CN100497619C - 鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽、编码该多肽的核酸、含有该核酸的重组DNA、带有该核酸或该重组DNA的导入细胞用载体、带有该核酸或该重组DNA的转化体的该多肽的制造方法，针对该核酸的寡核苷酸探针或引物、使用该探针或引物的该核酸的检测方法及其试剂盒、针对该多肽的抗体或其片段、使用该抗体或其片段的该多肽的检测方法及其试剂盒。本发明可用于鞘脂工程、神经系统疾病(例如神经变性疾病)、白血病、创伤等疾病的治疗。

Description

鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因

技术领域

本发明涉及到具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽、编码该多肽的核酸以及利用他们的技术。更详细地讲，本发明涉及到作为用于解析鞘脂结构和功能的鞘脂工程用试剂有用的具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列的多肽；具有编码该多肽的碱基序列的核酸；具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因工程制造方法；该多肽的检测方法及其试剂盒，和编码该多肽的基因的检测方法及其试剂盒。

背景技术

近年来，作为真核生物的细胞膜脂质的构成成分，甘油脂以及鞘脂具有的各种各样的生理功能受到人们的注目。作用于该鞘脂，生成脂肪酸和溶血鞘脂的鞘脂神经酰胺脱酰基酶(SCDase)不仅在阐明鞘脂的生理作用上有用，而且在称之为鞘脂衍生物的制作和标记的鞘脂工程领域中是非常重要的酶。

以前作为作用于神经酰胺水解鞘氨醇碱基和脂肪酸之间酰胺键的酶已知有神经酰胺酶(Ceramidase：EC 3.5.1.23)[Journal ofBiological Chemistry、第241卷、第3731-3737页(1966)、Biochemistry、第8卷、第1692-1698页(1969)、Biochimica etBiophysica Acta、第176卷、第339页-347页(1969)、Science、第178卷、第1100-1102页(1972)]。但是这样的酶不能水解鞘糖脂或鞘磷脂中神经酰胺部分的鞘氨醇碱基和脂肪酸之间的酰胺键。

而由属于诺卡氏菌(Nocardia)属、红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属微生物生产的酶[Journal ofBiochemistry、第103卷、第1-4页(1988)、特开平6-78782号公报、特开平7-107988号公报]作用于鞘糖脂可以水解鞘氨醇碱基和脂肪酸之间的酰胺键，生成溶血鞘糖脂(lysosphingoglycolipid)和脂肪酸。但无论哪一种酶都具有底物特异性窄，不能作用于所有鞘脂的性质。

就是说，由属于诺卡氏菌属的微生物生产的酶虽然可作用于GD1a、GM1、GM2、GM3等所谓的酸性糖脂，但却几乎完全不能作用于中性糖脂。相反，由属于红球菌属微生物生产的酶可作用于中性糖脂，但却不能作用于酸性糖脂。而由属于链霉菌属微生物生产的酶不能作用于GM3和作为中性糖脂的乳糖苷神经酰胺、脑苷脂类等。另外无论上述的哪一种酶都不能作用于鞘磷脂。

与上述酶不同，来自嗜糖假单胞菌TK-4(Pseudomonassp.TK-4)菌株的SCDase[Journal of Biological Chemistry、第270卷、第24370-24374页(1995)、特开平8-84587号公报]对包括酸性糖脂、中性糖脂以及鞘磷脂在内的所有鞘脂具有广泛的底物特异性。而该SCDase不仅催化鞘脂生成对应的溶血鞘脂和脂肪酸的水解反应，而且也催化由溶血鞘脂和脂肪酸合成鞘脂的缩合反应，还催化将鞘脂的脂肪酸部分换成其他脂肪酸的交换反应(国际公开第98/03529号小册子)。因此该酶是鞘脂工程领域中的非常重要的工具，产业上利用价值高。然而，想要在工业上由微生物有利地制造上述的SCDase时，为了诱导天然存在的该酶的生成，在培养时必须要向培养基中添加神经节苷脂混合物。由于在培养液中有时生成游离的脂肪酸和溶血鞘糖脂，以及鞘磷脂酶等目的以外的酶也同时生成，要将这些脂和混杂的酶与目的SCDase进行分离纯化是困难的。

于是为了通过基因工程方法制造嗜糖假单胞菌TK-4生产的SCDase，克隆了该SCDase基因，制作了导入了该基因的转化体(特开平11-276177号公报)。但是转化体中生产的SCDase或者是活性低，或者是不能检测的水平，所以通过基因工程方法制造SCDase是困难的。

本发明的目的在于提供在鞘脂工程领域有用的具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽、编码该多肽的核酸；容易且可大量制造该多肽的基因工程制造方法；能与该核酸特异杂交的寡核苷酸探针或引物、使用该寡核苷酸探针或引物的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的检测方法、以及检测用的试剂盒、能与本发明的多肽特异结合的抗体或其片段、使用该抗体或其片段的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的检测方法及使用其的试剂盒。

附图的简单说明

图1为质粒pSCD1插入DNA片段的限制酶酶切图谱。

发明公开

本发明人为了分离编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因进行了锐意研究，结果在具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因的分离和其碱基序列的解析中获得了成功，而且在此基础上确立了容易且可大量制造高纯度的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的方法，具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的检测方法以及该基因的检测方法，直至本发明的完成。

即，本发明的要点如下：

[1]从下述(a)～(c)选择出的多肽，而且是具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽：

(a)具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽；

(b)由具有在序列20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置换一个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽；以及

(c)与序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽；

[2]从下述(A)～(H)中选择出的核酸，而且是编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸；

(A)编码具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽的核酸；

(B)编码由具有在序列20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置换一个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的核酸；

(C)编码与序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽的核酸；

(D)具有序列19所示碱基序列或其一部分序列的核酸；

(E)具有在序列19所示碱基序列中至少缺失、附加、插入或置换一个碱基的碱基序列的核酸；

(F)在能与上述(A)～(F)任一项记载的核酸或其互补链杂交的核酸；

(G)具有由于密码子简并而与上述(A)～(F)任一项记载的核酸不同的碱基序列的核酸；以及

(H)具有与上述(A)～(G)任一项记载的核酸的碱基序列至少有17％序列同一性的碱基序列的核酸；

[3]含有上述[2]记载的核酸的重组DNA，

[4]带有上述[2]记载的核酸或上述[3]记载的重组DNA的转化体，

[5]具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的制造方法，其特征是：在适于鞘脂神经酰胺脱酰基酶表达的条件下对上述[4]的转化体进行培养，然后从得到的培养物中提取具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽，

[6]可在严格条件下能与上述[2]记载的核酸杂交的寡核苷酸探针或引物，

[7]至少由连续15个核苷酸构成的上述[6]记载的寡核苷酸探针或引物，

[8]编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的检测方法，其特征是：使含有核酸的被检测样品与上述[6]或[7]记载的寡核苷酸探针接触，然后对核酸与寡核苷酸探针的杂化体进行检测。

[9]编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的检测方法，其特征是：以含有核酸的被检测样品作为模板样品，使用上述[6]或[7]记载的引物进行核酸扩增。

[10]包含上述[6]或[7]记载的寡核苷酸探针和/或引物在内的用于检测编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的试剂盒，

[11]可以特异地与上述[1]记载的多肽结合的抗体或其片段，

[12]具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的检测方法，其特征是：使含有多肽的被检测样品与上述[11]记载的抗体或其片段接触，对多肽与抗体或其片段的复合物进行检测，以及

[13]包含上述[11]记载的抗体或其片段、用于检测具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的试剂盒。

在本发明说明书中，所谓“鞘脂神经酰胺脱酰基酶”就像上述那样是具有作用于鞘脂，使其水解为鞘氨醇类碱和脂肪酸的活性，但对神经酰胺几乎或完全没有作用的酶。

另外在本说明书中，有时将“具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽”记载为“鞘脂神经酰胺脱酰基酶”。

本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶由于具有很宽的底物特异性，可用于对细胞工程中糖脂的生物功能进行解析的方法、有用的鞘脂的大量生产、鞘脂的功能变换、鞘脂的探针的制作、新的鞘脂的创制等鞘脂工程中。另外可以应用于神经系统疾病(例如神经变性疾病等)、白血病、创伤等疾病的治疗中。

鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性也可以按照诸如Journal ofBiological Chemistry、第270卷、第24370-24374页(1995)记载的方法进行测定。具体来说，如向含有0.1％的TritonX-100和10nmol的GM1的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)10μl中加入10μl酶液，将得到的反应液于37℃下温育一定时间。然后于100℃下煮沸5分钟，终止反应，使用真空离心蒸发浓缩器使反应液完全干燥。加入15μl的氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，通过超声处理使反应生产物溶解。将得到的溶解物点到硅胶TLC板(商品名：Silica Ge160 TLC plate、メルク公司生产)上。然后用氯仿/甲醇/0.2％CaCl₂(5/4/1、v/v)展开后，喷苔黑酚硫酸。将喷雾后的TLC板用110℃的电热板加热后，通过反应使游离的溶血GM1和未反应的GM1显色。

使用色谱扫描仪[岛津CS-9300，岛津制作所生产]于波长540nm对相应于游离的溶血GM1和未反应的GM1的点进行定量，以得到的值为基础通过「分解率(％)＝[游离的溶血GM1的面积×100]/[游离的溶血GM1的面积和未反应的GM1的面积]」公式可以求分解率。

鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的1个单位(unit)定义为1分钟内分解1μmol的GM1的酶量。

在本发明中鞘脂神经酰胺脱酰基酶的来源没有特别限定，例如可来源于细菌类、放线菌类、酵母类、线状菌类、子囊菌类、担子菌类等微生物、或植物、动物、昆虫等生物。这样来源的鞘脂神经酰胺脱酰基酶也包括在本发明的范围内。具体来说，例如从海水中分离到的海洋性细菌海藻希瓦氏菌(Shewanellaalga)G8菌株就很适合作为获得本发明鞘脂神经酰胺脱酰基酶的材料。

而上述海藻希瓦氏菌G8可以象下述那样获得。

将从各地收集的样品(海水、河水、或生活在海水、河水的生物的体表或消化道等)悬浮于灭菌的生理盐水中。将得到的悬浮液10μl接种到在Eppendorf管中加有0.01％神经酰胺、0.05％NH₄Cl、0.05％K₂HPO₄、0.1％酵母提取物、2.0％NaCl、0.01％TDC(牛磺脱氧胆酸钠)、pH7.0的液体培养基400μl中，于25℃下振荡培养4天。然后用上述方法测定酶活性，选择具有活性的培养液。用灭菌的生理盐水将选择的培养液稀释后，将得到的稀释物涂布在平板培养基上。将涂布后的平板培养基于25℃培养2天，使其形成菌落。上述操作反复进行直至形成单一菌落。通过这样操作可以从样品中分离生产鞘脂神经酰胺脱酰基酶的海藻希瓦氏菌G8。

上述海藻希瓦氏菌G8保存在九州大学大学院农学研究科生物功能科学部门伊东研究室，如需要可以提供。

作为本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶如具有序列表中序列1所示氨基酸序列或具有其一部分序列的多肽，最好是具有缺失该序列1的C末端区的氨基酸序列(氨基酸序列：1～677)或具有其一部分的多肽等。具体来说如具有序列20所示氨基酸序列或具有其一部分序列的多肽。其中由上述序列20所示氨基酸序列构成的多肽是由上述序列1所示氨基酸序列构成的多肽的C末端缺失体多肽，表现出鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性。

即，作为本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶如具有(a)序列1或20所示氨基酸序列(具有缺失了天然型鞘脂神经酰胺脱酰基酶的C末端区的氨基酸序列的多肽)或其一部分序列的多肽。

其中“具有序列1或20所示氨基酸序列的一部分的多肽(也称之为部分多肽)”可以通过用上述活性测定方法测定活性，如果确认与具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽具有同样的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性即可。

具体来说，上述部分多肽可以通过常用的基因工程手法使含有序列1或20所示氨基酸序列中的任意部分的多肽表达，然后利用上述活性测定方法对该多肽进行鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性测定，根据测定结果通过选择表现该活性的多肽可以获得。作为使这样的部分肽表达的手法如将终止密码子导入编码序列1或20所示氨基酸序列的核酸(例如，序列2或19)的任意位置，使其表达的手法；利用限制酶等将对应所希望的部分肽的区域切出，导入到适当的表达载体之后，使其表达的手法。

另外通过利用上述活性测定方法测定活性，只要是确认有与具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽有同样的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性，(b)由具有序列1或20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置换1个氨基酸残基的氨基酸序列构成的多肽也包括在本发明的范围内。

上述“变异”如果是得到的多肽具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性那样的变异，即使有2个以上的变异也可以。这里的“具有变异的氨基酸序列”意思为含有来自天然的变异以及人为导入变异的氨基酸序列。而“至少一个”意思包括一个或多个，或更多。

上述“变异”是使用下面叙述的本发明的核酸，具体来说使用编码序列1或20所示氨基酸序列的核酸，通过下面叙述的随机变异导入方法、部位特异的变异导入方法等生成的。

另外通过用上述活性测定方法测定活性，只要是确认与具有序列20所示氨基酸序列的多肽有同样的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性，(c)至少具有与序列20所示氨基酸序列有25％，比较好的有30％以上，更好的有35％以上序列同一性的多肽也包括在本发明的范围内。

另外上述(c)多肽与序列1所示氨基酸序列比较时，至少有25％，比较好的有30％以上，更好的有35％以上序列同一性。

而在本发明说明书中，所谓的“序列同一性”指的是两个聚合性分子，具体来说，两个聚核苷酸之间或两个多肽之间的残基的序列类似性。上述“序列同一性”通过在比较对象的氨基酸序列或碱基序列的区域内，比较在最适状态下排列的两个氨基酸序列或碱基序列决定的。这里，比较对象聚核苷酸或多肽与用于两个序列的最适排列的参考序列(例如公有序列等)比较，即使含有附加或缺失(例如帽子、突出端)也可以。

序列同一性的数值(百分数)可以通过决定存在于两方序列中相同的核酸序列之后，决定符合位置数，然后用比较对象的序列区域内的碱基的总数除上述的符合位置数，得到的数值乘以100算出。作为为获得最适排列以及同源性的算法如Smith等人的局部同源性算法[Add.APL.Math.，第2卷、第482页(1981)]、Pearson等人的同源性检索法[Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe USA、第85卷、第2444页(1988)]等。更具体来说如dynamicprognamming method法、gap penalty method法、BLAST算法、FASTA算法等。

多肽间的序列同一性可以使用序列解析软件，具体来说如BLASTP、FASTA等测定。而核酸间的序列同一性可以使用序列解析软件，具体来说如BLASTN、FASTA等测定。上述的BLASTP和BLASTN在主页网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/、FASTA在主页网址http://www.ddbj.nig.ac.jp中一般都可以利用。

另外在本发明中也包括与序列20所示氨基酸序列之间具有至少25％、比较好的30％以上，更好的35％以上序列同源性的多肽。

另外，在本发明中也包括与序列1所示氨基酸序列之间具有至少25％、比较好的30％以上，更好的35％以上序列同源性的多肽。

具有上述序列同源性的多肽在鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列中即使具有保守置换的多肽也可以。上述“保守置换”包括与具有类似的性质(即在疏水性、电荷、pK、立体构造上的特征)的氨基酸置换；与只要是维持原有多肽生理活性的程度，没有使该多肽的立体结构、折叠构造变化的氨基酸置换。作为保守置换如在①甘氨酸、丙氨酸；②缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；③天冬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺；④丝氨酸、苏氨酸；⑤赖氨酸、精氨酸；⑥苯丙氨酸、酪氨酸的组内的置换。

上述的“序列同源性”可以通过序列解析软件，例如BLAST[Journal of Molecular Biology、第215卷、第403-410页(1990)]、FASTA[Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA、第85卷、第2444-2448页(1988)]等决定。

本发明的核酸是编码具有上述鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸，称之为具有编码具有上述鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的碱基序列的核酸。例如编码来自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的核酸，具体来说如(A)编码具有序列1或20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽的核酸；

(B)编码由在序列1或20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置换一个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的核酸；

(C)编码与序列1或20所示氨基酸序列相比至少具有25％序列同一性的多肽的核酸；

(D)具有序列2或19所示碱基序列或其一部分序列的核酸。

编码具有上述序列20所示氨基酸序列的多肽的核酸以及具有序列19所示碱基序列的核酸，如对应于具有序列2所示碱基序列的核酸中的碱基号1～2031碱基序列。

而具有上述序列2所示碱基序列的核酸可以从带有该核酸的质粒pSCD44转化的大肠杆菌JM109[Escherichia coli JM109/pSE5]获得。这样的“用携带有上述序列2所示碱基序列核酸的质粒pSCD44转化的大肠杆菌JM109”被命名为Escherichia coli JM109/pSE5，以FERM BP-7717于2001年8月24日[2000年9月22日(原保藏日)]按照布达佩斯条约寄托于独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物寄托中心[邮政编码305-8566日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6]。

在本发明中通过用上述活性测定方法测定活性只要是确认具有与具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽同样的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性，(E)具有在序列1或19所示碱基序列中至少缺失、附加、插入或置换一个碱基的碱基序列的核酸也包括在本发明的核酸中。上述(E)的核酸希望是在序列2或19所示碱基序列中，作为可被翻译成氨基酸序列的形式中具有至少缺失、附加、插入或置换一个碱基的碱基序列的核酸。

这里所谓的“具有置换、缺失、附加或插入的碱基序列”包括导入来自天然的变异以及人为变异的碱基序列。而“至少一个”意思包括一个或多个，或更多。上述“变异”可以通过下面叙述的随机变异导入方法、部位特异的变异导入方法等生成的。

而所谓的“翻译成氨基酸序列形式”指的是通过缺失、附加或插入，原来的开放阅读框不错位，或者维持原来具有的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性程度的读框移位。

通过用上述活性测定方法测定活性只要是确认与具有序列1或20所示氨基酸序列的多肽有同样的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性，(F)在严格条件下可与上述(A)～(E)中任一项记载的核酸或其互补链杂交的核酸也包括在本发明的核酸中。

在上述杂交中作为探针可以使用上述(A)～(E)中任一项记载的核酸或其互补链的全部一部分。这里的“上述(A)～(E)中任一项记载的核酸或其互补链的一部分”只要是具有对本发明的核酸特异的序列的都可以。而作为探针也可以使用可以特异结合上述(A)～(E)中任一项记载的核酸的寡核苷酸探针。

所谓的“在严格条件下进行杂交”指的是在1989年Cold SpringHarbor Laboratory发行T.Maniatis等人编辑的MolecularCloning：A Laboratory Manual 2nd ed.等记载的条件下可进行杂交的条件。具体来说，如指的是在以下条件可进行杂交。即，将固定有核酸的膜于含有0.5％ SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％ Ficol 400、0.01％变性的鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC表示0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)中，于50℃下与探针一起温育12～20小时。温育结束后于含有0.5％ SDS的2×SSC中，于37℃下开始洗，SSC浓度在0.1倍浓度之内范围，而温度在50℃以下范围内变化，直至达到来自固定的核酸的信号可以与背景区别的程度之后，洗净膜，进行探针的检测。

经杂交得到的新的核酸通过利用上述活性测定方法对该核酸编码的多肽具有的活性进行测定，可以确认得到的核酸是否是目的核酸。

而使用寡核苷酸探针时，作为上述“严格条件”没有特别限定，如于含有6×SSC、0.5％ SDS、5×Denhardt、0.01％变性的鲑鱼精子DNA的溶液中，在[Tm-25℃]温度下保温过夜的条件。

寡核苷酸探针的Tm在探针为18个核苷酸以上的链长时，例如可以通过下式(I)求出：

Tm＝81.5-16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(％G+C)-(600/N)(I)

(式中，N为寡核苷酸探针的链长，％G+C是寡核苷酸探针引物中的鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含量)。

当寡核苷酸探针的链长比18个核苷酸短时，Tm可以通过A+T(腺嘌呤+胸腺嘧啶)残基的含量与2℃的乘积，和G+C残基的含量与4℃的乘积的和[(A+T)×2+(G+C)×4]推定。

而在本发明中通过用上述活性测定方法测定活性，只要是确认与序列20所示的氨基酸序列的多肽有同样的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性，(G)具有由于简并而与上述(A)～(F)中任一项记载的核酸不同的碱基序列的核酸也包括在本发明中。

基因上确定氨基酸的密码子(3个碱基的组合)对于每一种氨基酸可能存在1～6种，这已为人们所知。所以编码某一个氨基酸序列的核酸由于其氨基酸序列的不同可能存在多个。核酸并不是在自然界以稳定形式存在的，其碱基序列发生变异也不稀少。有时也存在核酸上发生变异不会引起其编码的氨基酸序列的变化的时候(也称为沉默变异)，此时可以认为是生成了编码同一氨基酸序列的不同核酸。因此即使分离到编码某一特定氨基酸序列的核酸，含有该核酸的生物在传代的过程中生成编码同一氨基酸序列的多种核酸的可能性也不能否定。另外使用各种基因工程手法人为制作编码同一氨基酸序列的核酸并不困难。

而通过用上述活性测定方法测定活性，只要是确认与具有序列20所示氨基酸序列的多肽有同样的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性，(H)至少与上述(A)～(G)中任一项记载的核酸的碱基序列有17％，比较好的20％以上，更好的23％以上序列同一性的碱基序列的核酸也包括在本发明的范围内。

序列同一性通过上述手法可以求出。

利用本发明的核酸可以大量获得鞘脂神经酰胺脱酰基酶。例如在基因工程的蛋白质生产中，编码目的蛋白质的原来的核酸上使用的密码子在宿主中使用频率低的时候，有时蛋白质的表达量低。这样的情况下不要改变被编码的氨基酸序列，而要通过人为地将密码子变换为宿主频繁使用的密码子，就可以进行目的蛋白质的高表达(例如，特公平7-102146号公报)。不用说人为地制作这样的编码特定氨基酸序列的多种核酸是可能的，即使在自然界中也可以生成。

本发明通过阐明鞘脂神经酰胺脱酰基酶的一级结构和基因结构，向本发明的基因导入随机的变异或部位特异的变异，获得编码具有编码在天然的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列中缺失、附加、插入或置换一个以上氨基酸残基的多肽的基因是有可能的。通过这样操作获得编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性，最适温度、稳定温度、最适pH、稳定pH等性质变化少的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的基因是有可能的，通过基因工程手段制造这些鞘脂神经酰胺脱酰基酶已成为可能。

作为随机变异导入方法，例如可以使用通过用亚硫酸氢钠进行化学处理，引起胞嘧啶碱基置换为尿嘧啶碱基的置换变异的方法[Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、第79卷、第1408-1412页(1982)]、在含有锰的反应液中进行PCR，使DNA合成时的核苷酸整合正确性降低的方法[AnalyticalBiochemistry、第224卷、第347-353页(1995)]等。

作为部位特异的变异导入方法例如可以使用利用琥珀变异的方法[gapped duplex法、Nucleic Acids Research、第12卷、第9441-9456页(1984)]、利用缺失dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶-DNA糖基化酶)基因的宿主的方法[Kunkel法，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA、第82卷、第488-492页(1985)]、通过利用琥珀变异的PCR的方法(国际公开第98/02535号册)等。利用这些方法将部位特异的变异导入目的基因的各种试剂盒都有商品销售，通过利用这样试剂盒可以容易地获得导入所期望变异的基因。

以下就利用杂交法获得来自微生物的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的方法进行说明。

首先作为制作用于克隆鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的探针的信息，调查鞘脂神经酰胺脱酰基酶的部分氨基酸序列。将纯化的鞘脂神经酰胺脱酰基酶原封不动地提供给按照常规方法使用Edman降解法[Journal of Biological Biochemstry、第256卷、第7990-7997页(1981)]进行的氨基酸序列分析，或者是使赖氨酰内肽酶或N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲酮(TPCK)-胰蛋白酶等底物特异性高的蛋白水解酶作用，进行有限水解，对得到的肽混合物中分离纯化出的纯化肽片段进行氨基酸序列分析。

以阐明的部分氨基酸序列信息作为基础设计出作为杂交用探针使用的寡核苷酸，进行化学合成。

制备生产鞘脂神经酰胺脱酰基酶的微生物的基因组DNA，用适当的限制酶进行完全消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离之后，按照常规方法转移印迹在尼龙膜上。该尼龙膜上的DNA片段与上述合成的寡核苷酸探针的杂交在一般的条件下进行。例如在含有鲑鱼精子DNA的预杂交溶液中将尼龙膜封闭之后，与³²P标记的合成寡核苷酸探针一起保温过夜。将该尼龙膜洗净后，作成放射自显影照片，检测与合成寡核苷酸探针杂交的DNA片段。

将对应于放射自显影照片上信息的DNA片段从琼脂糖凝胶中提取、纯化。将这样获得的DNA片段通过常用的方法整合到载体、例如质粒载体中，制作重组DNA分子。载体可以使用市场上的各种载体。然后将该重组DNA分子导入适当的宿主、例如大肠杆菌，得到转化体。转化的方法可以从通常使用的方法、例如从上述Molecular Cloning：ALaboratory Manual第二版等记载的方法中选择对应于使用的载体的方法。

接下来，选择具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因片段的转化体。选择的方法根据载体的种类可以使用菌落杂交、噬斑杂交等。另外也可以使用以菌落或噬斑作为起始材料的PCR法或以鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性表达作为指标的方法。

从含有鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因片段的转化体制备整合了该片段的重组DNA分子，对该片段的碱基序列进行解析。碱基序列的解析可以使用通常的方法、例如双脱氧法决定。通过将决定的碱基序列与先前得到的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的部分氨基酸序列和鞘脂神经酰胺脱酰基酶的分子量等进行比较，确定得到的DNA片段是目的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的全部，还是其一部分。

当得到的DNA不含有鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的全长时，可以用该片段的一部分作为探针，在用其他限制酶对基因组DNA消化后同样进行杂交等，利用得到的缺失的部分可以获得目的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因全长。从这样获得的含有鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的DNA片断就可以确定鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的结构以及鞘脂神经酰胺脱酰基酶的总氨基酸序列。

除了上述那样的杂交法之外，通过PCR法也可以得到本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因。例如通过使用根据鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端氨基酸序列和内部部分氨基酸序列设计的引物的PCR法，和使用这些引物以及盒式DNA和盒式引物的PCR法可以获得鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因。

另外具有序列2所示碱基序列的核酸可以通过以序列2所示碱基序列为基础的化学合成法制作。

在通过化学合成制作由序列2所示碱基序列构成的核酸时，例如可以通过常用的亚磷酰胺法(phosphoramidite)等、通过酶学方法使化学合成的寡核苷酸连接合成上述核酸。具体来说，例如可以通过如下工序制作由序列2所示碱基序列构成的核酸。

(1)通过常用的化学合成法分别合成可包含序列2所示碱基序列的数十种寡核苷酸An(n为正整数)和与该An序列的3’端或5’端错开数个碱基的碱基序列互补的序列构成的与该An相同链长的寡核苷酸，通过与该寡核苷酸An退火，生成具有5’突出端或3’突出端的双链DNA的互补链寡核苷酸a_n(n为正整数)的工序；

[例如，上述An是分别由序列2的碱基序列1～20(A₁)、21～40(A₂)、41～60(A₃)、61～80(A₄)、81～100(A₅)、101～120(A₆)、121～140(A₇)、141～160(A₈)……2841～2862(A₁₄₃)构成的核酸，

而上述a_n是分别由序列2的碱基序列1～23(a₁)、24～43(a₂)、44～63(a₃)、64～83(a₄)、84～103(a₅)、104～123(a₆)、124～143(a₇)、144～163(a₈)……2843～2862(a₁₄₃)构成的寡核苷酸等的互补链]

(2)使用ATP和常用的T4聚核苷酸激酶对上述工序(1)中得到的各个寡核苷酸An和对应的互补链寡核苷酸an的各个5’末端进行磷酸化的工序；

(3)使上述工序(2)中得到的各个寡核苷酸An和对应的互补链寡核苷酸an退火，得到数十种“具有5’突出末端或3’突出末端的双链DNA(A_na_n)”的工序；

(4)将上述工序(3)得到的双链DNA(A_na_n)，依照n增加的顺序与序列2所示的碱基序列对应，分为数区段，对应于各个区段将上述工序(3)得到的双链DNA(A_na_n)收到一个试管中的工序；

[例如，设定寡核苷酸A₁～A₄和互补链a₁～a₄的试管，

寡核苷酸A₅～A₈和互补链a₅～a₈的试管，

寡核苷酸A₉～A₁₁和互补链a₉～a₁₁的试管，

寡核苷酸A₁₄₀～A₁₄₃和互补链a₁₄₀～a₁₄₃的试管]

(5)对应于上述(4)工序的各个区段的每个试管，对双链DNA进行连接，由此可以得到对应于各个区段的双链DNA的工序；

(6)将上述工序(5)得到的双链DNA进行凝胶电泳，从凝胶中提取具有对应于各个区段的目的链长的双链DNA带的工序；

(7)将具有对应于上述工序(6)得到的各个区段的目的链长的双链DNA归于一处进行连接的工序；

(8)对上述工序(7)得到的DNA通过凝胶电泳检查链长，和/或进行碱基序列解析，确认是由序列2所示碱基序列构成的DNA的工序。

下面以来自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的情况为例进行具体地说明。

首先对海藻希瓦氏菌G8生产的鞘脂神经酰胺脱酰基酶进行纯化。将海藻希瓦氏菌G8用通常使用的液体培养基[PY培养基(组成：0.5％多胨、0.1％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH7.2)]于25℃下进行培养，将得到的培养上清进行浓缩，经通常使用的柱层析对鞘脂神经酰胺脱酰基酶进行纯化。

然后确定鞘脂神经酰胺脱酰基酶的部分氨基酸序列。上述鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端氨基酸序列其对应的密码子种类很多，引物序列的组合变得很大。使用上述引物进行PCR时，由于生成很多非特异性的扩增产物，从这些产物中鉴定来自目的基因的产物是困难的。

本发明人为了获得相应的密码子简并少的序列，作为用于引物设计的氨基酸序列，使用以蛋白质水解酶或溴化氰为代表的蛋白质有限分解用试剂进行肽谱分析，然后尝试引物的设计。于是本发明人以得到的氨基酸序列作为基础合成寡核苷酸引物，即分别合成根据鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端氨基酸序列C603(序列7)设计的寡核苷酸引物SS2a(序列9)、根据部分氨基酸序列C606(序列3)设计的寡核苷酸引物SA3(序列13)。以海藻希瓦氏菌G8的基因组DNA为模板，通过使用上述两种引物进行PCR，可以得到特异扩增的DNA片段。研究该片段的碱基序列，通过对该序列与得到的有关鞘脂神经酰胺脱酰基酶的上述以外的部分氨基酸序列进行比较，可知该片段包含编码鞘脂神经酰胺脱酰基酶的基因的一部分。

通过以该扩增的DNA片段作为探针进行杂交等可以克隆编码鞘脂神经酰胺脱酰基酶全长的基因。

序列15给出了通过以上操作得到的编码来自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的全部碱基序列。而序列14给出了通过该碱基序列推定的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列。另外，通过与来自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端氨基酸序列进行比较，可知该菌株生产的鞘脂神经酰胺脱酰基酶是由翻译后除去N末端38个氨基酸构成的多肽后转换的成熟型酶。序列1为该成熟型的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列，而序列2给出了上述的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的碱基序列中，编码成熟型鞘脂神经酰胺脱酰基酶的部分碱基序列。而来自海藻希瓦氏菌G8的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列以及编码该序列的碱基序列，由于没有观察到与众所周知的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列以及碱基序列有显著的同源性，表明上述来自海藻希瓦氏菌G8的酶是属于新家族的鞘脂神经酰胺脱酰基酶。

另外从上述序列1给出的氨基酸序列使C末端的277个氨基酸缺失的多肽(C末端缺失体多肽)也具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性。序列20给出了上述C末端缺失体多肽的氨基酸序列，而序列19给出了碱基序列。

这样一来，在本发明中，由于编码鞘脂神经酰胺脱酰基酶的核酸的总碱基序列被确定，使用该鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的全部或其一部分作为杂交用探针，可以从由海藻希瓦氏菌G8菌株以外的生物体得到的基因组DNA或cDNA文库中选择出与鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因同源性高的DNA。杂交可以在一般常用的条件下进行。例如使用海藻希瓦氏菌G8菌株以外的生物体得到的基因组DNA或cDNA文库在上述严格条件下使其杂交，可以得到表现出各种各样同源性的基因。

另外，可以由本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的碱基序列设计PCR用的引物。通过使用该引物进行PCR可以检测出与本发明的基因同源性高的基因片段，也可以得到该基因全部，另外对生产鞘脂神经酰胺脱酰基酶的生物进行检测也是有可能的。

为了确认通过上述杂交、或者PCR得到的基因是否是编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因，可以通过将得到的基因的碱基序列与本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的碱基序列或氨基酸序列进行比较进行推定。而利用下述记载的方法，制作得到的基因编码的多肽，通过测定鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性可以确认是否是目的基因。

将编码本发明的多肽的核酸，例如具有序列2或序列19所示碱基序列的核酸与适当的载体进行连接，可以制作重组DNA。这样的重组DNA也包括在本发明的范围内。

作为在上述重组DNA的制作中使用的载体如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，可以根据重组DNA的使用目的进行适当的选择。

例如当作为导入上述重组DNA的对象的宿主为大肠杆菌时，作为载体可以使用pUC118、pUC119、pBR322、pCR3、pCMVSPORT等质粒载体；λZAPII、λgtII等噬菌体载体。宿主为酵母时，作为载体可以使用pYES2、pYEUra3等。宿主为昆虫时可以使用pAcSGHisNT-A等。宿主为动物时可以使用pKCR、pEFBOS、cDM8、pCEV4等。在这样的载体中即使含有适当的可诱导的启动子、选择标记、终止子等因子也可以。

从容易、而且可大量制造本发明的多肽的观点出发，可以使用能够使外源基因诱导表达的载体；能够使作为与报告基因产物等的融合蛋白表达的载体等。

使作为融合蛋白表达的可能的载体如具有在宿主内发挥作用的合适的启动子(1ac启动子、tac启动子、trc启动子、trp启动子、CMV启动子、SV40初期启动子等)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白载体(pGEX4T等)；具有上述适当启动子的标记(His标记等)序列的载体等。

另外通过本发明的核酸或者本发明的重组DNA也提供携带该核酸或重组DNA的细胞导入用载体。这样的细胞导入用载体也包括在本发明的范围内。本发明的细胞导入用载体具体来说可以由携带本发明的核酸或本发明的重组DNA的载体构成。作为上述载体如脂质体、HVJ-微脂粒、葡聚糖、磷酸钙、金粒子等。

另外将本发明的核酸或本发明的重组DNA，或者本发明的细胞导入用载体导入适当的宿主后可以制作转化体。上述转化体是携带本发明的核酸或本发明的重组DNA的转化体，包括在本发明中。

作为使用的宿主如细菌(例如大肠杆菌K-12系统的HB101菌株、C600菌株、JM109菌株等)、酵母(酿酒酵母等)、线状菌等微生物以外，也可以使用哺乳动物的培养细胞(L、3T3、FM3A、CHO、COS、Vero、Hela等)、植物的培养细胞、昆虫的培养细胞(sf9等)等。

而作为向宿主导入重组DNA的导入方法可以使用众所周知的导入方法，例如磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电脉冲法等。

通过上述转化体可以提供具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的制造方法。这样的具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的制造方法也包括在本发明中。

具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性多肽的制造方法的一大特征包括，在适合鞘脂神经酰胺脱酰基酶表达的条件下对上述转化体进行培养，从得到的培养物中提取具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的工序。尤其是由于使用了本发明的转化体可以高效而且大量地获得具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽。而由于使用表达载体，在异源宿主中可使SCDase特异表达，例如与假单胞菌属TK-4[特开平8-84547号公报，J.Biol.chem..、270(41)、24370-24374(1995)]情况相比，在SCDase的表达中可以发挥不需要诱导SCDase产生的物质(唾液酸基GM1等神经节苷脂)，不同时生产鞘磷脂酶等的SCDase以外的蛋白质，不生产来自培养基的脂肪酸或来自诱导物质的脂肪酸，且纯化容易的优良效果。

在本发明的制造方法中当该转化体是微生物或培养细胞时，通过确定有关培养基组成、培养基的pH、培养温度、培养时间以及诱导剂的使用量、使用时间等鞘脂神经酰胺脱酰基酶表达的最适条件，可以有效地生产具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽。

在从转化体培养物纯化具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽过程中使用了通常的方法。当具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽蓄积在象大肠杆菌那样的转化体细胞内时，可以在培养结束后，通过离心分离收集转化体细胞，得到的细胞经超声处理破碎后，通过离心分离得到无细胞提取液。以该提取液为起始材料，可以通过盐析法以及离子交换、凝胶过滤、疏水、亲和等各种层析等一般的蛋白质纯化法进行纯化。有时通过使用的转化体可以将表达产物分泌到细胞外。这种情况下，从培养上清中同样可以进行纯化。

在转化体生产的具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽中，虽然在该多肽在细胞内生产的时候同时还存在着很多酶、蛋白质，但这些酶和蛋白质的量与表达的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的量相比是很微量的，所以具有纯化非常容易的优点。另外作为载体使用菌体外分泌型的载体时，鞘脂神经酰胺脱酰基酶被分泌到菌体外，在含有鞘脂神经酰胺脱酰基酶的级分中还同时存在着培养基成分。但这些成分通常几乎不含有妨碍鞘脂神经酰胺脱酰基酶纯化那样的蛋白质成分，所以具有诸如不需要由海藻希瓦氏菌G8菌株的培养物纯化鞘脂神经酰胺脱酰基酶所必需的繁琐的分离纯化操作的优点。

另外，例如宿主为大肠杆菌时，有时表达产物形成不溶性的包涵体(inclusion body)。此时，可以在培养结束后通过离心分离收集菌体，然后菌体经超声处理破碎后，通过离心分离收集含有包涵体的不溶性级分。接下来将包涵体洗净后，用通常使用的蛋白质增溶溶解剂，例如尿素和盐酸胍盐等进行增溶溶解，根据需要可将溶解的样品通过离子交换、凝胶过滤、疏水、亲和等各种层析进行纯化，然后通过使用透析法或稀释法等重折叠操作，可以得到含有保持鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的标准样品。根据需要如果通过各种层析对标准样品再进一步纯化的话，可以得到高纯度的具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽。

鞘脂神经酰胺脱酰基酶表达的确认可以通过测定鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性来进行。活性测定，例如可以以转化体的细胞提取液作为样品，使用Journal of Biological Chemistry、第270卷、第24370-24374页(1995)记载的方法进行。另外也可以使用抗鞘脂神经酰胺脱酰基酶抗体，但当使鞘脂神经酰胺脱酰基酶以与其他多肽形成的融合体表达时，可以使用抗该多肽部分的抗体。在使用抗体时，例如可以将转化体的细胞提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，可以于该膜上使用抗体进行检测。

另外通过本发明的核酸可以提供可以特异检测鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的寡核苷酸探针或引物。上述寡核苷酸探针或引物在严格的条件下可以与本发明的核酸或与该核酸互补的核酸杂交。这里的严格条件只要是上述的“使用寡核苷酸探针时的严格条件”就可以。

而适于上述寡核苷酸探针或引物的序列可以在使用众所周知的软件、例如Oligo Primer Analysis Software(宝酒造公司制造)等，考虑二级结构的形成、Tm值、对本发明的核酸的特异性等之后可以得到。

上述寡核苷酸探针可以以本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的碱基序列作为基础进行设计，例如利用常规方法通过化学方法合成制作。

上述寡核苷酸探针的链长没有特别限定，从防止非特异性的杂交的观点出发，链长最好是至少连续15个核苷酸、即连续15个核苷酸以上的链，链长在18个核苷酸以上更好。

而在本发明的引物中也可以是具有与上述寡核苷酸探针同样的碱基序列的核酸。例如，可以通过以本发明的基因的碱基序列作为基础进行设计、化学合成等制作。对于引物的链长没有特别限定，例如可以使用至少连续15个核苷酸的链，具体来说可以使用15～40个核苷酸碱基的链长的引物，特别是17～30个核苷酸链长的引物更合适。上述引物可以用于PCR法为首的其他各种基因扩增法中，具有通过该引物可以特异检测鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的优越性质。

而作为上述寡核苷酸探针或引物也可以使用对编码来自天然的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的核酸通过进行限制酶、外切核酸酶等酶处理、超声处理等物理处理切断，得到的片段经以琼脂糖凝胶等为代表的各种核酸分离法分离纯化后得到的核酸。象上述那样得到的核酸最好是来自具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶特有序列的区域。

上述寡核苷酸探针或引物按照众所周知的方法实施适当的标记，可以用于本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的检测。标记没有特别限定，可以使用放射性同位素以及荧光物质、生物素或异羟基洋地黄毒那样的配基等。

通过本发明的寡核苷酸探针或引物可以提供编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的检测方法。本发明的检测方法其一大特征是使用上述的寡核苷酸探针和/或引物，利用探针和引物可以检测被检测样品中的基因。更具体地讲，如使含有核酸的被检测样品与本发明的寡核苷酸探针接触，然后对核酸与寡核苷酸探针的杂化体进行检测的方法，或将含有核酸的被检测样品作为模板样品，利用本发明的引物进行核酸扩增的方法。

在本发明的检测方法中使用上述寡核苷酸探针于严格条件下的杂交法等可以进行基因的检测，或使用上述引物通过PCR法等DNA扩增方法进行基因的检测。另外即使将两者组合用也可以。

使用寡核苷酸探针时，作为被检测样品可以是诸如微生物的菌落和组织切片那样的样品，将这样的样品中的DNA或RNA固定于膜上的被检测样品，从这些样品提取出的DNA或RNA等。而从样品的稳定性的观点看，固定于膜上的DNA或提取的DNA比较好。

使用寡核苷酸探针时，通过在上述的严格条件下进行杂交可以进行基因的检测。

使用引物时，作为被检测样品可以是如微生物培养液、微生物菌落、微生物菌体那样的微生物样品、皮肤、组织、组织切片那样的来自生物体的样品等。

使用上述引物时的被检测样品例如可以原封不动地直接使用分离的微生物，也可以实施适当处置之后使用。而象组织那样的固体样品可以在制备出浸出液或悬浮液之后使用。而这些样品的上清或这些样品经表面活性剂处理那样的细胞溶解处理后的样品或其上清也可以使用。另外在不损伤作为检测对象的核酸的范围内可以进行除去样品中其他成分的操作。

当使用上述引物通过PCR法进行检测时，PCR条件可以根据使用的引物的Tm值、扩增检测对象的区域的长度等进行适当地选择。

使用上述引物时，可以通过PCR法等DNA扩增方法进行扩增，通过确认PCR扩增产物的有无进行检测。扩增有无的确认方法没有特别限定，例如可以通过将核酸扩增反应液进行琼脂糖凝胶电泳后，凝胶用适当的核酸染色液，例如溴化乙锭、SYBER Green I等染色，通过检测照射紫外线后有无带生成确认。带的检测可以用肉眼观察，也可以使用荧光影像分析仪等进行检测。

在本发明的检测方法中，为了提高检测灵敏度，可以并用上述探针和引物。例如使用上述引物，利用PCR法对样品中存在的微量的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因进行扩增，然后使用探针与该基因进行杂交可以高灵敏度而且正确地进行检测。

通过本发明的检测方法对鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因进行检测，进一步确定该基因表达量时，可以通过对在严格条件下来自杂交的探针的信号强度、对来自使用引物扩增的产物的带的荧光强度等定量来进行。

用于本发明的核酸检测方法的试剂盒其特征之一是含有上述寡核苷酸探针和/或引物。

在本发明的试剂盒中可以含有用于固定核酸的膜或杂交缓冲液等为代表的杂交用各种试剂、耐热性DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR用缓冲液等为代表的PCR用试剂、探针和用于检测扩增DNA的试剂或微生物增殖用的培养基，用于从样品中提取核酸的试剂等。

另外通过本发明的多肽、或使本发明的核酸表达得到的多肽可以提供与该多肽特异结合的抗体或其片段。这样的抗体或其片段也包括在本发明中。

本发明的抗体或其片段只要是具有特异结合多肽能力即可，没有特别限定，无论是多克隆抗体、还是单克隆抗体都可以。另外也可以使用利用众所周知技术修饰的抗体或抗体的衍生物，例如人源化抗体、Fab片段、单链抗体等。本发明的抗体可以使用例如1992年JohnWeily & Sons，Inc.发行的、John E.Coliga编辑、Current Protocolsin Immunology记载的方法，用本发明的多肽的全部或其一部分对兔或鼠进行免疫很容易制作。也可以通过基因工程技术制作抗体。另外也包括可以与多肽的某一部分片段特异结合的抗体或其片段。

进一步将得到的抗体纯化后，经肽酶处理可以得到抗体的片段。至于得到的抗体或其片段的用途，可以考虑用于鞘脂神经酰胺脱酰基酶生产菌的检测、亲和层析、各种文库(基因组DNA或cDNA)的筛选、药物、诊断药、研究用药等方面的应用。

另外本发明的抗体或其片段为了使其通过酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法容易检测，可以进行各种修饰。

本发明的多肽的检测方法其特征是使用上述抗体或其片段，通过他们可以对具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽进行检测。具体来说，使含有多肽的被检测样品与上述抗体或其片段接触，对多肽与抗体或其片段的复合体进行检测。

在本发明中，作为被检测样品可以使用诸如微生物的细胞破碎物、皮肤等组织的提取液或洗净液、固定了来自组织或微生物的蛋白质的膜等蛋白质样品。

抗体或其片段与上述多肽的特异结合的检测可以利用众所周知的方法，如酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法。

用于本发明的多肽的检测方法的试剂盒其特征之一是含有上述抗体或其片段。由于本发明的试剂盒含有上述抗体或其片段，所以对具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽进行特异、而且简便的检测成为可能。

在本发明的试剂盒中可以进一步含有反应用缓冲液、标记二次抗体、显色试剂等。

另外本发明的核酸有可能应用于与鞘脂代谢有关系的疾病，例如神经系统疾病(例如神经变性疾病等)、白血病、创伤等疾病的治疗。就是说，可以提供含有本发明核酸作为有效成分的用于与鞘脂代谢有关系的疾病，例如神经系统疾病(例如神经变性疾病等)、白血病、创伤等疾病的治疗剂，以及在与鞘脂代谢有关系的疾病，具体来说如神经系统疾病(例如神经变性疾病等)、白血病、创伤等疾病的治疗方面应用本发明的核酸。

上述治疗剂可以是使该有效成分装载到可稳定维持上述有效成分的载体后得到的制剂，例如，上述细胞导入用载体等。具体来说，如可以将有效成分装载到可容易向作为投药对象的个体、器官、局部部位、组织等生物体导入的药学上容许的载体上。另外在治疗剂中根据该治疗剂投药必需的状态、疾病[例如神经系统疾病(例如，神经变性疾病等)、白血病、创伤等]；以及相应于作为投药对象的个体、器官、局部部位、组织还可以包含其他的助剂。具体来说，含有在直到到达使有效成分效果表达的对象部位之前的时间内，药学上容许的表现出抑制该核酸分解的性质的助剂、赋形剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、溶解辅助剂、等渗剂等。有效成分的含量根据投药必需的状态、疾病；作为投药对象的个体、器官、局部部位、组织；作为投药对象的个体的年龄等可进行适当选择。

作为上述治疗剂的投药方式可以是局部投药、皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射等。

当将本发明的核酸用于与鞘脂代谢有关系的疾病，例如神经系统疾病、白血病、创伤等疾病的治疗时，可以使用将该核酸装载到例如病毒载体、脂质体等适于导入细胞的载体上得到的治疗剂，然后将这样的治疗剂直接导入体内的方法，对于取自动物，例如哺乳动物的某种细胞可以使用于体外导入治疗剂，然后将得到的细胞返回体内的方法。

以下举些实施例对本发明进行具体说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。

实施例1

生产鞘脂神经酰胺脱酰基酶的微生物的检索

将从各地收集的样品(海水、河水、或生活在海水、河水的生物的体表或消化道等)悬浮于灭菌的生理盐水中。将得到的悬浮液10μl接种到在Eppendorf管中加有0.01％神经酰胺、0.05％NH₄Cl、0.05％K₂HPO₄、0.1％酵母提取液、2.0％NaCl、0.01％TDC、pH7.0的液体培养基400μl中，于25℃下振荡培养4天。然后测定鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性(也称之为SCDase)，选择具有活性的培养液。

用NBD-GM1作为底物测定上述培养液中SCDase活性。NBD-GM1是用NBD(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)对神经酰胺的脂肪酸部分进行标记的GM1，按照Journal of Biochemistry、第126卷、第604-611页(1999)记载的方法进行制备。

而活性测定象下述那样进行。即，向含有0.1％的TritonX-100和NBD-GM1 100pmol的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)10μl中加入酶液10μl，于37℃温育一定时间。然后于100℃下煮沸5分钟，终止反应，使用真空离心蒸发浓缩器使反应液完全干燥。加入15μl的氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，通过超声处理使反应生成物溶解。将得到的溶解物点到硅胶TLC板上。然后用氯仿/甲醇/0.2％CaCl₂(5/4/1、v/v)展开后，使用岛津色谱扫描仪CS-9300测定(吸光度475nm)分解率。再通过「分解率(％)＝[游离的溶血GM1的面积×100]/[游离的溶血GM1的面积+未反应的GM1的面积]」公式求分解率。1个单位(U)定义为1分钟内分解1μmol的NBD-GM1的酶量。

上述那样选择的培养液用灭菌的生理盐水稀释后，将得到的稀释物涂布在平板培养基上。将涂布后的平板培养基于25℃培养2天，使其形成菌落。上述操作反复进行直至形成单一菌落，结果从长崎县小长井町的海砂采取的样品中分离出生产鞘脂神经酰胺脱酰基酶的海藻希瓦氏菌G8菌株。

实施例2

鞘脂神经酰胺脱酰基酶结构基因的克隆

(1)基因组DNA的提取纯化

将鞘脂神经酰胺脱酰基酶的生产菌海藻希瓦氏菌G8菌株接种到200ml的PY培养基(0.5％多胨、0.1％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH7.2)中，于25℃下培养22小时。培养结束后，经离心分离收集菌体，悬浮于10ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)。向得到的悬浮液中再加入50mg/ml的卵白溶菌酶溶液0.2ml，于30℃下反应15分钟。然后向反应结束后得到的溶液中加入2ml的10％SDS，平稳搅拌，在溶液具有粘性后立即加入10ml的TE缓冲液饱和酚和1.5ml的5M NaCl，于室温下缓慢搅拌1小时。搅拌后得到的溶液于2500rpm离心10分钟后，回收上层。向得到的上层中加入等量的氯仿后搅拌10分钟，然后于1500rpm离心10分钟后，回收上层，再向回收上层加入等量的氯仿搅拌后，离心分离后回收上层(以下将这一系列操作记载为酚-氯仿处理)。向回收的溶液慢慢地加入等量的异丙醇，用巴氏移液管吸取界面上析出的DNA，溶解于10ml的TE缓冲液中。向得到的溶液加入20μl的RNase A(使RNase A于10mMTris-HCl、pH7.5、15mM NaCl溶液中溶解，浓度为10mg/ml，于100℃下进行加热处理15分钟的溶液)，于50℃下保温1小时。通过向保温后得到的溶液加入10μl的20mg/ml蛋白酶K溶液、200μl的5MNaCl、400μl的10％SDS之后，于37℃下保温1小时，使其反应。将反应后得到的溶液恢复到室温，进行酚-氯仿处理。反复进行2次，向得到的水层中加入等量的异丙醇和1/10容量的3M醋酸钠，于-20℃下冷却1小时后，于10000rpm下离心分离，将得到的沉淀用70％的乙醇冲洗之后，溶解于TE缓冲液，作为基因组DNA溶液。通过这样的操作可以得到1.1mg的基因组DNA。

(2)鞘脂神经酰胺脱酰基酶的部分氨基酸序列的确定

对海藻希瓦氏菌G8菌株生产的鞘脂神经酰胺脱酰基酶进行纯化。海藻希瓦氏菌G8菌株于含有0.5％多胨、0.1％酵母提取物、2％氯化钠、0.1％牛脑丙酮粉末的培养基在25℃下培养22小时。培养结束后，培养液于8,300rpm下离心分离30分钟后，得到培养上清4.6升。该培养上清中的SCDase活性是55.5单位(U)。而SCDase的1个单位(unit)定义为1分钟内分解1μmol GM1的酶量。

使用Minitan-ultratiltration system(Millipore公司生产)的去除分子量10,000的超滤膜将上述得到的培养上清浓缩到1升，供于Butyl-Toyopeal 650M的柱层析((柱)床体积80ml)。首先向预先用含有2M氯化钠的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的柱子加浓缩后的培养上清样品。然后用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将柱子洗净，然后用含有2％Lubrol PX(ナカライテスク公司生产)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将吸附的SCDase洗脱出来。

收集活性级分，得到17.7U的SCDase。

然后将该活性级分加到预先用含有2％Lubrol PX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的DEAE-Sepharose(Amersham PharmaciaBiotech公司生产)柱子(30ml)上。用上述平衡缓冲液将柱子充分洗净后，用含有1M NaCl和0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将吸附的酶脱下来。

收集活性级分，得到13.5U的SCDase。

该级分经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，在相当于分子量75,000的位置处检测出SCDase的带。

利用上述的纯化方法最终可以得到收率为24％的纯化了1600倍的13.5U的SCDase。

将得到的SCDase进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后利用电印迹法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF(Immobilon-P、Millipore公司生产)膜上。将对应于该膜的SCDase带的部分(约50pmol)切出，通过在含有0.2mg的赖氨酰[基]内肽酶(リジルエンドペプチダ-ゼ)(0.9U)、8％乙腈的20mM Tris-HCl缓冲液100μl中振荡的同时，于37℃下保温16小时，进行酶消化。

将该酶消化液进行反相层析，进行肽段的纯化。将得到的肽段通过使用477型气相肽序列分析仪(Applied Biosystems公司生产)的Edman降解法进行分析，确定SCDase的内部部分氨基酸序列C-606(序列3)、C-599(序列4)、C-614(序列5)、C-616(序列6)。

另外与上述作法不同，对上述的PVDF膜不进行赖氨酰[基]内肽酶处理，供肽序列分析仪分析，确定了N末端氨基酸序列C-603(序列7)。

(3)对含有鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的DNA片段利用PCR法进行扩增

根据实施例2-(2)中确定的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端氨基酸序列以及内部部分氨基酸序列设计引物，用DNA合成仪进行合成。

即分别合成相对应于序列7所示C-603合成有义混合引物SS1(序列8)、有义混合引物SS2a(序列9)以及有义混合引物SS2b(序列10)，对应于序列3所示C-606合成反义混合引物SA1a(序列11)、反义混合引物SA1b(序列12)以及反义混合引物SA3(序列13)。

用这些引物进行PCR。在PCR中使用AmpliTaq Gold(ピ-イ-バイオシステムズ公司生产)按照附带的程序进行PCR的35循环反应，每一循环为：95℃ 0.3分钟、52℃ 0.5分钟、72℃ 1.5分钟。

用实施例2-(1)中得到的海藻希瓦氏菌G8菌株基因组DNA作为模板，使用引物SS2a与引物SA3；SS1与SA1a；SS1与SA1b；SS1与SA3；SS2a与SA1a；SS2a与SA1b；SS2b与SA1a；SS2b与SA1b；SS2b与SA3的组合进行PCR。结果检测出相当于对应于大约1,000bp的特异的带的扩增。

从琼脂糖凝胶电泳后的凝胶中回收上述的大约1,000bp的扩增DNA片段。将得到的DNA片段与pGEM-T easy载体(Promega公司生产)连接，制作重组质粒。以该质粒作为模板，通过双脱氧法确定上述的扩增DNA片段的碱基序列。

结果在得到的碱基序列中发现分别编码鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端氨基酸序列C-603、部分氨基酸序列C-606以及C-599的碱基序列，很清楚该扩增DNA片段是编码目的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的基因的一部分。

(4)含有鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的DNA片段的检测

用实施例2-(3)中得到的PCR扩增DNA片段作为探针，进行含有SCDase基因的基因组DNA片段的筛选。

首先对实施例2-(1)制备的基因组DNA5μg用限制酶ApaI、KpnI、SalI、EcoRV、BamHI、XbaI和SacI各100单位于37℃下消化22小时。将得到的限制酶消化的DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳后通过Southern blot法将DNA转移到尼龙膜[Hybond-N+、Amersham公司生产]上。作为杂交的探针使用DNA标记试剂盒[ReadyToGo、Amersham Pharmacia Biotech公司生产]按照附带的程序对实施例2-(3)得到的PCR扩增DNA片段0.1μg用³²P标记后的产物。

将上述尼龙膜于含有0.5M Church法磷酸缓冲液[Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA、第81卷、第1991-1995页(1984)]pH7.0、7％ SDS、1mM EDTA的杂交溶液中，在65℃下进行1小时以上的预杂交。然后加入上述的标记探针，终浓度为6fmol/ml，于65℃下杂交过夜。

然后于65℃加温的洗净液(1％ SDS、40mM磷酸钠缓冲液)中，65℃下反复洗3次，每次15分钟。将尼龙膜上残留的水分除去后，将膜与富士胶片公司生产的像纸(富士胶片公司生产)接触20分钟，使其曝光。将感光后的像纸用BAS1000图象分析仪(富士胶片公司生产)进行分析，对尼龙膜上的探针进行检测。结果可以确认来自与ApaI、KpnI、SalI、EcoRV、BamHI、XbaI和SacI各消化物中的分别为约10kb、约5kb、约2.3kb、约4.4kb、约10kb、约10kb、约4kb的位置杂交的探针的信号。

(5)鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的克隆

根据实施例2-(4)的结果对约4.4kb的EcoRV片段进行克隆。通过1％琼脂糖凝胶电泳对EcoRV消化的基因组DNA 10mg进行分离，切出对应于约4.4kb大小的物质的琼脂糖凝胶。使用Sephaglas BandPrep试剂盒(Amersham pharmacia biotech公司生产)从凝胶中提取纯化DNA片段，将该DNA片段插入到pBluescript II SK(东洋纺公司生产)的EcoRV部位，制作重组质粒。用上述质粒转化大肠杆菌JM109。然后于含有氨苄青霉素100μg/ml的L琼脂(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取液、1％NaCl、pH7.2、1％琼脂)板上培养过夜，从出现的菌落中选择300菌落，接种到置于同样培养基板上的尼龙膜[Hybond-N)、Amersham pharmacia biotech公司生产]上。于37℃下培养16小时后，将该尼龙膜放置在浸入了碱性变性溶液(0.5M NaOH、1.5MNaCl)的滤纸上进行5分钟(变性)处理，再于浸入了中和溶液(0.5MTris-HCl(pH7.5)、3M NaCl)的滤纸上进行5分钟(中和)处理后，用2×SSC(1×SSC组成：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)进行冲洗。

该尼龙膜用实施例2-(3)得到的PCR扩增DNA片段作为探针，在与上述同样的条件下进行杂交，得到了对应于2个菌落的信号。从其中一个菌落制备的质粒被命名为pSCD1，对该质粒中插入DNA片段的碱基序列进行确定。结果发现了分别对应于实施例2-(2)得到的氨基酸序列C-606、C-599、C-614、C-616、N末端氨基酸序列C-603的序列以及在与这些序列同一框内的终止密码子。即表明该质粒含有由2976bp的开放读码框构成的SCDase基因全长。用该质粒转化的大肠杆菌JM109被命名为大肠杆菌JM109/pSE5，由以FERM BP-7717于2001年8月24日[原保藏日]原保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、特许微生物寄托中心[邮政编码305-8566日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6]转至按照布达佩斯条件的保藏。

图1给出了质粒pSCD1插入DNA片段的限制酶图谱。由该质粒的碱基序列的解析结果确定了鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的全部碱基序列和鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列。序列14给出了编码海藻希瓦氏菌G8菌株生产的SCDase的开放读码框(ORF)的碱基序列，而序列15给出了该ORF编码的氨基酸序列。

另外序列2给出了编码由实施例2-(2)得到的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端氨基酸序列C-603(序列7)所表明的成熟型SCDase的碱基序列，序列1给出了该碱基序列编码的成熟型SCDase的氨基酸序列。

实施例3表达鞘脂神经酰胺脱酰基酶多肽的质粒的构建

按照以下操作构建表达鞘脂神经酰胺脱酰基酶的质粒。

以鞘脂神经酰胺脱酰基酶的N末端和C末端的各碱基序列为基础分别合成附加了NheI位点的引物UN1(序列16)和附加了XhoI位点的引物LC1(序列17)。使用这些引物进行以上述实施例2记载的质粒pSCD1作为模板的PCR。在PCR中，使用Pyrobest DNA聚合酶按照附带的程序，进行25循环的RCR，每一循环为：98℃ 10秒、68℃ 3.5分钟。上述条件下的PCR结果可检测出大约3kb的特异的带。

从琼脂糖凝胶电泳后的凝胶中回收该大约3kb的扩增DNA片段，用限制酶NheI和XhoI消化，将得到的片段与pET23a载体(ノバジエン公司生产)连接，制作重组质粒pSCD2。

实施例4

鞘脂神经酰胺脱酰基酶在转化体大肠杆菌中的表达。

用实施例3得到的质粒pSCD2转化大肠杆菌BL21pLysS(ノバジエン公司生产)，得到大肠杆菌BL21/pSCD2。将该转化体接种到含有氨苄青霉素100μg/ml的3ml的LB培养基之后，于37℃下振荡培养过夜。然后将得到的培养液0.5ml接种到50ml的同样培养基中。于37℃下培养，在度(600nm的吸光度)大约达到0.5的阶段，加入终浓度0.1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于37℃下振荡培养30分钟。培养结束后，对培养液离心分离，收集菌体，悬浮于含有5ml的0.1％TritonX-100和0.8M NaCl的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)。然后进行超声处理，破碎菌体。得到的破碎液进行离心分离，提取上清，该上清作为粗酶液。

与上述实施例1一样，用NBD-GM1作为底物测定该粗酶液的SCDase活性。结果表明含有本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的大肠杆菌BL21/pSCD2每1升培养液生产大约1U的鞘脂神经酰胺脱酰基酶。

实施例5用于编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的核酸检测的试剂盒的构建

以序列2所示的碱基序列为基础制作寡核苷酸探针和引物，构建如下所示的用于编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的核酸检测的试剂盒。

在该试剂盒中包含可以对鞘脂神经酰胺脱酰基酶特异区域进行扩增的引物组、DNA聚合酶、PCR用缓冲液、dNTP混合物。

另外，用于进行扩增后杂交的对扩增区域特异的探针根据需要包括在试剂盒中。

例如，制作如下的试剂盒。

试剂盒的组成(PCR100次)

SS1(20pmol/μl)              110μl

SS2a(20pmol/μl)             110μl

SS2b(20pmol/μl)             110μl

SA1a(20pmol/μl)             110μl

SA1b(20pmol/μl)             110μl

SA3(20pmol/μl)              110μl

10×PCR缓冲液               1ml

TakaRa(5U/μl)               50μl

dNTP混合物(各2.5mM)         1.28μl

实施例6用于具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽检测的试剂盒的构建

通过以具有序列1所示氨基酸序列的多肽作为抗原，对山羊、兔、大鼠、小鼠等进行免疫，制作抗鞘脂神经酰胺脱酰基酶抗体，构建如下所示的用于具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽检测的试剂盒。

该试剂盒是含有包被抗SCDase单克隆抗体的96孔板、过氧化物酶标记的抗SCDase单克隆抗体、标准品、稀释液、底物溶液(TMBZ：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)以及反应终止液(1N硫酸)的夹心EIA用试剂盒。

例如作成如下那样的试剂盒

试剂盒的构成(96次)

抗SCDase单克隆抗体板

96孔(8孔×12列)         1块

过氧化物酶标记的抗SCDase单克隆抗体

(冷冻干燥品)            11ml用×1份

标准品(冷冻干燥品)      1ml×1份

稀释液                  11ml×1份

底物溶液(TMBZ)          12ml×1份

反应终止液(1N硫酸)      12ml×1份

实施例7  表达C末端缺失的鞘脂神经酰胺脱酰基酶多肽的质粒的构建

按照以下操作构建表达C末端缺失的鞘脂神经酰胺脱酰基酶多肽的质粒。

以由通过纯化酶推定的肽序列所给出的从N末端75kDa部分、即对应于C末端一侧(ERAEAH)的部分碱基序列为基础合成引物LSCD2125(序列18)。使用得到的引物LSCD2125和实施例3中合成的引物UN1(序列16)，以上述实施例2记载的质粒pSCD1为模板进行PCR。在PCR中，使用PyroBest DNA聚合酶(宝酒造公司生产)按照附带的程序进行30循环的RCR，每一循环为：96℃ 10秒、68℃ 2.5分钟。上述条件下的PCR结果可检测出大约2kb的特异的带。

从琼脂糖凝胶电泳后的凝胶中回收大约2kb的该扩增DNA片段，用限制酶NheI和XhoI消化，得到编码缺失了C末端区的SCDase的片段。将得到的片段与用限制酶NheI和XhoI消化的pET23b载体(ノバジエン公司生产)连接，制作重组质粒pETSCD-del。

序列19给出了编码缺失了C末端区的SCDase的DNA的碱基序列，序列20给出了该碱基序列编码的氨基酸序列。

实施例8鞘脂神经酰胺脱酰基酶C末端缺失体在转化大肠杆菌中的表达

用实施例7中得到的质粒pETSCD-del转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysE(ノバジエン公司生产)，得到转化体大肠杆菌BL21(DE3)pLysE/pETSCD-del。将该转化体接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和35μg/ml氯霉素的5ml的LB培养基之后，于25℃下振荡培养过夜。然后将得到的培养液振荡接种到加入2升容量带有风口的烧瓶的1升同样培养液中。然后对得到的培养液于25℃下振荡培养18小时，然后加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于25℃下振荡培养1小时。培养结束后，对培养液离心分离，回收菌体，悬浮于含有0.1％TritonX-100和150mM NaCl、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5μg/ml胃蛋白酶抑制剂、5μg/ml抑糜蛋白酶素以及5μg/ml亮抑蛋白酶肽的10mM Tris-HCl缓冲液50ml中(pH7.5)。然后将得到的悬浮物于-80℃下冷冻后、再使其融解来破坏菌体。再进行超声，破碎菌体。得到的破碎液进行离心分离，提取上清，得到粗酶液。

得到的粗酶液的SCDase活性测定按照以下的方法进行。即，向10μl底物[10nmol GM1a、5mM MgCl₂、5mM MnCl₂、5mM CaCl₂、0.2％ TritonX-100、200mM NaCl、50mM醋酸缓冲液(pH5.5)]中加入粗酶液10μ1，于37℃温育30分钟，使粗酶液与底物反应。然后于100℃下煮沸5分钟，终止反应，使用离心浓缩机将得到的反应液浓缩干燥。向得到的产物中加入10μl的氯仿/甲醇(2＝1、v/v)，对得到的化合物进行超声处理，使反应生成物溶解。将得到的溶解物点到硅胶TLC板上。然后用氯仿/甲醇/0.2％CaCl₂(5/4/1、v/v/v)展开后，通过苔黑酚硫酸法使硅胶TLC板显色。使用TCL色谱扫描仪(岛津制作所生产)测定显色后的硅胶TLC板的吸光度(波长540nm)，通过以下公式求分解率。

分解率(％)＝([游离的溶血GM1a的面积]/[游离的溶血GM1a的面积+未反应的GM1a的面积]×100)

其中SCDase的1个单位(U)定义为1分钟内分解1μmol的GM1a的酶量。

利用上述方法测定活性时，表明携带编码本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶C末端缺失体的基因的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysE/pETSCD-del每1升培养液生产872U的鞘脂神经酰胺脱酰基酶C末端缺失体。

通过以下的方法可以得到SCDase纯化标准品。

即，将上述粗酶液加到预先用含有0.1％TritonX-100和150mMNaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的HiTrap Chelating柱(Amersham pharmacia biotech公司生产)。然后用含有20mM咪唑的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将样品夹杂的蛋白质洗出。然后用含有50mM咪唑的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将SCDase洗脱出来，回收活性级分(1)。

将回收的活性级分(1)对含有0.1％TritonX-100的10M的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)透析。然后将上述透析液加到用含有0.1％TritonX-100的10mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的HiTrapQ柱(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)。接下来用含有0.1％TritonX-100和1M NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将SCDase洗脱出来，回收活性级分(2)。

将上述活性级分(2)加到用含有0.1％TritonX-100和150mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的HiLoad Superdex 200pg柱(Amersham pharmacia biotech公司生产)。回收柱子没有吸附的穿过的活性级分(3)。

将上述活性级分(3)加到用含有0.1％TritonX-100的10mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的HiTrap Q柱(Amersham PharmaciaBiotech公司生产)。然后用含有0.1％TritonX-100和1M NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将SCDase洗脱出来，回收活性级分(4)。回收的活性级分(4)作为酶纯化标准品。

得到的酶纯化标准品在SDS-PAGE上表现为单一带。总蛋白量为39.3mg，总活力为5258U。

序列表目录

序列8所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列9所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列10所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列11所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列12所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列13所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列16所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列17所示序列为用于扩增鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列18所示序列为用于扩增C末端缺失鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的引物序列。

序列19所示序列为编码C末端缺失鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的碱基序列。上述序列对应于序列2中碱基1～2031的序列。

序列20所示序列为C末端缺失鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列。上述序列对应于序列1中氨基酸1～677的序列。

产业上利用的可能性

本发明首次提供鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列以及编码该序列的碱基序列。由此提供使用编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性多肽的核酸制造具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因工程制造方法，以及该鞘脂神经酰胺脱酰基酶的检测方法。本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶制造方法可以发挥出不需要向培养基中添加用于诱导鞘脂神经酰胺脱酰基酶表达的鞘脂，没有混杂同时被诱导的鞘磷脂酶等酶和加到培养基的鞘脂或其他分解物，具有容易纯化目的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的优良效果。另外可以提供与编码具有本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸特异杂交的探针和引物，与具有本发明的鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽特异结合的抗体或其片段。利用这些探针、引物和抗体或其片段可以简便、而且高灵敏度地检测鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性。

序列表

<110>宝生物株式会社

<120>鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因

<130>01-060-PCT

<150>JP 2000-293181

<151>2000-09-26

<160>20

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>954

<212>PRT

<213>海藻希瓦氏菌

<400>1

<210>2

<211>2862

<212>DNA

<213>海藻希瓦氏菌

<400>2

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>海藻希瓦氏菌

<400>3

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>海藻希瓦氏菌

<400>4

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>海藻希瓦氏菌

<400>5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>海藻希瓦氏菌

<400>6

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>海藻希瓦氏菌

<400>7

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>8

<210>9

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>9

<210>10

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>10

<210>11

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>11

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>12

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>13

<210>14

<211>992

<212>PRT

<213>海藻希瓦氏菌

<400>14

<210>15

<211>2976

<212>DNA

<213>海藻希瓦氏菌

<400>15

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>16

<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>17

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SCDase基因的引物

<400>18

<210>19

<211>2031

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：3′末端截断的SCDase基因

<220>

<223>相应于序列2中的1-2031号碱基的序列

<400>19

<210>20

<211>677

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：C-末端截断的SCDase

<220>

<223>相应于序列1中第1-667号碱基的序列

<400>20

Claims (10)

1.由序列20或序列1所示氨基酸序列组成的多肽。

2.从下述(A)～(D)中选择出的、编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肤的核酸；

(A)编码由序列20或序列1所示氨基酸序列组成的多肽的核酸；

(B)由序列19或序列2所示碱基序列组成的核酸；

(C)在严格条件下能与上述(A)～(B)任一项记载的核酸或其互补链杂交的核酸；以及

(D)由因简并性而与上述(A)～(C)任一项记载的核酸不同的碱基序列组成的核酸.

3.重组DNA，其含有权利要求2记载的核酸，并且所述重组DNA通过载体连接.

4.携带权利要求2记载的核酸或权利要求3记载的重组DNA的转化体.

5.具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的制造方法，其特征是：在适于鞘脂神经酰胺脱酰基酶表达的条件下对权利要求4的转化体进行培养，然后从得到培养物中提取具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽.

6.可在严格条件下能与具有序列2所示核苷酸序列或其互补序列的核酸杂交的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针由至少15个核苷酸构成。

7.可在严格条件下能与具有序列2所示核苷酸序列或其互补序列的核酸杂交的引物，其中所述引物由15～40个核苷酸构成。

8.编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的检测方法，其特征是：使含有核酸的被检测样品与权利要求6记载的寡核苷酸探针接触，然后对核酸与寡核苷酸探针的杂合体进行检测.

9.编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的检测方法，其特征是：以含有核酸的被检测样品作为模板样品，使用权利要求7记载的引物进行核酸扩增。

10.包含权利要求6记载的寡核苷酸探针和/或权利要求7记载的引物在内的，用于检测编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的试剂盒。

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