TW495361B

TW495361B - Single-shot vaccine formulation

Info

Publication number: TW495361B
Application number: TW085103077A
Authority: TW
Inventors: Hyeon-Kook Lee; Jung-Hwan Park; Nam-Sok Choi; Myung-Jin Kim; Soo-Hyeon Kim
Original assignee: Lg Chemical Ltd
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2002-07-21
Also published as: CN1213736C; BR9601032A; MX9600938A; US5753234A; JP2739570B2; AR002969A1; CA2171881A1; KR960033469A; CN1136918A; PE57797A1; EP0737472A1; JPH08253426A; KR100201352B1

Description

495361 Α7 Β7 五、發明説明（發明頜城本發明係有關於一種微顆粒，其顆粒大小範圍為0.5-30〇μιη，該微顆粒是由一種抗原或數種抗原混合物，依續地以水溶性物質和生物可分解的聚合物包衣製備；及，一種疫苗配方，以分散微顆粒於供注射用介質中而製備，該疫苗配方能只Μ—次注射達到對抗傳染性疾病的免疫效果 (”、單次注射型疫苗配方”），其中之抗原在一段期間内， .如幾値月，延遲釋放。發明背晷迄今，已經發展很多預防各種不同傳染性疾病有效的疫苗。然而，大多數目前使用的疫苗需要多次接種，而增加接種者經濟上的負擔和不便（Μ. Τ. Agnado and Ρ. Η. Lambert, Tumunoh i ο I . . 184. 113(1992) ; Aryward, Β· 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,et al·,Vaccine, 12, 1155 ( 1994))。尤其是，接種第一劑的人大約只有30¾接受第二劑接種。統計結果，當處方爲三次接種時，100個之中只有9個完成一整値免疫處理過程，此結果清楚地顯示，單次注射接種以達到免疫之疫苗的需求。Η往發展單次注射型疫苗之論文，基本構想集中於使用微顆粒，其中，所需的抗原以生物可分解聚合材料包膠，在處方規定的時間慢慢地釋放抗原，完成疫苗接種（R Langer and，and J · Fo 1 knian , Nature . 263 · 797 (1976)) 〇在各種不同的生物可分解聚合物之中，聚乳交酯（PLA) ，聚乙交酯（PGA)，和乳交酯-乙交酯共聚物（PLGA)通本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 4 -Λ 495361 A7 B7 五、發明説明（2) 常被認爲是安全的，因爲他們在體內水解得到無害的乳酸和甘醇酸。這些聚合物常用於不需要移去之手術後縫合；及用於白脯胺酸乙酸酯（leuprolide acetate)包膠配方，一種 FDA核准爲可用於人體的LHRH類似物（R. Langer and M. Mose , Science, 249, 1527(1990)； D. K. Gilding and A. M. Reed, Polymer, 2Ό, 1459(1979);和 William Morris e广 2/·，1_2_, 5(1994))。這些聚合物的分解率因乙交酯/乳交酯之比率和其分子量而改變，因此，調整分子量、聚合物乙交酯/乳交酯之比例、顆粒大小、和配方包衣的厚度，可控制，維持藥物的釋放幾個月（S. J. Holland, WW·，/ 心/·，生， 155(1986))。自從1988年以來，世界衛生組織（WHO)已資助使用上述的生物可分解聚合物的破傷風類病毒單次注射型疫苗之硏究（Μ. T. Aguado, Π_, 596(1993); Proceed. Intern.

Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 21st Controlled Release Society, Inc., Y. Men, et aL, Paper No. 126(1994) ； 20th, B. Gander, et Paper No. 135(1993) » 19th, A. M. Hazrati, et Paper No. 220(1992) i 21st, M. Gilley, et a!., Paper No. 218(1992) » 21st, Manmohan Singh, et al., Paper No. 1476(1994) ; 21st, C. Yan，er 5/·，Paper Νο·127(1994))。然而，既使有這些努力，單次注射型疫苗配方仍無法實際應用，主要的缺點是，包膠配方產生的的抗體數量，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 495361 A7 B7 _ 五、發明説明（3 ) 只有傳統的明礬配方大約十分之一，而且其結果無法重複 (R. E. Spier, Vaccine, LL, 1450 (1993) ； Μ. Τ. Aguado and Ρ. Η. Lambert, Tumunobiol . · 184. 113 ( 1992)) ° 這些問題的原因是：首先，用於溶解生物可分解聚合物的有機溶劑使抗原變性，而減少抗原性或使其無效；第二，當與水接觸的時候，抗原凝聚而減少抗原性；及，第三，由於抗原和疏水性生物可分解聚合物之間不需要的交互作甩，而減少或破壞其抗原性。經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項S-填寫本頁)

Alonso et al.將破傷風類病毒疫苗MPLA和PLGA包膠而製備單次注射型疫苗，但是此疫苗顆粒僅存有原破傷風類毒素0.5-20 之抗原性，這是由於類毒素與有機溶劑在包膠過程中不可避免的接觸所引起的（Maria J. Alonso, et al . , Vaccine· 299 (1994))。在一老鼠的實驗中，顯示該疫苗配方形成抗體之能力低於使用明礬配方當做佐劑而無加強劑之對照配方，這表示本配方疫苗不能用為單次注射型疫苗配方。Schwendeman et al.試圖以破傷風類病毒之化學的修飾來解決上述問題，也就是說，將抗原的硫氧基硫烷化，但是結果並不令人滿意（S. P. Schwendeman, et a 1·，Proceed . Intern. Svmp. Control . R ft 1 . Bioact. Mater.. 21st.. Paper No· 128， 1994) °

Nellore et al.報告一種B塱肝炎單次注射型疫苗配方，其製備法為，使用有機溶劑萃取或蒸發方法，將B型肝炎平面抗原（HBsAg) MPGA包膠而得到微顆粒，U. V.

Ne1 lore, et a 1. , J. Parentera 1 Science & Technology. 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 495361 A7 B7 五、發明説明（4 ) 176 ( 1992))。在天竺鼠的動物實驗顯示一値包含較小顆粒（顆粒大小1-10 μ®)之配方，其形成抗體能力低於使用明礬配方當做佐劑而無加強劑之對照配方，而其他顆粒大小為2〇-6〇μιη和卜6〇μιη之配方基本上是沒有活性的。這些配方在包膠過程中，有機溶劑使得HBsAg變性了。因此，為了要將抗原Μ生物可分解聚合物包膠，而製備有效率的單次注射型疫苗，必須使用在包膠過程中不需要有機溶劑的聚合物，或在操作過程中，抗原必須避免接觸有機溶劑。然而，已知的生物可分解聚合物，沒有不需要使用有機溶劑的。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項S-填寫本頁) 典型製備微顆粒的方法是，將有機的胜肽或蛋白質藥物以生物可分解聚合物包膠而得。恃別地，是以藥物溶解或分散於溶有生物可分解聚合物之有機溶劑而製得油相，而油-水（"0/W”）乳劑之製備則是，由油相分散進入含表面活化劑之水相而得到。然後，Μ傳統的方法除去有機溶劑，如蒸發或萃取，生物可分解聚合物因此固化而得到微顆粒。結果，藥物是被分散在聚合物基質中，而該微顆粒散佈在溶有表面活化劑的水相中。然而，這個傳統的方法有其缺點：大多數的生物可分解聚合物會被水解；表面活化劑通常是不適合用於注射，必須Μ洗灌程序除去；而顆粒須經過乾燥以預防聚合物分解。這種0/W乳劑方法，藥物直接與有機溶劑接觸，因此，該方法不能用於疫苗配方之製備，其中之抗原會因接觸溶劑而減少其抗原性。再者，該方法更有不能用於水溶性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 495361 A7 B7_ 五、發明説明（5 ) 藥物的限制。因此，移轉硏究方向而發展使用W/0/W乳劑以克服上述的問題。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 舉例來說，歐洲專利申請案第87309286.0號，揭示一種口服給藥之疫苗配方，不同抗原以PLA，PGA，PLGA等包膠，其顆粒大小爲10# m或更小，已知所使用之聚合物都能通過派爾氏淋巴集結（Peyer'sPatches)。另外，歐洲專利申請案第88302940.7號揭示一種注射配方，該注射配方可維持超過6個月的效果，其製備方法是將胜肽或蛋白質，如LHRH類似物，以生物可分解聚合物，如PLGA包膠。更特別地，該微顆粒以下述方法製備：藥物溶解或分散在水相裡；與溶有生物可分解聚合物和表面活化劑之有機溶劑混合，得到W/0乳劑；將該W/0乳劑分散進入包含表面活化劑之水相，而得到一個W/0/W乳劑；然後除去有機溶劑以得到包含藥物之微顆粒。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製依此方法，藥物與有機溶劑的接觸會比使用0/W乳劑方法少。然而，仍不能夠避免與內和外水相之間某程度的混合，那可能造成減少疫苗的抗原性。而且，在除去表面活化劑之洗濯程序後，內水相之水份通常以傳統的方法，如，冷凍真空乾燥。在除去水份的過程中，可能在這生物聚合物產生許多大孔，而且，疫苗包膠時，這些毛孔可能當作人體內水的導管，使得抗原形成聚集而跟著失去抗原性。爲了要克服上述缺點，國際專利公開案WO 93/07861 揭示一種製備多相顆粒方法，該方法包含：使用一種高本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 495361 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 黏度食用油，形成W/0/W乳劑；以生物可分解聚合物，如 PGA，PLA和PLGA，之氟甲烷溶液取代外水相；所得的乳劑分散於礦物油内；除去氛甲烷而得到多相顆粒，其中W/0 微乳劑包膠於聚合物殼内。然而，本方法的缺點是：得到的多相顆粒不可能除去表面活化劑，如硬脂酸鋁和Span80 ，這些表面活化劑是用來增加食用油的黏性和分散之安定度，以避免藥物從内水相釋放進入外水相；而且，在該方法中，溫度增加至140C以幫助乳劑之分散時，可能失去藥物的抗原性。相分離方法(J. C. Wu et al.，J. Microencapsulation. .11(3), 297-308 ( 1994))包含聚合物溶解於第一溶劑裡；加入一種不溶解聚合物但是可與第一溶劑混合之第二溶劑 ;因此而得到一値核心-貝殼類型之微顆粒，該徹顆粒是當聚合物的溶解度減少時，包圍於藥物附近固化而形成的。然而，類似0/W乳劑方法，本方法不能避免抗原接觸第二有機溶劑。伴隨上述使用乳劑方法的問題是，可能喪失蛋白質藥物之活性。蛋白質容易被機槭力量改變本性，如在高能量分散過程。Μ大部分抗原是蛋白質來說，這是個嚴重的問題。另一方面，噴霧乾燥法（Β. Gander et al·, J. HicrQencap^u1ation> 12 (1) , 83-97 (1995))包含’藥物溶解或分散於溶有生物可分解聚合物之有機溶劑中，將混和物噴蓀乾燥而得到微顆粒。然而，這個方法也不能夠避本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（、210X297公釐） - 9 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 495361 A7 ___ B7__ 五、發明説明（7) 免藥物與有機溶劑的直接接觸。國際專利公開案冒〇94/12158和美國專利第5,019,400 號，提議一種冷凍-萃取的方法，用於製備蛋白質藥物（生長荷爾蒙）顆粒包膠。這個方法，藥物被分散於溶有生物可分解聚合物之有機溶劑中，如二氯甲烷，噴霧成低溫液態氣體，而形成冷凍顆粒。這些顆粒被收集.在冷凍乙醇的表面上。當冷凍乙醇熔融時，冷凍顆粒也融化，而顆粒內之有機溶劑被乙醇萃取出來，因此微顆粒被凝固的聚合物包覆。這個方法也使得抗原與有機溶劑直接接觸，而且藥物釋放期只有幾天。因此，本方法不適當於單次注射型疫苗的製備，該疫苗需要比較長的時間來釋放抗原。國際專利公開案W0 92/14449揭示一種用於製備含蛋白質藥物顆粒之方法，該方法包含：粉末狀蛋白質分散在熔融脂肪酸酐，冷卻使混合物凝固，將混合物磨粉而得顆粒。脂肪酸酐在5-75°C融化，而不像傳統有機溶劑使蛋白質變性。然而，在方法中，以脂肪酸酐作爲包膠材料，使其不易得適於注射的大小之微顆粒。另外，脂肪酸酐本身不能長時間釋放藥物，因此，它不適用當於單次注射型疫苗配方的製備。歐洲專利申請案第881 13933.1號，報導一種用於蛋白質藥物，除草劑或肥料以零次或雙相釋放之顆粒配方包膠設計，該方法是：以吸附性聚合物覆包藥物，除草劑或肥料，得到的顆粒，以不溶解於水，而只經過藥物，除草劑或肥料之聚合物包衣。然而，在用於第二次包衣之不本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10 - 495361 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 Α7 Β7 五、發明説明（8 ) 溶於水聚合物，如绻維素，不是生物可分解的聚合物，其中藥物只能在一天内釋放，而無法控制。另外，顆粒在人類的身髏快速地被水浸潤，因此，當藥物為抗原時，它將會凝聚而失去其抗原性。而且，這方法不適於製備用於注射之微顆粒，因為第一次包衣後之顆粒的大小範圍從125-ΙΟΟΟΟμπι，而第二次包衣必須有足夠厚度，以避免用於第一次包衣之吸水性聚合物膨脹而裂開。如上面之描述，已經有許多嘗試發展用於製備單次注射型疫苗的方法，Μ避免蛋白質藥物與有機溶劑，生物可分解聚合物和體内水份間不必要的交互作用。雖然有這些努力，仍未找到在抗原包膠過程中，足以保護其抗原性的方法；因此，仍有必要繼續發展單次注射型疫苗配方（ William Morris, et a 1. , Vaccine· 12，5 (1994)) 〇發明摘要因此，本發明的一個目檫是提供一種微顆粒，其中包含完整的抗原或混合抗原包膠於聚合物內。本發明的另一個目檫是提供一種單次注射型疫苗配方，該配方是將微顆粒分散於注射用之介質中。依照本發明，提供一種平均大小為0.5-300μιπ之撤顆粒，該微顆粒之製備是將一種抗原或數種抗原混合物依繪地以水溶性的物質和生物可分解聚合物包衣；及，一種單次注射型疫苗之製備，該疫苗是微顆粒分散於注射用介質中，Μ —次注射對抗傳染性疾病而得到免疫作用。匾示簡要說明本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 495361 A7 B7 五、發明説明（9 經濟部中央標準局員工消费合作社印製在下面詳細說明之後，配合第1圖，本發明上述的和其他的目檫和特徽會更明顯，第1圖顯示顆粒性質和抗髏構造之間的關係，其中比較依本發明製備的三種疫苗配方與傳統的明礬配方。發明洚期說明在此處被引用的所有的參考資料，全部被包含在本發明參考資料之中。本發明的微顆粒之製備方法是：抗原Μ水溶性物質包衣得到粉狀顆粒（” la @心顆粒”），該核心顆粒再Μ 一疏水性生物可分解聚合物包膠而得最後的撤顆粒。微顆粒爲一球型或類球型，其大小範圍為0.5-300μιη。及，製備一種單次注射型疫苗，該疫苗是微顆粒分散於注射用介質中，以一次注射對抗傳染性疾病而得到免疫作用。本發明可用適當的抗原是一稀釋的，已死的或重組的抗原，用於單一疾病（”單一抗原”）或同時二種或更多種疾病（”混合抗原”）。該混合抗原可能是二種或更多種抗原的混合，或同時具有二種或更多種疾病抗原性的抗原，如重組蛋白質。至於抗原，可用整個生物髏，如濾過性毒菌或細菌全細胞，或生物的一部份，如具抗原性之蛋白質本發明的抗原實例包括肝炎，白喉，水痘，傷寒，百日咳，破傷風類病毒，肺結核，沙門氏菌病，翟亂，HIV ，泡疹，黃熱病，麻疹，小兒麻痺症，德國麻疹，流行性腮腺炎，狂犬病，鼠疫，住血吸蟲病，流行性感冒，腫廇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 12 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂舞· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 495361 A7 B7 五、發明説明（10) ，錐蟲病，萊什曼病，痲瘋病，髓膜炎，和瘧疾。更特別的，他們包括B型肝炎表面抗原，破傷風類毒素，B型葡萄球菌腸類毒素，篦麻類毒素，及稀釋流行性感冒類病毒。核心顆粒之製備方法是，抗原溶解或分散於一個溶有水溶性物質之適當的水性溶劑溶液，如水或緩衝液，並用噴霧乾燥法或冷凍乾燥法使其乾燥。如果需要，可加入適當的佐劑，如明礬；胞壁酸二胜肽，胞壁酸三胜肽和其衍生物；提摩辛a (tymosin α );單磷酸脂質A ;皂素；免疫促進錯合物；多電解質如聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物；及其混合物。用於製備核心顆粒之水溶性物質不會引起與蛋白質抗原不必要的交互作用，而且不能溶解於用於第二包衣之有機溶劑。水溶性物質實例包括水溶性醣類，如葡萄糖，木糖，半乳糖，果糖，乳糖，麥芽糖，蔗糖，藻酸鹽，聚葡萄糖，透明質酸，軟骨素硫酸鹽和水溶性的纖維素衍生物，如羥丙甲基纖維素，羥丙基纖維素（HPC)，羧甲基纖維素（CMC)和羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na);蛋白質如白蛋白和明膠；氨基酸如羥苯基甘胺酸，丙胺酸，榖胺酸，精胺酸，離胺酸和其鹽類；和其混合物；而HPC，CMC， CMC-Na，明膠和其混合物是較佳的。水溶性的物質可用範圍爲1-50倍總抗原的重量，較佳爲5-15倍。如此製備的核心顆粒其顆粒大小爲0.1-200 # m，較佳爲0.5-20 ym。爲了要得到最後的微顆粒，以適當的裝置如本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------丨丨|_丨——ί*ιτ------#. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -13 - 495361 A7 B7 五、發明説明（u: 磁攪拌器，同質機，液化機和音波振盪器，將疏水性生物能分解聚合物溶於有機溶劑中，而核心顆粒分散於此溶劑内0 生物可分解聚合物用量範圍為1-100倍核心顆粒的重量，較佳為5-30。核心顆粒Μ不溶於有機溶劑的水溶性物質包衣，因此，它阻斷抗原與有機溶劑的接觸，而避免抗原性的減少或損失。可用於本發明之疏水性生物可分解聚合物包括乳交酯 -乙交酯共聚物（PLGA)，聚乙交酯（PGA)，聚乳交酯（PLA) ，草酸鹽共聚物，聚（4-己内酯），乳交酯-(4-己內酯）共聚物，聚酯胺酿，聚鄰酯，聚（b-羥丁酸），和聚酸酐；而 PLGA和PLA是較佳的。在論文中任何已知的有機溶劑均可用來溶解生物可分解聚合物，包括四氯化磺，二氯甲烷，丙酮，氯仿，乙酸乙酯和氟甲烷。經濟部中夬標準局員工消費合作社印製本發明微顆粒包括生物可分解聚合物包膠之核心顆粒，其製備法為將核心顆粒平均分散懇浮於含生物可分解聚合物之有機溶液（”核心顆粒分散条統"）。該核心顆粒分散条統的優點是，微顆粒可依照傳統的方法被製備，而避免抗原與有機溶劑或生物可分解聚合物接觸。另外，核心顆粒接觸有機溶劑的表面稹夠小，而不使抗原與有機溶劑有物理性接®。特別地，可依照下列任一傳統的方法，K核心顆粒分散条统製備本發明微顆粒。 14 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 495361 Α7 Β7 五、發明説明（12) 1) 溶劑蒸發法本方法為廣為人知的撤顆粒製備方法，但本發明與以往論文不同之處在於，為避免接觸抗原與有機溶劑，以核心顆粒分散条統，代替抗原溶解或分散的水溶液。特別地，該微顆粒之裂備方法是，將核心顆粒分散条統分散於含表面活化劑之水溶液，得到0/W乳劑，然後除去有機溶劑，或分散於與其不互溶，且不溶解生物可分解聚合物之溶劑，而得到0/0乳劑，再Μ—般傳統方法除去有機溶劑。當使用氤甲烷做為核心顆粒分散条統之溶劑時，礦物油可用來當做溶劑，它不能與該条統相混合，並且不溶解生物可分解聚合物，。 2) 溶劑萃取法本方法亦為文獻中已知的微顆粒的製備方法，但本發明與Μ往論文不同之處在於，使用核心顆粒分散条統。特別地，Κ與該条统不相混合，亦非生物可分解聚合物之溶劑，如礦物油和石蟠油，萃取該条統内之有機溶劑，而得到微顆粒。 3〉急速冷凍和溶劑萃取法經濟部中央標準局員工消費合作杜印製本發明與以往論文不同之處在於，使用核心顆粒分散条統。特別地，以超音波装置，使該条統噴霧成低溫液態氣髏，而得冷凍顆粒。這些顆粒被收集在冷凍乙醇的表面上。當冷凍乙醇熔融時，冷凍顆粒融化，顆粒裡有機溶劑被萃取至乙醇層內，而同時形成有生物可分解聚合物覆包的微顆粒。 15 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 495361 A7 B7 五、發明説明（13) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4)噴霧乾燥法這是用於本發明最好的方法，特別地，以噴霧乾燥器將核心顆粒分散条統噴成霧狀而製備微顆粒。這個方法優點是高生產力和迅速。另外，它的優點是，本方法不用水，所Μ不必除水；也不需要表面活化劑；可省略洗濯和乾燥之步驟。如此製備之微顆粒大小範圍為0.5-300μπι，較佳的是卜18〇μπι。小於18〇μιη之微顆粒可分散到注射介質，Μ製備用於皮下，肌内，和腹膜内注射之注射配方。大於18〇μιη 之微顆粒可用於製備口服给藥配方。因此，本發明更進一步地提供一種單次注射塱疫苗配方，該配方是將微顆粒分散於適當的注射介質而製備得到。本疫苗配方可能包含單一抗原，或二種或更多種抗原。二種或更多種抗原組成之疫苗配方，可由二種或數種抗原混合之核心顆粒，或二種或更多種各含一抗原之核心顆粒而製備得到。本發明單次注射型疫苗配方可Μ—次注射完成接種疫苗對抗抗原，而疫苗配方中之抗原的數量是相同或比傳统的明礬配方少，後者需要數次注射才能完成接種疫苗。可用於本發明的注射介質如包括缓衝液，包含或不包含分散劑及/或防腐劑，食用油，礦物油，鱈魚肝油，鯊烯，鯊烷，單-，雙-或三-酸甘油酯及其混合物；該食用油爲玉米油，芝麻油，橄攬油，大豆油，葵花子油，棉花子油，花生油或其混合物。 (請先閱讀背面之注音心事項萍填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 16 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 495361 A7 B7 五、發明説明（14) 下列各實施例試圖進一步說明本發明，但非限制其範圍。再者，除非另外特別標示，下列固體-固體，液體-液體，和固體-液體之百分比分別爲重量/重量，體積/體積和重量/體積比。用於下列實施例之材料和方法如下： •抗原重組B型肝炎表面抗原（HBsAg)溶於磷酸緩衝食鹽水溶液（PBS)，該食鹽水溶液（PBS)係依照韓國專利公開案第93-2735號的方法製備（公開日期：1994年4月9日）。 •生物可分解聚合物 PLGA ( 50/50 )，美國 BPI 所生產。 •抗原數量：以勞瑞法（Lowry method)測定。 •抗原性：以AUZYME裝置測試（Abbott，美國）。 •抗體濃度測定以AUSAB測試裝置，11隻天竺鼠血淸濃度測定的幾何平均値（Abbott，美國）。 •天竺鼠重300-400g，並確定在給藥前2天血液中沒有抗體。以心臟刺穿術收集其血液。實施例1:以冷凍乾燥法製備核心顆粒重組HBsAg溶於10以Μ之PBS中，使其濃度爲300mg/ml，加入經丙基纖維素，其濃度分別爲0.3mg/ml (樣品1)，1.5mg/ml (樣品2)，和3.0mg/ml (樣品3)。各溶液在乾冰和本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I ； —01T0^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -17 - 495361 A7 B7 五、發明説明（15) 丙酮混合液-70°C凍結30分鐘，然後以EYELAFD-81冷凍乾燥機（東京Rikakikai，日本），以〇.〇5托和-80°C，冷凍乾燥24小時，得到以羥丙基纖維素包衣之核心顆粒。以此法製備之核心顆粒平均大小分別爲1.0，1.2和1.5// m 〇實施例2 ：以噴霧乾燥法製備核心顆粒重組HBsAg溶於10# Μ之PBS，使其濃度爲300mg/ml，各樣品分別加入羥丙基纖維素（樣品4)，羧甲基鈉纖維素 (樣品5)和明膠（樣品6)其濃度爲0.3mg/ml。各溶液分別放至噴霧乾燥機（ Biichi 190)，其流速爲3ml/分鐘，而得到分別以羥丙基纖維素，羧甲基纖維素鈉鹽和明膠包衣之核心顆粒。本方法中推進劑氮氣之流速爲600公升/ 分鐘，入氣溫度是70°C。以此法製備之核心顆粒平均大小分別爲 4.6，6.3 和 4.9//m。測試實施例1 :核心顆粒中抗原之保護爲了要確定，當抗原與有機溶劑接觸時，水溶性物質包衣之核心顆粒是否保護其抗原性，以實施例1和實施例 2製備之核心顆粒，分散於乙酸乙酯或氰甲烷，此溶劑溶解PLGA，而不溶解羥丙基纖維素，所得之溶液以磁攪拌器混合，使核心顆粒與有機溶劑接觸。分離核心顆粒，乾燥以除去有機溶劑。已乾燥的核心顆粒溶於緩衝溶液（1〇#Μ 磷酸鹽，pH 7.5)，以AUZYME裝備測定抗原性，而與韓國專利公開案第93-2735號低溫儲存之重組HBsAg溶液相比較本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 舞· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 18 495361 A7 ____B7_ 五、發明説明（16) 另外，以未Μ水溶性物質包衣的HBsAg作為對照，如下述。重組HBsAg溶於10 μΜ PBS，使其濃度為300mg/ml , 並加入第1表所列相同的髏積之各種有機溶劑，所得之溶液K磁攪拌器混合10分鐘。分離水層，依照上述的方法測定抗原性。分離沈澱物，乾燥後加到PBS，测定抗原性。然而，沈澱物由於變性而不溶於PBS。結果，Μ羥丙基纖維素包衣之核心顆粒，與有機溶劑接觸後，其抗原仍維持抗原性，而未以聚合物包衣之抗原，在它與有機溶劑接觸後完全地失去其抗原性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ir 黌· 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ 297公釐）、- 19 - 495361 A7 B7 五、發明説明（17) 第1表樣品號碼水溶性聚合物有機溶劑抗原性(％) 不溶沈澱物備註原始tTBsAg 溶液 - - 100 - - 1 羥丙基纖維素 (0.3 mg/ml) 氰甲烷 78 - - 乙酸乙酯 75 - 麟 2 羥丙基纖維素 (1.5 mg/ml) 氯甲烷 80 - - 乙酸乙酯 80 攀 - 3 羥丙基纖維素 3.0 mg/ml) 氰甲烷 91 - - 乙酸乙酯 88 • 4 羥丙基纖維素 (3.0 mg/ml) 乙酸乙酯 90 - - 5 羧甲基纖維素 (3.0 mg/ml) 85 - - 6 明腰（3.0 mg/ml) 82 • • 對照未使用氰甲烷 0 產生 • 乙酸乙酯 0 產生 • 四氯化碳 0 產生 - 氯仿 «1.0 產生伞1) 二氯甲烷 «1.0 產生本1) 苯 «1.0 產生本1) 己烷 «1.0 產生本1) 微量，再溶解. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 管_例3 :徹顆粒之製備 PLGA ( 50/50)溶於乙酸乙酯，濃度為1%，加入實施例1製備的核心顆粒樣品3，使其濃度為lmg/ffll。所得溶液放至噴霧乾燥機（Buchi 190)，其流速為3ml/分鐘’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 495361 Α7 Β7 五、發明説明（18 得到進一步地M PLGA覆包之最後徹顆粒。在這步驟中，氮氣的流速為600公升/分鐘，而入氣溫度為60它。 Μ此法製備的徹顆粒其平均大小為而PLGA/核心顆粒的重量比是10。K Lowry法测定其抗原含量為6微克蛋白質/毫克顆粒。管施例4：微顆粒之製備 Μ實施例2製備的樣品4當做核心顆粒，依照如實施例3所描述相同的步驟，M PLGA包覆製備撤顆粒。PLGA/ 核心顆粒的重量比是10。 Μ此法製備的撒顆粒其平均大小為9μπι，而抗原含量是3微克蛋白質/毫克顆粒。管施例5 ••微顆粒之製備實施例2中的樣品4分散於乙酸乙酯，其濃度為2mg/ ml，依照如實施例3所描述相同的步驟，M PLGA包覆製備微顆粒。PLGA/核心顆粒的重量比是5。以此法製備的微顆粒其平均大小為7μπι，而抗原含量是6微克蛋白質/毫克顆粒。管施例6 :微顆粒之製備經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面4注意事項再填寫本頁) 、^τ 辦實施例2中的樣品4分散於乙酸乙酯，其濃度為0.5 mg/ml，依照如實施例3所描述相同的步驟，以PLGA包覆製備微顆粒。PLGA/核心顆粒的重量比是20。以此法製備的微顆粒其平均大小為1〇μΐΗ，而抗原含置是1.5微克蛋白質/毫克顆粒。 :微顆粒之裂備本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 21 - 21 - 495361 Α7 Β7 五、發明説明（19) * 實施例2中製備的樣品4 (核心顆粒）5mg，分散的在lml乙酸乙酯，PLGA200mgM超音波器溶於其中。核心顆粒分散条統與lml 1%聚乙烯醇水溶液（PVA) Μ磁攪拌器混合，所得的混合液分散於100ml 0.3%PVA水溶液，得到 0/W乳劑。該乳劑持續地混合5小時，使乙酸乙酯蒸發，Μ 〇.5μ®過濾器分離所得之微顆粒，洗滌後乾燥。平均顆粒平均大小為ΙΙΟμιπ。測試苜施例2 ：水溶性物質之髏内效應 Μ實施例3製備的徹顆粒分散的在PBS (樣品7)，樣品7Μ—次腹膜內注射到天竺鼠，其抗原量為40 mg蛋 .白質/隻。注射後，每隔十五天共2個月，採集天竺鼠血液樣品，測定每一樣品中抗髏的濃度UlU/ial)。依下面方法，只MPLGA包覆而不加水溶性物質核心包衣，Μ製備對照顆粒。原始的HBsAg溶液Μ實施例1的方法凍結，而不使用水溶性物質當核心包衣，依照實施例3 的方法，HBsAg顆粒直接地HPLGA包衣，（對照樣品），對照樣品Μ上述相同方法對天竺鼠施藥，而後測定產生之抗髏濃度。經濟部中央標準局員工消費合作社印製結果，顯示樣品7抗髏比對照樣品濃度更高，見第2 表。本結果顯示，沒有水溶性物質包衣核心，由於抗原與有機溶劑和生物可分解聚合物之間不必要的交互作用，抗原喪失它的抗原性。 22 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) W· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 495361 Α7 Β7 五、發明説明（ 20 第2表抗體濃度 (mlU/ml) 樣品注射後時間(月） 0 0.5 1 1.5 2 樣品7 對照樣品 0.0 2.4 10.6 24.6 34.0 0.0 U 8.1 10.2 14.3 1LM實施例3 :單次注射型疫苗配方之髏内效應下列實驗用Μ確定，本發明的疫苗配方，用於單次注射型疫苗配方之時，是否有較好的效果。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製實施例5製備之微顆粒分散於l.Oinl注射介質（PBS，含0.02 wt%Tween80)得到疫苗配方（樣品8)，該疫苗配方（樣品8) M26G注射針一次皮下注射到天竺鼠，抗原含量為20mg蛋白質/隻。注射後，每隔十五天或一値月，共5個月，採集血液樣品，並測定各樣品的產生之抗髏濃度 UlU/ml)。製備一Μ明礬為佐劑之對照配方如下。含HBsAg之PBS 溶液與明礬分散溶液（Superfos Biasector，Vedbaek， Denmark)混合Μ製備疫苗配方，其中HBsAg之含量為10徹克蛋白質/1.5毫克明礬。疫苗配方M 26G注射針一次注射到二組的天竺鼠，其抗原量為10微克蛋白質/毫升/注射（主要的注射）。其後，其中之一組在主要的注射（對照實施例1)十五天後以相同的抗原量作第一劑加強注射。另一値組在第一加強劑之後1.5個月，更以上述相同方法施以第二劑加強劑（對照實施例2 )。訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 23 495361 五、發明説明（21) 另外，以上述相同方法，另一組天竺鼠只施予明礬配方之主要的注射，其抗原量為20徹克蛋白質/毫升/注射 (對照實施例3,樣品9)。對照實施例1，2和3之抗體濃度UlU/inl) Μ上逑方法測定，並與樣品8l：b較其結果。其結果顯示於第3表，其中，可看到注射樣品8產生之抗體濃度高於多至三次明礬配方注射之抗髏濃度。這結果顯示本發明的疫苗配方當做單次注射型疫苗配方有良好的效果，也就是，本發明的疫苗配方20 mg蛋白質Μ單次注射，比30iug蛋白質明礬配方三次注射效果更好。第3表 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 抗體濃度 (mIU/ml) 樣品注射後時間(月） 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 樣品8 0.0 2.5 18.9 40.0 90.0 97.0 113.0 132.5 149.4 對照實例1 0.0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 對照實例2 0.0 - 18.0 - 92.2 鱗 99.8 - - 對照實例3 (樣品9) 0.0 6.8 10.7 9.2 14.4 18.0 19.5 22.0 30.2 ϋί試管施例4 ：疫苗配方顆粒性質和抗髏形成之關係、τ ΐ 經濟部中夬橾準局員工消費合作社印裝進行下列的測試Μ了解，是否可依生物可分解聚合物與核心顆粒的比例，控制抗髏產生的時間和數量。實施例4，實施例5和實施例6製備之各微顆粒，懸浮於PBSM製備單次注射型疫苗配方X樣品10, 8和11)，一次皮下注射到天竺鼠，抗原置為20mg蛋白質/隻。注射後，每隔十五天共5値月，採集血液樣品，並测定各樣品產生的抗髖濃度（mlU/iBl)。另外，測試實施例3製備之明礬配方，一次注射到天 w:. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 24 495361 Α7 Β7 五、發明説明（22) · 竺鼠，抗原量為20mg蛋白質/隻（樣品9)，並以上逑相同方法測定其產生之抗髏濃度（mIU/ml)。第1圖顯示，注射後，產生的抗體濃度隨時間而改變，其中之樣品8，PLGA/核心顆粒重量比為5，顯示增加最高比率的抗髏濃度。因此可確定，抗髏形成之速率可由生物可分解聚合物包衣的厚度調整。因此，可以用各種不同性質的不同顆粒製備含混合抗原之單次注射型疫苗，或不同釋放抗原型態的單次注射型疫苗。如那些上述的實施例，本發明單次注射型疫苗配方可 Μ只用一次注射而完成疫苗接種，而且，其產生抗體的能力比傳統疫苗配方更高。本發明已如上述特殊實例之描述，但須知本發明各種不同的修正和變化亦屬於本發明的範圍之内，如附加的申請專利範圍之定義。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部令央標準局員工消費合作社印製本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公釐） 25 H3 補充測試例 (1)位在核心顆粒中之抗原的保護除了以5 mM之PBS (150 mM NaCl與5 mM Na2HP04之水 /谷液）來取代1〇之PBS以外，藉由重覆本案實例2之流程來製備本發明之核心顆粒。除了以一無鹽溶液來取代5 mM之PBS以外，比較核心顆粒係藉由重覆上述流程來製備，該無鹽溶液係藉由在一攪拌容器内（Milipore，USA)，將無機鹽類移離5 mM之PBS 而製得。此二種核心顆粒之保護效應係依據本案測試丨之流程而利用乙酸乙酯來測試。結果示於附表4。附表4 樣品抗原性原始HBsAg溶液（對照組） 1 〇〇 —— 本發明之核心顆验 67.S ____ 比較核心顆救 | _ 21.3 如附表4所不，位在本發明之核心顆粒中的抗原仍維持高度的抗原性，而在該比較核心顆粒中，大部分的抗原均因與乙酸乙酯接觸而變性。經濟部中央標準局員工福利委員會印製 (2)單次注射型疫苗配方的活體内效應利用（1)中所得的本發明之核心顆粒以及比較核心顆粒並藉由重覆本案實例3之流程，而分別製備出本發明之微顆粒以及比較微顆粒。隨後，將兩種微藥旋分別配方於疫苗二，並以30/zg蛋白質/隻之用量來注射天竺鼠，並依據測試例3之流程來測定受測動物血液中所形成的抗體濃度。 495361 H3 結果示於附表5。附表5 Ab 濃度(mIU/ml) 樣品注射後之時間（月） 1 2 3 4 5 6 7 . 本發明之微顆粒 15.34 81.49 110 99.75 203.6 151.0 94.1 比車父微顆粒 8.04 44.01 50 46.5 89.04 62.5 36.25 如附表5所示，藉由注射本發明之微顆粒所生成的抗體濃度較注射該比較微顆粒所生成者為高，此顯示出，本發明之組成物具有較該比較微顆粒更為優越的疫苗化效應。此外更進行一系列實驗，以檢測本發明之範圍是否能擴及除了 HBsAg以外的其他抗原。在這些實驗中，藉由重覆本案實例1之流程，而製得含有preS2與S所構成的混合物以及含有破傷風類毒素的核心顆粒。位在核心顆粒中之preS2與S所構成的混合物以及破傷風類毒素之抗原性剝係依據本案測試例1來檢測，其結果分別示於附表6及7。經濟部中央標準局員工福利委員會印製本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) 495361 Η 經濟部中央標準局員工福利委員會印製附表6 樣品編號水溶性聚合物有機溶劑抗原性(％) 不可溶性沈澱 preS2與S之混合物的原始溶液 — - 100 - a 羥丙基纖維素 (0.3 mg/ml) 乙腈 79 一乙酸乙酯 81 b 羥丙基纖維素 (1.5 mg/ml) 乙腈 80 一乙酸乙酯 80 — c 羥丙基纖維素 (3.0 mg/ml) 乙腈 90 — 乙酸乙酯 87 — d 羥丙基纖維素 (3.0 mg/ml) 乙酸乙酯 85 - e 羥丙基纖維素 (3.0 mg/ml) 乙酸乙酯 88 — 對照組不使用乙腈 0 有生成乙酸乙酯 0 有生成附表7 樣品編號水溶性聚合物有機溶劑抗原性(％) 不可溶性沈澱破傷風類毒素原始溶液 - - 100 — f 羥丙基纖維素 (0.3 mg/ml) 乙腈 83 乙酸乙酯 85 — g 經丙基纖維素 (1.5 mg/ml) 乙腈 87 -- 乙酸乙酯 90 -- h 羥丙基纖維素 (3.0 mg/ml) 乙腈 80 -- 乙酸乙酯 79 -- I 羥丙基纖維素 (3.0 mg/ml) 乙酸乙酯 88 — j 羥丙基纖維素 (3.0 mg/ml) 乙酸乙酯 95 -- 對照組不使用乙腈 0 有生成乙酉曼乙酯 0 有生成如附表6及7所示，位在本發明之核心顆粒内的preS2 與S混合物以及破傷風類毒素之抗原性仍可維持。藉由重覆本案實例5之流程，從源自於樣品e及j的核 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) 495361

經濟部中央標準局員工福利委員會印製心顆粒分別製得微顆粒。此等微顆粒之活體内效應係依據本案測試例2來檢測，其結果示於附表8及9。依據測試例2，藉由以PLGA來包衣未經水溶性物質包衣的抗原顆粒，以作為一比較性樣品。 B表8

Ab 濃度(mIU/ml) 注射毛 1之時間（月）樣品 0 1 2 3 4 5 6 樣品e 0.0 21.0 82.1 115.6 132.9 154.8 189.2 比較樣品 0.0 17.9 65.7 98.2 105.3 122.4 148.2 所表9

Ab 濃度(mlU/ml：) 樣品注射毛 1之時間（月）. 0 1 2 3 4 5 6 樣品j 0.0 1.5 3.6 3.7 3.5 3.1 2.7 比較樣品 0.0 0.2 0.9 1.5 1.3 1.1 0.8 如附表8及9所示，包含有preS2與S混合物以及破傷風類毒素之本案微顆粒，在作為一種單次注射疫苗配方上具有更為優越的效應。因此，前述實驗之結果可證實，本發明之範圍非僅限於HBsAg，更可擴及諸如preS2與S混合物以及破傷風類毒素等其他抗原。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐)

Claims

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 495361 A8 ; B8 I C8 j 4 丨.¾ Qa、: --- • 一 1 ---------- ·--— 六、申請專利範圍第85103077號專利再審查案申請專利範圍修正本修正日期：9 0车1 Η 1. 一種微顆粒，其具有-位在0.5至3〇〇心之範圍内的顆粒尺寸，該微顆粒係藉由下列方式來製備：利用/ 水溶性物質與-藥學上可接受之無機鹽所構成之混合物來包衣一種抗原或數種抗原所構成之混合物而得一核心顆粒，並利用一生物可分解聚合物來包衣該核心顆粒，該水溶性物質係擇自於由醣類、蛋白質、胺基酸及此等之混合物所構成的群组中，卩及該生物可分解聚合物係擇自於由聚乙交酯、聚乳交酯、乳交酯一乙交酯共聚物、草酸鹽共聚物、聚（4-己内酯）、乳交酯-(4-己内酯）共聚物、聚酯醯胺、聚鄰酯、聚（石·羥丁酸）、聚酸酐及此等之混合物所構成的群組中。 2·如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中該抗原為一經弱化、殺死或重組型的抗原。 3 ·如申凊專利範圍第1項之微顆粒，其中該核心顆粒更包含一佐劑。 4·如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中，該抗原係用於一或多種疾病，其係擇自於下列所構成之群組中：肝炎、白喉、水痘、傷寒、百日咳、破傷風、肺結核、沙門氏菌病、霍亂、HIV、泡疹、黃熱病、麻疹、小兒麻痺症、德國痲疹、流行性腮腺炎、狂犬病、鼠疫、血吸蟲病、流行性感冒、腫瘤、錐蟲病、萊什曼病、麻瘋病、腦膜炎及癔疾。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------訂--— (請先M讀背面t注意事項再填寫本頁) 線 -26- 六、申請專利範圍 •如申凊專利範圍第3項之微顆粒，其中該佐劑為明礬；胞壁酸二胜肽、胞壁酸三胜肷及其衍生物；提摩辛a (tym〇sina );單磷酸脂a ;皂素；免疫促進複合物；多電解質；或此等之混合物。 6·如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中該水溶性物質之用量為1到50倍抗原的重量。 7·如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中該醣類為纖維素聚合物、葡萄糖、木糖、半乳糖、果糠、乳糖、麥芽糖、蔗糖、藻酸鹽、葡萄聚糖、透明質酸、軟骨素硫酸鹽或此等之混合物。 8·如申請專利範圍第7項之微顆粒，其中該纖維素聚合物為經丙基纖維素、羥丙曱基纖維素、羧甲基纖維素、鼓甲基纖維素鈉鹽或此等之混合物。 9·如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中該蛋白質為明膠、白蛋白或此等之混合物。 10 ·如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中，該胺基酸為罗至笨基甘胺酸、丙胺酸、穀胺酸、精胺酸、離胺酸或其鹽類’或此等之混合物。 11 ·如申请專利範圍第1項之微顆粒，其中該核心顆粒的顆粒尺寸係位在0.1到200 之範圍内。 12·如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中該生物可分解聚合物之用量為1比100倍核心顆粒的重量。 13.如申請專利範圍第1項之微顆粒，其中該無機鹽係擇自於由磷酸之鈣鹽、氯化鈉及此等之混合物所構成的本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) #------—訂”丨經濟部智慧財產局員JL消費合作社印製 •線丨.-------·----------------- -27- 495361 §1 C8 ~—— -—_ 六、申請專利範圍群組中。 14· 一種單次注射型疫苗配方，其係藉由將申請專利範圍第1至13項中任一項之微顆粒分散於一注射介質内而製備出。 15·如申請專利範圍第14項之單次注射型疫苗配方，其中該注射介質為一任擇地包含有一藥學上可接受之分散劑及/或一藥學上可接受之防腐劑的緩衝液。 16·如申晴專利範圍第1 5項之單次注射型疫苗配方，其中該注射介質為食用油、礦物油、鱈魚肝油、鯊烯、鯊烧、單-、雙-或三-酸甘油酯，或此等之混合物。 17.如申凊專利範圍第16項之單次注射型疫苗配方，其中該食用油為玉米油、芝麻油、撤揽油、大豆油、紅花油、棉花子油、花生油或此等之混合物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -28-