CN102056962B - 聚羟基脂肪酸共聚物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的PHA共聚物及其制备方法。至少含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的聚羟基脂肪酸共聚物；及聚羟基脂肪酸共聚物的制备方法，其特征在于，在碳源以及(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸的前体物质的存在下，培养向选自大肠杆菌、产碱菌属菌及假单胞菌属菌的微生物导入了聚羟基脂肪酸聚合酶基因的转化体，从得到的培养物收集至少含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的聚羟基脂肪酸共聚物。

Description

聚羟基脂肪酸共聚物及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及聚羟基脂肪酸共聚物及其制备方法。本发明尤其涉及至少含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的聚羟基脂肪酸共聚物及其制备方法。
【背景技术】
聚羟基脂肪酸(PHA)是微生物在细胞内蓄积的聚酯。近年、PHA被认为是可生物降解的塑料，作为生物质来源的塑料而受到注目。最普通的PHA是以(R)-3-羟基丁酸(3HB)作为构成单元的同聚物(以下称为“P(3HB)”)。但是、P(3HB)由于结晶性高，具有无柔软性的缺点。之后开发出了用显示高PHA蓄积能力的富养产碱菌(Ralstonia eutropha)制备由3HB和(R)-3-羟基缬草酸(3HV)组成的PHA共聚物(以下、“P(3HB-共-3HV)”)的方法(特开昭57-150393号公报或特开昭59-220192号公报)，但由于3HB和3HV共结晶化，从而柔软性几乎不提高。
近年建立了由3HB和(R)-3-羟基己酸(3HHx)构成的共聚物(以下称为“P(3HB-共-3HHx)”)的制备方法，使得有高柔软性的聚羟基脂肪酸的制备成为可能(特开平5-93049号公报或特开平7-265065号公报)。这些公报所述的方法中，使用土壤细菌豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)从植物油制备了P(3HB-共-3HHEx)。
另外，本发明人报告了利用向富养产碱菌(Ralstonia eutropha)来源的PHA合成酶基因缺陷突变株(PHB-4株)整合了假单胞菌属(Pseudomonas sp.)来源的PHA合成酶基因的突变体的重组株从植物油制备由3HB和(R)-3-羟基脂肪酸(3HA)构成的共聚物(以下称为“P(3HB-共-3HA)”，但3HA：C4～C12的(R)-3-羟基脂肪酸))(特开2007-125004号公报)。
另一方面，也报告了以有支链烷基的3-羟基脂肪酸作为构成单元的同聚物或其共聚物(Int.J.Biol.Macromol.，1990，Vol.12，pp.92-101)。但是、一般而言、以有支链烷基的3-羟基脂肪酸作为构成单元的聚合物的制备由于单体组成的控制困难，考虑材料物理性质的聚合物的合成难，所述公报中的支链烷基也仅限于支链辛酸，对其物理性质也不明了。
【发明概述】
因此，本发明以制备有更高柔软性的新颖的聚羟基脂肪酸为目的，旨在提供至少含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸(以下也称为“3H4MV”)单元的聚羟基脂肪酸的共聚物及其制备方法。再有，“(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸”与“(R)-3-羟基异己酸”同义。
本发明人鉴于所述实状，经锐意研究发现，在碳源的存在下，培养导入了聚羟基脂肪酸聚合酶基因的宿主微生物，在以往的聚羟基脂肪酸的合成系统中，得到含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的新颖的聚羟基脂肪酸共聚物，培养时，通过添加(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸的前体物质，可高效制备(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的组成比高的聚羟基脂肪酸共聚物(以下也简称为“PHA共聚物”或“PHA”)，从而完成本发明。
即，(1)本发明提供聚羟基脂肪酸共聚物，其至少含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元。
(2)本发明提供(1)所述的聚羟基脂肪酸共聚物，其含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元和(R)-3-羟基丁酸单元。
(3)本发明提供(2)所述的聚羟基脂肪酸共聚物，其含：(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元、(R)-3-羟基丁酸单元、(R)-3-羟基缬草酸单元、及任选(R)-3-羟基己酸单元。
(4)本发明提供(1)所述的聚羟基脂肪酸共聚物，其含14mol％以上的(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元。
(5)本发明提供(1)所述的聚羟基脂肪酸共聚物，其含14mol％～40mol％的(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元。
(6)本发明提供聚羟基脂肪酸共聚物的制备方法，其特征在于，在碳源以及(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸的前体物质的存在下，培养向选自大肠杆菌、产碱菌属菌及假单胞菌属菌的微生物导入了聚羟基脂肪酸聚合酶基因的转化体，以及从得到的培养物收集至少含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的聚羟基脂肪酸共聚物。
(7)本发明提供(6)所述的制备方法，其中所述前体物质选自：4-甲基缬草酸、4-甲基戊烯酸或它们的混合物。
(8)本发明提供(6)或(7)所述的制备方法，其中以0.1～5.0g/L的浓度添加所述前体物质。
(9)本发明提供(6)～(8)中任一项所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶基因来源于选自下列的微生物：假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3株、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、A33、Allochromatium vinosum、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)INT005、桃红色闪囊菌(Lamprocystis roseopersicina)、珊瑚红诺卡菌(Nocardia corallina)、Rhodobactor shaeroides、富养产碱菌(Ralstonnia eutropha)、红球菌属(Rhodococcus sp.)NCIMB 40126、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfennigii)、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)、及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。
(10)本发明提供(9)所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶基因来源于：假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3株(DDBJ登录号：AB014758)或豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank登录号：D88825)。
(11)本发明提供(10)所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶基因编码如下聚羟基脂肪酸聚合酶突变体：豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank登录号：D88825)来源的聚羟基脂肪酸聚合酶的第149位的天冬酰胺被置换为丝氨酸，且第171位的天冬氨酸被置换为甘氨酸。
(12)本发明提供(6)～(11)中任一项所述的制备方法，其中所述碳源是单糖。
(13)本发明提供(12)所述的制备方法，其中所述单糖是果糖。
(14)本发明提供成形体，其含(1)～(5)中任一项所述的聚羟基脂肪酸共聚物。
(15)本发明提供(14)所述的成形体，其是膜。
通过本发明的制备方法可廉价且高产率地制备至少含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的PHA共聚物。另外，该PHA共聚物有足够的强度和柔软性，容易加工成膜等，是工业上有用的高分子材料。
【附图说明】
图1是显示富养产碱菌(Ralstonia eutropha)合成的PHA共聚物及化学合成的3H4MV的GC-MS分析的图。(a)由果糖合成的PHA的m/z 103离子色谱；(b)由果糖及4-甲基缬草酸(4MV)合成的PHA的m/z 103离子色谱；(c)化学合成的3H4MV(3H4MV标准品)的m/z 103离子色谱；以及(d)三聚物P(3HB-共-3HV-共-3HHx)的m/z 103离子色谱。GC中温度程序是以于100℃保持1分钟开始、接着通过8℃/分钟的连续步骤升温至280℃。
图2是显示硅烷化3HA甲酯的GC-MS分析的结果的图。(A)总离子色谱；(B)峰1(3.5分钟)，峰2(4.6分钟)及峰3(5.3分钟)的离子碎片谱各对应于硅烷化3HB，硅烷化3HV及硅烷化3H4MV。
图3是显示从用果糖(20g/l)及4-甲基缬草酸(4MV)(1g/l)培养的富养产碱菌(phaClPs)分离的P(3HB-共-3H4MV)的500MHz1H-NMR谱的图。P(3HB-共-3H4MV)的化学式中，x及y表示重复数。
图4是显示从用果糖(20g/l)及4-甲基缬草酸(4MV)(1g/l)培养d富养产碱菌(phaClPs)分离的P(3HB-共-3H4MV)的125MHz13C-NMR谱的图。
图5是显示从富养产碱菌(phaCAc(NSDG突变体))分离的各种P(3HB-共-3H4MV)样品的溶液流延膜的DSC热容量变化的图。加热温度是20℃/分钟。
图6显示经1日，40日及180日保存后，从富养产碱菌(phaCAc(NSDG突变体))制备的：(A)P(3HB-共-7mol％3H4MV)；(B)P(3HB-共-9mol％3H4MV)；(C)P(3HB-共-14mol％3H4MV)；(D)P(3HB-共-16mol％3H4MV)；及(E)P(3HB-共-22mol％3H4MV)的各膜的应力-应变曲线。
图7是显示对以下的共聚物：P(3HB-共-3H4MV)级分(黑色三角)，P(3HB-共-3HHx)级分(白色三角)，P(3HB-共-3HV)级分(黑色圆点)，及P(3HB-共-4HB)级分(白色圆点)的(A)熔点(Tm)与第二单体单元含量的关系；(B)玻璃转变点(Tg)与第二单体单元含量的关系；及(C)断裂伸长比例(％)与第二单体单元含量的关系的图。横轴的第二单体级分显示3H4MV单元的含量(mol％)。P(3HB-共-3H4MV)的趋势线(trendline)以粗线显示。
【实施方式】
本发明人首次发现，本发明的含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的PHA共聚物，即便(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸(3H4MV)单元的组成比低，也可在碳源的存在下，通过培养导入了聚羟基脂肪酸聚合酶基因的宿主微生物，用以往的聚羟基脂肪酸的合成系统制备(图1参照)。而且得知，可通过培养时添加3H4MV的前体物质，制备3H4MV单元的组成比增加的共聚物。
即，本发明的PHA共聚物至少含下式(1)所示的3H4MV单元：
式(I)的PHA共聚物中3H4MV单元的含量优选14mol％以上，更优选14mol％～40mol％。3H4MV单元的含量不足14mol％时，易发生PHA共聚物的结晶化，得到的PHA共聚物易脆。另外，3H4MV单元的含量超过40mol％时，会成为弹性状。
本发明的PHA共聚物优选为下式(II)所示的含(R)-3-羟基丁酸(3HB)单元和3H4MV单元的共聚物P(3HB-共-3H4MV)：
Figure BDA0000035867160000061
〔式中，x及y是重复数，各自独立地表示1～20,000的整数〕。
另外，本发明的PHA共聚物优选为除3HB单元和3H4MV单元之外还含(R)-3-羟基缬草酸(3HV)单元的下式(III)所示的共聚物P(3HB-共-3HV-共-3H4MV)：
Figure BDA0000035867160000062
〔式中，x，y及z是重复数，各自独立地表示1～20,000的整数〕。
共聚物P(3HB-共-3HV-共-3H4MV)中，为使共聚物具有高柔软性，优选该共聚物中3HV的含量尽可能低，例如，3HV的含量只要是1.6mol％以下，则无碍于柔软性。共聚物P(3HB-共-3HV-共-3H4MV)可任选还含(R)-3-羟基己酸单元。
本发明的聚羟基脂肪酸共聚物可如下制备：在碳源以及3H4MV的前体物质的存在下，培养宿主中导入了聚羟基脂肪酸聚合酶基因而成的转化体，以及从得到的培养物收集含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的聚羟基脂肪酸共聚物。
导入了聚羟基脂肪酸聚合酶基因的转化体可如下得到：将向用于在宿主中表达目的基因的广宿主域载体中，插入聚羟基脂肪酸聚合酶基因及公知的单体供给基因而得到的质粒导入宿主细胞。
作为用于在宿主中表达目的基因的广宿主域载体，可例举例如，携带有迁移能力的mob区域的载体pBBR1MCS-2，pJRD215及pLA2917。
作为聚羟基脂肪酸聚合酶基因，可例举来源于选自下列的微生物的基因，例如、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3株、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)A33、Allochromatium vinosum、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)INT005、桃红色闪囊菌(Lamprocystis roseopersicina)、珊瑚红诺卡菌(Nocardia corallina)、Rhodobactor shaeroides、富养产碱菌(Ralstonnia eutropha)、红球菌属(Rhodococcus sp.)NCIMB 40126、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfennigii)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。其中，因为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3株来源的聚羟基脂肪酸聚合酶有在细胞内蓄积共聚物P(3HB-共-3HA)(3HA：C4～C12的(R)-3-羟基脂肪酸)的能力，而豚鼠气单胞菌(Aeromouas caviae)来源的聚羟基脂肪酸聚合酶有蓄积共聚物P(3HB-共-3HA)(3HA：C4～C7的(R)-3-羟基脂肪酸)的能力，因此尤其优选。
另外，聚羟基脂肪酸聚合酶基因也可为编码上述聚羟基脂肪酸聚合酶的突变体的基因。这样的基因是如下基因，其含野生型的聚羟基脂肪酸聚合酶的氨基酸序列中缺失，置换或添加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且编码有聚羟基脂肪酸聚合活性的蛋白质。作为这样的突变体，具体而言，可例举豚鼠气单胞菌来源的聚羟基脂肪酸聚合酶的第149位的天冬酰胺被置换为丝氨酸，且第171位的天冬氨酸被置换为甘氨酸的突变体(NSDG突变体)。该NSDG突变体的制备方法详细记载于FEMS Microbiol Lett，277(2007)，p，217-222中。
作为公知的单体供给基因，可例举例如，富养产碱菌来源的phbA，phbB，phaB，phbB(Peoples，0，P.and Sinskey，A.J.，J.Biol.Chem，264：15293-15297(1989))，豚鼠气单胞菌来源的phaJ(Fukui，T.and Doi，Y.，J.Bacteriol.179：4821-4830(1997))等。
插入聚羟基脂肪酸聚合酶基因及公知的单体供给基因的微生物表达用载体可使用有启动子，核糖体结合位点，基因克隆位点，终止子等的公知的载体。
作为宿主，从将糖类或油脂类作为碳源使用时增殖性良好，菌株的安全性高，菌体和培养液的分离比较容易的观点来看，可例举例如，大肠杆菌，产碱菌属菌，假单胞菌属菌等的微生物细胞。本发明中，具体而言，可使用作为富养产碱菌H16的PHA蓄积能力缺陷株的富养产碱菌PHB-4株。
目前虽然尚未建立将假单胞菌属61-3株来源的聚羟基脂肪酸聚合酶基因(phaClPs)有效转化进富养产碱菌PHB-4株的方法，但可通过接合转移以良好的再现性转移基因phaClPs。具体而言，向用于在富养产碱菌中表达目的基因的广宿主域载体连接含基因phaClPs及公知的单体供给基因的上述质粒的DNA片段，将通过连接得到的质粒转化进与DNA的迁移直接相关的tra区域整合在染色体中的大肠杆菌中后，将得到的质粒与富养产碱菌PHB-4株接触。大肠杆菌的转化可通过，例如，钙法(Lederberg.E.M.et al.，J.Bacteriol.119.1072(1974))或电穿孔法(Current Protocols in Molecular Biology，1卷，184页，1994年)等进行。
作为3H4MV的前体物质，优选例如，4-甲基缬草酸，4-甲基戊烯酸，或它们的混合物。3H4MV的前体物质的添加量，优选约0.1～约5.0g/L的范围，更优选约0.5～约2.0g/L的范围。
作为碳源，可使用例如，糖类，油脂类等。作为糖类，可例举葡萄糖，果糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉，淀粉水解物等。作为油脂类，优选植物油，可例举例如，大豆油，玉米油，绵子油，花生油，椰子油，棕榈油，棕榈仁油，或这些的油级分，例如棕榈W油精油(将棕榈油经2次无溶剂分级分离的低沸点级分)，棕榈仁油油精(将棕榈仁油经1次无溶剂分级分离的低沸点级分)，或将这些油脂或其级分经化学的或生物化学处理的合成油，或这些的混合油。
培养温度为菌可生长的温度，优选15～40℃，更优选20～40℃，再更优选28～34℃。培养时间不特别限制，例如分批培养时优选1～7天，且也可连续培养。培养基只要是本发明的宿主可利用的培养基就不特别限制。可使用除了碳源，还含氮源，无机盐类，其他的有机营养源等的培养基。
作为氮源，可例举例如氨，盐化铵，硫酸铵，磷酸氢二铵等的铵盐，肽胨，肉提取物，酵母提取物等。
作为无机盐类，可例举例如磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸氢镁，硫酸镁，氯化钠等。
作为其他的有机营养源，可例举例如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，脯氨酸等的氨基酸类；维生素B1，维生素B12，生物素，烟酰胺，泛酸，维生素C等的维生素类等。
从菌体回收本发明的PHA共聚物可通过例如，以下方法进行。培养结束后，用离心分离器等从培养液将菌体分离，将菌体用蒸留水，甲醇等洗涤后，干燥后，用氯仿等的有机溶剂从此干燥菌体提取共聚物。接着，从含此共聚物的有机溶剂溶液，通过过滤等除去菌体成分，向滤液中加入甲醇，己烷等的贫溶剂而将共聚物沉淀。通过过滤或离心分离从沉淀的共聚物除去上清液，干燥，就可回收共聚物。得到的共聚物的分析可通过，例如，气相色谱仪法或核磁共振法等进行。
本发明的PHA共聚物可加工成膜，片等的成形体。膜的厚度不特别限制，通常1mm以下，优选0.5mm以下。
本发明的膜通过溶液流延法，射出成形，压制成形，吹成形等得到，但为了简便得到无色透明的膜，则优选流延法。另外，本发明的膜为了提高机械特性等为目的，也可经高温热处理。热处理温度随着共聚物的种类不同而不同，通常，在50～200℃的范围进行。而且，本发明的膜通过实施延伸处理，可更提高拉伸强度，弹性率等的机械特性等。
另外，在无损于本发明的目的的范围内，也可向本发明的成形体中添加通常膜中用到的各种添加剂，例如紫外线吸收剂，热稳定剂，氧化防止剂，着色剂等。
本发明的含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的PHA共聚物有足够的强度和柔软性，有用于医疗用材料，食品之外的包装材料，农业用乙烯片或橡胶袋等。
【实施例】
以下以实施例为例详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例
【材料及制备方法】
(1)微生物
(a)大肠杆菌S17-1株(H.G.Schlegel(Georg-August-Universitat，获自德国)
(b)富养产碱菌PHB-4(富养产碱菌H16的聚羟基脂肪酸蓄积能力缺陷株DSM541，获自德国DSM)
(2)培养基
(a)Luria-Bertani(LB)培养基
将细菌胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶于去离子水1L，于121℃灭菌20分钟而制备。另外，向上述成分中加入琼脂至1.5～2％(wt/vol)后经灭菌处理而制备了琼脂培养基。灭菌处理后，向液体培养基，琼脂培养基均添加抗生素(卡那霉素：终浓度50μg/mL)。
(b)富含营养的(NR)培养基(pH7.0)
将细菌胰蛋白胨10g，酵母提取物2g，肉提取物10g溶于去离子水1L，在121℃灭菌处理20分钟后，添加了抗生素(卡那霉素：终浓度50μg/mL)。
(c)Simmons柠檬酸培养基
将柠檬酸钠二水和物2g，NaCl 5g，NH4H2PO41g，K2HPO41g，0.2g/mL MgSO4溶液溶于去离子水1L，于121℃灭菌处理20分钟而制备。琼脂培养基是，首先将液体培养基调节到pH6.9，为防止褐变，将所述液体培养基和琼脂成分分别于121℃灭菌处理20分钟后混合。而且，将调至200g/L的MgSO4·7H2O过滤灭菌，以相对培养基全量为1/1000量加入及加入抗生素(卡那霉素：终浓度50μg/mL)。
(d)MS培养基
将矿物培养基(pH7.0)：K2HPO41.5g，Na2HPO4·12H2O 9.0g，NH4Cl 0.5g，NaCl 0.5g溶于去离子水1L，于121℃灭菌处理20分钟后，加入MgSO4·7H2O 0.2g，微量金属盐培养基1ml，及卡那霉素50mg而制备。
再有，微量金属盐培养基(0.1N HCl)是将CoCl2·6H2O 0.218g，FeCl39.7g，CaCl27.8g，NiCl3·6H2O 0.118g，CrCl3·6H2O 0.105g，及CuSO4·5H2O 0.156g溶于去离子水1L而制备。
(3)质粒
(a)pBBR1”ClPsABRe
向pGEM-T载体(获自Promega)中插入假单胞菌属61-3株来源的PHA合成酶基因phaClPs(DDBJ登录号：AB014758)和富养产碱菌来源的单体供给基因phaABRe(GenBank登录号：J04987)而制备了pGEM”ClPsABRe。
将pGEM”ClPsABRe质粒转化进大肠杆菌DH5α株，用含抗生素的LB琼脂培养基于37℃培养12小时。挑选平板上形成的单集落，往含抗生素的LB培养基1.7mL植菌，于37℃，以160/分钟振荡培养12小时。从所述培养液回收大肠杆菌DH5α株，使用75μL的TE溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，用Rapid Plasmid MiniprepSystem(MARLIGEN BIOSCIENCE社制)提取质粒。
将上述提取的质粒用BamHI消化，使用0.8％琼脂糖凝胶(TaKaRa社制)进行电泳。之后，切出分离的目的DNA片段的凝胶，使用Rapid Gel Extraction System(MARLIGEN BIOSCIENCE社制)进行纯化。此时，使用50μL的TE溶液洗脱。而且，将此DNA片段通过乙醇沉淀浓缩，在10μL的TE溶液中溶解。
将如此得到的DNA插入片段4μL与pBBR1MCS-2载体(M.E.K.，Kovach，Louisiana State University，从美国得到)1μL混合，加入5μL DNA Ligation试剂盒ver.2(TaKaRa社制)后，于16℃反应约2～3小时，制备出插入了pGEM”ClPsABRe的BamHI片段(含phaClPs和phaABRe)的质粒pBBR1”ClPsABRe。
(b)pBBREE32d13
除了代替假单胞菌属61-3株来源的聚羟基脂肪酸聚合酶基因(phaClPs)使用了豚鼠气单胞菌来源的PHA合成酶基因(phaCAc)(GenBank登录号：D88825)之外，与上述(a)同样制备了质粒pBBREE32d13。
(4)PHA共聚物的结构及物理性质的分析法
(a)气相色谱(GC)
菌体内的PHA共聚物含有率及其组成通过气相色谱确定(Braunegg等人，1978)。首先，将得到的干燥菌体在耐压玻璃管中秤量10～15mg，向其中加入硫酸甲醇溶液(硫酸∶甲醇＝15vol％∶85vol％)2mL及氯仿2mL而密封，用加热块于100℃加热140分钟而使甲醇分解。加热过程中，每隔约30分钟搅拌样品。之后，冷却至室温，加入纯水1mL剧烈搅拌。静置后，分离成二层的下层(氯仿层)用巴斯德吸管吸引，用0.45μm径的Millex-FH PVDF过滤器(Millipore社制)过滤。将向过滤后的氯仿层500μL中加入混合作为内部标准物质的0.1vo1％辛酸甲酯500μL的液体作为样品。GC装置使用岛津制作所制的气相色谱仪GC14B，色谱柱中使用了GLSCIENCE社制NEUTRA-BOND-1(内径30m×0.25mm，膜厚0.4μm)。载气使用了He及N2，成分的检测使用了氢焰电离检测器。
(b)PHA共聚物的提取及纯化
将蓄积了PHA共聚物的干燥菌体移入100mg的带有盖子的玻璃瓶中，加入100mL的氯仿，用搅拌器搅拌72小时。搅拌后的溶液用No.1滤纸(Adventec社制)过滤，转移到圆底烧瓶中。之后，用旋转蒸发器将滤液完全挥发，析出共聚物。
接下来，将析出的PHA共聚物用少量的甲醇洗涤，完全溶解在约20mL的氯仿中后，一边向400mL的甲醇中少量滴下，一边进行搅拌而纯化。将纯化的共聚物用No.1滤纸回收，在烘箱中干燥48小时。
(c)GPC(凝胶渗透色谱)
通过GPC测定求出了从菌体纯化的PHA共聚物的数均分子量(Mn)及分子量分布(Mw/Mn)(Mw；重量平均分子量)。由于使用聚苯乙烯作为标准物质，本发明中求出的分子量是用聚苯乙烯换算的相对分子量。所用的5种聚苯乙烯的分子量是3,790，30,300，219,000，756,000及4,230,000。
将纯化的PHA共聚物溶解于氯仿中至约1mg/mL，并用带有孔径0.45μm的Millex-FH PVDF过滤器(Millipore社制)的注射器过滤而制备GPC样品。
GPC测定中使用了岛津制作所社制的LC-VP系列(系统控制器：SCL-10AVP，自动注射器：SIL-10A VP，送液单位：LC-10AD VP，色谱柱烘箱：CTO-10A，检测器：RID-10A)，色谱柱使用了Shodex社制的K-806M及K-802。移动层使用了氯仿，总液流量是0.8mL/分钟，色谱柱温度设定为40℃，样品注入量设为50μL。数据的分析使用了CLASS-VP用GPC(岛津制作所社制)。由聚苯乙烯标准物质绘制标准曲线，将此与样品数据比较而算出了以聚苯乙烯换算的分子量及分子量分布。
(d)示差扫描量热法(DSC)
作为DSC样品是，称取约10mg纯化的PHA共聚物，装入5mL容积的样品小瓶，完全溶解于约1～2mL的氯仿中。将此在干燥器中干燥约3周来制备流延膜。从此流延膜秤量约3mg，装入专用铝平底锅作为DSC测定样品。测定中使用了Perkin-Elmer社制的Pyris 1DSC。测定在20mL/分的氮氛围下进行。对照使用未装入铝平底锅的样品。作为测定条件，首先，以20℃/分钟的升温速度加热至25℃～200℃，于200℃保持1分钟后，以-500℃/分钟急冷至-120℃。接着，于-120℃保持1分钟后，以20℃/分钟的升温速度加热至200℃。分析中使用了Perkin-Elmer社制的分析软件Data Analysis。通过最初升温时的热分析图确定所测定的样品的熔点Tm及熔解焓ΔHm，通过再次升温时的热分析图求出了玻璃转变温度Tg。
(e)3H4MV标准品的合成
在100mL圆底烧瓶中称取1g NaBH4，加入甲醇10mL。接着，在冰上一边搅拌一边向此溶液中缓慢滴加异丁基醋酸甲酯(东京化成工业)3mL/甲醇10mL。在冰上搅拌至不发热，之后于室温搅拌12小时。反应结束后，滤除未反应的NaBH4，加入氯仿40mL，用饱和氯化钠水溶液40mL洗涤3次。干燥氯仿层后，用旋转蒸发器浓缩，得到无色透明液体。
(f)气相色谱/质谱(GC/MS)
PHA共聚物中所含的微量的3-羟基脂肪酸的组成通过GC/MS确定。定性使用了SCAN模式，定量使用了SIM(选定离子监控，selectedion monitoring)模式。
<装置>
气相色谱仪：GC-2010(岛津制作所)
气相色谱仪质谱仪：GCMC-QC2010(岛津制作所)
色谱柱：Inert Cap 1(GL SCIENCE)
检测器：质谱仪(MS)
电离源：电子碰撞电离法(EI)
分析软件：GC MS Solution(岛津制作所)
<样品制备>
●甲酯化
在螺旋盖耐压试管中秤量所定量的PHA，加入硫酸甲醇溶液2mL及氯仿2mL，于100℃加热140分钟，期间搅拌数次。反应结束后，冷却至室温，加入超纯水1mL剧烈搅拌，将静置后的下层作为样品。
●三甲基硅烷化
向甲酯化样品200μL中加入二甲基甲酰胺300μL，双(三甲基丝氨酸)三氟乙酰胺100μL，于70℃加热30分钟，期间搅拌数次。反应结束后，冷却至室温，加入超纯水1mL，己烷1mL，剧烈搅拌，将静置后上层作为样品。
<测定条件>
MS的质量数较正使用了全氟三丁胺。
作为载气使用氦，入口压设为120kPa。
各装置的分析线的温度条件：GC：样品气化温度，280℃；色谱柱初期温度，100℃；色谱柱最终温度，280℃；色谱柱升温速度，8℃/分钟；注入模式，分流，GC-MS：离子源温度，230℃；界面温度，250℃；溶剂洗脱时间，1.7分钟；检测器获得，0.8kV。测定条件，MS SCAN：开始时间，2分钟；结束时间，24分钟；扫描速度，1250；开始，m/z 45.00；结束，m/z 600.00。
样品注入量作为1μL。
(g)1H-NMR及13C-NMR测定
向CDCl3中溶解PHA共聚物至3％(wt/vol)，作为测定样品。使用核磁共振分光装置，于室温进行了测定。
(5)PHA共聚物的力学强度的测定
制备PHA膜，通过拉伸试验确定PHA的膜的杨氏模量，断裂应力，断裂伸长。
<装置>
拉伸试验机：AGS-H/EZTest(岛津制作所)
分析软件：TRAPEZIUM 2(岛津制作所)
<样品制备>
(a)流延膜的制备
将纯化的聚合物溶解在适量的氯仿中，在平皿中展开。其中使用的聚合物重量，考虑到皿的面积，计算为厚度达150μm。展开后，用开孔的铝箔盖住皿，在平滑处于室温静置至氯仿完全气化。干燥后，从皿小心剥下膜，于室温静置一周。难以从皿剥下的聚合物，则通过在皿和聚合物之间滴下超纯水来剥离。
(b)拉伸试验片的制备
制备的流延膜切成纵20mm，横3mm而作为样品。使用剃刀切，通过从聚合物的正上方押下而切断。
<测定条件>
将夹间距设为10mm，拉伸速度设为10mm/分钟，于室温进行了测定。
<数据分析>
聚合物断裂时的应力作为断裂应力，拉伸率作为断裂伸长。杨氏模量设为应力-应变曲线中开始点的斜率作为。
以下实施例中使用的术语“本发明的PHA共聚物”，“PHA”或“P(3HB-共-3H4MV)”是指“P(3HB-共-3H4MV)”及/或“P(3HB-共-3HV-共-3H4MV)”。
【实施例1～2】利用假单胞菌属61-3株来源的聚合酶的P(3HB-共-3H4MV)的制备
(1)转化体富养产碱菌PHB-4株的制备
将对数增殖期的细胞用氯化钙溶液处理而得到大肠杆菌S17-1株的感受态细胞。向所述经处理细胞加入质粒pBBR1”ClPsABRe的DNA，通过温度升至42℃的热激来促进向细胞内导入质粒。
为了向富养产碱菌PHB-4株导入基因，进行了接合转移。将导入了质粒pBBR1”ClPsABRe的大肠杆菌S17-1株植菌到1.7mL LB培养基中，于37℃振荡培养15小时。另外，将导入的宿主(富养产碱菌PHB-4株)也植菌到1.7mL NR培养基中，于30℃培养15小时。培养后，将各培养液全量移到灭菌的离心管中，于12,000rpm离心2分钟。向含抗生素的大肠杆菌S17-1株加入500μL LB培养基而再离心，完全除去抗生素。除去部分上清至残留约50μL，将大肠杆菌S17-1株和富养产碱菌PHB-4株混合，滴到LB琼脂培养基，干燥后，于30℃培养5小时。之后，划线到含抗生素的Simmons柠檬酸琼脂培养基上，于30℃培养2天。将由此得到的单集落再度划线到Simmons柠檬酸培养基上，于30℃培养2天。将由此分离的集落(转化体富养产碱菌株)用于将来的实验。
(2)转化体富养产碱菌株的培养
转化体富养产碱菌株的培养中使用了MS培养基。在Simmons柠檬酸培养基上分离的单集落用白金耳植菌到1.7mL的NR培养基中，于30℃振荡培养12小时(前培养)。将此培养液1mL植菌到含果糖20g/L，抗生素，作为3H4MV的前体物质的4-甲基缬草酸或4-甲基戊烯酸(均为1g/L)的100mL的MS培养基中，于30℃，以130/分钟振荡培养72小时を进行(本培养)。另外，为了比较，添加L-缬氨酸或L-亮氨酸而进行了同样的培养。
培养后，将培养液移入250mL离心管种，于4℃，以6,000rpm(4,050×g)离心10分钟来集菌。离心分离菌后，将菌体悬浮于约20mL的水中，再度于4℃，以6,000rpm离心10分钟来进行集菌，去除上清。将集菌的菌的沉淀悬浮于2～3mL的超纯水中，移入5mL的聚丙烯容器中，贴上开孔的石蜡膜，于-80℃冷冻干燥，通过真空干燥72小时来得到干燥菌体。
将干燥菌体如上所述纯化得到PHA，通过GC-MS(图1，2)，1H-NMR(图3)及13C-NMR(图4)分析了其结构。表1分别显示3HA甲酯的分子量及GC保持时间。
表1：3HA甲酯的分子量及气相色谱(GC)
保持时间
  3HAa)单元   分子量   GC保持时间(分钟)b)
  3HA甲酯   118   2.2
  3HV甲酯   132   2.8
  3H4MV甲酯   146   3.5
  3HHx甲酯   146   3.8
  硅烷化3HA甲酯   190   3.5
  硅烷化3HV甲酯   204   4.5
  硅烷化3H4MV甲酯   218   5.3
  硅烷化3HHx甲酯   218   5.7
a)3HB：(R)-3-羟基丁酸；3HV：(R)-3-羟基缬草酸；3H4MV：(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸；3HHx：(R)-3-羟基己酸
b)GC温度程序是，以于100℃保持1分钟开始，接着通过8℃/分钟的连续步骤升温至280℃。
如图1所示，首次发现，即便不存在前体物质，也可得到以3H4MV作为构成单元的P(3HB-共-3H4MV)(图1的(a))。以下显示P(3HB-共-3H4MV)的1H-NMR数据，及13C-NMR的数据。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm)：5.30-5.23(m，3HB的CCHCH3)，5.13(d，3H4MV的CCHCH2)，2.67-2.44(m，3HB的CCH2CO)，1.89(dd，3H4MV的CCH2CO)，1.27(dd，3HB的CCH3)，0.90(d，3H4MV的C(CH3)2)。13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ(ppm)：169.1(3HB单元的羰基碳)，169.7(3H4MV单元的羰基碳)。
另外得知，在前体物质的存在下，可得到3H4MV的组成比高的P(3HB-共-3H4MV)(图1的(b))。结果显示于表2。另一方面，代替前体物质添加L-亮氨酸或L-缬氨酸时，完全检测不到P(3HB-共-3H4MV)。
表2：由富养产碱菌PHB-4株(phaClPs)从果糖及3H4MV类似物合成的PHA的组成a)
a)结果是自3个独立的培养物的平均及标准偏差。
b)向含果糖(20g/L)的MS培养基加入3H4MV类似物至最终浓度达1.0g/L。
【实施例3～6】由导入了豚鼠气单胞菌来源的聚合酶的富养产碱菌株从果糖及4-甲基缬草酸制备P(3HB-共-3H4MV)
除了代替质粒pBBR1”ClPsABRe使用质粒pBBREE32d13之外，如同实施例2，研究了豚鼠气单胞菌来源的聚羟基脂肪酸聚合酶基因是否整合3H4MV。另外，根据FEMS Microbiol Lett，277(2007)，p.217-222所述的方法制备了豚鼠气单胞菌来源的聚羟基脂肪酸聚合酶的第149位的天冬酰胺被置换为丝氨酸，且第171位的天冬氨酸被置换为甘氨酸的突变体(NSDG突变体)，研究了编码该突变体的聚合酶基因是否整合3H4MV。结果显示于表3。
表3：由富养产碱菌株从果糖及4-甲基缬草酸生物合成PHAa)
Figure BDA0000035867160000182
a)干燥菌体重量，PHA含有率，及PHA组成结果是自至少3个独立的培养物的平均及标准偏差。细胞在含果糖(20g/L)及4-甲基缬草酸的MS培养基中培养。
b)假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3株来源的PHA合成酶基因
c)豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)株来源的PHA合成酶基因
d)豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)株来源的PHA合成酶突变体(N149→S及D171→G)基因
从表3得知，虽然野生型的富养产碱菌H16来源的PHA合成酶基因中也整合了3H4MV，但假单胞菌属61-3株来源的PHA合成酶基因，豚鼠气单胞菌株来源的PHA合成酶基因，及豚鼠气单胞菌株来源的PHA合成酶突变体基因中的整合率更高。
【实施例7】4-甲基缬草酸的浓度的影响
除了改变4-甲基缬草酸的浓度之外，如同实施例4，6制备了P(3HB-共-3H4MV)。结果显示于表4。
表4：由各种富养产碱菌株从果糖及4-甲基缬草酸(4MV)制备P(3HB-共-3H4MV)a)
Figure BDA0000035867160000191
a)干燥菌体重量，PHA含有率及PHA组成的值是自至少3个独立的培养物的平均及标准偏差。细胞在含果糖(20g/L)及变化浓度的4MV的MS培养基中培养。
b)量微而无法定量。
【实施例8】P(3HB-共-3H4MV)的分子量，以及含P(3HB-共-3H4MV)的溶液流延膜的热特性及力学特性
如上所述制备了含实施例7中制备的样品号(1)～(18)的共聚物的溶液流延膜(得到的膜的样品号设为(1’)～(18’))，测定了热特性及力学特性(表5)。
表5：由重组富养产碱菌株合成的P(3HB-共-3H4MV)的分子量，以及P(3HB-共-3H4MV)溶液流延膜的热特性及力学特性a)
Figure BDA0000035867160000201
a)纯化的共聚物样品的PHA组成由GC确定。Mn：数均分子量；Mw：重量平均分子量；Mw/Mn：多分散度；Tg：玻璃转变点；Tm：熔点；ΔHm：结晶熔解焓。共聚物P(3HB-共-3H4MV)样品从有phaClPs的PHB-4，及有NSDG突变体基因的PHB-4取得。
b)ND：非检测。
结晶熔解焓(ΔHm)越高，得到的PHA共聚物的结晶性就越高。结晶性升高，则该PHA共聚物的硬度增加，变脆。
本发明中，尤其是含14mol％以上3H4MV的样品(6)，(7)及(14)～(18)的PHA共聚物的结晶性低，对于其中的样品(6’)，(7’)及(14’)～(16’)而言，从杨氏模量及断裂伸长的值实际确认了有高柔软性。样品(9’)～(16’)及(18’)的DSC热容量变化显示于图5。另外，对于P(3HB-共-3H4MV)，P(3HB-共-3HHx)，P(3HB-共-3HV)，及P(3HB-共-4HB)而言，将(A)熔点(Tm)和第二单体单元含量的关系；(B)玻璃转变点(Tg)和第二单体单元含量的关系；及(C)断裂伸长比例(％)和第二单体单元含量的关系显示于图7。
作为参考，3HV组成为14mol％的P(3HB-共-3HV)的熔点是150℃(P，Holms，in Development in Crystalline Polymers-2，D.C，Bassett，Ed.，Elsevier，London，1988，PP.1-65)，3HHx组成为15mol％的P(3HB-共-3HHx)的熔点是115℃(Macromolecules，1995，Vol.28，pp.4822-4828)，3HB的同聚物的熔点是174℃。
【实施例9】(3HB-共-3H4MV)的力学特性的经时变化
将实施例8中得到的样品(1’)～(18’)于室温保存1日，40日，180日后，测定了拉伸强度及断裂伸长(表6，图6)。
表6：保存1日，40日及180日的P(3HB-共-3H4MV)溶液流延膜的力学特性
Figure BDA0000035867160000221
从表6及图6得知，含本发明的PHA共聚物的溶液流延膜在保存180日后也具有刚制备时的力学特性，所以稳定性高。

Claims (8)

1.聚羟基脂肪酸共聚物的制备方法，其特征在于，
●在单糖以及(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸的前体物质的存在下培养转化体，其中
■所述(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸的前体物质选自：4-甲基缬草酸，4-甲基戊烯酸及它们的混合物，
■所述转化体是微生物中导入了聚羟基脂肪酸聚合酶基因的转化体，
■所述微生物选自大肠杆菌，产碱菌属菌及假单胞菌属菌；及
●从培养所述转化体而得到的培养物收集至少含14mol%～40mol%的(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元的聚羟基脂肪酸共聚物。
2.权利要求1所述的制备方法，其中以0.1～5.0g/L的浓度添加所述前体物质。
3.权利要求1所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶基因来源于选自下列的微生物：假单胞菌属（Pseudomonas sp.）61-3株、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、Allochromatium vinosum、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）INT005、桃红色闪囊菌（Lamprocystis roseopersicina）、珊瑚红诺卡菌（Nocardia corallina）、类球红细菌（Rhodobactor sphaeroides）、富养产碱菌（Ralstonniaeutropha）、红球菌属（Rhodococcus sp.）NCIMB 40126、普氏荚硫菌（Thiocapsa pfennigii）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、及嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。
4.权利要求3所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶基因来源于：假单胞菌属（Pseudomonas sp.）61-3株（DDBJ登录号：AB014758）或豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）（GenBank登录号：D88825）。
5.权利要求4所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶基因编码如下聚羟基脂肪酸聚合酶突变体：豚鼠气单胞菌（Aeromonascaviae）（GenBank登录号：D88825）来源的聚羟基脂肪酸聚合酶的
●第149位的天冬酰胺被置换为丝氨酸，且
●第171位的天冬氨酸被置换为甘氨酸。
6.权利要求1所述的制备方法，其中所述单糖是果糖。
7.权利要求1所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸共聚物含(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元和(R)-3-羟基丁酸单元。
8.权利要求1所述的制备方法，其中所述聚羟基脂肪酸共聚物含：(R)-3-羟基-4-甲基缬草酸单元、(R)-3-羟基丁酸单元、(R)-3-羟基缬草酸单元、及任选(R)-3-羟基己酸单元。
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