --->ATG Q481M SEQ ID NO: 19/20 SEQ ID NO: 15:5- ate aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3

SEQ ID NO: 16: 5- ggt cgg cgc cat cgc ate ggt cat gag gtt gat- 3 SEQ ID NO: 17: 5- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3

SEQ ID NO: 18: 5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3

SEQ ID NO: 19: 5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3

SEQ ID NO: 20: 5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3

O vetor de pPs619C1300 obtido foi excisado com SbflJNdei, e

o gene CP-PCT clonado foi inserido no sítio de reconhecimento de SbflINdel para construir o vetor recombinante pPs619C1300-CPPCT (figura 2).

(2) Construção de pMCS104ReAB

Plasmídeo pMCS104ReAB foi construído para prover alfa- 10 cetotiolase (PhaA) e acetoacetil-CoA redutase (PhaB) derivado de R. eutropha (Si-Jae Park, PhD thesis, Department de Chemical e Biomolecular Engineering, KAIST, 2003). PSYL105 (Lee et al. Biotechnol. Bioeng. 44: 1337, 1994) foi cortado com PstI para obter gene phaAB, que foi inserido em sítio cortado de PstI de pl0499A (Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 15 2002) para construir pl0499PhaAB. O plasmídeo pl0499PhaAB foi cortado com Sspl para obter um fragmento compreendendo promotor 104 e gene de phaAB, e o fragmento foi inserido em sítio cortado de EcoRV de plasmídeo pBBRIMCS para obter plasmídeo pMCS104ReAB (figura 4).

(3) Construção de plasmídeo pTacCpPctNCvEC

Vetor pTac99A (Park e Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 5 2003) foi cortado com Sspl para obter um fragmento de gene compreendendo promotor Tac e terminador de transcrição, e o fragmento foi inserido em pTrc99A (Pharmacia Biotech, Suécia) excisado com enzima de restrição SspI para fazer vetor pTaclac. Gene phaEC foi amplificado com o DNA cromossômico de Chromatium vinosum (DSMZ180) como gabarito e os 10 iniciadores de SEQ ID NO: 21 e 22.

SEQ ID NO: 21: ggaaatc cat ATGACGATGTTCTCGCTCATGGCG SEQ ID NO: 22: ggaaatc catatg ate cag ggc cac tat ctc caa ctg

O gene de phaEC amplificado foi inserido no sítio NdeI excisado do vetor pTaclac para fazer vetor pTaclacNCvEC. Além disso, gene de pct foi obtido cortando pPs619C 13OO-CPPCT com EcoRI/Xbal, e o gene de pct foi inserido no sítio cortado com EcoRI/Xbal de pTaclacNCvEC para fazer pTacCpPctNCvEC (figura 3).

Exemplo 2: Preparação de copolímero 3-hidroxialcanoato com MCL -lactato E. coli WBlOl (Park e Lee, J. Bacterid. 185, 5391-5397, 2003) foi transformado com o plasmídeo recombinante pPs619C1300- CPPCT construído no exemplo 1, compreendendo gene de pct e gene de PHA sintase 20 para obter WB 101/pPs619C 1300-CPPCT de E. coli. WBlOl é relatado como sendo um mutante fadB de E. coli que é efetivo na preparação de MCL-PHA (Patente Coreana expedida No. 10-0447531).

O transformante foi cultivado em duas etapas para obter copolímero de 3-hidroxialcanoato com MCL -lactato como a seguir: Primeiro, WBlOl/ pPs619C1300-CPPCT de E.coli recombinante transformado foi cultivado durante 24 horas em 100 mL de meio de cultura LB (Bacto™ Triptona (BD) 10 g/L, extrato de levedura Bacto™ (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) contendo 100 mg/L de ampicilina e então o meio de cultura foi centrifugado por 15 minutos a 4°C, 1000 g para coletar células.

As células coletadas foram anaerobicamente cultivadas durante 3 dias em meio de cultura MR Bacto™ Triptona (BD) 10 g/L, Bacto 5 ™ extrato de levedura, (BD) 5 g/L, NaCl (amresco) 10 g/L) ainda compreendendo 10 g/L de glicose, 2 g/L de decanoato de sódio e 100 mg/L de ampicilina.

O meio de cultura foi centrifugado por 15 minutos a 4°C, 1000 para coletar células, e as células foram lavadas 4 vezes com água destilada em 10 abundância e secadas por 12 horas a 80 0C. As células completamente secas foram quantificadas, e reagiram com metanol a 100 0C em solvente clorofórmio sob o catalisador de ácido sulfurico. Metade do volume de água destilada foi adicionada em temperatura ambiente ao clorofórmio, e misturada. Em seguida, a mistura foi assentada até ser separada em duas 15 camadas. Nas duas camadas, a camada clorofórmio dissolvendo monômero metilado foi coletada, e os ingredientes do polímero foram analisados com cromatografia de gás. Benzoato foi usado como padrão interno.

Como um resultado da análise, 3-hidrodecanoato de metila e lactato de metila foram detectados em transformante WB101/pPs619C1300- CPPCT de E. coli, o que significa que o copolímero 3-hidroxialcanoato com MCL-Iactato [poli (3-hidroxialcanoato com MCL-co-lactato) foi preparado pelo E. coli recombinante.

Exemplo 3: Preparação de terpolímero de 3-hidroxibutirato-3- hidroxialcanoato com MCL-Iactato WBlOl de E. coli [W3110 {fadB: :Km), Park e Lee, J.

Bacterid. 185:5391, 2003] foi transformado com o plasmídeo recombinante pPs619C 13 OO-CPPCT construído no exemplo 1, compreendendo gene de pct e gene de PHA sintase para obter WB101/pPs619C1300- CPPCT de E. coli. WBlOl é relatado como sendo um mutante fadB de E. coli que é efetivo na preparação de MCL-PHA (Patente Coreana expedida No. 10- 0447531).

O transformante foi cultivado por duas etapas para obter terpolímero de 3-hidroxibutirato-3-hidroxialcanoato com MCL-Iactato como a seguir: Primeiro, WB101/pPs619C1300-CPPCT de E. coli recombinante 5 transformado foi cultivado durante 24 horas em 100 mL de meio LB (Bacto™ Triptona (BD) 10 g/L, Bacto™ extrato de levedura (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) contendo 100 mg/L de ampicilina, e então o meio foi centrifugado durante 15 minutos a 4°C, 1000 g para coletar células.

As células coletadas foram anaerobicamente cultivadas durante 3 dias em meio LB (Bacto™ Triptona (BD) 10 g/L, Bacto™ extrato de levedura (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) ainda compreendendo 1 g/L de 3-hidroxibutirato, 2 g/L de decanoato de sódio e 100 mg/L de ampicilina.

Além disso, WBlOl de E. coli foi transformado com pPs619C 1300-CPPCT e pMCS104ReAB para obter WBlOl/pPs 619C1300- CPPCTVPMCS104ReAB de E. coli.

O WB101 /pPsó 19C13 00-CPPCT/pMCS 104ReAB de E. coli foi cultivado por duas etapas para obter terpolímero de 3-hidroxibutirato- 3-hidroxivalerato-lactato como a seguir: Primeiro, WB101/pPs619C1300- CPPCT/pMCS104ReAB de E. coli recombinante transformado foi cultivado 20 durante 24 horas em 100 mL de meio LB (Bacto™ Triptona(BD) 10 g/L, Bacto™ extrato de levedura (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) contendo 100 mg/L de ampicilina e 30 mg/L de cloranfenicol, e então o meio foi

o

centrifugado durante 15 minutos a 4 C, 1000 g para coletar células. As células coletadas foram anaerobicamente cultivadas durante 3 dias em meio LB ainda compreendendo 1 g/L de 3-hidroxibutirato, 2 g/L de decanoato de sódio e 100 mg/L de ampicilina.

O meio de cultura de WB 101/pPs619C 13 00-CPPCT de E. coli e WB101 /pPsó 19C1300-CPPCT/pMCS104ReAB de E. coli foi centrifugado durante 15 minutos a 4°C, 1000 para coletar as células e as células foram lavadas 4 vezes com abundância de água destilada e secadas durante 12 horas a 80°C. As células completamente secas foram quantificadas, e reagidas com metanol a 100°C em solvente de clorofórmio sob o catalisador de ácido sulfurico. Metade do volume de água destilada foi adicionada em temperatura 5 ambiente ao clorofórmio, e misturada. Em seguida, a mistura foi assentada até ser separada em duas camadas. Nas duas camadas, as camadas de clorofórmio dissolvendo monômero metilado foram coletadas, e os ingredientes do polímero foram analisados com cromatografia de gás. Benzoato foi usado como padrão interno.

Como resultado da análise, 3-hidroxibutirato de metila, 3-

hidroxidecanoato de metila e lactato de metila foram detectados em WB 101/pPs619C 1300-CPPCT de E. coli e transformantes de WB101 /pPsó 19C1300- CPPCT/pMCS104ReAB de E. coli, o que significa que terpolímero de 3-hidroxibutirato-3-hidroxialcanoato com MCL-Iactato 15 [poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxialcanoato com MCL-co-lactato) ] foram preparados por este E. coli recombinante (figura 5).

Exemplo 4: Preparação de copolímero de 3-hidroxibutirato-3-hidroxivalerato- lactato

Top 10 de E. coli (Invitrogen) foi transformado com o plasmídeo recombinante pPs619C 1300-CPPCT construído no exemplo 1, compreendendo gene de pct e gene de PHA sintase para obter TOP10/pPs619C1300-CPPCT de£. coli.

O transformante foi cultivado por duas etapas para obter terpolímero 3-hidroxibutirato-3-hidroxivalerato-lactato como a seguir: 25 Primeiro, Topl0/pPs619C1300- CPPCT de E. coli recombinante transformado foi cultivado durante 24 horas em 100 mL de meio LB (Bacto™ Triptona(BD) 10 g/L, Bacto™ extrato de levedura (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) contendo 100 mg/L de ampicilina, e então o meio foi centrifugado durante 15 minutos a 4°C, 1000 g para coletar células. As células coletadas foram anaerobicamente cultivadas durante 3 dias em meio MR (Glicose 10 g, KH2PO4 6,67 g, (NH4) 2HP04 4 g, MgS04-7H?0 0,8 g, ácido cítrico 0,8 g e solução de metal de traço 5 mL por 1L; composição de solução de metal de traço: 5M HCl 5 mL, FeS04-7H20 10 5 g, CaCl2 2 g, ZnS04-7H20 2,2 g, MnS04-4H20 0,5 g, CuS04-5H20 1 g, (NH4) 6Mo702-4H20 0,1 g, e Na2B4OvlOH2O 0,02 g por 1 L) ainda compreendendo 1 g/L de 3-hidroxivalerato (3-HV), 1 g/L de 3-hidroxibutirato (3-HB) e 100 mg/L de ampicilina.

Além disso, Top 10 de E. coli (Invitrogen) foi transformado com tanto pPs619C 13 00-CPPCT como pMCS104ReAB para obter Top 10/pPs619C1300-CPPCT/pMCS 104ReAB de E. coli.

O transformante foi cultivado por duas etapas para obter terpolímero de 3-hidroxibutirato-3-hidroxivalerato-lactato como a seguir: Primeiro, Top 10/pPs619C 1300- CPPCT/pMCS104ReAB de E. coli 15 recombinante transformado foi cultivado durante 24 horas em 100 mL de meio LB (Bacto™ Triptona (BD) 10 g/L, Bacto™ extrato de levedura (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) contendo 100 mg/L de ampicilina e 30 mg/L de cloranfenicol, e então o meio foi centrifugado durante 15 minutos a 4 C, 1000 g para coletar células.

As células coletadas foram anaerobicamente cultivadas

durante 3 dias em meio MR (Glicose 10 g, KH2PO4 6,67 g, (NH4) 2HP04 4 g, MgS04-7H20 0,8 g, ácido cítrico 0,8 g e solução de metal de traço 5 mL por 1 L; composição de solução de metal de traço: 5M HCl 5 mL, FeS04-7H20 10 g, CaCl2 2 g, ZnSO4-7H20 2,2 g, MnSO4- 4H?0 0,5 g, CuS04-5H20 1 g, 25 (NH4) 6Mo702-4H20 0,1 g, e Na2B4O2-IOH2O 0,02 g por 1L) ainda compreendendo 2 g/L de ácido propiônico ou 2 g/L de ácido valérico, e 100 mg/L de ampicilina e 30 mg/L de cloranfenicol.

O meio de cultura foi centrifugado durante 15 minutos a 4 C, 1000 para coletar células e as células foram lavadas 4 vezes com abundância de água destilada e secadas durante 12 horas a 80°C. As células completamente secadas foram quantificadas, e reagidas com metanol a 100 C em solvente de clorofórmio sob o catalisador de ácido sulfúrico. Metade do volume de água destilada foi adicionada em temperatura ambiente para o 5 clorofórmio e misturada. Então, a mistura foi assentada até separar em duas camadas. Nas duas camadas, a camada de clorofórmio dissolvendo monômero metilado foi coletada, e os ingredientes do polímero foram analisados com cromatografia de gás. Benzoato foi usado como padrão interno.

Como resultado da análise, 3-hidroxibutirato de metila, 3- 10 hidrovalerato de metila e lactato de metila foram detectados em tanto TOP10/pPs619C1300-CPPCT de E. coli como Topl0/pPs619C1300- CPPCT/pMCS104ReAB, o que significa que terpolímero de 3-hidroxibutirato-3- hidroxivalerato-lactato [poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-lactato) ] foi preparado pelo E. coli recombinante (figura 6).

Exemplo 5: Preparação de copolímero 3-hidroxipropionato-lactato

Top 10 de E. coli (Invitrogen) foi transformado com o plasmídeo recombinante pPs619C 1300-CPPCT construído no exemplo 1, compreendendo gene de pct e gene de PHA sintase para obter Top 10/pPs619013 00-CPPCT de E. coli.

O transformante foi cultivado por duas etapas para obter

copolímero 3-hidroxipropionato-lactato como a seguir: Primeiro Top 10/pPs619Cl300-CPPCT de E. coli recombinante transformado foi cultivado durante 24 horas em 100 mL de meio LB (Bacto™ Triptona(BD) 10 g/L, Bacto™ extrato de levedura (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) 25 contendo 100 mg/L de ampicilina, e então o meio foi centrifugado durante 15 minutos a 4°C, 1000 g para coletar células.

As células coletadas foram anaerobicamente cultivadas durante 3 dias em meio MR (Glicose 10 g, KH2PO4 6,67 g, (NH4J2HPO4 4 g, MgS04-7H,0 0,8 g, ácido cítrico 0,8 g e solução de metal de traço 5 mL por 1 L; composição de solução de metal de traço: 5M HCl 5 mL, FeS04-7H20 10 g, CaCl2 2 g, ZnS04-7H20 2,2 g, MnS04-4H20 0,5 g, CuS04-5H->0 1 g, (NH4) 6Mo702-4H20 0,1 g, e Na2B4Og-IOH2O 0,02 g por 1L) ainda compreendendo 2 g/L de 3-hidropropionato (3-HP) e 100 mg/L de ampicilina.

O meio de cultura foi centrifugado durante 15 minutos a 4°C,

1000 para coletar células, e as células foram lavadas 4 vezes com abundância de água destilada e secadas durante 12 horas a 80 C. As células completamente secadas foram quantificadas, e reagidas com metanol a 100 C em solvente de clorofórmio sob o catalisador de ácido sulfurico. Metade do 10 volume de água destilada foi adicionada em temperatura ambiente para o clorofórmio e misturada. Então, a mistura foi assentada até separar em duas camadas. Nas duas camadas, a camada de clorofórmio dissolvendo monômero metilado foi coletada, e os ingredientes do polímero foram analisados com cromatografía de gás. Benzoato foi usado como padrão interno.

Como resultado da análise, 3-hidroxipropionato de metila e

lactato de metila foram detectados em Top 10/pPs619C 13 00-CPPCT de E. coli, o que significa que novo copolímero 3-hidroxipropionato-lactato [poli (3-hidroxipropionato-co-lactato) ] foi preparado pelo E. coli recombinante. Exemplo 6: Preparação de terpolímero de 3-hidroxibutirato-3- hidroxipropionato-lactato

Top 10 de E. coli (Invitrogen) foi transformado com o plasmídeo recombinante pPs619C 13 00-CPPCT construído no exemplo 1, compreendendo gene de pct e gene de PHA sintase para obter Top 10/pPs619C 1300-CPPCT de E. coli.

O transformante foi cultivado por duas etapas para obter

terpolímero 3-hidroxibutirato-3-hidroxipropionato-lactato como a seguir: Primeiro, Top 10/pPs619C 13 00-CPPCT de E. coli recombinante transformado foi cultivado durante 24 horas em 100 mL de meio LB (Bacto™ Triptona(BD) 10 g/L, Bacto™ extrato de levedura (BD) 5 g/L; NaCl (amresco) 10 g/L) contendo IOO mg/L de ampicilina, e então o meio foi centrifugado durante 15 minutos a 4 C, 1000 g para coletar células.

As células coletadas foram anaerobicamente cultivadas durante 3 dias em meio MR (Glicose 10 g, KH2PO4 6,67 g, (NH4)2HPO4 4 g, 5 MgS04-7H200,8 g, ácido cítrico 0,8 g e solução de metal de traço 5 mL por 1 L; composição de solução de metal de traço: 5M HCl 5 mL, FeS04'7H20 10 g, CaCl2 2 g, ZnS04-7H20 2,2 g, MnS04-4H20 0,5 g, CuS04-5H20 1 g, (NH4) 6Mo702-4H20 0,1 g, e Na2B4O2-IOH2O 0,02 g por 1L) ainda compreendendo 2 g/L de 3-hidroxipropionato (3-HP), 1 g/L de 3- 10 hidroxibutirato (3-HB) e 100 mg/L de ampicilina.

o

O meio de cultura foi centrifugado durante 15 minutos a 4 C, 1000 para coletar células e as células foram lavadas 4 vezes com abundância de água destilada e secadas durante 12 horas a 80 C. As células

o

completamente secadas foram quantificadas, e reagidas com metanol a 100 C em 15 solvente de clorofórmio sob o catalisador de ácido sulfurico. Metade do volume de água destilada foi adicionada em temperatura ambiente para o clorofórmio e misturada. Então, a mistura foi assentada até separar em duas camadas. Em duas camadas, a camada de clorofórmio dissolvendo o monômero metilado foi coletada, e os ingredientes do polímero foram analisados com cromatografia de 20 gás. Benzoato foi usado como padrão interno.

Como resultado da análise, 3-hidroxipropionato de metila, 3- hidroxibutirato de metila e lactato de metila foram detectados em Top 10/pPs619C 1300-CPPCT de E. coli, o que significa que terpolímero de 3- hidroxibutirato-3-propionato-lactato [poli (3-hidroxibutirato-co-

hidroxipropionato-co-lactato) ] foi preparado pelo E. coli recombinante. Exemplo 7 : Preparação de vários mutantes

Vários mutantes de PHA sintase foram preparados como a construção de pPs619C1300 com os iniciadores abaixo. Os mutantes obtidos foram mostrados nas tabelas 2, 3, 4 e 5. E130D

SEQ ID NO: 15: 5'-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3'

SEQ ID NO: 16: 5' -ggt cgg cgc cat cgc ate ggt cat gag gtt gat- 3'

S325T

SEQ ID NO: 17: 5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3'

SEQ ID NO: 18: 5'- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3'

S477R

SEQ ID NO: 23: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age cgc ggg cat ate- 3'

SEQ ID NO: 24: 5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3'

S477H

SEQ ID NO: 25: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age cat ggg cat ate- 3'

SEQ ID NO: 26: 5'-gat atg ccc atg gct cga cag cac gaa ttc- 3'

S477F

SEQ ID NO: 27: 5'- gaa ttc gtg ctg tcg age ttt ggg cat ate- 3'

SEQ ID NO: 28: 5'- gat atg ccc aaa gct cga cag cac gaa ttc- 3'

S477Y

SEQ ID NO: 29: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age tat ggg cat ate- 3'

SEQ ID NO: 30: 5’-gat atg ccc ata gct cga cag cac gaa ttc- 3’

S477G

SEQ ID NO: 31: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age ggc ggg cat ate- 3'

SEQ ID NO: 32: 5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc- 3'

Q481K

SEQ ID NO: 33: 5'-ggg cat ate aaa age ate ctg aac ccg c- 3'

SEQ ID NO: 34: 5'-gcg ggt tea gga tgc ttt tga tat gcc c- 3'

Q481M

SEQ ID NO: 35: 5'-ggg cat ate atg age ate ctg aac ccg c- 3'

SEQ ID NO: 36: 5'-gcg ggt tea gga tgc tea tga tat gcc c- 3' Q481R

SEQ ID NO: 37: 5'-ggg cat ate cgc age ate ctg aac ccg c- 3' SEQ ID NO: 38: 5'-gcg ggt tea gga tgc tgc gga tat gcc c- 3'

Tabela 2

Sintase Substituição de ácido Substituição de Inieiadores recombinante nucleico aminoácido pPs619C1200 AGC -»· ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 CAG ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1202 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 CAG ---»AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1203 AGC -»· ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 CAG -*■ AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1204 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 CAG -> ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1205 GAA -»■ GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 CAG -»■ CGC Q481R SEQ ID NO: 37,38 Tabela 3

Sintase Substituição de ácido Substituição de Iniciadores recombinante nucleico aminoácido pPs619C1300 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -» ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 CAG -> ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1301 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 CAG ---» AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1304 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -* CGC S477R SEQ ID NO: 23, 24 CAG -η· AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1305 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -*■ CGC S477R SEQ ID NO: 23, 24 CAG -* ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1306 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> CGC S477R SEQ ID NO: 23, 24 CAG -» CGC Q481R SEQ ID NO: 37, 38 pPs619C1307 GAA -*■ GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> CAT S477H SEQ ID NO: 25, 26 CAG ---► AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1308 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> CAT S477H SEQ ID NO: 25, 26 CAG -> ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1309 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -*· CAT S477H SEQ ID NO: 25, 26 CAG CGC Q481R SEQ ID NO: 37, 38 pPs619C1310 GAA -*· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -» TTT S477F SEQ ID NO: 27, 28 CAG -»■ AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 Tabela 4

Sintase Substituição de ácido Substituição de Iniciadores recombinante nucleico aminoácido pPs619C1311 GAA -*· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -► TTT S477F SEQ ID NO: 27, 28 CAG -► ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1312 GAA -+ GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -» TTT S477F SEQ ID NO: 27, 28 CAG -*· CGC Q481R SEQ ID NO: 37, 38 pPs619C1313 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC TAT S477Y SEQ ID NO: 29, 30 CAG ---> AAA Q481K SEQ ID NO: 33,34 pPs619C1314 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»· TAT S477Y SEQ ID NO: 29,30 CAG -»· ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1315 GAA -» GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»· TAT S477Y SEQ ID NO: 29, 30 CAG -> CGC Q481R SEQ ID NO: 37, 38 Tabela 5

Sintase Substituição de ácido Substituição de Iniciadores recombinante nucleico aminoácido pPs619C1400 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 AGC -> CGC S477R SEQ ID NO: 23, 24 CAG -»· ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1401 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 AGC -> CGC S477R SEQ ID NO: 23, 24 CAG ---> AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1334 GAA -+ GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 AGC -> TTT S477F SEQ ID NO: 27, 28 CAG -»· ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1336 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 AGC -»· GGC S477G SEQ ID NO: 31, 32 CAG -»· ATG Q481M SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1339 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> ACC S325T SEQ ID NO: 17, 18 AGC -»· TTT S477F SEQ ID NO: 27, 28 CAG-> AAA Q481K SEQ ID NO: 33, 34 Exemplo 8: Preparação de P(3HB-co-LA) usando vários mutantes

E. coli recombinante sendo capaz de expressar mutante de PHA sintase originado de Pseudomonas sp. 6-19 e propionil-CoA transferase foi construído como o método descrito no exemplo 3, e usado para preparar P (3HB-co-LA). Resultados foram mostrados nas Tabelas 6, 7 e 8 abaixo.

Tabela 6

Mutação Teor (% peso) LA mol% WT E130 S325 S477 Q481 Dupla C1-202 D K 36,6 35,3 C1-204 D M 28,2 19,7 C1-204 D M 42,9 10,7 C1-205 D R 22,9 35,1 Tabela 7

Mutação Teor (% peso) LA mol% WT E130 S325 S477 Q481 Tripla C1-300 D T M 43,8 31,9 Cl-304 D R K 20,2 22,0 Cl-305 D R M 51,8 15,2 C1-306 D R R 23,5 26,8 Cl-307 D H K 36,9 31,0 Cl-308 D H M 47,0 27,6 Cl-309 D H R 28,5 39,8 Cl-310 D F K 60,4 15,0 C1-311 D F M 49,2 32,3 Cl-312 D F R 57,9 13,2 C1-313 D Y K 51,3 18,5 C1 -314 D Y M 50,8 29,3 C1-315 D Y R 46,1 17,1 Tabela 8

Mutação Teor (% peso) LA mol% WT E130 S325 S477 Q481 Quádrupla C1-400 D T R M 15,8 15,4 Cl-401 D T R K 12,9 12,5 Cl-334 D T F M 1,6 20,8 Cl-336 D T G M 10,3 17,5 Como mostrado nas tabelas 6, 7 e 8, os mutantes de PHA

sintase da presente invenção eficientemente sintetizaram o copolímero de lactato com Iactil-CoA como um substrato.

[APLICABILIDADE INDUSTRIAL]

Como descrito e provado acima, a presente invenção provê um copolímero compreendendo unidade de monômero 3-hidroxialcanoato e unidade de monômero de lactato. A presente invenção também provê um método para preparar o copolímero, em que o método compreende cultivar uma célula ou planta compreendendo o gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente e gene de poliidroxialcanoato sintase (PHA) juntos. O copolímero da presente invenção é um polímero biodegradável sendo capaz de ser usado de modo utilizável em vez de plástico sintético convencional e o copolímero pode ser usado também para uso médico. I LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> LG CHEM, LTD

Korea Advanced Institute of Science and Technology

<120> Copolímero contendo unidade de 3-hidroxialcanoato e unidade de lactato, e seu método de fabricação

<130> F2007-0087PC (PCT07-071 <150> KRl0-2006-O115162 <151> 2006-11-21 <150> KR10-2006-0115163 <151> 2006-11-21 <150> KRl0-2006-0115164 <151> 2006-11-21 <150> KRl0-2006-0116233 <151> 2006-11-23 <150> KR10-2006-0116232 <151> 2006-11-23 <160> 38 <17 0> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> Iniciador <223> <4 00> 1

ggaattcatg agaaaggttc ccattattac cgcagatga 39

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 2

gctctagatt aggacttcat ttccttcaga cccattaagc cttctg 46

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223>

Iniciador <4 00> 3 aggcctgcag gcggataaca atttcacaca gg

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 4

gcccatatgt ctagattagg acttcatttc c

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 5

gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 6

eactcatgea agcgtcaccg ttcgtgcacg tac

<210> 7 <211> 1677 <212> DNA

<213> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC11027BP)

<4 00> 7

atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg

cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc 900 acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677 <210> 8 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC11027BP)

<4 00> 8

Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 15 10 15

Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20

Ala Ser Ala Arg 35

Ser Val Lys His 50

Leu Gly Lys Ser 65

Asp Pro Ala Trp

Tyr Leu Ala Trp 100

Leu Ala Pro Lys 115

Thr Glu Ala Met 130

Lys Arg Phe Phe 145

His Leu Ala Lys

Asn Met Gly Ala 180

Ala Val Val Phe 195

Thr Thr Glu Gln 210

He Asn Lys Phe 225

Arg Phe Cys Leu

Asn Pro Thr Lys 260

Ala Leu Lys Glu 275

Asp Val Asn Met 290

Leu Leu Gly His 305

Thr Leu Leu Val

Leu Phe Val Asn 340

Gln Ala Gly Val

Met Val Leu Arg 40

Val Ala His Phe 55

Gly Leu Gln Pro 70

Ser Gln Asn Pro

85

Arg Lys Glu Leu

Asp Val Ala Arg 120

Ala Pro Thr Asn 135

Glu Thr Gly Gly 150

Asp Leu Val His 165

Phe Glu Val Gly

Arg Asn Asp Val 200

Val Tyr Glu Arg 215

Tyr Val Phe Asp 230

Arg Asn Asn Val 245

Glu Gln Arg Glu

Ala Val Asp Val 280

Leu Gly Ala Cys 295

Tyr Ala Ala Ile 310

Ser Val Leu Asp 325

Glu Gln Thr Leu

Leu Glu Gly Arg

25

Gln Ala Ile Lys

Gly Leu Glu Leu 60

Thr Ser Asp Asp 75

Leu Tyr Lys Arg 90

His Asp Trp Ile 105

Gly His Phe Val

Thr Ala Ala Asn 140

Lys Ser Leu Leu 155

Asn Gly Gly Met 170

Lys Ser Leu Gly 185

Leu Glu Leu Ile

Pro Leu Leu Val 220

Leu Ser Pro Asp 235

Gln Thr Phe Ile 250

Trp Gly Leu Ser 265

Val Thr Ala Ile

Ser Gly Gly Ile 300

Gly Glu Asn Lys 315

Thr Thr Leu Asp 330

Glu Ala Ala Lys 345

Asp Met Ala Lys

Gln Pro Val His 45

Lys Asn Val Leu

Arg Arg Phe Ala 80

Tyr Leu Gln Thr

95

Asp Glu Ser Asn 110

Ile Asn Leu Met 125

Pro Ala Ala Val

Asp Gly Leu Ser 160

Pro Ser Gln Val 175

Val Thr Glu Gly 190

Gln Tyr Lys Pro

205

Val Pro Pro Gln

Lys Ser Leu Ala 240

Val Ser Trp Arg 255

Thr Tyr Ile Glu 270

Thr Gly Ser Lys 285

Thr Cys Thr Ala

Val Asn Ala Leu 320

Ser Asp Val Ala 335

Arg His Ser Tyr 350

Val Phe Ala Trp 355 360 365

Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr 370 375 380

Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn

385 390 395

Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu

405 410 415

Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly 420 425 430

Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala 435 440 445

Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala 450 455 460

Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His

465 470 475

Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met

485 490 495

Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala 500 505 510

Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala 515 520 525

Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys 530 535 540

Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 9

atgcccggag ccggttcgaa 20

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

Leu

Asp

400

Phe

Thr

Gly

Gln

Ile

480

Thr

Gln

Ala

<4 00>

10 cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc

35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 11

gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg

35

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 12

cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 13

gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg 33

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 14 aacgggaggg aacctgcagg 20

<210> 15

<211> 33

<212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador

<4 00> 15

atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 16

ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<400> 17

ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 18

ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag

33

<210> 19 <211> 36 <212> DNA <2 13> Seqüência <220> <22 3> Iniciador <4 00> 19 cgagcagcgg gcatatcatg agcatcctga acccgc

36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 20

gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg

36

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 21

ggaaatccat atgacgatgt tctcgctcat ggcg

34

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 22

ggaaatccat atgatccagg gccaetatct ccaactg

37

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 23

gaattcgtgc tgtcgagccg cgggcatatc 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador

<4 00> 24

gatatgcccg cggctcgaca gcacgaattc 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 25

gaattcgtgc tgtcgagcca tgggcatatc 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 26

gatatgccca tggctcgaca gcacgaattc 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 27

gaattcgtgc tgtcgagctt tgggcatatc 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00>

28 gatatgccca aagctcgaca gcacgaattc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 29

gaattcgtgc tgtcgagcta tgggcatatc 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 30

gatatgccca tagctcgaca gcacgaattc 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 31

gaattcgtgc tgtcgagcgg egggcatatc 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Iniciador

<4 00> 32

gatatgcccg ccgctcgaca gcacgaattc 30

<210> 33

<211> 28

<212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 33

gggcatatca aaagcatcct gaacccgc 28

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 34

gcgggttcag gatgcttttg atatgccc 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 35

gggcatatca tgagcatcct gaacccgc 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 36

gcgggttcag gatgctcatg atatgccc 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 37

gggcatatcc gcagcatcct gaacccgc

28 <210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador

<4 00> 38

gcgggttcag gatgctgcgg atatgccc

28

Claims

1. Copolímero, caracterizado pelo fato de compreender unidade de monômero de lactato e unidade de monômero de 3- hidroxialcanoato.

2. Copolímero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o 3-hidroxialcanoato é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxipropionato e 3-hidroxialcanoato com comprimento de cadeia médio (MCL).

3. Copolímero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o 3-hidroxialcanoato com comprimento de cadeia médio (MCL) é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxi- hexanoato (3HHx), 3-hidroxi-heptanoato (3HHp), 3-hidroxioctanoato (3HO),3-hidroxinonanoato (3HN), 3-hidroxidecanoato (3HD), 3-hidroxiundecanoato (3HUD) e 3-hidroxidodecanoato (3HDD).

4. Copolímero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o copolímero é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de copolímero de 3-hidroxialcanoato com MCL -lactato (poli (3- hidroxialcanoato com MCL-co-lactato)), terpolímero de 3-hidroxibutirato com comprimento de cadeia médio (MCL) 3-hidroxialcanoato-lactato (poli (3- hidroxibutirato-co-3-hidroxialcanoato com MCL-co-lactato)), terpolímero de 3- hidroxibutirato-3-hidroxivalerato-lactato (poli (3-hidroxibutirato-co-3- hidroxivalerato-co-lactato)), copolímero de 3-hidroxipropionato-lactato (poli (3- hidroxipropionato-co-lactato)) e terpolímero de 3-hidroxibutirato-3- hidroxipropionato-lactato (poli (3-hidroxibutirato-co-hidroxipropionato-co- lactato)).

5. Método para preparar um copolímero compreendendo unidade de monômero de lactato e unidade de monômero 3-hidroxialcanoato, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula ou planta compreendendo um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, e gene de poliidroxialcanoato (PHA) sintase juntos.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula ou planta é obtida transformando uma célula ou planta não tendo qualquer um ou ambos dos dois genes com um gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil- CoA, respectivamente, e/ou um gene de poliidroxialcanoato (PHA) sintase usando Iactil-CoA como um substrato.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene de enzima convertendo lactato e 3-hidroxialcanoato em Iactil-CoA e 3-hidroxialcanoil-CoA, respectivamente, é gene de propionil- CoA transferase (pct).

8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene de poliidroxialcanoato (PHA) sintase é phaClpS6-i9 derivado de Pseudomonas sp. 6-19.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene de PHA sintase codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 tendo mutações de a) S325T e Q481M; b) E130D e Q481K; c) S325T e Q481K; d) E130D e Q481M; e) E130D e Q481R; f) E130D, S325T e Q481M; g) E130D, S325T e Q481K; h) E130D, S477Re Q481K; i) E130D, S477R e Q481M; j) E130D, S477R e Q481R; k) E130D, S477H e Q481K; 1) E130D, S477H e Q481M; m) E130D, S477H e Q481R; n) E130D, S477F e Q481K; ο) E130D, S477F e Q481M; ρ) E130D, S477F e Q481R; q) E130D, S477Y e Q481K; r) E130D, S477Y e Q481M; s) E130D, S477Y e Q481R; t) E130D, S325T, S477R e Q481M; u) E130D, S325T, S477R e Q481K; v) E130D, S325T, S477F e Q481M; w) E130D, S325T, S477G e Q481M; ou x) E130D, S325T, S477F e Q481K.

10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula ou planta ainda compreende um gene de enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3-hidroxialcanoil-CoA.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a enzima convertendo 3-hidroxialcanoato em 3-hidroxialcanoil- CoA é uma alfa-cetotiolase (PhaA) e/ou acetoacetil-CoA redutase (PhaB).

12. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula é um microorganismo.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é E. Coli.

14. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado em um meio de cultura compreendendo 3-hidroxialcanoato (3-HA).

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o 3-hidroxialcanoato é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxipropionato e 3-hidroxialcanoato com comprimento de cadeia médio (MCL).