JP5247437B2

JP5247437B2 - ポリ乳酸またはその共重合体の生成能を有する細胞または植物、及びそれを用いたポリ乳酸またはその共重合体の製造方法

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Publication number: JP5247437B2
Application number: JP2008513358A
Authority: JP
Inventors: ジュン−ヒョン・チョ; シ−ジェ・パク; サン−ユップ・イ; ユ−キュン・ジュン
Original assignee: LG Chem Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2026-05-17
Also published as: AR053486A1; DK1885857T3; MY150715A; BRPI0613198A2; JP2008541719A; KR20060121555A; EP1885857A1; ES2404095T3; CN101184843B; KR100979694B1; US20070277268A1; CN101184843A; EP1885857A4; TW200714712A; US9410167B2; EP1885857B1; TWI376417B; WO2006126796A1

Description

本発明は、ポリ乳酸またはその共重合体の生成能を有する細胞または植物、及びそれを用いたポリ乳酸またはその共重合体の製造方法に係り、さらに詳細には、乳酸をラクチル（ｌａｃｔｙｌ）−ＣｏＡに切り換え可能な酵素とＰＨＡ合成に関連した酵素とを発現することができる細胞または植物、及び前記細胞を乳酸または乳酸及び多様なヒドロキシアルカン酸を含む培地で培養するか、または前記植物を栽培することを特徴とするポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸（hydroxyalkanoate）−乳酸（lactate）共重合体の製造方法に関する。

ポリ乳酸（PLA）は、乳酸由来の代表的な生分解性高分子であって、汎用の高分子または医療用の高分子への応用性の高い高分子である。現在、ＰＬＡは、微生物の醗酵によって生産された乳酸を重合することにより製造されているが、乳酸の直接重合によっては低分子量（１０００−５０００ダルトン）のＰＬＡのみが生成される。１００，０００ダルトン以上のＰＬＡを合成するためには、乳酸の直接重合によって得られた低分子量のＰＬＡから、鎖結合剤（chain coupling agent）を利用してさらに高分子量のＰＬＡに重合する方法があるが、高分子量のＰＬＡを製造する方法は、有機溶剤や鎖結合剤を添加することから、工程が複雑になり、また、それらを除去し難いという短所がある。現在、常用化されている高分子量のＰＬＡの生産工程は、乳酸をラクチド（lactide）に切り換えた後、ラクチドリングの開環縮合反応を通じてＰＬＡを合成する方法が使用されている。

一方、ＰＨＡは、過度な炭素源が存在し、燐、窒素、マグネシウム、酸素などの他の栄養分が不足するとき、微生物がエネルギーや炭素源の保存物質としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油由来の合成高分子と類似した物性を有し、かつ完全な生分解性を有するので、既存の合成プラスチックを代替する物質として認識されている。

一般的に、ＰＨＡは、短い炭素数を有するＳＣＬ（short−chain−length）−ＰＨＡと長い炭素数を有するＭＣＬ（medium−chain−length）−ＰＨＡとに大別される。ＰＨＡを合成する遺伝子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどからクローニングされ、組換え微生物を通じて多様な種類のモノマーから構成されたＰＨＡが合成された(Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624)。

微生物でＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素と、ＰＨＡモノマーを利用してＰＨＡ高分子を合成するＰＨＡ合成酵素（synthase）とが必須である。ＰＨＡ合成酵素は、ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡを基質としてＰＨＡを合成し、ＰＨＡの基質であるｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡを提供し得る酵素としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａなどからクローニングされたβ−ケトチオラーゼ（ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ）（PhaA）、汗とアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（PhaB）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからクローニングされた３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰ：ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｙｌ−ＡＣＰ：ＣｏＡｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（PhaG）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｙｌ−ＣｏＡｈｙｄｒａｔａｓｅ）（PhaJ）(Fukui et al., J. Bacteriol., 180:667, 1998; Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000)、大膓菌及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどから由来した３−ケトアシル−ＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ（３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（FabG）などが知られている（Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol., 182:2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 2002）。このような酵素を用いて、多様な炭素位置（主に３、４、５、６番の位置）にヒドロキシル化されたヒドロキシアルカン酸を用いて多様な種類のＰＨＡを合成した。

しかし、２番の位置にヒドロキシル化されたヒドロキシアルカン酸に対するＰＨＡ合成酵素の反応性はほとんどないと報告されている（Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994）。これまでラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡポリメラーゼ（polymerase）の体外活性（in vitro activity）の測定を通じて、ＰＨＡシンターゼ（synthase）のラクチル−ＣｏＡに対する反応性を分析した報告はあったが、ラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡシンターゼの反応性は非常に微弱である（Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994）。すなわち、２番炭素の位置にヒドロキシル化された乳酸のようなヒドロキシアルカン酸は、ＰＨＡシンターゼの基質特異性に適しておらず、自然的にあるいは組換え細胞や植物を利用してＰＨＡ及びその共重合体を製造した例はない。
Fukui et al., J. Bacteriol., 180:667, 1998; Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000

本発明者らは、細胞または植物を利用して高分子量のＰＬＡ及びその共重合体を製造するために鋭意努力した結果、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）遺伝子（pct）で形質転換された組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａを乳酸の含まれた生産培地で培養して、ポリ（ヒドロキシアルカン酸-ｃｏ-乳酸）｛ｐｏｌｙ（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ−ｃｏ−ｌａｃｔａｔｅ）｝共重合体が生成されることを確認し、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（phaRC）及びｐｃｔ遺伝子で形質転換された組換え大膓菌を、乳酸を含む生産培地で培養して、ＰＬＡが生成されることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、ＰＬＡまたはその共重合体［ポリ(ヒドロキシアルカン酸-co-乳酸)］の生成能を有する細胞または植物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記細胞を培養するか、または前記植物を栽培してＰＬＡまたはその共重合体を製造する方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するポルリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の合成酵素の遺伝子とを共に有し、ポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の生成能を有する細胞または植物を提供する。

また、本発明は、前記細胞を、乳酸または乳酸及びヒドロキシアルカン酸を炭素源として含む培地で培養した後、前記培養された細胞からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得るか、または前記植物を栽培した後、栽培された植物体からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得ることを特徴とするポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造方法を提供する。

また、本発明は、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子とを含むポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造用の組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された細胞または植物を提供する。

また、本発明は、前記形質転換細胞を、乳酸またはヒドロキシアルカン酸及び乳酸を炭素源として含む培地で培養した後、前記培養された細胞からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得るか、または前記形質転換植物を栽培した後、前記栽培された植物体からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得ることを特徴とするポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造方法を提供する。

また、本発明は、３−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、３−ヒドロキシ吉草酸（hydroxyvalerate）、４−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、炭素数６〜１４個である中間鎖長（medium chain length）の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（hydroxycarboxylic acid）、３−ヒドロキシプロピオン酸（hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシヘキサン酸（hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシヘプタン酸（hydroxyheptanoic acid）、３−ヒドロキシオクタン酸（hydroxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシノナン酸（hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシデカン酸（hydroxydecanoic acid）、３−ヒドロキシウンデカン酸（hydroxyundecanoic acid）、３−ヒドロキシドデカン酸（hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（hydroxytetradecanoic acid）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（hydroxyhexadecanoic acid）、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（pentenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（octenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（nonenoic acid）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（decenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（methylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（methylheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉc acid）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸（malic acid）、３−ヒドロキシコハク酸（hydroxysuccinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸（hydroxyadipinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸（hydroxysuberic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸（hydroxyazelaic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸（hydroxysebacic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸（hydroxypimelic acid）−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（acetoxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（acetoxynonanoic acid）、フェノキシ（phenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉc acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、パラシアノフェノキシ（para-cyanophenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、パラニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（phenylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸（cyclohexylbutyric acid）、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸（dihydroxydodecanoic acid）、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸（epoxydecanoic acid）、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸（epoxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（fluoroheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（fluorononanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（chlorohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（chlorooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（bromohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（bromooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（bromoundecanoic acid）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（butenoic acid）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−２−メチルブタン酸（methylbutyric acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸、及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸（heptenoic acid）よりなる群から選択された一つ以上のヒドロキシアルカン酸及び乳酸をモノマーとして含むヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を提供する。

また、本発明は、炭素数３〜１２の３ＨＡ（３−ヒドロキシアルカン酸）及び乳酸の共重合体［ポリ(３HA-co-乳酸)］を提供する。

本発明の他の特徴及び具現例は、以下で説明する発明の詳細な説明及び特許請求の範囲からさらに明らかになる。

本発明は、一観点で、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素遺伝子とを共に有し、ポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の生成能を有する細胞または植物に関する。

前記ポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の生成能を有する細胞または植物は、（ｉ）ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有さない細胞または植物を、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子とラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得るか、（ｉｉ）ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞または植物を、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子で形質転換して得るか、または（ｉｉｉ）乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子を有する細胞または植物を、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得ることを特徴とすることができるが、これに制限されるものではない。例えば、前記二つの遺伝子（ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子、及び乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子）のどちらか一方を有する細胞でその遺伝子を増幅させると共に、他方の遺伝子で形質転換させることも本発明の範囲に属する。

本発明において、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子であることを特徴とすることができる。本発明に係る細胞または植物は、ｐｃｔ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換され、同時にｐｈａＲＢＣを含むベクターで形質転換されるか、またはｐｈａＲＢＣが染色体上に挿入されていることを特徴とすることができ、この場合、炭素源として乳酸またはヒドロキシアルカン酸及び乳酸を使用すれば、ポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を製造することが可能である。また、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子はｐｈａＣであることを特徴とし、ｐｃｔ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換され、同時にｐｈａＣを含むベクターで形質転換されるか、またはｐｈａＣが染色体上に挿入されていることを特徴とすることができ、この場合、炭素源として脂肪酸及び乳酸を使用すれば、炭素数３〜１２の３ＨＡ及び乳酸共重合体［ポリ（３HA-co-乳酸）］を製造することが可能である。

前記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞としては、多様な微生物が知られている（KR 10-250830 B1）。例えば、Achromobacter sp.、Achromobacter xylosoxidansなどを含むAchromobacter属の微生物、Acidovorax delafieldii、Acidovax facilis、Acinetobacter sp.、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter lwoffiiなどを含むAcinetobacter属の微生物、Actinomyces sp.、Aeromonas caviae、Aeromonas hydrophila、Aeromonas salmonicidaなどを含むAeromonas属の微生物、Alcaligenes aestus、Alcaligenes denitrificans、Alcaligenes eutrophus (Ralstonia eutrophaに再命名された後、Wautersia eutrophaに再命名される）、Alcaligenes faecalis、Alcaligenes latus、Alcaligenes pacificus Alcaligenes paradoxus、Alcaligenes venestusなどを含むAlcaligenes属の微生物、Alteromonas macleodii、Amoebobacter roseu、Amoebobacter pendensなどを含むAmoebobacter属の微生物、Aphanocapa sp.、Aphanothece sp. Aquaspirillum autotrophicum、Azorhizobium caulinodans、Azospirillum sp.、Azospirillum brasilense、Azospirillum lipoferum などを含むAzospirillum属の微生物、Azotobacter sp.、Azotobacter agilis、Azotobacter chroococcum、Azotobacter macrocytogenes、Azotobacter vinelandii などを含むAzotobacter属の微生物、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus subtillus、Bacillus thuringiensis などを含むBacillus属の微生物、Beggiatoa sp.、Beggiatoa alba などを含むBeggiatoa属の微生物、Beijerinckia indicus、Beijerinckia mobilis などを含むBeijerinckia属の微生物、Beneckia natrigens、Beneckea pelagia などを含むBeneckea属の微生物、Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、Caryophamon latum、Caulobacter bacteroides、Caulobacter crescentus などを含むCaulobacter属の微生物、Chloroflexus aurantiacus、Chlorogloea fritschii などを含むChlorogloea属の微生物、Chromatium minutissimum、Chromatium okenii、Chromatium tepidum などを含むChromatium属の微生物、Chromobacterium violaceum などを含むChromobacterium属の微生物、Clostridium botulinum、Clostridium sphenoides などを含むClostridium属の微生物、Comamonas acidovorans、Comamonas testosteroni などを含むComamonas属の微生物、Corynebacterium autotrophicum、Corynebacterium hydrocarboxydans などを含むCorynebacterium属の微生物、Cyanobacteria、Derxia gummosaを含むDerxia属の微生物、Desulfococcus multivorans、Desulfonema limicola、Desulfonema magnum などを含むDesulfonema属の微生物、Desulfosacina variabilis、Desulfovibrio sapovorans、Ectothiorhodospira halochloris、Ectothiorhodospira mobilis、Ectothiorhodospira vacuolata などを含むEctothiorhodospira属の微生物、Ferrobacillus ferroxidans、Flavobacterium sp.、Haemophilus influenzae、Halobacterium gibbonsii、Halobacterium volcanii などを含むHalobacterium属の微生物、Haloferax mediterranei、Hydroclathratus clathratus、Hydrogenomonas facilis、Hydrogenophaga flava、Hydrogenophaga pseudoflava、Hydrogenophaga taeniospiralis などを含むHydrogenophaga属の微生物、Hyphomicrobium vulgareを含むHyphomicrobium属の微生物、Ilyobacter delafieldii、Labrys monachus、Lamprocystis reseopersicina、Lampropedia hyalina、Legionella sp.、Leptothrix discophorus、Methylobacterium AM1、Methylobacterium extorquens などを含むMethylobacterium属の微生物、Methylococcus thermophilus、Methlocystis parvus、Methylomonas methanica、Methylosinus sporium、Methylosinus trichosporium などを含むMethylosinus属の微生物、Methylovibrio soehngenii、Micrococcus denitrificans、Micrococcus halodenitrificans などを含むMicrococcus属の微生物、Mycobacterium album、Mycobacterium vacae などを含むMycobacterium属の微生物、Nitrobacter agilis、Nitrobacter winogradskyi などを含むNitrobacter属の微生物、Nocardia alba、Nocardia asteroides、Nocardia lucida、Nocardia rubra などを含むNocardia属の微生物、Paracoccus dentrificans、Oscillatoria limosa、Penicillium cyclopium、Photobacterium mandapamensis、Photobacterium phosphoreum などを含むPhotobacterium属の微生物、Physarum ploycephalum、Pseudomonas glathei、Pseudomonas indigofera、Pseudomonas lemonieri、Pseudomonas mallei、Pseudomonas marina、Pseudomonas mixta、Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas oxalaticus、Pseudomonas pseudoalcaligenes、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas butanovora、Pseudomonas cepacia、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas denitrificans、Pseudomonas diminuta、Pseudomonas echinoides、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas rubrilineas、Pseudomonas saccharophila、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas syringae、Pseudomonas thermophilus、Pseudomonas viridiflava などを含むPseudomonas属の微生物、Ralstonia属の微生物、Rhizobium hedysarum、Rhizobium lupini、Rhizobium meliloti、Rhizobium phaseoli、Rhizobium trifoli などを含むRhizobium属の微生物、Rhodobacillus属の微生物、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides などを含むRhodobacter属の微生物、Rhodococcus rhodochrousを含むRhodococcus属の微生物、Rhodocyclus gelatinosus、Rhodocyclus tenuis などを含むRhodocyclus属の微生物、Rhodomicrobium vannielii、Rhodopseudomonas acidophila、Rhodopseudomonas capsulata などを含むRhodopseudomonas属の微生物、Rhodospirillum molischianum、Rhodospirillum rubrum などを含むRhodospirillum属の微生物、Sphingomonas paucimobilis、Spirillum itersomii、Spirillum serpens などを含むSpirillum属の微生物、Spirulina jenneri、Spirulina maxima、Spirulina subsaksa などを含むSpirulina属の微生物、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus xylosus などを含むStaphylococcus属の微生物、Stella humosa、Stella vacuolata などを含むStella属の微生物、Streptomyces antibioticus、Streptomyces coelicolor などを含むStreptomyces属の微生物、Syntrophomonas wolfei、Thermophilic cyanobacteria、Thermus thermophilus、Thiobacillus A2、Thiobacillus acidophilus、Thiobacillus versutus などを含むThiobacillus属の微生物、Thiocapsa pfennigii などを含むThiocapsa属の微生物、Thiocystis violacea、Vibrio parahaemolyticus、Xanthobacter autotrophicus、Xanthomonas maltophilia、Zoogloea ramigera などを含むZoogloea属の微生物などがある。

本発明は、他の観点で、前記細胞を、乳酸または乳酸及びヒドロキシアルカン酸を炭素源として含む培地で培養した後、前記培養された細胞からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得るか、または前記植物を栽培した後、栽培された植物体からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得ることを特徴とするポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造方法に関する。

本発明において、ヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体は、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）、ポリ（４ＨＢ−ｃｏ−乳酸）、ポリ（３ＨＰ−ｃｏ−乳酸）、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ−ｃｏ−乳酸）及びポリ（３ＨＰ−ｃｏ−４ＨＢ−ｃｏ−乳酸）よりなる群から選択されることを特徴とすることができるが、これに制限されるものではない。例えば、本発明に係るヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体のヒドロキシアルカン酸は、３−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、３−ヒドロキシ吉草酸（hydroxyvalerate）、４−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、炭素数６〜１４個である中間鎖長（medium chain length）の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（hydroxycarboxylic acid）、３−ヒドロキシプロピオン酸（hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシヘキサン酸（hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシヘプタン酸（hydroxyheptanoic acid）、３−ヒドロキシオクタン酸（hydroxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシノナン酸（hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシデカン酸（hydroxydecanoic acid）、３−ヒドロキシウンデカン酸（hydroxyundecanoic acid）、３−ヒドロキシドデカン酸（hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（hydroxytetradecanoic acid）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（hydroxyhexadecanoic acid）、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（pentenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（octenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（nonenoic acid）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（decenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（methylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（methylheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉc acid）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸（malic acid）、３−ヒドロキシコハク酸（hydroxysuccinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸（hydroxyadipinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸（hydroxysuberic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸（hydroxyazelaic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸（hydroxysebacic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸（hydroxypimelic acid）−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（acetoxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（acetoxynonanoic acid）、フェノキシ（phenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉc acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、パラシアノフェノキシ（para-cyanophenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、パラニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（phenylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸（cyclohexylbutyric acid）、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸（dihydroxydodecanoic acid）、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸（epoxydecanoic acid）、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸（epoxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（fluoroheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（fluorononanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（chlorohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（chlorooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（bromohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（bromooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（bromoundecanoic acid）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（butenoic acid）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−２−メチルブタン酸（methylbutyric acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸、及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸（heptenoic acid）よりなる群から選択された一つ以上であることができる。

また、本発明は、また他の観点で、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子とを含むポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造用の組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された細胞または植物に関する。

用語「ベクター（vector）」とは、適合な宿主内でＤＮＡを発現させ得る適合な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。本発明において、前記ベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミッドベクター、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosome）ベクターなどが使用できる。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用することが望ましい。このような目的に使用され得る典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当り数百個のプラスミドベクターを含むように複製を効率的に行わせる複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選抜させる抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入され得る制限酵素の切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素の切断部位が存在せずとも、通常の方法による合成オリゴヌクレオチド・アダプダ（adaptor）またはリンカー（linker）を使用すれば、ベクター及び外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ligation）することができる。

ライゲーション後、ベクターは、適切な宿主細胞で形質転換されねばならない。本発明において好ましい宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞でありうる。好みの宿主細胞は、原核細胞である。好適な原核細胞は、前述のＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する微生物だけでなく、大膓菌のようにＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有さない微生物を使用することができる。また、前記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する微生物として、ＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換された大膓菌を使用することも可能である。好適な大膓菌は、E.coli DH5a, E.coli JM101, E.coli K12, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli XL1-Blue(Stratagene)及びE.coli Bなどを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ．ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種（species）及び属（genera）なども使用されることができる。前述のＥ．ｃｏｌｉ及びＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する微生物に付け加えて、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属の菌株、枯草菌（Bacillus subtilis）のような壊疽菌（bacilli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）またはセラチア菌（Serratia marcescens）のようなさらに他の腸内細菌などが宿主細胞として使用されることができる。酵母及びカビのような周知の真核宿主細胞、スポドプテラ・フルギペルタ（Spodoptera frugiperda、SF9）のような昆虫細胞、ＣＨＯ及びネズミ細胞のような動物細胞、組職培養された人間細胞及び植物細胞も使用されることができる。適当な宿主で形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製及び機能するか、またはある場合にゲノムそのものに統合されることができる。

周知のように、宿主細胞で形質転換遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び判読の発現調節配列に作動可能に連結されねばならない。望ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製開始点（replication origin）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。

前述の発現ベクターによって、形質転換細胞は、本発明のさらに他の側面を構成する。本明細書で使用された用語「形質転換」は、ＤＮＡを宿主として導入して、ＤＮＡが、染色体外の因子または染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する。

もちろん、全てのベクター及び発現調節配列が本発明のＤＮＡ配列の発現に同等に機能しないということを理解せねばならない。同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して同一に機能を発揮するものではない。しかし、当業者ならば、過度な実験をせずとも本発明の範囲を逸脱しないまま、多くのベクター、発現調節配列及び宿主のうち適切に選択することができる。例えば、ベクターを選択するに当っては宿主を考慮せねばならないが、これは、ベクターが宿主内で複製される必要があるからである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力、及び当該ベクターによってコートされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮されねばならない。これらの変数の範囲内で、当業者は、本発明に適した各種のベクター／発現調節配列／宿主の組み合わせを選定することができる。

一方、植物体の形質転換は、アグロバクテリウムやウイルスベクターなどを利用した通常の方法によって達成することができる。例えば、本発明に係る遺伝子を含む組換えベクターでアグロバクテリウム属の微生物を形質転換させた後、前記形質転換されたアグロバクテリウム属の微生物を対象植物の組職などに感染させて形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換された植物を利用してＰＨＡを製造することに関する先特許（WO 94／11519；US6,103,956）と同一または類似した方法によって本発明に適した形質転換植物を得ることができる。

本発明で利用可能な形質転換対象植物としては、タバコ、トマト、唐辛子、豆、稲、トウモロコシなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、形質転換に使用される植物が有性繁殖植物であっても、組職培養などによって無性的に繰り返して生殖させ得るということは、当業者には明らかである。

本発明は、さらに他の観点で、前記形質転換細胞を、乳酸またはヒドロキシアルカン酸及び乳酸を炭素源として含む培地で培養した後、前記培養された細胞からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得るか、または前記形質転換植物を栽培した後、前記栽培された植物体からポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を得ることを特徴とするポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造方法に関する。

本発明は、さらに他の観点で、３−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、３−ヒドロキシ吉草酸（hydroxyvalerate）、４−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、炭素数６〜１４個である中間鎖長（medium chain length）の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（hydroxycarboxylic acid）、３−ヒドロキシプロピオン酸（hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシヘキサン酸（hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシヘプタン酸（hydroxyheptanoic acid）、３−ヒドロキシオクタン酸（hydroxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシノナン酸（hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシデカン酸（hydroxydecanoic acid）、３−ヒドロキシウンデカン酸（hydroxyundecanoic acid）、３−ヒドロキシドデカン酸（hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（hydroxytetradecanoic acid）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（hydroxyhexadecanoic acid）、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（pentenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（octenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（nonenoic acid）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（decenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（methylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（methylheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉc acid）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸（malic acid）、３−ヒドロキシコハク酸（hydroxysuccinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸（hydroxyadipinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸（hydroxysuberic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸（hydroxyazelaic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸（hydroxysebacic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸（hydroxypimelic acid）−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（acetoxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（acetoxynonanoic acid）、フェノキシ（phenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉc acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、パラシアノフェノキシ（para-cyanophenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、パラニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（phenylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸（cyclohexylbutyric acid）、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸（dihydroxydodecanoic acid）、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸（epoxydecanoic acid）、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸（epoxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（fluoroheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（fluorononanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（chlorohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（chlorooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（bromohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（bromooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（bromoundecanoic acid）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（butenoic acid）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−２−メチルブタン酸（methylbutyric acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸、及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸（heptenoic acid）よりなる群から選択された一つ以上のヒドロキシアルカン酸及び乳酸をモノマーとして含むヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体に関する。

本発明において、前記ヒドロキシアルカン酸は、３ＨＢ及び４ＨＢを含むか、または３ＨＰ及び４ＨＢを含むことを特徴とすることができる。

本発明は、さらに他の観点で、炭素数３〜１２の３ＨＡ及び乳酸の共重合体[ポリ(3HA-co-乳酸)]を提供する。

本発明において、炭素数３〜１２の３ＨＡ及び乳酸の共重合体は、［ポリ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−乳酸）］または［ポリ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３ＨＤＤ−乳酸）］であることを特徴とすることができる。

本発明では、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子（pct）をｐＴａｃ９９Ａに挿入して発現ベクターｐＴａｃ９９Ｐｃｔ（図１）を製作した後、これをｐＢＢＲ１ＭＣＳに挿入して組換え発現ベクターｐＭＣＳＴａｃＰｃｔを製作した（図２）。また、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＡＴＣＣ１４５７９由来のｐＨＡ合成酵素の遺伝子（phaRBC）をｐ１０４９９Ａベクターに挿入して組換え発現ベクターｐ１０４９９ＢｃＲＢＣを製作した（図３）。さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３由来のｐＨＡ合成酵素の遺伝子（phaC）を増幅させた後、ｐ１０４９９Ａに挿入して組換え発現ベクターｐ１０４９９６１３Ｃ２を製作した（図４）。

一方、使用する炭素源の種類によって多様なＰＨＡ及びその共重合体を製造することができるということは周知のことである（KR 10-250830 B1; Lee, Biotechnol. Bioeng., 49:1, 1996; Steirlbchel and Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128:219, 1995）。３−ヒドロキシプロピン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（３ＨＰ））、４−ヒドロキシ酪酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（４ＨＢ））、３−ヒドロキシ酪酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（３ＨＢ））、３−ヒドロキシへキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ（３ＨＨｘ））、３−ヒドロキシオクタノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏａｔｅ（３ＨＯ））、３−ヒドロキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏａｔｅ（３ＨＤ））、３−ヒドロキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ（３ＨＤＤ））など、全てのヒドロキシアルカン酸をＰＨＡのモノマーから構成することができ、モノマー及びそのモル組成比が多様に構成されたＰＨＡを製造することが可能である。すなわち、培養時に使用する炭素源の種類によって、３−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、３−ヒドロキシ吉草酸（hydroxyvalerate）、４−ヒドロキシ酪酸（hydroxybutyrate）、炭素数６〜１４個である中間鎖長（medium chain length）の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（hydroxycarboxylic acid）、３−ヒドロキシプロピオン酸（hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシヘキサン酸（hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシヘプタン酸（hydroxyheptanoic acid）、３−ヒドロキシオクタン酸（hydroxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシノナン酸（hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシデカン酸（hydroxydecanoic acid）、３−ヒドロキシウンデカン酸（hydroxyundecanoic acid）、３−ヒドロキシドデカン酸（hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（hydroxytetradecanoic acid）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（hydroxyhexadecanoic acid）、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（pentenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（octenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（nonenoic acid）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（decenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（methylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（methylheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉc acid）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸（malic acid）、３−ヒドロキシコハク酸（hydroxysuccinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸（hydroxyadipinic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸（hydroxysuberic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸（hydroxyazelaic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸（hydroxysebacic acid）−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸（hydroxypimelic acid）−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバチン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（acetoxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（acetoxynonanoic acid）、フェノキシ（phenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉc acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、パラシアノフェノキシ（para-cyanophenoxy）−３−ヒドロキシ酪酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、パラシアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、パラニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（phenylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸（cyclohexylbutyric acid）、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸（dihydroxydodecanoic acid）、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸（epoxydecanoic acid）、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸（epoxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（fluoroheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（fluorononanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（chlorohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（chlorooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（bromohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（bromooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（bromoundecanoic acid）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（butenoic acid）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−２−メチルブタン酸（methylbutyric acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸、及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸（heptenoic acid）などのようなヒドロキシアルカン酸を含むヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を製造することが可能である。また、上述の単結合化合物の他に二重結合や三重結合を有するヒドロキシアルケノエート（hydroxyalkenoate）をモノマーとして含む共重合体を製造することも可能である。したがって、本発明で使用された用語「ヒドロキシアルカン酸」は、前記配列された単一結合化合物のほかに二重結合や三重結合を有するヒドロキシアルケノエートも包括すると定義される。

したがって、本発明によって提供される組換えベクターで形質転換された細胞または植物を利用する場合、ＰＬＡだけでなく乳酸及び多様なヒドロキシアルカン酸の共重合体［ポリ(ヒドロキシアルカン酸-co-乳酸)］を製造することが可能である（図５ないし図８）。

ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有するＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａＮＣＩＭＢ１１５９９を、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（pct）を有するプラスミドで形質転換して得られた組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａを乳酸または乳酸及び多様な炭素源を添加して培養する場合、多様な組み合わせの共重合体を製造することが可能である。例えば、前記組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａを乳酸の含まれた生産培地で培養する場合、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）の製造が可能である（図５）。また、前記組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａを３ＨＢ、４ＨＢ及び乳酸の含まれた生産培地で培養する場合、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ−ｃｏ−乳酸）の製造が可能である（図６）。

Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ１４５７９）由来のｐｈａＲＢＣを含む組換えベクターと、ｐｃｔを含む組換えベクターとで形質転換された組換え大膓菌（またはｐｈａＲＢＣとｐｃｔとを共に含む組換えベクターで形質転換された組換え大膓菌）を乳酸の含まれた生産培地で培養する場合、ポリ乳酸の製造が可能である（図７）。さらに、前記組換え大膓菌を乳酸及び多様な炭素源を添加して培養する場合、多様な組み合わせの共重合体を製造することが可能である。

一方、ＫＲ１０−０４４７５３１Ｂ１では、ｐ１０４９９６１３Ｃ２で形質転換された組換え大膓菌ＷＢ１０１を、デカノン酸及びドデカノン酸を含む培地でそれぞれ培養する場合、３ＨＨｘ、３ＨＯ及び３ＨＤを含む共重合体及び３ＨＨｘ、３ＨＯ、３ＨＤ及び３ＨＤＤを含む共重合体が製造されるということが確認された。したがって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３由来のｐＨＡ合成酵素の遺伝子（phaC）を含む組換えベクターと、ｐｃｔを含む組換えベクターとで形質転換された組換え大膓菌（またはｐｈａＣとｐｃｔとを共に含む組換えベクターで形質転換された組換え大膓菌）を乳酸及び脂肪酸の含まれた生産培地で培養する場合、炭素数３〜１２のＭＣＬ−ＰＨＡモノマー及び乳酸を含む共重合体［ポリ（３ＨＡ−ｃｏ−乳酸）］を製造することができる（図８）。例えば、前記組換え大膓菌を乳酸及びデカン酸の含まれた培地でそれぞれ培養する場合、［ポリ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−乳酸）］の製造が可能であり、乳酸及びドデカノン酸の含まれた培地でそれぞれ培養する場合、［ポリ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３ＨＤＤ−乳酸）］の製造が可能である。

生物学的ポリ乳酸及びその共重合体の製造に使用される培地は、本発明の目的を阻害しない限り、特別に制限されるものではなく、本発明では、組換え大膓菌の培養時には複合培地であるＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を使用した。また、組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａの培養時には、基本培地であるＮ−ｌｉｍｉｔｅｄＭＲ培地を使用した。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業者には明らかである。

下記実施例では、ＰＨＡポリメラーゼの基質であるラクチル−ＣｏＡを提供するために、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子としてｐｃｔを使用したが、他の微生物由来のトランスフェラーゼ遺伝子を使用しても同じ結果が得られるということは、当業者には明らかである。

また、下記実施例では、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３由来のｐｈａＣとＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ１４５７９）由来のｐｈａＲＢＣのみを例示したが、Ｗａｕｔｅｒｓｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍなど、多様な種類の微生物から由来した基質特異性の類似したＰＨＡ合成酵素などを使用しても同じ結果が得られるということは、当業者には明らかである。

また、下記実施例では、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有さない微生物及びＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物としてそれぞれ大膓菌及びＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａのみを例示したが、他の種類の細胞（バクテリア、酵母、カビ、動・植物細胞）及び植物を使用しても同じ結果が得られるということも、当業者には明らかである。

実施例１：ｐｃｔを含む組換えベクターの製作
ｐｃｔのＰＣＲクローニングのために、ｐｃｔ遺伝子シーケンス(Selmer et al., Eur J Biochem., 269:372, 2002)に基づいて配列番号１及び２の塩基配列を有するプライマを合成した。

配列番号１: 5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA
配列番号２: 5-gctctagattaggacttcatttccttcagacccattaagccttctg

ｐｃｔを増幅するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍの染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号１及び２のプライマを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５０秒間変性（denaturation）、５２℃で５０秒間徐冷復元（アニーリング（annealing））、７２℃で２分間伸長（extension）を一周期として、総３０周期を繰り返した。ＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動法によって確認した結果、ｐｃｔに該当する１．５ｋｂサイズの遺伝子断片を確認した。ｐＴａｃ９９Ａベクター(Park and Lee, J. Bacteriol., 185:5391, 2003)をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ酵素で切断した後、ｐｃｔをｐＴａｃ９９ＡのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩの認識部位に挿入することによりｐＴａｃ９９Ｐｃｔ組換え発現ベクターを製造した（図１）。また、ｐＴａｃ９９ＰｃｔをＢａｍＨＩ／ＳｃａＩで切断して得た遺伝子断片を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶで切断したｐＢＲＲ１ＭＣＳ(Kovach et al., Gene, 166:175, 1995)に挿入することによりｐＭＣＳＴａｃＰｃｔを製作した（図２）。

実施例２：ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えベクターの製作
ｐｈａＲＢＣ遺伝子オペロンを増幅するために、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４のプライマを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５０秒間変性、５２℃で５０秒間徐冷復元、７２℃で２分間伸長を一周期として、総３０周期を繰り返した。

配列番号３: 5-ggaattcatgaattgtttcaaaaacga
配列番号４: 5-cgggatccttaattagaacgctcttcaa

ＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動法によって確認した結果、ｐｈａＲＢＣに該当する２．５ｋｂサイズの遺伝子断片を確認した。ｐ１０４９９Ａベクター(KR 10-0447531B1)をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ酵素で切断した後、ｐｈａＲＢＣをｐ１０４９９ＡのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩの認識部位に挿入することによりｐ１０４９９ＢｃＲＢＣ組換え発現ベクターを製作した（図３）。

また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３由来のｐＨＡポリメラーゼ遺伝子（phaC）を増幅させた後、ｐ１０４９９Ａに挿入することにより組換え発現ベクターｐ１０４９９６１３Ｃ２を製作した(KR 10-0447531B1)（図４）。

実施例３：組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａの製作及びそれを用いたヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造
実施例１で製作されたｐＭＣＳＴａｃＰｃｔをＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａＮＣＩＭＢ１１５９９に導入して組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ（ｐＭＣＳＴａｃＰｃｔ）を製作した後、２ステップの培養を行った。まず、組換えＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａをＮＢ培地（Nutrient Broth; Peptone 5g/L, Beef extract 3g/L）で一晩中培養した後に遠心分離して得た菌体を、２ｇ／Ｌの乳酸の含まれたＮ−ｌｉｍｉｔｅｄＭＲ培地で３日間培養した。Ｎ−ｌｉｍｉｔｅｄＭＲ培地の組成は、次の通りである：ＫＨ_２ＰＯ_４６．６７ｇ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４４ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．８ｇ、クエン酸０．８ｇ、及び微量金属溶液５ｍＬ。微量金属溶液(リットル当り）：５ＭＨＣｌ５ｍＬ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１０ｇ、ＣａＣｌ_２２ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２．２ｇ、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１ｇ、（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２・４Ｈ_２Ｏ０．１ｇ、及びＮａ_２Ｂ_４Ｏ_２・１０Ｈ_２Ｏ０．０２ｇ。

前記培養液を遠心分離して菌体を得て凍結乾燥させた後、クロロホルムを利用して菌体に蓄積された高分子物質を得た。図９及び図１０に示すように、得られた高分子物質に対するＮＭＲ分析を行った結果、前記得られた高分子物質はポリ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）共重合体であるということが確認された。

実施例４：組換え大膓菌の製作及びそれを用いたポリ乳酸及びヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造
実施例１で製作されたｐＭＣＳＴａｃＰｃｔと実施例２で製作されたｐ１０４９９ＢｃＲＢＣとを大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入して組換え大膓菌を製作し、前記組換え大膓菌を２ｇ／Ｌの乳酸の含まれたＬＢ培地で４日間培養した後、遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を凍結乾燥した後、クロロホルムを利用して菌体に蓄積された高分子物質を得た。得られた高分子物質に対するＮＭＲ分析を行った結果、前記得られた高分子物質はポリ乳酸であるということが確認された（図１１）。

また、実施例１で製作されたｐＭＣＳＴａｃＰｃｔと実施例２で製作されたｐ１０４９９６１３Ｃ２とを大膓菌ＷＢ１０１［Ｗ３１１０（ｆａｄＢ：：Ｋｍ）］に導入して組換え大膓菌を製作した。ＷＢ１０１は、ｆａｄＢ突然変異体の大膓菌であって、ＭＣＬ−ＰＨＡの生産に効果的であると知られた菌株である(KR 10-0447531B1)。前記組換え大膓菌ＷＢ１０１を、２ｇ／Ｌの乳酸及び２ｇ／Ｌのデカノン酸の含まれたＬＢ培地でそれぞれ４日間培養した後、遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を凍結乾燥した後、クロロホルムを利用して菌体に蓄積された高分子物質を得た。得られた高分子物質に対するＮＭＲ分析を行った結果、前記得られた高分子物質は［ポリ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−乳酸）］共重合体であるということが確認された。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、斯かる詳細な記述は単に好適な実施様態を説明したものであって、これに本発明の範囲が限定されるものではないことは、当業者にとって明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されると言える。

以上説明したように、本発明は、乳酸をラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用できるＰＨＡ合成酵素遺伝子とを発現する細胞または植物及びそれを用いたポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体の製造方法を提供する効果がある。本発明によれば、細胞または植物を利用してポリ乳酸を製造可能であり、乳酸及び多様なヒドロキシアルカン酸をモノマーとして含む多様な種類のポリエステルを製造することができる。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のｐｃｔを含む組換えプラスミドｐＴａｃ９９Ｐｃｔの遺伝子地図である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のｐｃｔを含む組換えプラスミドｐＭＣＳＴａｃ９９Ｐｃｔの遺伝子地図である。Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来のｐｈａＲＢＣを含む組換えプラスミドｐ１０４９９ＢｃＲＢＣの遺伝子地図である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３由来のｐＨＡ合成酵素遺伝子ｐｈａＣ２_Ｐｓを含む組換えプラスミドｐ１０４９９６１３Ｃ２の遺伝子地図である。葡萄糖及び乳酸を利用してＰ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）を合成する経路を示す模式図である。葡萄糖、４ＨＢ、３ＨＰ及び乳酸を利用して共重合体Ｐ（３ＨＰ−ｃｏ−４ＨＢ−ｃｏ−乳酸）を合成する経路を示す模式図である。細胞を利用してＰＬＡを合成する経路を示す模式図である。炭素数３〜１２の中間鎖長(medium chain length)の３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＡ）及び乳酸をモノマーとして含む共重合体ポリ（３ＨＡ−ｃｏ−乳酸）の合成経路を示す模式図である。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａＮＣＩＭＢ１１５９９（ｐＭＣＳＴａｃＰｃｔ）で製造されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の^１Ｈ−ＮＭＲ結果を示す図である。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａＮＣＩＭＢ１１５９９（ｐＭＣＳＴａｃＰｃｔ）で製造されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の^１３Ｃ−ＮＭＲ結果を示す図である。大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐ１０４９９ＢｃＲＢＣ＋ｐＭＣＳＴａｃＰｃｔ）で製造されたＰＬＡの^１Ｈ−ＮＭＲ結果を示す図である。

Claims

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来であるpctであるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用することができるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素をコードする遺伝子を共に有し、ポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体[ポリ（ヒドロキシアルカン酸−ｃｏ−乳酸）]の生成能を有する形質転換された細胞であって、前記ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来であるphaC及びＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来であるphaRBCの一方または両方であることを特徴とする、形質転換された細胞。
前記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子を含まない細胞を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来であるpctであるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来であるphaC及びＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来であるphaRBCのから選択されるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換して収得することを特徴とする請求項１に記載の細胞。
Pctを含む組換えベクターで形質転換されて、かつphaCまたはphaRBCを含むベクターで形質転換されるかphaCまたはphaRBCが染色体に挿入されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
ＰＨＡ合成酵素の遺伝子を含まない細胞は大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来であるpctであるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子を含む組換えベクターで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来であるphaC及びＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来であるphaRBCのから選択されるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子を有する細胞を形質転換して収得することを特徴とする請求項１に記載の細胞。
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来であるpctであるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子を含む細胞を、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用することができるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターで形質転換して収得され、前記ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来であるphaC及びＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来であるphaRBCの一方または両方であることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来であるpctであるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子を含む細胞は前記遺伝子で増幅されていることを特徴とする請求項６に記載の細胞。
請求項１、３、４、５、６及び７の何れか一項に記載の細胞を乳酸；または乳酸及び多様なヒドロキシアルカン酸を炭素源として含む培地で培養した後、前記培養された細胞からポリ乳酸またはポリ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）共重合体を得ることを特徴とするポリ乳酸またはポリ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）共重合体の製造方法。
請求項１または３に記載の細胞を乳酸及びデカン酸である脂肪酸を炭素源として含む培地で培養した後、前記培養された細胞から[ポリ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−乳酸）]共重合体および乳酸を得ることを特徴とする[ポリ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−乳酸）]共重合体の製造方法。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来であるpctであるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用することができるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素をコードする遺伝子とを含む組換えベクターであって、前記ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来であるphaC及びＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来であるphaRBCの一方または両方であることを特徴とする、組換えベクター。
請求項１０に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
請求項１１に記載の形質転換された細胞を乳酸；または乳酸及び多様なヒドロキシアルカン酸を炭素源として含む培地で培養した後、前記培養された細胞からポリ乳酸またはポリ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）共重合体を得ることを特徴とするポリ乳酸またはポリ（３ＨＢ−ｃｏ−乳酸）共重合体の製造方法。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来であるpctであるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用することができるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素をコードする遺伝子を共に有しポリ乳酸またはヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体[ポリ（ヒドロキシアルカン酸−ｃｏ−乳酸）]の生成能を有する形質転換された植物であって、前記ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来であるphaC及びＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ由来であるphaRBCの一方または両方であることを特徴とする、形質転換された植物。
請求項１０に記載の組換えベクターで形質転換された植物。