TWI247804B - Sphingolipid ceramide deacylase gene - Google Patents

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1247804 A7 B7 五、發明説明（5 ) 有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽的編碼核 酸： ‘ (A) 具有序列編號：20所示之胺基酸序列或其一部分之聚 胜肽的編碼核酸； (B) 具有序列編號：20所示之胺基酸序列中，至少具有i 個胺基酸殘基的缺失、附加、插入或取代之胺基酸序列所 構成之聚胜肽的編碼核酸； (C) 具有與序列編號：20所示之胺基酸序列至少25%序列 相同性之聚胜肽的編碼核酸； (D) 具有序列編號：19所示之鹼基序列或其一部分之核 酸； (E) 具有序列編號：19所示之驗基序列中，至少具有1個 鹼基的缺失、附加、插入或取代之鹼基序列的核酸； (F) 與前述（A)〜(E)任一者中所記載之核酸或其互補鏈，可 在嚴苛條件下進行雜合之核酸； (G) 具有與前述（A)〜(F)任一者中所記載之核酸，係因退化 (degenerate)而有所不同之驗基序列的核酸；以及 (H) 具有與前述（A)〜(G)任一者中所記載之核酸的驗基序 列，係至少17%序列相同性之鹼基序列的核酸； [3] 含有前述[2]記載之核酸的重組DNA ; [4] 保有前述[2]記載之核酸或前述[3]記載之重組DNA的轉 形體； [5] 具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽的 製造方法，其特徵係將前述[4]記載之轉形體，於鞘脂質神 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 物的體表或硝化管等）懸浮於滅菌之生理食鹽水中。將含有 0.01%神經醯胺、〇·〇5% NH4Cn、0.05% Κ2ΗΡ〇4、〇·1%酵母 萃取物、2.0% Naa、0.01% TDC(牛磺脫氧膽酸鈉）、ρΗ 7 〇 之液體培養基400 # 1加入艾平道夫氏管中，再以前述之懸 浮液10# 1接種，於25。(：下震盪培養4日。其後，以上述之 方法進行酵素活性之測定，並選擇具有活性之培養液。將 所選擇之培養液以滅菌生理食鹽水加以稀釋，所得到之稀 釋物則塗布於平板培養基中。塗布後之平板培養基於251 下培養2曰，使其形成菌落。重複此流程直至形成單一菌落 為止。如此，就可由樣品中分離出可生產鞘脂質神經醯胺 脫乙酿基轉移酶之Shewanella alga G8株。 又，前述之Shewanella alga G8株，其係保存於九州大學 研究所農學研究科，生物機能科學部門之伊東研究室中， 可依據需要而進行分讓。 本發明之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶，例如有具有 序列表之序列編號：1所示之胺基酸序列或其一部分的聚胜 肽等，理想者，係具有該序列編號：1的C末端區域為缺失 之胺基酸序列（胺基酸編號：1〜677)或其一部分的聚胜肽 等。具體言之，如具有序列表之序列編號：20所示之胺基 酸或其一部分的聚胜肽。在此，前述由序列編號：20所示 之胺基酸序列構成的聚胜肽，其係前述序列編號··丨所示之 胺基酸序列構成的聚胜肽中，C末端係缺失之聚胜肽，且具 有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性。 亦即，本發明之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶，其例 -12· 1247804 A7 _____ B7 五、發明説明（10 ) 如有具有（a>序列編號：1或20所示之胺基酸序列（具有在天 然型之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶的C末端區域係缺失 之胺基酸序列的聚胜肽）或其一部分之聚胜肽。 在此，「具有序列編號：1或20所示之胺基酸序列的一部 分之聚胜肽（亦稱為「部分胜肽」）」，其只要是根據前述活 性測定方法測定其活性，並確認係與具有序列編號：1或2〇 所示之胺基酸序列的聚胜肽，為相同之鞘脂質神經醯胺脫 乙醢基轉移酶活性者即可。 前述之部分胜肽，具體而言，可依據習用之遺傳工程方 法，使包含具有序列編號· 1或2 0所示之胺基酸序列中任意 部分的聚胜肽，加以表現，然後，關於該聚胜肽，再依據 前述活性測定方法，來測定鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移 酶活性，最後基於該活性，選擇具活性之聚胜肽，就可以 得到。使此種部分胜肽表現之方法，例如可在序列編號：1 或20所示之胺基酸序列的編碼核酸（如序列編號：2或19)之 任意位置中，導入中止密碼，而使其表現之方法；以及利 用限制酵素等，將對應於期望之部分胜肽的區域切下，導 入適當之表現載體中，再使其表現之方法等。 又，以前述活性測定方法測定活性，只要是與具有序列 編號：1或20所示之胺基酸序列的聚胜肽，係具有相同的销 脂質神經酿胺脫乙醜基轉移酶活性，且（b)在序列編號：1或 20所示之胺基酸序列中，係由具有至少1個胺基酸殘基之缺 失、附加、插入或取代之胺基酸序列所構成的聚胜肽者， 亦包含於本發明之範圍中。 •13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公楚^ " 1247804 A7 B7

前述「變異」，其只要是具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基 轉移酶活性之變異者，亦可為2個以上之變異。在此，，具 有變異之胺基酸序列」，乃指包括導入有天然而來之變異 以及人工變異之胺基酸序列。又，所謂「至少丨個」係包含 1個或數個、或其以上者。 前述「變異」，可使用後述的本發明之核酸，具體來 說’即具有序列編號：1或20之胺基酸序列的編碼核酸，並 根據後述之隨機變異導入法、部位特異性變異導入法等， 使其發生。 進一步，根據前述活性測定方法來測定活性，只要是與 具有序列編號：20所示之胺基酸序列的聚胜肽，係具有相 同的鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性，且（〇與序列編 號：20所示之胺基酸序列係具有至少25%，理想為30%以 上，更理想為35%以上之序列相同性的聚胜肽，亦包含於本 發明之範圍中。 又，前述（c)之聚胜肽，若與序列編號：1所示之胺基酸序 列相比較時，係具有至少25%，理想為30%以上，更理想為 35%以上之序列相同性。 又，本說明書中，所謂的「序列相同性」，係指2個聚合 性分子，具體言之，係指2個聚核甞酸間或2個聚胜肽間， 其殘基之序列類似性而言。前述「序列相同性」，係針對 作為比較對象之胺基酸序列或鹼基序列的區域，再比較於 最佳狀態下所排列之2個胺基酸序列或鹼基序列而決定者。 在此，作為比較對象之聚核甞酸或聚胜肽，其在用於比較2 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（12 ) 個排列為最-適當之參考序列（例如，共有（Consensus)序列） 時，亦可為附加或缺失（例如，溝（gap) '過懸（overhang)等） 者。 序列相同性的數值（百分比），其計算係以決定兩方序列中 所存在之同一核酸鹼基，來決定其合適部位之數目，然 後，以作為比較對象之序列區域内的鹼基總數，求出前述 合適部位之數目所佔的比率，最後將所得到之數值乘以1〇〇 便可以得到。用於得到最佳排列及相同性之計算方式，例 如有史密斯（Smith)等人的局部相同性計算方式[Add· APL. Math.，第2卷，第482頁（1981)]、尼德曼（Needleman)等人的 相同性排列計算方式[(Journal of Molecular Biology)，第 48 卷，第443頁（1970)]，皮爾森（Pearson)等人的相同性檢索法 [(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA)，第85卷，第2444頁（1988)]。更具體言之，有動力計 算（dynamic programing)法、縫隙罰責（gap penalty)法、 Smith-Waterman 計算方式、Good-Kanehisa 計算方式、 BLAST計算方式、FASTA計算方式。 聚胜肽間之序列相同性，可使用BLASTP、FASTA等進行 測定。又，核酸間之序列相同性，例如可使用序列解析軟 體，具體言之，係使用BLASTN、FASTA等加以測定。前述 之 BLASTP 及 BLASTN ， 可在首 頁網址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中，而 FASTA則在首頁 網址http://www.ddbi.nig.ac.jp中，一般人皆可加以利用。 又，本發明中，亦包含了聚胜肽，其與序列編號：20所 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

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線 1247804 A7 B7 五、發明説明（13 ) 示之胺基酸序列間為至少25%、理想為30%以上、更理想為 35%以上之序列相同性者。 進一步，本發明中，亦包含了聚胜肽，其與序列編號：1 所示之胺基酸序列間為至少25%、理想為30%以上、更理想 為35%以上之序列相同性者。 具有前述序列相同性之聚胜肽，其亦可為在鞘脂質神經 醯胺脫乙醯基轉移酶的胺基酸序列中，具有保存性取代之 聚胜肽。前述「保存性取代」，係包含與具有類似性質（亦 即厭水性、電荷、pK、立體構造上之特徵）的胺基酸間之取 代；以及與只能維持原本聚胜肽的生理活性程度之該聚胜 肽的立體構造及摺疊構造，而將該構造加以改變所得到的 胺基酸間之取代。保存性取代，例如有下述①甘胺酸、丙 胺酸；②纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；③天冬氨酸、麩胺 酸、天冬氨酸、麵醯胺酸；④絲胺酸、蘇氨酸；⑤離胺酸、 精胺酸；⑥苯丙胺酸、酪胺酸之群組内的取代。 前述「序列相同性」，可依據序列解析軟體，例如 BLAST[(Journal of Molecular Biology)，第 215 卷，第 403-410 頁（1990)] ，FASTA[(Proceedings of the National

Academy of Sciences of the USA)，第 85 卷，第 2444-2448 頁 (1988)]等，來加以決定。 本發明之核酸，係具有前述鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉 移酶活性之聚胜肽的編碼核酸，亦即針對具有鞘脂質神經 醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽的胺基酸序列，而為具 有編碼該序列之鹼基序列的核酸。舉例來說，由Shewanella -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（14 ) alga G8株而_來之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶的編碼核 酸，其舉例來說，有（A)具有序列編號·· 1或20所示之胺基 酸序列或其一部分的聚胜肽之編碼核酸； (B) 在序列編號：1或20所示之胺基酸序列中，具有至少1 個胺基酸殘基為缺失、附加、插入或取代之胺基酸序列構 成的聚胜肽之編碼核酸； (C) 與序列編號：1或20所示之胺基酸序列，為具有至少 25%序列相同性之聚胜肽的編碼核酸； (D) 具有序列編號：2或19所示之鹼基序列或其一部分的 核酸。 具有前述序列編號：20所示之胺基酸序列的聚胜肽之編 碼核酸，以及具有序列編號：19所示之鹼基序列的核酸， 舉例來說，係對應於具有序列編號：2所示之鹼基序列的核 酸中，該鹼基編號：1〜2031的鹼基序列。 又，具有前述序列編號：2所示之鹼基序列的核酸，其可 由保持該核酸之質體PSCD44所加以轉形之大腸菌 JM109[Escherichia coli JM109/pSE5]來獲得。此「序列編 號：2所示之鹼基序列的核酸，其可由保持該核酸之質體 pSCD44戶斤力口以轉形之大腸菌JM109」，係以Escherichia coli JM109/pSE5命名並表示，而於2001年9月24曰，寄存於 台灣新竹市食品路331號之食品工業發展研究所，寄存編號 為 CCRC 940378 〇 本發明中，根據前述活性測定方法來測定活性，若確認 係與序列編號：1或20所示之胺基酸序列的聚胜肽具有相同 -17· 本纸琅尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1247804 A7 B7 五、發明説明（15 ) 之鞘脂質神··經醯胺脫乙醯基轉移酶活性，且（E)在序列編 號：2或19所示之鹼基序列中，係具有至少1個鹼基為缺 失、附加、插入或取代之鹼基序列的核酸者，亦包含於本 發明之核酸中。前述（E)之核酸，其理想者為在序列編號： 2或19所示之鹼基序列中，轉譯成胺基酸鹼基序列的形式 下，係具有至少1個驗基為缺失、附加、插入或取代之驗基 序列的核酸者。 在此，所謂的「具有取代、缺失、附加或插入之鹼基序 列」，係包含導入有天然而來的變異以及人工變異之驗基 序列。又，所謂的「至少1個」，係意指1個或多個，或其 以上者。前述「變異」，可使用後述之隨機變異導入法、 部位特異性變異導入法等，來加以產生。 又，所謂的「轉譯成胺基酸鹼基序列的形式」，係指由 於缺失、附加或插入，使本來的開放閱讀架構（open reading frame)移動，或使維持本來具有之鞘脂質神經醯胺脫乙酿基 轉移酶活性的架構有所移動之意。 又，根據前述活性測定方法來測定活性，若確認係盘序 列編號：1或20所示之胺基酸序列的聚胜肽具有相同之銷脂 質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性，且（F)與前述（A)〜（E)任一 者中所§己載之核酸或其互補鍵’可在嚴苛條件下進行雜合 之核酸，亦包含於本發明之核酸中。 前述雜合反應中，可使用前述（A)〜(E)任一者中所記載之 核酸或其互補鍵的全部或一部分，來作為探針。在此，該 「前述（A)〜(E)任一者中所記載之核酸或其互補鏈的一部 -18- I紙張尺度適財S S家標準(CNS) A4規格(21QX 29?公I) ----- 1247804 A7 B7 五、發明説明（26 ) 經醯胺脫乙酿基轉移酶的編碼基因之全鹼基序列，係表示 於序列編號：15中。又，由該序列所推定之鞘脂質神經醯 胺脫乙醯基轉移酶的胺基酸序列，則表示於序列編號：14 中。進一步，將此胺基酸序列，與序列編號：7所示之由 Shewanella alga G8株而來的鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移 酶的N末端胺基酸序列相比較時，確認了該菌株所生產之朝 脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶，在轉譯後已被轉換成其N末 端之第38個胺基酸所構成之聚胜肽被除去的成熟型酵素。 此成熟型鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶之胺基酸序列係 表示於序列編號：1中，又上述之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基 轉移酶基因的鹼基序列中，成熟型之鞘脂質神經醯胺脫乙 醯基轉移酶的編碼基因序列，則表示於序列編號·· 2中。 又，前述由Shewanella alga G8株而來的鞘脂質神經醯胺脫 乙醯基轉移酶的胺基酸序列及其編碼之鹼基序列，由於與 習知之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶的胺基酸序列及鹼 基序列，被觀察俾具有統計上有意義之相同性之故，前述 由Shewanella alga G8株而來的酵素，就顯示應係屬於新穎 群組的鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶。 進一步，由前述序列編號：1所示之胺基酸序列，所得到 之在C末端方面有277個胺基酸缺失之聚胜肽（C末端缺失之 聚胜肽），其亦具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性。 前述C末端缺失之聚胜肽的胺基酸序列係表示於序列編號： 20中，而鹼基序列則表示於序列編號：19中。 如此，在本發明中，由於鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）

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線 1247804 A7 B7 五、發明説明（29 ) 載體，具體言之，係由保有本發明之核酸或本發明之重組 DNA的載體所構成。前述載體，例如有核醣體、HVJ-核醣 體、葡聚糖、磷酸鈣、金粒子等。 又，本發明之核酸或本發明之重組DNA或本發明之細胞 導入用載體，亦可導入適當之宿主而製作轉形體。前述轉 形體，係保有本發明之核酸或本發明之重組DNA的轉形 體，亦係包含於本發明中。 所使用之宿主，舉例來說，除有細菌（例如Escherichia coli K-12系統之HB101株、C600株、JM109株等）、酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae等）、絲狀菌等微生物之外，尚有 哺乳動物的培養細胞（L、3T3、FM3A、CHO、COS、 Vero、Hela等）、植物培養細胞、昆蟲培養細胞（sf9等）等。 又，重組DNA導入宿主之方法，可使用習知之導入方 法，舉例來說，有磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、電脈衝法 等。 利用前述轉形體，可提供具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基 轉移酶活性之聚胜肽的製造方法。這種具有鞘脂質神經醯 胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽的製造方法亦包含於本發 明之中。 具有本發明之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚 胜肽的製造方法，其一個大特徵係包含下述步驟，亦即可 於適合鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶表現之情形下，將 前述轉形體加以培養，再由所得到之培養物，採取具有鞘 脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽。其中，特別 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（4Q ) 並選擇具有活性之培養液。 以NBD-GM1作為基質，測定前述培養液之SCDase活性。 NBD-GM1係將神經醯胺的脂肪酸部分以NBD(7-硝基苯_2-草酸-1，3-二唑-4-基）標定之GM1，並係根據（J〇urnal 〇f Biochemistry)’ 第 126卷，第 604-611頁（1999)所記載之方法 加以製作。 又，在此，活性測定係以下述方法進行。亦即，在含有 0.1% TritonX-100 及 NBD-GM1 100 pmol 之 50 mM 醋酸緩衝 液（pH 6.0)10//1中，加入酵素液10#1，於37 °C下以特定時 間進行孵育。其後，在100°C下煮沸5分鐘使反應停止，使 用「快速貝康紙」，讓反應液完全乾燥。加入15/zl的氣仿/ 甲醇=2 : l(v/v)，以超音波使反應生成物溶解。所得到之 溶解物再點潰於石夕凝膠TLC盤。將其以氣仿/甲醇/〇 2% CaCl2 (5/4/1，v/v)展開之後，分解率使用島津色層分析儀 CS-9300進行測定（吸光度475 nm)。進一步，根據「分解率 (%)=[游離之溶解GM1面積X 100] / [游離之溶解GM1面積 +未反應之GM1面積]」之式子計算而得到分解率。其1單 位（U)，並被定義為1分鐘内可將1 β mol的NBD-GM1分解之 酵素量。 將上述所選擇之培養液以滅菌生理食鹽水加以稀釋，所 得到之稀釋物塗布於平板培養基中。將塗布後之平板培養 基於25°C下培養2曰，使其形成菌落。重複此一程序直至單 一菌落形成為止，其結果，發現由長崎縣小長井町的海砂 所採取之試料中，分離出可生產鞘脂質神經醯胺脫乙醯基 -43- 本紙張\度適用中國國家標準(CNS) A4^(2l〇X 297公董)-----------Γ 一 1247804 A7 B7 五、發明説明（42 ) 下保溫1小時。進一步，保溫後在所得到之溶液中，加入10 之20毫克/毫升的蛋白酶K溶液、200 /z 1之5 M NaCl、400 /z 1之10% SDS，藉由37°C下保溫一小時，使其發生反應。 反應後，待所得到之溶液回復至室溫，進行苯酚-氣仿處 理。重複此操作2次，在所得到之水層中加入等量之異丙醇 及1/10容量之3 Μ醋酸鈉，於_20 °C冷卻1小時之後，以 10000 rpm離心分離10分鐘，所得到之沉澱再以70%乙醇潤 溼並溶解於TE緩衝液後，以其作為基因組DNA溶液。由此 步驟，得到1.1毫克之基因組DNA。 (2)鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶之部分胺基酸序列的 決定 純化Shewanella alga G8株所生產之鞘脂質神經酿胺脫乙 醢基轉移酶。將Shewanella alga G8株於含有0.5%聚蛋白 腺、0.1%酵母萃取物、2% NaCl、0.1%牛腦丙酮粉末之 中，以25°C培養22小時。培養終了後，以8,300 rpm將培養 液離心分離30分鐘，而得到4.6升之培養上清液。此培養上 清液中之SCDase活性，係55.5單位（U)。又，SCDase活性之 1單位（U)，係被定義為1分鐘内將1/zmol之GM1分解的酵素 量。 關於所得到之培養上清液，以米尼坦·伍特過濾系統（密 立•波爾公司製），使用分子量10,000篩之限外過濾膜，濃 縮至1升為止，並供注至普契特約魯650 Μ之管柱色層分析 (全容積80毫升）中。在事先以含有2 Μ氣化鈉之20 mM Tris-HC1緩衝液（pH 7.5)平衡過之管柱中，將濃縮過之培養上清 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7

以序列編號：2所示之鹼基序列為基礎，製作寡核苷酸探 針及引子，而構築成下述具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基^ 移酶活性之聚胜肽的編碼核酸檢測用之套組。 土 在本套組中，針對鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶具特 異性之區域，而可進行增幅的引子組、DNA聚合酶、PCR 用緩衝液、dNTP混合物，皆包含於其中。 又’針對增幅後所進行之雜合反應的增幅區域具特異性 之探針，若有需要時亦可包含於套組中。 舉例來說，可製作如下之套組。 套組之構成（進行PCR 1〇〇次之份量） SS1 (20 pmol/β 1) 110/z 1 SS2a (20 pmol/以 1) 110// 1 SS2b (20 pmol//z 1) 110//1 SAla (20 pmol/β 1) 110^ 1 SAlb (20 pmol/ β 1) 110 e 1 SA3 (20 pmol/ β 1) ΙΙΟ^ζ 1 l〇xPCR緩衝液 1 ml 寶酒造Taq (5U//Z 1) 50 β 1 dNTP混合物（各2·5 mM) 1.28 // 1 實施例6 具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜 肽的檢測用套組的構築 將具有序列編號：1所示之胺基酸序列的聚胜肽作為抗 原，使山羊、兔子、大鼠、老鼠等免疫，而製作抗鞘脂質 -53 - 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（51 ) 神經醯胺脫乙醯基轉移酶之抗體，並構築成下述具有鞘脂 質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽的檢測用套組。 本套組係三明治型EIA用套組，其包含塗覆有抗SCDase 單株抗體之96井盤、過氧化酶標誌抗SCDase單株抗體、標 準品、稀釋液、基質液（TMBZ : 3，3，，5，5，-四甲聯苯胺）以 及反應停止液（1 N硫酸）。 舉例來說，可製作如下之套組。 套組之構成（進行96次之份量） 1片 11 ml用X 1管 I ml用X 1管 II mix 1 管 12 mix 1 管 12 mix 1 管 抗SCDase單株抗體盤 96井（8井X 12列） 過氧化酶標誌抗SCDase單株抗體 (冷凍乾燥品） 標準品（冷凍乾燥品） 稀釋液 基質液（TMBZ) 反應停止液（1 N硫酸） 實施例7 C末端缺失之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶聚 胜肽的表現質體之構築 鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶之C末端缺失體，其表現 質體，係根據下述操作進行構築。 以由純化酵素所推定胜肽序列而確認之N末端開始的 75 kDa部分，亦即對應於c末端側（ERAEAH)之部分的鹼基 序列，作為基礎，而合成引子LSCD2125(序列編號：18)。 -54 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱〉 1247804 A7 B7 五、發明説明（53~) 為0· 1 mM，進一步，於25 °C下震盪培養1小時。培養結束 後，將培養液離心分離，回收菌體，再懸浮於含有〇. 1 % Triton X-100、150 mM NaCl、1 mM 苯甲烷績醯 I 化物 (PMSF)、5 // g/ml胃蛋白酶抑制素、5 /z g/ml凝乳酶抑制素 及5/zg/ml亮肽素之50毫升10 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH 7.5) 中。其後，將所得到之懸浮物，於-80°C冷凍之後，再溶解 而使菌體破壞。所得到之破碎液再離心分離，採取上清 液，而作為粗酵素液。 此粗酵素液的SCDase活性測定，係以下述方法進行。亦 即，在10//1 之基質溶液[10 nmol、GMla、5 mM MgCh、5 mM MnCl2、5 mM CaCl2、0.2% Triton X-100、200 mM NaCh 50 mM醋酸緩衝液（pH 5.5)]中，加入10/zl之粗酵素 液，於37 °C下孵育30分鐘，再使粗酵素液與基質進行反 應。其後，在l〇〇°C下煮沸5分鐘，使反應停止《所得到之 反應物以離心濃縮機進行濃縮乾固。在所得到之產物上， 添加10 A 1之氣仿/甲醇（2 : 1，v/v)，再將所得到之混合物進 行超音波處理，並溶解其反應產物。將所得到之反應產 物，以矽凝膠TLC盤加以點潰。將其以氣仿/曱醇/0.02% CaCl2 (5/4/1，v/v/v)展開之後，再以苔黑酚硫酸法，使石夕凝 膠TLC盤上之糖脂質產生顏色。關於產生顏色後之矽凝勝 TLC盤，使用TLC色層掃描儀（島津製作所公司製）測定吸光 度（波長：540 nm)，並根據下式來測定分解率。 分解率（％)=([游離之溶解GMla面積]/ [游離之溶解GMla 面積+未反應之GMla面積])x 100 -56- 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1247804 A7 B7 五、發明説明（54 ) 在此，SCDase之1單位（U)，係被定義為1分鐘内可將1 // mol 的GMla分解之酵素量。 以上述方法測定活性時，保有本發明之鞘脂質神經醯胺 脫乙醯基轉移酶C末端缺失體之編碼基因的大腸菌 Escherichia coli BL21(DE3)pLysE/pETSCD-del，顯示每 1升 培養液可生產872U之鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶C末 端缺失體。 再以下述方法，可得到SCDase純化標準品。 亦即，在事先以含有0.1% Triton X-100及150 mM氯化鈉 之1〇111%丁1^-11(：1緩衝液（？117.5)平衡過之出1[^?(：1^1&^1^ 管柱（亞馬孫•法瑪西亞•生技公司製）中，將前述粗酵素液 負荷於其中。然後，以含有20 mM咪唑的10 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7·5)，將夾雜於其中之蛋白質溶離。其後，又以 含有含有50 mM咪唑的10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)，使 SCDase溶離，並回收活性劃分（1)。 收集活性劃分（1)，並對含有0.1% Triton X-100之10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)，進行透析。在事先以含有0.1% Triton X-100 之 10 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5)平衡過之 HiTrap Q管柱（亞馬孫•法瑪西亞•生技公司製）中，將前述 透析液負荷於其中。然後，以含有0.1% Triton X-100及1M 氯化鈉的10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)，使SCDase溶離， 並回收活性劃分（2卜 在事先以含有0.1% Triton X-100及150 mM氣化鈉之10 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5)平衡過之 HiLoad Superdex -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1247804 A7

2〇〇Pg管柱（亞馬孫•法瑪西亞•生技公司製）中，將上述活 性劃分（2)負荷於其中。回收沒有吸著於管柱而通過之活性 劃分（3卜 在事先以含有0.1% Triton X-100之1〇 mM Tris-HCl緩衝液 (pH7,5)平衡過之HiTrapQ管柱（亞馬孫·法瑪西亞·生技公 司製）中，將上述活性劃分（3)負荷於其中。然後，以含有

0.1% Triton X-100及 1M氣化鈉之 10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7·5)，使SCDase溶離，並回收活性劃分（4)。將回收之活性 劃分（4)作為酵素純化標準品。 所得到之酵素純化標準品，係於SDS-PAGE中顯示單一之 色帶。其總蛋白質量為39.3毫克，總活性則為5258U。 序列表自由主交 序列編號：8所示之序列，係表示用以增幅鞘脂質神經醯 胺脫乙醯基轉移酶基因的引子之序列<> 序列編號：9所示之序列，係表示用以增幅鞘脂質神經醯 胺脫乙醯基轉移酶基因的引子之序列》 序列編號：10所示之序列，係表示用以增幅鞘脂質神經 醯胺脫乙醯基轉移酶基因的引子之序列。 序列編號：11所示之序列，係表示用以增幅鞘脂質神經 醯胺脫乙醯基轉移酶基因的引子之序列。 序列編號：12所示之序列，係表示用以增幅鞘脂質神經 醯胺脫乙醯基轉移酶基因的引子之序列。 序列編號：13所示之序列，係表示用以增幅鞘脂質神經 醯胺脫乙醯基轉移酶基因的引子之序列。 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇 x 297公爱) 1247804 A7 B7 五、發明説明（58 ) 序列表 〈110>寶酒造株式會社 〈120>鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶基因

<130> 01-060TW <150〉 JP 2000-293181 <151> 2000-09-26 <160〉 20 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 954 <212> PRT <213> Shewanella alga <400〉 1

Thr Thr Gin Ala Val Asp Ser Leu Ala Gin Gin Cys Phe He lie Gin 1 5 10 15

Ser Pro Thr Asn Gly Gin Tyr Leu His Arg Phe His Gin Gly Gly Thr 20 25 30

Val Asp Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Asp Asn lie Ser Gin Ala Glu -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（ 59 ) 35 40 45 Ala Ser Ala Phe Tyr Phe Lys Pro Ser Arg Arg Gly His Phe Met Met 50 55 60 Thr Asp Ala Asp Gly Arg Phe Phe Ala Ser His Leu Pro Ala Glu Val 65 70 75 80 Ser Ala Gly Arg Tyr Pro Gly Glu Phe Ala Glu Trp Arg Val Asp Ala 85 90 95 Clu Thr Ala Pro Ser Gly Giu Phe Ser Tyr Arg Phe His Ala Val Gly 100 105 110 Leu Asn Leu Gly Leu Arg His Asn Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Tyr Phe 115 120 125 Phe Asp Leu Leu Asn Pro Gly Asn Asn Thr Ser Glu Ala Ser Phe Lys 130 135 140 Leu Val Ala Ser Asp Ala Cys Ser Ala Phe Pro Glu Val Glu Val Asn 145 150 155 160 Ala Ser Gly Asp Phe Ser Ala Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu Pro Val 165 170 175 Arg Gly Leu Val Asp Ala His Thr His He Thr Ser Tyr Glu Phe Met 180 185 190 Gly Gly Lys Met Met His Gly Lys Pro Phe His Arg Trp Gly Val Thr 195 200 205 Gin Ala Leu Asn Asp Ser Ala Val lie His Gly Pro Asn Gly Ser Leu 210 215 220 Asp Leu lie Gly Asn Leu Tyr Ser Phe Asn Asp Ala Asn Phe Arg Tyr 225 230 235 240 Asp Thr Arg Gly Trp Pro Asp Phe Pro Trp Trp Pro Asn His Glu Gin 62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（ 60 ) 245 250 255 Met Thr His Ser Gly Tyr Tyr Tyr Lys Trp He Glu Arg Ala Trp Leu 260 265 270 Gly Gly Leu Arg Leu Met Val Thr His Leu Val Glu Asn Glu Val Leu 275 280 285 Cys Asn Ala Gin Lys Thr He Asn Pro Ala Ser Trp Val Asn Pro Asn 290 295 300 Asp Cys Asn Thr Met Asn Ser He Gin Leu Gin He Asn Arg Leu Lys 305 310 315 320 Gin Met Gin Glu Tyr He Asp Val Gin Ser Gly Gly Pro Gly Lys Gly 325 330 335 Phe Phe Arg Leu Val Ser Ser Pro Gin Glu Ala Arg Glu Val lie Ala 340 345 350 Asp Gly Lys Leu Ala Val Leu Met Gly He Glu Ala Ser Glu Leu Phe 355 360 365 Asn Cys Gly He Lys Asp Asp Cys Asn Arg Arg Gin lie Glu Glu Gin 370 375 380 Leu Gin Gin Val Tyr Ala Lys Gly Val Arg lie Leu Phe Pro Thr His 385 390 395 400 Lys Phe Asp Asn Gin Leu Gly Gly Ser Val Val Glu Asp Gly Phe He 405 410 415 Asn lie Gly Glu Val Leu Ala Thr Gly His Phe Phe Glu Thr Gin Ala 420 425 430 Cys Asp Ala Asp Thr Gin Gly Arg Pro Phe Lys Ser Gly Phe Pro lie 435 440 445 Leu Gly Glu He Pro Val Leu Lys Asp He Leu Asn Ala Val Gly Leu - 63- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（ 61 ) 450 455 i 460 Asn Pro Gin Tyr Asp Glu Asn Met Leu His Cys Asn Lys His Gly Leu 465 470 475 480 Ser Glu Lys Gly Val Tyr Leu Val Asn Arg Met lie Asp Met Gly Met 485 490 495 Leu He Glu Leu Asp His Met Ser Ala Gin Thr Ala Thr Ser Val Met 500 505 510 Asp He Val Glu Gin Arg Gin Tyr Gly Gly Val He Thr Ser His Ser 515 520 525 Trp Met Thr Asp Gly Thr Gin Gly Arg Leu His Pro Asn Thr Leu Arg 530 535 540 Leu Ala Lys Val Gly Gly Phe Met Ala Pro Tyr Asn Ser Asn Ala Asn 545 550 555 560 His Leu Gly Gly Ser He Asp Arg Tyr Leu Gin Leu He Ala Asp Thr 565 570 575 Pro Phe Leu Pro Gly Val Gly Leu Gly Thr Asp Met Ser Gly Leu Gly 580 585 590 Ala Gin Ala Gly Pro Arg Asp Asp Ala Ala Thr Asn Pro Leu His Tyr 595 600 605 Pro Phe Val Ser Glu Phe Gly lie Gin Phe Glu Arg Gin Val Ser Gly 610 615 620 Asn Arg Val Phe Asp Phe Asn Gin Asp Gly Met Ala His Tyr Gly Met 625 630 635 640 Leu Ala Asp His Leu Gin Asp Val Arg Glu Gin Leu Gly Gly Ser Thr 645 650 655 Tyr Glu Ala Leu Met Asn Ser Ala Glu Ala Tyr Leu Gin Met Trp Glu -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（ 62 ) 660 665 670 Arg Ala Glu Ala His Arg Asp Glu Ala Tyr He Asn Pro Leu Pro Thr 675 680 685 Tyr Val Arg lie Val Asn Arg Ala Ser Asp Lys Cys Met Asp lie Pro 690 695 700 Gly Asn Gly Ser Asp Met Val Asn Gly Thr Asp Val He Leu Tyr Asp 705 710 715 720 Cys Glu Arg Asp Ala Trp Asp Gin Arg Trp Ser Phe Asp Ala Asp Lys 725 730 735 Arg Met Phe Ser Asn Lys Ala Asn Pro Ser Leu Cys Leu Asp Asn Arg 740 745 750 Gly Gin Ala Tyr Asn Glu Gly Glu lie Vai Val Trp Glu Cys Val Asp 755 760 765 Ser Asp Asn Leu Arg Trp Asp Tyr Asp Gly Arg Phe tie Arg Ser Ala 770 775 ! ·' 780 His Asp Ala Asn lie Val Ala Asp Ala Tyr Gly Arg Gly Asn Asp Ala 785 790 795 800 Gin Val Gly Gin Trp Gin Phe His Gly Gly Ala Asn Gin Gin Trp Leu 805 810 815 Leu Arg Pro Glu Met Thr He His Arg Trp Val Ser Leu Arg Asp Lys 820 825 830 Arg Ala Gly Leu Cys [le Ser Ala Pro Glu Gin Ala Gin Ser Gly Ser 835 840 845 Leu Val Asn Leu Asp Asn Cys Ser Asn Arg Gin Gly Gin Lys Trp Tyr 850 855 860 Phe Asp Pro lie Lys Gly Ser [le Lys Leu Ala Gly Asp Ala Gly Leu -65- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（63 ) 865 870 875 880

Cys Leu His lie Pro Gly Gly Asn Thr Gin Asp His Ser Gin Leu Ala 885 890 895

Leu Ala Pro Cys Asp Ala Ser Asn Pro Ala Gin Ala Phe Asp Lys Asp 900 905 910

Gly Ser Val Phe Ser Ser Arg Met Ala Pro Asn Gin Val Leu Asp Ala 915 920 925

Ser Gly Glu Gin Ala Gly Ala Ala Leu He Leu Tyr His His His Gly 930 935 940

Asp Ser Asn Gin Lys Trp Lys Ser Ser Leu 945 950

<210〉 2 <211〉 2862 <212〉 DNA <213> Shewanella alga 〈400〉 2 accacccagg cggtcgacag cctggcgcag caatgtttta ttattcaatc gccaaccaat 60 ggccagtatc tgcatcgctt ccatcaggga ggcactgtgg atgatggtct gagttatcgt 120 ttcgataata tcagccaggc cgaggccagt gcgttttact tcaaacccag tcgccgcggt 180 cattttatga tgacagacgc agatggccgc ttctttgcca gccatctgcc ggccgaagtc 240 agcgccggtc gttacccggg ggaatttgcc gagtggcggg ttgacgccga aacagcacca 300 tccggtgaat tcagttatcg ctttcacgcc gtgggcctca atctgggact caggcacaac 360 tacagcggcg gaggcttgta tttcttcgat ctgctcaacc ctggaaacaa cacttcagag 420 gcaagcttca agctggttgc cagtgacgcc tgcagcgcgt ttcccgaggt tgaagtcaat 480

I -66 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1247804 A7 __ B7 1、發明説明（64~) gccagtggtg atttctccgc cctgaaaggc gatgcttcac tgccggtgcg gggtctggtc 540 gatgcccaca cccatatcac ctcgtafgag tttatgggcg gcaagatgat gcatggcaag 600

I i ccgttccacc gctggggggt gacccaggcg ttgaacgaca gtgcggtgat ccatgggccg 660 aatggctcac tggatctcat cggcaatctc tactccttca acgacgccaa cttccgctat 720 gacacccgag gctggccgga cttcccctgg tggcccaatc acgagcagat gacccactca 780 ggttactact acaagtggat tgagcgcgcc tggctaggcg gtttgcgcct gatggtcacc 840 catctggtgg aaaacgaggt gttgtgcaac gcccagaaaa ccatcaatcc cgccagttgg 900 gtcaacccca acgactgtaa caccatgaac agcattcagt tgcagattaa ccgtctcaag 960 caaatgcagg agtatattga tgtgcagtcc ggcggccccg gcaaaggctt cttccgcctg 1020 gtgtcctcgc ctcaagaggc tcgcgaggtc attgccgacg gcaagctggc ggtgctgatg 1080 ggcatagagg cctcagagct gttcaactgc ggtatcaagg atgattgcaa ccgccgccag 1140 attgaagagc aactgcagca agtttatgcc aagggggtga gaatcctgtt cccgacccac 1200 aagttcgata accaactggg cggctcagtg gtggaagacg gctttatcaa tatcggtgaa 1260 gtcttggcga cgggccattt ctttgaaacc caggcctgcg acgccgacac ccagggcaga 1320 ccattcaagt ccggtttccc cattttgggc gaaatcccag tgctcaagga tattctcaat 1380 • gccgtgggtc tcaatcccca gtacgacgag aacatgctgc actgcaacaa gcatggcttg 1440 tccgaaaaag gcgtctacct ggttaaccgc atgatagata tgggaatgtt gatagaattg 1500 gatcatatgt cggcacaaac cgccaccagt gtgatggata ttgtcgagca gcgccaatat 1560 ggcggggtga tcaccagcca cagctggatg actgatggca cccaaggcag actgcacccc 1620 aacaccctgc gcctggccaa ggtcggcggt tttatggcgc cctacaacag taacgccaac 1680 catcttggag gcagtattga tagatacctg cagttgatag ccgatactcc ttttctgccg 1740 ggtgtcggcc tgggaaccga tatgagtggc ctcggcgctc aggccggtcc cagagacgat 1800 gcggccacta atccactgca ctaccccttc gtcagtgagt tcggtatcca gtttgagcgt 1860 caggtatcgg ggaatcgtgt atttgacttc aatcaggatg gcatggccca ttacggtatg 1920 ctggctgatc atctgcagga tgtgcgcgag cagcttggcg gcagtaccta tgaagccttg 1980 atgaactcgg ccgaagccta tctgcagatg tgggagcgcg cagaagccca cagggatgaa 2040 -67· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（65 ) gcctatatca atccactgcc gacctatgtg cggatagtca accgcgcctc ggacaagtgt 2100 atggatattc cgggtaatgg cagcgatatg gtcaatggca cagatgtgat cctctatgat 2160 tgtgaacgcg acgcctggga tcaacgctgg agctttgatg ccgacaaacg catgttcagc 2220 * i j aacaaagcca atccatcctt gtgtttggac aatcgcggtc aggcctacaa tgaaggcgaa 2280 atcgtggtat gggagtgtgt cgacagcgac aatctgcgtt gggattatga cggccgcttt 2340 attcgcagtg cccatgacgc caatatagtg gccgacgcct atggccgtgg caacgatgcc 2400 caagtgggtc aatggcaatt tcatggcggc gccaaccagc aatggttgct caggcctgag 2460 atgactattc accgctgggt cagtttgcgg gataaacgtg ccgggctatg tatcagcgct 2520 cccgaacagg cccaaagcgg cagcctggtg aacctggaca actgcagcaa ccgtcagggg 2580 caaaaatggt acttcgatcc gataaaaggc agtatcaaac tggctggtga cgcgggactg 2640 tgcctgcaca ttccgggtgg caatacccag gatcatagcc agttggcact ggcgccctgc 2700 gatgcttcca atccggctca ggcattcgat aaagacggca gcgtgttctc aagccgaatg 2760； gcacccaatc aggtgcttga tgcctcggga gaacaagccg gcgcggctct gatcctctac 2820 caccaccatg gcgacagtaa tcagaagtgg aagtccagcc tc 2862

<210〉 3 <211〉 16 <212〉 PRT <213> Shewanella alga <400> 3

Gin Met Gin Glu Tyr lie Asp Val Gin Ser Gly Gly Pro Gly Lys Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211〉 12 -68- 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1247804 A7 B7 五、發明説明（66 )

<212> PRT <213> Shewanella alga <400〉 4

Arg Leu Met Val Thr His Leu Val Glu Asn Glu Val 1 5 10

<210〉 5 <211〉 7 <212〉 PRT <213> Shewanella alga <400> 5

Gin Leu Gin Gin Val Tyr Ala 1 5

<210〉 6 <211〉 7 〈212〉 PRT <213〉 Shewanella alga 〈400〉 6

Gly Val Arg He Leu Phe Pro 1 5 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（67 )

<211〉 18 <212〉 PRT <213> Shewanella alga <400〉 7

Thr Thr Gin Ala Val Asp Ser Leu Ala Gin Gin Cys Phe lie lie Gin 1 5 10 15

Ser Pro

〈210〉 8 〈211〉 20 <212> DNA <213〉 人工序列 · <220〉 人工序列内容：用以增幅SCDase基因之引子 <400> 8 20 carcartgyt tyathathca <210> 9 <211〉 17 <212〉 DNA <213> 人工序列 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（68 ) <220> 〈223>人工序列内容：用以增幅SCDasetcg基因之引子 <400〉 9 ttngcncarc artgytt 17 <2i0> 10 <211> 17 〈212> DMA 〈213>人工序列 <220> 〈223>人工序列内容：用以增幅SCDase基因之引子 <400> 10 ctngcncarc artgytt 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉人工序列内容：用以增基因之引子 -71- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（69 ) <400> 11 ccnstytgna crtcdat 17 <210〉 12 <211〉 17 <212> DNA <213〉人工序列 〈220> <223〉人工序列内容：用以增幅SCDase基因之引子 <400〉 12 17 ccnsaytgna crtcdat <210〉 13 <211〉 20 〈212> DNA 〈213>人工序列 <220> 〈223>人工序列内容··用以增幅SCDase基因之引子 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（7(3 ) <400> 13 acrtcdatrt aytcytgcat 20

<210> 14 <211> 992 <212> PRT <213> Shewanella alga <400> 14

Met Lys Lys Leu He Gly His Gly Asp Trp Pro Ser Ala Lys Ser Leu 15 10 15

Phe Ser Ala Leu lie Pro Gly Leu Phe Thr Leu Gly Thr Leu Pro Leu 20 25 30

Ala Ala Ala Glu Thr Gin Thr Thr Gin Ala Val Asp Ser Leu Ala Gin 35 40 45

Gin Cys Phe lie He Gin Ser Pro Thr Asn Gly Gin Tyr Leu His Arg 50 55 60

Phe His Gin Gly Gly Thr Val Asp Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Asp 65 70 75 80

Asa lie Ser Gin Ala Glu Ala Ser Ala Phe Tyr Phe Lys Pro Ser Arg 85 90 95

Arg Gly His Phe Met Met Thr Asp Ala Asp Gly Arg Phe Phe Ala Ser 100 105 110

His Leu Pro Ala Glu Val Ser Ala Gly Arg Tyr Pro Gly Glu Phe Ala 115 120 125

Glu Trp Arg Val Asp Ala Glu Thr Ala Pro Ser Gly Glu Phe Ser Tyr -73- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1247804 A7 B7 五、發明説明 < 71 ) 130 135 140 Arg Phe His Ala Val Gly Leu Asn Leu Gly Leu Arg His Asn Tyr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Leu Tyr Phe Phe Asp Leu Leu Asn Pro Gly Asn Asn Thr 165 170 175 Ser Glu Ala Ser Phe Lys Leu Val Ala Ser Asp Ala Cys Ser Ala Phe 180 185 190 Pro Glu Val Glu Val Asn Ala Ser Gly Asp Phe Ser Ala Leu Lys Gly 195 200 205 Asp Ala Ser Leu Pro Val Arg Gly Leu Val Asp Ala His Thr His He 210 215 220 Thr Ser Tyr Glu Phe Met Gly Gly Lys Met Met His Gly Lys Pro Phe 225 230 235 240 His Arg Trp Gly Val Thr Gin Ala Leu Asn Asp Ser Ala Val [le His 245 250 255 Gly Pro Asn Gly Ser Leu Asp Leu lie Gly Asn Leu Tyr Ser Phe Asn 260 265 270 Asp Ala Asn Phe Arg Tyr Asp Thr Arg Gly Trp Pro Asp Phe Pro Trp 275 280 285 Trp Pro Asn His Glu Gin Met Thr His Ser Gly Tyr Tyr Tyr Lys Trp 290 295 300 lie Glu Arg Ala Trp Leu Gly Gly Leu Arg Leu Met Vai Thr His Leu 305 310 315 320 Vai Glu Asn Glu Vai Leu Cys Asn Ala Gin Lys Thr lie Asn Pro Ala 325 330 335 Ser Trp Val Asm Pro Asn Asp Cys Asn Thr Met Asn Ser lie Gin Leu _ 74- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（72 ) 340 345 350

Gin He Asn Arg Leu Lys Gin Met Gin Glu Tyr He Asp Val Gin Ser 355 360 365

Gly Gly Pro Gly Lys Gly Phe Phe Arg Leu Val Ser Ser Pro Gin Glu 370 375 380

Ala Arg Glu Val He Ala Asp Gly Lys Leu Ala Val Leu Met Gly lie 385 390 395 400

Glu Ala Ser Glu Leu Phe Asn Cys Gly He Lys Asp Asp Cys Asn Arg 405 410 415

Arg Gin He Glu Glu Gin Leu Gin Gin Val Tyr Ala Lys Gly Val Arg 420 425 430 lie Leu Phe Pro Thr His Lys Phe Asp Asn Gin Leu Gly Gly Ser Val 435 440 445

Val Glu Asp Gly Phe lie Asn 丨le Gly Glu Val Leu Ala Thr Gly His 450 455 460

Phe Phe Glu Thr Gin Ala Cys Asp Ala Asp Thr Gin Gly Arg Pro Phe 465 470 475 480

Lys Ser Gly Phe Pro lie Leu Gly Glu lie Pro Val Leu Lys Asp lie 485 490 495

Leu Asn Ala Val Gly Leu Asn Pro Gin Tyr Asp Glu Asn Met Leu His 500 505 510

Cys Asn Lys His Gly Leu Ser Glu Lys Gly Val Tyr Leu Val Asn Arg 515 520 525

Met He Asp Met Gly Met Leu He Glu Leu Asp His Met Ser Ala Gin 530 535 540

Thr Ala Thr Ser Val Met :Asp He Val Glu Gin Arg Gin Tyr Gly Gly -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1247804 A7 B7 五、發明説明（ 73 ) 545 550 555 560 Val He Thr Ser His Ser Trp Met Thr Asp Gly Thr Gin Gly Arg Leu 565 570 575 His Pro Asn Thr Leu Arg Leu Ala Lys Val Gly Gly Phe Met Ala Pro 580 585 590 Tyr Asn Ser Asn Ala Asn His Leu Gly Gly Ser He Asp Arg Tyr Leu 595 600 605 Gin Leu lie Ala Asp Thr Pro Phe Leu Pro Gly Val Gly Leu Gly Thr 610 615 620 Asp Met Ser Gly Leu Gly Ala Gin Ala Gly Pro Arg Asp Asp Ala Ala 625 630 635 640 Thr Asn Pro Leu His Tyr Pro Phe Val Ser Glu Phe Gly lie Gin Phe 645 650 655 Glu Arg Gin Val Ser Gly Asn Arg Val Phe Asp Phe Asn Gin Asp Gly 660 665 670 Met Ala His Tyr Gly Met Leu Ala Asp His Leu Gin Asp Val Arg Glu 675 680 685 Gin Leu Gly Gly Ser Thr Tyr Glu Ala Leu Met Asn Ser Ala Giu Ala 690 695 700 Tyr Leu Gin Met Trp Glu Arg Ala Glu Ala His Arg Asp Glu Ala Tyr 705 710 715 720 lie Asn Pro Leu Pro Thr Tyr Val Arg He Val Asn Arg Ala Ser Asp 725 730 735 Lys Cys Met Asp He Pro Gly Asn Gly Ser Asp Met Val Asn Gly Thr 740 745 750 Asp Val lie Leu Tyr Asp Cys Glu Arg Asp Ala Trp Asp Gin Arg Trp ' 76- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（ 74 ) 755 760 765 Ser Phe Asp Ala Asp Lys Arg Met Phe Ser Asn Lys Ala Asn Pro Ser 770 775 780 Leu Cys Leu Asp Asn Arg Gly Gin Ala Tyr Asn Glu Gly Glu ile Val 785 790 795 800 Val Trp Glu Cys Val Asp Ser Asp Asn Leu Arg Trp Asp Tyr Asp Gly 805 810 815 Arg Phe He Arg Ser Ala His Asp Ala Asn He Val Ala Asp Ala Tyr 820 825 830 Gly Arg Gly Asn Asp Ala Gin Val Gly Gin Trp Gin Phe His Gly Gly 835 840 845 Ala Asn Gin Gin Trp Leu Leu Arg Pro Glu Met Thr Ile His Arg Trp 850 855 860 Val Ser Leu Arg Asp Lys Arg Ala Gly Leu Cys Ile Ser Ala Pro Glu 865 870 875 880 Gin Ala Gin Ser Gly Ser Leu Val Asn Leu Asp Asn Cys Ser Asn Arg 885 890 895 Gin Gly Gin Lys Trp Tyr Phe Asp Pro He Lys Gly Ser He Lys Leu 900 905 910 Ala Gly Asp Ala Gly Leu Cys Leu His He Pro Gly Gly Asn Thr Gin 915 920 925 Asp His Ser Gin Leu Ala Leu Ala Pro Cys Asp Ala Ser Asn Pro Ala 930 935 940 Gin Ala Phe Asp Lys Asp Gly Ser Val Phe Ser Ser Arg Met Ala Pro 945 950 955 960 Asn Gin Val Leu Asp Ala Ser Gly Glu Gin Ala Gly Ala Ala Leu lie -77- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1247804 A7 B7 1、發明説明（75~~) ^ 965 970 975

Leu Tyr His His His Gly Asp Ser Asn Gin Lys Trp Lys Ser Ser Leu 980 985 990

〈210〉 15 <211〉 2976 <212> DNA <213> Shewanella alga <400〉 15 atgaaaaagc taatcggaca tggagattgg cccagtgcca aaagtctgtt ctctgccctg 60 atccccggcc tgtttacgct gggaacccta cccctagctg cagctgaaac gcaaaccacc 120 caggcggtcg acagcctggc gcagcaatgt tttattattc aatcgccaac caatggccag 180 tatctgcatc gcttccatca gggaggcact gtggatgatg gtctgagtta tcgtttcgat 240 aatatcagcc aggccgaggc cagtgcgttt tacttcaaac ccagtcgccg cggtcatttt 300 atgatgacag acgcagatgg ccgcttcttt gccagccatc tgccggccga agtcagcgcc 360 ggtcgttacc cgggggaatt tgccgagtgg cgggttgacg ccgaaacagc accatccggt 420 gaattcagtt atcgctttca cgccgtgggc ctcaatctgg gactcaggca caactacagc 480 ggcggaggct tgtatttctt cgatctgctc aaccctggaa acaacacttc agaggcaagc 540 ttcaagctgg ttgccagtga cgcctgcagc gcgtttcccg aggttgaagt caatgccagt 600 ggtgatttct ccgccctgaa aggcgatgct tcactgccgg tgcggggtct ggtcgatgcc 660 cacacccata tcacctcgta tgagtttatg ggcggcaaga tgatgcatgg caagccgttc 720 caccgctggg gggtgaccca ggcgttgaac gacagtgcgg tgatccatgg gccgaatggc 780 tcactggatc tcatcggcaa tctctactcc ttcaacgacg ccaacttccg ctatgacacc 840 cgaggctggc cggacttccc ctggtggccc aatcacgagc agatgaccca ctcaggttac 900 tactacaagt ggattgagcg cgcctggcta ggcggtttgc gcctgatggt cacccatctg 960 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公爱) 1247804 A7 __ B7 、發明説明（76~Γ " gtggaaaacg aggtgttgtg caacgcccag aaaaccatca atcccgccag ttgggtcaac 1020 cccaacgact gtaacaccat gaacagcatt cagttgcaga ttaaccgtct caagcaaatg 1080 caggagtata ttgatgtgca gtccggcggc cccggcaaag gcttcttccg cctggtgtcc 1140 tcgcctcaag aggctcgcga ggtcattgcc gacggcaagc tggcggtgct gatgggcata 1200 gaggcctcag agctgttcaa ctgcggtatc aaggatgatt gcaaccgccg ccagattgaa 1260 gagcaactgc agcaagttta tgccaagggg gtgagaatcc tgttcccgac ccacaagttc 1320 gataaccaac tgggcggctc agtggtggaa gacggcttta tcaatatcgg tgaagtcttg 1380 gcgacgggcc atttctttga aacccaggcc tgcgacgccg acacccaggg cagaccattc 1440 aagtccggtt tccccatttt gggcgaaatc ccagtgctca aggatattct caatgccgtg 1500 ggtctcaatc cccagtacga cgagaacatg ctgcactgca acaagcatgg cttgtccgaa 1560 aaaggcgtct acctggttaa ccgcatgata gatatgggaa tgttgataga attggatcat 1620 atgtcggcac aaaccgccac cagtgtgatg gatattgtcg agcagcgcca atatggcggg 1680 gtgatcacca gccacagctg gatgactgat ggcacccaag gcagactgca ccccaacacc 1740 ctgcgcctgg ccaaggtcgg cggttttatg gcgccctaca acagtaacgc caaccatctt 1800 ggaggcagta ttgatagata cctgcagttg atagccgata ctccttttct gccgggtgtc 1860 ggcctgggaa ccgatatgag tggcctcggc gctcaggccg gtcccagaga cgatgcggcc 1920 actaatccac tgcactaccc cttcgtcagt gagttcggta tccagtttga gcgtcaggta 1980 tcggggaatc gtgtatttga cttcaatcag gatggcatgg cccattacgg tatgctggct 2040 gatcatctgc aggatgtgcg cgagcagctt ggcggcagta cctatgaagc cttgatgaac 2100 tcggccgaag cctatctgca gatgtgggag cgcgcagaag cccacaggga tgaagcctat 2160 atcaatccac tgccgaccta tgtgcggata gtcaaccgcg cctcggacaa gtgtatggat 2220 attccgggta atggcagcga tatggtcaat ggcacagatg tgatcctcta tgattgtgaa 2280 cgcgacgcct gggatcaacg ctggagcttt gatgccgaca aacgcatgtt cagcaacaaa 2340 gccaatccat ccttgtgttt ggacaatcgc ggtcaggcct acaatgaagg cgaaatcgtg 2400 gtatgggagt gtgtcgacag cgacaatctg cgttgggatt atgacggccg ctttattcgc 2460 agtgcccatg acgccaatat agtggccgac gcctatggcc gtggcaacga tgcccaagtg 2520 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（77 ) ggtcaatggc aatttcatgg cggcgccaac cagcaatggt tgctcaggcc tgagatgact 2580 attcaccgct gggtcagttt gcgggataaa cgtgccgggc tatgtatcag cgctcccgaa 2640 caggcccaaa gcggcagcct ggtgaacctg gacaactgca gcaaccgtca ggggcaaaaa 2700 tggtacttcg atccgataaa aggcagtatc aaactggctg gtgacgcggg actgtgcctg 2760 cacattccgg gtggcaatac ccaggatcat agccagttgg cactggcgcc ctgcgatgct 2820 tccaatccgg ctcaggcatt cgataaagac ggcagcgtgt tctcaagccg aatggcaccc 2880 aatcaggtgc ttgatgcctc gggagaacaa gccggcgcgg ctctgatcct ctaccaccac 2940 catggcgaca gtaatcagaa gtggaagtcc agcctc 2976 <210〉 16 〈211〉 30 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> <223〉人工序列内容：用以增幅sCDase基因之引子 <400〉 16 gacgctagca tgaaaaagct aatcggacat 30

<210〉 17 <211〉 32 <212〉 DNA <213〉人工序列 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 χ 297公釐） 1247804 A7 B7 五、發明説明（78 ) <220> 〈223〉人工序列内容：用以增幅SCDasetcg基因之引子 <400〉 17 cttctcgaga ggaggctgga cttccacttc tg 32 <210> 18 〈211〉 30 <212> DMA <213〉人工序列 <220〉 〈223> 人工序列内容：用以增幅SCDase基因之引子 <400〉 18 gtgctcgagg tgggcttctg cgcgctccca 30 〈210> 19 <211> 2031 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉人工序列内容：3’末端有缺失之SCDase基因 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4埤格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（79 ) <220> <223〉對應於序列編號:2中鹼基編號··丨-203!之序列 <400> 19 accacccagg cggtcgacag cctggcgcag caatgtttta ttattcaatc gccaaccaat 60 ggccagtatc tgcatcgctt ccatcaggga ggcactgtgg atgatggtct gagttatcgt 120 ttcgataata tcagccaggc cgaggccagt gcgttttact tcaaacccag tcgccgcggt 180 cattttatga tgacagacgc agatggccgc ttctttgcca gccatctgcc ggccgaagtc 240 agcgccggtc gttacccggg ggaatttgcc gagtggcggg ttgacgccga aacagcacca 300 tccggtgaat tcagttatcg ctttcacgcc gtgggcctca atctgggact caggcacaac 360 tacagcggcg gaggcttgta tttcttcgat ctgctcaacc ctggaaacaa cacttcagag 420 gcaagcttca agctggttgc cagtgacgcc tgcagcgcgt ttcccgaggt tgaagtcaat 480 gccagtggtg atttctccgc cctgaaaggc gatgcttcac tgccggtgcg gggtctggtc 540 gatgcccaca cccatatcac ctcgtatgag tttatgggcg gcaagatgat gcatggcaag 600 ccgttccacc gctggggggt gacccaggcg ttgaacgaca gtgcggtgat ccatgggccg 660 aatggctcac tggatctcat cggcaatctc tactccttca acgacgccaa cttccgctat 720 gacacccgag gctggccgga cttcccctgg tggcccaatc acgagcagat gacccactca 780 ggttactact acaagtggat tgagcgcgcc tggctaggcg gtttgcgcct gatggtcacc 840 catctggtgg aaaacgaggt gttgtgcaac gcccagaaaa ccatcaatcc cgccagttgg 900 gtcaacccca acgactgtaa caccatgaac agcattcagt tgcagattaa ccgtctcaag 960 caaatgcagg agtatattga tgtgcagtcc ggcggccccg gcaaaggctt cttccgcctg 1020 gtgtcctcgc ctcaagaggc tcgcgaggtc attgccgacg gcaagctggc ggtgctgatg 1080 ggcatagagg cctcagagct gttcaactgc ggtatcaagg atgattgcaa ccgccgccag 1140 -82 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7__ 五、發明説明（8G ) attgaagagc aactgcagca agtttatgcc aagggggtga gaatcctgtt cccgacccac 1200 aagttcgata accaactggg cggctcagtg gtggaagacg gctttatcaa tatcggtgaa 1260 gtcttggcga cgggccattt ctttgaaacc caggcctgcg acgccgacac ccagggcaga 1320 ccattcaagt ccggtttccc cattttgggc gaaatcccag tgctcaagga tattctcaat 1380 gccgtgggtc tcaatcccca gtacgacgag aacatgctgc actgcaacaa gcatggcttg 1440 tccgaaaaag gcgtctacct ggttaaccgc atgatagata tgggaatgtt gatagaattg 1500 gatcatatgt cggcacaaac cgccaccagt gtgatggata ttgtcgagca gcgccaatat 1560 ggcggggtga tcaccagcca cagctggatg actgatggca cccaaggcag actgcacccc 1620 aacaccctgc gcctggccaa ggtcggcggt tttatggcgc cctacaacag taacgccaac 1680 catcttggag gcagtattga tagatacctg cagttgatag ccgatactcc ttttctgccg 1740 ggtgtcggcc tgggaaccga tatgagtggc ctcggcgctc aggccggtcc cagagacgat 1800 gcggccacta atccactgca ctaccccttc gtcagtgagt tcggtatcca gtttgagcgt 1860 caggtatcgg ggaatcgtgt atttgacttc aatcaggatg gcatggccca ttacggtatg 1920 ctggctgatc atctgcagga tgtgcgcgag cagcttggcg gcagtaccta tgaagccttg 1980 atgaactcgg ccgaagccta tctgcagatg tgggagcgcg cagaagccca c 2031 <210〉 20 <211> 677 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列内容：C末端有缺失之SCDase <220> <223>對應於序列編號：1中胺基酸編號：1-677之序列 •83- 本紙張尺度適用中國國家樣準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明（ 81 ) <400> 2( 3 Thr Thr Gin Ala Val Asp Ser Leu Ala Gin Gin Cys Phe He He Gin 1 5 10 15 Ser Pro Thr Asn Gly Gin Tyr Leu His Arg Phe His Gin Gly Gly Thr 20 25 30 Val Asp Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Asp Asn He Ser Gin Ala Glu 35 40 45 Ala Ser Ala Phe Tyr Phe Lys Pro Ser Arg Arg Gly His Phe Met Met 50 55 60 Thr Asp Ala Asp Gly Arg Phe Phe Ala Ser His Leu Pro Ala Glu Val 65 70 75 80 Ser Ala Gly Arg Tyr Pro Gly Glu Phe Ala Glu Trp Arg Val Asp Ala 85 90 95 Glu Thr Ala Pro Ser Gly Glu Phe Ser Tyr Arg Phe His Ala Val Giy 100 105 110 Leu Asn Leu Gly Leu Arg His Asn Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Tyr Phe 115 120 125 Phe Asp Leu Leu Asn Pro Gly Asn Asn Thr Ser Glu Ala Ser Phe Lys 130 135 140 Leu Val Ala Ser Asp Ala Cys Ser Ala Phe Pro Glu Val Glu Val Asn 145 150 155 160 Ala Ser Gly Asp Phe Ser Ala Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu Pro Val 165 170 175 Arg Giy Leu Val Asp Ala His Thr His He Thr Ser Tyr Glu Phe Met 84- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1247804 A7 B7 五、發明説明 < 82 ) 180 185 190 Giy Giy Lys Met Met His Gly Lys Pro Phe His Arg Trp Gly Vai Thr 195 200 205 Gin Ala Leu Asn Asp Ser Ala Val He His Gly Pro Asn Gly Ser Leu 210 215 220 Asp Leu lie Gly Asn Leu Tyr Ser Phe Asn Asp Ala Asn Phe Arg Tyr 225 230 235 240 Asp Thr Arg Gly Trp Pro Asp Phe Pro Trp Trp Pro Asn His Glu Gin 245 250 255 Met Thr His Ser Gly Tyr Tyr Tyr Lys Trp [le Glu Arg Ala Trp Leu 260 265 270 Gly Gly Leu Arg Leu Met Val Thr His Leu Val Glu Asn Glu Val Leu 275 280 285 Cys Asn Ala Gin Lys Thr [le Asn Pro Ala Ser Trp Val Asn Pro Asn 290 295 300 Asp Cys Asn Thr Met Asn Ser He Gin Leu Gin He Asn Arg Leu Lys 305 310 315 320 Gin Met Gin Glu Tyr lie Asp Val Gin Ser Gly Gly Pro Gly Lys Gly 325 330 335 Phe Phe Arg Leu Val Ser Ser Pro Gin Glu Ala Arg Glu Val lie Ala 340 345 350 Asp Gly Lys Leu Ala Val Leu Met Gly lie Glu Ala Ser Glu Leu Phe 355 360 365 Asn Cys Gly lie Lys Asp Asp Cys Asn Arg Arg Gin He Glu Glu Gin 370 375 380 Leu Gin Gin Val Tyr Ala Lys Gly Val Arg lie Leu Phe Pro Thr His -85- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1247804 A7 ___B7 五、發明説明（83~) 385 390 395 400

Lys Phe Asp Asn Gin Leu Gly Gly Ser Val Val Glu Asp Gly Phe He 405 410 415

Asn He Gly Glu Val Leu Ala Thr Gly His Phe Phe Glu Thr Gin Ala 420 425 430

Cys Asp Ala Asp Thr Gin Gly Arg Pro Phe Lys Ser Gly Phe Pro lie 435 440 445

Leu Gly Glu He Pro Val Leu Lys Asp He Leu Asn Ala Val Gly Leu 450 455 460

Asn Pro Gin Tyr Asp Glu Asn Met Leu His Cys Asn Lys His Gly Leu 465 470 475 480

Ser Glu Lys Gly Val Tyr Leu Val Asn Arg Met lie Asp Met Gly Met 485 490 495

Leu He Glu Leu Asp His Met Ser Ala Gin Thr Ala Thr Ser Val Met 500 505 510

Asp He Val Glu Gin Arg Gin Tyr Gly Gly Val He Thr Ser His Ser 515 520 525

Trp Met Thr Asp Gly Thr Gin Gly Arg Leu His Pro Asn Thr Leu Arg 530 535 540

Leu Ala Lys Val Gly Gly Phe Met Ala Pro Tyr Asn Ser Asn Ala Asn 545 550 555 560

His Leu Gly Gly Ser lie Asp Arg Tyr Leu Gin Leu He Ala Asp Thr 565 570 575

Pro Phe Leu Pro Gly Val Gly Leu Gly Thr Asp Met Ser Gly Leu Gly 580 585 590

Ala Gin Ala Gly Pro Arg Asp Asp Ala Ala Thr Asn Pro Leu His Tyr -86- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

裝 訂

1247804 A7 B7 五、發明説明（84 ) 595 600 605

Pro Phe Val Ser Glu Phe Gly He Gin Phe Glu Arg Gin Val Ser Gly 610 615 620

Asn Arg Val Phe Asp Phe Asn Gin Asp Gly Met Ala His Tyr Gly Met 625 630 635 640

Leu Ala Asp His Leu Gin Asp Val Arg Glu Gin Leu Gly Gly Ser Thr 645 650 655

Tyr Glu Ala Leu Met Asn Ser Ala Glu Ala Tyr Leu Gin Met Trp Glu 660 665 670

Arg Aia Glu Ala His 675 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

Claims (1)

1247^04123776號專利申請案 g - 丁-―二―—] 中文申請專利範圍替換本(94年10月）喆1七年γ月:财更)止尽 六、申請專利範圍 ~ 1· 一種經單離或純化之聚胜肽，其係下述（a)或（b)之聚胜 肽’且具有鞘脂質神經醢胺脫乙醯基轉移酶活性： (a) 由序列編號：20所示之胺基酸序列或其一部分所組 成之聚胜肽；或 (b) 可於嚴苛條件下與由序列編號·· 19所示之鹼基序列 或其一部分所組成之核酸雜合之核酸所編碼之聚胜肽。 2· 一種經單離或純化之核酸，其係由下述（A)〜(D)構成之群 組所選擇之核酸，且編碼具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基 轉移酶活性之聚胜肽： (A) 編碼由序列編號·· 20所示胺基酸序列或其一部分 所組成之聚胜肽之經單離或純化的核酸； (B) 具有序列編號：19所示之驗基序列或其一部分之 核酸； (C) 可在嚴苛條件下與前述（A)之核酸或其互補鏈進 行雜合之核酸；以及 (D) 由因退化（degenerate)而與前述（B)或（c)之核酸有 所不同之鹼基序列所組成的核酸。 3· 一種重組DNA，其係含有前述申請專利範圍第2項之核 酸。 4· 一種轉形體，其係保有前述申請專利範圍第2項或第3項 之重組DNA。 5· 一種具有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽 的製造方法，其特徵係將前述申請專利範圍第4項之轉 形體，於鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶可適當表現的 73735-941028.doc

1247804 - C8 D8 六、申請專利範圍 條件下進行培養，然後，由所得到之培養物中， 有鞘脂質神經醯胺脫乙醯基轉移酶活性之聚胜肽 -2- 採取具 73735-941028.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)