DE69831415T2

DE69831415T2 - Schnellfreisetzende enkapsulierte bioaktive wirkstoffe zur induzierung einer immunantwort und verwendung derselben

Info

Publication number: DE69831415T2
Application number: DE69831415T
Authority: DE
Inventors: K. Jay STAAS; R. Thomas TICE; Syamal Raychaudhuri; R. Paul SLEATH
Original assignee: Corixa Corp; Brookwood Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Corixa Corp; Surmodics Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: HK1029742A1; EP1009386A1; DK1009386T3; CA2301587C; DE69831415D1; CA2301587A1; AU9125698A; WO1999009956A1; AU760034B2; ES2248914T3; EP1009386B1; US6312731B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt biologisch aktive Mittel bereit, die in eine schnell freisetzende polymere Zusammensetzung eingekapselt sind, die eine Immunantwort induzieren oder potenzieren können, und Verfahren zu ihrer Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der Regulation von Tumorwachstum als auch beim Schutz gegen Infektionskrankheiten. Sie erkennen antigene Peptide, die an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden sind, entweder von tumorassoziierten Antigenen oder von Antigenen von infektiösen Mitteln. Diese Peptide werden im Cytosol erzeugt und dann in das endoplasmatische Retikulum überführt, wo sie an MHC-Klasse-I-Moleküle binden. Der Peptid-Klasse-I-Komplex wird dann an die Zelloberfläche transportiert, wo er den CTLs präsentiert wird. Um CTL-Antworten zu induzieren oder zu potenzieren, ist es daher allgemein notwendig, Proteinantigene in das Cytoplasma zu bringen.
Ein Ansatz, der verwendet wurde, um Antigene in den MHC-Klasse-I-Pfad einzuschleusen, ist die Verwendung rekombinanter infektiöser Mittel, wie Vaccinia-Virus, Adeno-Virus, Listeria monoyctogenes und anderer ähnlicher Vektoren. Eine Anzahl von Sicherheitsbedenken müssen jedoch adressiert werden, bevor infektiöse Mittel eine weit verbreitete Akzeptanz bei der Verwendung für Impfstoffe haben können. Andere Ansätze beinhalten übliche Adjuvantien, wie Alaun oder auf Öl basierende Materialien, wie Montanide 720 oder TiterMax, um Antigene in Form von Emulsionen abzugeben. Alaun erzeugt jedoch schwache und variable CTL-Antworten und ist typischerweise nicht wirksam darin, Immunantworten auf schwache Antigene zu induzieren. Bei auf Öl basierenden Adjuvantien ist Toxizität ein Thema, das bis jetzt noch nicht befriedigend behandelt wurde. Demzufolge wurden eine Anzahl neuer Adjuvantien entwickelt, wie QS21 und AF, und zeigen in einigen Fällen, dass sie CTL-vermittelte Antworten induzieren können. Es bleibt jedoch ein eindeutiger Bedarf für ein Abgabesystem, das biologisch sicher ist, bestehen, wobei es gleichzeitig starke CTL-Antworten gegen Antigene von Tumoren oder von infektiösen Krankheiten induzieren können soll.
Die Verwendung der Mikroverkapselung, um empfindliche biologisch aktive Mittel vor einem Abbau zu schützen, ist mittlerweile wohl bekannt geworden. Typischerweise wird ein biologisch aktives Mittel in einem schützenden Wandmaterial verkapselt, das gewöhnlich ein Polymer ist. Das Polymer, das verwendet wird, um das biologische Mittel zu verkapseln, ist typischerweise ein einzelnes Copolymer oder Homopolymer. Beispielhafte Polymere für Nahtmaterial, Prothesen und andere medizinische Vorrichtungen ebenso wie für Wirkstoff- und Antigenträger sind Polylactid, Polyglycolid und Poly(iactid-co-glycolid). Diese Polymere und Copolymere wurden verwendet, um MHC-Klasse-II-Antworten hervorzurufen. Z.B. offenbart U.S.-Patent Nr. 5 417 986 von Reid et al. die Abgabe eines Antigens unter Verwendung von Poly(lactid-co-glycolid)mikrokügelchen. Das mikroverkapselte Antigen wurde Kaninchen injiziert, um eine Antikörperantwort zu erzeugen.
Ertl et al. (Vaccine, 1996, Bd. 14, Nr. 9, Peyer's patch 879–885) offenbart die Verwendung von Poly(lactid-co-glycolid)polymeren, um lineare Peptidepitope als Peptidimpfstoffe einzuarbeiten, um MHC-Klasse-II-Antworten hervorzurufen. Hermann et al. (International Journal of Pharmaceutics, 1995, 126, Peyer's patch 129–138) offenbart die Herstellung von biologisch abbaubaren Polyestermikrokügelchen aus Poly(lactid) und Poly(lactid-co-glycolid), die Somatostatin enthalten, das ein Peptidwirkstoff ist. Thomasin et al. (Journal of Controlled Release, 1996, 41, Peyer's patch 131–145) offenbart den Abbau von Poly(lactid)- und Poly(lactid-co-glycolid)mikrokügelchen und die gleichzeitige Freisetzung eines natürlichen und synthetischen Antigens, um eine Immunantwort in Mäusen hervorzurufen.
Eine Kombination von zwei oder mehr Arten von polymeren Mikrokügelchen, die ein biologisch aktives Mittel enthalten, wurde gemacht. Es wurde gezeigt, dass solche Kombinationsmikrokügelchen auch MHC-Klasse-II-Antworten hervorrufen. Men et al. (Vaccine, 1995, 13 (7), Peyer's patch 683–689) offenbaren die Kombination oder eine Mischung von Mikrokügelchen, die getrennt aus Poly(lactid) bzw. Poly(lactid-co-glycolid) hergestellt wurden mit einem Molekulargewicht im Bereich von 12.000 bis 129.000 Dalton, die Tetanustoxoid als biologisch aktives Mittel enthielten. Die Mikrokügelchen riefen eine T-Zellen-proliferierende Antwort und Antikörperproduktion hervor.
Obwohl frühere Arbeiten bei der Forschung auf dem Gebiet der Abgabe von immunologischen Mitteln die Abgabe starker Antigene erreichten, um eine Immunantwort hervorzurufen, wie eine CTL-Antwort, besteht ein großer Bedarf für Abgabesysteme, die eine CTL-Antwort auf weniger immunogene Antigene bewirken können. Solche Systeme können verwendet werden, um äußerst nützliche wirksame Impfstoffe zu entwickeln. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf sehr effektiv, indem Zusammensetzungen eines Antigens, das in Mikrokügelchen verkapselt ist, die das Antigen schnell freisetzen, sobald sie von der Zelleaufgenommen wurden, um eine starke CTL-Antwort hervorzurufen, bereitgestellt werden. Die Zusammensetzungen können eine Immunantwort sogar gegen schwach immunogene Antigene induzieren. Die erfinderischen verkapselten Antigene können daher eine Immunantwort und insbesondere eine CTL-Antwort induzieren, die ausreichend ist, um für wirksame Impfstoffe verwendet zu werden. Weiterhin erfüllt die vorliegende Erfindung den Bedarf für effektive Impfstoffe, indem ein Mittel bereitgestellt wird, um irgendeine Immunantwort zu potenzieren, indem einem Wesen, das die Immunantwort erzeugt, ein biologisch aktives Mittel verabreicht wird, das zu einer Adjuvans-Funktion fähig ist, verkapselt in einem Mikrokügelchen, das das biologisch aktive Mittel schnell freisetzt. Die verbesserte Abgabe des biologisch aktiven Mittels stimuliert eine verbesserte Immunantwort.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert Antigene oder Nucleinsäuren, die ein Antigen codieren, die in einer schnell freisetzenden Polymerzusammensetzung verkapselt sind, die eine CTL- oder T-Helfer-Antwort induzieren oder potenzieren kann, und Methoden zu ihrer Verwendung.
Gemäß dem Zweck dieser Erfindung, wie er hier ausgeführt und breit beschrieben wird, betrifft diese Erfindung gemäß einem Aspekt eine Zusammensetzung, um eine CTL-Antwort bei einem Lebewesen bzw. Wesen zu induzieren, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer po lymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung eine Mischung, d.h. mechanische Mischung bzw. ein Blend von Komponenten aufweist:

(a) ein Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der Polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und
(b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente, wobei (b) mindestens zweimal so schnell biologisch abgebaut wird wie Komponente (a).

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass eine CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung mit einem Grad von mindestens 30% Cytotoxizität messbar ist. Die Zusammensetzung kann weiterhin ein biologisch aktives Mittel enthalten, das kein Antigen ist und das eine Immunantwort induzieren oder potenzieren kann oder insbesondere eine CTL-Antwort induzieren oder potenzieren kann. Das nicht-antigene biologisch aktive Mittel kann in der polymeren Zusammensetzung verkapselt sein oder das nicht-antigene biologisch aktive Mittel kann unverkapselt in der Zusammensetzung vorhanden sein.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Zusammensetzung, um eine T-Helferzellantwort bei einem Lebewesen zu induzieren, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer Polymerzusammensetzung enthält, wobei die Polymerzusammensetzung ein Blend von Komponenten aufweist:

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik für die Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass eine T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung messbar ist in einem Ausmaß, das mindestens das Zweifache des Hintergrunds ist, was durch T-Zellproliferation oder Cytokininduktion gemessen wird.
Es wird auch eine Zusammensetzung bereitgestellt, um eine bereits bestehende CTL-Antwort auf ein Antigen bei einem Lebewesen zu potenzieren, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, verkapselt in einer Polymerzusammensetzung enthält, wobei die Polymerzusammensetzung ein Blend von Komponenten aufweist:

(a) ein Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der Polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und
(b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente, wie oben definiert.

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik für eine Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass die potenzierte CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung messbar ist in einem höheren Ausmaß als die vorher bestehende CTL-Antwort. Das biologisch aktive Mittel kann ein Antigen enthalten, gegen das die Immunantwort induziert oder potenziert wird, oder eine Nucleinsäure, die funktionell ein solches Antigen codiert.
Weiterhin wird eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer bereits bestehenden T-Helferzellantwort auf ein Antigen in einem Lebewesen bereitgestellt, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend von Komponenten aufweist:

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung liefern, dass die potenzierte T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung messbar ist in einem höheren Ausmaß als die vorher bestehende T-Helferzellantwort.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, um ein Arzneimittel zur Induktion einer CTL-Antwort bei einem Lebewesen herzustellen.
Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung liefern, dass eine CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung messbar ist in einem Ausmaß von mindestens 30% Cytotoxizität, wodurch die CTL-Antwort in dem Lebewesen induziert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert auch die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels, um eine T-Helferzellantwort in einem Lebewesen zu induzieren; wobei die Zusammensetzung, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer Po lymerzusammensetzung, enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend von Komponenten aufweist:

(a) ein Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der Polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und
(b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente,

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass eine T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung messbar ist in einem Ausmaß, das mindestens das Zweifache des Hintergrunds ist, wie durch T-Zell proliferation oder Cytokininduktion gemessen, wodurch die T-Helferzellantwort in dem Lebewesen induziert wird.
Eine Zusammensetzung, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend aufweist von:

(a) einem Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und
(b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente,

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass die potenzierte CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung messbar ist in einem höheren Grad als die vorher bestehende CTL-Antwort, wodurch die vorher bestehende CTL-Antwort in dem Lebewesen potenziert wird.
Eine Zusammensetzung, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend von

(a) einem Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und
(b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente aufweist,

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass die potenzierte T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung messbar ist mit einem höheren Grad als die vorher bestehende T-Helferzellantwort, wodurch die bereits bestehende T-Helferzellantwort in dem Lebewesen potenziert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, in einem Verfahren, um eine CTL-, T-Helferantwort in einem Lebewesen zu induzieren, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein schnell biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Zusammensetzung in einem Verfahren zur Induktion einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, enthält verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung, wobei die polymere Zusammensetzung ein nicht-blockiertes oder unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung in einem Verfahren zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer enthält mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung in einem Verfahren zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein biologisch aktives Mittel verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung in einem Verfahren zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, das beinhaltet, dass ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, das eine CTL- oder T-Helferzellantwort potenzieren kann, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, um eine CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen zu induzieren, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, aufweist verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Induktion einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Induktion einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung mit einem Antigen oder einer Nucleinsäure, die das Antigen codiert, enthält, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, enthält, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die ein Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid aufweist.
Weitere Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung angegeben und ergeben sich teilweise aus der Beschreibung oder finden sich bei Durchführung der Erfindung. Die Vorteile der Erfindung werden realisiert und erreicht mithilfe von Elementen und Kombinationen, die insbesondere in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt sind. Es versteht sich, dass sowohl die vorhergehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und erklärend sind und nicht die Erfindung beschränken sollen, wie sie beansprucht wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Einführung eines Antigens mit Ova/PLG1-Mikrokügelchen in den Klasse-I-MHC-Pfad. PLG1-Mikrokügelchen enthalten ein einziges Polymer.
2a–c zeigen die in-vivo-Induktion von CTLs mit Ova, das in PLG1-Mikrokügelchen verkapselt ist.
3a–e zeigen eine Untersuchung zur Kinetik der Ova/PLG1-Immunisierung.
4a–c zeigen die in-vivo-Induktion von CTLs durch P815-I-Peptid verkapselt in PLG1-Mikrokügelchen.
5 zeigt die Induktion einer Antitumorimmunität bei Mäusen, die mit P815-1/PLG1-Mikrokügelchen immunisiert wurden.
6a–i zeigen Anti-Ova-Induktion von Ova, das unter Verwendung der Blend-Komponentensysteme dieser Erfindung verkapselt wurde.
7a–b zeigen % Cytotoxizität, die erreicht wird unter Verwendung von zwei Mikrokügelchenpräparaten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann leichter unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und der darin enthaltenen Beispiele verstanden werden.
Es versteht sich, dass die hier verwendete Terminologie nur dem Zweck dient, spezielle Ausführungsformen zu beschreiben und nicht beschränkend sein soll. Es ist anzumerken, dass die Singularformen "ein", "eine", "einer" und "der", "die", "das", wie sie in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, die Pluralformen einschließen, wenn der Kontext nicht eindeutig dagegenspricht.
In der gesamten Anmeldung wird auf Literaturstellen Bezug genommen, deren Offenbarung in ihrer Gesamtheit hier durch Bezugnahme in die Anmeldung mitaufgenommen wird, um den Stand der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, vollständiger zu beschreiben.
Blend-Zusammensetzungen
Ein Aspekt der Erfindung betrifft Zusammensetzungen, um eine Immunantwort in einem Lebewesen zu induzieren. Spezifisch wird eine Zusammensetzung zur Induktion einer CTL-Antwort in einem Lebewesen bereitgestellt, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend von

(a) einem Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und
(b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente aufweist.

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass eine CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem Ausmaß von mindestens 30% Cytotoxizität messbar ist. Die Zusammensetzung kann weiterhin ein biologisch aktives Mittel, das kein Antigen ist, das auch als nicht-antigenes biologisch aktives Mittel bezeichnet wird, enthalten, das eine Immunantwort induzieren oder potenzieren kann oder insbesondere eine CTL-Antwort. Das nicht-antigene biologisch aktive Mittel kann in der polymeren Zusammensetzung verkapselt sein oder das nicht-antigene biologisch aktive Mittel kann in der Zusammensetzung unverkapselt vorhanden sein.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Zusammensetzung zur Induktion einer T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend von

(a) einem Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und
(b) einer schnell biologisch abbaubaren Komponente, wie oben definiert, aufweist.

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung bereitstellen, dass eine T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem im Vergleich zum Hintergrund mindestens zweifachen Ausmaß messbar ist, wie es durch T-Zellproliferation oder Cytokininduktion gemessen wird.
Bei jeder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, ob zur Induktion oder Potenzierung einer Immunantwort, kann die Zusammensetzung weiterhin ein biologisch aktives Mittel, das kein Antigen ist, enthalten, das eine Immunantwort oder insbesondere eine CTL-Antwort, eine T-Helferzellantwort und/oder eine neutralisierende Antikörperantwort induzieren oder potenzieren kann. Das nicht-antigene biologisch aktive Mittel kann in der polymeren Zusammensetzung verkapselt sein. Alternativ oder zusätzlich kann ein lösliches oder nicht lösliches (z.B. Suspension) nicht-antigenes biologisch aktives Mittel in der Zusammensetzung unverkapselt vorhanden sein.
Weiterhin kann bei Verfahren unter Verwendung dieser Zusammensetzungen das nicht-antigene biologisch aktive Mittel dem Lebewesen verabreicht werden bei einer Verabreichung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung getrennt von der Verabreichung eines verkapselten Antigens, wobei das Antigen in einer Zusammensetzung der Erfindung oder in einer weiteren Zusammensetzung verabreicht wird. Die Verabreichung der Zusammensetzung mit dem nicht-antigenen biologisch aktiven Mittel der Erfindung kann vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des Antigens erfolgen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch Zusammensetzungen, um eine Immunantwort auf ein Antigen zu potenzieren. So wird spezifisch eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer bereits bestehenden CTL-Antwort auf ein Antigen in einem Lebewesen bereitgestellt, die ein biologisch aktives Mittel verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend von Komponenten aufweist:

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels bereitstellen, dass die potenzierte CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem höheren Grad als die bereits bestehende CTL-Antwort messbar ist.
Weiterhin wird eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer bereits bestehenden T-Helferzellantwort auf ein Antigen in einem Lebewesen bereitgestellt, die ein biologisch aktives Mittel verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend von

Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels bereitstellen, dass die potenzierte T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem höheren Grad messbar ist als die vorher bestehende T-Helferzellantwort.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Induktion einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton enthält.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Induktion einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, das eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, enthält, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Induktion einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polyiactid oder Polyglycolid aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein biologisch aktives Mittel verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein biologisch aktives Mittel verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer CTL- oder T-Helferantwort in einem Lebewesen, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein biologisch aktives Mittel verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid aufweist.
Bei jeder Zusammensetzung dieser Erfindung, die zur Induzierung oder Potenzierung einer Immunantwort verwendet wird, ist das biologisch aktive Mittel ein Mittel, das eine Immunantwort bei Verabreichung an ein Lebewesen induzieren oder potenzieren kann, wobei die Immunantwort, die induziert oder potenziert wird, eine CTL- oder T-Helferzellantwort ist. Somit kann das biologisch aktive Mittel ein Antigen enthalten, gegen das die Immunantwort induziert oder potenziert wird, oder das biologisch aktive Mittel kann eine Nucleinsäure, die funktionell ein solches Antigen codiert, enthalten. Eine Nucleinsäure, die funktionell ein Antigen codiert, ist eine Nucleinsäure, die ein Antigen in den Zellen, in die die Nucleinsäure aufgenommen wird, exprimieren kann; z.B. hat eine solche Nucleinsäure geeignete Expressionskontrollen (z.B. Promotor, Enhancer, falls erwünscht, Translations-Startcodon, Polyadenylierungssignal etc.) und eine Codonverwendung, die mit den Zellen kompatibel ist.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können eine Kombination von Immunantworten in dem Lebewesen, an das die Zusammensetzung verabreicht werden, erzeugen. So kann man z.B. eine cytotoxische T-Zell-(CTL)-Antwort und/oder eine T-Helferzellantwort erreichen. Jede Antwort kann mit auf diesem Gebiet bekannten Standardmethoden gemessen oder nachgewiesen werden, wie sie hier auch gelehrt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann bei allen Zusammensetzungen dieser Erfindung für eine CTL-Antwort die Antwort gemessen werden durch den Prozentanteil der erreichten Cytotoxizität, was im Stand der Technik eine Standardmethode ist, die hier auch angegeben wird. Für eine CTL-Antwort ist eine befriedigende Zusammensetzung eine, die eine solche Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels erzeugen kann, z.B. eine Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung, dass bevorzugt eine CTL-Antwort innerhalb von 14 bis 30 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem solchen Ausmaß messbar oder nachweisbar ist, dass mindestens 30% Cytotoxizität erreicht werden. Der Grad kann höher sein, z.B. 40% Cytotoxizität, 50% Cytotoxizität, 60% Cytotoxizität, 70% Cytotoxizität, 80% Cytotoxizität, 90% Cytotoxizität oder sogar 100% Cytotoxizität. Der Ausdruck "Kinetik der Freisetzung" wird definiert als die Rate, mit der das biologisch aktive Mittel aus der verkapselten Polymerzusammensetzung freigesetzt wird. Zusätzlich kann die Antwort bei einem ausgewählten Grad von Cy totoxizität innerhalb kürzerer Zeiträume nachweisbar sein, z.B. nach 12 Tagen, 10 Tagen, 8 Tagen, 7 Tagen, 5 Tagen oder früher, nach einer einzelnen Verabreichung der Zusammensetzung. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Antwort in einem ausgewählten Ausmaß der Cytotoxizität nach 7 Tagen gemessen oder nachgewiesen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann für alle Zusammensetzungen der Erfindung eine T-Helferzellantwort gemessen werden durch T-Zeliproliferation oder Cytokininduktion, was auf diesem Gebiet Standardmethoden sind, die hier auch angegeben werden. Für eine T-Helferzellantwort ist eine zufrieden stellende Zusammensetzung eine, die bevorzugt eine solche Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels, z.B. Antigen- oder Nucleinsäurefreisetzung liefern kann, dass eine T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung der Zusammensetzung in einem Grad messbar oder nachweisbar ist, der mindestens das Zweifache des Hintergrunds ist, gemessen durch T-Zellproliferation oder Cytokininduktion. Eine stärkere Antwort kann auch erreicht werden, z.B. dreifach, vierfach, fünffach, zehnfach, fünfundzwanzigfach, fünfzigfach, hundertfach oder noch höher im Vergleich zum Hintergrund. Zusätzlich kann eine schnellere Antwort erreicht werden, z.B. ein Ausmaß von mindestens dem Zweifachen im Vergleich zum Hintergrund innerhalb von 12 Tagen, 10 Tagen, 8 Tagen, 7 Tagen, 5 Tagen oder früher nach einer einzelnen Verabreichung der Zusammensetzung. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Antwort bei einem ausgewählten Ausmaß der T-Zellproliferation nach 7 Tagen gemessen oder nachgewiesen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können alle Zusammensetzungen der Erfindung als zweite oder Booster-Verabreichung und/oder als Potentiator einer früheren CTL-Antwort verwendet werden. Eine befriedigende Zusammensetzung für diese Verwendung ist eine, die eine solche Kinetik der Freisetzung eines biologisch aktiven Mittels liefern kann, dass bevorzugt eine potenzierte CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem Ausmaß, das größer ist als die vorbestehende CTL-Antwort, messbar oder nachweisbar ist. Ein solches Ausmaß kann bevorzugt mindestens 30% Cytotoxizität, 40% Cytotoxizität, 50% Cytotoxizität, 60% Cytotoxizität, 70% Cytotoxizität, 80% Cytotoxizität, 90% Cytotoxizität oder sogar 100% Cytotoxizität sein. Zusätzlich kann die Antwort bei einem ausgewählten Grad der Cytotoxizität z.B. einen höheren Grad als der vorbestehenden CTL-Antwort, innerhalb kürzerer Zeiträume, wie 12 Tage, 10 Tage, 8 Tage, 7 Tage, 5 Tage oder früher nach einer einzigen Verabreichung der Zusammensetzung nachweisbar sein. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die potenzierte Antwort innerhalb von 7 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem Ausmaß gemessen oder nachgewiesen werden, das größer ist als die vorbestehende CTL-Antwort.
In einer bevorzugten Ausführungsform können alle Zusammensetzungen der Erfindung als zweite oder Booster-Verabreichung und/oder als Potentiator einer früheren T-Helferzellantwort verwendet werden. Die Antwort kann durch T-Zellproliferation oder Cytokininduktion gemessen werden, was Standardmethoden im Stand der Technik sind, die hier auch gezeigt werden. Für eine T-Helferzellantwort ist eine befriedigende Zusammensetzung für die Potenzierung eine, die bevorzugt eine solche Kinetik der Freisetzung eines biologisch aktiven Mittels bieten kann, dass eine potenzierte T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung der Zusammensetzung in einem Ausmaß messbar oder nachweisbar ist, das größer ist als die vorbestehende T-Helferzellantwort oder mindestens zweifach gegenüber dem Hintergrund erhöht ist, gemessen durch T-Zellproliferation oder Cytokininduktion. Eine stärkere Antwort kann auch erhalten werden, z.B. 3-fach, 4-fach, 5-fach, 10-fach, 25-fach, 50-fach, 100-fach oder mehr im Vergleich zum Hintergrund. Zusätzlich kann eine schnellere Antwort erzielt werden, z.B. in einem Ausmaß, das größer ist als die vorbestehende T-Helferzellantwort oder mindestens 2-fach höher als der Hintergrund ist innerhalb von 12 Tagen, 10 Tagen, 8 Tagen, 7 Tagen, 5 Tagen oder früher nach einer einzigen Verabreichung der Zusammensetzung. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Antwort bei einem ausgewählten Grad der T-Zellproliferation nach 7 Tagen gemessen oder nachgewiesen werden, z.B. bei einem Ausmaß, das größer ist als die vorbestehende T-Helferzellantwort.
In den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist die Komponente/sind die Komponenten der polymeren Zusammensetzung biologisch kompatibel, ein Ausdruck, der im Stand der Technik bekannt ist als einer, der Komponenten einschließt, die im Wesentlichen nicht toxisch, nicht karzinogen sind und im Wesentlichen keine Entzündung in Körpergeweben bei Verabreichung induzieren sollten. Der Ausdruck mechanische "Mischung" oder "Blend" im Hinblick auf die polymere Zusammensetzung wird definiert als die Kombination von zwei oder mehr polymeren Komponenten, um eine Gesamtpolymerzusammensetzung zu bilden, die ein biologisch aktives Mittel mikroverkapselt. Wenn auf polymere Zusammensetzungen Bezug genommen wird, ist der Ausdruck "Blend", wie er hier verwendet wird, verschieden von dem Ausdruck "Gemisch". Ein "Gemisch" wird hier definiert als eine Kombination von mikroverkapselten Strukturen von jeweils getrennten Arten von Zusammensetzungen, um eine Zusammensetzung getrennter Hilfsmittelarten von verkapselten biologisch aktiven Mitteln zu erzeugen. Somit hat ein Blend zwei oder mehr Komponenten, die zuerst miteinander kombiniert werden, um dann ein einziges entweder gleichmäßiges oder nicht gleichmäßiges Zusammensetzungshilfsmaterial zu bilden, wohingegen ein Gemisch zuerst mindestens zwei verschiedene mikroverkapselte Strukturen aus getrennten Komponenten bildet und dann die getrennten mikroverkapselten Strukturen zusammen vereinigt werden. So wird für ein Gemisch eine erste mikroverkapselte Struktur erzeugt und dann eine zweite mikroverkapselte Struktur erzeugt, die verschieden von der ersten ist, und dann werden die ersten und zweiten mikroverkapselten Strukturen zu einer Zusammensetzung vereinigt.
Die polymere Zusammensetzung, die verwendet wird, um das biologisch aktive Mittel zu verkapseln, weist ein polymeres Blend-Komponentensystem auf. Der Ausdruck "Blend-Komponentensystem" wird hier definiert als ein verkapseltes System, wobei die Polymerzusammensetzung oder das Blend, die verwendet werden, um das biologisch aktive Mittel zu verkapseln, mindestens zwei Komponenten aufweisen.
Die erste Komponente des Blend-Komponentensystems, die hier als Komponente (a) bezeichnet wird, ist ein Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen. Da die Komponente (b) typischerweise eine Flüssigkeit oder fast eine Flüssigkeit oder bei Raumtemperatur klebrig ist, muss die Komponente (a) Stabilität verleihen, um eine feste oder nicht klebrige Struktur in Kombination mit Komponente (b) bei Raumtemperatur zu liefern. Die Menge an Komponente (a) kann gerade genug sein, um der Polymerzusammensetzung die minimale Integrität zu verleihen oder mehr als die minimale Menge sein. Wenn die Menge der Kompo nente (a) im Überschuss zu dem zugegeben wird, was für die strukturelle Integrität notwendig ist, nimmt die Schnelligkeit der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels ab. Die Komponente (a) stabilisiert die Zusammensetzung, was typischerweise zur Bildung und Isolierung eines stabilen Pulvers führt. Die vorliegende Erfindung ist bevorzugt ein stabiles Pulver, das leicht aufzubewahren und zu handhaben ist.
Weil die polymere Zusammensetzung, die verwendet wird, um das biologisch aktive Mittel der vorliegenden Erfindung zu verkapseln, bevorzugt zu einem stabilen Pulver führt, ist darüber hinaus die entstehende Zusammensetzung bevorzugt nicht klebrig und wird nicht klebrig oder aggregiert, sobald sie zu einem flüssigen Träger zugegeben worden ist. Typischerweise wird, wenn eine flüssige oder gelartige Zusammensetzung zu einem flüssigen Träger zugegeben wird, die polymere Zusammensetzung sich nicht gleichmäßig in dem flüssigen Träger verteilen, was zu einer ungleichmäßigen Konzentration des in dem flüssigen Träger verkapselten biologisch aktiven Mittels führt. Dies ist nicht der Fall bei der vorliegenden Erfindung, die bevorzugt ein verkapseltes biologisch aktives Mittel in Form eines Pulvers verwendet. Sobald das verkapselte biologisch aktive Mittel zu einem flüssigen Träger zugegeben worden ist, verteilt es sich bevorzugt gleichmäßig in der gesamten Lösung, was zur Bildung einer gleichmäßigen Dispersion führt.
Der Ausdruck "Menge, die ausreicht, um strukturelle Integrität zu verleihen" wird definiert als die Menge der Komponente (a), die erforderlich ist, damit das verkapselte biologisch aktive Mittel seine ursprüngliche Form behält und das biologisch aktive Mittel seine Eigenschaften in einer Dispersion behält, so dass das biologisch aktive Mittel zum vorgesehenen Zeitpunkt nach Verabreichung des verkapselten biologisch aktiven Mittels in einem flüssigen Träger freigesetzt wird. Außerdem wird die "Menge, die ausreicht, um strukturelle Integrität zu verleihen" weiter definiert als die Menge der Komponente (a), die erforderlich ist, um das verkapselte biologisch aktive Mittel in Form einzelner Teilchen zu erhalten, wenn es aufbewahrt wird. Die ausreichende Menge kann gerade genug sein, um die minimale Integrität zu schaffen, oder mehr als die minimale Menge sein.
Die zweite Komponente der polymeren Zusammensetzung, die hier als Komponente (b) bezeichnet wird, sorgt für die schnelle Freisetzung des biologisch aktiven Mittels. Komponente (b) ist eine schnell biologisch abbaubare Komponente. Komponente (b) kann eine einzelne Komponente sein, die schnell biologisch abbaubar ist. Die Ausdrücke "schnell biologisch abbaubar" und "schnell auflösend", wenn die Komponente (b) der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, werden hier so definiert, dass Komponente (b) im Minimum sich zweimal so schnell biologisch abbaut oder in einer höheren Rate löst als Komponente (a). Die Komponenten (a) und (b) können sich mit einer Anzahl von Methoden biologisch abbauen, was eine Hydrolyse oder einen enzymatischen Abbau einschließt, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Rate, mit der Komponente (b) biologisch abgebaut wird oder sich löst in Bezug auf Komponente (a) hängt ab von den für die Komponenten (a) und (b) ausgewählten Materialien. Genauer zeigt der Ausdruck "schnell", dass Komponente (b) in einer solchen Rate biologisch abgebaut wird, dass die Freisetzung des biologisch aktiven Mittels innerhalb eines Zeitraums ermöglicht wird, der eine CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort induziert oder potenziert. Eine solche Antwort kann innerhalb einiger Stunden bis mehr als 4 Stunden, mehr als 6 Stunden, mehr als 24, 36, 48 und bis zu 2 Wochen bis zu mindestens einem Monat nach Verabreichung auftreten.
In einer Ausführungsform ist die Rate, mit der Komponente (b) biologisch abgebaut wird in Bezug auf die Komponente (a) zweimal so schnell, fünfmal so schnell, zehnmal so schnell usw., wobei eine messbare CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort beobachtet wird.
Eine weite Vielfalt von Polymeren kann für die Komponenten (a) und/oder (b) verwendet werden. In einer Ausführungsform kann Komponente (a) und/oder (b) ein Poly(dien), Poly(alken), Poly(acryl), Poly(methacryl), Poly(vinylether), Poly(vinylalkohol), Poly(vinylketon), Poly(vinylhalogenid), Poly(vinylnitril), Poly(vinylester), Poly(styrol), Poly(carbonat), Poly(ester), Poly(orthoester), Poly(esteramid), Poly(anhydrid), Poly(urethan), Poly(amid), Celluloseether, Celluloseester, Poly(saccharid), Poly(lactid-co-glycolid), Poly(lactid), Poly(glycolid), Copolyoxalat, Polycaprolacton, Poly(lactid-co-caprolacton), Poly(esteramid), Polyorthoester, Poly(α-hydroxybuttersäure), Polyanhydrid oder Mischung davon sein. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Komponenten (a) und (b) ein Poly (lactid-co-glycolid), Poly(lactid), Poly(glycolid), Copolyoxalat, Polycaprolacton, Poly(lactid-co-caprolacton), Poly(esteramid), einen Polyorthoester, eine Poly(α-hydroxybuttersäure), ein Polyanhydrid oder eine Mischung davon.
Die Komponenten (a) und/oder (b) können auch Polymere sein, die durch Polymerisation mindestens eines Monomers entstehen. In einer weiteren Ausführungsform kann Komponente (b) ein Polymer oder Oligomer sein, das durch Polymerisation oder Oligomerisation mindestens eines Monomers entsteht. Beispiele für geeignete Monomere schließen α-Hydroxycarbonsäure, ein Lacton, Dien, Alken, Acrylat, Methacrylat, einen Vinylether, einen Vinylalkohol, ein Vinylketon, Vinylhalogenid, Vinylnitril, einen Vinylester, ein Styrol, ein Carbonat, einen Ester, einen Orthoester, ein Esteramid, Anhydrid, Urethan, Amid, einen Celluloseether, Celluloseester, ein Saccharid, eine α-Hydroxycarbonsäure, ein Lacton, Esteramid oder eine Mischung davon ein. In einer weiteren Ausführungsform können die oben aufgeführten Monomere auch für Komponente (b) verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Komponente (a) und/oder Komponente (b) das Polymerisationsprodukt einer α-Hydroxycarbonsäure, eines Lactons oder einer Mischung davon. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beinhaltet die α-Hydroxycarbonsäure Glycolsäure, Milchsäure, α-Hydroxybuttersäure, α-Hydroxyisobuttersäure, α-Hydroxyvaleriansäure, α-Hydroxyisovaleriansäure, α-Hydroxycapronsäure, α-Hydroxy-α-ethylbuttersäure, α-Hydroxyisoeapronsäure, α-Hydroxy-3-methylvaleriansäure, α-Hydroxyheptansäure, α-Hydroxyoctansäure, α-Hydroxydecansäure, α-Hydroxymyristinsäure, α-Hydroxystearinsäure, α-Hydroxylignocerinsäure oder eine Mischung davon. In einer Ausführungsform beinhaltet das Lacton 3-Propiolacton, Tetramethylenglycolid, β-Butyrolacton, 4-Butyrolacton, Pivalacton oder Mischungen davon.
In einer weiteren Ausführungsform enthält Komponente (a) und/oder (b) das Copolymerisationsprodukt eines Glycolids, Lactids oder einer Mischung davon. Im Fall des Lactids sind die D-, L- und DL-Formen für die vorliegende Erfindung nützlich. In einer Ausführungsform beinhaltet Komponente (a) ein Polymer, das aus Komponenten gebildet wird, die 40 bis 100 Mol-% Lactid und 0 bis 60 Mol-% Glycolid aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält Komponente (b) ein Polymer, das aus Komponenten gebildet wird, die 0 bis 100 Mol-% und 0 bis 100 Mol-% Glycolid aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform können die Komponenten (a) und (b) beide ein Copolymer sein, das die Polymerisation von Lactid und Glycolid beinhaltet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Komponente (a) ein Copolymer aus Glycolid und Lactid und Komponente (b) ist ein Homopolymer aus Lactid. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist Komponente (a) ein 60:40- bis 50:50-Poly(lactid-co-glycolid) und (b) ist Poly(lactid).
Wenn die Komponenten (a) und/oder (b) Polymere, Oligomere oder Monomere sind, die einen endständigen Carbonsäureanteil besitzen, werden sie hier als unblockiert bezeichnet. Wenn die Endgruppe keine Carbonsäure ist, sondern z.B. ein Ester ist, dann wird das entstehende Polymer, Oligomer oder Monomer als blockiert bezeichnet. Das unblockierte Polymer, Oligomer oder Monomer adsorbiert mehr Wasser und wird aufgrund der Gegenwart der Carboxylgruppe hydrolytisch schneller abgebaut als blockierte Analoga. In der vorliegenden Erfindung können Komponente (a) und/oder (b) blockiert oder unblockiert sein. In einer Ausführungsform sind die Komponenten (a) und/oder (b) in dem Blend-Komponentensystem blockiert.
Die Menge der Komponenten (a) und (b) in dem Blend-Komponentensystem der vorliegenden Erfindung kann variieren. In einer Ausführungsform bildet Komponente (a) 5 bis 95 Gew.-% und Komponente (b) 95 bis 5 Gew.-% des Polymerzusammensetzungsgewichts. In einer weiteren Ausführungsform ist die Menge von Komponente (a) größer als die Menge von Komponente (b). In einer bevorzugten Ausführungsform bildet Komponente (a) 50 bis 90 Gew.-% und Komponente (b) 10 bis 50 Gew.-% des Gewichts der Polymerzusammensetzung. In einer weiteren Ausführungsform ist die Menge von Komponente (a) kleiner als die Menge von Komponente (b). In dieser Ausführungsform bildet Komponente (a) 10 bis 50 Gew.-% und Komponente (b) bildet 50 bis 90 Gew.-% des Gewichts der polymeren Zusammensetzung. In einer weiteren Ausführungsform besteht das Blend-Komponentensystem der polymeren Zusammensetzung im Wesentlichen aus den Komponenten (a) und (b).
Das Molekulargewicht der Komponenten (a) und/oder (b) kann auch variieren. Das Molekulargewicht von Komponente (a) kann kleiner als, größer als oder gleich dem der Komponente (b) sein, wenn Komponente (b) ein Polymer ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Molekulargewicht der Komponente (a) größer als das Molekulargewicht von (b). Das Molekulargewicht des Polymers kann auch mit der inhärenten Viskosität in Verbindung stehen. Je höher der Wert für die inhärente Viskosität, desto größer ist das Molekulargewicht des Polymers. In einer Ausführungsform hat Komponente (a) eine inhärente Viskosität von weniger als 4,0 dl/g und Komponente (b) hat eine inhärente Viskosität von weniger als 2,0 dl/g und ist kleiner als die inhärente Viskosität von Komponente (a). Wenn die inhärente Viskosität eines Polymers gemessen wird, sollten die Zusammensetzung und die Löslichkeit des Polymers in Betracht gezogen werden. Die Auswahl des geeigneten Lösungsmittels und die Bestimmung der inhärenten Viskosität der Polymere ist im Stand der Technik bekannt. In einer Ausführungsform sind Chloroform und Hexafluorisopropanol geeignete Lösungsmittel, um die inhärente Viskosität eines Polymers zu bestimmen. In einer weiteren Ausführungsform, wenn der Lactidgehalt kleiner als 65 Mol-% ist oder bei einem Homopolymer des Polyglycolids, kann das verwendete Lösungsmittel Hexafluorisopropanol sein. In einer weiteren Ausführungsform, wenn der Lactidgehalt eines Lactid-Glycolid-Polymers größer als 65 Mol-% ist oder wenn es ein Homopolymer von Polylactid ist, kann das verwendete Lösungsmittel Chloroform sein. In einer weiteren Ausführungsform hat Komponente (a) eine inhärente Viskosität von 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 oder 3,0 dl/g bis 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 3,5 oder 4,0 dl/g und Komponente (b) hat eine inhärente Viskosität von 0,01 bis 2,0 dl/g, bevorzugt 0,01 bis 0,5 dl/g und noch bevorzugter 0,01 bis 0,25 dl/g. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Komponente (a) 60:40 Mol-% Poly(lactid-co-glycolid) mit einer inhärenten Viskosität von 0,49 dl/g in Chloroform oder 50:50 Poly(lactid-co-glycolid) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 dl/g in Hexafluorisopropanol und Komponente (b) ist Poly(lactid) mit einem Molekulargewicht von 2.000 Dalton bis 7.000 Dalton. Molekulargewichtsmessungen oder Bestimmungen der Komponenten sind bekannt oder leicht mit Standardmethoden zu bestätigen und die Komponenten (a) und (b) für jede gewünschte Zusammensetzung werden entsprechend ausgewählt, um strukturelle Integrität durch Komponente (a) und schnelle Freisetzung des biologisch aktiven Mittels durch Komponente (b) zu erreichen.
"Biologisch aktives Mittel", wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein biokompatibles Mittel, das eine Immunantwort bei Verabreichung an ein Lebewesen induzieren oder potenzieren kann, d.h. ein Antigen, wie es weiter unten beschrieben und erläutert wird, oder eine Nucleinsäure, die funktionell ein Antigen codiert. Unter "induzieren" einer Immunantwort wird verstanden, dass bei Verabreichung eines Antigens oder einer Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in der Zusammensetzung, eine Immunantwort bewirkt wird, d.h. stimuliert, initiiert oder induziert. Die vorliegende Methode kann auch verwendet werden, um eine Induktion einer Immunantwort zu verstärken gegenüber der, die durch Immunisierung mit dem Antigen alleine oder einer anderen immunologischen Zusammensetzung erreicht wird, die nicht schnell freisetzt, wie die vorliegende Erfindung. Unter "Potenzieren" einer Immunantwort wird verstanden, dass bei Verabreichung eines Antigens oder eines anderen biologischen aktiven Mittels, verkapselt in der Zusammensetzung, eine vorbestehende Immunantwort verbessert, gefördert, ergänzt, amplifiziert, erhöht oder verlängert wird. Die vorliegende Methode kann auch verwendet werden, um die Potenzierung der Immunantwort gegenüber der zu verstärken, die erreicht wird durch Immunisierung mit dem biologisch aktiven Mittel allein oder einem anderen immunologischen Präparat, das nicht schnell freisetzt, wie die vorliegende Erfindung es tut.
Man kann eine entstehende Immunantwort mit irgendeiner von verschiedenen Methoden bestimmen, einschließlich dem Nachweis der Gegenwart von Antikörpern, die für das Antigen spezifisch sind, der Bestimmung einer T-Zellproliferativen Antwort, der Bestimmung einer cytotoxischen T-Zellantwort unter anderen im Stand der Technik bekannten Nachweismitteln. Solche Methoden sind im Stand der Technik bekannt und werden hier beschrieben. Unter "Immunantwort" wird jede Antwort des Immunsystems verstanden, einschließlich der zellulären ebenso wie der lokalen und systemischen humoralen Immunität, wie CTL-Antworten, einschließlich einer antigenspezifischen Induktion von CD8⁺-CTLs, Helfer-T-Zellantworten einschließlich einer T-Zell-proliferativen Antwort und Cytokinfreisetzung und B-Zellantworten einschließlich einer Antikörperantwort, ohne darauf beschränkt zu sein.
Somit können die vorliegenden Zusammensetzungen für MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Antworten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ist je doch besonders bemerkenswert für ihre Fähigkeit, durch MHC-Klasse I vermittelte Antworten zu induzieren oder zu potenzieren. Je schneller die Freisetzung des biologisch aktiven Mittels ist, unabhängig davon, ob es ein Antigen oder ein anderes biologisch aktives Mittel ist, desto schneller ist die potenzielle Immunantwort und desto stärker ist die Gesamtimmunantwort, die möglich wird. Typischerweise wird die CTL-Antwort durch die vorliegenden Zusammensetzungen induziert oder potenziert zusätzlich zu einer Induktion oder Potenzierung der B-Zellantwort, einschließlich der Produktion von Antikörpern, und T-Helferzellantworten.
Die vorliegende Erfindung liefert vorteilhafterweise Methoden, die die schnelle Freisetzung des biologisch aktiven Mittels aus der Zusammensetzung fördern, wodurch eine Methode bereitgestellt wird, um das biologisch aktive Mittel in den phagozytischen Stoffwechselweg einzuleiten und eine durch MHC-Klasse I vermittelte Antwort zusätzlich zu einer durch MHC-Klasse II vermittelten Immunantwort hervorzurufen. Biologisch aktive Mittel, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, schließen ein Adjuvans (z.B. Adjuvantien, die in Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell und M. J. Newman, Herausgeber), Pharmaceutical Biotechnology Bd. 6, Plenum Press (New York 1995), aufgeführt sind); ein Antigen; eine Nucleinsäure, die funktionell ein Antigen codiert; einen Immunmodulator, eine Verbindung oder Ansammlung von Verbindungen, die eine Th1-artige Cytokinantwort (wie LeIF) hervorrufen können; ein Molekül, das mit costimulierenden Molekülen auf T-Zellen (wie anti-CD28-Antikörpern) wechselwirken kann und/oder costimulierende Moleküle hinaufregulieren kann, oder eine Mischung davon.
In einer Ausführungsform kann das Antigen ein Peptid, Polypeptid oder Protein aufweisen. Beispiele für ein Antigen schließen ein Allergen, ein virales Antigen, ein bakterielles Antigen, wie bakterielle DNA, ein Protozoenantigen, ein Tumorantigen, ein Pilzantigen, ein Antigen einer infektiösen Krankheit oder eine Mischung davon ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Spezifisch kann z.B. ein Tumorantigen Her-2/neu-Protein, Proteinfragmente oder Peptide, PSA, PSM, Mammaglobulin, Prolactin induzierendes Protein (PIP), p21 oder p53 sein; Antigene einer infektiösen Krankheit können Hepatitis-B-Oberflächenantigene, Hepatitis-C-Antigene, Malariaantigene, TB-Antigene, Chlamydia-Antigene, Herpesan tigene, flu-Antigene, HIV-Antigene, EBV-Antigene, Papilloma-Antigene und H.-pylon-Antigene sein. Antigene, einschließlich antigener Fragmente eines Proteins, können leicht mit Standardmitteln zur Bestimmung der Antigenizität von Substanzen bestimmt werden.
Ein "nicht-antigenes biologisches aktives Mittel" bzw. ein biologisch aktives Mittel, das kein Antigen ist, kann ein Adjuvans sein. Wie es im Stand der Technik bekannt ist, ist ein Adjuvans eine Substanz, die im Zusammenhang mit einem Antigen die Immunantwort auf das Antigen verstärkt. Allgemein können Adjuvantien solche Moleküle, wie Cytokine, Immunmodulatoren und costimulatorische Moleküle einschließen. Für die in-vivo-Verwendung sollten nicht-toxische Adjuvantien ausgewählt werden, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Ein Adjuvans kann mit Standardkriterien basierend auf dem verwendeten Antigen, der Art der Verabreichung und dem Lebewesen ausgewählt werden (R. Arnon (Herausgeber), Synthetic Vaccines I: 83–92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1987). Mit der Verwendung eines Adjuvans ist es möglich, eine noch stärkere Immunantwort zu induzieren oder zu potenzieren, wenn es in Kombination mit dem biologisch aktiven Mittel der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Z.B. kann die polymere Zusammensetzung ein biologisch aktives Mittel und ein Adjuvans enthalten, wobei ein Adjuvans in einer zweiten polymeren Zusammensetzung verkapselt ist, wobei die zweite polymere Zusammensetzung ein Blend eines Polymers aufweist, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der polymeren Zusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen, und eine schnell biologisch abbaubare Komponente.
Ein nicht-antigenes biologisch aktives Mittel kann auch eine Nucleinsäure aufweisen, die funktionell ein Adjuvans codiert.
Nützliche Adjuvantien schließen ein Cytokin, z.B. ein Lymphokin, Monokin oder Chemokin, oder einen Cytokininduktor oder ein Mittel, das den Eintritt des verkapselten biologischen Mittels in das Cytoplasma der Zelle erleichtert, ein, ohne darauf beschränkt zu sein. In einer Ausführungsform beinhaltet das Cytokin IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IFN-α, IFN-β, GM-CSF, Flt31 oder eine Mischung davon. Diese Cytokine könnten entweder als lösliche oder unlösliche Einheiten mit einem verkapselten Antigen oder verkapselt in Mikrokügelchenpräparate verabreicht werden.
Andere Beispiele für Adjuvantien, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, schließen Plasmid-DNA oder bakterielle Mittel ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Ein Adjuvans kann z.B. auch einen Immunmodulator enthalten. Ein Immunmodulator könnte costimulatorische Moleküle, wie B7 oder CTLA-4 hinaufregulieren oder könnte Th1-artige Antworten verstärken. Moleküle, die eine Th1-artige Antwort in vivo verstärken, könnten mit den antigenhaltigen Mikrokügelchen verabreicht werden, um die T-Zellantworten bevorzugt zu verstärken. Ein Beispiel für ein solches Molekül ist LeIF, ein von Leishmania abgeleitetes Protein, von dem gezeigt wurde, dass es eine Th1-Antwort induziert. Weiterhin kann eine Nucleinsäure, die ein costimulatorisches Molekül codiert, verabreicht werden, um das costimulatorische Molekül zu liefern.
Zusätzliche Adjuvantien schließen jede Verbindung ein, die in Kapitel 7 (Seiten 141–227) von "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" (Herausgeber M. F. Powell und M. J. Newman), Pharmaceutical Biotechnology, Bd. 6, Plenum Press (New York), beschrieben werden. Beispiele aus diesem Kompendium schließen Muramyldipeptid (MDP) und Montanide 720 ein. Moleküle, wie Polyinosin:Cytosin (Poly I:C) oder Plasmid-DNA, die CpG-Motive enthält, können auch als Adjuvantien in Kombination mit Antigenen, die in Mikroteilchen verkapselt sind, verabreicht werden. In einem weiteren Beispiel ist das Adjuvans ein Mittel, das den Eintritt des verkapselten biologisch aktiven Mittels in das Cytoplasma einer Zelle erleichtert, wie Listeriolysin, Streptolysin oder eine Mischung davon.
In einer Ausführungsform kann das biologisch aktive Mittel z.B. ein Lipid; eine Nucleinsäure; ein Peptid, Polypeptid oder Protein enthalten.
In einer Ausführungsform der Erfindung enthält die Zusammensetzung ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die funktionell das Antigen codiert, verkapselt in die polymere Zusammensetzung. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält die Zusammensetzung ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen funktionell codiert, und ein Adjuvans, verkapselt in die Polymerzusammen setzung. In dieser Ausführungsform können das Antigen und das Adjuvans innerhalb des gleichen Mikrokügelchens verkapselt sein, oder sie können getrennt verkapselt sein, aber in einer Zusammensetzung zusammen verabreicht werden. In dem Fall, in dem Antigen und Adjuvans getrennt verkapselt werden, können sie unter Verwendung der identischen polymeren Zusammensetzung oder unter Verwendung verschiedener polymerer Zusammensetzungen verkapselt werden. in einer weiteren Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die funktionell das Antigen codiert, verkapselt in der Polymerzusammensetzung, und ein Adjuvans, das in der Zusammensetzung unverkapselt vorhanden ist, d.h. als freies (z.B. lösliche oder nicht lösliche Emulsion) Adjuvans.
Eine Immunantwort induzierende oder potenzierende Menge eines Antigens kann unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt werden. Kurz gesagt werden verschiedene Konzentrationen eines spezifischen immunreaktiven Epitops präpariert, in der Zusammensetzung verkapselt und einem Tier verabreicht und die immunologische Antwort (z.B. die Produktion von Antikörpern oder die Erzeugung einer zellvermittelten Immunität) oder der Anstieg (Größe oder Zeitraum) der Antwort eines Tiers auf jede Konzentration wird bestimmt. Die Mengen an Antigen, die verabreicht werden, können von dem Lebewesen, z.B. einem Menschen oder einem Meerschweinchen, dem Zustand des Lebewesens, der Größe des Lebewesens etc. abhängen. Diese eine Immunantwort induzierenden oder potenzierenden Mengen können extrapoliert werden auf das relative Körpergewicht eines Menschen oder anderer Lebewesen. Für die Verwendung als Impfstoff kann danach ein so mit einem Antigen geimpftes Tier dem Antigen ausgesetzt werden, um die Impfstoffwirkung der spezifischen verabreichten Zusammensetzung zu testen.
Der Ausdruck "eine wirksame Menge" einer Zusammensetzung, wie er hier verwendet wird, ist die Menge, die den gewünschten Effekt erzielen kann. Die wirksame Menge ist eine wirksame Menge innerhalb jeder verkapselten Struktur, die ausreicht, um die gewünschte Antwort zu erzeugen. Wie hier beschrieben, kann eine wirksame Menge eine Menge sein, die ausreicht, um eine Immunantwort zu Primen, zu induzieren oder zu potenzieren. Eine wirksame Menge kann auch eine Menge sein, die ausreicht, um eine T-Zellantwort zu induzieren oder zu po tenzieren, eine Menge, die ausreicht, um eine Antikörperantwort zu induzieren oder zu potenzieren (d.h. Antikörperproduktion), eine Menge, die ausreicht, um eine cytotoxische T-Zellantwort zu induzieren oder zu potenzieren, eine Menge, die ausreicht, um die Aktivierung CD8-positiver T-Lymphozyten, die für ein Antigen spezifisch sind, zu induzieren oder zu potenzieren, eine Menge, die ausreicht, um eine Aktivierung von CD4-positiven T-Lymphozyten, die für ein Antigen spezifisch sind, zu induzieren oder zu potenzieren, abhängig vom Zusammenhang, in dem sie verwendet wird. Solche Mengen können leicht für jede spezifische Zusammensetzung unter Verwendung von Standardmethoden und wie hier beschrieben, bestimmt werden.
Es ist aus den hier gegebenen Lehren abzuleiten, dass die Zusammensetzung als prophylaktische oder therapeutische Modalität verwendet werden kann.
Die Menge an biologisch aktivem Mittel, die durch die polymere Zusammensetzung verkapselt wird, variiert abhängig von dem angewendeten biologisch aktiven Mittel. Wenn das biologisch aktive Mittel ein Antigen ist, kann es in einer Immunantwort induzierenden oder potenzierenden Menge vorhanden sein. In einer Ausführungsform bildet das biologisch aktive Mittel weniger als 80 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet das biologisch aktive Mittel 0,01 bis 10 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung. In einer Ausführungsform ist die Menge des biologisch aktiven Mittels, z.B. eines Antigens oder einer Nucleinsäure, die das Antigen codiert, 1 ng bis 10 mg pro Injektion/pro Person. In einer weiteren Ausführungsform ist die Menge des biologisch aktiven Mittels 1 ng bis 500 μg/Injektion/Person. In einer weiteren Ausführungsform ist die Menge an biologisch aktivem Mittel 100 mg/Injektion/Person. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge an Antigen 1 μg bis 5 mg pro Injektion/Person.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, um eine Immunantwort in einem Lebewesen zu induzieren oder potenzieren, die ein biologisch aktives Mittel enthält, das eine Immunantwort induzieren oder potenzieren kann, das in einer polymeren Zusammensetzung verkapselt ist, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g enthält. Wenn die Zusammensetzung zur Induktion einer Immunantwort verwendet werden soll, ist das biologisch aktive Mittel bevorzugt ein Antigen. Wenn die Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort verwendet werden soll, ist das biologisch aktive Mittel bevorzugt ein Antigen oder ein anderes hier definiertes biologisch aktives Mittel.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, um eine CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen zu induzieren oder potenzieren, die ein Antigen enthält, das eine CTL- oder T-Helferzellantwort induzieren oder potenzieren kann und in einer polymeren Zusammensetzung verkapselt ist, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid enthält. Wenn die Zusammensetzung verwendet werden soll, um eine CTL- oder T-Helferzellantwort zu induzieren, wird das biologisch aktive Mittel ein Antigen sein. Wenn die Zusammensetzung verwendet werden soll, um eine CTL- oder T-Helferzellantwort zu potenzieren, kann das biologisch aktive Mittel ein Antigen oder ein anderes biologisch aktives Mittel sein, wie es hier definiert wird.
Das Einzel-Komponentensystem wird biologisch schneller abgebaut, als andere Einzelzusammensetzungen des Standes der Technik. Das Blend-System der Erfindung liefert typischerweise eine bessere Leistung, d.h. es setzt das biologisch aktive Mittel schneller frei als das Einzelkomponentensystem. Dies ist der Fall, weil Komponente (b) des Blend-Systems durch Komponente (a) stabilisiert werden kann, wobei jedoch Komponente (b) eine sehr schnelle Freisetzung verursacht.
Die Zusammensetzung der Blend-Komponentenerfindung setzt das biologisch aktive Mittel schnell frei. Unter "schneller Freisetzung", wie hier verwendet, wird die schnelle Freisetzung des biologisch aktiven Mittels schnell nach Aufnahme in eine Zelle verstanden. Schnelle Freisetzung nach Aufnahme in die Zelle kann eine durch MHC-Klasse I vermittelte Antwort induzieren. Somit liefert die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise eine schnelle Freisetzung des biologisch aktiven Mittels bei Verabreichung und kann eine Immunantwort und insbesondere eine CTL-Antwort induzieren.
In einer Ausführungsform hat das biologisch abbaubare Polymer bevorzugt eine inhärente Viskosität von weniger als 0,4 dl/g, bevorzugter 0,35 dl/g oder weniger, bevorzugter 0,30 dl/g oder weniger und noch bevorzugter 0,25 dl/g oder weniger.
In einer Ausführungsform kann das verkapselte biologisch aktive Mittel mit einem weiteren verkapselten biologisch aktiven Mittel vermischt werden, das aus einer anderen polymeren Zusammensetzung und/oder einem biologisch aktiven Mittel der Erfindung hergestellt wurde. In einer Ausführungsform können zwei oder mehr verkapselte biologisch aktive Mittel der vorliegenden Erfindung mit zwei oder mehr polymeren Zusammensetzungen hergestellt werden, wobei jedes ein Polymer mit einem Molekulargewicht von weniger als 7.000 Dalton aufweist. Verfahren, um zwei oder mehr verkapselte biologisch aktive Mittel zu kombinieren, sind im Stand der Technik bekannt (z.B. Men et al. (Vaccine, 1995, 13 (7), Peyer's patch 683–689)).
Allgemeine Techniken zur Herstellung der verkapselten Strukturen der Blend-Komponente sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Siehe U.S.-Patent Nr. 5 407 609 von Tice et al., Grandfils et al. (Journal of Controlled Release, 1996, Peyer's patch 109–122), Bodmeier et al. (International Journal of Pharmaceutics, 1989, Bd. 51, 1–8) und Europäisches Patent A1 0 058 481 von Hutchinson.
Die Herstellung von Blend-Komponentensystemen kann die Zugabe eines Tensids zu den Verarbeitungsmedien und/oder einer Lösung der polymeren Zusammensetzung mit dem biologisch aktiven Mittel beinhalten. Der Rest eines solchen Tensids verbleibt typischerweise in der polymeren Zusammensetzung bei Bildung des verkapselten Mittels. Das Tensid kann kationisch, anionisch oder nichtionisch sein. Beispiele für nützliche Tenside schließen Carboxymethylcellulose, Gelatine, Poly(vinylpyrrolidon), Poly(ethylenglycol), Tween 80, Tween 20, Polyvinylalkohol oder Mischungen davon ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Das Tensid sollte bevorzugt die biologische Abbaubarkeit der polymeren Zusammensetzung und die Freisetzung des biologisch aktiven Mittels nicht hindern. Das Tensid sollte die Aufnahme von Wasser durch die polymere Zusammensetzung nicht hindern. Z.B. ist ein Tensid, das häufig im Stand der Technik verwendet wird, Polyvinylalkohol (PVA). PVA kann eine Beschichtung auf dem verkapselten biologisch aktiven Mittel bilden, was verhindern oder stören kann, dass die Polymere Zusammensetzung biologisch abgebaut und das biologisch aktive Mittel freigesetzt wird. In einer Ausführungsform kann das Tensid in das verkapselte biologisch aktive Mittel eingearbeitet werden. Wenn das Tensid in das verkapselte biologisch aktive Mittel eingearbeitet wird, kann ein biologischer Abbau des verkapselten biologisch aktiven Mittels über osmotisches Reißen auftreten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Tenside der vorliegenden Erfindung nicht in das verkapselte biologisch aktive Mittel eingearbeitet, sondern von der Oberfläche der polymeren Zusammensetzung durch Waschen der entstehenden polymeren Zusammensetzung mit Wasser entfernt.
Während des Verfahrens der Einkapselung des biologisch aktiven Mittels kann die Größe des entstehenden Teilchens gesteuert werden. In einer Ausführungsform ist der durchschnittliche Durchmesser der verkapselten Struktur kleiner als 300 μm. In einer weiteren Ausführungsform ist der durchschnittliche Durchmesser der verkapselten Struktur 20 μm bis 200 μm; in einer weiteren Ausführungsform ist der durchschnittliche Durchmesser der verkapselten Struktur 20 μm bis 80 μm. In einer weiteren Ausführungsform ist der durchschnittliche Durchmesser der verkapselten Struktur 1 μm bis 15 μm. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die verkapselte Struktur einen durchschnittlichen Durchmesser von 1 bis 10 μm. In einer weiteren Ausführungsform hat die verkapselte Struktur einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 15 μm, weniger als 10 μm, weniger als 5 μm oder weniger als 1 μm bis bevorzugt 0,1 μm durchschnittlichen Durchmesser. Das verkapselte biologisch aktive Mittel kann als Mikroteilchen, Mikrokapsel, Mikrokügelchen, Nanopartikel, Nanokapsel, Nanokügelchen oder irgendeine andere verkapselte Struktur hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn das biologisch aktive Mittel ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, aufweist, hat die verkapselte Struktur einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 10 μm oder 1 bis 10 μm. Ein solches Mikrokügelchen wird wahrscheinlich schnell von einem Makrophagen aufgenommen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wenn das biologisch aktive Mittel ein Adjuvans ist, hat die verkapselte Struktur einen durchschnittlichen Durchmesser von 1 μm bis 300 μm, z.B. einen durch schnittlichen Durchmesser von 20 μm bis 200 μm und bevorzugter einen durchschnittlichen Durchmesser von 20 μm bis 80 μm.
Induzierung oder Potenzierung einer Immunantwort unter Verwendung einer Blend-Zusammensetzung
Die vorliegende Erfindung liefert zusätzlich Methoden zur Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, um eine Immunantwort zu induzieren oder zu potenzieren. Bei jeder solchen Methode zur Induktion einer Immunantwort enthält die Zusammensetzung ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die funktionell das Antigen codiert, als biologisch aktives Mittel. Bei einer solchen Methode zur Potenzierung einer Immunantwort kann das biologisch aktive Mittel z.B. ein Antigen, ein Adjuvans oder beides enthalten. Wenn das biologisch aktive Mittel ein Antigen enthält, kann darüber hinaus die Zusammensetzung weiterhin ein nicht verkapseltes Adjuvans enthalten. Zusätzlich kann eine Zusammensetzung, bei der das biologisch aktive Mittel ein Adjuvans enthält, an ein Lebewesen verabreicht werden, wobei das Lebewesen unabhängig einem Antigen ausgesetzt wurde, auf das eine Immunantwort induziert oder potenziert werden soll.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren, um eine CTL-Antwort bei einem Lebewesen zu induzieren, die beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in eine polymere Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein Blend der Komponenten, wie in Anspruch 1 definiert, enthält.
Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Freisetzung von Antigen oder Nucleinsäure liefern, dass eine CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem Ausmaß von mindestens 30% Cytotoxizität messbar ist, wodurch bei dem Lebewesen die CTL-Antwort induziert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert auch die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, in einem Verfahren, um eine T-Helferzellantwort in einem Lebewesen zu induzieren, was beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, wobei ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer Polymerzusammensetzung verabreicht wird.
Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Freisetzung des Antigens oder der Nucleinsäure liefern, dass eine T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem mindestens zweifachen Ausmaß verglichen mit dem Hintergrund, gemessen als T-Zellproliferation oder Cytokininduktion, messbar ist, wodurch die T-Helferzellantworf in dem Wesen induziert wird.
Weiterhin wird erfindungsgemäß die Verwendung der obigen Zusammensetzung in einem Verfahren zur Potenzierung einer bereits bestehenden CTL-Antwort auf ein Antigen in einem Lebewesen bereitgestellt, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge der Zusammensetzung verabreicht wird.
Die polymere Zusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels liefern, dass die potenzierte CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem Ausmaß, das höher ist als die vorbestehende CTL-Antwort, messbar ist, wodurch die vorbestehende CTL-Antwort in dem Wesen potenziert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin die Verwendung der obigen Zusammensetzung in einem Verfahren zur Potenzierung einer bereits bestehenden T-Helferzellantwort auf ein Antigen in einem Lebewesen, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge der Zusammensetzung verabreicht wird.
Die Polymerzusammensetzung kann weiterhin eine solche Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels liefern, dass die potenzierte T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzigen Verabreichung in einem Ausmaß messbar ist, das größer ist als die vorbestehende T-Helferzellantwort, wodurch die vorbestehende T-Helferzellantwort in dem Lebewesen potenziert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung in einem Verfahren zur Induktion einer CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen, die beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die funktionell das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung in einem Verfahren, um eine CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen zu induzieren, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen funktionell codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung in einem Verfahren, um eine CTL- oder T-Helferzellantwort in einem Lebewesen zu induzieren, was beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in eine polymere Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid enthält.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung in einem Verfahren, um eine CTL- oder T-Helferantwort in einem Lebewesen zu potenzieren, das beinhaltet, dass dem Lebewesen eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein biologisch aktives Mittel verkapselt in eine polymere Zusammensetzung enthält, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die obige Verwendung, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die obige Verwendung, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, um eine CTL- oder T-Helferantwort in einem Lebewesen zu induzieren, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die funktionell das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung aufweist, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einem Molekulargewicht von ≤ 7.000 Dalton aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, um eine CTL- oder T-Helferantwort in einem Lebewesen zu induzieren, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die funktionell das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung aufweist, wobei die polymere Zusammensetzung ein biologisch abbaubares Polymer mit einer inhärenten Viskosität von weniger als 0,4 dl/g aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, um eine CTL- oder T-Helferantwort in einem Lebewesen zu induzieren, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung enthält, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen codiert, verkapselt in einer polymeren Zusammensetzung aufweist, wobei die polymere Zusammensetzung ein unblockiertes Polymer von Poly(lactid-co-glycolid), Polylactid oder Polyglycolid aufweist.
Wie oben diskutiert, kann eine Induktion oder Potenzierung leicht mit irgendeiner von mehreren Standardmethoden bestimmt werden. Eine Immunantwort kann eine oder mehrere der folgenden einschließen: B-Zellantworten, einschließlich der Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch für das biologisch aktive Mittel sind und Cytokinfreisetzung, und cytotoxische T-Zellantworten. Die Einführung von Antigenen in den phagozytischen Stoffwechselweg ist für Impfstoffanwendungen attraktiv. Antigene, die in diesen Stoffwechselweg eintreten, können voraussichtlich sowohl MHC-Klasse-I- als auch Klasse-II-Molekülen präsentiert werden und erzeugen gleichzeitig CD8⁺- und CD4⁺-T-Zellimmunität. Die zwei Hauptarme der T-Zellimmunantwort werden daher stimuliert. Außerdem wurde gezeigt, dass unter diesen Bedingungen die CD4⁺-T-Zellantwort die Erzeugung von CTL fördert, indem CTL und T-Helferzelle Cluster bilden können und rund um die Antigen präsentierenden Zellen (APCs) wechselwirken können, eine kritische Stufe für CD4⁺-T-Zellhilfe. Das vorliegende Verfahren liefert vorteilhafterweise Metho den, die die schnelle Freisetzung des biologisch aktiven Mittels aus der Zusammensetzung fördern, wodurch ein Verfahren bereitgestellt wird, um das biologisch aktive Mittel in den phagozytischen/cytosolischen Stoffwechselweg zu bringen und MHC-Klasse-I-vermittelte Antworten zusätzlich zu MHC-Klasse-II-vermittelten Immunantworten hervorzurufen.
Die polymere Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die verwendet wird, um das biologisch aktive Mittel zu verkapseln, ist biologisch kompatibel. In einer Ausführungsform sind die Abbauprodukte der polymeren Zusammensetzung Milchsäure und Glycolsäure, die natürliche Metaboliten sind. Die Verkapselung von Antigenen unter Verwendung der Polymerzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lässt es zu, dass Antigene in einer nicht chemisch modifizierten Form innerhalb von polymeren Trägern und Vehikeln abgegeben werden.
Das verkapselte biologisch aktive Mittel wird typischerweise schnell freigesetzt, sobald es phagozytiert und daher innerhalb der Zelle freigesetzt worden ist. Um eine schnelle Freisetzung in einer Zelle zu erreichen, ist eine bevorzugte Zusammensetzung eine mit einer Mikrokügeichenstruktur von weniger als 10 μm oder alternativ 1 bis 10 μm durchschnittlichem Durchmesser. Wenn die Größe des verkapselten biologisch aktiven Mittels erhöht wird (mehr als 10 μm), nimmt die Aufnahme des verkapselten Mittels in die Zelle ab, was zur Freisetzung des biologisch aktiven Mittels außerhalb der Zelle führt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das biologisch aktive Mittel vor der Phagozytose im Wesentlichen innerhalb der verkapselten Struktur gefunden. Unter "im Wesentlichen" innerhalb der Struktur zu finden wird verstanden, dass mindestens etwa 0,1 bis 50%, bevorzugt mindestens 20%, bevorzugter mindestens 40%, noch bevorzugter mindestens 50% und noch bevorzugter mindestens 70% des ursprünglich abgegebenen Mittels in der Zusammensetzung sich immer noch innerhalb der Struktur befinden. Wie oben diskutiert, kann die Aufnahme einer Zusammensetzung entweder aus dem Blend- oder Einzelkomponentensystem durch Größe der Mikrokügelchenstruktur, d.h. des Durchmessers der Mikrokügelchen, gesteuert werden. Die Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels aus der Formulierung kann über verschiedene Parameter manipuliert werden. Im Fall des Blend-Komponentensystems kann die Kinetik der Freisetzung, d.h. die schnelle Frei setzung des biologisch aktiven Mittels innerhalb der Zelle außer über den Durchmesser der Mikrokügelchenstruktur gesteuert werden, indem 1) die Menge der Komponente (a) bezogen auf die Komponente (b) variiert wird; 2) die Zusammensetzung von Komponente (b) ebenso wie das Molekulargewicht von (b) variiert wird; 3) die Löslichkeit von Komponente (b) erhöht oder vermindert wird; 4) durch Ladung und Art des Antigens; 5) Art des verwendeten Tensids; 6) ob die Komponente (a) und/oder (b) blockiert oder unblockiert ist; 7) Gegenwart weiterer Additive; 8) Porosität des verkapselten biologisch aktiven Mittels und 9) wenn Glycolid und Lactid ausgewählt werden, das Molverhältnis von Glycolid und Lactid, das verwendet wird, um die Komponenten (a) und/oder (b) herzustellen. Komponente (a) kann auch zur Freisetzung des biologisch aktiven Mittels aus der polymeren Zusammensetzung beitragen; Komponente (b) bestimmt jedoch typischerweise schließlich die Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels.
Wenn außerhalb der Zelle schnell freigesetzt wird, wird das biologisch aktive Mittel bevorzugt in der Nähe der Zelle schnell freigesetzt für eine schnelle Aufnahme des biologisch aktiven Mittels. Eine bevorzugte Zusammensetzung für eine schnelle Freisetzung außerhalb der Zelle ist eine mit einer Mikrokügelchenstruktur mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 10 μm, z.B. 20 bis 300 μm durchschnittlichem Durchmesser, einem durchschnittlichen Durchmesser zwischen 20 und 200 μm oder einem durchschnittlichen Durchmesser von 20 bis 80 μm. Natürlich wird bei jeder Zusammensetzung etwas Mittel typischerweise vor der Aufnahme durch die Zelle freigesetzt.
Die Blend-Komponentensysteme der vorliegenden Erfindung können eine Immunantwort induzieren oder potenzieren. "Immunantwort" wird hier so definiert, dass T- und B-Zellantworten, wie oben beschrieben, umfasst sind. Außerdem soll der Ausdruck "Immunantwort" nicht die Wirkstoffabgabe (d.h. Abgabe von nicht eine immunologische Antwort induzierenden oder potenzierenden Substanzen) beinhalten oder umfassen. Unter "Wirkstoff' oder "pharmazeutisches Mittel" wird eine Substanz verstanden, die keine Immunantwort induziert oder potenziert, wie es im Stand der Technik bekannt ist.
In einer weiteren Ausführungsform können die Blend-Komponentensysteme eine T-Zellantwort, bevorzugt eine cytotoxische T-Zellantwort induzieren oder potenzieren. Die Blend-Systeme können daher verwendet werden, um eine Aktivierung von CD8-positiven Lymphozyten zu induzieren oder zu potenzieren. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Verwendung eines verkapselten biologisch aktiven Mittels eine T-Zellantwort verstärkt, im Vergleich zu einem biologisch aktiven Mittel, das nicht verkapselt ist oder das nicht so schnell freigesetzt wird wie bei der vorliegenden Erfindung.
In einer Ausführungsform wird das verkapselte Mittel, sobald es sich innerhalb der Zelle befindet, schnell freigesetzt. Wie vorher beschrieben, ist die Kinetik der Freisetzung abhängig von den zur Herstellung der polymeren Zusammensetzung verwendeten Komponenten. Da das verkapselte biologisch aktive Mittel das biologisch aktive Mittel bevorzugt innerhalb der Zelle statt außerhalb der Zelle schnell freisetzt, ist es möglich, eine geringere Dosierung des biologisch aktiven Mittels zu verwenden, um eine Immunantwort zu erzielen.
Sobald das verkapselte biologisch aktive Mittel in die Zelle eingebracht worden ist, kann die CTL-Antwort durch Auswahl der polymeren Zusammensetzung zugeschnitten werden. In einer Ausführungsform kann eine frühe CTL-Antwort erzeugt werden. Eine frühe CTL-Antwort wird definiert als eine CTL-Antwort, die weniger als oder genau 14 Tage nach Verabreichung des verkapselten biologisch aktiven Mittels gemessen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ruft das verkapselte biologisch aktive Mittel eine frühe CTL-Antwort innerhalb von 7 Tagen hervor. In einer weiteren Ausführungsform kann das verkapselte biologisch aktive Mittel eine späte CTL-Antwort erzeugen. Eine späte CTL-Antwort wird definiert als eine messbare CTL-Antwort 14 Tage nach der Verabreichung, aber nicht mehr als 30 Tage, bevorzugt 21 Tage. Die messbare CTL-Antwort kann bevorzugt mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50% Cytotoxizität sein. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die frühe CTL-Antwort, eine messbare CTL-Antwort von mindestens 50%, innerhalb von 7 Tagen nach Verabreichung des verkapselten biologisch aktiven Mittels nachgewiesen werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann eine frühe CTL-Antwort von mindestens 50% durch eine einzige Verabreichung des verkapselten biologisch aktiven Mittels erzeugt werden.
Bei jeder Verwendung dieser Erfindung kann man z.B. eine Zusammensetzung, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen funktionell codiert, verkapselt in der polymeren Zusammensetzung enthält; eine Zusammensetzung, die ein Antigen oder eine Nucleinsäure, die das Antigen funktionell codiert, und ein Adjuvans, verkapselt in der polymeren Zusammensetzung enthält, verabreichen.
Die Blend-Komponentensysteme können einem Lebewesen unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, verabreicht werden. In einer Ausführungsform können die Blend-Komponentensysteme parenteral durch Injektion, z.B. intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder subcutane Injektion, oder durch Inhalation abgegeben werden. In einer weiteren Ausführungsform können die Blend-Komponentensysteme rektal, vaginal, nasal, oral, ophthalmisch, topisch, transdermal oder intradermal abgegeben werden. Wenn die Verabreichungsart eine Injektion ist, kann das verkapselte biologisch aktive Mittel an der Injektionsstelle bis zu 2 Wochen verbleiben, wodurch ein Depot eines Antigens geschaffen wird, das eine längere Freisetzung oder pulsartige Freisetzung in vivo ergibt. Mit einem solchen Abgabesystem ist es möglich, ein "Single-Shot"-Impfpräparat für Antigene herzustellen, das ansonsten mehrfache Injektionen erfordern würde, um eine Immunantwort hervorzurufen.
Die Zusammensetzung kann zusätzlich einen pharmazeutisch annehmbaren Träger bzw. ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel aufweisen. Unter "pharmazeutisch annehmbar" wird ein Material verstanden, das nicht biologisch oder in anderer Weise unerwünscht ist, d.h., das Material kann an eine Person zusammen mit der ausgewählten Verbindung verabreicht werden, ohne irgendwelche unerwünschten biologischen Wirkungen zu verursachen oder in schädlicher Weise mit einer der anderen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, in der es enthalten ist, eine Wechselwirkung einzugehen. Beispiele für solche pharmazeutisch annehmbaren Träger schließen physiologische Kochsalzlösung oder andere geeignete Träger bzw. Vehikel ein (R. Arnon (Herausgeber), Synthetic Vaccines I: 83–92, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1987).
Die genaue Menge solcher Zusammensetzungen, die erforderlich ist, variiert von Person zu Person, abhängig von der Art, dem Alter, Gewicht und dem allgemei nen Zustand des Lebewesen, der Schwere des Krankheitszustandes, der Infektion oder des Zustandes, der behandelt oder verhütet werden soll, der jeweils verwendeten Verbindung, der Verabreichungsart und dgl. Somit ist es nicht möglich, eine exakte Menge spezifisch anzugeben. Eine geeignete Menge kann jedoch vom Fachmann unter Verwendung von Routineversuchen, zu denen die Anleitung hier gegeben wird, bestimmt werden. In einer Ausführungsform ist die Menge an Antigen, die in verkapselter Form verabreicht wird, 1 ng bis 5 mg. In einer weiteren Ausführungsform ist die Menge an Antigen, die in verkapselter Form verabreicht wird, 1 mg bis 100 mg. In einer weiteren Ausführungsform ist die Menge an Antigen, die in verkapselter Form verabreicht wird, mindestens etwa 10 mg. In einer weiteren Ausführungsform ist die Menge an Adjuvans, die in verkapselter Form verabreicht wird, 1 ng bis 10 mg. Eine einzige Verabreichung kann ausreichend sein, abhängig von der Krankheit, dem Zustand oder der Infektion, die behandelt oder verhütet werden sollen; es wird jedoch in Betracht gezogen, dass mehrfache Verabreichungen verabreicht werden. Verabreichungen nach der ersten Verabreichung können eine geringere Dosierung als die Anfangsdosierung haben.
Abhängig von der vorgesehenen Verabreichungsart können die erfindungsgemäßen Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsformen sein, z.B. als Tabletten, Zäpfchen, Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Suspensionen, Lotionen, Cremes, Gele oder dgl., bevorzugt in Einheitsdosierungsform, die für eine einzige Verabreichung einer genauen Dosis geeignet ist. Die Zusammensetzungen enthalten, wie oben angegeben, eine wirksame Menge der ausgewählten Zusammensetzung, möglicherweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und können zusätzlich weitere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Vehikel etc. enthalten.
Übliche nicht-toxische feste Träger schließen z.B. Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dgl. in pharmazeutischer Qualität ein. Verkapselte pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen in einem flüssigen Träger können z.B. hergestellt werden, indem das verkapselte biologisch aktive Mittel in einem Träger, wie z.B. Wasser, Kochsalzlösung, wässriger Dextrose, Glycerin, Ethanol und dgl., dispergiert wird, um dadurch eine Lösung oder Suspension zu bilden. Falls erwünscht, kann die pharmazeutische Zusammensetzung, die verabreicht werden soll, auch kleinere Mengen nicht-toxischer Hilfssubstanzen, wie Benetzungs- oder Emulsionsmittel, pH-Puffermittel und dgl., z.B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminnatriumacetat, Triethanolaminoleat etc. enthalten. Tatsächliche Methoden zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder ergeben sich für den Fachmann auf diesem Gebiet z.B. aus Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin (Herausgeber), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA.
Für die orale Verabreichung können feine Pulver oder Körnchen Verdünnungs-, Dispersions- und/oder oberflächenaktive Mittel enthalten und können in Wasser oder in einem Sirup präsentiert werden, in Kapseln oder Säckchen in trockenem Zustand oder in nicht wässriger Lösung oder Suspension, wobei Suspensionsmittel enthalten sind, in Tabletten, wobei Bindemittel und Gleitmittel enthalten sind, oder in einer Suspension in Wasser oder einem Sirup vorliegen. Wenn es wünschenswert oder notwendig ist, können Aromatisierungs-, Konservierungs-, Suspensions-, Verdickungs- oder Emulsionsmittel enthalten sein. Tabletten und Körnchen sind bevorzugte orale Verabreichungsformen und diese können beschichtet sein.
Parenterale Verabreichung, falls verwendet, ist allgemein durch Injektion gekennzeichnet. Injizierbare Mittel können in üblicher Form hergestellt werden entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Auflösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen.
Die Blend-Komponentensysteme der vorliegenden Erfindung können eine Immunantwort in einem Lebewesen induzieren oder potenzieren. In einer Ausführungsform ist das Lebewesen ein Säugetier, Reptil, ein Vogel oder ein Fisch. In einer weiteren Ausführungsform kann das Lebewesen ein Mensch oder ein anderes Tier sein, wobei das Tier insbesondere ein Haustier, Lebensmittel erzeugendes oder wildes Tier sein kann. Beispiele für Haustiere schließen Hunde, Katzen, Pferde oder Vögel ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Beispiele für Lebensmittel erzeugende Tiere schließen Kühe, Schweine, Hühner oder Schafe ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Beispiele für wild lebende Tiere schließen zoologische Tiere, wie Löwen, Tiger, Elefanten, Affen oder Bären ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung wird genauer in den folgenden Beispielen beschrieben, die jedoch nur erläuternd sein sollen, da zahlreiche Modifikationen und Variationen möglich sind, die sich für den Fachmann auf diesem Gebiet ergeben.
I. Beispiele
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um dem Fachmann auf diesem Gebiet eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dessen zu liefern, wie die Zusammensetzungen und Methoden, die hier beansprucht werden, durchgeführt und ausgewertet werden und sollen nur beispielhaft für die Erfindung sein und nicht den Schutzbereich dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen, beschränken. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit im Hinblick auf die Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur etc.) sicherzustellen, aber einige Fehler und Abweichungen können möglich sein. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, die Temperatur ist in °C oder ist in etwa Raumtemperatur und der Druck ist etwa atmosphärischer Druck.
Herstellung von verkapselten biologisch aktiven Mitteln
Verwendete biologisch aktive Mittel:
Ovalbumin (OVAL
Ovalbumin (OVA) Qualität VII wurde von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, erworben und ohne weitere Reinigung verwendet.
P815-1 (TRA-4)
Ein Peptid mit 28 Aminosäuren, das das P1A-Epitop enthielt, das aus den Resten 28 bis 49 des P815-Antigens bestand, wobei drei Lysinreste sowohl dem C- als auch N-Ende der Sequenz zugefügt wurden, um die Löslichkeit zu verbessern. P1A ist ein wohl definiertes Tumorantigen, das auf von DBA/2 abgeleiteten P815-Tumorzellen exprimiert wird und auch von verschiedenen normalen DBA/2-Geweben. Ein Peptid mit 9 Aminosäuren bestehend aus den Resten 35 bis 43 des P815-Antigens wurde auch erzeugt. Diese Peptide wurde an einem Millipore-9050-Pluspeptid-Syntheseautomaten unter Verwendung von HBTU-(O-Benzotriazol-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat)-Aktivierung synthetisiert. Die Abspaltung der Peptide von dem festen Träger wurde durchgeführt unter Verwendung der folgenden Mischung: Trifluoressigsäure:Ethandithiol:Thioanisol:Wasser:Phenol (40:1:2:2:3). Nach 2-stündiger Abspaltung wurden die Peptide in kaltem Ether ausgefällt. Die rohen Peptide wurden dann mit C18-Reverse-Phase-HPLC gereinigt und vor ihrer Verwendung durch Massenspektrometrie charakterisiert.
Beispiel 1 (Referenz)

Biologisch aktives Mittel: Ovalbumin
Polymer: 50:50 DL-PLG (503H)
Tensid: Carboxymethylcellulose (CMC)

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 2,0 g 50:50 DL-PLG (503H, Boehringer Ingelheim) (PLG ist Poly(lactid-co-glycolid) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 dl/g in Hexafluorisopropanol in 7,5 g Ethylacetat gelöst wurde. Als Nächstes wurden ungefähr 25 mg Ovalbumin in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Die Ovalbuminlösung wurde der Polymerlösung zugegeben, während mit einem Brinkmann Polytron (Modell 10, PTA-10S-Sonde, Brinkmann Instrument Co., Westbury, NY) homogenisiert wurde.
In einem getrennten Behälter wurden 280 g 1,4 gew.-%ige wässrige Carboxymethylcelluiose, die mit Ethylacetat gesättigt war, bei 20 ± 2°C equilibriert. Der Standardmischkopf eines Silverson-Labormischers (Silverson Machines Inc., East Longmeadow, MA) wurde unter der Oberfläche der CMC-Lösung positioniert.
Während der Silverson-Mischer mit einer Rührrate von 3.600 ± 50 U/min betrieben wurde, wurde die Ovalbumin/Polymer-Emulsion sofort in die CMC-Lösung überführt. Die entstehende Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde 45 Sekunden lang gerührt, wonach die Emulsion in 5,2 l steriles Wasser überführt wurde und mit einem Kreiselrührer aus rostfreiem Stahl gerührt wurde. Die entstehenden Mikrokügelchen wurden in Wasser ungefähr 15 Minuten lang gerührt.
Das sterile Wasser und die Mikrokügelchen wurden dann in 6 1-l-Zentrifugenflaschen überführt. Die Flaschen wurden mit 4.200 U/min unter Verwendung einer Beckman-J6M-Zentrifuge (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) 40 Minuten lang zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren der Suspension wurde der Überstand entfernt. Die Mikrokügelchen wurden wieder in weiterem sterilen Wasser suspendiert. Der Inhalt jeder Zentrifugenflasche wurde auf ein Gesamtvolumen von 800 ml verdünnt. Die Zentrifugenflaschen wurden wiederum mit 4.200 U/min 40 Minuten lang zentrifugiert. Dieses Waschverfahren wurde ein weiteres Mal wiederholt, wonach die Mikrokügelchen in einem Gesamtvolumen von ungefähr 800 ml sterilem Wasser suspendiert wurden. Insgesamt wurden 500 mg Mannit zu der Suspension zugegeben, die dann in zwei 1-l-Gefriertrocknungskolben aufgeteilt wurde. Die Mikrokügelchensuspension wurde dann eingefroren und lyophilisiert (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten ungefähr 0,8 ± 0,2 Gew.-% Ovalbumin und hatten einen Durchmesser von etwa 5,0 μm oder weniger.
Beispiel 2 (Referenz)

Biologisch aktives Mittel: Ovalbumin
Polymer: 50:50 DL-PLG (503H)
Tensid: Carboxymethylcellulose (CMC) und Tween 80

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 1,5 g 50:50 DL-PLG (503H, Boehringer Ingelheim) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 dl/g in Hexafluorisopropanol in 5,7 g Ethylacetat gelöst wurden. Als Nächstes wurden 12 mg Ovalbumin in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Die Ovalbuminlösung wurde zu der Polymerlösung zugegeben, während die Polymerlösung mit einem Brinkmann Polytron (Modell 10, PTA-10S-Sonde, Brinkmann Instrument Co., Westbury, NY) homogenisiert wurde.
In einem getrennten Behälter wurde eine Lösung, die aus 280 g 1,33 Gew.-% wässriger Carboxymethylcellulose, die 0,05 Gew.-% Polysorbat (Tween 80) enthielt, bestand, auf 18 ± 2°C gehalten. Diese Lösung wurde mit Ethylacetat gesättigt. Der Standardmischkopf eines Silverson-Labormischers (Silverson Machines Inc., East Longmeadow, MA) wurde unter der Oberfläche der CMC/Tween-Lösung angeordnet.
Während der Silverson-Mischer mit einer Rührrate von 4.100 ± 50 U/min betrieben wurde, wurde die Ovalbumin/Polymer-Emulsion sofort in die CMC/Tween-Lösung überführt. Die entstehende Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde 45 Sekunden lang gerührt, wonach die Emulsion in 5,2 l steriles Wasser überführt wurde, das mit einem Kreiselrührer aus rostfreiem Stahl gerührt wurde. Die entstehenden Mikrokügelchen wurden in dem Wasser ungefähr 15 Minuten lang gerührt.
Steriles Wasser und Mikrokügelchen wurden dann in 6 1-l-Zentrifugenflaschen überführt. Die Flaschen wurden mit 4.200 U/min unter Verwendung einer Beckman-J6M-Zentrifuge (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) 45 Minuten lang zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren der Suspension wurde der Überstand entfernt. Die Mikrokügelchen wurden wieder in weiterem sterilen Wasser suspendiert. Der Inhalt jeder Zentrifugenflasche wurde auf ein Gesamtvolumen von 800 ml verdünnt. Die Zentrifugenflaschen wurden wiederum mit 4.200 U/min 50 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dann entfernt. Die Mikrokügelchen wurden wieder in einem minimalen Volumen von sterilem Wasser suspendiert und insgesamt 350 mg Mannit zugegeben. Die Mikrokügelchen wurden dann in einen 1-l-Gefriertrocknungskolben gespült und auf ein Gesamtvolumen von ungefähr 400 ml verdünnt. Die Mikrokügelchensuspension wurde dann gefroren und lyophilisiert (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten ungefähr 0,8 ± 0,2 Gew.-% Ovalbumin und hatten einen Durchmesser von etwa 5,0 μm oder weniger.
Beispiel 3 (erfindungsgemäß)

Biologisch aktives Mittel: Ovalbumin
Polymer-Blend: 60:40 DL-PLG/DL-Lactid (70/30)
Tensid: Poly(vinylalkohol) (PVA) – 1,0 Gew.-%,
Carboxymethylcellulose (CMC) – 0,7 Gew.-%

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 1,05 g 60:40 DL-PLG (Birmingham Polymers Inc.) mit einer inhärenten Viskosität von 0,49 dl/g in Chloroform und 0,45 g DL-Lactid (R104, Boehringer Ingelheim) mit einem Molekulargewicht von 2.000 in 5,5 g Ethylacetat gelöst wurden. Als Nächstes wurden ungefähr 12,5 mg Ovalbumin in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Die Ovalbuminlösung wur de zu der Polymerlösung zugegeben, während sie mit einem Brinkmann Polytron (Modell 10, PTA-10S-Sonde, Brinkmann Instrument Co., Westbury, NY) homogenisiert wurde.
In einem getrennten Behälter wurden 280 g einer wässrigen Lösung, die aus 1,0 Gew.-% Poly(vinylalkohol) (PVA) und 0,7 Gew.-% Carboxymethylcellulose (CMC) bestand, die mit Ethylacetat gesättigt wurde, auf 12 ± 2°C equilibriert. Der Standardmischkopf eines Silverson-Labormischers (Silverson Machines Inc., East Longmeadow, MA) wurde unter der Oberfläche der PVA/CMC-Lösung angeordnet.
Während der Silverson-Mischer mit einer Rührrate von 3.850 ± 50 U/min betrieben wurde, wurde die Ovabumin/Polymer-Emulsion sofort in die PVA/CMC-Lösung überführt. Die entstehende Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde 45 Sekunden lang gerührt, wonach die Emulsion in 5,2 l steriles Wasser überführt wurde, das mit einem Kreiselrührer aus rostfreiem Stahl gerührt wurde. Die entstehenden Mikrokügelchen wurden in dem Wasser ungefähr 15 Minuten lang gerührt.
Steriles Wasser und Mikrokügelchen wurden dann in 6 1-l-Zentrifugenflaschen überführt. Die Flaschen wurden mit 4.200 U/min unter Verwendung einer Beckman-J6M-Zentrifuge (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) 45 Minuten lang zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren der Suspension wurde der Überstand entfernt. Die Mikrokügelchen wurden in weiterem sterilen Wasser wieder suspendiert. Der Inhalt jeder Zentrifugenflasche wurde auf ein Gesamtvolumen von 800 ml verdünnt. Die Zentrifugenflaschen wurden wiederum mit 4.200 U/min 55 Minuten lang zentrifugiert. Das Waschverfahren wurde ein weiteres Mal wiederholt, wonach die Mikrokügelchen in einem Gesamtvolumen von ungefähr 400 ml sterilem Wasser suspendiert wurden. Insgesamt 300 mg Mannit wurden zu der Suspension zugegeben, die dann in 1-l-Gefriertrocknungskolben überführt wurde. Die Mikrokügeichensuspension wurde dann gefroren und lyophilisiert (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten ungefähr 0,8 ± 0,2 Gew.-% Ovalbumin und hatten einen Durchmesser von etwa 5,0 μm oder weniger.
Beispiel 4 (erfindungsgemäß)

Biologisch aktives Mittel: Ovalbumin
Polymer-Blend: 50:50 DL-Lactid (80/20)
Tensid: Poly(vinylalkohol) (PVA) – 1,0 Gew.-%,
Carboxymethylcellulose (CMC) – 0,7 Gew.-%

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 0,8 g 50:50 DL-PLG (Birmingham Polymers Inc.) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 dl/g in Hexafluorisopropanol und 0,20 g DL-Lactid (R104, Boehringer Ingelheim) mit einem Molekulargewicht von 2.000 in 4,0 g Ethylacetat gelöst wurden. Als Nächstes wurden ungefähr 9,3 mg Ovalbumin in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Die Ovalbuminlösung wurde der Polymerlösung zugegeben, während sie mit einem Brinkmann Polytron (Modell 10, PTA-10S-Sonde, Brinkmann Instrument Co., Westbury, NY) homogenisiert wurde.
In einem getrennten Behälter wurden 280 g einer wässrigen Lösung, die aus 1,0 Gew.-% Poly(vinylalkohol) (PVA) und 0,7 Gew.-% Carboxymethylcellulose (CMC) bestand, die mit Ethylacetat gesättigt war, auf 17 ± 2°C equilibriert. Der Standardmischkopf eines Silverson-Labormischers (Silverson Machines Inc., East Longmeadow, MA) wurde unter der Oberfläche der PVA/CMC-Lösung positioniert.
Während der Silverson-Mischer mit einer Rührrate von 3.950 ± 50 U/min betrieben wurde, wurde die Ovalbumin/Polymer-Emulsion sofort in die PVA/CMC-Lösung überführt. Die entstehende Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde 45 Sekunden lang gerührt, wonach die Emulsion in 5,2 l steriles Wasser, das mit einem Kreiselrührer aus rostfreiem Stahl gerührt wurde, überführt wurde. Die entstehenden Mikrokügelchen wurden in dem Wasser ungefähr 15 Minuten lang gerührt.
Steriles Wasser und Mikrokügelchen wurden dann in 6 1-l-Zentrifugenflaschen überführt. Die Flaschen wurden mit 4.200 U/min unter Verwendung einer Beckman-J6M-Zentrifuge (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) 50 Minuten lang zentrifugiert. Nach Zentrifugieren der Suspension wurde der Überstand entfernt. Die Mikrokügelchen wurden wieder in weiterem sterilen Wasser suspendiert. Der Inhalt jeder Zentrifugenflasche wurde auf ein Gesamtvolumen von 800 ml verdünnt. Die Zentrifugenflaschen wurden wiederum mit 4.200 U/min 60 Minuten lang zentrifugiert. Dieses Waschverfahren wurde ein weiteres Mal wiederholt, wonach die Mikrokügelchen in einem Gesamtvolumen von ungefähr 400 ml sterilem Wasser suspendiert wurden. Insgesamt 250 mg Mannit wurden zu der Suspension zugegeben, die in einen 1-l-Gefriertrocknungskolben überführt wurde. Die Mikrokügelchensuspension wurde dann gefroren und lyophilisiert (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten ungefähr 0,8 ± 0,2 Gew.-% Ovalbumin und hatten einen Durchmesser von etwa 5,0 μm oder weniger.
Beispiel 5 (Referenz)

Biologisch aktives Mittel: P895-1
Polymer: 50:50 DL-PLG (503H)
Tensid: Carboxymethylcellulose (CMC)

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 1,5 g 50:50 DL-PLG (503H, Boehringer Ingelheim) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 dl/g in Hexafluorisopropanol in 5,6 g Ethylacetat gelöst wurden. Als Nächstes wurden ungefähr 15 mg P815-1 in 0,4 ml sterilem Wasser gelöst. Die P815-1-Lösung wurde der Polymerlösung zugegeben, während mit einem Brinkmann Polytron (Modell 10, PTA-10S-Sonde, Brinkmann Instrument Co., Westbury, NY) homogenisiert wurde.
In einem getrennten Behälter wurden 280 g 1,4 Gew.-% wässrige Carboxymethylcellulose, die mit Ethylacetat gesättigt war, auf 18 ± 2°C equilibriert. Der Standardmischkopf, mit dem ein Silverson-Labormischer ausgestattet war (Silverson Machines Inc., East Longmeadow, MA), wurde unter der Oberfläche der CMC-Lösung angeordnet.
Während der Silverson-Mischer mit einer Rührrate von 3.850 ± 50 U/min betrieben wurde, wurde die P815-1/Polymer-Emulsion sofort in die CMC-Lösung überführt. Die entstehende Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde 45 Sekunden lang gerührt, wonach die Emulsion in 5,2 l steriles Wasser, das mit einem Krei selrührer aus rostfreiem Stahl gerührt wurde, überführt wurde. Die entstehenden Mikrokügelchen wurden in dem Wasser ungefähr 15 Minuten lang gerührt.
Steriles Wasser und Mikrokügelchen wurden dann in 6 1-l-Zentrifugenflaschen überführt. Die Flaschen wurden mit 4.200 U/min unter Verwendung einer Beckman-J6M-Zentrifuge (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) 40 Minuten lang zentrifugiert. Nach Zentrifugieren der Suspension wurde der Überstand entfernt. Die Mikrokügelchen wurden wieder in weiterem sterilen Wasser suspendiert. Der Inhalt jeder Zentrifugenflasche wurde auf ein Gesamtvolumen von 800 ml verdünnt. Die Zentrifugenflaschen wurden wiederum mit 4.200 U/min 45 Minuten lang zentrifugiert. Dieses Waschverfahren wurde ein weiteres Mal wiederholt, wonach die Mikrokügelchen in einem Gesamtvolumen von ungefähr 800 ml sterilem Wasser suspendiert wurden. Insgesamt 400 mg Mannit wurden der Suspension zugegeben, die dann gleichmäßig auf zwei 1-l-Gefriertrocknungskolben verteilt wurde. Die Mikrokügelchensuspension wurde dann gefroren und lyophilisiert (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten ungefähr 0,8 ± 0,2 Gew.-% P815-1 und hatten einen Durchmesser von etwa 5,0 μm oder weniger.
Beispiel 6 (Referenz)

Biologisch aktives Mittel: P815-1
Polymer: 50:50 DL-PLG (503H)
Tensid: Carboxymethylcellulose (CMC) und Tween

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 1,5 g 50:50 DL-PLG (503H, Boehringer Ingelheim) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 dl/g in Hexafluorisopropanol in 5,7 g Ethylacetat gelöst wurden. Als Nächstes wurden 14,5 mg P815-1 in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Die P815-I-Lösung wurde der Polymerlösung zugegeben, während sie mit einem Brinkmann Polytron (Modell 10, PTA-10S-Sonde, Brinkmann Instrument Co., Westbury, NY) homogenisiert wurde.
In einem getrennten Behälter wurde eine Lösung, die aus 280 g 1,0 Gew.-% wässriger Carboxymethylcellulose bestand, die 0,03 Gew.-% Polysorbat (Tween 80) enthielt, auf 18 ± 2°C gehalten. Die Lösung wurde mit Ethylacetat gesättigt. Der Standardmischkopf eines Silverson-Labormischers (Silverson Machines Inc., East Longmeadow, MA) wurde unter der Oberfläche der CMC/Tween-Lösung angeordnet.
Während der Silverson-Mischer mit einer Rührrate von 4.000 ± 50 U/min betrieben wurde, wurde die P815-1/Polymer-Emulsion sofort in die CMC/Tween-Lösung überführt. Die entstehende Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde 45 Sekunden lang gerührt, wonach die Emulsion in 5,2 l steriles Wasser überführt wurde, das mit einem Kreiselrührer aus rostfreiem Stahl gerührt wurde. Die Mikrokügelchen wurden ungefähr 15 Minuten lang im Wasser gerührt.
Steriles Wasser und Mikrokügelchen wurden dann in 6 1-l-Zentrifugenflaschen überführt. Die Flaschen wurden mit 4.200 U/min unter Verwendung einer Beckman-J6M-Zentrifuge (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) 45 Minuten lang zentrifugiert. Nach Zentrifugieren der Suspension wurde der Überstand entfernt. Die Mikrokügelchen wurden in weiterem sterilen Wasser wieder suspendiert. Der Inhalt jeder Zentrifugenflasche wurde auf ein Gesamtvolumen von ungefähr 800 ml verdünnt. Die Zentrifugenflaschen wurden wiederum mit 4.200 U/min ungefähr 50 Minuten lang zentrifugiert. Wiederum wurde der Überstand dann entfernt. Die Mikrokügelchen wurden in einem minimalen Volumen an sterilem Wasser wieder suspendiert und insgesamt 350 mg Mannit wurden zugegeben. Die Mikrokügelchen wurden dann in einen 1-l-Gefriertrocknungskolben gespült und auf ein Gesamtvolumen von ungefähr 400 ml verdünnt. Die Mikrokügelchensuspension wurde dann gefroren und lyophilisiert (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten ungefähr 0,8 ± 0,2 Gew.-% P815-1 und hatten einen Durchmesser von etwa 5,0 μm oder weniger.
Beispiel 7 (erfindungsgemäß)

Biologisch aktives Mittel: P815-1
Polymer-Blend: 60:40 DL-PLG (80%), DL-Lactid (20%)
Tensid: Poly(vinylalkohol) (PVA) – 1,0 Gew.-%,
Carboxymethylcellulose (CMC) – 0,7 Gew.-%

Es wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 1,2 g 60:40 DL-PLG (Birmingham Polymers Inc.) mit einer inhärenten Viskosität von 0,49 dl/g in Chloroform und 0,30 g DL-Lactid (R104, Boehringer Ingelheim) mit einem Molekulargewicht von 2.000 in 5,5 g Ethylacetat gelöst wurden. Als Nächstes wurden 15,1 mg P815-1 in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Die P815-1-Lösung wurde der Polymerlösung zugegeben, während sie mit einem Brinkmann Polytron (Modell 10, PTA-10S-Sonde, Brinkmann Instrument Co., Westbury, NY) homogenisiert wurde.
In einem getrennten Behälter wurden 280 g einer wässrigen Lösung, die aus 1,0 Gew.-% Poly(vinylalkohol) (PVA) und 0,7 Gew.-% Carboxymethylcellulose (CMC) bestand, die mit Ethylacetat gesättigt worden war, auf 15 ± 2°C equilibriert. Der Standardmischkopf eines Silverson-Labormischers (Silverson Machines Inc., East Longmeadow, MA) wurde unter der Oberfläche der PVA/CMC-Lösung angeordnet.
Während der Silverson-Mischer mit einer Rührrate von 3.850 ± 50 U/min betrieben wurde, wurde die Ovalbumin/Polymer-Emulsion sofort in die PVA/CMC-Lösung überführt. Die entstehende Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde 45 Sekunden lang gerührt, wonach die Emulsion in 5,2 l steriles Wasser überführt wurde, das mit einem Kreiselrührer aus rostfreiem Stahl gerührt wurde. Die entstehenden Mikrokügelchen wurden in dem Wasser ungefähr 15 Minuten lang gerührt.
Striles Wasser und Mikrokügelchen wurden dann in 6 1-l-Zentrifugenflaschen überführt. Die Flaschen wurden mit 4.200 U/min unter Verwendung einer Beckman-J6M-Zentrifuge (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) 50 Minuten lang zentrifugiert. Nach Zentrifugieren der Suspension wurde der Überstand entfernt. Die Mikrokügelchen wurden in weiterem sterilen Wasser wieder suspendiert. Der Inhalt jeder Zentrifugenflasche wurde auf ein Gesamtvolumen von 800 ml verdünnt. Die Zentrifugenflaschen wurden wieder mit 4.200 U/min 55 Minuten lang zentrifugiert. Das Waschverfahren wurde ein weiteres Mal wiederholt, wonach die Mikrokügelchen in einem Gesamtvolumen von ungefähr 400 ml sterilem Wasser suspendiert wurden. Insgesamt 400 mg Mannit wurden der Suspension zugegeben, die in 1-l-Gefriertrocknungskolben überführt wurde. Die Mikrokügelchensuspension wurde dann gefroren und lyophilisiert (FTS Systems, Stone Ridge, NY). Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten ungefähr 0,8 ± 0,2 Gew.-% P815-1 und hatten einen Durchmesser von etwa 5,0 μm oder weniger.
Immunologische Versuche
Materialien und Methoden
Mäuse
Weibliche C57BL/6 (H-2^b)- und DBA/2 (H-2^d)-Mäuse, die 6 bis 8 Wochen alt waren, wurden von Charles River Laboratories (Boston, MA) erworben. Sie wurden im Tiergehege des Fred Hutchinson Cancer Research Center (Seattle, WA) gehalten.
Antigene und Reagenzien
Ovalbumin (Qualität VII) wurde von Sigma (St. Louis, MO) erworben und wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Monoklonale Anti-CD8-(53-6.7)- und anti-CD4-(H129.19)-Antikörper wurden von Pharmingen (San Diego, CA) erworben. Die in dieser Untersuchung verwendeten Peptide wurden an einem Millipore-9050-Plus-Peptidsyntheseautomaten über HBTU-(O-Benzotriazol-N,N,N',N'tetramethyluroniumhexafluorphosphat)-Aktivierung synthetisiert und dann von dem festen Träger mit einer Lösung aus Trifluoressigsäure:Ethandithiol:Thioanisol:Wasser:Phenol (40:1:2:2:3) gespalten. Nach der Spaltung wurden die rohen Peptide mit C18-Reverse-Phase-HPLC gereinigt und mit Massenspektrometrie vor der Verwendung charakterisiert. Ova-Peptide wurden hergestellt nach den veröffentlichten Sequenzen für potenzielle Epitope, die durch H-2K^b beschränkt sind, wie in Barber et al. offenbart (Journal of Experimental Medicine, 1994, 180, Seiten 119–1194). Zwei tumorassoziierte Peptide wurden hergestellt basierend auf dem P1A-Kernepitop, das aus dem P815-Tumor stammt, ein Peptid mit 28 Aminosäuren, P815-1, das aus den Resten 28 bis 49 des P1A-Antigens besteht mit 3 Lysinresten, die sowohl dem C- als auch dem N-Ende der Sequenz zugefügt wurden (KKKRYSLEEILPYLGWLVFAVVTTSKKK), um die Löslichkeit zu verbessern, und ein Peptid mit 9 Resten, P815-2, das aus dem exakten Epitop LPYLGWLV bestand. Das Kontrollpeptid JAK-1 (SYFPEITHI) wurde nach Harpur et al. (Immunological Letters, 1993, 35, Seiten 235–237) synthetisiert.
Tumore und Transfektionszelllinien
EL4-Thymoma (H-2^b), P815-Mastozytoma (H-2^d) und P1A-Antigen-negative L1210 (H-2^d) lymphozytische Leukämielinien wurden von ATCC (Rockville, MD) erworben. Die Herstellung des Ova exprimierenden EL4-Transfizienten EG7.Ova wurde in Moore et al. (Cell, 1988, 54, Seiten 777–785) offenbart. BMA3.1 war eine von C57BL/6 abgeleitete Knochenmarksmakrophagenlinie. Alle Zellgewebe verwendeten RPMI komplettes Medium, das mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin, Streptomycin, Gentamycin und 2·10^–5 M β-Mercaptoethanol ergänzt war. EG7.Ova-Zelllinie wurde in einem selektiven Medium gezüchtet, das 0,4 mg/ml G418 enthielt.
Formulierung und Charakterisierung von verkapselten biologisch aktiven Mitteln
Alle verkapselten biologisch aktiven Mittel, die in den immunologischen Untersuchungen verwendet wurden, wurden hergestellt unter Verwendung der Verfahren der Beispiele 1 bis 7. Die Mikrokügelchen hatten im Durchschnitt 2 bis 3 μm Durchmesser und hatten einen Antigengehalt von 0,5 bis 1% (G/G). Das Mikrokügelchenprodukt wurde unter Verwendung von Standardmethoden charakterisiert, wobei Kernbeladung, Homogenität des verkapselten Peptids oder Proteins und auch die in-vitro-Freisetzungseigenschaften der Mikrokügelchen (J. H. Eldridge et al. (1993), Semin. Hematol. 30, 16–24; J. H. Eldridge et al. (1991), Infect. Immun. 59, 2978–2986) festgestellt wurden. Typischerweise setzen Mikrokügelchenpräparate in vitro 50% des verkapselten Antigens über 4 bis 8 Wochen frei, nach einem Anfangs-Burst von < 10% Antigen in PBS.
Tierimmunisierung und in-vitro-Stimulation einer Effektorpopulation
C57BL/6-Mäuse wurden subcutan mit 15 bis 30 μg löslichem Ova oder Ova verkapselt in Mikrokügelchen (Ova/PLG) immunisiert. In dem P1A-System wurden DBA/2-Mäuse auf gleiche Weise mit P815-1-Peptid allein oder P815-1/PLG immunisiert. PLG wird hier als PLG1 definiert, das die polymere Zusammensetzung des Einzelkomponentensystems darstellt, oder PLG2a-XX, das die polymere Zusammensetzung des Blend-Komponentensystems repräsentiert. Die Antigene wurden in 200 μl PBS suspendiert und an beiden Flanken des Tiers injiziert. Als Kontrollen wurden die Mäuse mit Ova gemischt mit Alaun als Adjuvans immunisiert. 14 bis 21 Tage nach der Immunisierung wurden Splenozyten als Einzelzellsuspensionen präpariert und ~50·10⁶ Zellen aus jeder Maus wurden mit 2,5·10⁶ bestrahlten (200.000 rad) EG7.Ova-Zellen inkubiert. Für die anti-P1A-Antwort wurden Milzzellen mit bestrahlten P815-Zellen stimuliert oder Splenozyten wurden mit P815-2-Peptid vorinkubiert. Nach 5 Tagen Kultur wurden die CTL- Aktivitäten in einem ⁵¹Cr-Freisetzungs-Cytotoxizitätsassay, wie unten beschrieben, gemessen.
In-vitro-Präsentation von verkapseltem Antigen
BMA3.1-Makrophagenzellen wurden pulsweise 4 Stunden lang mit 6 mg Ova/PLG, einer äquivalenten Konzentration von löslichem Ova oder Ova + Placebo-PLG-Mikrokügelchen behandelt. Überschüssige Mikrokügelchen wurden durch wiederholtes Waschen entfernt. Die gepulsten Zellen wurden geerntet, mit PBS gewaschen und sofort einem CTL-Assay unter Verwendung einer etablierten Ova-spezifischen CTL-Linie unterzogen.
Cytotoxischer T-Zellassay
Um einen CTL-Assay durchzuführen, wurden Zielzellen mit ⁵¹Cr bei 100 μCi/10⁶ Zellen bei 37°C 60 Minuten lang inkubiert. Markierte Zellen wurden zwei- oder dreimal gewaschen und 1·10⁴ markierte Ziele pro Napf wurden in 96-Napf-Platten in einem Endvolumen von 200 μl RP-10 (RPMI-Medium mit 10% FCS) pro Napf verteilt. Verschiedene Verhältnisse von Effektor:Ziel wurden verwendet, wie angegeben. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurde der Überstand aus Testnäpfen gesammelt unter Verwendung von Skatron-Filterstreifen und auf einem Packard-Cobra-II-Counter gezählt. Die spezifische Lyse wurde berechnet als:
Um die Peptidspezifität der CTLs zu bestimmen, wurden Zielzellen mit 50 μg/ml Peptiden in RP-10 1 Stunde lang inkubiert, dreimal gewaschen und dann dem gleichen Testverfahren, wie oben beschrieben, unterzogen.
T-Helferzelltest und Cytokinproduktion
Um die Beteiligung der PLG-Kügelchen am Ergebnis der Untergruppen der T-Helferzellen (Th1 oder Th2) zu bestimmen, wurden die Cytokine IFN-γ und IL-4 in den Kulturüberständen der mit Antigen stimulierten Zellen gemessen. Kurz gesagt, wurden Milzzellen oder Lymphknotenzellen (3,0 × 10⁶/ml) von Mäusen, die mit Antigenen immunisiert worden waren, 3 Tage lang mit oder ohne verschiedene Antigene gezüchtet. Die Überstände wurden gesammelt und die Cytokine IFN-γ und IL-4 mit ELISA quantitativ ausgewertet, wie beschrieben, unter Verwendung spezifischer monoklonaler anti-IFN-γ- oder anti-IL-4-Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA). Kurz gesagt, wird IFN-γ gemessen unter Verwendung eines Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). ELISA-Platten werden mit einem Antikörper, der gegen Maus-IFN-γ gerichtet war, in PBS 6 Stunden lang bei Raumtemperatur beschichtet. Die Näpfe wurden dann mit PBS, das 1% (G/V) BSA plus 0,1% Tween-20 enthielt, 3 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden sechsmal in PBS/0,1% Tween-20 gewaschen und die Proben 1:2 in PBS/1% BSA/0,1% Tween-20 in den ELISA-Platten verdünnt. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden wiederum gewaschen und mit monoklonalen anti-IFN-γ oder IL-4, verdünnt in PBS/1% BSA/0,1% Tween-20 biotinyliert. Die Platten wurden dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und 100 μl (pro Napf) Streptavidin-HRP (verdünnt 1:2.000 in PBS/1% BSA/0,1%) zugegeben. Dann wurde Tween-20 zugegeben. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen und TMB-Substrat zugefügt. Die Reaktion wurde nach 10 Minuten mit 1 n Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm unter Verwendurg von 570 nm als Referenzwellenlänge bestimmt. Die Fraktionen, die bei beiden Replikaten zu einer OD führten, die doppelt so hoch war wie die mittlere OD von Zellen, die in Medium alleine gezüchtet worden waren, plus drei Standardabweichungen, wurden als positiv angesehen.
In gleicher Weise wurde IL-4 gemessen unter Verwendung eines Paars von monoklonalen anti-Maus-IL-4-Antikörpern. Ansonsten wurden die Tests durchgeführt, wie oben beschrieben.
T-Zellabreicherungstest
Für in-vitro-Abreicherungsversuche wurden in vivo geprimte Splenozytenkulturen mit anti-CD4- oder anti-CD8-mAbs, die auf AIS-MicroCELLector-T25-Kulturkolben immobilisiert worden waren, gemäß dem vom Lieferanten beigefügten Protokoll (Applied Immune Sciences Inc., Menlo Park, CA) inkubiert.
Induktion einer spezifischen Antikörperantwort in Mäusen
Mäuse (2 bis 3 pro Gruppe) wurden mit 5 bis 40 μg Testantigen mit oder ohne Verkapselung in PLG-Kügelchen immunisiert. Als Kontrolle wurden Mäuse auch mit dem rekombinanten Antigen in Alaun, CFA oder in PBS immunisiert. Den Mäusen wurde 1 Woche nach jeder Immunisierung Blut entnommen. Die Antikörper, die Antigene erkennen, wurden wie folgt nachgewiesen: die Platten wurden mit 100 bis 500 ng Testantigen in PBS pro Napf in 96-Napf-PVC-Platten beschichtet. Sie wurden blockiert und 100-μl-Reihenverdünnungen der Seren wurden pro Napf zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit HRP konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG wurde zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Platten gewaschen und mit HRP-Substrat TMB entwickelt. Die optischen Dichten der entwickelten Farbe wurden bei 405 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als OD405 pro 1/Reihenverdünnung.
Antitumorimmunitätsstudien
Mäuse wurden subcutan mit 30 μg/Maus P815-1/PLG, Peptid allein oder Peptid gemischt mit Alaun als Adjuvans immunisiert. 3 Wochen nach der Immunisierung wurden sie intradermal an der Flanke mit 5·10⁴ lebenden P815-Zellen beaufschlagt. Das Auftreten eines Tumors wurde alle 3 oder 4 Tage untersucht.
Beispiel 8 (Referenz)
Das in einer einzelnen Komponente verkapselte Antigen, das untersucht wurde, wurde hergestellt unter Verwendung des in Beispiel 1 ausgeführten Verfahrens mit der polymeren Zusammensetzung, die als PLG1 bezeichnet wurde.
Um zu bestimmen, ob Antigene, die unter Verwendung eines Einzelkomponentensystems verkapselt wurden, in den Antigenpräsentationsstoffwechselweg des MHC-Klasse-I-Moleküls eingeführt werden könnten, wurde ein in-vitro-System verwendet, bei dem Ova/PLG1-Mikrokügelchen mit einer Makrophagenzelllinie, BMA3.1 (H-2K^b) über verschiedene Zeiträume inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann daraufhin untersucht, ob sie Teilchen aufgenommen hatten. Die MHC-Präsentation der Ova-Epitope wurde bestimmt durch die Fähigkeit der Ova-spezifischen CTL, BMA3.1-Zellen, die mit Ova/PLG1 vorinkubiert worden waren, zu erkennen.
Wie in 1 gezeigt, wurden effizient für die Ova-Erkennung sensibilisierte Ova/PLG1 Zielzellen, BMA3.1-Zellen, die mit Ova/PLG1-Mikrokügelchen 4 Stun den lang inkubiert worden waren, effizient von spezifischen CTLs getötet. 1·10⁶ BMA3.1-Zellen wurden mit einer optimalen Dosis von 6 mg Ova/PLG (
), die etwa 30 μg Ova enthielt, 4 Stunden bei 37°C inkubiert und einer CTL-Erkennung mit einer etablierten Ova-spezifischen CTL-Linie unterzogen. Als Kontrollen wurden BMA3.1-Zellen auch mit Medium allein (O), Ova-257-264-Peptid (+), 30 μg/ml löslichem Ova (☐), 6 mg Placebo PLG1 (Δ) oder 30 μg/ml Ova gemischt mit 6 mg PLG1 (O) über den gleichen Zeitraum behandelt. Die spezifische CTL-Erkennung wurde nur beobachtet, wenn BMA3.1-Zellen mit Ova/PLG1 und dem H-2K^b präsentierten Ova-257-264-Peptid vorinkubiert worden waren.
Bei diesem Versuch wurde keine CTL-Erkennung von Makrophagen, die mit äquivalenten Konzentrationen von löslichem Ova gepulst worden waren, beobachtet (1), was darauf hindeutet, dass die Aufnahme von löslichem Protein aus dem Medium durch diese Zellen extrem ineffizient ist. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Gegenwart von Mikroteilchen in der Kultur statt deren verkapseltem Antigen die Antigenaufnahme durch BMA3.1-Zellen stimuliert haben könnte, wurden diese Zellen auch mit löslichem Ova plus Placebo-PLG1-Mikrokügelchen inkubiert. Es wurde keine CTL-Erkennung, die über den Hintergrund hinausging, beobachtet (1). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Sensibüisierung von Makrophagen teilchenförmige Antigene erforderte.
Beispiel 9 (Referenz)
Das in einer einzelnen Komponente verkapselte Antigen, das untersucht wurde, wurde hergestellt unter Verwendung des in Beispiel 1 ausgeführten Verfahrens, was als PLG1 bezeichnet wird, und es wurde auf CTL-Aktivität getestet.
Um festzustellen, ob das gleiche Ova/PLG1 spezifische CTL in vivo primen könnte, wurden C57BL/6-Mäuse (H-2^b) entweder mit löslichem Ova oder mit Ova/PLG immunisiert. Kontrollmäuse wurden auch mit löslichem Ova gemischt mit Placebo-PLG1-Mikrokügelchen (Ova + PLG1) und Ova mit Alaun immunisiert. Um die CTL-Aktivität zu testen, wurden Splenozyten 2 Wochen nach Immunisierung geerntet und mit bestrahlten EG7.Ova-Zellen stimuliert.
Die Ergebnisse in 2a zeigen, dass nur mit Ova/PLG1-Mikrokügelchen immunisierte Mäuse eine starke CTL-Antwort zeigten. C57BL/6-Mäuse wurden mit Ova/PLG (
), das 30 μg Ova enthielt, einmal für 2 Wochen Immunisiert. Die entstehenden Effektorzellen wurden entweder gegen EL4-Zellen (offene Symbole) oder EG7.Ova (geschlossene Symbole) getestet. Es wurde keine Cytotoxizität beobachtet mit Effektorzellen aus Mäusen, die mit der gleichen Menge an löslichem Ova (
), Ova plus Alaun (
) oder Ova gemischt mit PLG-Mikrokügelchen (
) immunisiert worden waren. Die hier gezeigten Ergebnisse sind typisch für mehr als 70 Versuche, die bisher durchgeführt wurden. Im Hinblick auf die invitro-Daten konnte keine spezifische CTL-Erzeugung in Mäusen nachgewiesen werden, die mit irgendeiner anderen Antigenkombination immunisiert worden waren, einschließlich Ova gemischt mit Placebo-PLG1-Mikrokügelchen oder Alaun.
Die Peptidspezifitäten der CTL-Population, die durch Ova/PLG1 induziert wurden, wurden weiter untersucht. Die gleiche geprimte CTL-Population wurde gegen EL4-Zellen getestet, die mit sechs von Ovalbumin abgeleiteten Peptiden beschichtet worden waren, einschließlich der zwei bekannten immunodominanten Peptide Ova 257–264 und Ova 55–62 und vier anderen mit Sequenzen, die dem K^b-Bindungsmotiv entsprechen. Die Ergebnisse in 2b zeigen, dass mit Ova/PLG1 geprimte Effektorzellen Spezifitäten aufwiesen für beide bekannten Epitope, aber nicht gegen eines der anderen vier möglichen Epitope. Mit Ova/PLG1 geprimte Effektoren erkannten EG7.Ova (
) und EL4 gepulst mit den immundominanten Ova 257–264 (SIINFEKL,
)- und subdominante Ova-55–62-(KWRFDKL,
)-Epitopen, aber nicht EL4 (
)oder EL4 gepulst mit den anderen vier Peptiden, Ova 12–19 (CFDVFKEL, Δ), Ova 25–32 (ENIFYCPI, ♦), Ova 107–114 (AEERYPIL, O) und Ova 176–183 (NAIVFKGL, ☐); die dem H-2K^b-Bindungsmotiv entsprechen.
Die Phänotypen der durch Ova/PLG1 induzierten T-Zellpopulation wurden auch untersucht. Mit Ova/PLG1 immunisierte Milzzellen wurden mit bestrahlten EG7.Ova gezüchtet und dann geerntet und von CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen abgereichert durch Inkubation mit monoklonalen anti-CD4- oder anti-CD8-Antikörpern, wie bei "Materialien und Methoden" beschrieben. Wenn auf CTL-Aktivität gegen EG7.Ova-Zellen getestet wurde, hob die Abreicherung der CD8⁺-, nicht aber der CD4⁺-Subpopulation die CTL-Antwort auf, was darauf hindeutet, dass die Ova-reaktive cytolytische Aktivität CD8⁺-abhängig war (2c). In vivo geprimte Milzzellen wurden gegen EL4 (offene Symbole) oder EG7.Ova (geschlossene Symbole) ohne Abreicherung (
) oder mit Abreicherung von CD4⁺ (
) oder CD8⁺ (
) getestet, wie in 2c gezeigt. Nur die Abreicherung der CD8⁺-Population verminderte die cytolytische Aktivität.
Um sicherzustellen, dass die durch Ova/PLG1 hervorgerufene CTL-Antwort über einen längeren Zeitraum andauerte, wurde die Gesamt-Ova-spezifische CTL-Aktivität in der geprimten Splenozytenpopulation bis zu 12 Wochen nach einer einzigen Immunisierung überwacht. Wie in 3 gezeigt, blieb die anti-Ova-Aktivität noch 12 Wochen nach der Anfangsimmunisierung auf hohem Niveau. C57BL/6-Mäuse wurden einmal mit 30 μg Protein pro Tier immunisiert. Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten getötet, wie in der Figur für die CTL-Aktivität angegeben. Noch nach 12 Wochen konnten die in vivo geprimten Splenozyten noch EG7 (
), nicht aber EL4 (O) in hohem Ausmaß erkennen.
Beispiel 10 (Referenz)
Das in einer einzelnen Komponente verkapselte Antigen, das in Beispiel 10 untersucht wurde, wurde hergestellt unter Verwendung des in Beispiel 5 ausgeführten Verfahrens und wird als PLG1 bezeichnet.
Um die Anwendung von verkapselten biologisch aktiven Mitteln für andere Arten von Antigenen zu untersuchen, wurde der obige Versuch auf ein tumorassoziiertes Antigen P1A ausgedehnt. Das P1A-Antigen unterscheidet sich signifikant von Ovalbumin darin, dass es ein Selbstantigen ist, das sowohl vom Tumor als auch von normalen Geweben exprimiert wird. Da das P1A-Proteinantigen voller Länge nicht leicht verfügbar war, wurde ein Peptid mit 28 Aminosäuren, das das CTL-Epitop enthielt, synthetisiert (P815-1) und in PLG1-Mikrokügelchen verkapselt. Die Mäuse wurden mit diesen P815-1/PLG-Mikrokügelchen und verschiedenen Kontrollen immunisiert.
Zwei Wochen der Immunisierung mit P815-1/PLG1 führte zu einer Splenozytenpopulation, die gegen P815-Zellen stark reaktiv war, nicht aber gegen syngene L1210-Zellen (4a). DBA/2-Mäuse wurden mit 30 μg löslichem P815-1-Peptid (
und
) oder der äquivalenten Menge an P815-1/PLG (
und Δ) immunisiert. Zwei Wochen nach einer einzigen Immunisierung wurden Milzzellen in vitro 5 Tage lang mit bestrahlten Splenozyten stimuliert, die mit P815-2-(LPYLGWLV)-Peptid vorinkubiert worden waren. Die entstehenden Effektorzellen zeigten eine spezifische Aktivität gegen P815 (geschlossene Symbole), aber nicht gegen syngene L1210-(offene Symbole)-Zellen. Ein minimales CTL-Priming war mit löslichem P815-1-Peptid zu sehen.
Es wurde bestätigt, dass die Peptidspezifität der durch P815-1/PLG1 induzierten CTL gegen das P1A-Antigen gerichtet war. Wie in 4b gezeigt, erkannten die Effektorzellen nur P815-Zellen, die P1A-Antigen exprimierten (
). Dieselben Effektorzellen erkannten auch L1210-Zellen, die dem Kern P1A-Epitop (
) ausgesetzt worden waren, wohingegen das auf H-2K^d beschränkte Kontrollpeptid, JAK-1, das stark auf P815-Zellen exprimiert wurde, nicht erkannt wurde. L1210-(Δ)-Zellen allein wurden nicht erkannt, noch mit H-2K^d-beschränktem JAK-1-Kinasepeptid (SYFPEITHI, O) gepulste L1210-Zellen.
Die cytolytische Aktivität war strikt CD8⁺-abhängig, wie in dem Abreicherungstest in 4c gezeigt. Nicht getrennte (
und ☐), CD4⁺-abgereicherte (
und O) und CD8⁺-abgereicherte (
und
) CTLs wurden gegen L1210-Zellen (offene Symbole) und P815-Zellen (geschlossene Symbole) getestet. Die Daten zeigen, dass mit P815-1/PLG1 geprimte Effektorzellen CD8⁺-abhängig sind.
Beispiel 11 (Referenz)
Die Fähigkeit von P815-1/PLG1-Mikrokügelchen, eine schützende Immunität gegen intradermal geimpfte Tumoren hervorzurufen, wurde untersucht. Gruppen von 10 Mäusen wurden mit P815-1/PLG1 und verschiedenen Kontrollen, wie oben beschrieben, immunisiert. DBA/2-Mäuse wurden mit PBS (O), 30 μg löslichem P815-1-Peptid (☐), P815-1/PLG1-(
)-Mikrokügelchen oder P815-1 in Alaun (Δ) immunisiert. 3 Wochen nach der Immunisierung wurden sie mit 5·10⁴ lebenden P815-Zellen an der Flanke beaufschlagt. 7 von 10 Mäusen, die mit P815-1/PLG1 immunisiert worden waren, waren vor dem Auftreten eines Tumors geschützt und blieben 90 Tage lang tumorfrei. 4 Wochen nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit 5·10⁴ P815-Zellen pro Maus beaufschlagt. Sobald sie mit Tumorzellen geimpft worden waren, wurden die Mäuse ständig auf ein Anwachsen des Tumors überwacht. Nach 21 Tagen Beobachtung mussten alle Mäuse der Kontrolle aufgrund großer Tumormassen getötet werden. In der mit P815-1/PLG1 immunisierten Gruppe waren jedoch 7 von 10 Mäusen tumorfrei und bei den verbleibenden Mäusen war die Tumorprogression signifikant langsamer als in den Kontrollgruppen. Die Mäuse, die Tumoren bei Präimmunisierung mit P815-1/PLG1 abgestoßen hatten, blieben 90 Tage lang tumorfrei. Die Ergebnisse, zusammengefasst in 5, zeigen, dass die in vivo durch tumorassoziiertes Antigen verkapselt in PLG1 hervorgerufene Immunität potent genug ist, um gegen den Angriff eines malignen metastatischen Tumors, wie P815, zu schützen.
In Blend-Komponenten verkapselte Antigene
Unter Verwendung der oben in den Beispielen 8 bis 11 beschriebenen Verfahren wurde das Blend-Komponentensystem getestet, um festzustellen, ob es eine Immunantwort hervorrufen würde. Die verkapselten biologisch aktiven Mittel, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, wurden hergestellt wie in den Beispielen 3 bis 4. Die Ergebnisse sind in den 6a bis i gezeigt.
Beispiel 12 (erfindungsgemäß)
Um festzustellen, ob in das Blend-Komponentensystem der vorliegenden Erfindung verkapselte biologisch aktive Mittel spezifische CTL in vivo hervorrufen könnten, wurden C57BL/6-Mäuse subcutan mit 30 μg/Maus Ova verkapselt in verschiedene Formulierungen von PLG (Tabelle 1) immunisiert. 2 Wochen später wurden die Mäuse getötet und Milzzellen wurden für die in-vitro-Stimulation mit bestrahlten EG7.Ova, wie oben beschrieben, präpariert.
Die in den 6a bis i gezeigten Daten erläutern, dass das Blend-Komponentensystem, das aus einem Blend von Polymeren mit hohem und niedrigem MW aufgebaut ist, die Fähigkeit haben, in vivo auf Klasse I beschränkte CTL effizient zu primen. Die Wirkung von verschiedenen Verhältnissen von Polymeren mit hohem zu solchen mit niedrigem MW wurden auf ein effektives CTL-Priming getestet. C57BL/6-Mäuse (H-2^b) wurden entweder mit löslichem Ova oder verschiedenen Ova/PLG-Präparaten immunisiert, die aus Polymeren mit hohem und niedrigem MW aufgebaut waren in Verhältnissen, die in einem Be reich von 80 bis 60% Polymer mit hohem MW und 20 bis 40% Polymer mit niedrigem MW lagen.
Das Blend-Komponentensystem der vorliegenden Erfindung zeigte eine konsistente CTL-Antwort. Im Fall der Einzelkomponentensysteme des Standes der Technik wurden inkonsistente CTL-Antworten beobachtet. Abhängig von den Bedingungen, unter denen das Einzelkomponentensystem hergestellt worden war, kann die Kinetik der Freisetzung aus den Einzelkomponentensystemen des Standes der Technik variieren. Der Einbau der Komponente (b) in das Blend-Komponentensystem vermindert dieses Problem, was zu einer konsistenten und höheren Kinetik der Freisetzung des biologisch aktiven Mittels führt. Zusätzlich zeigte das Einzelkomponentensystem der Erfindung eine höhere Konsistenz der CTL-Antwort als das Einzelkomponentensystem des Standes der Technik. Tabelle 1

¹ Molekulargewicht des Polylactids war 2.000 Dalton
² Diagramm (a) war ein Kontrollversuch unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung
³ 50/50 PLG in Durch (f) war unblockier. Die Komponente (a) für die Diegramme b bis e und g bis i und Polactid (Komponente (b)) sind blockiert
⁴ CMC ist Carboxymethylcellulose und PVA ist Poly(vinylalkohol)

Beispiel 13
Um zu zeigen, dass die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung eine stärkere und schnellere CTL-Antwort induzieren, wurde der folgende Versuch durchgeführt. Um festzustellen, ob Mikrokügelchen, die in einer beschleunigten Rate abgebaut werden, eine stärkere und schnellere CTL-Antwort induzieren, wurde der folgende Versuch durchgeführt. Erfindungsgemäß verbessert die Zugabe von Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht zu PLG mit höherem Molekulargewicht die Freisetzung von Wirkstoffen, die in die Mikrokügelchen verkapselt sind. Alle PLG-Formulierungen wurden von Southern Research Institute (Birmingham, AL) hergestellt.
Zwei Chargen von Mikrokügelchen, die Ovalbumin (Qualität VII) (Sigma, St. Louis, MO) enthielten, wurden hergestellt, eine Charge, die aus 65:35 PLG-Polymer (Boehringer Ingelheim, Petersburg, VA) bestand, und die andere, die aus 65:35 PLG vermischt mit 40% (Gewicht) R104-Lactid (2.000 kD) (Boehringer Ingelheim) bestand.
Charge J236-134-00 hergestellt mit einem einzelnen Polymer (Referenz)
Ovalbumin (5,15 mg, Qualität VII, Sigma, St. Louis, MO) wurde in sterilem Wasser gelöst, um eine Lösung herzustellen, die 20 mg Ovalbumin/ml enthielt. Diese Ovalbuminlösung wurde in eine 1-cm³-Spritze mit einer 18-guage-Nadel aufgezogen.
Eine Polymerlösung wurde hergestellt, indem 0,50 g 65:35 DL-PLG (inhärente Viskosität 0,72 dl/g, Methylenchlorid) in 6,3 g Methylenchlorid gelöst wurde. Diese Polymerlösung wurde in eine verkappte 10-cm³-Spritze gegossen. Als Nächstes wurde die Pofymerlösung in einem Brinkman-Polytron-Homogenisator gemischt. Während dieses Vermischens wurde die Ovalbuminlösung zu der Polymerlösung zugegeben, um eine Wasser-in-Öl-(W/O)-Emulsion herzustellen. Die Emulsion wurde insgesamt 45 Sekunden lang (15-Sekunden-Intervalle) ge mischt. Nach dem Vermischen wurde eine 14-guage-Nadel auf das Ende der 10-cm³-Spritze gesteckt.
Als Nächstes wurde die W/O-Emulsion aus der 10-cm³-Spritze durch die 14-guage-Nadel in 280 ml einer 1,4 gew.-%igen wässrigen Lösung von Carboxymethylcellulose (CMC), die mit Methylenchlorid gesättigt war, gespritzt. Während dieser Zugabe zu der W/O-Emulsion wurde die 1,4 gew.-%ige CMC mit 4.008 U/min mit einem Silverson-Homogenisator gerührt, um eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-(W/O/W)-Emulsion zu bilden. Die W/O/W-Emulsion wurde 75 Sekunden lang gemischt. Nach 75 Sekunden Vermischen wurde die W/O/W-Emulsion schnell in 3,5 l steriles Wasser gegossen, um feste Teilchen (Mikrokügelchen) zu bilden. Während dieser Zugabe wurden die 3,5 l steriles Wasser mit ~600 U/min mit einem Cole-Parmer-Laborrührer gerührt. Die Mischung wurde 18 Minuten lang gerührt.
Die Suspension der Mikrokügelchen wurde auf vier 800-ml-Flaschen verteilt und 35 Minuten in einer Beckman-J6M-Zentrifuge zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wurden die Mikrokügelchen in zwei 800-ml-Flaschen überführt. Etwa 800 ml steriles Wasser wurden zu jeder Flasche zugegeben, um die Mikrokügelchen wieder zu suspendieren. Die Suspensionen wurden 70 Minuten lang zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurden die Überstände entfernt und 125 ml steriles Wasser zu jeder 800-ml-Flasche zugegeben und die Mikrokügelchen wurden wieder suspendiert. Als Nächstes wurden die Suspensionen in einem 500-ml-Gefriertrocknungskolben vereinigt zusammen mit 0,3447 g Mannit mit Biotech-Qualität. Nachdem das Mannit gelöst war, wurde die Suspension gefroren und lyophilisiert.
Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten 0,88 Gew.-% Ovalbumin und hatten einen Durchmesser von etwa 1 bis 10 μm.
Charge J236-149-00 hergestellt mit einem 60/40 Blend von zwei Polymeren (erfindungsgemäß)
Ovalbumin (5,31 mg, Qualität VII, Sigma, St. Louis, MO) wurde in sterilem Wasser gelöst, um eine Lösung herzustellen, die 20 mg Ovalbumin/ml enthielt. Diese Ovalbuminlösung wurde in eine 1-cm³-Spritze mit einer 18-guage-Nadel aufgezogen.
Eine Polymerlösung wurde hergestellt, indem 0,30 g 65:35 DL-PLG (inhärente Viskosität 0,72 dl/g, Methylenchlorid) und 0,21 g Poly(DL-lactid) (2.000 Dalton, R104, Boehringer Ingelheim) in 6,3 g Methylenchlorid gelöst wurden. Diese Polymerlösung wurde in eine verkappte 10-cm³-Spritze gegossen. Als Nächstes wurde die Polymerlösung mit einem Brinkman-Polytron-Homogenisator gemischt. Während des Vermischens wurde die Ovalbuminlösung zu der Polymerlösung zugegeben, um eine Wasser-in-Öl-(W/O)-Emulsion zu bilden. Die Emulsion wurde insgesamt 45 Sekunden (15-Sekunden-Intervalle) gemischt. Nach dem Vermischen wurde eine 14-guage-Nadel auf das Ende der 10-cm³-Spritze gesteckt.
Als Nächstes wurde die W/O-Emulsion aus der 10-cm³-Spritze durch die 14-guage-Nadel in 280 ml einer 1,4 gew.-%igen wässrigen Lösung von Carboxymethylcellulose (CMC), die mit Methylenchlorid gesättigt war, injiziert. Während dieser Zugabe der W/O-Emulsion wurde das 1,4 gew.-%ige CMC mit 3.867 U/min mit einem Silverson-Homogenisator gerührt, um eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-(W/O/W)-Emulsion zu bilden. Die W/O/W-Emulsion wurde 75 Sekunden lang gemischt. Nach 75 Sekunden Vermischen wurde die W/O/W-Emulsion schnell in 3,5 l steriles Wasser gegossen, um feste Teilchen (Mikrokügelchen) zu bilden. Während dieser Zugabe wurden die 3,5 l steriles Wasser mit ~600 U/min mit einem Cole-Parmer-Laborrührer gerührt. Die Mischung wurde 20 Minuten lang gerührt.
Die Suspension der Mikrokügelchen wurde auf vier 800-ml-Flaschen verteilt und 35 Minuten in einer Beckman-J6M-Zentrifuge zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die Mikrokügelchen in zwei 800-ml-Flaschen überführt. Etwa 800 ml steriles Wasser wurden jeder Flasche zugegeben, um die Mikrokügelchen wieder zu suspendieren. Die Suspensionen wurden 70 Minuten lang zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurden die Überstände entfernt und 125 ml steriles Wasser wurde jeder 800-ml-Flasche zugegeben und die Mikrokügelchen wieder suspendiert. Als Nächstes wurden die Suspensionen in einem 500-ml-Gefriertrocknungskolben zusammen mit 0,3447 g Mannit mit Biotech-Qualität vereinigt. Nachdem das Mannit gelöst war, wurde die Suspension gefroren und lyophilisiert.
Die entstehenden Mikrokügelchen enthielten 0,83 Gew.-% Ovalbumin und hatten einen Durchmesser von etwa 1 bis 10 μm. Die Mikrokügelchen wurden unter Verwendung von Standardmethoden charakterisiert, um ihre Kernbeladung, Homogenität des verkapselten Proteins und die in-vitro-Freisetzungseigenschaften der Mikrokügelchen zu bestimmen.
Für Gewebekulturen wurde ein RPMI-komplettes Medium, ergänzt mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin, Streptomycin, Gentamycin und 2·10^–5 M 2-Mercaptoethanol verwendet. Eine EL4-Thymoma-Zelllinie (ATCC, Rockville, MD), die mit Ovalbumin transfiziert war (EG7.Ova), wurde in einem selektiven Medium, das 0,4 mg/ml G418 enthielt, gezüchtet. C57BL/6-Mäuse (Charles River Laboratories, Boston, MA) (3 pro Gruppe) wurden subcutan mit 30 μg Ovalbumin, das in PLG-Mikrokügelchen verkapselt war, immunisiert. Die Mikrokügelchen wurden in 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert und an beiden Flanken der Tiere verabreicht. Nach 10 Tagen wurden Splenozyten als Einzelzellsuspensionen präpariert und ca. 50·10⁶ Zellen aus jeder Maus wurden mit 2,5·10⁶ bestrahlten (200.000 rad) EG7.Ova-Zellen inkubiert.
Nach 5 Tagen Kultur wurden die CTL-Aktivitäten gemessen unter Verwendung eines ⁵¹Cr-Freisetzungscytotoxizitätstests. Zielzellen (EG7.Ova oder nicht transfizierte EL4) wurden mit ⁵¹Cr mit 100 μCi/10⁶ Zellen bei 37°C 60 Minuten lang inkubiert. Markierte Zellen wurden zwei- oder dreimal gewaschen und 1·10⁴ markierte Zielzellen pro Napf wurden in 96-Napf-Platten in einem Endvolumen von 200 μl/Napf RP-10 (RPMI-Medium mit 10% FCS) verteilt. Das Verhältnis von Effektor zu Zielzelle war wie in 7a bis b angegeben. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurde der Überstand aus den Testnäpfen unter Verwendung von Skatron-Filterstreifen gesammelt und an einem Packard-Cobra-II-Gammazähler gezählt. Die spezifische Lyse wurde bestimmt als:
Die in 7a–b gezeigten Daten zeigen den Prozentanteil Lyse, der erhalten wurde unter Verwendung der zwei Mikrokügelchenpräparate. 7a zeigt Daten von 65:35 PLG-Mikrokügelchen aufgetragen gegen verschiedene Verhältnisse von Effektor zu Zielzellen und 7b zeigt Daten, die mit 65:35 PLG vermischt mit 40 Gew.-% R104-Lactid erhalten wurden. Die Antworten für einzelne Mäuse sind gezeigt sowohl gegen EG7.Ova als auch untransfizierte EL4-Zellen. Die Lyse von EG7.Ova-Zellen war signifikant höher bei Mäusen, die mit dem Polymer-Elend immunisiert worden waren, als bei Mäusen, die mit 65:35 PLG allein immunisiert worden waren.
Beispiel 14 (erfindungsgemäß)
Um zu zeigen, dass Mikrokügelchen aus Polymer-Elend eine antigenspezifische T-Helferzellantwort in vivo induzieren, wurde MtB-Antigen, 85b, in einem Blend aus 80% 60:40 PLG und 20% R104-Lactid verkapselt. Alle PLG-Formulierungen wurden von Southern Research Institute nach den Methoden von Beispiel 13 hergestellt.
Balb/c-Mäuse (weiblich, 6 bis 8 Wochen alt, Charles River Laboratories, Boston, MA) wurden s.c. in den Flanken mit den folgenden Immunisierungsreagenzien immunisiert: 85b/PLG-Mikrokügelchen (enthaltend 40 mg 85b in einem Endvolumen von 200 ml sterilem PBS (Gibco BRL)), Placebo-PLG-Mikrokügelchen, die kein Antigen enthielten, oder PBS. Die Tiere wurden mit der gleichen Dosis am Tag 14 geboostert, bevor sie am Tag 28 getötet wurden. Einzelzellsuspensionen der gepoolten Milzen wurden hergestellt und wieder in 3 × 10⁶ Zellen/ml in kompletten Medien (RPMI-1640, das 10% FCS, 2 mM Glutamin, Natriumpyruvat, nicht essenzielle Aminosäuren, 2 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 50 U/ml Penicillin und Streptomycin enthielt) suspendiert. Die Milzzellen (3 × 10⁵ Zellen pro Napf) wurden dann in vitro (dreifache Ansätze) mit 20, 10 oder 5 mg/ml löslichem rekombinanten 85b stimuliert. Die Zellen wurden 5 Tage bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ stimuliert. Die Zellen wurden mit ³[H]Thymidin (Amersham, MA, 1 mCu pro Napf) die letzten 18 Stunden der Kultur gepulst, dann unter Verwendung von Packard Filtermate 196 geerntet. Der Thymidineinbau wurde ausge wertet unter Verwendung eines Packard-Betazählers. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Stimulationsindizes, wurden aus der folgenden Gleichung bestimmt:
Die Ergebnisse (Tabelle 2) zeigen, dass 85b, eingearbeitet in ein Blend aus 80% 60:40 PLG und 20% R104-Lactid, zu einer antigenspezifischen proliferativen Antwort der Milzzellen führte. 85b/PLG-Mikrokügelchen induzierten Antworten, die signifikant höher waren, als für entweder mit Placebo-Mikrokügelchen oder mit PBS immunisierte Mäuse.
Tabelle 2
Obwohl das vorliegende Verfahren unter Bezugnahme auf spezifische Details bestimmter Ausführungsformen beschrieben wurde, ist nicht daran gedacht, dass diese Details als Beschränkung des Schutzbereiches angesehen werden sollten, außer in dem Ausmaß, in dem dies in den beigefügten Ansprüchen der Fall ist.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung zur schnellen Freisetzung eines Antigens oder einer Nukleinsäure, die ein Antigen kodiert, bei Aufnahme in eine Zelle, wobei die Zusammensetzung ein Antigen oder eine Nukleinsäure, die ein Antigen kodiert, verkapselt in einer Polymerzusammensetzung aufweist, wobei die Polymerzusammensetzung eine Mischung von Komponenten aufweist: (a) ein Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der Polymerzusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen, und (b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente, wobei (b) mindestens zweimal so schnell biologisch abgebaut wird, wie Komponente (a); um ein Arzneimittel herzustellen, um eine CTL-Antwort oder eine T-Helferzellantwort bei einem Wesen zu induzieren oder zu potenzieren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (b) entweder ein Polymer mit einem geringeren Molekulargewicht oder einer geringeren inhärenten Viskosität als das Polymer von Komponente (a) oder ein unblockiertes Polymer ist.
Verwendung nach Anspruch 1, zur Induktion oder Potenzierung einer CTL-Antwort, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein biologisch aktives Mittel enthält, das die CTL-Antwort potenzieren kann, eingekapselt in eine zweite Polymerzusammensetzung, wobei die zweite Polymerzusammensetzung Komponenten (a) und/oder (b) aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, zur Induktion oder Potenzierung einer CTL-Antwort, wobei die CTL-Antwort innerhalb von 14 Tagen nach ei ner Verabreichung messbar ist, in einem Ausmaß von mindestens 30% Cytotoxizität.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (b) in einer solchen Rate biologisch abgebaut wird, dass die Freisetzung des Antigens oder der Nukleinsäure, die das Antigen kodiert, in einem Zeitraum möglich ist, um eine CTL-Antwort oder eine T-Helferzellantwort zu induzieren oder potenzieren, die bis zu 2 Wochen nach der Verabreichung auftritt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Polymerzusammensetzung eine solche Kinetik für die Antigen- oder Nukleinsäurefreisetzung liefert, dass die potenzierte CTL-Antwort oder T-Helferantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einfachen Verabreichung messbar ist in einem Ausmaß, das größer ist als die vorher bestehende CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Induktion oder Potenzierung einer T-Helferzellantwort, wobei die Polymerzusammensetzung eine solche Kinetik der Antigen- oder Nukleinsäurefreisetzung liefert, dass eine T-Helferzellantwort innerhalb von 14 Tagen nach einer einzelnen Verabreichung in einem Ausmaß messbar ist, das, gemessen an der T-Zellproliferation oder Cytokininduktion, mindestens das Zweifache des Hintergrunds ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (b) in einer solchen Rate biologisch abgebaut wird, dass eine CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort innerhalb von 12 Tagen nach einer einzelnen Verabreichung ermöglicht wird, in einem Ausmaß, das größer ist als die vorbestehende CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (b) in einer solchen Rate biologisch abgebaut wird, dass eine CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort innerhalb von 5 Tagen nach einer einfachen Verabreichung ermöglicht wird in einem Ausmaß, das größer ist als die vorbestehende CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (a) und Komponente (b) beide ein biologisch abbaubares Polymer enthalten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Adjuvans enthält.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das biologisch aktive Mittel, das in die zweite Polymerzusammensetzung eingekapselt ist, ein Adjuvans beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (a) und/oder (b) Poly(lactid-co-glycolid), Poly(lactid), Poly(glycolid), Copolyoxalat, Polycaprolacton, Poly(lactid-co-caprolacton), Poly(esteramid), Polyorthoester, Poly-(∀-Hydroxybuttersäure), Polyanhydrid oder eine Mischung davon enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (a) ein Polymer aufweist, das aus Komponenten gebildet wird, die 40 bis 100 mol% Lactid und 0 bis 60 mol% Glycolid enthalten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (a) ein 60:40 Poly(lactid-co-glycolid) oder 50:50 Poly(lactid-co-glycolid) ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (b) ein Polymer aufweist, das aus Komponenten gebildet wird mit 0 bis 100 mol% Lactid und 0 bis 100 mol% Glycolid.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (a) ein Copolymer aus Glycolid und Lactid ist und Komponente (b) ein Homopolymer aus Lactid ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (a) 60:40 Poly(lactid-co-glycolid) mit einer inhärenten Viskosität von 0,49 dl/g in Chloroform oder 50:50 Poly(lactid-co-glycolid) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 in Hexafluorisopropanol ist und Komponente (b) ein Homopolymer aus Lactid mit einem Molekulargewicht von 2000 Dalton bis 7000 Dalton ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (b) ein kleineres Molekulargewicht als Komponente (a) hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die polymere Zusammensetzung ein Mikroteilchen, eine Mikrokapsel, ein Mikrokügelchen, ein Nanoteilchen, eine Nanokapsel oder ein Nanokügelchen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Polymerzusammensetzung einen durchschnittlichen Durchmesser von kleiner oder gleich 10 μm hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der durchschnittliche Durchmesser der polymeren Zusammensetzung kleiner als 5 μm ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der durchschnittliche Durchmesser der polymeren Zusammensetzung 1 bis 10 μm ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Komponente (a) eine inhärente Viskosität von weniger als 4,0 dl/g hat und Komponente (b) eine inhärente Viskosität von weniger als 2,0 dl/g hat, die kleiner als die inhärente Viskosität von Komponente (a) ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dosierung des Antigens oder der Nukleinsäure, die das Antigen kodiert, ein 1 ng bis 100 mg ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein Allergen ein virales Antigen, ein bakterielles Antigen, bakterielle DNA, ein Protozoenantigen, ein Tumorantigen, ein Pilzantigen, ein Antigen einer infektiösen Krankheit oder eine Mischung davon ist.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Antigen ein Tumorantigen ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung einer Infektion.
Zusammensetzung zur schnellen Freisetzung eines Antigens oder einer Nukleinsäure, die ein Antigen kodiert, bei Aufnahme in eine Zelle, um eine CTL-Antwort oder T-Helferzellantwort bei einem Wesen zu induzieren oder zu potenzieren, wobei die Zusammensetzung ein Antigen oder eine Nukleinsäure, die ein Antigen kodiert, verkapselt in einer Polymerzusammensetzung enthält, wobei die Polymerzusammensetzung eine Mischung aus zwei Komponenten aufweist: (a) ein Polymer, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um der Polymerzusammensetzung strukturelle Integrität zu verleihen und (b) eine schnell biologisch abbaubare Komponente, wobei Komponente (b) biologisch zweimal so schnell abgebaut wird, wie Komponente (a), wobei Komponente (b) in einer solchen Rate biologisch abgebaut wird, die die Freisetzung des biologisch aktiven Mittels innerhalb eines Zeitraumes ermöglicht, um eine CTL-Antwort oder eine T-Helferzellantwort zu induzieren oder zu potenzieren, die bis zu einem Monat nach Verabreichung auftritt.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die Zusammensetzung in Form von Mikrokapseln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von kleiner oder gleich 10 μm ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei Komponente (a) 60:40 Poly(lactid-glycolid) mit einer inhärenten Viskosität von 0,49 dl/g in Chloroform oder 50:50 Poly(lactid-co-glycolid) mit einer inhärenten Viskosität von 0,39 dl/g in Hexafluoroisopropanol ist und Komponente (b) ein Homopolymer von Lactid mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 7000 Dalton ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, die in einer Form ist, um rektal, vaginal, nasal, oral, ophthalmisch, transdermal, intradermal, topisch oder durch Inhalation verabreicht zu werden.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, die in einer Form ist, um parenteral verabreicht zu werden.
Zusammensetzung nach Anspruch 33, die in Form einer Injektion vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das Antigen ein Allergen ein virales Antigen, ein bakterielles Antigen, bakterielle DNA, ein Protozoenantigen, ein Tumorantigen, ein Pilzantigen, ein Antigen einer infektiösen Krankheit oder eine Mischung davon ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei das Antigen ein Tumorantigen ist.