KR20220158062A - 전 세포 조성분의 수송 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220158062A
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수저우 어성 바이오파마슈티컬 컴파니 리미티드
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Abstract

나노급 크기 또는 마이크로급 크기의 입자를 사용하여 전 세포 조성분의 수용성 성분 및 수불용성 성분을 전달하기 위한 전달 시스템, 및 암의 예방 및 치료용 백신의 제조에 있어서의 용도를 개시한다. 상기 전 세포 조성분의 전달 시스템은 나노급 크기 또는 마이크로급 크기의 입자와 상기 입자가 로딩된 전 세포 조성분으로 이루어지며, 상기 전 세포 조성분은 세포 또는 조직 내 전 세포의 수용성 및 수불용성 성분이다. 세포 조성분에서 암에 의해 생성된 돌연변이 단백질 또는 폴리펩타이드는 나노입자 또는 마이크로입자에 로딩된다. 전 세포 조성분에서 질병 돌연변이에 의해 생성된 이러한 면역원성 물질은 암의 예방 및 치료에 사용될 수 있으며 암을 예방 및/또는 치료하는 백신을 제조할 수 있다.

Description

전 세포 조성분의 수송 시스템 및 이의 용도
본 출원은 출원일자가 2020년 3월 26일이고, 발명 명칭이 "전 세포 조성분의 수송 시스템 및 이의 용도"인 중국특허출원 202010223563.2의 우선권을 주장한다. 본 출원은 상기 중국 특허출원의 전문을 인용한다.
본 발명은 면역요법 분야에 관한 것으로, 구체적으로 전 세포 조성분의 수송 시스템 및 이의 응용, 특히 전 세포 조성분의 수송 시스템 및 암 예방 및 치료용 백신의 제조에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
면역은 인체의 생리적 기능으로, 인체는 이런 기능에 의존하여 "자기" 및 "비자기" 구성요소를 식별하고 인체에 들어오는 항원성 물질(바이러스, 세균 등),또는 인체 자체에서 생성되는 손상된 세포와 종양 세포를 파괴 및 거부함으로써 인체의 건강을 유지한다. 최근 몇 년 면역 기술, 특히 암 면역 요법 분야의 발전이 신속히 이루어지고 있다. 암에 대한 인식이 지속적으로 향상됨에 따라 신체의 면역 체계와 다양한 면역 세포가 암의 발생과 발전을 억제하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다.
최근 PD-1 항체, CAR-T 등의 치료제가 연속적으로 임상 진입을 승인 받았으며 이의 임상적으로 효과는 좋으나 매우 큰 한계도 있다. 현재의 PD-1 항체와 CAR-T를 기반으로 하는 암 면역 요법은 특정 환자군에게만 효과가 있다. CAR-T를 예로 하면, 이가 사용하는 항원 표적이 CD19, CD20 및 CD22 등 B세포 표면 특이적 표적이기 때문에 고형 종양에서 발견하기가 극히 어렵거나 거의 존재하지 않으므로 CAR-T 등 치료법은 현재 혈액 종양의 치료에만 적용 가능하다.
고형 종양의 치료를 개선하기 위해 미국과 독일의 과학자들은 암 환자의 종양 세포에서 암 특이적 또는 암 관련 항원성 폴리펩타이드를 분석하고 식별한 다음, 이를 시험관 내에서 인공적으로 합성하여 암 치료용 백신을 제조하는 신기술을 채택하였다. 이 기술은 암 환자의 임상시험에서 일부 효능을 보여주었다. 그러나 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고 노동력 집약적이며 비용이 많이 든다. 더욱이 사용되는 방법은 암세포의 수용성 성분에서 암세포와 정상세포의 차이를 추출하여 분석한 후 차이점이 있는 폴리펩타이드를 찾는 방법에 불과하기 때문에 이러한 방법 및 기술은 우수한 수용성을 갖는 제한된 수의 항원성 폴리펩타이드만을 찾을 수 있어, 이러한 방법의 적용에는 큰 제한이 있다. 그러나 인체의 실제 환경에서 많은 면역원성이 강한 항원성 단백질이나 폴리펩타이드는 순수한 물에 불용성이며 단백질과 결합, 흡착되거나 막이나 막 표면에 위치하여야 체내에 존재할 수 있으므로 순수한 물에는 용해되지 않는 이 부분의 수불용성 단백질과 폴리펩타이드는 매우 중요하고 관건적이다. 그러나 현재로서는 암세포의 전 세포 조성분을 암의 예방 및 치료를 위한 백신으로 사용할 수 있는 방법이 없다.
이러한 관점에서, 본 발명의 목적은 기존 기술에 존재하는 문제를 해결하고, 수용성 성분과 순수한 물 또는 가용화제가 없는 수용액에서 수불용성인 성분을 모두 포함하는 전 세포 조성분의 수송 시스템 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명의 목적을 구현하기 위하여 하기 기술적 해결수단을 취한다:
전 세포 조성분의 수송 시스템으로, 나노급 크기 또는 마이크로급 크기의 입자 및 상기 입자에 로딩된 전 세포 조성분으로 이루어지고, 상기 전 세포 조성분은 세포 또는 조직 내 전 세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분이다.
본 발명에 기재된 수송 시스템에 있어서, 상기 로딩 방법은 전 세포의 수용성 성분과 수불용성 성분을 입자 내부에 별도로 또는 함께 포획하고/거나, 입자 표면에 별도로 또는 함께 로딩한다. 수용성 성분을 함께 입자 내부에 적재하고 입자 표면에 로딩하며, 수불용성 성분을 함께 입자 내부에 적재하고 입자 표면에 로딩하며, 수용성 성분을 입자 내부에 적재하고 수불용성 성분을 입자 표면에 로딩하며, 수불용성 성분을 입자 내부에 적재하고 수용성 성분을 입자 표면에 로딩하며, 수용성 성분과 수불용성 성분을 입자 내부에 적재하고 수불용성 성분만 입자 표면에 로딩하며, 수용성 성분과 수불용성 성분을 입자 내부에 적재하고 수용성 성분만 입자 표면에 로딩하며, 수용성 성분을 입자 내부에 적재하고 수용성 성분과 수불용성 성분을 함께 입자 표면에 로딩하며, 수불용성 성분을 입자 내부에 적재하고 수용성 성분과 수불용성 성분을 함께 입자 표면에 로딩하며, 수용성 성분과 수불용성 성분을 함께 입자 내부에 적재하고 수용성 성분과 수불용성 성분을 함께 입자 표면에 로딩하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 수송 시스템에서 상기 입자는 내부 및/또는 표면에 면역 강화 보조제를 더 포함한다.
상기 면역강화제를 첨가하는 방법은 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 적재하거나, 나노입자 또는 마이크로입자의 표면에 로딩하거나, 함께 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 적재하거나 및 나노입자 또는 마이크로입자의 표면에 로딩하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 전 세포 조성분은 순수한 물 또는 가용화제가 없는 수용액에서의 용해도에 따라 수용성 성분과 수불용성 성분 두 부분으로 나눌 수 있다. 상기 수용성 성분은 순수한 물 또는 가용화제가 없는 수용액에 용해되는 원 수용성 부분이고, 상기 수불용성 성분은 순수한 물에 불용성인 원 수불용성 부분이, 적절한 가용화 방법에 의해 순수한 물 또는 가용화제가 없는 수용액에서의 불용성으로부터 가용화제를 함유하는 수용액 또는 유기 용매에서의 가용성으로 전환되는 부분이다. 상기 전 세포 조성분의 수용성 부분 및 수불용성 부분은 모두 가용화제를 함유하는 가용화 수용액 또는 유기 용매에 의해 용해될 수 있다.
본 발명의 수송 시스템에 있어서, 상기 가용화제는 수용액에서 단백질 또는 폴리펩타이드의 용해도를 증가시킬 수 있는 가용화제 중 적어도 하나이고; 상기 유기 용매는 단백질 또는 폴리펩타이드를 용해할 수 있는 유기 용매이다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 가용화제는 요소, 염산 구아니딘, 데옥시콜산나트륨, SDS, 글리세롤, pH 7 보다 큰 알칼리 용액, pH 7보다 작은 산성 용액, 각종 단백질 분해효소, 알부민, 레시틴, 고농도 무기염, 트리톤, 트윈, DMSO, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, DMF, 프로판올, 이소프로판올, 아세트산, 콜레스테롤, 아미노산, 글루코시드, 콜린, Bri -35, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, CHAPS, 디지토닌, 라우릴디메틸아민 옥사이드, IGEPAL® CA-630을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당업자는 상기 수불용성 성분이 또한 다른 단백질 및 폴리펩타이드 단편을 가용화할 수 있는 방법에 의해 순수한 물에서의 불용성으로부터 가용성으로 전환될 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 유기 용매는 DMSO, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, DMF, 이소프로판올, 프로판올, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당업자는 상기 유기 용매는 또한 기타 단백질 및 폴리펩타이드 단편을 가용화할 수 있는 유기 용매를 함유하는 방법을 채택할 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 면역 강화 보조제는 미생물 유래 면역 강화제, 인간 또는 동물 면역계의 산물, 선천성 면역 작용제, 적응 면역 작용제, 화학적 합성 약물, 진균 다당류 및 한약재 중 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 면역 강화 보조제는 패턴 인식 수용체 작용제, 칼메트 게랭 백신(BCG), BCG 세포벽 골격, BCG 메탄올 추출 잔류물, BCG 무라밀 디펩타이드, 마이코박테리움 플레이, 다항갑소, 미네랄 오일, 바이러스 유사 입자, 면역 강화 재구성 인플루엔자 비리온, 콜레라 장독소, 사포닌 및 이의 유도체, 레시퀴모드, 티모신, 신생아 소 간 활성 펩타이드, 미퀴모드, 다당류, 커큐민, 면역 보조제 CpG, 면역 보조제 폴리(I:C), 면역 보조제 폴리 ICLC, 코리네박테리움 푸밀루스, 용혈성 연쇄상구균 제제, 코엔자임 Q10, 레바미솔, 폴리시티딜산, 인터루킨, 인터페론, 폴리이노신산, 폴리아데닐산, 명반, 인산알루미늄, 라놀린, 식물성 기름, 내독소, 리포솜 아주반트, GM-CSF, MF59, 이중 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 수산화알루미늄, CAF01, 인삼 및 황기의 유효성분 중 적어도 하나인 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
당업자는 상기 면역 강화 보조제가 면역 반응을 강화할 수 있는 다른 물질도 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 나노급 크기 입자의 입경은 1nm 내지 1000nm이다. 일부 실시형태에서, 상기 나노급 크기 입자의 입경은 50nm 내지 800nm이다. 또한, 일부 실시형태에서, 상기 나노급 크기 입자의 입경은 100nm 내지 600nm이다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 마이크로급 크기 입자의 입경은 1μm 내지 1000μm이다. 일부 실시형태에서, 상기 마이크로급 크기 입자의 입경은 1μm 내지 100μm이다. 일부 실시형태에서, 상기 마이크로급 크기 입자의 입경은 1μm 내지 10μm이다. 또한, 일부 실시형태에서, 상기 마이크로급 크기 입자의 입경은 1μm 내지 5μm이다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 나노급 크기 입자 또는 마이크로급 크기 입자의 표면은 전기적으로 중성일 수 있으며, 음전하 또는 양전하를 띨 수도 있다.
본 발명의 상기 수송 시스템에 있어서, 상기 나노급 크기 또는 마이크로급 크기 입자의 제조 재료는 유기 합성 고분자 재료, 천연 고분자 재료 또는 무기 재료이다.
여기서, 상기 유기 합성 고분자 재료는 생체 적합성 또는 분해성 고분자 재료로, PLGA, PLA, PGA, Poloxamer, PEG, PCL, PEI, PVA, PVP, PTMC, 폴리안하이드라이드, PDON, PPDO, PMMA, 폴리아미노산, 합성 폴리펩타이드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 천연 고분자 재료는 생체 적합성 또는 분해성 고분자 재료로, 레시틴, 콜레스테롤, 전분, 당류, 폴리펩타이드, 알긴산 나트륨, 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 세포막 성분을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 무기 재료는 명백한 생물학적 독성이 없는 재료로, 산화제2철, 사산화삼철, 탄산칼슘, 인산칼슘을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 상기 수송 시스템의 형상은 흔히 볼 수 있는 임의의 형상으로, 구형, 타원체, 배럴형, 다각형, 막대형, 시트형, 와이어형, 웜형, 정사각형, 삼각형, 나비형 또는 원반형을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 수송 시스템은 나노급 크기 입자 및 마이크로급 크기 입자의 개발된 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 통상적인 용매 증발 방법, 투석 방법, 압출 방법 및 핫멜트 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 수송 시스템은 용매 증발 방법 중 이중 에멀젼 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 전 세포 조성분 수송 시스템은 적재된 전 세포 조성분을 해당 면역 세포에 전달할 수 있고, 적재된 성분의 면역원성을 통해 암세포에 대한 자가면역 시스템의 사멸 효과를 활성화 및 강화할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 암 예방 및/또는 치료용 백신 제조에 있어서의 상기 전 세포 조성분 수송 시스템의 용도를 제공한다.
본 발명의 상기 전 세포 조성분 수송 시스템은 질병을 예방 또는 치료할 때 수용성 성분만을 로딩한 나노입자 또는 마이크로입자와 수불용성 성분만을 로딩한 나노입자 또는 마이크로입자를 동시에 사용할 수 있고, 수용성 성분만 로딩한 나노입자 또는 마이크로입자를 사용할 수 있고, 수불용성 성분만 로딩한 나노입자 또는 마이크로입자를 사용하거나, 또는 함께 수용성 성분 및 수불용성 성분을 로딩한 나노입자 또는 마이크로입자를 사용할 수 있다.
상기 기술적 해결수단으로부터, 본 발명은 나노급 크기 또는 마이크로급 크기의 입자를 사용하여 세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분을 전달하는 수송 시스템, 및 암 예방 및 치료용 백신 제조에 있어서의 용도를 제공함을 알 수 있다. 관련 세포나 조직의 전 세포 조성분은 순수한 물에 대한 용해도에 따라 순수한 물에 용해되는 수용성 부분과 순수한 물에 용해되지 않는 수불용성 부분으로 나누어지고, 수용성 부분과 수불용성 부분은 모두 나노입자 또는 마이크로입자에 로딩되어 있으므로 세포 조성분에서 대부분 암에 의해 생성되는 변이 단백질 또는 폴리펩타이드는 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 로딩된다. 세포 조성분의 수용성 부분 및 수불용성 부분은 전체 세포의 조성분을 포함하고; 세포 조성분의 수용성 부분 및 수불용성 부분은 또한 동시에 가용화제를 함유하는 수용액에 의해 용해될 수 있다. 여기서 정상 세포 조성분과 동일한 돌연변이되지 않은 단백질, 폴리펩타이드 및 유전자는 자가면역 시스템의 발달 과정에 산생되는 면역 내성 때문에 면역 반응을 일으키지 않으나; 암 등에 의해 생성되는 유전자, 단백질 및 폴리펩타이드의 돌연변이는 자가면역 시스템의 발달 과정에 산생된 면역내성이 없기 때문에 면역원성을 가지며 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 전 세포 조성분에서 질병에 의한 돌연변이에 의해 생성된 이러한 면역원성 물질은 암 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 전 세포 조성분의 수송 시스템은 암 예방 및/또는 치료용 백신의 제조에 사용될 수 있다. 상기 암은 혈액 종양과 고형 종양을 포함한 모든 종류의 암으로, 내분비계 종양, 신경계 종양, 생식계 종양, 소화계 종양, 호흡기계 종양, 혈액암, 피부암, 유방암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 뇌암, 결장암, 전립선암, 직장암, 두경부암, 신장암, 뼈암, 코암, 방광암, 갑상선암, 식도암, 자궁경부암, 난소암, 자궁암, 골반암, 고환암, 음경암, 림프종, 혀암, 잇몸암, 망막모세포종 및 육종 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암 예방 및 치료용 백신으로 사용하는 경우, 본 발명의 백신은 암 발생 전후에 여러 번 투여하여 신체의 면역 체계를 활성화함으로써 암의 발전을 지연시키고, 암을 치료하고, 암의 발생, 암의 전이를 예방하고 또는 암의 재발을 방지할 수 있다.
본 발명의 실시예 또는 기존 기술의 기술적 해결수단을 보다 명확하게 설명하기 위하여, 이하에서는 실시예 또는 기존 기술의 설명에 필요한 첨부 도면을 간략하게 소개한다.
도 1은 본 발명에 기재된 백신의 제조과정 및 적용분야의 개략도이고; a는 수용성 성분 및 수불용성 성분이 각각 나노백신 또는 마이크로백신을 수집 및 제조하는 개략도이며; b는 가용화제를 함유한 가용화 용액이 전 세포 조성분을 용해하는 것과 나노백신 또는 마이크로백신을 제조하는 개략도이다.
도 2 내지 도 17은 수용성 및 수불용성 세포 성분이 로딩된 나노급 크기 입자 또는 마이크로급 크기 입자의 구조의 개략도이고, 여기서 1은 세포 또는 조직 조성분 수용성 성분이고; 2는 세포 또는 조직 조성분의 수불용성 성분이며; 3은 면역 강화 보조제이고; 4는 나노입자 또는 마이크로입자이며; 5는 나노입자의 내부 코어 부분이고; 도 2 내지 도 5에서 나노입자 또는 마이크로입자의 표면 및 내부에 모두 면역 강화 보조제가 함유되어 있고; 도 6 내지 도 9에서 면역 강화 보조제는 나노입자 또는 마이크로입자 내부에만 분포되어 있으며; 도 10 내지 도 13에서 나노입자 또는 마이크로입자는 외부 표면에만 면역 강화 보조제를 함유하고； 도 14 내지 도 17에서 나노입자 또는 마이크로입자의 내부 및 외부 표면 모두에 면역 강화 보조제가 없고; 도 2, 도 6, 도 10 및 도 14에서 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 로딩된 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분 또는 수불용성 성분이 각각 나노입자 또는 마이크로입자의 내부에 분포될 때 유의한 내부 코어를 형성하지 않았고; 도 3, 도 7, 도 11 및 도 15에서, 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 로딩되는 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분 또는 수불용성 성분이 각각 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 분포할 때 하나의 내부 코어 부분이 형성되고, 내부 코어는 제조과정에서 생성되거나 고분자 또는 무기염 등을 사용하여 형성될 수 있으며; 도 4, 도 8, 도 12 및 도 16에서, 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 로딩되는 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분 또는 수불용성 성분이 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 분포될 때 복수의 내부 코어부가 형성되고, 내부 코어는 제조과정에서 생성되거나 고분자 또는 무기염 등을 사용하여 형성될 수 있으며; 도 5, 도 9, 도 13 및 도 17에서, 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 포획된 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분 또는 수불용성 성분이 각각 나노입자 또는 마이크로입자의 내부에 분포될 때, 형성된 내부 코어에 외층에 위치하고; a: 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 내부에 포획되고 표면에 로딩된 성분은 모두 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분이고; b: 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 내부에 포획 및 표면에 로딩된 성분은 모두 세포 또는 조직 조성분의 수불용성 성분이며; c: 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 내부에 포획된 성분은 세포 또는 조직 조성분의 수불용성 성분이고, 표면 로딩된 성분은 모두 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분이며; d: 나노입자 또는 마이크로입자의 내부에 포획된 성분은 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분이고, 표면 로딩된 성분은 모두 세포 또는 조직 조성분의 수불용성 성분이며; e: 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분과 수불용성 성분이 함께 포획되고, 나노입자 또는 마이크로입자 표면에도 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분과 수불용성 성분이 함께 로딩되며; f: 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분과 수불용성 성분이 함께 포획되고, 나노입자 또는 마이크로입자 표면에는 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분만 로딩되며; g: 나노입자 또는 마이크로입자 내부에는 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분과 수불용성 성분이 함께 포획되고, 나노입자 또는 마이크로입자 표면에는 세포 또는 조직 조성분의 수불용성 성분만 로딩되며; h: 나노입자 또는 마이크로입자 내부에는 세포 또는 조직 조성분의 수불용성 성분만 포획되고, 나노입자 또는 마이크로입자 표면에는 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분과 수불용성 성분이 함께 로딩되며; i: 나노입자 또는 마이크로입자 내부에는 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분만 포획되고, 나노입자 또는 마이크로입자 표면에는 세포 또는 조직 조성분의 수용성 성분과 수불용성 성분이 함께 로딩된다.
도 18 내지 도 21은 나노백신을 각각 실시예1 내지 실시예3에서 흑색종의 치료에 사용할 때의 마우스의 종양 성장 속도 및 생존기간에 대한 효과를 실험한 결과이고; . a는 종양 성장 속도에 대한 나노백신 치료의 억제 효과에 관한 실험(n≥8)이고; b는 종양을 접종한 마우스의 생존기간에 대한 나노백신의 치료 효과의 실험(n≥8)이고, 각 데이터 포인트는 평균 ± 표준 오차(mean ± SEM)이며; 도 a에서 종양 성장 억제 실험의 유의한 차이는 ANOVA로 분석하였고, 도 b 에서 유의한 차이는 Kaplan-Meier 및 log-rank test로 분석하였으며; *는 해당 실험군을 PBS 블랭크 대조군과 비교하여 p<0.05이고, 유의한 차이가 있음을 나타내고;
Figure pct00001
은 해당 실험군을 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군과 비교하여 p<0.05이고, 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 22는 나노백신을 실시예4 및 실시예5에서 흑색종 예방에 사용할 때 마우스의 종양 성장 속도 및 생존기간에 대한 나노백신의 효과를 실험한 결과이고; a는 종양 성장 속도에 대한 나노백신 치료의 억제 효과 실험(n≥8)이고; b는 종양을 접종한 마우스의 생존기간에 대한 나노백신 치료 효과의 실험(n≥8)이고, 각 데이터 포인트는 평균 ± 표준 오차(mean ± SEM)이며; 도 a에서 종양 성장 억제 실험의 유의한 차이는 ANOVA로 분석하였고, 도 b 에서 유의한 차이는 Kaplan-Meier 및 log-rank test로 분석하였으며; *는 해당 실험군을 PBS 블랭크 대조군과 비교하여 p<0.05이고, 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 23 내지 도 28은 각각 실시예 6 내지 실시예11에서 나노백신 또는 마이크로백신을 유방암의 예방 또는 치료에 사용 하였을 때의 마우스의 종양 성장 속도 및 생존기간에 미치는 영향을 실험한 결과이고; a는 종양 성장 속도에 대한 나노백신 또는 마이크로백신 치료의 억제 효과 실험(n≥7)이고; b는 종양을 접종한 마우스의 생존기간에 대한 나노백신 또는 마이크로백신 치료 효과의 실험(n≥7)이고, 각 데이터 포인트는 평균 ± 표준 오차(mean ± SEM)이며; 도 a에서 종양 성장 억제 실험의 유의한 차이는 ANOVA로 분석하였고, 도 b 에서 유의한 차이는 Kaplan-Meier 및 log-rank test로 분석하였으며; *는 해당 실험군을 PBS 블랭크 대조군과 비교하여 p<0.05이고, 유의한 차이가 있음을 나타내고;
Figure pct00002
은 해당 실험군을 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군과 비교하여 p<0.05이고, 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
본 발명은 전 세포 조성분 수송 시스템 및 이의 용도를 개시한다. 당업자는 본 발명의 내용을 참조하여 공정 매개변수를 적절하게 개선할 수 있다. 특히, 모든 유사한 대체 및 변형은 당업자에게 자명하며, 이들은 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다는 점에 유의해야 한다. 본 발명의 방법 및 제품에 대하여 바람직한 실시예를 통하여 설명하였으며, 당업자는 본 발명의 내용, 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위에서 본 발명의 실시예에 대하여 적절히 수정과 또는 변경 및 조합하여 본 발명의 기술을 구현하고 응용할 수 있다.
하기 기술적 해결수단을 채택하여 본 발명의 목적을 실현하고자 한다:
나노급 크기 또는 마이크로급 크기의 입자와 상기 입자에 의해 로딩된 전 세포 조성분으로 구성되는 전 세포 조성분 수송 시스템으로, 상기 전 세포 조성분은 세포 또는 조직 내의 전체 세포의 수용성 성분과 수불용성 성분이다.
본 발명에서는 암세포 또는 조직을 용해시킨 후 먼저 순수한 물 또는 가용화제가 없는 수용액에 용해되는 수용성 성분을 획득하고, 다음 가용화제를 포함하는 수용성 가용화 용액을 사용하여 가용화 용액에 수불용성 성분을 용해시킴으로써 모든 세포 조성분을 수용액에 용해될 수 있는 성분으로 전환시킨 다음 나노입자 또는 마이크로입자의 내부 및 외부에 로딩하여 암의 예방 및 치료에 사용되는 나노백신 또는 마이크로백신을 제조할 수 있다. 실제 사용에서는 세포 또는 조직을 용해한 후 수용성 성분과 수불용성 성분을 따로 회수하지 않고, 가용화제를 포함한 가용화 수용액을 직접 사용하여 전 세포 조성분을 용해시키고, 가용화 수용액에 용해된 전 세포 조성분을 사용하여 나노 백신 또는 마이크로 백신을 제조한다.
본 발명에서는 가용화제를 포함하는 수용액을 사용하여 순수한 물 또는 가용화제가 없는 수용액에 불용성인 세포 내 성분을 특정 가용화제 용액에서 가용성으로 전환시켜 나노입자 및 마이크로입자의 제조에 사용될 수 있도록 함으로써, 나노입자 또는 마이크로입자에 의해 로딩되는 항원성 물질 또는 성분의 포괄성 및 면역원성을 향상시켰다.
본 발명은 암세포 또는 종양조직의 전 세포 조성분을 가용화제가 없는 순수한 물 또는 수용액에 용해될 수 있는 수용성 부분과 소정의 농도의 가용화제를 사용하여 수용액에 용해될 수 있는 수불용성 부분으로 구분하고, 수용성 부분과 수불용성 부분을 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 포획 및 표면에 로딩하여 대부분의 항원성 물질이 제조된 백신에 로딩되도록 한다.
세포 조성분의 수용성 부분 및 수불용성 부분은 전체 세포의 구성 및 성분을 포함한다. 여기서 정상 세포 조성분과 같은 돌연변이되지 않은 단백질, 폴리펩타이드 및 유전자는 자가면역 시스템의 발달 과정에 생성된 면역 내성 때문에 면역 반응을 일으키지 않으나; 암 등에 의해 생성되는 유전자, 단백질 및 폴리펩타이드의 돌연변이는 자가면역 시스템이 발달하는 동안 면역내성이 생기지 않기 때문에 면역원성을 가지며 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 전 세포 조성분에서 질병 돌연변이에 의해 생성된 이러한 암세포 특이적 면역원성 물질은 암의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
백신의 면역원성과 효과를 높이기 위해 소정의 면역 조절 기능을 가진 특정 면역 증강제를 첨가할 수도 있다.
본 발명의 전 세포 조성분 수송 시스템은 암 예방 및/또는 치료용 백신을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 이의 제조 과정 및 적용 분야는 도 1에 도시된 바와 같다. 제조과정에서 세포나 조직을 용해시킨 후 수용성 성분과 수불용성 성분을 각각 수집하여 나노백신 또는 마이크로백신을 제조하거나; 또는 가용화제를 함유한 가용화 용액을 사용하여 세포나 조직을 직접 용해시키고 전 세포 조성분을 용해시켜 나노백신 또는 마이크로백신을 제조할 수 있다.
본 발명에 기재된 전 세포 조성분은 용해되기 전 또는(및) 용해된 후에 비활성화 또는(및) 변성 처리를 거쳐 나노백신 또는 마이크로백신을 제조할 수 있으며, 또한 세포 용해 전 또는(및) 용해 후에 아무런 비활성화 또는(및) 변성 처리 없이 직접 나노백신 또는 마이크로백신을 제조할 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 종양조직 세포는 용해 전에 비활성화 또는(및) 변성 처리를 거쳤고, 실제 사용과정에서도 세포 용해 후에 비활성화 또는(및) 변성 처리를 하거나, 세포 용해 전 및 용해 후에 모두 비활성화 또는(및) 변성 처리를 할 수 있고; 본 발명의 일부 실시예에서, 세포 용해 전 또는(및) 용해 후의 비활성화 또는(및) 변성 처리 방법은 자외선 조사 및 고온 가열이고, 실제 사용과정에서 방사선 조사, 고압, 동결 건조 및 포름알데히드 등 비활성화 또는 변성 방법을 취할 수도 있다. 당업자는 실제 적용과정에서 구체적인 조건에 따라 적절한 조절을 할 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명의 전 세포 조성분의 수송 시스템 구조 개략도는 도 2 내지 도 17에 도시된 바와 같다. 실제 사용과정에서는 이중 하나의 특정한 구조를 갖는 나노입자 또는 마이크로입자만을 사용할 수도 있고, 또한 2개 또는 2개 이상의 상이한 구조를 갖는 나노입자 또는 마이크로입자를 동시에 사용할 수도 있다.
실시예에서, 면역 강화제는 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 포획되고 함께 나노입자 또는 마이크로입자 표면에 로딩되며, 실제 사용과정에서 면역 강화제는 나노입자 또는 마이크로입자 내부에만 포획되거나, 또는 나노입자 또는 마이크로입자 표면에만 로딩될 수 있고, 또는 면역 강화제가 첨가되지 않을 수도 있다.
일부 실시예에서, 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명은 먼저 세포 조성분의 순수한 물에 용해되는 수용성 부분 또는(및) 수불용성 부분을 가용화제에 의해 가용화한 후, 나노입자 또는 마이크로입자 내부에 포획시키고, 함께 면역 강화제도 포획시키며; 다음 세포 성분의 수용성 부분 또는(및) 수불용성 부분을 나노입자의 표면에 흡착시키고, 동시에 면역 강화제도 흡착시킨다. 이러한 방식으로, 나노입자 또는 마이크로입자에서 세포의 수용성 또는 수불용성 성분의 로딩 용량을 최대화 할 수 있다. 실제 응용에서 가용화제를 포함하는 가용화 용액(예를 들어, 8M 요소 수용액 또는 6M 염산 구아니딘 수용액)을 사용하여 세포 또는 조직을 직접 용해시키고 전 세포 조성분을 직접 용해시킨 다음 이로써 나노백신 또는 마이크로백신을 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 나노백신 및 마이크로백신의 제조방법은 통상적인 제조방법이다. 일부 실시형태에서, 나노백신의 제조는 용매 증발법 중 이중 에멀젼 방법을 채택하고, 사용된 나노 입자 제조 재료는 분자량이 24Kda 내지 38KDa인 유기 고분자 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)이며, 사용된 면역 보조제는 폴리(I:C), 칼메트 게랭 백신(BCG) 또는 CpG이다. 당업자는 실제 응용과정에서 구체적인 상황에 따라 제조방법, 제조과정, 사용되는 나노입자 제조 재료, 면역 보조제의 종류 및 농도 등을 적절하게 조절할 수 있음을 이해할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명에 채택된 이중 에멀젼 방법의 구체적인 제조방법은 다음과 같다:
단계1, 제1 소정 체적의 제1 소정 농도를 함유하는 수상용액을 제2 소정 체적의 제2 소정 농도의 의료용 고분자 제료를 함유하는 유기상에 가한다.
일부 실시형태에서, 수상용액은 암세포 용해물의 각 구성 및 면역강화 보조제 폴리(I:C), BCG 또는 CpG를 함유하고; 암세포 용해물의 각 조성분은 제조될 때 각각 수용성 성분 또는 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이다. 수상용액이 함유한 암세포 유래의 수용성 성분 농도 또는 8M 요소에 용해되는 암세포 유래의 원 수불용성 성분의 농도, 즉, 제1 소정 농도는 단백질 폴리펩타이드의 농도 함유량이 1ng/mL보다 높을 것을 요구하며, 상기 농도를 선택한 이유는 본 발명자들이 다수의 실험을 통해 사용된 세포 용해물의 수용액의 농도가 높을수록 제조된 나노입자에 포획된 암 항원이 더 많으며 제조된 단백질 폴리펩타이드 농도가 1ng/mL 이상, 즉 제1 소정 농도가 1ng/mL 이상인 경우, 관련 면역 반응을 활성화하기에 충분한 암 항원으로 로딩될 수 있다는 것을 발견하였기 때문이다. 초기의 수상에서의 면역강화 보조제의 농도는 0.01ng/mL보다 높다. 또한, 제1 소정 체적은 600μL이다.
일부 실시형태에서, 수상용액은 종양조직 용해물의 각 구성 및 면역강화 보조제 폴리(I:C), BCG 또는 CpG를 함유하고; 종양조직 용해물의 각 구성은 제조될 때 각각 수용성 성분 또는 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이다. 수상용액에 포함된 종양조직 유래의 수용성 성분 농도 또는 8M 요소에 용해된 종양조직 유래의 원 수불용성 성분의 농도, 즉, 제1 소정 농도는 단백질 폴리펩타이드의 농도 함량이 1ng/mL보다 높을 것을 요구하고, 상기 농도를 선택한 이유는 본 발명자들이 다수의 실험을 통해 사용된 세포 용해물의 수용액의 농도가 높을수록 제조된 나노입자에 포획된 암 항원이 더 많으며 제조된 단백질 폴리펩타이드 농도가 1ng/mL 이상, 즉 제1 소정 농도가 1ng/mL 이상인 경우, 관련 면역 반응을 활성화하기에 충분한 암 항원으로 로딩될 수 있다는 것을 발견하였기 때문이다. 초기의 수상에서의 면역강화 보조제의 농도는 0.01ng/mL보다 높다. 또한, 제1 소정 체적은 600μL이다.
본 발명에서, 의료용 고분자 재료를 유기 용매에 용해하여 제2 소정 체적의 제2 소정 농도의 의료용 고분자 재료를 함유하는 유기상을 얻는다. 일부 실시예에서, 의료용 고분자 재료는 PLGA이고, 유기 용매는 디클로로메탄이며, 얻어진 유기상의 체적, 즉, 제2 소정 체적은 2mL이다. 또한, 일부 실시예에서 의료용 고분자 재료의 제2 소정 농도의 범위는 0.5mg/mL 내지 5000mg/mL이며, 바람직하게는 100mg/mL이다.
본 발명에서 PLGA는 생분해성 재료이고 FDA로부터 약물 드레싱으로 사용하도록 승인되었기 때문에 선택되었다. 연구에 따르면 PLGA는 소정의 면역 조절 기능을 가지고 있어 백신 제조에서의 보조제로 사용하기에 적합하다.
실제로, 유기상의 제2 소정 체적은 수상의 제1 소정 체적에 대한 비율에 따라 설정되며, 본 발명에서 수상의 제1 소정 체적과 유기상의 제2 소정 체적의 비율의 범위는 1:1.1 내지 1:5000, 바람직하게는 1:10이다. 구체적인 실시과정에서, 수요에 따라 제1 소정 체적, 제2 소정 체적 및 제1 소정 체적과 제2 소정 체적의 비율을 조절하여 제조된 나노입자의 크기를 조절할 수 있다.
단계2, 단계1에서 얻어진 혼합물을 2초 이상 초음파 처리하거나 1분 이상 교반한다.
상기 단계의 목적은 나노미터화를 수행하는 것으로, 초음파 시간의 길고 짧음 또는 교반 속도 및 시간은 제조된 나노입자의 크기를 조절할 수 있는데, 시간이 너무 길거나 너무 짧으면 입경의 변화를 일으킬 수 있으므로, 적절한 초음파 시간을 선택하는 것이 필요하다. 본 발명에서 초음파 시간은 2초 이상, 교반 속도는 50rpm 이상, 교반 시간은 1분 이상이다.
단계3, 단계 2의 처리를 거친 후 얻어진 혼합물을 제3 소정 농도의 유화제를 함유하는 제3 소정 체적의 수용액에 첨가하고 2초 이상 초음파 처리 또는 1분 이상 교반한다.
상기 단계에서는 단계 2에서 얻어진 혼합물을 유화제 수용액에 첨가하여 초음파 처리 또는 교반을 계속하여 나노미터화한다.
본 발명에서, 유화제 수용액은 폴리비닐알코올(PVA) 수용액이고, 제3 소정 체적은 5mL이고, 제3 소정 농도는 20mg/mL이다. 제3 소정 체적은 제2 소정 체적에 대한 이의 비율에 따라 조절된다. 본 발명에서 제2 소정 체적과 제3 소정 체적의 비율의 범위는 1:1.1 내지 1:1000사이에 설정하며, 바람직하게는 2:5이다. 구체적인 실시과정에서, 제3 소정 체적과 제2 소정 체적의 비율을 조절하여 나노입자의 크기를 조절할 수 있다.
마찬가지로, 본 단계에서 초음파 시간 또는 교반 시간, 유화제 수용액의 체적 및 농도는 적절한 크기의 나노입자를 얻기 위한 값을 기준으로 한다.
단계4, 단계 3의 처리를 거친 후 얻어진 액체를 제4 소정 체적의 제4 소정 농도의 유화제 수용액에 첨가하고, 소정의 교반 조건을 만족시킬 때까지 교반한다.
이 단계에서, 유화제 수용액은 여전히 PVA이고, 제4 소정 체적은 50mL 이상이고,
제4 소정 농도는 5mg/mL이고, 적절한 크기의 나노입자를 얻는 것을 근거로 제4 소정 농도를 선택한다. 제4 소정 체적의 선택은 제3 소정 체적과 제4 소정 체적의 비율에 따라 결정된다. 본 발명에서, 제3 소정 체적과 제4 소정 체적의 비율의 범위는 1:1.5 내지 1:2000, 바람직하게는 1:10이다. 구체적인 실시과정에서 제3 소정 체적과 제4 소정 체적의 비율을 조절하여 나노입자의 크기를 조절할 수 있다.
본 발명에서, 본 단계의 소정의 교반 조건은 유기 용매의 휘발이 완료될 때까지, 즉 단계1에서 디클로로메탄의 휘발이 완료될 때까지이다.
단계5, 단계4에서 소정 교반 조건을 만족시키는 혼합용액을 100RPM 보다 빠른 속도로 1분 이상 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 나머지 침전물을 동결 보호제를 함유하는 제5 소정 체적의 제5 소정 농도 수용액 또는 제6 소정 체적의 PBS(또는 생리 식염수)에 재현탁시킨다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 단계5에서 얻어진 침전물을 제6 소정 체적의 PBS(또는 생리 식염수)에 재현탁시킬 때 동결건조할 필요가 없고, 나노입자 표면에 암세포 용해물을 흡착시키는 그 다음의 실험을 직접 수행할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 단계5에서 얻어진 침전물을 동결 보호제를 함유하는 수용액에서 재현탁할 경우 동결건조시켜야 하며, 그 다음 나노입자 표면에 암세포 용해물을 흡착시키는 관련 실험을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결건조 보호제는 트레할로스로부터 선택된다.
본 발명에 있어서, 상기 단계의 동결건조 보호제의 제5 소정 체적은 20mL이고, 제5 소정 농도는 4질량%인데, 후속 동결건조에서 동결건조 효과에 영향을 미치지 않게 하기 위하여 이렇게 설정한다.
단계6, 단계5에서 얻어진 동결건조 보호제를 함유하는 현탁액을 동결건조한 후, 동결건조된 물질을 추후 사용하기 위해 준비한다.
단계7, 제6 소정 체적의 단계5에서 얻어진 PBS(또는 생리 식염수)에 재현탁된 나노입자를 함유하는 현탁액 또는 제6 소정 체적의 PBS(또는 생리 식염수)를 사용하여 재현탁한 단계6에서 얻어진 나노입자 및 동결건조 보호제를 함유하는 동결건조된 동결건조 물질과 제7 소정 체적의 수용성 성분 또는 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분을 혼합하여 1분 보다 긴 시간 동안 방치함으로써 나노백신 또는 마이크로백신을 얻는다.
본 발명에서, 제6 소정 체적과 제7 소정 체적의 체적비는 1:10000 내지 10000:1이고, 바람직하게는 1:100 내지 100:1이며, 최적의 체적비는 1:30 내지 30:1이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 재현탁된 나노입자 현탁액의 체적은 10mL이고, 암세포 용해물을 함유하거나 종양조직 용해물의 수용성 성분을 함유하거나, 또는 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분의 체적은 1mL이다.
본 발명에서, 사용된 암세포 용해물 또는 종양조직 용해물을 함유한 수용성 성분 또는 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분은 폴리(I:C), 칼메트 게랭 백신(BCG) 또는 CpG를 함유하되, 폴리(I:C), BCG 또는 CpG의 농도가 1ng/mL보다 크다.
나노백신 또는 마이크로백신의 입경은 나노 스케일 또는 마이크로 스케일이며, 이는 백신이 항원 제시 세포에 의해 탐식되는 것을 보장할 수 있으며, 탐식 효율을 개선하기 위해 입자 크기는 적절한 범위내에 있어야 한다. 나노백신의 입경은 1nm 내지 1000nm, 보다 바람직하게는 30nm 내지 1000nm, 가장 바람직하게는 100nm 내지 600nm이고; 마이크로백신의 입경은 1㎛ 내지 1000㎛, 보다 바람직하게는 1㎛ 내지 100㎛, 보다 바람직하게는 1㎛ 내지 10㎛, 가장 바람직하게는 1㎛ 내지 5㎛이다. 본 실시예에서, 나노백신의 입경은 100nm 내지 600nm이고, 마이크로백신의 입경은 1μm 내지 5μm이다.
또한, 본 발명에서는 요소 및 염산 구아니딘을 사용하여 암세포 용해물 또는 종양조직 용해물 중 원 수불용성 성분을 가용화시키고, 수용액에서 암세포 용해물 또는 종양조직 용해물의 원 수불용성 성분을 용해시킬 수 있는 다른 가용화 물질도 실제로 사용할 수 있는데, 예를 들어 데옥시콜산나트륨, SDS, pH가 7보다 큰 알칼리 용액, pH가 7보다 작은 산성 용액, 알부민, 레시틴, 고농도 무기염, 트리톤, 트윈, DMSO, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, DMF, 이소프로판올, 프로판올, 아세트산, 콜레스테롤, 아미노산, 글루코시드, 콜린, Brij-35, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, CHAPS, 디지토닌, 라우릴디메틸아민 옥사이드, IGEPAL® CA-630이고; 또는 상기 가용화제를 사용하여 수용성 성분과 수불용성 성분을 동시에 용해시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서는 8M 요소 및 6M 염산 구아니딘 수용액을 사용하여 암세포 용해물 또는 종양조직 용해물의 원 수불용성 성분을 가용화하였으며, 실제 사용에서는 수용액의 암세포 용해물 또는 종양조직 용해물의 원 수불용성 성분을 용해시킬 수 있는 임의의 다른 요소 농도 또는 염산 구아니딘 농도를 사용할 수도 있으며; 또는 8M 요소 수용액을 사용하여 수용성 성분과 수불용성 성분을 동시에 용해시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서 나노백신의 제조는 이중 에멀젼법을 사용하며, 실제로 다른 통상적으로 사용되는 나노입자 또는 마이크로입자 제조방법을 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명에서 나노백신를 제조하는 재료는 PLGA이며, 실제로 나노입자 또는 마이크로입자를 제조할 수 있는 다른 물질도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 암세포 용해물 또는 종양조직 용해물 중 수용성 성분 또는 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분이 각각 나노입자 내부에 포획 및 나노입자 표면에 흡착되고, 실제 사용시, 암세포 용해물 또는 종양조직 용해물의 수용성 성분과 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분도 혼합시킨 다음 나노입자 또는 마이크로입자의 내부에 포획 및/또는 나노입자 또는 마이크로입자 표면에 흡착시키거나; 또는 8M 요소를 사용하여 수용성 성분과 수불용성 성분을 동시에 용해시킨 다음 나노입자 또는 마이크로입자의 내부에 포획 및/또는 나노입자 또는 마이크로입자 표면에 흡착시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서는 폴리(I:C), 칼메트 게랭 백신(BCG) 및 CpG를 면역 보조제로 사용하며, 실제로는 면역 보조제를 첨가하지 않아도 되며 또한 기타 면역강화 기능을 갖는 다른 면역 보조제를 첨가하여도 되는데, 예를 들어 패턴 인식 수용체 작용제, BCG 세포벽 골격, BCG 메탄올 추출 잔기, BCG 무라밀 디펩타이드, 마이코박테리움 플라이, 다항갑소, 미네랄 오일, 바이러스 유사 입자, 면역 강화 재구성 인플루엔자 비리온, 콜레라 장독소, 사포닌 및 이의 유도체, 레시퀴모드, 티모신, 신생아 소 간 활성 펩타이드, 미퀴모드, 다당류, 커큐민, 면역 보조제 폴리 ICLC, 코리네박테리움 푸밀루스, 용혈성 연쇄상구균 제제, 코엔자임 Q10, 레바미솔, 폴리시티딜산, 인터루킨, 인터페론, 폴리이노신산, 폴리아데닐산, 명반, 알루미늄 인산염, 라놀린, 식물성 기름, 내독소, 리포솜 아주반트, GM-CSF, MF59, 이중 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 수산화 알루미늄, CAF01, 인삼, 황기 등 중약의 유효성분이다.
또한, 본 발명의 일부 실시예에서 사용되는 백신은 나노백신이고, 일부 실시예에서는 마이크로백신을 사용한다. 당업자는 실제 상황에 따라 나노백신 또는 마이크로백신을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명을 더 잘 이해하기 위하여 이하에서 본 발명의 실시예와 결부하여 본 발명 실시예에 따른 기술적 해결수단을 명확하고 완전하게 설명할 것이며, 상술한 실시예는 본 발명의 일부분일 뿐, 실시예 전부가 아닌 것이 자명하다. 본 발명의 실시예에 기초하여, 당업자가 창조적인 노력이 없이 획득한 기타의 모든 실시예는 본 발명의 보호 범위에 속할 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시예에서 사용된 방법은 모두 통상적인 방법이며, 사용된 재료, 시약 등은 모두 상업적 공급으로부터 입수할 수 있다. 본 발명의 실시예와 관련되는 나노급 크기 입자 또는 마이크로급 크기 입자의 구조, 제조방법, 질병 치료 시의 사용 전략, 다른 면역 치료제와의 병용 전략, 다른 표적 치료제와의 병용 전략 등은 단지 대표적인 방법일 뿐, 다른 나노급 크기 입자 또는 마이크로급 크기의 입자 구조, 제조방법, 질병 치료 시의 사용 전략, 다른 면역 치료제와의 병용 전략 및 다른 표적 치료제와의 병용 전략도 본 발명에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 실시예는 본 발명의 일부 암에서의 용도만 나열하였지만, 본 발명은 다른 암의 치료에도 사용될 수 있다. 실시예에서 사용되는 구체적인 방법 또는 재료에 대하여, 당업자는 본 발명의 기술적 사상의 기초상에 기존 기술에 근거하여 통상적인 대체 선택을 할 수 있으며, 본 발명의 실시예의 구체적인 설명에 한정되지 않는다.
PD-1 항체는 임상적 효능이 우수하여 많은 암의 치료제로 승인되어 있으므로, 본 발명의 실시예에서 출원인은 상기 암의 치료에 상기 나노백신 또는 마이크로백신을 사용하였을 뿐만 아니라 암의 치료에 있어서의 나노백신 또는 마이크로백신과 PD-1 항체의 병용도 시험하였다. 실제 적용 시 상황에 따라 구체적인 투여 시간, 투여 빈도, 투여 방안, 다른 약물과의 병용 상황은 조정될 수 있다.
실시예1. 흑색종 암세포 전 세포 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 흑색종을 암 모델로 사용하여 전 세포 조성분이 로딩된 나노백신을 제조하고, 이로써 흑색종을 치료하였다.
PD-1 항체는 이의 우수한 임상 효능으로 인해 많은 암 치료에 승인되었다. 따라서, 본 실시예에서 출원인은 상기 나노백신을 흑색종의 치료에 적용했을 뿐만 아니라 흑색종의 치료에서 나노백신과 PD-1 항체의 병용도 시험하였다. 실제 적용 시 상황에 따라 구체적인 투여 시간, 투여 빈도, 투여 방안 등은 조정될 수 있다.
본 실시예에서는 B16F10 마우스 흑색종 세포를 암세포 모델로 사용하였다. 먼저 B16F10 세포의 수용성 및 수불용성 성분을 제조하기 위하여 B16F10을 용해시켰다. 다음, 유기고분자 재료 PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리(I:C))을 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 B16F10 세포의 수용성 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 제조하였다. 그리고 해당 나노백신을 사용하여 B16F10 흑색종 담지 마우스의 종양을 치료하였다.
(1) 암세포의 용해 및 각 조성분의 수집
일정량의 B16F10 세포를 수집하여 배지를 제거하고 -20℃ 내지 -273℃에서 냉동하고 일정량의 초 순수한 물을 가하여 3회 이상 냉동 및 해동하고 초음파 처리하여 용해된 세포를 파괴하였다. 세포가 용해된 후, 용해물을 100g 보다 빠른 회전 속도로 1분 이상 원심분리하고 상청액, 즉 B16F10의 순수한 물에 용해되는 수용성 성분을 취하고; 얻어진 침전 부분에 8M 요소를 첨가하여 침전 부분을 용해시키면 순수한 물에 용해되지 않는 B16F10의 수불용성 성분을 8M 요소 수용액에 용해될 수 있게 전환시킬 수 있다. 상기에서 얻어진 암세포 용해물에서 유래된 수용성 성분과 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분은 암 치료용 나노백신을 제조하기 위한 원료 공급원이다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서, 대조군으로 나노백신 및 블랭크 나노입자의 제조는 용매 증발법의 이중 에멀젼법을 사용하고, 사용된 나노입자 제조 재료 PLGA의 분자량은 24Kda 내지 38KDa이고, 사용된 면역 보조제는 폴리(I:C)이되, 폴리(I:C)는 나노입자 내부에 분포될 뿐만 아니라 나노입자 표면에 흡착되어 있기도 한다. 제조방법은 상기에서 설명한 바와 같다. 나노입자의 표면에 세포 성분 및 면역 보조제가 로딩되기 전, 나노입자의 평균 입경은 약 250nm이었고, 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 흡착된 후, 얻어진 나노백신의 평균 입경은 약 300nm이었으며, 나노백신 표면의 제타전위는 약 -5mV이었다. PLGA 나노입자 1mg에는 약 150μg의 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이 로딩되어 있었으며, PLGA 나노입자 1mg의 내부와 외부에 사용되는 폴리(I:C) 면역 보조제는 약 0.01mg이었으며, 내부와 외부는 각각 절반이었다. 블랭크 나노입자의 입경은 약 215nm이었으며, 블랭크 나노입자 제조 시 각각 동일한 양의 폴리(I:C)를 함유하는 순수한 물 또는 8M 요소를 사용하여 대응되는 수용성 및 수불용성 성분을 대체하였고, 블랭크 나노입자의 외부에는 나노백신과 동일한 양의 폴리(I:C)가 흡착되어 있었다.
(3) 암 치료용 나노백신
본 연구는 두 가지 다른 투여 방식, 나노백신만 사용하는 방식과 나노백신을 PD-1 항체와 병용하여 사용하는 방식을 각각 조사하였다. 대조군은 각각 PBS군과 PD-1 항체+블랭크 나노입자+세포 용해물군이었다.
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 모델 마우스로 선택하여 흑색종 종양 담지 마우스를 제조하였다.
나노백신 단독 사용군에 대한 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 암세포 용해물의 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL와 내부 및 표면에 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL를 피하 주사하였다.
나노백신과 PD-1 항체 병용군의 투여 방안은 다음과 같났다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 암세포 용해물의 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL와 내부 및 표면에 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL를 피하 주사하였다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
PBS 블랭크 대조군의 투여 일정은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 400μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
PD-1 항체+블랭크 나노입자+세포 용해물 대조군: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 동일한 양의 암세포 용해물의 수용성 성분, 동일한 암세포 용해물 중 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분 및 동일한 양의 폴리(I:C)외 다른 세포 용해물 성분을 로딩하지 않은 4mg PLGA 블랭크 나노입자를 각각 피하 주사하였다. 상기 세 가지 투여물을 별도로 및 각각 다른 부위에 주사함로써 블랭크 나노입자의 표면에 유리 세포 용해물의 흡착을 방지하여야 한다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
실험에서 6일차부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 동물 실험 윤리를 감안하여, 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험 결과
도 18에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군과 비교하여 볼 때, 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군에서 마우스의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 다음으로, PBS 블랭크 대조군 및 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군과 비교하여 볼 때, 나노백신 단독 사용군 및 나노백신+PD-1 항체 병용군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05) 마우스의 생존 시간이 유의하게 연장되었다(p<0.05). 또한, 두 약물 투여군의 마우스 중 25%가 완치되었고 종양이 완전히 사라졌다. 본 실시예에서 PD-1 항체와 나노백신을 병용하여 사용하는 경우, 마우스의 생존 기간 연장에 있어서 양자의 시너지 효과는 유의하지 않았다.
결론적으로, 본 발명에 기재된 암세포의 수용성 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신은 흑색종에 대한 치료 효과가 있으며 흑색종을 부분적으로 치료할 수 있다.
실시예2. 흑색종 암세포 수용성 세포 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 흑색종을 암 모델로 사용하여 세포 성분 중 수용성 성분만 로딩된 나노백신을 제조하였고, 이로써 흑색종을 치료하는 방법을 설명하였다.
PD-1 항체는 이의 우수한 임상 효능으로 인해 많은 암 치료에 승인되었다. 따라서, 본 실시예에서 출원인은 흑색종의 치료에 있어서 상기 나노백신과 PD-1 항체의 병용 방법을 적용하였다. 실제 적용 시 세포 성분의 원 수불용성 부분에서 제조된 나노백신만 치료에 사용할 수도 있다. 또한 상황에 따라 구체적인 투여 시간, 투여 빈도, 투여 방안 등은 조정될 수 있다.
본 실시예에서는 B16F10 마우스 흑색종 세포를 암세포 모델로 사용하였다. 먼저 B16F10 세포의 수용성 및 수불용성 성분을 제조하기 위하여 B16F10을 용해시켰다. 다음, 유기고분자 재료 PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, 폴리(poly(I:C))를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 B16F10 세포의 수용성 성분이 로딩된 나노백신을 제조하였다. 그리고 해당 나노백신을 사용하여 B16F10 흑색종 종양 담지 마우스의 종양을 치료하였다.
(1) 암세포의 용해 및 각 조성분의 수집
일정량의 B16F10 세포를 수집하여 배지를 제거하고 -20℃ 내지 -273℃에서 냉동하고 일정량의 초 순수한 물을 첨가하여 3회 이상 냉동 및 해동하고 초음파 처리하여 용해된 세포를 파괴하였다. 세포가 용해된 후, 용해물을 100g 보다 큰 회전 속도로 5분 동안 원심분리하고 상청액, 즉 B16F10의 순수한 물에 용해되는 수용성 성분을 취하였다. 상기에서 얻어진 암세포 용해물에서 유래된 수용성은 암 치료용 나노백신을 제조하기 위한 원료 공급원이었다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서, 나노백신 및 대조군인 블랭크 나노입자의 제조는 용매 증발법의 이중 에멀젼법을 사용하고, 사용한 나노입자 제조 재료는 분자량이 24Kda 내지 38Kda인 유기 고분자 재료 PLGA이고, 사용된 면역 보조제는 폴리(I:C)이되, 폴리(I:C)는 나노입자 내부에 분포될 뿐만 아니라 나노입자 표면에 흡착되어 있기도 한다. 제조방법은 상기에서 설명한 바와 같다. 나노입자의 표면에 세포 성분 및 면역 보조제가 로딩되기 전, 나노입자의 평균 입경은 약 250nm이고, 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 흡착된 후, 얻어진 나노백신의 평균 입경은 약 300nm이며, 나노입자 표면의 제타전위는 약 -5mV이다. PLGA 나노입자 1mg에는 약 150μg의 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이 로딩되어 있으며, PLGA 나노입자 1mg의 내부와 외부에 사용되는 폴리(I:C) 면역 보조제는 약 0.01mg이며, 내부와 외부는 각각 절반이다. 블랭크 나노입자의 입경은 약 215nm이며, 블랭크 나노입자 제조 시 각각 동일한 양의 폴리(I:C)를 함유하는 순수한 물 또는 8M 요소를 사용하여 해당 수용성 및 수불용성 성분을 대체하였고, 블랭크 나노입자의 외부에는 나노백신과 동일한 양의 폴리(I:C)가 흡착되어 있었다.
(3) 암 치료용 나노백신
연구에서는 암을 치료하기 위해 PD-1 항체와 수용성 성분만 함유한 나노백신을 병용하였다.
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6를 선택하여 흑색종 종양 담지 마우스를 제조하였다.
나노백신과 PD-1 항체 병용군의 투여 방안은 다음과 같다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였다. 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 모두 암세포 용해물의 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL, 동일한 양의 폴리(I:C)가 로딩된 2mg PLGA 블랭크 나노입자 및 세포 용해물중 8M 요소에 용해시킨 수불용성 성분을 피하 주사하되, 삼자는 각각 다른 부위에 주사되었다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
PBS 블랭크 대조군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였다. 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 400μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
PD-1 항체+블랭크 나노입자+세포 용해물 대조군: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였다. 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 200μL의 동일한 양의 암세포 용해물의 수용성 성분, 200μL의 동일한 양의 암세포 용해물 중 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분 및 동일한 양의 폴리(I:C)외 다른 세포 용해물 성분을 로딩하지 않은 4mg PLGA 블랭크 나노입자를 각각 피하 주사하였다. 상기 세 가지 투여물을 별도로 및 각각 다른 부위에 주사함로써 블랭크 나노입자의 표면에 유리 세포 용해물의 흡착을 방지하여야 한다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
실험에서 6일째부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 동물 실험 윤리를 감안하여, 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험결과
도 19에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군과 비교하여 볼 때, 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군과 나노백신 투여군에서 마우스의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 그리고, 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군과 비교하여 볼 때, 나노백신 투여군에서 마우스의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌다(p<0.05). 또한, 나노백신 투여군의 마우스 중 12.5%가 완치되었고 종양이 완전히 사라졌다. 그러므로 본 발명에 기재된 암세포의 수용성 성분이 로딩된 나노백신은 흑색종에 대한 치료 효과가 있으며 흑색종을 부분적으로 치료할 수 있다.
실시예3. 흑색종 종양조직 용해 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 흑색종을 사용하여 흑색종 종양조직 용해물 성분이 로딩된 나노 백신을 제조하는 방법과 이로써 흑색종을 치료하는 방법을 설명하였다.
본 실시예에서 출원인은 흑색종의 치료에 있어서의 상기 나노백신과 PD-1 항체의 병용의 효과를 시험하였고, 실제 적용 시 나노백신만 암 치료에 사용할 수도 있다.
본 실시예에서는 마우스 흑색종 종양조직의 용해된 성분을 나노입자의 내부 및 표면에 로딩하여 나노백신을 제조하였다. 먼저 마우스 흑색종 종양 덩어리를 얻은 후 이를 용해시켜 종양 덩어리 조직의 수용성 성분과 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분을 제조하였다. 다음으로, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고 폴리(I:C)를 면역 보조제로 사용하여 종양조직 용해물의 수용성 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 용매 증발법으로 제조하였다. 그다음 상기 나노백신을 흑색종 종양 보유 마우스의 종양 치료에 사용하였다.
(1) 종양조직의 용해 및 각 성분의 수집
C57BL/6 마우스의 등에 150,000개의 B16F10 흑색종 세포를 피하 접종하였고, 각 마우스에 접종된 종양이 각각 약 80mm3, 200mm3, 400mm3 및 1000mm3로 성장했을 때 마우스를 죽이고 종양조직을 적출하였다. 동일한 크기의 종양조직을 잘게 썰고 분쇄한 후, 셀 스트레이너를 통해 적당량의 순수를 첨가하고, 냉동 및 해동을 5회 반복하였다. 종양조직 부위의 세포를 용해시킨 후, 종양 덩어리 조직의 세포 용해물을 12,000RPM 보다 빠른 속도로 5분 동안 원심분리하여 상청액을 얻었는데, 이는 순수한 물에 용해되는 종양조직의 수용성 성분이었고; 얻어진 침전 부분에 8M 요소 수용액을 첨가하여 침전 부분을 용해시키면, 순수한 물에 불용인 원 수불용성 성분을 8M 요소 수용액에 용해되게 전환시킬 수 있었다. 상기에서 얻어진 종양조직 용해물의 수용성 성분과 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분은 암세포 치료용 나노백신을 제조하기 위한 원료 공급원이었다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서, 나노백신 및 대조군인 블랭크 나노입자의 제조는 용매 증발법의 이중 에멀젼법을 사용하였고, 사용된 나노입자 제조 재료 PLGA의 분자량은 24Kda 내지 38KDa이었고, 사용된 면역 보조제는 폴리(I:C)이되, 폴리(I:C)는 나노입자 내부에 분포될 뿐만 아니라 나노입자 표면에 흡착되어 있기도 한다. 제조방법은 상기에서 설명한 바와 같다. 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 로딩되기 전, 나노입자의 평균 입경은 약 250nm이었고, 나노입자의 표면에 세포 성분 및 면역 보조제가 흡착된 후, 얻어진 나노백신의 입경은 약 300nm이었으며, 나노입자 표면의 제타전위는 약 -5mV이었다. PLGA 나노입자 1mg에는 약 160μg의 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이 로딩되어 있었으며, PLGA 나노입자 1mg의 내부와 외부에 사용되는 폴리(I:C) 면역 보조제는 약 0.01mg이었으며, 내부와 외부는 각각 절반이었다. 블랭크 나노입자의 입경은 약 215nm이었으며, 블랭크 나노입자 제조 시 각각 동일한 양의 폴리(I:C)를 함유하는 순수한 물 또는 8M 요소를 사용하여 해당 수용성 성분 및 수불용성 성분을 대체하였고, 블랭크 나노입자의 외부에는 나노백신과 동일한 양의 폴리(I:C)가 흡착되어 있었다.
(3) 암 치료용 나노백신
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6를 선택하여 흑색종 종양 담지 마우스를 제조하였다.
나노백신 투여군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 모두 종양조직 용해물 중 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL 및 내부 및 표면에 모두 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL를 피하 주사하였다. 여기서, 4일차 및 7일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 80mm3인 종양 덩어리에서 유래되었고, 10일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 200mm3인 종양 덩어리에서 유래되었으며, 15일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 400mm3인 종양 덩어리에서 유래되었고, 20일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 1000mm3인 종양 덩어리에서 유래되었다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 각각 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
PBS 블랭크 대조군의 투여 일정은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였으며, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 400μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
PD-1 항체+블랭크 나노입자+세포 용해물 대조군: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 동일한 양의 암세포 용해물의 수용성 성분, 동일한 양의 암세포 용해물 중 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분 및 동일한 양의 폴리(I:C)외 다른 세포 용해물 성분을 로딩하지 않은 4mg PLGA 블랭크 나노입자를 각각 피하 주사하였다. 상기 세 가지 투여물을 별도로 및 각각 다른 부위에 주사함로써 블랭크 나노입자의 표면에 유리 세포 용해물의 흡착을 방지하여야 한다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
실험에서 6일째부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 동물 실험 윤리를 감안하여, 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험결과
도 20에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군과 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군을 비교하여 볼 때, 나노백신 투여군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 또한, 나노백신 투여군의 마우스 중 25%가 완치되었고 종양이 완전히 사라졌다. 그러므로 본 발명에 기재된 종양조직 용해물의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신은 흑색종에 대한 치료 효과가 있으며 흑색종을 부분적으로 치료할 수 있다.
실시예4. 흑색종 암세포의 전 세포 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 예방에 사용
본 실시예에서는 마우스 흑색종을 암 모델로 사용하여 전 세포 조성분이 로딩된 나노백신을 제조하고, 이로써 흑색종을 예방하는 방법을 설명하였다.
본 실시예에서는 B16F10 마우스 흑색종 세포를 암세포 모델로 사용하였다. 먼저 B16F10 세포의 수용성 및 수불용성 성분을 제조하기 위하여 B16F10을 용해시켰다. 다음, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, 폴리(I:C))를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 B16F10 세포의 수용성 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 제조하였다. 그리고 해당 나노백신을 사용하여 흑색종을 예방하였다.
(1) 암세포의 용해 및 각 구성의 수집
암세포의 용해방법 및 각 구성의 수집방법은 실시예1과 같았다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서, 나노백신 및 대조군으로 블랭크 나노입자의 제조는 용매 증발법의 이중 에멀젼법을 사용하고, 나노입자 제조 재료 PLGA의 분자량은 24Kda 내지 38KDa이고, 사용된 면역 보조제는 폴리(I:C)이되, 폴리(I:C)는 나노입자 내부에 분포될 뿐만 아니라 나노입자 표면에 흡착되어 있기도 한다. 제조방법은 상기에서 설명한 바와 같다. 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 로딩되기 전, 나노입자의 평균 입경은 약 250nm이었고, 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 흡착된 후, 얻어진 나노백신의 평균 입경은 약 300nm이었으며, 나노백신 표면의 제타전위는 약 -5mV이었다. PLGA 나노입자 1mg에는 약 150μg의 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이 로딩되어 있었으며, PLGA 나노입자 1mg의 내부와 외부에 사용되는 폴리(I:C) 면역 보조제는 약 0.01mg이었으며, 내부와 외부는 각각 절반이었다. 블랭크 나노입자의 입경은 약 215nm이었으며, 블랭크 나노입자 제조 시 각각 폴리(I:C)를 함유하는 순수한 물 또는 8M 요소를 사용하여 대응되는 수용성 성분 및 수불용성 성분을 대체하였고, 블랭크 나노입자의 외부에는 나노백신과 동일한 양의 폴리(I:C)가 흡착되어 있었다.
(3) 암 예방에 있어서의 나노백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6을 선택하여 흑색종 종양 담지 마우스를 제조하였다. B16F10 암세포를 접종하기 전 42일, 35일, 28일, 21일 및 14일에 내부와 표면에 암세포 용해물의 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL및 내부와 표면에 8M 요소에 용해시킨 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노백신 200μL를 각각 피하 주사하였다. 나노백신을 마지막 투여하고 14일 후, 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 이 날을 종양세포 접종 0일로 설정하였다.
본 실험에서 대조군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였다.
실험에서 6일차부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 동물 실험 윤리를 감안하여, 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험결과
도 21에 도시된 바와 같이, 대조군과 비교하여 볼 때, 나노백신 예방군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 또한, 나노백신 투여군의 마우스 중 35%가 종양이 완전히 사라졌다. 그러므로 본 발명에 기재된 암세포 용해물의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신은 흑색종에 대한 예방 효과가 있으며 일부 백신 접종자의 흑색종을 예방할 수 있음을 알 수 있다.
실시예5. 흑색종 종양조직의 용해물 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 예방에 사용
본 실시예에서는 마우스 흑색종을 암 모델로 사용하여 흑색종 종양조직의 용해물 성분이 로딩된 나노백신을 제조하고, 이로써 흑색종을 예방하는 방법을 설명하였다.
본 실시예에서는 마우스 흑색종 종양조직 용해 구성을 나노입자의 내부와 표면에 로딩하여 나노백신을 제조하였다. 먼저 마우스 흑색종 종양 덩어리를 얻은 후 용해시켜 종양 덩어리 조직의 수용성 성분과 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분을 제조하였다. 다음, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, 폴리(I:C)를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 종양조직 용해물의 수용성 성분과 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 제조하였다. 그리고 상기 나노백신을 사용하여 B16F10 흑색종 담지 마우스의 종양을 치료하였다.
(1) 종양조직의 용해 및 각 성분의 수집
종양조직의 처리방법은 실시예 3과 같았다. 먼저 각 C57BL/6 마우스의 등에 150,000개의 B16F10 흑색종 세포를 피하 접종하였고, 각 마우스에 접종된 종양이 각각 약 80mm3, 200mm3, 400mm3 및 1000mm3로 성장했을 때 마우스를 죽이고 종양조직을 적출하였다. 동일한 크기의 종양조직을 잘게 썰고 분쇄한 후, 셀 스트레이너를 통해 적당량의 순수한 물을 가하고, 냉동 및 해동을 3회 이상 반복하였다. 종양조직의 세포가 용해된 후, 종양 덩어리 조직의 세포 용해물을 12,000RPM의 회전 속도로 5분 동안 원심분리하여 상청액을 얻었으며, 이는 순수한 물에 용해되는 종양조직의 수용성 성분이었고; 얻어진 침전 부분에 8M 요소 수용액을 가하여 침전 부분을 용해시키면, 순수한 물에 불용인 원 수불용성 성분을 8M 요소 수용액에 용해되게 전환시킬 수 있엇다. 상기에서 얻어진 종양조직 용해물의 수용성 성분과 원 수불용성 성분은 암세포 예방용 나노백신을 제조하기 위한 원료 공급원이었다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서, 나노백신 및 대조군인 블랭크 나노입자의 제조는 용매 증발법의 이중 에멀젼법을 사용하였고, 나노입자 제조 재료 PLGA의 분자량은 24Kda 내지 38KDa이었고, 사용된 면역 보조제는 폴리(I:C)이되, 폴리(I:C)는 나노입자 내부에 분포될 뿐만 아니라 나노입자 표면에 흡착되어 있기도 한다. 제조방법은 상기에서 설명한 바와 같다. 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 로딩되기 전, 나노입자의 평균 입경은 약 250nm이었고, 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 흡착된 후, 얻어진 나노백신의 평균 입경은 약 300nm이었며, 나노입자 표면의 제타전위는 약 -5mV이었다. PLGA 나노입자 1mg에는 약 160μg의 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이 로딩되어 있으며, PLGA 나노입자 1mg의 내부와 외부에 사용되는 폴리(I:C) 면역 보조제는 약 0.01mg이었고, 내부와 외부는 각각 절반이었다. 블랭크 나노입자의 입경은 약 215nm이며, 블랭크 나노입자 제조 시 각각 동일한 양의 폴리(I:C)를 함유하는 순수한 물 또는 8M 요소를 사용하여 해당 수용성 성분 및 수불용성 성분을 대체하였고, 블랭크 나노입자의 외부에는 나노백신과 동일한 양의 폴리(I:C)가 흡착되어 있었다.
(3) 암 예방에 있어서의 나노백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6를 선택하여 흑색종 종양 담지 마우스를 제조하였다. 종양세포를 접종하기 전 42일, 35일, 28일, 21일 및 14일에 내부와 표면에 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL 및 내부와 표면에 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노백신 200μL를 각각 피하 주사하였다. 여기서 종양 접종 전 42일과 35일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 80mm3인 종양 덩어리에서 유래되었고, 종양 접종하기 전 28일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 200mm3인 종양 덩어리에서 유래되었으며, 종양 접종하기 전 21일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 400mm3인 종양 덩어리에서 유래하되었고, 종양 접종 전 14일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 1000mm3의 종양 덩어리에서 유래되었다. 나노백신을 마지막 투여하고 14일 후, 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였고, 이 날을 종양세포 접종 0일로 설정하였다.
본 실험에서 대조군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였다.
실험에서 6일차부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 동물 실험 윤리를 감안하여, 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험결과
도 22에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군과 비교하여 볼 때, 나노백신 예방군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 또한, 나노백신 투여군의 마우스 중 35%가 종양이 완전히 사라졌다. 그러므로 본 발명에 기재된 종양조직 용해물의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신은 흑색종에 대한 예방 효과가 있으며 일부 백신 접종자의 흑색종을 예방할 수 있음을 알 수 있다.
실시예6. 유방암 세포의 전 세포 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 유방암 치료로 전 세포 조성분이 로딩된 나노백신을 제조하는 방법과 이로써 유방암을 치료하는 방법을 설명하였다.
본 실시예에서 출원인은 유방암을 치료에만 상기 나노백신을 적용했을 뿐만 아니라 유방암의 치료에 있어서의 나노백신과 PD-1 항체의 병용도 시험하였다. 실제 적용 시 상황에 따라 구체적인 투여 시간, 투여 빈도, 투여 일정 등은 조정될 수 있다.
본 실시예에서는 4T1 마우스 삼중음성 유방암 세포를 암세포 모델로 사용하였다. 먼저 4T1 세포의 수용성 성분과 수불용성 성분을 제조하기 위하여 4T1 세포를 용해시켰다. 다음, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, 폴리(I:C)를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 4T1 세포의 수용성 성분과 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 제조하였다. 그리고 상기 나노백신을 사용하여 4T1 유방암 종양 담지 마우스의 종양을 치료하였다.
(1) 암세포의 용해 및 각 성분의 수집
본 실시예에서 암세포의 용해방법 및 용해물의 수집방법과 가용화 방법은 실시예1과 같았으며, 단 4T1 세포로 B16F10 세포를 대체하였다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서 나노백신의 제조방법, 사용되는 재료 등은 모두 실시예1과 같았고, 단 4T1 세포로 B16F10 세포를 대체하였을 뿐이였다.
(3) 암 치료에 있어서의 나노백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 선택하여 4T1 종양 담지 마우스를 제조하였다.
나노백신 투여군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 암세포 용해물의 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL와 내부 및 표면에 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL를 피하 주사하였다.
나노백신과 PD-1 항체 병용군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 암세포 용해물의 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL와 내부 및 표면에 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL를 피하 주사하였다.
PBS 블랭크 대조군의 투여 일정은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 400μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
PD-1 항체+블랭크 나노입자+세포 용해물 대조군: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 암세포 용해물의 수용성 성분, 암세포 용해물 중 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분 및 동일한 양의 폴리(I:C)외 다른 세포 용해물 성분을 로딩하지 않은 4mg PLGA 블랭크 나노입자를 각각 피하 주사하였다. 상기 세 가지 투여물을 별도로 및 각각 다른 부위에 주사함로써 블랭크 나노입자의 표면에 유리 세포 용해물의 흡착을 방지하여야 한다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
수용성 성분만 함유하는 나노백신과 PD-1 항체 병용군의 투여 방안은 다음과 같다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 150,000개의 B16F10 세포를 피하 접종하였다. 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 내부 및 표면에 암세포 용해물의 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL, 동일한 양의 폴리(I:C)만 로딩된 2mg PLGA 플랭크 나노입자 200μL와 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분을 각각 다른 부위에 피하 주사하였다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 각각 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
실험에서 6일차부터 마우스 종양 채적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 동물 실험 윤리를 감안하여, 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험 결과
도 23에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군 및 블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군과 비교하여 볼 때, 나노백신 투여군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 그러므로 본 발명에 기재된 암세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신은 유방암에 대해 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
본 실시예에서 나노백신과 PD-1 항체를 병용하는 투여 방안을 사용하는 경우, 종양 성장 속도 억제 및 마우스 생존 기간 연장에 있어서 양자의 시너지 효과는 유의하지 않았다.
블랭크 나노입자+세포 용해물+PD-1 항체 대조군과 비교하여, 수용성 성분만 함유하는 나노백신+PD-1 항체군은 종양 성장 속도를 억제하고 마우스의 생존 기간을 연장하는데 두가지 방면에 있어서 모두 유의한 차이가 없었다. 이는 유방암 치료에 있어서 수용성 성분만 함유하는 나노백신의 치료가 효과적이지 않다는 것을 알 수 있다.
실시예7. 유방암 종양조직의 용해 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 유방암을 암 모델로 사용하여 유방암 종양조직 용해물 성분이 로딩된 나노백신을 제조하는 방법과 이로써 유방암을 치료하는 방법을 설명하였다. 실제 적용 시 상황에 따라 구체적인 투여 시간, 투여 빈도, 투여 일정 등은 조정될 수 있다.
본 실시예에서는 마우스 유방암 종양조직의 용해된 성분을 나노입자의 내부와 표면에 로딩하여 나노백신을 제조하였다. 먼저 마우스 유방암 종양 덩어리를 얻은 후 용해시켜 종양 덩어리 조직의 수용성 성분과 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분을 제조하였다. 다음으로, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고 폴리(I:C)를 면역 보조제로 사용하여 종양조직 용해물의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 용매 증발법으로 제조하였다. 그다음 상기 나노백신을 유방암 종양 담지 마우스의 종양 치료에 사용하였다.
(1) 종양조직의 용해 및 각 조성분의 수집
본 실시예에서 암세포의 용해, 용해물의 수집 및 가용화 방법은 실시예3과 같았고, 단 유방암 종양조직으로 흑색종 종양조직을 대체하였을 뿐이었다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서 나노백신의 제조방법, 사용되는 재료 등은 모두 실시예3과 같았고, 단 유방암 종양조직으로 흑색종 종양조직을 대체하을 뿐이었다.
(3) 암 치료에 있어서의 나노백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 선택하여 4T1 종양 담지 마우스를 제조하였다.
나노백신 투여군의 투여 방안은 다음과 같다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL와 내부 및 표면에 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL를 피하 주사하였다. 여기서 4일차와 7일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 80mm3인 종양 덩어리에서 유래되었고, 10일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 200mm3인 종양 덩어리에서 유래되었으며, 15일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 400mm3인 종양 덩어리에서 유래하였고, 20일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 1000mm3의 종양 덩어리에서 유래하였다.
PBS 블랭크 대조군의 투여 방안은 다음과 같다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 400μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
실험에서 6일차부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 동물 실험 윤리를 감안하여, 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험 결과
도 24에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군과 비교하여 볼 때, 나노백신 투여군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 그러므로 본 발명에 기재된 종양조직의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신은 유방암에 대해 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예8. 유방암 세포 전 세포 조성분이 마이크로입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 유방암을 암 모델로 전 세포 조성분이 로딩된 마이크로백신을 제조하는 방법과 이로써 유방암을 치료하는 방법을 설명하였다.
본 실시예에서는 4T1 마우스 삼중음성 유방암 세포를 암세포 모델로 사용하였다. 먼저 4T1 세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분을 제조하기 위하여 4T1 세포를 용해시켰다. 다음, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, 폴리(I:C)를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 4T1 세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 마이크로백신을 제조하였다. 그리고 상기 마이크로백신을 사용하여 4T1 유방암 종양 담지 마우스 체내의 종양을 치료하였다.
(1) 암세포의 용해 및 각 구성의 수집
본 실시예에서 암세포의 용해방법 및 용해물의 수집방법과 가용화 방법은 실시예1과 같았고, 단 4T1 세포로 B16F10 세포를 대체하였을 뿐이었다.
(2) 마이크로백신의 제조
본 실시예에서 마이크로백신 및 블랭크 마이크로입자에 사용된 제조방법 및 재료는 모두 실시예1과 유사하였고, 단 초유와 복합유의 초음파 시간이 이중 에멀젼법으로 미립자를 제조하는 과정에서 더 짧을 뿐이었다. 제조된 마이크로백신의 평균 입경은 약 2μm이었고, 마이크로입자의 표면 제타전위는 -4mV이었며, 1mg의 PLGA 마이크로입자 내부 및 외부에 로딩된 단백질 및 폴리펩타이드 성분은 200μg이었고, 1mg의 PLGA 나노 입자 내부 및 외부에 사용되는 폴리(I:C) 면역 보조제의 총량은 0.01mg이었으며 내부 및 외부는 각각 절반이었다.
(3) 암 치료에 있어서의 마이크로백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 선택하여 4T1 종양 보유 마우스를 제조하였다.
마이크로백신 투여군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 암 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 마이크로입자 200μL와 내부 및 표면에 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 마이크로입자 200μL를 피하 주사하였다.
PBS 블랭크 대조군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 400μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
블랭크 마이크로입자+세포 용해물 대조군: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 동일한 양의 암세포 용해물의 수용성 성분, 동일한 양의 암세포 용해물 중 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분 및 동일한 양의 폴리(I:C)외 다른 세포 용해물 성분을 로딩하지 않은 4mg PLGA 블랭크 마이크로입자를 각각 피하 주사하였다. 상기 세 가지 투여물을 별도로 및 각각 다른 부위에 주사함로써 블랭크 마이크로입자의 표면에 유리 세포 용해물의 흡착을 방지하여야 한다.
실험에서 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험 결과
도 25에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군 및 블랭크 마이크로입자 대조군과 비교하여 볼 때, 마이크로백신 투여군에서의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 그러므로 본 발명에서 상기 암세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 마이크로백신은 유방암에 대해 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예9. 유방암 종양조직 용해 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되어 암 예방에 사용
본 실시예에서는 마우스 유방암을 암 모델로 사용하여 유방암 종양조직 용해물 성분이 로딩된 나노백신을 제조하고 이로써 유방암을 예방하는 방법을 설명하였다.
본 실시예에서는 마우스 유방암 종양조직 조직 용해 성분을 나노입자의 내부와 표면에 로딩하여 나노백신을 제조하였다. 먼저 마우스 유방암 종양 덩어리를 얻은 후 이를 용해시켜 종양 덩어리 조직의 수용성 성분과 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분을 제조하였다. 다음, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, 폴리(I:C)를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 종양조직 용해물의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 제조하였다. 그리고 상기 나노백신을 사용하여 유방암 종양 담지 마우스 체내의 종양을 치료하였다.
(1) 종양조직의 용해 및 각 조성분의 수집
본 실시예에서 종양조직의 용해, 용해물의 수집 및 가용화 방법은 실시예 3과 같았고, 단 유방암 종양 덩어리로 흑색종 종양 덩어리를 대체하였을 뿐이었다.
(2) 나노백신의 제조
본 실시예에서 나노백신의 제조방법, 사용되는 재료 등은 모두 실시예 3과 같았고, 단 유방암 종양 덩어리로 흑색종 종양 덩어리를 대체하였을 뿐이었다. 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 로딩되기 전, 나노입자의 평균 입경은 약 250nm이고, 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 흡착된 후, 나노백신의 평균 입경은 약 300nm이며, PLGA 나노입자 1mg에는 약 150μg의 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이 로딩되어 있으며, PLGA 나노입자 1mg의 내부와 외부에 사용되는 폴리(I:C) 면역 보조제는 약 0.01mg이며, 내부와 외부는 각각 절반이었다. 얻어진 나노입자 표면의 제타전위는 약 -5mV이었다.
(3) 암 예방에 있어서의 나노백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 선택하여 4T1 종양 보유 마우스를 제조하였다.
나노백신 예방군 투여 방안: 종양세포를 접종하기 전 42일, 35일, 28일, 21일및 14일에 내부와 표면에 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL 및 내부와 표면에 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노입자 200μL를 각각 피하 주사하였다. 여기서 종양 접종 전 42일과 35일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 80mm3인 종양 덩어리에서 유래되었고, 마우스가 종양을 접종하기 전 28일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 200mm3인 종양 덩어리에서 유래되었으며, 종양 접종하기 전 21일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 400mm3인 종양 덩어리에서 유래되였고, 종양 접종 전 14일에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 1000mm3의 종양 덩어리에서 유래되였다. 나노백신을 마지막 투여하고 14일 후, 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 이 날을 종양세포 접종 0일로 설정하였다.
대조군의 투여 방안은 다음과 같다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였다.
실험에서 6일차부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시킨다.
(4) 실험결과
도 26에 도시된 바와 같이, 대조군과 비교하여 볼 때, 나노백신 예방군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 그러므로 본 발명에 기재된 유방암 종양 덩어리 용해물의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신은 흑색종에 대한 예방 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예10. 유방암 세포 전 세포 조성분이 나노입자의 내부 및 표면에 로딩되고 칼메트 게랭 백신(BCG)을 면역 보조제로 하는 나노백신을 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 유방암을 암 모델로 사용하고 BCG를 면역 보조제로 사용하여 전 세포 조성분이 로딩된 나노백신을 제조하고 상기 나노 백신을 사용하여 유방암을 치료하는 사용방법을 설명하였다.
본 실시예에서는 4T1 마우스 삼중음성 유방암 세포를 암세포 모델로 사용하였다. 먼저 4T1 세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분을 제조하기 위하여 4T1 세포를 용해시켰다. 다음, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, BCG를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 4T1 세포의 수용성 성분 및 수불용성 성분이 로딩된 나노백신을 제조하였다. 그리고 상기 나노백신을 사용하여 4T1 유방암 종양 보유 마우스의 종양을 치료하였다.
(1) 암세포의 용해 및 각 조성분의 수집
본 실시예에서 암세포의 용해방법 및 가용화 방법은 실시예1과 같았고, 단 4T1 세포로 B16F10 세포를 대체하였을 뿐이었다.
(2) BCG의 용해 및 각 조성분의 수집
본 실시예에서 BCG의 용해 및 용해물의 수집 방법과 가용화 방법은 실시예1과 같았고, 단 BCG로 암세포를 대체하였을 뿐이었다.
(3) 나노백신의 제조
본 실시예에서 나노백신의 제조방법, 사용되는 재료 등은 모두 실시예6과 같았다. 그러나 본 실시예에서 나노백신 내부에 포획된 면역 보조제는 폴리(I:C)에서 BCG 용해물의 수용성 성분 또는 수불용성 성분으로 대체되는 반면, 나노백신 표면에 흡착되어 있는 면역 보조제는 용해되기 전의 BCG 보조제였다. 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 로딩되기 전, 나노입자의 평균 입경은 약 250nm이었고, 나노입자의 표면에 세포 조성분 및 면역 보조제가 흡착된 후, 제조된 나노백신의 평균 입경은 약 310nm이었으며, PLGA 나노입자 1mg에는 약 150μg의 단백질 또는 폴리펩타이드 성분이 로딩되어 있으며, PLGA 나노입자 1mg의 내부와 외부에 사용되는 BCG 면역 보조제는 약 0.01mg이었으며, 내부와 외부는 각각 절반이었다.
(4) 암 치료에 있어서의 나노백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 선택하여 4T1 종양 보유 마우스를 제조하였다.
나노백신과 PD-1 항체 병용군의 투여 방안은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 각각 내부 및 표면에 수용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노백신 200μL와 내부 및 표면에 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분이 로딩된 2mg PLGA 나노백신 200μL를 피하 주사하였다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 각각 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
본 실시예에서 PBS 블랭크 대조군의 투여 일정은 다음과 같다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 400μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
PD-1 항체+블랭크 나노입자+세포 용해물 대조군: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 동일한 양의 암세포 용해물의 수용성 성분, 동일한 양의 암세포 용해물 중 8M 요소에 용해되는 원 수불용성 성분 및 동일한 양의 BCG외 다른 세포 용해물 성분을 로딩하지 않은 4mg PLGA 블랭크 나노입자를 각각 피하 주사하였다. 상기 세 가지 투여물을 별도로 및 각각 다른 부위에 주사함로써 블랭크 나노입자의 표면에 유리 세포 용해물의 흡착을 방지하여야 한다. 3일차, 6일차, 9일차 및 14일차에 PD-1 항체를 복강내 주사하였고, 각 마우스의 주사 용량은 10mg/kg이었다.
실험에서 6일차부터 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험 결과
도 27에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군 및 PD-1 항체+블랭크 나노입자+세포 용해물 대조군과 비교하여 볼 때, BCG를 면역 보조제로 사용한 나노백신 투여군에서 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 그러므로 본 발명에서 상기 암세포의 전 세포 조성분이 로딩되고 BCG를 면역 보조제로 사용한 나노백신은 유방암에 대해 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예11. 6M 염산 구아니딘에 용해된 종양조직 조성분이 나노입자의 내부와 표면에 로딩되어 암 치료에 사용
본 실시예에서는 마우스 유방암을 암 모델로 사용하여 6M 염산 구아니딘을 사용하여 전 세포 조성분을 용해하고 유방암 치료용 전 세포 조성분이 로딩된 마이크로 백신을 제조하는 방법을 설명하였다. 본 실시예에서는 4T1 마우스 삼중음성 유방암 세포를 암세포 모델로 사용하였다. 먼저 종양조직 세포를 비활성화 및 변성시킨 후, 종양조직을 6M 염산 구아니딘으로 용해시켜 전 세포 조성분을 용해시켰다. 다음, PLGA를 나노입자 골격 재료로 사용하고, CpG를 면역 보조제로 사용하여 용매 증발법으로 종양조직 전 세포 조성분이 로딩된 마이크로백신을 제조하였다. 그리고 상기 마이크로백신을 사용하여 4T1 유방암 종양 담지 마우스의 종양을 치료하였다.
(1) 암세포의 용해 및 각 성분의 수집
각 BALB/c 마우스의 등에 400,000개의 4T1 유방암 세포를 피하 접종하였고, 각 마우스에 접종된 종양의 체적이 각각 약 80mm3, 200mm3, 400mm3 및 1000mm3로 성장했을 때 마우스를 죽이고 종양조직을 적출하였다. 동일한 크기의 종양조직을 잘게 썰고 분쇄한 후, 셀 스트레이너를 통해 여과하여 종양조직 세포를 얻었다. 얻어진 종양조직 세포를 자외선 및 고온 가열에 의해 각각 비활성화 및 변성시킨 후, 적절한 양의 6M 염산 구아니딘을 사용하여 종양조직 세포를 용해시키고 용해시킨 조직 용해물이 마이크로백신 제조에서의 원료 공급원이었다.
(2) 마이크로백신의 제조
본 실시예에서 마이크로백신 및 블랭크 마이크로입자에 사용된 제조방법 및 재료는 실시예8과 유사하였고, 단 CpG를 면역 보조제로 사용하였을 뿐이었다. 제조된 마이크로백신의 평균 입경은 약 2.5μm이고, 마이크로입자의 표면 제타전위는 -4mV이었다. 1mg의 PLGA 마이크로입자 내부 및 외부에 로딩된 단백질 및 폴리펩타이드 구성은 210μg이고, 1mg의 PLGA 나노 입자 1mg 내부 및 외부에 사용되는 CpG 면역 보조제의 총량은 0.01mg이었으며 내부 및 외부는 각각 절반이었다.
(3) 암 치료에 있어서의 마이크로백신의 사용
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 선택하여 4T1 종양 담지 마우스를 제조하였다.
마이크로백신 투여군에 대한 투여 일정은 다음과 같았다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 내부 및 표면에 종양조직의 전 세포 조성분이 로딩된 2mg PLGA 마이크로입자 100μL를 피하 주사하였다. 여기서 종양 접종 4일차와 7일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 80mm3인 종양 덩어리에서 유래되었고, 10일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 크기가 약 200mm3인 종양 덩어리에서 유래되었으며, 15일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 400mm3인 종양 덩어리에서 유래되였고, 20일차에 주사된 나노백신에 의해 로딩된 종양조직 용해물은 약 1000mm3의 종양 덩어리에서 유래되였다.
PBS 블랭크 대조군의 투여 방안은 다음과 같다: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 100μL의 PBS를 각각 피하 주사하였다.
블랭크 마이크로입자+세포 용해물 대조군: 0일차에 각 마우스의 등 우측 하단에 400,000개의 4T1 세포를 피하 접종하였고, 4일차, 7일차, 10일차, 15일차 및 20일차에 동일한 양의 종양조직 용해물의 및 동일한 양의 CpG외 다른 세포 용해물 성분을 로딩하지 않은 2mg PLGA 블랭크 마이크로입자를 각각 피하 주사하였다. 상기 두 가지 투여물을 별도로 및 각각 다른 부위에 주사함로써 블랭크 나노입자의 표면에 유리 세포 용해물의 흡착을 방지하여야 한다.
실험에서 마우스 종양 체적의 크기는 3일에 한번씩 기록되었다. 종양 체적은 공식 v=0.52*a*b2를 사용하여 계산되었으며, 여기서 v는 종양 체적, a는 종양 길이, b는 종양 너비이다. 마우스 생존기 시험에서 마우스 종양 체적이 2000mm3를 초과하면 마우스가 죽은 것으로 간주하고 마우스를 안락사 시켰다.
(4) 실험 결과
도 28에 도시된 바와 같이, PBS 블랭크 대조군 및 블랭크 마이크로입자 대조군과 비교하여 볼 때, 마이크로백신 투여군의 종양 성장 속도는 유의하게 느려졌고(p<0.05), 마우스의 생존 시간은 유의하게 연장되었다(p<0.05). 그러므로 본 발명에 기재된 종양조직의 전 세포 조성분이 로딩된 마이크로백신은 유방암에 대해 치료 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. 나노급 크기 또는 마이크로급 크기의 입자 및 상기 입자에 로딩된 전 세포 조성분(whole-cell component)으로 이루어지고, 상기 전 세포 조성분은 세포 또는 조직 내 전 세포의 수용성 조성분 및 수불용성 조성분인 것을 특징으로 하는 전 세포 조성분의 전달 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 로딩 방법은 전 세포의 수용성 조성분과 수불용성 조성분을 입자 내부에 별도로 또는 함께 로딩하고/거나, 입자 표면에 별도로 또는 함께 로딩하는 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 입자는 내부 및/또는 표면에 면역 강화 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 또는 조직 내 전 세포의 수용성 조성분은, 가용화제 없이 순수한 물 또는 수용액에 용해될 수 있는 세포 또는 조직 내 전 세포의 원 수용성 부분이고; 상기 세포 또는 조직 내 전 세포의 수불용성 조성분은 세포 또는 조직 내 전 세포의 원 수불용성 부분이고, 상기 세포 또는 조직 내 전 세포의 원 수불용성 부분은 적절한 가용화 방법에 의해 순수한 물에서의 불용성으로부터 가용화제를 함유하는 수용액 또는 유기 용매에서의 가용성으로 전환되는 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 가용화제는 요소, 염산 구아니딘, 데옥시콜산나트륨, SDS, 글리세롤, pH 7보다 큰 알칼리 용액, pH 7보다 작은 산성 용액, 각종 단백질 분해효소, 알부민, 레시틴, 고농도 무기염, 트리톤, DMSO, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, DMF, 프로판올, 이소프로판올, 트윈, 아세트산, 콜레스테롤, 아미노산, 글루코시드, 콜린, Brij-35, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, CHAPS, 디지토닌, 라우릴디메틸아민 옥사이드, IGEPAL CA-630이고; 상기 유기 용매는 DMSO, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, DMF, 이소프로판올, 디클로로메탄, 프로판올 또는 에틸 아세테이트인 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 면역 강화 보조제는 미생물 유래 면역 강화제, 인간 또는 동물 면역계의 산물, 선천성 면역 작용제, 적응 면역 작용제, 화학적 합성 약물, 진균 다당류 및 한약재 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 면역 강화 보조제는 패턴 인식 수용체 작용제, 바실 칼메트-게랭(BCG) 백신, BCG 세포벽 골격, BCG 메탄올 추출 잔류물, BCG 세포벽 아실 디펩타이드, 마이코박테리움 플레이, 티모신, 폴리액틴 A, 미네랄 오일, 바이러스 유사 입자, 면역 강화 재구성 인플루엔자 비리온, 콜레라 장독소, 사포닌 및 이의 유도체, 레시퀴모드, 신생아 소 간 활성 펩타이드, 미퀴모드, 다당류, 커큐민, 면역 보조제 CpG, 면역 보조제 폴리(I:C), 면역 보조제 폴리 ICLC, 코리네박테리움 파르붐, 용혈성 연쇄상구균 제제, 코엔자임 Q10, 레바미솔, 폴리시티딜산, 인터루킨, 인터페론, 폴리이노신산, 폴리아데닐산, 명반, 인산알루미늄, 라놀린, 식물성 기름, 내독소, 리포솜 아주반트, GM-CSF, MF59, 이중 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 수산화알루미늄, CAF01, 인삼의 유효 성분 및 황기의 유효성분 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노급 크기 입자의 입경은 1nm 내지 1000nm이고, 상기 마이크로급 크기 입자의 입경은 1μm 내지 1000μm이며; 상기 나노급 크기 입자 또는 마이크로급 크기 입자의 표면은 전기적으로 중성이거나, 음전하 또는 양전하를 띠는 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노급 크기 또는 마이크로급 크기 입자의 제조 재료는 유기 합성 고분자 재료, 천연 고분자 재료 또는 무기 재료인 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 유기 합성 고분자 재료는 PLGA, PLA, PGA, PEG, PCL, 폴록사머, PVA, PVP, PEI, PTMC, 폴리안하이드라이드, PDON, PPDO, PMMA, 폴리아미노산, 합성 폴리펩타이드이고; 상기 천연 고분자 재료는 레시틴, 콜레스테롤, 알긴산 나트륨, 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 세포막 성분, 전분, 당류 및 폴리펩타이드이고; 상기 무기 재료는 산화제2철, 사산화삼철, 탄산칼슘 또는 인산칼슘인 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    형상이 구형, 타원체, 배럴형, 다각형, 막대형, 시트형, 와이어형, 웜형, 정사각형, 삼각형, 나비형 또는 원반형인 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  12. 제1항에 따른 전 세포 조성분의 전달 시스템의 암 예방 및/또는 치료용 백신의 제조에 있어서의 용도.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114028550A (zh) * 2021-11-15 2022-02-11 苏州大学 一种基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统及其制备方法与应用
CN114099655A (zh) * 2021-11-16 2022-03-01 苏州大学 一种预防或治疗癌症的疫苗系统及其应用
CN114404580A (zh) * 2021-12-24 2022-04-29 苏州大学 一种树突状细胞癌症疫苗及其应用
CN114225021A (zh) * 2022-01-28 2022-03-25 苏州尔生生物医药有限公司 基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统
CN114931632A (zh) * 2022-06-06 2022-08-23 苏州尔生生物医药有限公司 一种基于抗原提呈细胞膜组分的癌症疫苗及其制备方法和应用
CN115607660A (zh) * 2022-06-30 2023-01-17 苏州尔生生物医药有限公司 负载癌细胞全细胞组分和混合膜组分的疫苗的制备方法及其应用
CN116196404A (zh) * 2022-07-19 2023-06-02 苏州尔生生物医药有限公司 基于激活的抗原提呈细胞的核酸递送粒子、核酸递送系统及制备方法
CN115920028B (zh) * 2023-01-09 2024-02-09 武汉安智因医疗科技有限公司 一种免疫佐剂及其制备方法和在抗体制备中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007041190A2 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 The University Of Iowa Research Foundation Polymer-based delivery system for immunotherapy of cancer
CN102343086A (zh) * 2010-05-28 2012-02-08 四川大学 治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途
CN108114274B (zh) * 2017-12-26 2019-10-25 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗及其制备方法
CN111658767B (zh) * 2019-06-13 2022-03-22 四川大学 一种亲水性抗原和/或疏水性抗原疫苗递送系统及其制备方法
CN110898215A (zh) * 2019-12-06 2020-03-24 郑州大学 一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用

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