KR20020086558A

KR20020086558A - 다공성 필터를 이용하는 생리활성 시료물질의 측정방법

Info

Publication number: KR20020086558A
Application number: KR1020027010881A
Authority: KR
Inventors: 니우기요사또; 스즈끼요시노리; 다지마도시오; 하뉴쯔네오; 다네베마사루
Original assignee: 닛뽕 케미파 가부시키가이샤
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2001-02-20
Publication date: 2002-11-18
Also published as: WO2001063283A1; JP4545869B2; AU2001232350A1; TWI275796B; JP2001235471A

Abstract

측정시료물질 용액과 시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체 용액을, 용액 용량비가 1:1∼20:1로 접촉시켜 리간드에 결합된 생리활성물질과 측정시료물질의 복합체를 용액 내에서 형성하는 것; 복합체함유 용액을 상기 리간드 포착제가 결합된 다공성 필터에 적가하여 이 복합체의 리간드 부분을 리간드 포착제에 결합시키는 것; 필터에, 측정시료물질에 특이적으로 결합하는, 효소로 표지된 제2생리활성물질 용액을 적가하여 이 효소 표지 생리활성물질을, 리간드 포착제와 리간드 부분을 통해 필터에 결합되어 있는 제1생리활성물질과 측정시료물질의 복합체에 결합시키는 것; 필터를 세정하여 결합되지 않은 효소 표지 제2생리활성물질을 제거하는 것; 다음에 필터에 결합된 효소 활성을 측정하는 것으로 이루어진, 단시간에 생리활성 시료물질의 고감도 측정이 가능한 방법.

Description

다공성 필터를 이용하는 생리활성 시료물질의 측정방법{METHOD OF MEASURING PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SAMPLE SUBSTANCE BY USING POROUS FILTER}

고상 면역 측정법에서는 측정대상으로 하는 항원 또는 항체에 따라 미리 해당하는 항원에 대응되는 고정화 항체 고상 또는 해당하는 항체에 대한 고정화 항원 고상을 조제하고, 측정 때마다 대상으로 하는 물질에 대응된 이 고상을 선택하는 방법이 종래에는 일반적이었다. 이러한 방법에서는 측정대상물질마다 필요한 고상 종류는 무수하기 때문에, 고상 조제가 매우 번잡하고 또 측정 조작도 기계적 또는 사용수법에 관계없이 측정대상물질에 따라 적당한 고상마다 선택해야 하는 번잡함이 겹쳤다.

상기 문제를 해결하고자 하는 시도는 이미 이루지고 있다. 예컨대, 1종류의 리간드 포착제 고정화 고상을 사용하고, 측정대상물질에 따른 리간드 표지 생리활성물질을 선택하여 리간드 포착제 고정화 고상 상에서 측정시에 필요로 하는 리간드 표시 생리활성물질, 즉 리간드 표지 항원 또는 항체를 고상으로 포착하는 것에 의한 방법이 알려져 있다. 또, 필요한 고상을 조제하거나, 시료 중의 측정대상의 항원 또는 측정대상항체와 리간드 표지 항체 또는 리간드 표지 항원을 리간드 포착제 고정화 고상 상에 첨가하여 포착함으로써, 면역적으로 측정되는 임의의 측정대상물질을 측정할 수 있게 하는 방법도 알려져 있다. 이들 방법은 예컨대 일본 특허공보 평4-49657호 및 일본 공개특허공보 평2-145967호에 기재되어 있다.

그러나, 공지 방법으로는 매우 단시간에 1mL당 나노그램량의 레벨에서의 측정 감도를 얻을 수는 없었다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 범용성이 높은 측정구를 사용하여, 종래의 면역학적 측정법에 필요한 시간보다 매우 짧은 시간에 1mL당 나노그램량의 레벨에서의 측정 감도를 얻을 수 있는 면역학적 측정법에 따른 생리활성을 갖는 시료물질의 측정방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 고상 담체로서 다공성 필터를 이용하여 면역학적 측정법에 따른 생리활성을 갖는 시료물질의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명은, 생리활성을 갖는 측정시료물질을 함유하는 시료용액과 이 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체를 함유하는 용액을, 이들 용액의 용량비가 1:1∼20:1(바람직하게는 2:1 이상, 10:1 이하임)이 되는 양으로 접촉시켜 리간드에 결합된 생리활성물질과 측정시료물질의 복합체를 용액 내에서 형성하는 공정; 이 복합체를 함유하는 용액을 상기 리간드 포착제가 결합된 다공성 필터 표면에 적가하여 이 복합체의 리간드 부분을 이 리간드 포착제에 결합시키는 공정; 이 다공성 필터 표면에, 상기 측정시료물질에 특이적으로 결합하는, 효소로 표지된 제2생리활성물질을 함유하는 용액을 적가하여 리간드 포착제와 리간드 부분을 통해 다공성 필터에 결합되어 있는 제1생리활성물질과 측정시료물질의 복합체에 결합시키는 공정; 다공성 필터를 세정함으로써 결합되지 않은 효소 표지 제2생리활성물질을 제거하는 공정; 그리고 다공성 필터에 결합된 효소의 활성을 측정하는 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공성 필터를 이용하는 생리활성을 갖는 시료물질의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측정방법에서 사용되는 다공성 필터로는 섬유질 다공성 필터가 바람직하지만, 다공성 세라믹필터를 이용할 수도 있다.

본 발명은 또한, 생리활성을 갖는 측정시료물질을 함유하는 시료용액, 이 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체를 함유하는 용액, 그리고 이 측정시료물질에 특이적으로 결합하는, 효소로 표지된 제2생리활성물질을 함유하는 용액을, 이 시료용액과 이 결합체용액의 용량비가 1:1∼20:1(바람직하게는 2:1 이상, 10:1 이하임)이 되도록 접촉시켜 리간드에 결합된 제1생리활성물질과 측정시료물질과 효소 표지 생리활성물질로 이루어진 복합체를 용액 내에서 형성하는 공정; 이 복합체를 함유하는 용액을 상기 리간드 포착제가 결합된 다공성 필터 표면에 적가하여 이 복합체의 리간드 부분을 이 리간드 포착제에 결합시키는 공정; 다공성 필터를 세정함으로써 결합되지 않은 효소 표지 제2생리활성물질을 제거하는 공정; 그리고 다공성 필터에 결합된 효소 활성을 측정하는 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공성 필터를 이용하는 생리활성을 갖는 시료물질의 양을 측정하는 방법에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 측정방법에서사용되는 다공성 필터로는 섬유질 다공성 필터가 바람직하지만, 다공성 세라믹필터를 이용할 수도 있다.

본 발명의 시료물질 측정방법의 바람직한 태양을 다음 기재한다.

(1) 리간드로서 비오틴을 사용하는 것,

(2) 리간드 포착제로서 항비오틴 항체를 사용하는 것,

(3) 리간드 포착제가 항비오틴 항체이며 스페이서가 항비오틴 항체에 대한 항체인 것,

(4) 제1생리활성물질에 리가드가 결합된 결합체로서 비오틴화 알러겐을 사용하는 것,

(5) 리간드 포착제가 스페이서를 통해 결합되어 있는 섬유질 다공성 필터를 이용하는 것,

(6) 리간드 포착제가 스트렙토아비딘인 것,

(7) 리간드 포착제가 스트렙토아비딘이고, 스페이서가 항스트렙토아비딘 항체인 것,

(8) 리간드 포착제가 스트렙토아비딘이고, 스페이서가 항스트렙토아비딘 항체에 대한 항체에 항스트렙토아비딘 항체를 중층한 것,

(9) 섬유질 다공성 필터 하부에 흡수체가 구비되어 있는 것,

(10) 섬유질 다공성 필터를 고상 담체로 하고 리간드를 포착하는 리간드 포착제를 이 고상 담체 상에 담지하고, 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 물질과 측정시료물질을 함유하는 시료를 액 내에서 혼합 교반하고 반응시킨 후, 이 반응액의 일정량을 리간드 포착제가 결합되어 있는 고체 담체 상에 직접 적가하고, 그 후 적가 부분에, 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 효소로 표지된 제2생리활성물질을 함유하는 용액을 적가 반응시키고, 이 반응액이 필터의 세로방향으로 침투한 후 세정액을 적가하여 이어서 섬유질 다공성 필터 상의 효소 활성량을 측정함으로써 측정시료물질량을 측정하는 섬유질 다공성 필터 면역측정방법에서, 측정시료물질을 함유하는 시료와 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 생리활성물질에 리간드가 결합된 물질의 액 내에서의 비율이 20:1∼1:1까지의 범위, 바람직하게는 10:1∼2:1, 더욱 바람직하게는 10:1∼4:1 범위에서 측정하는 것,

(11) 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 물질과 측정시료물질을 함유하는 시료의 용액 내에서 결합 반응시킨 후, 이 반응액을 적당한 희석액으로 희석시킨 후 그 일정량을 취하여 고상 담체 상에 적가하는 것,

(12) 효소 반응 후의 신호량의 측정방법으로서 적분구를 사용하여 반사율을 측정하는 것,

(13) 상기 신호량을 측정할 때에 신호 강도의 최초속도를 측정하는 것,

(14) 고상 담체 상에 결합된 효소 활성의 신호 강도의 최초속도를 다 측정할 때까지의 시간이 리간드 포착제가 결합되어 있는 섬유질 다공성 필터 상에 직접, 용액을 적가한 후 15분 이내, 바람직하게는 8분 이내로 반응을 종료시키는 것.

발명의 상세한 설명

본 발명의 다공성 필터를 이용하는 생리활성 시료물질량이나 생리활성 측정법에서 다공성 필터로서는 글래스파이버필터를 이용하는 것이 바람직하다. 리간드로는 비오틴을 사용하는 것이 바람직하고, 또 다공성 필터에 결합시키는 리간드 포착제로는 항비오틴 항체 또는 스트렙토아비딘을 사용하는 것이 바람직하다.

또, 리간드 포착제는 다공성 필터에 스페이서를 통해 결합될 수도 있다. 예컨대, 리간드로서 비오틴을 사용할 때 스페이서를 통하지 않을 때에는 리간드 포착제로는, 리간드에 대한 항체, 즉 항비오틴 항체 또는 스트렙토아비딘을, 그리고 스페이서를 통할 때에는 스페이서로서 리간드 포착제에 대한 항체, 즉 항비오틴 항체에 대한 항체에 항비오틴 항체를 중층하는 것이 바람직하다. 또, 스페이서로서 항스트렙토아비딘 항체를 사용하거나, 항스트렙토아비딘에 대한 항체에 항스트렙토아비딘을 중층하거나 하여 사용할 수도 있다.

다음에, 본 발명의 다공성 필터를 이용하는 생리활성 시료물질의 측정방법을, 항체(알러겐 특이적 IgE 항체)를 측정대상의 생리활성물질로 하고, 제1생리활성물질로서 항원(알러겐)을 사용하고 효소로 표지된 제2생리활성물질로서 효소로 표지된 제2항체(항인간 IgE 항체)를 사용하는 경우에, 그리고 상기 바람직한 다공성 필터, 리간드, 리간드 포착제를 이용하는 계를 예로 들어 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 측정방법에서는 다공성 필터를 고상 담체로서 사용하고, 측정물질에 특이적으로 결합하는 생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체, 예컨대 리간드 표지 항원, 또는 리간드 표시 항체를 함유하는 용액과 측정시료물질을 함유하는 시료용액을 미리 액 내에서 반응시키고, 다음에 이 반응액을 리간드 포착제가 결합되어 있는 다공성 필터 고상 상에 직접 적가하여 적가된 반응액이 필터의 세로방향으로 침투한 후 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제2생리활성물질로, 효소로 표지된 것, 예컨대 효소 표지 항체 또는 효소 표지 항원을 적가, 반응시키고, 이어서 세정액을 적가하여 미반응물을 제거한 후, 섬유질 다공성 필터 상의 효소 활성량을 측정함으로써 측정물질량을 측정할 수 있으나, 본 발명의 측정법에서는 측정시료물질을 함유하는 시료용액과 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체를 용량비로 20:1∼1:1까지의 범위, 바람직하게는 10:1∼2:1 범위로 함으로써 예컨대 15분 이하의 단시간에 ng/mL 레벨의 미량을 측정할 수 있게 되었다.

다공성 필터(고상 담체)의 하부에는 신속하게 용액을 투과시키기 위한 흡수체를 설치하는 것도 바람직하다. 구체적으로는 고상 담체로서 예컨대 일본 공개특허공보 평4-318462호 또는 일본 공개특허공보 평7-218438호에 기재되어 있는 바와 같이, 통액성이 우수하며 단백질이나 당단백질을 물리적 또는 화학적으로 고정화시키는 능력이 우수하고, 적당한 물리적 강도를 갖는 글래스파이버를 사용하며 그 하부에 고상 담체를 통과시킨 용액을 흡수하기 위한 셀룰로오스로 이루어진 흡수층을 조합한 면역학적 측정용 반응용기(즉, 블롯장치)를 사용하는 것이 바람직하다.

스페이서 또는 리간드 포착제의 고상 담체에 대한 고상화 방법은 물리적 고정화법으로는, 이 고상 담체의 상부에서부터 순차적으로 습윤용 완충액, 비오틴을특이적으로 인식하는 단백질용액(리간드 포착제 용액), 측정 목적물질 이외의 협잡물질의 비특이적 흡착을 방지하기 위한 블로킹용액 및 안정화제를 함유하는 완충액을 첨가, 동결 건조시켜 리간드 포착제 고정화 고상 담체를 조제하는 방법을 이용할 수 있다. 또, 화학적 고정화법으로는 글래스파이버 담체를 예컨대 이시카와 등의 방법(효소면역측정법: 의학서원, p94, 1978)에 따라 아미노알킬실란-글루탈알데히드로 처리한 후 흡수층과 조합하여 블롯장치를 만들고, 상기 물리적 고정화법과 동일한 용액을 동일한 순서로 첨가, 동결 건조시켜 리간드 포착제 고정화 고상을 만들 수 있다.

본 발명의 측정방법에서 리간드 포착제로서 항비오틴 항체 또는 스트렙토아비딘을 사용할 수 있으나, 직접 이들 단백질을 글래스파이버 고상 담체에 고정화시키는 것보다 다음에 서술하는 스페이서를 통해 고정화시켰을 때에 보다 높은 감도를 얻을 수 있다. 즉, 바람직하게는 고상 담체에 항비오틴 항체에 대한 항체를 통해 항비오틴 항체를 고정화시키거나, 고상 담체에 항스테렙토아비딘 항체를 통해 스트렙토아비딘을 고정화 또는 항스트렙토아비딘 항체에 대한 항체에 항스트렙토아비딘 항체를 중층한 고상에 스트렙토아비딘을 고정화시켜 만든 고상은 본 발명의 측정법의 유리함을 더욱 증가시킬 수 있다.

본 발명의 측정방법에서는 면역학적 측정법에서, 다종류의 측정대상물질을 신속, 고감도, 특이적, 고정밀도로 측정하기 위해서 리간드 포착제 고정화 고상을 효과적으로 이용할 수 있다.

시료 중의 측정대상물질(측정시료물질)과 면역학적으로 특이적으로 반응하는리간드 표지 항원 또는 리간드 표지 항체의 리간드로서 소분자의 비오틴을 사용하는 것이 바람직하다. 비오틴 표지 항원 또는 비오틴 표지 항체는 그 자체의 면역학적 활성을 손상시키지 않고 측정대상물질과 신속하게 반응하기 때문에 측정시간의 단축이 가능해진다. 비오틴 표지에 의해 항원 또는 항체의 활성 변화가 확인되는 경우에는, 비오틴화 시약의 측쇄길이를 변경하거나 항원 또는 항체의 말단 당쇄를 산화시킨 후 비오틴 표지로 만드는 방법 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 측정방법에서 리간드 포착제 고정화 고상 담체 및 리간드 표지체를 사용하여 시료 중의 측정대상물질을 측정할 때 측정대상물질 검출에 필요한 측정 감도 또는 측정대상물질과 리간드 표지체의 반응에 따라 측정대상의 생리활성물질 용액과 리간드 표지체를 함유하는 용액의 용량비를 바꿔 리간드 표지물질의 농도를 올리며 측정대상물질 농도가 유지되는 용량비, 즉 리간드 표지체 용액:측정대상물질 용액을 1:20∼1:1, 바람직하게는 1:10∼1:2 범위에서 반응시킴으로써, 고감도, 단시간의 측정이 가능해진 것이다. 또, 감도가 레인지오버한 경우에는 적당한 희석액으로 측정시료를 희석한 후 리간드 표지체와 혼합할 수도 있고, 또 측정시료와 리간드 표지체를 혼합한 후 적당한 희석액으로 희석하고, 그 후에 그 일정량을 검체량으로 사용할 수도 있다.

본 발명의 측정방법에서는 측정시료물질과 리간드 표지 항원 또는 리간드 표지 항체, 그리고 효소 표지 항체를 미리 용액 내에서 반응시키고, 이 반응혼합물을 리간드 포착제 고정화 고상에 첨가하고, 이어서 세정액을 첨가하여 여분의 효소 표지 항체를 제거한 후에 다시 효소 기질을 반응시키는 방법을 취할 수도 있다.이들 방법은 고분자량의 물질 상에 에피토프가 1종류로 다수 존재하는 당쇄 항원의 CA19-9와 같은 경우에는 매우 유효하다.

본 발명의 측정방법에서 측정대상이 되는 시료물질로는, 알러겐 특이적 IgE 항체, 비특이적 IgE, 간염바이러스(A,B,C,D,E형), 바이러스성 감염증(HIV, HTLV, 헤르페스, 로터, 루벨라 등), 원충성 감염증(톡소플라스마, 스피로헤타 등), 진균성 감염증(클라미디아, 칸디다, 트리코모나스 등) 등 각종 감염증 마커, CEA, AFP, PSA, CA19-9, CA125, 페리틴, DUPANII 등과 같은 종양 마커, CRP, ASO, RF 등과 같은 염증 마커, 트로포닌I, 트로포닌T, 미오글로빈 등과 같은 심근경색 마커 등을 예시할 수 있다.

다음에 본 발명의 실시예와 비교예를 나타낸다.

[실시예 1]

(1) 물리적 고정화법에 의한 항비오틴 항체 고정화 다공성 고상의 제조

1) 항비오틴 항체 염소 IgG 항체 고정화 고상의 제조

글래스필터와 흡수층을 조합한 블롯장치(일본 공개특허공보 평7-218438호 참조)에 그 필터 상부로부터 실온에서 10mM 인산염-생리식염수 완충액(습윤액: pH7.4)을 첨가하고, 다음에 1∼1000㎍/mL 항비오틴 항체 염소 IgG 용액(100mM 시트르산 완충액: pH3∼4 또는 10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 10∼30분간 방치시킨 후, 블록에이스(다이닛폰 제약㈜ 제조)를 함유하는 블로킹제와 방부제를 함유하는 안정화제 혼합액을 첨가한다. 상기 블롯장치를 하룻동안 동결 건조시켜 항비오틴 항체 고정화 고상을 제조한다.

2) 항염소 항체 토끼 IgG에 항비오틴 항체 염소 IgG를 중층한 고상의 제조

글래스필터를 장착한 블롯장치에 실온에서 필터 상부로부터 습윤액을 첨가하고, 다음에 1∼100㎍/mL 항염소 항체 토끼 IgG 용액(100mM 시트르산 완충액: pH3∼4 또는 10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 10∼30분간 방치시킨다. 계속해서, 1∼1000㎍/mL 항비오틴 항체 염소 IgG 용액(10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 다시 10∼30분간 방치시키고, 이어서 블로킹제와 안정화제 혼합액을 첨가한다. 하룻동안 동결 건조시켜 중층 항비오틴 항체 고정화 고상을 제조한다.

(2) 표준 IgE를 사용한 검출 감도 비교

상기 2)에서 제조된 항비오틴 항체 고정화 고상 담체를 장착한 블롯장치에 블록에이스와 방부제를 함유하는 블록액을 각 50μL 첨가하고, 다음에 미리 인간 IgE 항체 표품 50μL에 항인간 IgE 모노클로날항체를 비오틴화 시약으로 표지한 시약 5μL를 첨가하고, 5분간 37℃에서 가온 혼합한 액 50μL를 적가한다. 2분간 37℃에서 가온시킨 후 퍼옥시다아제로 표지한 항인간 IgE 모노클로날항체를 20μL 적가하여 37℃에서 2분간 가온시킨 후 0.5% 비이온 계면활성제(Tween-20)를 함유하는 완충화 생리식염수로 이루어진 세정액 80μL를 2회, 각각이 완전히 흡수된 후 적가하여 필터 고상 담체에 남은 과잉 표지 항체를 제거한다. 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘(TMBZ) 용액을 각각 40μL씩 첨가하여 37℃에서 반응시키고, 670㎚ 레이저광을 광원으로 하는 적분구 검출기로 고상 담체 표면의 청색 색조의 반사율(ΔK/S)을 측정한다. 측정시에는 블롯장치에액을 적가한 후 6분 이내에 효소반응의 최초속도의 측정을 완료하였다. 기질의 첨가시부터 a, b초 후의 반사율을 각각 (K/S)a, (K/S)b로 하면, 최초속도(ΔK/S)는 다음 식으로 표시된다.

ΔK/S=((K/S)b-(K/S)a) ×60/(b-a)

상기 본 발명의 측정방법에서 사용되는 고상과 비교하기 위해서, 미감작 유리섬유를 펀칭하여 쌓아올린 블롯장치를 이용하여 필터 상부로부터 실온에서 10mM 인산염-생리식염수 완충액(습윤액: pH7.4)을 첨가하고, 다음에 1∼100㎍/mL 항인간 IgE 모노클로날항체 용액(100mM 시트르산 완충액: pH3∼4 또는 10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4) 50μL를 첨가하고 10∼30분간 방치시킨 후, 블록에이스를 함유하는 블로킹제와 방부제를 함유하는 안정화제 혼합액을 첨가한다. 상기 블롯장치를 하룻동안 동결 건조시켜 항인간 IgE 모노클로날항체 고정화 고상을 제조한다. 이 고상 담체를 사용하고 측정 조작시에 희석액과 검체를 1:1로 혼합하며 검체로서 50μL를 사용하고, 상기 본 발명 방법과 동일하게 조작하여 인간 IgE 표품을 측정하여 측정값을 구한다(비교예 1).

측정 결과를 표 1에 나타낸다.

표준 인간 IgE 항체 농도의 감도 비교

검체	본 발명 방법(ΔK/S)	비교예 1(ΔK/S)	본 발명 방법/비교예
IgE 표준액(iu/mL)00.351.00	0.005520.028510.08816	0.006700.008190.02036	0.8234.843.3

표 1 결과에서 본 발명에 따른 측정법에서는 비교예에 비하여 30배∼40배 측정 감도가 높은 것이 확인되었다.

(3) 환자 혈청 내의 알러겐 특이적 IgE 측정

상기 (1)-2)에서 제조된 항비오틴 항체 고정화 고상을 장착한 블롯장치를 5개 ×3명 합계 15개 준비한다. 각각의 상부로부터 블록에이스를 함유하는 블로킹제와 방부제를 함유하는 블록액을 각 50μL 첨가하고, 다음에 비오틴화 하우스더스트2ㆍ알러겐액(H2), 비오틴화 코나효 진드기(Dermatophagoides farinae)ㆍ알러겐액(D2), 비오틴화 가모가야(학명: Dactylis glomerata L.) 꽃가루ㆍ알러겐액(G3), 비오틴화 부타쿠사(Ambrosia artemisiaefolia L. var. elatior(L.) Desc.) 꽃가루ㆍ알러겐액(W1), 비오틴화 알테르나리아(Alternaria)ㆍ알러겐액(M6) 각각 5μL에 환자 혈청을 50μL 첨가하고 37℃에서 5분간 가온시킨다.

이것들을 각각의 블롯장치에 50μL씩 첨가하고 37℃에서 2분간 가온시킨 후, 각각의 블롯장치에 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표지 항인간 IgE 마우스 모노클로날항체 용액을 각각 20μL씩 첨가하고 37℃에서 2분간 가온시킨다. 각각의 블롯장치를 0.5% Tween-20을 함유하는 완충화 생리식염수로 이루어진 세정액 80μL를 2회, 직전에 공급된 용액이 완전히 흡수된 후 공급하고, 필터 고상에 남은 과잉 표지 항체를 제거하고, 서양고추냉이 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘(TMBZ) 용액을 각각 40μL씩 첨가하고 37℃에서 반응시키고, 다음에 670㎚ 레이저광을 광원으로 하는 적분구 검출기로 고상 표면의 청색 색조의 반사율(ΔK/S)을 측정한다. 측정시에는 블롯장치에 액을 적가한 후 6분 이내에 효소 반응의 최초속도를 다 측정한다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

비교하기 위해서 각종 알러겐액(1∼5㎍/mL 농도)을 사용하며 더스트 필터와 흡수층을 조합한 블롯장치에 필터 상부로부터 실온에서 10mM 인산염-생리식염수 완충액(습윤액: pH7.4) 50㎛를 첨가하고, 다음에 1∼5㎍/mL 알러겐액 100mM 시트르산 완충액: pH3∼4 또는 10mM 인산염-생리식염수 완충액(습윤액: pH7.4) 100㎛을 첨가하고 10∼30분간 방치시킨 후, 블록에이스를 함유하는 블로킹제와 방부제를 함유하는 안정화제 혼합액 50μL를 첨가한다. 상기 블롯장치를 하룻동안 동결 건조시켜 알러겐 고정화 고상을 얻는다.

상기 고상을 사용하고 블록액을 첨가한 후 환자 혈청을 각 25μL에 희석액 25μL를 첨가 혼합한 후, 블롯장치에 50μL씩 첨가하고 37℃에서 2분간 가온시킨 후, 각각의 블롯장치에 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표지 항인간 IgE 항체 마우스 모노클로날항체 용액을 각각 20μL씩 첨가하고 37℃에서 2분간 가온시킨다. 각각의 블롯장치를 0.5% Tween-20을 함유하는 완충화 생리식염수로 이루어진 세정액 80μL를 2회, 직전에 공급된 용액이 완전히 흡수된 후 공급하여 필터 고상에 남은 과잉 표지 항체를 제거한다. 다음에, 서양고추냉이 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘(TMBZ) 용액을 각각 40μL씩 첨가하고 37℃에서 반응시킨다. 그 이후에 670㎚ 레이저광을 광원으로 하는 적분구 검출기로 고상 표면의 청색 색조의 반사율(ΔK/S)을 측정한다(비교예 2). 그 결과를 표 2에 나타낸다.

상기 결과에서 비교예의 측정 조작(비교예 2)에 비하여 본 발명에 따른 측정 조작에서는 측정 감도(즉, ΔK/S의 값)가 2배 이상이고, 비교예에 비하여 낮은 값(환자 C)이라도 본 발명 방법에서는 감도좋게 측정되어 판정하기 쉽다는 것을 알 수 있다.

[실시예 2]

(1) 물리적 고정화법에 의한 스트렙토아비딘 고정화 다공성 고상의 제조

1) 스트렙토아비딘 고정화 고상의 제조

글래스필터를 장착한 블롯장치에 실온에서 그 필터 상부로부터 습윤액을 첨가하고, 다음에 1∼1000㎍/mL 스트렙토아비딘 용액(100mM 시트르산 완충액: pH3∼4 또는 10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 10∼30분간 방치시킨 후, 블로킹제와 안정화제 혼합용액을 첨가한다. 하룻동안 동결 건조시켜 스트렙토아비딘 고정화 고상을 제조한다.

2) 항스트렙토아비딘 항체 염소 IgG에 스트렙토아비딘을 중층한 고상의 제조

글래스필터를 장착한 블롯장치에 실온에서 필터 상부로부터 습윤액을 첨가하고, 다음에 1∼100㎍/mL 항스트렙토아비딘 항체 염소 IgG 용액(100mM 시트르산 완충액: pH3∼4 또는 10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 10∼30분간 방치시킨 후, 1∼1000㎍/mL 스트렙토아비딘 용액 (10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 10∼30분간 방치시킨 후, 블로킹제와 안정화제 혼합용액을 첨가한다. 하룻동안 동결 건조시켜 중층 스트렙토아비딘 고정화 고상을 제조한다.

비교예로서 실시예 1에 기재된 비교예 2(알러겐을 직접 고상 상에 결합시킨 것)를 그대로 사용하며 상기 2)의 고상을 사용하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 환자 혈청의 알러겐 특이적 IgE를 측정한 경우에도, 실시예 1과 동일한 값을 얻을 수 있고, 감도로서 2배 정도의 고감도를 나타낸다. 즉, 고상을 스트렙토아비딘으로 바꿔도 동일한 효과를 얻을 수 있음이 확인되었다.

[실시예 3]

(1) 화학적 고정화법에 의한 항비오틴 항체 고정화 다공성 고상의 제조

직경 8㎜로 펀칭한 글래스필터를 2% 3-아미노프로필에톡시실란-아세톤 용액에 45℃에서 하룻동안 침지시킨 후, 아세톤으로 세정하여 건조시킨다. 다음에, 이것을 1% 글루탈알데히드(GA) 수용액에 실온에서 1시간 침지시킨 후, 0.25M 인산염완충액(pH7.4)을 사용하여 글루탈알데히드 냄새가 사라질 때까지 세정하여 글루탈알데히드 활성화 필터를 조제한다. 이것을 블롯장치에 장착하고 실온에서 필터 상부로부터 1∼100㎍/mL 항염소 항체 토끼 IgG 용액(10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 실온에서 10∼30분간 방치시킨 후, 1∼1000㎍/mL 항비오틴 항체 염소 IgG 용액(10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 실온에서 10∼30분간 방치시킨다. 이어서, 블로킹제와 안정화제 혼합용액을 위에서부터 첨가하고, 하룻동안 동결 건조시켜 중층 항비오틴 항체 고정화 고상을 제조한다.

상기에서 얻은 고상을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 검출 감도를 구한 결과, 실시예 1과 동일한 효과를 얻을 수 있음이 확인되었다.

[실시예 4]

(1) 중층 항비오틴 항체 고상을 사용한 환자 혈청 내의 알러겐 특이적 IgE 측정

샘플 컵을 8개 ×8명 합계 64개 준비하고, 각각에 비오틴화 교기시바(bermudagrass; 학명:Cynodon dactylon(L.) Pers.) 꽃가루ㆍ알러겐액(G2), 비오틴화 오오아와가에리(Phleum pratense) 꽃가루ㆍ알러겐액(G6), 비오틴화 아키노키린소우(golden rod; 학명:Solidago virga-aurea) 꽃가루ㆍ알러겐액(W12), 비오틴화 실라칸바(학명:Betula platyphylla var japonica Hara)꽃가루ㆍ알러겐액(T3), 비오틴화 페니실륨(M1)ㆍ알러겐액, 비오틴화 크래도스폴륨ㆍ알러겐액(M2), 비오틴화 피너츠ㆍ알러겐액(F13), 비오틴화 난황ㆍ알러겐액(F75)을 각각 5μL 분취하고, 여기에 환자 혈청을 각각 50μL씩 첨가하고 37℃에서 5분간 가온시킨다. 즉, 비오틴화 알러겐액 1용량에 대하여 피검시료액 10용량을 사용한다. 미리 블록액 50μL를 첨가하여 습윤시킨 실시예 1의 (1)-2)에서 제조된 블롯장치 각각의 필터 상부로부터 이들 반응혼합액을 각각 50μL 첨가하고 37℃에서 2분간 가온시킨다. 가온 후, 각각의 블롯장치 상부로부터 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표지 항체 인간 IgE 마우스 모노클로날항체 용액을 20μL씩 첨가하고 37℃에서 2분간 가온시킨다. 이어서, 각각의 블롯장치 상부로부터 세정액 100μL를 2회씩 첨가하여 과잉 표지 항체를 제거한 후, TMBZ 용액을 각각 40μL씩 첨가하여 37℃에서 반응시키고, 적분구 검출기로 고상 담체 표면의 청색의 반사율(ΔK/S)을 측정한다. 전체 반응시간은 10분동안 마친다. 미리 동일한 조작법으로 인간 IgE 항체 표품을 사용하여 제조된 검량선으로부터 8명 환자 혈청 내의 각각 8종류의 알러겐 특이적 IgE 항체 농도를 산출한다. 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3 결과에서 본 발명에 따른 측정방법에 따르면 각종 알러겐 특이적 IgE를 감도좋게 측정할 수 있음이 확인되었다.

[실시예 5]

(1) 알러겐 특이적 IgE 농도의 상관

항비오틴 항체 고정화 고상을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 5명의 환자에 대하여 28종류의 알러겐 특이적 IgE(H1:하우스더스트, H2:하우스더스트, D1: 야케효 진드기 (영문명;house dust mite, 학명:Dermatophagoides pteronyssinus(TROUESSART)), D2:코나효 진드기(Dermatophagoides farinae), E1:고양이 상피, E2:개 상피, E5:개 피부부스럼, G1:하루가야(학명: Anthoxanthum odoratum L.), G3:가모가야(학명: Dactylis glomerata L.),G6:오오아와가에리(Phleum pratense), W1:부타쿠사(Ambrosia artemisiaefolia L. var. elatior(L.) Desc.), W6:쑥, W12:아키노키린소우(golden rod; 학명:Solidago virga-aurea) , T17:삼, F1:난백, F2:우유, F4:소맥, F9:쌀, F11:메밀, F14:대두, F23:게, F24:새우, F75:난황, M1:페니실륨, M2:크래도스폴륨, M3:어스페르길루스(Aspergillus), M5:칸디다, M6:알테르나리아(Alternaria))를 측정한다. 시판되고 있는 팔마시아 업젼사의 알러겐 특이적 IgE 측정 시약(비교)을 사용하여 동일한 검체를 측정하여 본 발명의 측정방법(발명)과의 상관을 구한다. 결과를 표 4와 표 5에 나타낸다.

알러겐 점수는 표 6에 따라 분류된다.

IgE 단위와 알러겐 점수

IgE 단위(iu/mL)	알러겐 점수
0.34＜0.35∼0.70.7∼3.53.5∼17.517.5∼5050∼100100＞	0123456

표 4 및 표 5에 나타낸 비교용 시판되는 알러겐 특이적 IgE 측정시약을 사용한 경우와 본 발명 방법을 이용한 경우의 상관은 다음과 같다.

측정 총수 n=140, 알러겐 특이적 IgE 단위(iu/mL)에서는 Y=0.911X+1.769(r=0.9542), 알러겐 점수에서는 Y=0.978X-0.123(r=0.8668).

따라서, 두 측정법의 상관은 양호함이 확인되었다.

[실시예 6]

시료물질 용액과 리간드 결합체 용액을 혼합할 때의 용량비의 영향 검토

1) 시료물질 용액(표준 IgE 용액: 100iu/mL)과 리간드 결합체 용액(비오틴화 항인간 IgE 용액(LW)을 사용하고, 그 혼합비(용량비)의 측정 감도에 대한 영향을 실시예 1-1)에서 제조된 항비오틴 항체 염소 IgG 항체 고정화 고상 담체를 사용하여 동일한 방법으로 측정 조사한다. 그 측정과 결과를 표 7에 나타낸다.

표준 IgE액량/비오틴화 항인간 IgE액량(μL) 검토

	표준 IgE액량/비오틴화 항인간 IgE액량(μL)55/5 50/10 30/30 10/50
용량 비율측정 액량	11/150μL	5/150μL	1/150μL	1/550μL
ΔK/S	2.36552	2.35153	1.30979	0.30871
상대 감도	195	194	100	26

표 7 의 결과에서 시료물질 용액과 리간드 결합체 용액을 혼합할 때의 용량비의 측정 감도에 미치는 영향이 커서, 전자/후자의 비로 1/1 이상인 것이 바람직하고, 그리고 감도 상승은 약 5/1로 거의 포화상태가 됨을 알 수 있다.

2) 각종 시료물질 용액(알러겐 양성 혈청)과 이것에 대응하는 리간드 결합체 용액(비오틴화 알러겐 용액)을 사용하고 그 혼합비(용량비)의 측정감도에 대한 영향을 혼합비 5/1(혼합계 A)과 혼합비 1/1(혼합계 B)에 대해서 측정시의 샘플링량을 모두 50μL으로 하며 실시예 1-1)에서 만든 항비오틴 항체 염소 IgG 항체 고정화 고상을 사용하여 동일한 방법으로 측정 조사한다. 그 측정과 결과를 표 8에 나타낸다.

표 8 의 결과에서 알러겐 측정시에도 전처리된 섬유질 다공성 고상을 사용한 측정에서 미리 실행되는 알러겐 용액/비오틴화 알러겐 용액의 혼합비 증가가 감도의 명확한 향상을 가져옴을 알 수 있다.

3) 시료물질 용액(IgE 용액) 농도를 여러번 변경하여 IgE 용액(시료용액)과비오틴화 항인간 IgE액의 혼합비(용량비)의 측정 감도에 대한 영향을 혼합비 5/1(혼합계 A)과 혼합비 1/1(혼합계 B)에 대해서 측정시의 샘플링량을 모두 50μL으로 하여 상기 1)과 동일하게 실험한다(검량선의 제조). 그 결과를 표 9에 나타낸다.

검량선: IgE 용액의 농도를 변경한 감도 측정 결과(ΔK/S)

IgE 용액 농도	혼합계A(5/1)	혼합계B(1/1)	감도비(혼합계A/혼합계B)
0(iu/mL)1525100	0.000550.009570.103790.837632.55494	0.001330.004300.046800.386431.76600	0.412.232.222.171.45
평균값 2.02

표 9 의 결과에서 검량선의 감도도 시료물질 용액과 리간드 결합체 용액을 혼합할 때의 혼합비 증가에 따라 명확한 향상이 보임을 알 수 있다.

[실시예 7]

당쇄 항원이며 분자 상에 1종류의 항원이 다수 존재하는 CA19-9를 측정하는 경우에는, 실시예 1 방법에서는 감도 향상이 보이지 않기 때문에 3자를 동시에 반응시키는 방법에 대해서 실시한다.

실시예 3의 화학적 고정화법에 의한 항비오틴 항체 고정화 다공성 고상을 사용하여 블롯장치에 다공성 고상을 장착한다. 비오틴 표지 항인간 CA19-9 모노클로날항체 4㎍/mL, 15μL와 CA19-9 표준 각 농도 30μL, 그리고 퍼옥시다아제 표지 항CA19-9 모노클로날항체 30μL를 혼합하고 37℃에서 5분간 가온 유지하고, 블롯장치에 블록에이스를 함유하는 블로킹제와 방부제를 함유하는 블록액을 각 50μL 첨가하고, 다음에 미리 가온해 둔 시료 50μL를 적가하고 37℃에서 3∼4분 가온하고, 각각의 블롯장치를 0.5% Tween-20을 함유하는 완충화 생리식염수로 이루어진 세정액 80μL를 2회, 직전에 공급된 용액이 완전히 흡수된 후 공급하여 필터 고상에 남은 과잉 표지 항체를 제거한다.

이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘(TMBZ) 용액을 각각 40μL씩 첨가하고 37℃에서 반응시키고, 670㎚ 레이저광을 광원으로 하는 적분구 검출기로 고상 표면의 청색 색조의 반사율(ΔK/S)을 측정한다. 표준액의 측정값을 표 10에 나타낸다.

다음에, 비교예로서 처리되지 않은 글래스섬유필터를 장착한 블롯장치를 사용하여 필터 상부로부터 실온에서 10mM 인산염-생리식염수 완충액(습윤액: pH7.4)을 첨가하고, 이어서 100㎍/mL 항인간 CA19-9 모노클로날항체 용액(100mM 시트르산 완충액: pH3∼4 또는 10mM 인산염-생리식염수 완충액: pH7.4)을 첨가하고 10∼30분간 방치시킨 후, 블록에이스를 함유하는 블로킹제와 방부제를 함유하는 안정화제 혼합액을 첨가한다. 상기 블롯장치를 하룻동안 동결 건조시켜 항인간 CA19-9 모노클로날항체 고정화 고상을 제조한다. 이 고상을 비교예로서 사용한다. 측정방법은 희석액과 CA19-9 표준액을 1:1로 혼합하고 검체로서 50μL을 사용하여 본 발명 방법과 동일하게 조작하여 인간 CA19-9 표품을 측정하여 측정값을 구한다. 그 결과도 표 10에 나타낸다.

CA19-9 표준액 측정값

CA19-9 표준	본 발명 방법	비교예
0U/mL40U/mL160U/mL640U/mL	0.0110.5484.0628.822	0.0050.4562.0435.819

그 결과는 3자를 동시에 혼합한 것이 감도적으로 높은 것을 나타내고 있다.

본 발명의 생리활성물질의 존재량이나 감도의 측정방법에 따르면, 면역학적 측정법을 이용하여 측정대상물질에 따른 각각의 고상을 조제ㆍ설치하지 않고 단일 리간드 포착제 고정화 고상을 사용하여 다종류의 측정대상물질을 간편, 신속, 고감도 그리고 고정밀도로 측정할 수 있다.

Claims

생리활성을 갖는 측정시료물질을 함유하는 시료용액과 이 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체를 함유하는 용액을, 이들 용액의 용량비가 1:1∼20:1이 되도록 접촉시켜 리간드에 결합된 생리활성물질과 측정시료물질의 복합체를 용액 내에서 형성하는 공정; 이 복합체를 함유하는 용액을 상기 리간드 포착제가 결합된 다공성 필터 표면에 적가하여 이 복합체의 리간드 부분을 이 리간드 포착제에 결합시키는 공정; 이 다공성 필터 표면에, 상기 측정시료물질에 특이적으로 결합하는, 효소로 표지된 제2생리활성물질 용액을 적가하여 이 효소 표지를 갖는 제2생리활성물질을, 리간드 포착제와 리간드 부분을 통해 다공성 필터에 결합되어 있는 제1생리활성물질과 측정시료물질의 복합체에 결합시키는 공정; 다공성 필터를 세정함으로써 결합되지 않은 효소 표지 제2생리활성물질을 제거하는 공정; 그리고 다공성 필터에 결합된 효소의 활성을 측정하는 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공성 필터를 이용하는 생리활성을 갖는 시료물질의 측정방법.
생리활성을 갖는 측정시료물질을 함유하는 시료용액, 이 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체를 함유하는 용액, 그리고 이 측정시료물질에 특이적으로 결합하는, 효소로 표지된 제2생리활성물질을 함유하는 용액을, 이 시료용액과 이 결합체용액의 용량비가 1:1∼20:1이 되도록 접촉시켜 리간드에 결합된 제1생리활성물질과 측정시료물질과 효소 표지 제2생리활성물질로 이루어진 복합체를 용액 내에서 형성하는 공정; 이 복합체를 함유하는 용액을 상기 리간드 포착제가 결합된 다공성 필터 표면에 적가하여 이 복합체의 리간드 부분을 이 리간드 포착제에 결합시키는 공정; 다공성 필터를 세정함으로써 결합되지 않은 효소 표지 생리활성물질을 제거하는 공정; 그리고 다공성 필터에 결합된 효소 활성을 측정하는 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공성 필터를 이용하는 생리활성을 갖는 시료물질의 측정방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 다공성 필터로서 섬유질 다공성 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 시료물질의 측정방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 시료용액과 측정시료물질에 특이적으로 결합하는 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체를 함유하는 용액을, 이들 용액의 용량비가 2:1∼10:1로 되는 양으로 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시료물질의 측정방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드로서 비오틴을 사용하는 것을 특징으로 하는 시료물질의 측정방법.
제 5 항에 있어서, 리간드 포착제로서 항비오틴 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 시료물질의 측정방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1생리활성물질에 리간드가 결합된 결합체로서 비오틴화 알러겐을 사용하는 것을 특징으로 하는 시료물질의 측정방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 포착제가 스페이서를 통해 결합되어 있는 섬유질 다공성 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 시료물질의 측정방법.