TWI275796B - Method for measuring physiologically active sample substance by the use of porous filter - Google Patents

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1275796 第90118884號專利申請案 中文說明書修正頁 民國93年11月8曰修正 B7 五、發明説明（1) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係有關以多孔性濾器做爲固相載體使用，以免 疫學測定法爲基準，爲具有生理活性之試料物質量的測定 方法者。 先行技術 固相免疫測定法中係因應做爲測定對象之抗原或抗體 ，預先調製對應該抗原之固定化抗體固相或對應該抗體之 固定化抗原固相，選擇對應測定之適度性，做爲對象物質 .之該固相的方法爲一般先行方法者。此方法必要測定各對 ϋ象物質其固相種類無數多·，因此，固相調製上極爲煩雜， 丨且，測定操作不管機械性或用手操作，若因應測定對象物 質務必選擇適當之每個固相者，更形煩雜。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲解決上述問題，嘗試各種方法。公知者如：利用1 >種配位基收集劑固定化固相，選擇因應測定對象物質之配 位基標識生理活性物質後，於配位基收集劑固定化固相上 C ，使測定時所需配位基標識生理活性物質，亦即，配位基 1標識抗原或抗體於固相中進行收集爲基準之方法者。又， 進行調製必要之固相，或使試料中測定對象之抗原或測定 對象抗體之配位基標識抗體或配位基標識抗原添加於配位 基收集固定化固相上，藉由收集後，可測定免疫學所測定 任意測定對象物質之方法亦爲公知者。此等方法如載於特 公平4 — 4 9. 6 5 7號公報及特開平2 - 1 4 5 9 6 7號 公報中。 惟，公知方法中，並無法於極短時間內取得1 ln£爲1 n g量水準之測定感度。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -4 - 1275796 μ Β7 年月 修補 五、發明説明（2) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明爲解決該課題而提供一種利用高泛用性測定器 具，於比先行免疫學測定法所需時間更極短時間下可取得 1 爲n g量水準之測定態度以免疫學測定法爲基準之具 生理活性的測定試料物質方法者。 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 本發明係使含有.具生理活性之測定試料物質的試料溶 液與特異性結合於該測定試料物質之第1生理活性物質中 含配位基所結合結合體之溶液相互溶液之容量比以1 : 1 〜2 0 : 1 (較佳者爲2 : 1〜1 0 : 1者）量進行接觸 後，於溶液中形成配位基所結合之生理活性物質與測定試 料物質相互之複合體之步驟；將含該複合體之溶液滴入結 合該配位基收集劑之多孔性濾器表面後，使該複合體之配 位基部份結合於該配位基收集劑之步驟者；該多孔性濾器 表面以特異性結合該測定試料物質後，滴入含有以酵素標 識之第2生理活性物質之溶液後，介著配位基收集劑與配 位基部份結合結合於多孔性濾器之第1生理活性物質與測 定試料物質相互之複合體之步驟；藉由洗淨多孔性濾器後 去除未結合酵素標識第2生理活性物質之步驟；再測定結 合於多孔性濾器之酵素活性步驟所成者爲特徵之使用多孔 性濾器具生理活性之試料物質量的測定方法者。做爲該本 發明測定方法所使用之多孔性濾器者通常以纖維質多孔性 濾器爲較佳，而，亦可使用多孔性陶瓷濾器者。 又，本發明係使含具有生理活性之測定試料物質的試 料溶液，於特異性結合該測定試料物質之第1生理活性物 質中含有配位基所結合之結合體溶液，及該特異性結合測 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） -5- 1275796 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 ) 定旨式料·物質，以酵素所標識之第2生理活性物質含有溶液 其該g式料溶液與該結合體溶液相互之容量比以1 : 1〜 2 0 : 1 (較佳者爲2 : 1〜1 0 : 1者）進行接觸後， 於溶液中形成結合配位基之第1生理活性物質與測定試料 物質以及酵素標識生理活性物質所成之複合體步驟；將含 該複合體之溶液滴入結合該配位基收集劑之多孔性濾器表 面後’將該複合體配位部份結合於該配位基收集劑之步驟 ;藉由洗淨多孔性濾器後去除未結合之酵素標識第2生理 活性物質之步驟；以及測定結合多孔性濾器之酵素活性步 驟所成者爲其特徵之使用多孔性濾器測定具生理活性之試 料物質量之方法者亦有。做爲該本發明測定方法所使用之 多孔性濾器者以纖維質多孔性濾器者宜，而，亦可使用多 孔性陶瓷濾器。 理想之本發明試料物質測定方法之形態如下。 (1 )以生物素做爲配位基使用者。 (2 )以抗生物素做爲配位基收集劑者。 (3 )配位基收集劑爲抗生物素抗體下，其調距板爲 對於抗生物素抗體之抗體者。 (4 )以生物素化過敏原做爲結合配位基於第1生理 活性物質之結合體使用者。 (5 )配位基收集劑係使用介著調距板結合之纖維質 多孔性濾器者。 (6 )配位基收集劑爲鏈霉抗生物素蛋白.者。 (7 )配位基收集劑爲鏈霉抗生物素蛋白，調距板爲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---K--：---.-0¾衣------1T------Φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -6 - A7 B7 1275796 五、發明説明（4 ) 抗鏈霉抗生物素蛋白抗體者。 (8 )配位基收集劑爲鏈霉抗生物素蛋白，調距板爲 &針對抗鏈霉抗生物素蛋白抗體之抗體中使抗鏈霉抗生物 素蛋白抗體呈多層者。 (9 )於纖維質多孔性濾器下部具備有吸收體者。 (1 0 )以纖維質多孔性瀘器做爲固相載體，使收集 配位基之配位基收集劑擔載於此固相載體上，使特異結合 於測定試料物質之第1生理活性物質中結合配位基之物質 與含有測定試料物質之試料於液中進行混合攪拌反應後， 使其一定量反應液直接滴入配位基收集劑所結合之固相載 體後，於該滴入部份滴入特異結合測定試料物質之以酵素 標識的第2生理活性物質含有溶液中，進行反應，其反應 柯夂往濾器縱方向滲透後，滴入洗淨液後，再藉由測定纖維 質多孔性濾器上酵素活性量後，測定測定試料物質量之纖 維質多孔性瀘器免疫測定方法中，其含有測定試料物質之 試料與特異結合於測定試料物質之生理活性物質中所結合 配位基之物質相互液中之比率以2 0 : 1〜1 : 1之範圍 者宜，較佳者爲1 0 : 1〜2 : 1 ，更佳者爲1 〇 :丄〜 4 : 1之範圍下進行測定者。 (1 1 )特異結合於測定試料物質之第1生理活性物 質中配位基所結合之物質與含測定試料物質之試料相互之 溶液中結合反應後，以適當稀釋液稀釋該反應液後，取其 一定量後，滴入固相載體者。 (1 2 )做爲酵素反應後信號量之測定方法者以利用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂：297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 項再填办 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1275796 A7 B7 五、發明説明（5 ) 積分球進行測定反射率者。 (1 3 )測定該信號量時，測定信號強度之初速度者 〇 (1 4 )測定結合於固相載體之酵素活性信號強度之 初速度結束時間係於配位基收集劑所結合之纖維質多孔性 濾器上直接滴入溶液後，於1 5分鐘以內，較佳爲8分鐘 以內結束反應者。 〔發明之詳細說明〕 本發明利用多孔性濾器之生理活性試料物質量，生理 活性之測定法中做爲多孔性瀘器者以使用玻璃纖維瀘器者 宜。做爲配位基者以生物素使用者宜，又，做爲結合於多 孔性濾器之配位基收集劑者以抗生物素抗體或鏈霉抗生物 素蛋白使用者宜。 又，配位基收集劑亦可於多孔性濾器介著調距板被結 合之。例如：以生物素做爲配位基使用時，若未介著調距 板時，則做爲配位基收集劑者針對配位基之抗體，亦即， 使抗生物素抗體或鏈霉抗生物素蛋白做成多層者宜，而介 著調距板時，做爲調距板者針對配位基收集劑之抗體，亦 即於針對抗生物素抗體之抗體使抗生物素抗體做成多層者 宜。另外，做成調距板者使用抗鏈霉抗生物素蛋白抗體， 或於針對抗鏈霉抗生物素蛋白之抗體使抗鏈霉抗生物素蛋 白做成多層者均可使用之。 另外，利用本發明多孔性濾器做爲生理活性試料物質 本^尺度適用中國國家標準（〇呢）八4規格（210父297公釐) - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝_

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -8 - 1275796 A7 B7 五、發明説明（6) (請先閲讀背vB之注意事項再填寫本頁) 之測定方法，以抗體（過敏原特異I g E抗體）做爲測定 對象之生理活性物質，做爲第1生理活性物質者使用抗原 (過敏原）’做爲被標識酵素之第2生理活性物質者使用 被標識酵素之第2抗體（抗人體I g e抗體）時，以使用 上述理想多孔性濾器.，配位基，配位基收集劑之系統爲例 ，進行更詳細說明。 經濟部智慧財產局i(工消費合作社印製 本發明測定方法中，以多孔性濾器做爲固相載體使用 後，其特異結合於測定物質之生理活性物質中配位基被結 合之結合體如：配位基標識抗原或含配位基標識抗體之溶 液與含測定試料物質之試料溶液預先於液中反應後，再將 此反應液直接滴入配位基收集劑所結合多孔性濾器固相上 ，滴入後之反應液在濾器之縱方向滲透後，特異結合於測 定試料物質之第2生理活性物質，爲以酵素被標識者5如 :滴入酵素標識抗體或酵素標識抗原後進行反應，再滴入 洗淨液去除未反應物，藉由測定纖維質多孔性濾器上之酵 素活性量後，可測得測定物質之量，而，本發明測定法中 則可藉由使含測定試料物質之試料溶液與特異結合測定試 料物質之第一生理活性物質中配位基所結合之結合體相互 以容量比爲2 0 ·· 1〜1 ·· 1之範圍，較佳者爲1 〇 :工 〜2 : 1之範圍後，於1 5分鐘以內之短時間下測出n g / 之微量水準者。 多孔性濾器（固相載體）之下部中，以設置可快速通 過溶液之吸收體者宜。具體而言，做爲固相載體者如：特 開平4 — 3 1 8 4 6 2號公報或特開平7 — 2 1 8 4 3 8 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -9- 1275796 A7 ____ B7 五、發明説明（7 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 號公報所載者，利用具有良好通液性，使蛋白質，糖蛋白 具良好物理性或化學性之固定化能力，適度物理強度之玻 璃纖維後，於其下部以使用爲吸收通過固相載體之溶液由 纖維所成之吸收層相互組合之免疫學測定用反應器（亦即 ’ b 1 〇 t裝置）者宜。 針對調距板或配位基收集劑固相載體之固定化方法其 做爲物理性固定化法者可利用由該固相載體上部依序添加 特異標識生物素之蛋白質溶液配位基收集劑），爲防止 測定目的物質以外的夾雜物質之非特異性吸著的連粘溶液 以及含有安定化劑之緩衝液後，進行凍結乾燥後，調製配 位基收集劑固定化固相載體之方法者。又，做爲化學固定 化方法者如：依石川等之方法（酵素免疫測定法：醫學書 院，P 9 4，1 9 7 8 )，以胺基烷基矽烷一戊二醛進行 處理後，與吸收層組合後作成blot裝置，將同該物理固定化 .方法之溶液同法依序進行添加，凍結乾燥後，可製作配位 基收集劑固定化固相者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明測定方法中，可使用抗生物素抗體或鏈霉抗生 物素蛋白者，而，直接將此等蛋白質於玻璃纖維固相載體 上進行固定化者不如介著以下所述配位基進行固定化時， 更可取得較高感度者。亦即，較理想者係以固相載體中針 對抗生物素抗體介著抗體使抗生物素抗體進行固定化後， 或固相載體中介著抗鏈霉抗生物素蛋白抗體使鏈霉抗生物 素蛋白進行固定化，或針對抗鏈霉抗生物素蛋白抗體之抗 體中使抗鏈霉抗生物素蛋白抗體做成多層之固相中使鏈霉 i紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐) -10- 1275796 A7 ____B7 五、發明説明（8 ) 抗生物素蛋白進行固定化後所製作之固相可更增加本發明 測定法之有效度。 本發明測定方法中之免疫學測定方法爲以快速，高感 度’特異性’高精密度測定多種類之測定對象物質，其配 位基收集劑固定化固相可有效利用之。 做爲δ式料中測疋對象物質（測定試料物質）與免疫學 上特異性反應之配位基標識抗原或標識抗體之配位基者， 以小分子生物素使用者宜。生物素標識抗原或生物素標識 抗體在不ί貝及其本身免疫學活性與測定對象物質快速進行 反應後，可縮短測定時間。藉由生物素標識後，出現抗原 或抗體活性的變化時，可利用變更生物素化試藥之側鏈長 度、氧化抗原或抗體末端糖鏈後進行標識生物素之方法等 本發明測定方法中，使用配位基收集劑固定化固相載 體及配位基標識體進行測定試料中測定對象物質時，因應 測疋對象物質必要檢出之測定感度或測定對象物質與配位 基標識體相互反應後，改變測定對象之生理活性物質溶液 與含配iiL基標識體之溶液相互之容量比後，提昇配位基標 識物質濃度，維持測定對象物質濃度之容量比，亦即，配 位基標識體溶液，測定對象物質溶液於1 ·· 2 〇〜1 : 1 ，較佳者爲Γ : 1 〇〜汀：2之範圍下藉由反應後，可高 感度’且短時間內測定之。又，感度超出範圍時，以適當 稀釋液稀釋測定試料後，亦可與配位基標識體混合之，又 ，測定試料與配位基標識體混合後，以適當稀釋液進行稀 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先聞讀背面之注意事 I# •項再填、 裝— :寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -11 - 1275796 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（9 ) 釋後，亦可以該一定量做爲檢體量使用。 本發明測定方法中’預先將測定試料物暂與配位基標 識抗原或配位基標識抗體，以及酵素標識抗體於溶液中進 行反應後，將該反應混合物加入配位基收集劑固定化固相 後，再加入洗淨液，去除多餘的酵素標識抗體後，更可採 取反應酵素基質之方法。此等方法於高分子量物質上其抗 原素以1種且多種存在之糖鏈抗原如：c A 1 9 - 9爲極 有效者。 本發明測定方法中，做爲測定對象之試料物質者如： 過敏原特異I g E抗體、非特異性I g E、肝炎病毒（A 、：B、C、D、E型）、病毒性感染症（Η I v、 Η T L V、單純疱疹、枯病、風疹等）、原蟲性感染病（ .毒漿原蟲屬、螺旋原蟲屬等）、真菌性感染症（拉坦捏屬 、串珠菌屬、滴蟲屬等）各種感染症標識劑、C Ε Α、 AFP、PSA、CA19 — 9、CAl25、鐵蛋白、 D U P A N I I等腫瘤標識劑、C R P、A S ◦、R F等 炎症標識劑、肌動朊I 、肌動朊T、肌血球蛋白等心肌梗 塞標識劑等示例。 以下代表本發明之實施例與比較例。 〔實施例1〕 (1 ).藉由物理性固定化方法製作抗生物_抗體固疋化多 孔性固相 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I~L-----—·1-------訂------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -12- 1275796 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（10 ) 1 )製作抗生物素抗體山羊I g G抗體固定化固相 於玻璃濾器與吸收層相互組成之blot裝置（特開平 了 一 2 1 8 4 3 8號公報之記載）中於室溫下由其濾器上 部加入1 〇 m Μ磷酸鹽一生理食鹽水緩衝液（濕潤液： ρΗ4.7)，再加入1〜1 0 00/zg/a抗生物素抗 體山羊I g G溶液（1 〇 〇 m Μ檸檬酸緩衝液：ρ Η 3〜 4，或1 〇 m Μ磷酸鹽一生理食鹽水緩衝液：ρ η 7 . 4 )後，放置1 0〜3 0分鐘後，再加入含有Block S (大日 本製藥（股份）製）之含連粘劑.與防腐劑之安定化劑混合 液。該blot裝置經凍結乾燥1晝夜後，製成抗生物素抗體固 定化固相。 2 )於抗山羊抗體兔子I g G中製作多層抗生物素抗體山 羊I g G之固相 裝有玻璃瀘器之Blot裝置中，室溫下由濾器上部加入濕 潤液，添加1〜1 0 0 // g / 4之抗山羊抗體兔子I g G 溶液（1 0 0 m Μ檸檬酸緩衝液:ρ η 3〜4，或1 0 m Μ磷酸鹽一生理食鹽水緩衝液：ρ η 7 . 4 )後，放置 1 0〜3 0分鐘。再加入1〜1 〇 〇 〇 //忌/2之抗生物 素抗體I g G溶液（1 〇 m Μ磷酸鹽-生理食鹽水緩衝液 :Ρ Η 7 _ 4 )，更放置1 0〜3 0分鐘後，再添加連粘 劑與安定化劑混合液。進行乾燥丨天1夜後，製成多層抗 生物素抗體固定化固相。 (請先閲讀背面之注意事 4 項再填. 裝— ;寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） -13- 1275796 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（u ) (2 )使用標準I g E之檢出感度比較 於以該2 )所製作之抗生物素抗體固定化固相載體組 裝之Blot裝置中各添加5 0 // 1之含Block S與防腐劑之連 粘液後，再加入5 // 1之預先於5 0 // 1人體I g E抗體 標品中以生物素化試藥標識抗人體1 g E monoclonal抗體 之試藥後，滴入5 0 β 1之於3 7 °C下進行5分鐘加溫之 混合液。3 7 °C下進行加溫2分鐘後’滴入2 0 // 1以過 氧化酶進行標識之抗人體I g E monoclonal抗體後，3 7 °C下再加溫2分鐘後，完全吸收2次8 0 // 1之含有 0 . 5 %非離子界面活性劑（Tween-20 )之緩衝化生理食 鹽水所成之洗淨液後進行滴入後，去除殘留於濾器固相載 體之過剩標識抗體。再將西洋山葵過氧化酶基質之四曱基 聯苯胺（Τ Μ B Z )溶液各以4 0 // 1添加後，於3 7 °C 下進行反應後，以6 7 0 n m激光做爲光源之積分球檢測 器測定固相載體表面之青色色調之反射率（△ K / S )。 測定時，於液體滴入blot裝置後6分鐘以內測定酵素反應之 初速度後完成。由添加基質開始分別以a、b秒後之反射 率做爲（K/S) a、（K/S) b後，初速度（ΛΚ/ S )以下式示之。 Δ K/S = ((K/S)b-(K/S)a)x 60/(b-a) 爲了與該‘本發明測定方法所使用之固相進行比較，利 用未敏化之玻璃纖維冲孔後組裝之Blot裝置於室溫下由濾器 上部加入1 0 m Μ磷酸鹽-生理食鹽水緩衝液（濕潤液： pH 7 . 4)後，再添加51 1〜1 00#g/

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210 X297公釐J I — ^-----------1T------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -14- 1275796 A7 B7 五、發明説明（12 ) C请先閱讀背面之注意事項存填寫本貢) m L之抗體I g E monoclonal抗體溶液（1 〇 〇 m Μ檸檬 酸緩衝液：ρ Η 3〜4，或1 0 m Μ磷酸鹽一生理食鹽水 緩衝液：ρ Η 7 . 4 )後，放置1 〇〜3 0分鐘後，加入 含有Block S之粘連劑與防腐劑之.安定化劑混合液。將該 Blot裝置進行乾燥1天1夜後，製作抗人體I g E monoclonal抗體固定化固相。利用此固相載體進行測定操作 時，以1 : 1混合稀釋液與檢體後，使用5 0 // 1做爲檢 體後，求出測定値（比較例1 .)。 測定結果如表1所不。 表1 標準人體I g E抗體濃度之感度比較 檢體 本發明方法 (Δ K/S) 比較例1 (△ K/S) 本發明方法/ 比較例 IgE標準液（iu/m L) 0 0.00552 0.00670 0.82 0.35 0.02851 0.00819 34.8 1.00 0.08816 0.02036 43.3 由表1 結果確定本發明測定方法比比較例之測定感度 高出3〇〜 4 0倍者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3 )測定病患血淸中之過敏原特異I g E .準備5個X 3各計1 5個組裝該（1 ) 一 2 )所製作 本纸張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（公釐） -15- 1275796 A7 B7 五、發明説明（彳3 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之抗生物素抗體固定化固相之Blot裝置。分別由上部添加 5 0 // 1含有Block S之粘連劑與含有防腐劑之粘連液，再 分別於5 // 1之生物素化家塵2，過敏原液（Η 2 )、生 物素化粉蟎、過敏原液（D 2 )、生物素化加茂榧花粉、 過敏原液（G 3 )、生物素化豬草花粉、過敏原液（W 1 )、生物素化格鏈孢、過敏原液（Μ 6 )中加入5 0 // 1 患者血淸於3 7 °C下加溫5分鐘。 將此於分別Blot裝置中各添加5 0 // 1後3 7 °C下加溫 2分鐘後，分別於Blot裝置中加入西洋山葵過氧化酶標識抗 人體I g E老鼠monoclonal抗體溶液各2 0 // 1 ，3 7 °C下 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 加溫 2 分鐘。將 80//1 含 0 . 5% Tween-20 之緩衝化生理食鹽水所成洗淨液2次供給前溶液完全吸收 後供入各個Blot裝置後，去除殘留於濾器固相之過剩標識抗 體後，分別加入4 0 // 1之西洋山葵過氧化酶基質之四甲 基聯苯胺（Τ Μ B Z )溶液後，於3 7 °C下進行反應後， 再以6 7 0 n m激光做爲光源之積分球檢測器進行測定固 相表面青色色調之反射率（△ K / S )。測定時係於Blot裝 置中滴入溶液後，於6分鐘以內使酵素反應之初速度測定 完成。其結果示於表2。 爲進行比較，利用各種過敏原液（1〜5 // m g / d 濃度），於組裝玻璃濾器與吸收層之Blot裝置中由濾器上部 於室溫下添加5 0 // m之1 〇 m Μ磷酸鹽-生理食鹽水緩 衝液（濕潤液：Ρ Η 7 · 4 )後，再加入1 〇 〇 // m之1 〜5 A g /J過敏原液1 0 0 m Μ檸檬酸緩衝液：p Η 3 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS )八4規格（210 X297公釐） -16- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1275796 A7 B7 五、發明説明（14) 〜4，或1 0 m Μ磷酸—生理食鹽水緩衝液（濕潤液： Ρ Η 7 . 4 )之後，放置1 〇〜3 0分鐘後，再加入5〇 A 1之含有Block S之粘連劑與含有防腐劑之安定化劑混合 液。將該Blot裝置進行凍結乾燥1 .天1夜後，取得過敏原固 定化固相。 使用該固相後，加入粘連液之後，於各2 5 // 1病患 血淸中加入2 5 // 1稀釋液進行混合後，各以5 0 // 1加 入Blot裝置中，3 7 °C T進行加溫2分鐘後，於各Blot裝置 中分別加入2 0 // 1之西洋山葵過氧化酶標識抗人體 Ig E抗體老鼠monoclonal抗體溶液後，3 7°C下加溫2分 鐘。將8 0 // 1含0 . 5 % T w e e η — 2 0之緩衝化 生理食鹽水所成之洗淨液以2次於供於前完全吸收溶液後 供入各blot裝置後，去除殘留於瀘器固相之過剩標識抗體。 再分別加入4 0 // 1之西洋山葵過氧化酶基質之四甲基聯 苯胺（Τ Μ B Z )溶液，於3 7 t：下進行反應。隨後，以 6 7 0 n m激光做爲光源之積分球檢測器進行測定固相表 面青色色調之反射率（△ K / S )(比較例2 )。其結果 示於表2。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I--^------^裝------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -17- 1275796 A 7 B7 五、發明説明（15 ) 表2 依抗生物素抗體固相之患者血淸中的過敏原特異性 I g E抗體反應性 患者

A

B

C 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 過敏原 H2 D2 G3 W1 M6 H2 D2 G3 W1 M6 H2 D2 G3 W1 Μ 6 本發明方法 (△ K/S) 2.54016 2.60332 11.51162 5.57485 2.74481 0.35537 0.56343 1.51130 0.21810 0.16459 0.00109 0.00093 0.00963 0.01234 0.00244 比較例2 (△ K/S) 1.21961 1.42753 5.93553 3.16917 0.94953 0.11558 0.14109 0.66317 0.07252 0.02248 0.00181 0.00016 0.00287 0.00510 0.00156 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） _ 18- 1275796 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（16 ) 由該結果證明，與比較例測定操作（比較例2 )比較 後本發明測定操作之測定感度（即△ K / S之値）爲2倍 以上，與比較例比較後，即使再低値（病患C )者，本發 明方法仍以良好感度測得，容易判定者。 〔實施例2〕 (1 )藉由物理性固定化法製作抗鏈霉抗生物素蛋白固定 化多孔性固相 1 )鏈霉抗生物素蛋白固定之化固相之製作 於組裝玻璃濾器之Blot裝置中，室溫下由其濾器上部加 入濕潤液後，再加入1〜1 0 〇 〇 // g / 2之鏈霉抗生物 素蛋白溶液（1 0 0 m Μ檸檬酸緩衝液：P Η 3〜4，或 1 0 m Μ磷酸鹽一生理食鹽水緩衝液：ρ Η 7 · 4 )，放 置1 0〜3 0分鐘後，加入粘連劑與定定化劑混合液。凍 結乾燥1天1夜後，製成鏈霉抗生物素蛋白固定化固相。 I丨Κ-----裝------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -19- 1275796 A7 ___B7 五、發明説明（17 ) p Η 7 . 4 )，放置1〇〜3〇分鐘後，添加1〜 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 〇 0 0 // g/mC之鏈霉抗生物素蛋白溶液（1 〇mM磷 酸鹽—生理食鹽水緩衝液：p Η 7 · 4 )，放置1 〇〜 3 0分鐘後，加入粘連劑與安定劑混合溶液。凍結乾燥1 天.1夜後，製作多層鏈霉抗生物素蛋白固定化固相。 使用實施例1所載比較例2 (過敏原直接接合於固相 上者）後以該2 )之固相做爲比較例之使用後，與實施例 1相同之方法進行測定病患血淸特異I g Ε時亦與實施例 1取得幾乎相同値者，顯示2倍左右之高感度者。亦即， 證明因相變更爲鏈霉抗生物素蛋白仍取得相同結果者。 〔實施例3〕 (1 )藉由化學固定化法製作抗生物素抗體固定化多孔固 相 將穿孔値徑8 m m之玻璃濾器於4 5 °C下浸漬於2 % 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 3 -胺基丙基乙氧基矽烷-丙酮溶液中1天1夜後，以丙 酉同洗淨後乾燥之。再於室溫下將此浸漬於1 %戊二醛（ G A )水溶液中1小時後，利用0 _ 2 5 Μ磷酸鹽緩衝液 (Ρ Η. 7 _ 4 )使戊二醛之臭味消失爲止進洗淨之後，調 製戊二醛活性化濾器。室溫下將此組裝於Blot裝置中，由濾 器上部加入1〜1 OOeg/α之抗山羊抗體兔子I gG 溶液（· 1 0 m Μ磷酸鹽一生理食鹽水緩衝液.：Ρ Η 7 . 4 )，室溫下放置1 0〜3 0分鐘後，加入1〜1 〇〇〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -20- 1275796 A7 B7 五、發明説明（18 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) V g 2之抗生物素抗體山羊I g G溶液（1 0 m Μ磷酸 鹽—生理食鹽水緩衝液：ρ Η 7 . 4 )，室溫下放置1 0 〜3 〇分鐘。再由上部加入粘連劑與安定化混合溶液後， 凍結乾燥1天1夜後，製作多層抗生物素抗體固定化固相 〇 利用該取得固相與實施例1同法求取檢出感度之結果 證明，與實施例1取得之結果相同者。 〔實施例4〕 (1 )利用多層抗生物素抗體固相測定病患血淸中過敏原 特異I g Ε 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 準備8個X 8名計6 4個採樣杯，分別取5 _// 1之生 物素化花粉、過敏原液（G 2 )、生物素化絆根草花粉、 過敏原（G 6 )、生物素化秋麒麟草花粉、過敏原液 (W 1 2 )、生物素化白樺花粉、過敏原液（T 3 )、生 物素化青徽（Μ 1 )、過敏原液、生物素化cladosponium。 過敏原液（Μ 2 )、生物素化花生過敏原液（F 1 3 )、 生物素化蛋黃、過敏原液（F 7 5 )，於此中分別加入 5 0 // . 1病患血清後3 7 °C下加溫5分鐘。亦即，當1容 量生物素化過敏原液時使用1 0容量之被檢試料液。預先 添加5 0 // 1粘連液後濕潤之實施例1之（1 ) 一 2 )所 製成之Blot裝.置中分別於爐上部分加入5 0// 1之此等反 應混合液，3 7 °C下加溫2分鐘。加溫後，由各Blot裝置上 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ — -21 - 1275796 A7 7 Β 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 部各加入2 0，1之西洋山葵過氧化酶標識抗人體I g E 老鼠monoclonal抗體溶液後，3 7 °C下加溫2分鐘。再由分 別Blot裝置之上部各加入2次1 0 0 // 1洗淨後，去除過剩 之標識抗體後，再各添加4 0 // 1之Τ Μ B Z溶液，3 7 °C.下進行反應後，以積分球檢測器測定呈現於固相載體表 面之青色反射率（△ K / S )。總反應時間爲1 〇分鐘完 成。預先以相同方法使用人體I g E抗體標品後由所製作 之檢量線算出8名病患血淸中分別8種過敏原特異I g e 抗體濃度。結果如表3所示。 表3 依多層抗生物素抗體固相 患者血淸中之過敏原特異性I g E濃度 過敏原特異性IgE濃度(iu/m L) 過敏原 患者D 患者E 患者F 患者G 患者Η 患者I 患者J 患者Κ G2 88.0 10.1 2.3 73.5 91.5 91.3 94.2 2.6 G6 75.0 44.6 1.7 75.4 182.0 122.6 111.9 1.4 W1 6.1 0.4 0.7 9.9 144.3 9.1 3.5 1.8 Τ3 8.9 0.4 0.6 11.8 90.5 8.6 0.9 0.4 Ml 6.8 0.2 0.2 3.7 1.2 3.1 2.1 0.0 M2 6.5 0.9 0.4 4.4 25.8 2.9 59.4 0.1 F13 1.2 0.3 0.6 0.9 4.1 0.6 0.5 0.5 F75 0.5 0.1 0.5 0.3 0.8 0.0 0.5 0.1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） I — ,- — ‘---------、玎-----Φ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -22- 1275796 A7 ____B7 五、發明説明（20 ) 由表3結果確疋本發明測定方法可以高感度測得各種 過敏原特異I g E者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〔實施例5〕 (1 )關於過敏原特異I g E濃度 利用抗生物素抗體固定化固相，與實施例4相同方法 下’針對5名病患進行測定2.8種過敏原特異1§£( Η 1 :家麈、Η 2 :家塵2、D 1 :野粉蟎、d 2粉蟎、 Ε1 :貓上皮、Ε2 :狗上皮、Ε5 :狗皮屑、G1 :黃 化才 〇 3 ·甲矛、G 6 ·絲早（phieum pratense) 、W1 :豬草、W 6 :艾蒿、W 1 2 :秋麒麟草、τ 1 7 :杉木 、F1 ·蛋白、F2 :牛奶、F4 :小麥、F9 :米、 F11:薔麥、F14:大豆、F23:蠏、F24:蝦 、F 7 5 :蛋黃、Μ 1 :青黴、Μ 2 : cladosporium、Μ 3 :曲黴、Μ 5 :念珠菌、Μ 6 :格鏈孢菌）。使用市販 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Pharmacia，普強公司之過敏原特異I g ε測定試藥（比較 )測定相同檢體後，求出與本發明測定方法（發明）之關 係。結果示於表4與表5。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23 - 1275796 A7 B7 五、發明説明（21 )

表4 關於患者血淸中過敏原特異性I g E

IgE 濃度(m/mL) 過敏原 患者A 患者B 患者C 患者D 患者E 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 比較 發明 比較 發明 比較 發明 比較 發明 比較 發明 H1 57.9 38.7 100> 100〉 29.7 9.6 0.8 1.1 17.6 6.9 H2 62.1 57.1 100> 100> 14.2 8.8 2.0 2.5 2.65 2.7 D1 38.0 25.0 100〉 100> 26.0 13.2 0.65 2.4 0.53 0.34< D2 58.4 83.2 100〉 100> 14.9 11.3 1.35 3.4 0.5 0.34< E! 16.1 17.7 17.0 18.0 2.0 3.3 2.25 1.3 24.2 16.7 E2 19.8 29.2 45.4 100> 13.5 8.4 3.75 0.8 27.4 20.4 E5 39.5 55.3 86.6 100> 24.5 12.4 3.55 4.8 48.6 44.5 G1 100〉 100〉 100〉 100> 47.5 33.3 1.5 2.4 33.3 37.7 G3 53.2 100> 100〉 100> 45.9 31.6 2.3 3.7 47.4 37.4 G6 100〉 1〇0> 100> 100> 30.9 35.2 1.6 3.3 10.7 34.8 W1 1〇0> 100〉 28.4 28.3 10.4 7.0 2.9 2.8 1.07 0.5 W6 100〉 100〉 11.8 8.1 13.5 11.1 0.34< 0.34< 0.7 1.2 W12 100> 100> 6.5 1.9 5.4 4.7 0.34< 2.1 0.34< 1.3 T17 33.2 50.2 7.8 16.2 5.6 7.9 1.45 1.7 1.63 3.7 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24- !27579 6

表 明説明（ 22 A7 B7

關於患者血淸中過敏原特異性I g E 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 過敏原 〜---__ F1 F2 F4 F9 Fll F14 F23 F24 F75 Ml M2 M3 M5 M5 患者A 比較發明 2.21.8 18.3 24.2 36.6 72.1 13.5 10.9 5.9 7.2 54.6 100> 30.5 76.7 6.4 4.6 14.0 23.7 43.3 97.1 8.3 6.7 6.2 7.6 24.4 100> 23.7 48.3

IgE 濃度(iu/mL) 患者B 患者C 2.0 4.9 0.34< 1.0 2.8 0.34< 1.2 2.5 0.75 5.7 11.7 1.1 034 1.1 〇.34< 0.9 3.6 2.9 6.3 7.4 0.34< 4.0 14.0 0.34< 0.7 1.4 0.34< 0.8 0.35 5.6 28.5 6.6 5.4 17.8 12.0 6.2 21.0 17.6 2.8 0.34< 17.8 9.1 8.5 2.8 患者D 患者E 發明 比較 發明 比較 發明 0.6 0.7 1.1 0.63 0.34< 0.34< 1.05 1.4 0.65 0.34< 8.3 0.34< 1.7 0.34< 2.2 2.6 0.4 0.5 0.5 1.9 2.4 0.5 2.4 0.34< 2.0 4.2 1.65 2.1 0.77 0.9 1.9 0.34< 2.8 0.34< 2.7 0.34< 0.34< 2.1 0.34< 2.1 0.34< 0.34< 1.6 0.34< 1.6 2.0 0.34< 0.6 0.34< 1.3 2.3 0_34< 0.34< 0.34< 2.5 3.2 1.1 1.0 1.45 1.5 0.34< 0.34< 0.34< 2.0 2.0 2.8 1.25 1.1 20.1 7.7 過敏原點數依表6進行分類之。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -25- 1275796 A7 B7 五、發明説明（23 ) 表6 I g E單位與過敏原級數 I g E單位（i u / m L)過敏原級數 0.34< 0 0.35-0.7 1 0.7-0.35 2 3.5-17.5 3 17.5-50 .4 50〜100 5 100> 6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用表4及表5所示之比較用市販過敏原特異I g E 測定試藥時與使用本發明方法時相互關係如下所述。 測定總數η二1 4 0，過敏原特異I g E單位（1 u / J )中 Y 二 0.911X+1.769 (r=0.9542 )， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 過敏原點數中 Y 二〇.9 7 8 X - 0 . 123 (r = 0 .8668 )。 因此，兩測定法關係被確定呈良好者。 〔實施例Θ〕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 1275796 A7 B7 五、發明説明（24 ) 3寸論試料物質溶液與配位基結合溶液相互混合時容量比之 影響 1 )使用試料物質溶液（標準I g E溶液：1〇〇 1 u / 4 )與配位基結合體溶液（生物素抗人體I g e溶 液（L W )後，利用於實施例1 - 1 )所製成抗生物素抗 體山羊I g G抗體固定化固相載體後，相同方法之測定進 行檢測其混合比（容量比）對測定感度之影饗。其測定結 果不於表7 〇 表7 標準I g E液量/生物素化抗人體I g E液量（ β L )之檢討 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 標準IgE液量/生物素化抗人體IgE液量 之檢討 55/5 50/10 30/30 10/50—一 容量比率 11/1 5/1 1/1 1/5 測疋攸量 50 β L 50 β L 50 β L △ K/S 2.36552 2.35153 1.30979 0.30871 相對感度 195 194 100 26 ----—一 、紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -27- 1275796 Α7 Β7 五、發明説明（25 ) 由表7結果證明，試料物質溶液與配位基結合體溶液 相互混合時其谷量比對測定感度之影響極大，前者/後者 之比以1 / 1以上者爲理想者，而感度上昇約爲5 / 1呈 飽和狀態。 2 )使用各種試料物質溶液（過敏原陽性血淸）與對 應其之配位基結合體溶液（生物素化過敏原溶液）後，針 對混合比5 / 1 (混合系A )與混合比1 / 1 (混合系b )’測定時採樣量共爲5 〇 // .1 ，利用實施例q —丄）所 作成之抗生物素抗體山羊I g G抗體固定化固相後，相同 方法之測定下進檢測其混合比（容量比）對於測定感度之 彭響。其測定結果如表8所τρ；。 --------------打----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28- 1275796 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26 ) 表8 感度測定結果（△ K / S ) 過敏原 混合糸A (5/1) 混合系B (1/1) 感度比 (混合系A /混合系B) .Hi 1.23978 0.44445 2.79 H2 1.11038 0.33981 3.27 D1 0.62250 0.32875 1.89 D2 1.05743 0.33024 3.20 T17 0.44030 0.20788 2.12 M5 0.23293 0.17990 1.29 W6 2.76923 1.62059 1.71 G6 4.35569 2.05935 2.12 F4 0.18331 0.09790 1.87 E2 0.32497 0.11364 2.8 6 Ml 0.04295 0.01872 2.29 平均値 2.3 1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -29- 1275796 A7 ________B7 五、發明説明（27 ) 由表8結果證明，即使過敏原測定時，使用前處理之 纖維質多孔性固相之測定中，預先增加進行過敏原溶液/ 生物素化過敏原溶液之混合比仍可明顯提昇感度者。 3 )針對改善各種試料物質溶液（I g E溶液）之濃 度後針對混合比5 / 1 (混合系a )與混合比1 / 1 (混 合系B )對於I g E溶液（試料溶液）與生物素化抗人體 I g E液之混合比（容量比）測定感度之影響，測定時採 牛永夏做爲5 0 // 1 ’與該1 )同法進行實驗（作成檢量線 )。其結果如表9所不。 表9 檢量線：變更I g E溶液濃度之感度測定結果 (Δ K / S ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

IgE溶液 濃度 混合系A (5/1) 混合系B (1/1) 感度比 (混合系A/混合系B) 0(iu/mL) 0.00055 0.00133 0.41 1 0.00957 0.00430 2.23 5 0.10379 0.04680 2.22 25 0.83763 0.38643 2.17 100 2.55494 1.76600 1.45 平均値 2.02 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -30- 1275796 A7 B7 五、發明説明（28 ) 由表9結果證明，檢量線之感度亦藉由試料物質溶液 與配位基結合體溶液相互混合時混合比增加而出現提昇。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 〔實施例7〕 爲糖鏈抗原者，分子上進行測定1種抗原存在多數 C A 1 9 - 9時以實施例1之方法並未出現感度提昇，因 此，針對同時反應3者之方法進行之。 藉由實施例3之化學固定化法利用抗生物素抗體固定 化多孔性固相，組裝多孔性固相於Blot裝置中。將生物素標 識抗人體 C A 1 9 — 9 monoclonal 抗體 4 // g/w£，1 5 與0八19 一 9標準各濃度30//1 ，與30//1之過 氧化酶標識抗C A 1 9 - 9 monoclonal抗體進行混合後， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 7 °C下加溫維持5分鐘，加入各5 0 // 1之含Block S之 粘連劑與含有防腐劑之粘連液於Blot裝置中，再滴入5〇 // 1預先加溫之試料，於3 7 °C下進行加溫3〜4分鐘， 將2次80//1之含0 . 5% Tween — 20之緩衝 化生理食鹽水所成洗淨液於供與前完全被溶液吸收後供於 各Blot裝置後，去除殘留於.濾器固相中過剩之標識抗體。 再分別添加4 0 // 1之西洋山葵過氧化酶基質之四甲 基聯苯胺（Τ Μ B Z )溶液，於3 7 °C下進行反應，於以 6 了 0 n m激光做爲抗原之積分球檢測器進行測定固相表 面青色色調之反射率（△ K / S )。標準液之測定値如表 1〇所示。 以組裝未處理之玻璃纖維濾器之Blot裝置做爲比較例使 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -31 - 1275796 A7 _____B7 五、發明説明（29 ) 用後，由濾器上部於室溫下加入1 〇 m Μ磷酸鹽-生理食 鹽水緩衝液（濕潤液：ρ Η 7 · 4 )，再加入1 0 〇 β g / mC之抗人體C A 1 9 — 9 monoclonal抗體溶液（ 1〇0 n m棒橡酸緩衝液：p η 3〜4 ，或1〇ηι Μ憐酸 鹽—生理食鹽水緩衝液：ρ Η 7 . 4 )，放置1 0〜3〇 分鐘後，再加入含Block S之粘連劑與含有防腐劑之安定化 劑混合液。將該Blot裝置乾燥凍結一天一夜後製作抗人體 C A 1 9 — 9 m 0 η 〇 c 1 ο n a 1抗體固定化固相。以此固相做爲 比較例使用之。測定方法係將稀釋液與C A 1 9 - 9標準 液以1 ·· 1混合後，以5 0 // 1做爲檢體使用後，與本發 明方法同法操作後，測定人體C A 1 9 - 9標品，求出測 定値。其結果示於表1 〇。 表1 0 c A 1 9 - 9標準液測定値 ----------------訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CA19-9標準 本發明方法 比較例 OU/mL 0.011 0.005 40U/mL 0.548 0.456 160U/mL 4.062 2.043 640U/mL 8.822 5.8 19 罕 標 豕 國 1¾ T 通 度 尺 張 紙 尽 格 規 4 公 -32- 1275796 A7 B7 五、發明説明（30 ) 該結果顯示三者同時混合者感度較高。 〔產業上可利用性〕 根據本發明生理活性物質之存在量，感度測定法 用用免疫學測定法後，因應測定對象物質未分別調製 定固相，使用單一配位基收集劑固定化固相可以簡便 速，且高感度及高精密度測定多種類之測定對象物質者 ，利 ，設 ，迅 Γ請先聞讀背面之注意事項再填寫本I) -裝· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33-

Claims (1)

1275796 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 第90 1 1 88 84號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 f r •λ Γ ^ 民國95年ίο月27日修;ίΕ 1 · 一種使用多孔性濾器具生理活性之試料物質的測 €方法，其特徵係由含具有生理活性之測定試料物質的試 f斗溶液與含有結合配位基於特異結合於該測定試料物質之 第1生理活性物質的結合體溶液使其溶液容量比以1 : 1 〜2 〇 : 1相互接觸後，使結合配位基之生理活性物質與 '測定試料物質相互複合體形成於溶液中之步驟；將含有該 複合體之溶液滴入該配位基收集劑介著調距板而結合之多 子匕性濾器表面，使該複合體之配位基部份結合於該配位基 收集劑之步驟；於該多孔性濾器表面滴入特異結合於該測 定試料物質之標識酵素的第2生理活性物質溶液後，此具 有標識酵素之第2生理活性物質介著配位基收集劑與配位 基部份進行結合結合多孔性濾器之第1生理活性物質與測 定試料物質相互之複合體步驟；藉由洗淨多孔性濾器後去 除未結合之酵素標識第2生理活性物質步驟；以及測定結 合於多孔性濾器之酵素活性步驟所成者。 2 · —種使用多孔性濾器具有生理活性之試料物質的 測定方法，其特徵係含具有生理活性之測定試料物質試料 溶液，含結合配位基於特異結合於該測定試料物質之第i 生理活性物質之結合體溶液，以及含特異結合該測定試料 物質之被標識酵素的第2生理活性物質溶液其該試料溶液 與該結合體溶液相互之容量比以1 : 1〜2 0 : 1進行接 ί紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~~ " L-IL-------II (請先閲脅背面之注意事項再填寫本頁) *1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1275796 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 觸後，於溶液中形成結合配位基之第1生理活性物質與測 定試料物質以及酵素標識第2生理活性物質所成之複合體 步驟；將含該複'合體溶液滴入該配位基收集劑介著調距板 而結合之多孔性濾器表面，使該複合體配位基部份結合於 該配位基收集劑之步驟；藉由洗淨多孔性濾器後去除未結 合之酵素標識生理活性物質之步驟；以及測定結合於多孔 性濾器之酵素活性之步驟所成者。 3 .如申請專利範圍第1項或第2項之試料物質的測 定方法，其中該方法係以纖維質多孔性濾器做爲多孔性濾 器使用者。 4 .如申請專利範圍第1項或第2項之試料物質的測定 方法，其中該方法係使試料溶液與含有結合配位基於特異 結合測定試料物質之第1生理活性物質之結合體溶液其溶 液容量比以2 : 1〜1 0 : 1之量進行接觸者。 5 .如申請專利範圍第1項或第2項之試料物質的測定 方法，其中該方法係以生物素做爲配位基使用者。 6 .如申請專利範圍第5項之試料物質的測定方法， 其中該方法係以抗生物素抗體做爲配位基收集劑使用者。 7 .如申請專利範圍第1項或第2項之試料物質的測定 方法，其中該第1生理活性物質中做爲配位基被結合之結 合體者爲使用生物素化過敏原者。 本紙張尺度適用中國國家播準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-2 - L---^----：------ (請先閲·«背面之注意事項再填寫本頁) *v't> 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製