TWI359014B - - Google Patents

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1359014 L -麩醯胺與乙胺合成茶胺酸的酵素法（日本專利特開平 11-225789)。另外，已開發出將此酵素於載體上固定化的 酵素法（日本專利特開平5 - 3 2 8 9 8 6 )。但是，於使用來自假 單胞菌屬之麩醯胺酶的情形中，經由合成茶胺酸的反應與 水解反應，令L-麩醯胺酸以副反應物型式合成。因此，副 產物的L -麩醯胺酸具有令茶胺酸精製煩雜的問題點。

[專利文獻1 ]日本專利特開平1 1 - 2 2 5 7 8 9號公報 [專利文獻2 ]日本專利特開平5 - 3 2 8 9 8 6號公報 [非專利文獻 1] Chem. Parm. Bull.，19 (7) 1301-1307 (1971) 【發明内容】 (發明所欲解決之問題）

本發明為鑑於上述問題而 酸的有效率製造方法。 (解決問題之手段） 發明者等人為了解決前述 現使用來自芽孢桿菌屬、黴 微生物的麩醯胺酶，可於高 為極少量，而基本完成本發 茶胺酸的製造方法，其特徵 完成，其目的為在於提供茶胺 課題而重複致力研究，結果發 菌或酵母中之一種或二種以上 產率下合成茶胺酸，且副產物 明。即，本發明的要旨為關於 為，對麩醯胺與乙胺衍生物的 渴合物，.以來自芽孢桿菌屬、黴菌或酵母中之一種或二種 以上微生物的麩醯胺酶作用。 (發明效果） 若根據本發明，則提供茶胺酸之有效率的新穎製造方 6 326傳利說明書(補件)\94-1OW】21388 1359014 法，為簡易且可於工業上有利的生產。即，經由使用來自 芽孢桿菌屬、黴菌或酵母中之一種或二種以上微生物的麩 醯胺酶，則可確認比以往更高的茶胺酸轉換率，且可進行 工業性生產。 【實施方式】

其次，詳細說明本發明的實施形態，但本發明之技術性 範圍並非被下述之實施形態所限定，且不變更其要旨下， 可作出各式各樣改變而實施。又，本發明的技術性範圍為 及於均等範圍為止。 本發明所用之茶胺酸為茶的葉中所含的麩醯胺酸衍生 物，為茶咮道的主成分，被使用於以呈現咮道為用途的食 品添加物。具體而言，·為被稱為7 -麩醯胺基乙醯胺、L -麩醯胺酸-7 -乙醯胺等的化合物。 本發明所用的乙胺衍生物可列舉乙胺、乙胺鹽酸鹽、乙 胺氯化金酸鹽、乙胺脂肪酸鹽、乙胺苦味酸鹽、乙胺之N-苯磺醯化合物、乙胺之 N -對-曱苯磺醯化合物等，但並非 限定於此。又，其中，特別以使用乙胺、乙胺鹽酸鹽為佳。 本發明中之麩醯胺酶為具有水解 L -麩醯胺生成 L -麩醯 胺酸的麩醯胺酶活性，可使用於味噌、醬油等醱酵食品的 味道提升、呈現味道性提升。已知麩醯胺酶為於鹼性條件 下，T -麩醯胺基轉移活性為比水解活性更高，亦可利用於 茶胺酸為首的烷基醯胺合成。 本發明中之麩醯胺酶活性為以 L -麩醯胺作為基質令酵 素作用，並藉由定量所生成之L -麵醢胺Si而加以測量。生 326\專利說明書(補件)\94-10\941213 S 8 7

1359014 成的L -缝酿胺酸量可使用市售的套件，例如，使用F L -麩醯胺酸（羅蘇•戴雅各諾斯提克斯公司）進行測量 酵素的單位為將每1分鐘生成1微莫耳之麩醯胺酸的 量定義為「mUj。又，使用此定義，將溶液中之蛋白質 毫克的酵素量定義為麵醯胺酶比活性「mU/mg」。 本發明中之芽孢桿菌屬為於細胞型態學上，具有格 陽性之嗜氧性菌、桿菌、芽胞形成能力、運動性等各 的微生物。 本發明中來自芽孢桿菌屬之麩醯胺酶的起源並無 限定，較佳為來自枯草桿菌（Bacillussubtilis)、解 芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、凝結芽孢 (Bacillus coagulans)、遲缓芽抱桿菌' (Baci 1e n t u s ) ' 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)、 芽抱桿菌（Bacillus polymixa)、嗜熱脂肪芽抱 (Bacillus stearothermophilus)、嗜熱解蛋白酶芽孢 (Bacillus thermoproteolyticus)的酵素 ° 若由麵西盘 比活性特別高的菌為佳的觀點來看，則最佳為來自枯 菌、解澱粉芽孢桿菌的麩醯胺。 又，來自芽孢桿菌屬的麩醯胺酶亦可使用應用生 術，經由基因重組等之改質菌所製造者。 本發明中之酶菌為真菌類之中，菌絲為纏繞成為不 之集合體的總稱，可見於許多藻菌類、子囊菌類及一 担子菌類中。 本發明中來自黴菌之麩醯胺酶的起源並無特別限定 326\專利說明書(補件)\94-10\94121388 8 套件 。本 酵素 每1 蘭氏 性質 特別 澱粉 桿菌 1 1 u s 多黏 桿菌 桿菌 胺酶 草桿 物技 定形 部分 ，較 1359014 佳為來自米曲酶 （Aspergillus oryzae)、 黑黴菌 (Aspergillus niger)、青黴菌（Penicillium notatum)、 匐枝根徽菌（Rizopus stolonifer)、史普諸斯毛徵菌 (Mucor sponosus)的酵素。由麵酿胺酶比活性特別高的菌 為佳的觀點而言，最佳為來自綠黴菌、黑黴菌的麩醯胺酶。 又，來自黴菌之麩醯胺酶亦可使用應用生物技術，經由 基因重組等之改質菌所製造者。

本發明中之酵母為屬於子囊菌屬的菌類。不含有葉綠 素，雖經由出芽而繁殖，但亦可經由分裂。被利用於酒類、 醬油、麵包等的製造。 本發明中來自酵母之麩醯胺酶的起源並無特別限定，較 佳為來自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、魯酵母 菌（Saccharomyces rouxii)、高蛋白假絲酵母（Candida utilis)、南極念珠菌（Candida antarctica)、雅諾馬拉漢 歇納 (Hansenul la a η o m a 1 a)、 八抱裂 殖酵母 (Schizosaccaromyces octosporus)的酵素。若由麩醢胺酶 比活性特別高的菌為佳的觀點來看，則最佳為來自釀酒酵 母、魯酵母菌、高蛋白假絲酵母、南極念珠菌的麩醯胺酶。 又，來自酵母的麩醯胺酶亦可使用應用生物技術，經由 基因重組等之改質菌所製造者。 上述來自芽孢桿菌屬、黴菌、酵母等之微生物的麩醯胺 酶亦可使用（1 )微生物本身、或（2 )由微生物所抽出的粗製 酵素。但是，若由茶胺酸轉換率的觀點來看，則以使用由 微生物所精製的麩醯胺酶為佳。麩醯胺酶的精製方法可使 9 326傳利說明書(補件)\94-10\941213 88 1359014 用公知的任何酵素精製法。可例示如柱層析、使用溶劑之 分配、透析、超過濾、電泳、以中性鹽的分級鹽析、使用 乙醇、丙酮的分級沈澱法、HPLC等。其中，以組合溶劑分 配及各種層析、HPLC，精製麩醯胺酶為佳。更且，亦可组 合C Μ -纖維素柱層析、塞佛蒂克斯G 1 5 0柱層析、羥基磷灰 石柱層析、丁基-東洋珠（Toyopearl)柱層析。

如此，本發明之茶胺酸的製造方法中，以令來自芽孢桿 菌屬、青黴屬' 根黴屬、毛黴屬、麴菌屬、漢歇納屬、裂 殖酵母屬、念珠菌屬中之一種或二種以上微生物的麩醯胺 酶作用於麩醯胺和乙胺衍生物為佳。於此情形中，（1 )以此 等微生物之培養上澄液的麩醯胺酶比活性為1 0 m U / m g以上 之條件培養之情況為佳，又，（2 )關於麩醯胺酶，使用本發 明中之主產物的茶胺酸與副產物的麩醯胺酸之比（茶胺酸/ 麩醯胺酸）為大於5者，係就減少副產物方面而言為佳。 本發明中之茶胺酸酶合成時的液性並無特別限定，但以 p Η為約 9 ~ 1 2為佳，且以約1 0 ~ 1 1為更佳。又，反應溫度 雖無特別限定，但以約〇°C〜45°C為佳，且以約4°C〜30°C為 更佳。使用作為基質的L -麩醯胺、乙胺衍生物濃度並無特 別限定，但以L -麩醯胺約0. 1莫耳以上、乙胺衍生物約1 莫耳以上為佳。本發明中之L -麩醯胺除了含有純的L -麩醯 胺以外，含有L -麩醯胺鈉鹽等之適當的無機鹽或有機鹽。 將本發明之方法所合成的茶胺酸由反應液中單離精製 上，可使用公知的任何胺基酸精製法，可例示如柱層析、 使用溶劑之分配、透析、晶析、超過渡、電泳、以中性鹽 10 326\專利說明書(補件)W-1 〇\94121388

1359014 的分級鹽析、使用乙醇、丙酮的分級沈澱法' HPLC等。 中，以組合溶劑分配及各種層析、Η P L C為佳。更且，亦 組合CM -纖維素柱層析、塞佛蒂克斯G150柱層析、羥基 灰石柱層析、丁基-東洋珠柱層析。 本發明中之載體為將麩醯胺酶固定化者，可列舉如矽 石（C e 1 i t e )、矽藻土 、高嶺土 、矽膠、分子篩、多孔質 璃、活性碳、碳酸鈣、陶瓷等無機載體、陶瓷粉末、聚 烯醇、聚丙烯、幾丁聚糖、離子交換樹脂、斥水吸黏樹月旨 螯合樹脂、合成吸黏樹脂等有機高分子等，但並非限定 此〇 [實施例] 以下，根據實施例及比較例更加詳細說明本發明。其 本發明之實施例的一部分，本發明不被該實施例及試驗 所限定。 (實施例1 ) 將枯草桿菌以含有葡萄糖〇 . 3 %、聚蛋白3 . 0 %、酵母萃 物1 . 0 %、氯化鈉0 . 5 %之p Η 7 . 0的培養基於3 0 °C之溫度 培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於此培 上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回收。 所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（ρ Η 7. 0 )，並進行透析 透析液為使用DEAE-SepharoseFastFlow，吸|έ後，以 溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩醯胺酶 液使用U F膜（U F Ρ - 5 - C - 3 Μ A )(亞馬相生物科技（股）），進 濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液的麩醯胺 326\專利說明書(補件)\94-10\941213 88 11 其 可 鱗 藻 玻 乙 > 於 為 例 取 下 養 將 〇 鹽 溶 行 酶 1359014 比活性為6 7 m U / m g。 (實施例2 )

將解澱粉芽孢桿菌以含有葡萄糖0 . 3 %、聚蛋白3 . 0 %、酵 母萃取物1.0%、氯化鈉0.5%之pH7.0的培養基於30 °C之 溫度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於 此培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回 收。將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（p Η 7 . 0 )，並進行 透析。透析液為使用DEAE-SepharoseFastFlow，吸黏後’ 以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩醯胺 酶溶液使用 UF 膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相 生物科技 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液 的麵酿胺酶比活性為5 3 m U / m g。 (實施例3 ) 將凝結芽孢桿菌以含有葡萄糖0 . 3 %、聚蛋白3 . 0 %、酵母 萃取物1 . 0 %、氣化鈉0 · 5 %之p Η 7 . 0的培養基於3 0 °C之溫 度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於此 培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回收。 將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（p Η 7 . 0 )，並進行透 析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow，吸黏後， 以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩醯胺 酶溶液使用 UF 膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相生物科技 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液 的麵醢胺酶比活性為4 3 m U / m g。 (實施例4 ) 12 326\專利說明書(補件)\94-10\94121388 1359014

將地衣芽孢桿菌以含有葡萄糖0.3 %、聚蛋白3.0%、酵母 萃取物1.0%、氯化鈉0.5¾之pH7.0的培養基於30 °C之溫 度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於此 培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回收。 將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（ρ Η 7 . 0 )，並進行透 析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow，吸黏後， 以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩醯胺 酶溶液使用 UF 膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相 生物科技 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液 的麵Si胺酶比活性為4 0 m U / m g。 (實施例5 ) 將螺狀芽抱桿菌（Bacillus cereus)以含有葡萄糖 0 . 3 %、聚蛋白3 . 0 %、酵母萃取物1 . 0 %、氣化鈉0 · 5 %之ρ Η 7 . 0 的培養基於3 0 °C之溫度下培養。將所得之培養液離心，取 得培養上澄液。於此培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得 之沈澱物離心、回收。將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶 液（pH7.0)，並進行透析。透析液為使用 DEAE-Sepharose Fast Flow '吸黏後，以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純 度。將所得之麩醯胺酶溶液使用UF膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬 相生物科技（股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。 培養上澄液的麵醯胺酶比活性為5 m U / m g。 (比較例 1 ) 來自硝基還原假單胞菌（P s e u d 〇 m ο n a s nitroreducens)t 本奢 ϋ @ 白勺 ϋ 將硝基還原假單胞菌使用含有麩醯胺酸鈉0 . 6 %、酵母萃 13 326\專利說明書(補件)\94-10\94121388

1359014 取物 0.]%、葡萄糖 1.0%、ΚΗ2Ρ〇4 0·05%、Κ2ΗΡ〇4 0.

MgSO厂 7H2〇 0. 0 7% ' EDTA-Fe (K 01%的培養液（pH7) 公升容積之撥酵罐（Jar-fermentor)(30 公升 lvvm = 25公升/分、迴轉數2,000rpm)中，將硝基還 胞菌培養約2 0小時。將所得培養液1 7 5公升部分的 淨後，·懸浮於3 0 m Μ填酸舒緩衝液（p Η 7 . 0 ) 7 . 5公升 於5~20°C下超音波弄碎，取得菌體破碎物。 一邊以7%氨水將pH調整至7, 一邊將菌體破碎物 酸銨分級，取得4 5 ~ 9 0 %飽和餾分。將其溶於0 . 0 1 Μ 緩衝液中，並且對相同缓衝液透析。吸黏至 D E A Ε -柱（15x60公分），並且以含有0.1M食鹽之緩衝液溶 胺酶，取得麩醯胺酶液。對所得之麩醯胺酶溶液相 膜（U F P - 5 - C - 3 Μ A )(亞馬相生物科技（股）），進行濃 鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液的麩醯胺酶比 (實施例6 ) 以精製麩醯胺酶酵素合成茶胺酸 使用精製麩醯胺酶（0 . 1毫升），且令基質溶液 1 (0.5M L -麩醯胺及各種濃度之乙胺）以ρΗΙΟ.Ο、溫 之條件，進行茶胺酸的酵素合成。 (實施例7 ) 以Η P L C定量茶胺酸量及麩醯胺酸量 進行茶胺酸之酵素合成的酵素反應液中的茶胺酸 醯胺酸量，為經由適當稀釋反應液後，進行 HPLC 量。使用所得之茶胺酸量（莫耳/升）及麩醯胺酸量 升），計算來自基質之麩醯胺量（莫耳/升）的莫耳 326\專利說明書(補件)W-10\94〗21388 14 05%、 ，於30 •通氣 原假單 菌體洗 中，並 進行硫 磷酸鉀 纖維素 出麵S裔 :用 UF 縮及脫 活性為 0毫升 i 3.0。。 量及麵 則可定 (莫耳/ 轉換率 1359014 (%)。 HPLC的定量條件為如下表。 [表1 ] 分 析 柱 De v e 1 〇 s i 1 ODS HG- 5/野 村 化學 (股） 檢 測 器 Wa t e rs2487Dual λ UV/V IS 檢測 器 /Waters 茶 胺 酸 標 準 品 :L-茶 胺酸 /栗 田 工 業 (股） 内 部 標 準 物 質 :菸醯 胺/拿卡 萊 跌 克 移 動 相 純 水 :曱醇： 三氧 醋酸= 9 8 0 : 20:1

(試驗例 1 ) 以來自芽孢桿菌屬之麩醯胺酶及來自假單胞 菌屬之麩醯胺酶酵素合成茶胺酸 使用實施例1〜實施例5及比較例1所調製之來自各微生 物的麩醯胺酶，並以實施例6之條件進行茶胺酸酵素合成 試驗。試驗後之茶胺酸量及麩醯胺酸量為以實施例7之條 件測量。試驗結果示於圖1。 使用實施例1 ~實施例5及比較例1之任一者的麩醯胺酶 之情況，由L -麩醯胺至茶胺酸的莫耳轉換率亦均為5 0 %以 上。特別是實施例1 ~實施例4之麩醯胺酶的莫耳轉換率分 別為 78%、76%、72 %及70 %的高數值。另一方面，由L -麩 醯胺至L -麩醯胺酸的莫耳轉換率（副產物的生產），於實施 例1〜實施例4之麩醯胺酶為6 %以下的低數值，但於實施例 5及比較例1之麩醯胺酶為顯示1 5 %以上的高數值。於使用 麩醯胺酶合成茶胺酸的情形中，以往茶胺酸的莫耳轉換率 為高，加上往副產物之 L -麩醯胺酸的莫耳轉換率低者為 15 326傳利說明書(補件)\94-10\94121388 1359014 佳。若為如此，則可簡化茶胺酸的精製步驟。於本試驗例 中，為了滿足此類條件上，以使用來自芽孢桿菌屬之麩醯 胺酶，其培養上澄液的麩醯胺酶比活性為10mU/mg以上者 為佳。 (實施例8 )

將綠徵菌以含有麥芽萃取物（Malt extract)2.0%、葡萄 糖 2.0%、蛋白 0.1%、酵母萃取物（Yeast extract)0.1%之 pH5.0的培養基於30 °C之溫度下培養。將所得之培養液離 心，取得培養上澄液。於此培養上澄液中添加冷乙醇，並 將所得之沈澱物離心、回收。將所得之沈澱物溶解於磷酸 缓衝溶液（p Η 7 · 0 )，並進行透析。透’析液為使用 DEAE-SepharoseFastFlow，吸黏後，以鹽溶液予以溶離， 提高蛋白質的純度。將所得之麩醯胺酶溶液使用 UF膜 (U F P - 5 - C - 3 Μ A )(亞馬相 生物科技（股）），進行濃縮及脫 鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液的麩醯胺酶比活性為 4 2 m U / m g 〇 (實施例9 ) 將黑黴菌以含有麥芽萃取物 2 . 0 %、葡萄糖 2 . 0 %、蛋白 0.1%、酵母萃取物0.1 %之pH5.0的培養基於30 °C之溫度下 培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於此培養 上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回收。將 所得之沈澱物溶鮮於磷酸緩衝溶液（p Η 7 · 0 )，並進行透析。 透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow，吸黏後，以鹽 溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麵醯胺酶溶 16 326\專利說明書(補件)\94-10\9412 ] 388 1359014 液使用U F膜（U F P - 5 - C - 3 M A )(亞馬相生物科技（股）），進行 濃缩及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液的麩醯胺酶 比活性為3 9 m U / m g。 (實施例1 0 )

將匐枝根黴菌以含有麥芽萃取物2 . 0 %、葡萄糖2. 0 %、蛋 白0.1%、酵母萃取物0.1%之pH5.0的培養基於30 °C之溫 度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於此 培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回收。 將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（p Η 7 . 0 )，並進行透 析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow，吸黏後， 以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩醯胺 酶溶液使用 UF 膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相 生物科技 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液 的麵ii胺酶比活性為1 5 m U / m g。 (實施例1 1 ) 將史普諾斯毛黴菌以含有麥芽萃取物 2. 0%、葡萄糖 2.0°/。、蛋白0.1%、酵母萃取物 0.1 %之ρΗ5·0的培養基於 3 0 °C之溫度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄 液。於此培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離 心、回收。將所得之沈澱物溶解於破酸緩衝溶液（p Η 7 . 0 )， 並進行透析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow， 吸黏後，以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得 之麩醯胺酶溶液使用UF膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相生物科 技（股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄 326\專利說明書(補件)\94-10\94121388 17 ⑧

1359014 液的麵Si胺酶比活性為5 m U / m g。 (試驗例 2 ) 以來自黴菌之麩醯胺酶及來自假單胞 麩醯胺酶酵，素合成茶胺酸 使用實施例8 ~實施例1 1及比較例1所調製之來 生物的麩醯胺酶，並以實施例6之條件進行茶胺酸 成試驗。試驗後之茶胺酸量及麩醯胺酸量為以實施 條件測量。試驗結果示於圖2。 使用實施例8 ~實施例1 1及比較例1之任一者的 酶之情況，由L-麩醯胺至茶胺酸的莫耳轉換率亦均 以上。特別是實施例8及實施例9之麩醢胺酶的莫 率分別為 7 2 %及7 3 %的高數值。另一方面，由 L -麩 L -麩醯胺酸的莫耳轉換率（副產物的生產），於實施 實施例9之麩醯胺酶為5 %以下的低數值，但於比較 麩醯胺酶為顯示 1 0 %以上的高數值。於使用麩醯胺 茶胺酸的情形中，以往茶胺酸的莫耳轉換率為高， 副產物之L -麩醯胺酸的莫耳轉換率低者為佳。若為 則可簡化茶胺酸的精製步驟。於本試驗例中，為了 類條件上，顯示以使用來自黴菌（特別為麴菌屬、根 毛黴屬）之麩醯胺酶，（1)其培養上澄液之麩醯胺酶 為10mU/mg以上者 '或（2)於來自L -麩醯胺之莫耳 中，本實施例中之主產物的茶胺酸與副產物的麩醯 比（茶胺酸/麩醯胺酸之比=X )為X > 5者為佳。 (實施例1 2 ) 將釀酒酵母以含有麥芽萃取物0. 3 %、酵母萃取物 326\專利說明書(補件)\94- ] 0\94121388 18 菌屬之 自各微 酵素合 例7之 麵酿胺 為5 0 % 耳轉換 醯胺至 例8及 例1之 酶合成 加上往 如此， 滿足此 黴屬、 比活性 轉換率 胺酸之 0.3%'

1359014 蛋白0.5¾、葡萄糖1.0%之pH5.0的培養基於30°C之 下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於 養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回 將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（PH7.0)，並進 析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow，吸芻 以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩 酶溶液使用 UF 膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相 生物 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上 的楚醯胺酶比活性為4 5 m U / m g。 (實施例1 3 ) 將魯酵母菌以含有麥芽萃取物0 . 3 % '酵母萃取物0 蛋白0.5%、葡萄糖1.0%之ρΗ5·0的培養基於30°C之 下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。於 養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、回 將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（P Η 7 · 0 )，並進 析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow，吸黏 以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩 酶溶液使用 UF 膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相 生物 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上 的麵酿胺酶比活性為4 0 m U / m g。 (實施例1 4 ) 將高蛋白假絲酵母以含有麥芽萃取物0 . 3 %、酵母萃 0.3%'蛋白0 . 5 %、葡萄糖1 . 0 %之p Η 5 · 0的培養基於 之溫度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄 326\專利說明書(補件)\94-10\94121388 19 溫度 此培 收。 行透 後， 醯胺 科技 澄液 .3% > 溫度 此培 收。 行透 後， 醯胺 科技 澄液 取物 3ITC 液。 1359014 於此培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、 回收。將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（PH7.0)，並進 行透析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow’吸黏 後，以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩 醯胺酶溶液使用 UF膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相生物科技 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液 的麩醯胺酶比活性為30mU/mg。 (實施例1 5 )

將南極念珠菌以含有麥芽萃取物 0.3%、酵母萃取物 0.3%'蛋白0.5%、葡萄糖1.0%之ρΗ5·0的培養基於30°C 之溫度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。 於此培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、 回收。將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（P Η 7 . 0 )，並進 行透析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow，吸黏 後，以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得之麩 醯胺酶溶液使用 UF膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相生物科技 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上澄液 的楚醢胺酶比活性為.2 5 m U / m g。 (實施例1 6 ) 將雅諾馬拉漢歇納以含有麥芽萃取物0 . 3 %、酵母萃取物 0.3°/。、蛋白0 . 5 %、葡萄糖1 _ 0 %之p Η 5 . 0的培養基於3 0 °C 之溫度下培養。將所得之培養液離心，取得培養上澄液。 於此培養上澄液中添加冷乙醇，並將所得之沈澱物離心、 回收。將所得之沈澱物溶解於磷酸緩衝溶液（P Η 7. 0 )，並進 20 326\專利說明書(補件)\94-10\94121388

1359014 行透析。透析液為使用DEAE-Sepharose Fast Flow， 後，以鹽溶液予以溶離，提高蛋白質的純度。將所得 醯胺酶溶液使用 UF膜（UFP-5-C-3MA)(亞馬相生物 (股）），進行濃縮及脫鹽，取得精製麩醯胺酶。培養上 的麵酿胺酶比活性為1 5 m 11 / m g。 (試驗例 3 ) 以來自酵母之麩醯胺酶及來自假單胞菌 麩醯胺酶酵素合成茶胺酸 使用實施例1 2 ~實施例1 6及比較例1所調製之來自 的麩醯胺酶，並以實施例6之條件進行茶胺酸酵素合 驗。試驗後之茶胺酸量及麩醯胺酸量為以實施例7之 測量》試驗結果示於圖3。 使用實施例1 2〜實施例1 6及比較例1之任一者的麩 酶之情況，由L -麩醯胺至茶胺酸的莫耳轉換率亦均為 以上。特別是實施例1 2 ~實施例1 5之麩醯胺酶的莫耳 率分別為70 %的高數值。另一方面，由L -麩醯胺至L-胺酸的莫耳轉換率（副產物的生產），於實施例 1 2〜實 1 5之麩醯胺酶均為低數值，但於比較例1之麩醯胺酶 示 1 0 %的高數值。於使用麩醯胺酶合成茶胺酸的情形 以往茶胺酸的莫耳轉換率為高，加上往副產物之L -麩 酸的莫耳轉換率低者為佳。若為如此，則可簡化茶胺 精製步驟。於本試驗例中，為了滿足此類條件上，以 來自酵母（特別為酵母屬、念珠菌屬）之麩醯胺酶，其 上澄液的麩醯胺酶比活性為1 0 m U / m g以上者為佳。 (實施例1 7 ) 調製使用奇吐珠4 0 1 0之固定化麩醯胺 326\專利說明書(補件)\94- ] 0\941213 88 21 吸黏 之麩 科技 澄液 屬之 各屬 成試 條件 醯胺 50% 轉換 麩醯 施例 為顯 中， 醯胺 酸的 使用 培養 酶

1359014 將幾丁聚糖珠粒之市售品奇吐珠 4 0 1 0 (富士 I 浸潰於50mM填酸納緩衝液（pH7.4)中24小時。將 後奇吐珠4 0 1 0之1 0毫升浸潰於實施例3所調製 酶（15毫克/毫升）25毫升，且振盈約2小時。其 去附著液的奇吐珠4010加至2. 5%戊二醛溶液中 盪2小時。戊二醛處理後，使用30倍量之50mM 衝液（ρΗ7·4)洗淨至吸光度（280nm)為0.01以下， 填至柱中。 (實施例1 8 ) 以固定化麩醯胺酶的酵素反應 使用實施例 1 7所調製的固定化麩醯胺酶，將 (4 % 麩醯胺、2 5 % 乙胺 ρ Η 1 0 . 0 )以 3 0 t、S V = 0 · 2 之 時，可以7 0 %之產率取得茶胺酸。 (實施例 19) 使用陰離子交換樹脂之固定化麩 調製 對於實施例3所得之精製麩醯胺酶（1 5毫克/毫 升，添加陰離子交換樹脂DIAIONHPA25C三菱化号 毫升後，振盪約2小時。其後，將除去附著液的 至2. 5 %戊二醛溶液中，再振盪2小時。戊二醛處 用 30倍量之 50mM填酸鈉缓衝液（ρΗ7·4)洗淨 (280nm)為0.01以下為止，並充填至柱中。 (實施例2 0 ) 以固定化麩醯胺酶的酵素反應 使用實施例 1 9所調製的固定化麩醯胺酶，將. (4%麩11胺、25% 乙胺 ρΗ1(Κ0)以 30 °C 、SV=0.2 之 時，可以7 5 %之產率取得茶胺酸。

326\專利說明書(補件)W-1OW1213 8S 22 f績（股）） 此平衡化 的麩醯胺 後，將除 ，且再振 磷酸鈉緩 b止，並充 基質溶液 流速通筒 醯胺酶的 升）25毫 、（股））1〇 ΗΡΑ 25 力口 理後，使 至吸光度 基質溶液 流速通筒 1359014 (實施例2 1 ) 茶胺酸之精製 茶胺酸由反應液中的單離精製可經由將反應液中之乙胺 以減壓濃縮除去後，以R 0膜進行脫鹽，其後加至D 〇 w e X 5 0 x8、Dowex 1x2柱層析，並且予以乙醇處理而進行。

將此單離物質加至胺基酸分析器、纸層析時，顯示與茶 胺酸標準物質相同舉動。又，將單離物質以鹽酸或麩醯胺 酶進行水解處理時，以 1 : 1 之比例生成 L -麩醯胺酸和乙 胺。如此，顯示單離物質為經由麩醯胺酶水解後，乙胺為 結合至L -麩醯胺酸的7位。又，水解所產生的L -麩醯胺酸 為L型，係根據L -麩醯胺酸脫氫酶（G 1 u D Η )而被確認。圖4 中，示出茶胺酸標準品及單離物質的I R光譜。兩物質均顯 示同等之光譜。由此，確認單離物質為茶胺酸。 【圖式簡單說明】 圖1為示出使用來自芽孢桿菌屬之麩醯胺酶及來自假單 胞菌屬之麩醯胺酶，由L-麩醯胺和乙胺酵素合成茶胺酸時 之合成茶胺酸量、麩醯胺酸量之表。 圖2為示出使用來自黴菌之麩醯胺酶及來自假單胞菌屬 之麩醯胺酶，由L-麩醯胺和乙胺酵素合成茶胺酸時之合成 茶胺酸量、麩醯胺酸量之表。 圖3為示出使用來自酵母之麩醯胺酶及來自假單胞菌屬 之麩醯胺酶，由L-麩醯胺和乙胺酵素合成茶胺酸時之合成 茶胺酸量、麩醯胺酸量之表。 圖4為示出茶胺酸標準品及單離物質之I R光譜的圖。 23 326\專利說明書(補件)\94-10\94121388

Claims (1)

1359014 十、申請專利範圍： 1. 一種茶胺酸之製造方法，其特徵為，係使用來自從解 激粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、凝結芽抱 桿菌（Bacillus coagulans)、黑徽菌（Aspergillus niger)、 D 枝根黴菌（Rizopus stolonifer)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、魯酵母菌（Saccharomyces

rouxii)、高蛋白假絲酵母（Candida utilis)及南極念珠菌 (Candida antarctica)中選出之一種或二種以上微生物的 麩醯胺酶’並將該麩醯胺酶作用於麩醯胺和乙胺衍生物而 製造茶胺酸者， 其中’（i)上述微生物的培養上澄液的麩醯胺酶比活性 為10mU/mg以上；（ii)上述麩醯胺酶係主產物之茶胺酸與 副產物之麩酿胺酸之比（茶胺酸/麩醯胺酸）大於5; (iii) 茶胺酸酵素合成時之pH為9~12;且

由L -鼓酿胺至茶胺酸的莫耳轉換率為7〇%以上，及 由L -麵酿胺至麩醯胺酸的莫耳轉換率為6%以下。 2_如申請專利範圍第丨項之茶胺酸之製造方法，其中， 該麩醯胺酶被固定化至載體。 94121388 24